Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur-Wirkungs-Beziehungen an Trypanosoma brucei brucei Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Julius-Maximilians-Universit¨at Wurzburg ¨ vorgelegt von Verena Horr ¨ aus Bad Mergentheim Wurzburg ¨ 2008 Eingereicht am:.................................................. bei der Fakult¨at fur ¨ Chemie und Pharmazie 1. Gutachter:..................................................... 2. Gutachter:..................................................... der Dissertation 1. Prufer:............................................................. ¨ 2. Prufer:............................................................. ¨ 3. Prufer:............................................................. ¨ ¨ des Offentlichen Promotionskolloquiums ¨ Tag des Offentlichen Promotionskolloquiums:............................. Doktorurkunde ausgeh¨andigt am:............................. The trouble with the world is that the stupid are cocksure and the intelligent are full of doubt. Bertrand Russell (1872-1970) Britischer Philosoph und Mathematiker Nobelpreis fur ¨ Literatur 1950 INHALTSVERZEICHNIS 5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” . . . . . . . . . . . . . 1.1.1 Bakterielle Infektionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1.1 Arzneimittelsituation . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1.2 Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft? 1.1.2 Humane Afrikanische Trypanosomiasis (HAT) . . . . . . 1.1.2.1 Erkrankung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.2.2 Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.2.3 Kombinationstherapie . . . . . . . . . . . . . . 1.1.2.4 ”Public-Private-Partnership” . . . . . . . . . . . 1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1 ”hits”, “leads” und Arzneistoffkandidaten . . . . . . . . 1.2.2 ”In-vitro-whole-cell-bioassays” . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.3 ”High-throughput-screening” (HTS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 11 12 12 13 14 14 14 20 21 21 21 24 25 2 Problemstellung und Ziele der Arbeit 27 3 Theoretische Grundlagen 3.1 Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Klassifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1.1 Zellwand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1.1.1 Gram-negative Bakterien . . . . . . . 3.2.1.1.2 Gram-positive Bakterien . . . . . . . 3.2.1.2 Stoffwechsel aerober und anaerober Bakterien 3.2.2 Kolloidchemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2.1 Zeta-Potenzial . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2.2 Elektrophoretische Mobilit¨at . . . . . . . . . . 3.2.2.3 Stabilit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2.4 Wechselwirkung zwischen Licht und Materie 3.2.2.5 Praktische Anwendung: Turbidimetrie . . . . 30 30 30 31 31 31 32 33 34 35 36 37 38 40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 INHALTSVERZEICHNIS 3.3 3.4 3.5 Optische Spektroskopie an Molekulen ¨ . . . . . . . . . 3.3.1 Absorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2 Fluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3 Fluoreszenzloschung ¨ (”Quenching”) . . . . . . Kapillarelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1 Apparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1.1 Injektion . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1.2 ”Sample stacking” . . . . . . . . . . . 3.4.1.3 Detektor . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1.4 Auflosung ¨ . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Trennprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.3 Elektroosmotischer Fluss (EOF) . . . . . . . . . 3.4.4 Kapillarelektrophoretische Methoden . . . . . 3.4.4.1 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) . 3.4.4.2 Kapillargelelektrophorese (CGE) . . 3.4.5 Eigenschaften von “fused silica” Oberfl¨achen . 3.4.6 Wandbeschichtung (”Coating”) . . . . . . . . . 3.4.6.1 Permanente Beschichtung . . . . . . 3.4.6.2 Dynamische Beschichtung . . . . . . Magnetische Kernresonanz . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.1 Messprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.2 Klassische Darstellung . . . . . . . . . . . . . . 3.5.2.1 Relaxation . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.2.1.1 Bloch-Gleichungen . . . . . 3.5.2.1.2 Spinecho . . . . . . . . . . . 3.5.2.2 Chemischer Austausch . . . . . . . . 3.5.3 Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.4 Bildgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.4.1 Schichtselektionsgradient . . . . . . . 3.5.4.2 Lesegradient . . . . . . . . . . . . . . 3.5.4.3 Phasenkodiergradient . . . . . . . . . 3.5.4.4 k-Raum . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 4.1.1 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . 4.1.2 AlamarBlue . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.3 AlamarBlue-Test . . . . . . . . . . . . . . 4.1.3.1 Losungsmittel ¨ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 43 44 44 45 45 46 47 47 47 48 49 50 50 50 50 51 51 52 53 53 54 55 55 57 58 59 60 61 61 61 62 . . . . . 63 63 63 64 65 66 INHALTSVERZEICHNIS 4.2 7 4.1.3.2 Referenzsubstanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 4.1.3.3 Etabliertes Testsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 4.1.4 Struktur-Wirkungs-Beziehungen benzannelierter Systeme . . . . 71 4.1.4.1 Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) . . . . . . . . . . 71 4.1.4.1.1 C,C-verknupfte ¨ NIQs . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.1.4.1.2 N,C-verknupfte ¨ NIQs . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.1.4.2 Fluorchinolone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.2.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels Kapillarelektrophorese 80 4.2.2 Auswahl verschiedener Bakterienst¨amme . . . . . . . . . . . . . . 80 4.2.3 Problematik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 4.2.4 Standardisierung der Bakterienkulturen . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.2.4.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.2.4.2 Wachstumskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4.2.4.3 Kalibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4.2.5 Trenntechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 4.2.6 Entwicklung eines Trennpuffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 ¨ 4.2.6.1 Uberblick uber ¨ literaturbekannte Puffersysteme . . . . . 86 4.2.6.2 Eignung verschiedener Puffersysteme . . . . . . . . . . 87 4.2.6.3 Optimierung der Trennmethode . . . . . . . . . . . . . . 92 4.2.6.3.1 Pufferkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . 92 4.2.6.3.2 PEO Konzentration und Viskosit¨at . . . . . . . 94 4.2.6.3.3 Probenpr¨aparation . . . . . . . . . . . . . . . . 96 4.2.6.3.4 Probenkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . 98 4.2.6.4 Mechanistische Betrachtung . . . . . . . . . . . . . . . . 100 4.2.7 Reproduzierbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 4.2.7.1 Pufferinstabilit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 4.2.7.2 Probeninstabilit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 4.2.7.3 Elektrophoretische Heterogenit¨at . . . . . . . . . . . . . 104 4.2.7.4 Biologische und statistische Einflusse ¨ . . . . . . . . . . . 105 ¨ 4.2.8 Ubertragung der Methode auf: P. fluorescens und S. vestibularis . . 106 4.2.9 Anwendungsbreite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 4.2.9.1 N. cinerea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 4.2.9.2 Trypanosoma brucei brucei . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 4.2.10 Trennung verschiedener Bakterienst¨amme . . . . . . . . . . . . . 110 4.2.11 Validierung der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 4.2.11.1 Linearit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 4.2.11.2 Pr¨azision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 8 INHALTSVERZEICHNIS 4.3 4.4 4.2.12 Fazit: CE-Analyse von Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1 Zustand einer Bakterienpopulation . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid . . . . . . . . . . 4.3.3 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) . . . . . . . . . . 4.3.4.1 Validierung der Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . . 4.3.4.1.1 S¨attigungskonzentration . . . . . . . . . . . . . 4.3.4.1.2 Korrelationsfunktion 1. Ordnung . . . . . . . . 4.3.4.2 Testung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.5 LIF-CE zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation . . . . . 4.3.5.1 Injektionstechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.5.2 Validierung der Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . . 4.3.5.2.1 Korrelationsfunktion 1. Ordnung . . . . . . . . 4.3.5.2.2 Unterschiede zwischen FMR und LIF-CE . . . 4.3.5.3 Charakteristische “fingerprints” . . . . . . . . . . . . . . 4.3.5.4 Testung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.6 Moglichkeiten ¨ und Grenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.6.1 Losungsmittel-Effekt ¨ und Wirkmechanismus . . . . . . 4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick . . . . . . . . . . . . . 4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays” . . . . . . . Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum . . . . . . . . . . 4.4.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels NMR . . . . . . . . . 4.4.2 Chemischer Austausch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.3 Anwendungsbreite des Parameters T2 . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.4 Analyse der Zellproliferation von S. vestibularis . . . . . . . . . . 4.4.4.1 Korrelation zwischen T2 , Zellzahl und pH . . . . . . . . 4.4.4.2 Komponenten im BHI-Medium . . . . . . . . . . . . . . 4.4.4.3 Metabolite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 4.4.4.4 Quantitative Beitr¨age zur T2 -Anderung w¨ahrend der Zellproliferation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.4.4.1 N¨ahrstoffverbrauch im Medium . . . . . . . . 4.4.4.4.2 pH-Einfluss durch Bakterienmetabolismus . . 4.4.4.4.3 Effekt der Zellzunahme . . . . . . . . . . . . . . 4.4.4.4.4 Metabolitenkonzentrationen . . . . . . . . . . . 4.4.4.4.5 Maßgebende Einflussfaktoren . . . . . . . . . . 4.4.5 T2 als Maß fur ¨ die antibiotische Wirksamkeit . . . . . . . . . . . . 4.4.5.1 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 116 116 117 118 120 120 120 121 123 124 125 127 127 128 129 132 136 136 139 139 140 140 141 141 144 144 146 150 151 151 153 154 155 156 157 157 INHALTSVERZEICHNIS . . . . 158 158 159 160 5 Experimenteller Teil 5.1 Bakteriologische Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1 Kapillarelektrophorese (CE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter . . . . . . . . . . . 5.1.1.2 Spulschritte ¨ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1.3 Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1.4 CE-Trennpuffer (pH = 8.7) . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.3 Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.4 Ultraschallbad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.5 Magnetische Kernresonanz (NMR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.5.1 Bildgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.5.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter . . . . . . 5.1.5.1.2 Sequenz und Parameter . . . . . . . . . . . . . 5.1.5.1.3 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.5.2 Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.5.2.1 1D-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.5.2.2 2D-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.6 Fluoreszenzmarker: SYTO9 und Propidiumiodid . . . . . . . . . 5.1.7 Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7.1 Antibiotika-Losungen ¨ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7.2 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7.2.1 Bakterien-St¨amme . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7.2.2 Kultur-Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7.2.3 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7.2.4 Zellkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.7.2.5 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen zur kapillarelektrophoretischen und fluoreszenzspektroskopischen Analyse . . . . . . . . . . . 5.1.7.2.6 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen fur ¨ die NMR-Messungen . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.8 Zytotoxizit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.8.1 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) . . . . . 5.1.8.2 LIF-CE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 161 161 161 161 162 162 163 163 163 163 163 163 164 164 165 165 165 165 166 166 166 166 167 167 167 4.4.6 4.4.5.2 T2 -Beeinflussung durch Vancomycin . . . . . 4.4.5.3 Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit 4.4.5.4 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick . . . . . . . Fazit: T2 als Marker fur ¨ Zellwachstum . . . . . . . . . . 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 168 169 169 169 10 INHALTSVERZEICHNIS 5.2 5.3 5.1.8.3 Mikrodilutionsverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei . 5.2.1 Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.1.1 Baltz-Medium-Basis-Losung ¨ . . . . . . . . . . . . . . 5.2.1.2 Baltz-Medium zur Kultivierung . . . . . . . . . . . . 5.2.2 Parasitenkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2.2 Stabilate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2.3 Zellkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.3 Referenz- und Testsubstanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.3.1 Stammlosungen ¨ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.3.2 Arbeitslosungen ¨ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.4 AlamarBlue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.5 Durchfuhrung ¨ des Zytotoxizit¨atstests . . . . . . . . . . . . . . Berechnung von ED50 -Werten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 170 170 170 171 172 172 172 172 173 173 173 174 174 175 6 Zusammenfassung 176 7 Summary 179 A Abkurzungsverzeichnis ¨ 182 B Prozessierung der Rohdaten 185 C Region of Interest (ROI) 188 D Literaturverzeichnis 191 Danke 215 11 Kapitel 1 Einleitung 1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” Der Begriff “Orphan Drugs” (Orphan auf englisch die Waise) wurde 1983 erstmals fur ¨ Arzneimittel zur Behandlung seltener Krankheiten verwendet [94]. Mit der Grundung ¨ des Orphan-Drug-Status durch das U. S. Orphan-Drug-Gesetz versuchte man die Entwicklung von Arzneistoffen gegen diese Krankheiten anzukurbeln, da unter normalen Umst¨anden aufgrund des teilweise kleinen Marktes und des geringen Umsatzes w¨ahrend des gesetzlichen Patentschutzes fur ¨ diese Arzneimittel keine Chance besteht, ¨ die Entwicklungskosten einzuspielen. Ahnliche Gesetzgebungen folgten in Japan, Australien und 2000 in der Europ¨aischen Union. Hier entscheidet das “Committee for Orphan Medicinal Products” (COMP) uber ¨ die Aufnahme in die Liste der “Orphan Drugs”. Die Zuerkennung des Status kann sich sowohl auf epidemiologische, d. h. nicht mehr als funf ¨ Patienten unter 10.000 Personen in der EU durfen ¨ davon betroffen sein, als auch auf wirtschaftliche Kriterien stutzen. ¨ Die EU-Verordnung vom 22.01.2000 verpflichtet dabei die europ¨aische Zulassungsagentur EMEA (”European Medicines Agency”), Firmen bei der Entwicklung, insbesondere bei Design und Durchfuhrung ¨ klinischer Studien fur ¨ solche Arzneimittel zu unterstutzen ¨ [94]. Wirtschaftlichkeit und Rentabilit¨at definieren nicht nur den Begriff des “Orphan Drug” sondern auch den Begriff der “Neglected Diseases”. Dabei handelt es sich um Krankheiten, die haupts¨achlich in Kaufkraft schwachen Teilen Afrikas, Asiens und Amerikas vorkommen und deren Arzneimittelforschung und -entwicklung durch effektive Kooperationen zwischen offentlichen ¨ und privaten Unternehmen bzw. Organisationen (”public-private-partnerships for product development”, PD-PPP) gew¨ahrleistet werden soll. Ob Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft sind und wie sich die Arzneimittelsituation der Afrikanischen Trypanosomiasis, einer der zehn Krankheiten, die von der “World Health Organization” (WHO) als “Neglected Diseases” gelistet sind [5], in den 12 1. Einleitung letzten Jahren zuspitzte, wird nachfolgend diskutiert. 1.1.1 Bakterielle Infektionen 1.1.1.1 Arzneimittelsituation In den letzten Jahren nahm die Zahl an Organ- und Systeminfektionen durch Grampositive multiresistente Bakterien wie Methicillin-resistente Staphylococcus-aureus(MRSA)-St¨amme, Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE), Penicillin-resistentem Streptococcus pneumoniae (PRSP) und Fluorchinolon-resistentem Pseudomonas aerugino¨ sa (FQRP) stetig zu [50, 104, 113, 116, 261]. Abbildung 1.1 gibt einen Uberblick uber ¨ die Resistenzentwicklung der letzten Jahre [50]. Vor allem stieg die Anzahl registrierter MRSA-F¨alle dramatisch an. Bei MRSA handelt es sich um Staphylococcus-aureusSt¨amme, gegen die alle β-Lactam-Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme) inklusive des Penicillinase-festen Methicillins (Oxacillin, Flucloxacillin) und h¨aufig auch andere Antibiotika-Gruppen wie Makrolide, Clindamycin und Fluorchinolone, ihre Wirksamkeit verloren haben [197, 203]. W¨ahrend seit uber ¨ 40 Jahren MRSA-St¨amme als nosokomiale (”hospital-acquired”, HA) Problemkeime bekannt sind, werden in letzter Zeit weltweit neue Varianten von MRSA-St¨ammen beobachtet, sogenannte ubiquit¨ar auftretende (”community-acquired”, CA) MRSA-Keime [159]. Als letzte Waffen gegen diese multiresistenten Staphylococcus-aureus-Erreger galten lange Zeit die beiden Glykopeptide Vancomycin und Teicoplanin, bis 2002 der erste Fall von Vancomycinresistenz mit gleichzeitiger Kreuzresistenz gegenuber ¨ Teicoplanin auftrat [10, 27, 245]. Auch wurde die Therapie einiger Gram-negativer Keime wie Acinetobacter baumannii und “extended spectrum”-β-Lactamase (ESBL)-bildenden Enterobacteriaceae und Klebsiella-Spezies in den letzten Jahren immer schwieriger [260]. In einigen Teilen der Vereinigten Staaten sind viele Isolate von Acinetobacter-Keimen bereits gegen alle Aminoglykoside, Cephalosporine und Fluorchinolone resistent [156]. Mittlerweile stehen neue Therapiealternativen zur Behandlung dieser multiresistenten, HA- und CA-Keime zur Verfugung ¨ bzw. befinden sich gerade in der klinischen Prufung ¨ [131]. Durch Molekulvariationen ¨ bekannter Wirkstoffe einer Arzneistoffgruppe versuchte man den Resistenzmechanismus zu uberwinden. ¨ Beispiele solcher Schrittinnovationen der letzten Jahre sind: Tigecyclin (Glycylcycline als Weiterentwicklung der Tetracycline), Dalbavancin und Oritavancin (Glykopeptide), Telithromycin (Ketolide als Weiterentwicklung der Makrolide) und Quinupristin/Dalfopristin (Streptogramine). Doch wurde schon nach kurzer Zeit von Resistenzen gegen Telithromycin und Quinupristin/Dalfopristin berichtet [119, 142]. Ebenso zeigte sich bei den im Jahr 2000 und 2003 neu auf den Markt gekommenen Wirkstoffgruppen der Oxazolidinone (Linezolid) und zyklischen Lipopeptide (Daptomycin), die erste Resistenzbil- 1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 13 dung [167, 181, 233]. Diese schnelle Resistenzentwicklung ist vor allem auf den Einsatz als Breitbandantibiotika zuruckzuf ¨ uhren. ¨ Abbildung 1.1: Anstieg resistenter und multiresistenter Bakterien. (PRSP=Penicillinresistenter Streptococcus pneumoniae, FQRP=Fluorchinolonresistente Pneumokokken, MRSA=Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus, VRE=Vancomycin-resistente Enterokokken) [50]. 1.1.1.2 Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft? Trotz der zunehmenden H¨aufigkeit und Schwere antimikrobieller Resistenzen ist die zukunftige ¨ Entwicklung neuer Antiinfektiva durch die Einstellung dieses Forschungsgebietes vieler großer Pharmaunternehmen bedroht [75, 183, 188, 248, 279]. Fur ¨ die Großunternehmen ist die Entdeckung und klinische Entwicklung von neuen Antiinfektiva im Vergleich zu Arzneistoffen gegen chronische Erkrankungen unrentabel [52, 210, 213, 244]. Kleinere Firmen unternehmen derzeit den Versuch die Antibiotikaforschung aufzunehmen und auf die medizinische Notwendigkeit aufmerksam zu machen, doch ist ungewiß, ob die notwendigen finanziellen Mittel, die klinische Entwicklung und die Kooperationsmoglichkeiten ¨ mit den großen pharmazeutischen Unternehmen ausreichend sind, um die Therapiesicherheit bakterieller Infektionserkrankungen zu gew¨ahrleisten [211, 242]. Im M¨arz 2003 wurde die “Antimicrobial Availability Task Force” (AATF) der “Infectious Diseases Society of America” (IDSA) ins Leben gerufen. Ihre Aufgabe besteht darin den derzeitigen Trend in Bezug auf Forschung, Entwicklung und Herstellung von Antiinfektiva zu bewerten, und ihre zukunftige ¨ Verfugbarkeit ¨ zu gew¨ahrleisten. In ihrem Bericht vom Juli 2004: ”Bad Bugs, no drugs: As antibiotic R&D stagnates, a public health crisis brews” schlug die IDSA deshalb staatliche Maßnahmen zur Aufrechterhaltung der Therapiesicherheit vor [260]. Derzeit befindet sich lediglich ein Antibiotikum, das Ramoplanin, in Amerika in der dritten Phase der klinischen Prufung. ¨ Es handelt sich dabei um eine neuartige Antibiotikaklasse, einem Lipoglykodepsipeptid, und soll bei Blutinfektionen durch Vancomycin-resistente Enterokokken zum Einsatz kommen. Die Rechte an diesem Arzneistoff wurden 2001 von dem italienischen Biotechnologieunternehmen Biosearch Italia einlizensiert. Am 9.10.2001 bekam Ramoplanin in Europa bereits den Orphan-Drug-Status zugesprochen, wodurch im Falle einer Zulassung das Medikament etwa 10 Jahre exklusiv vermarktet werden kann (Marktexklusivrecht) [283]. 14 1. Einleitung 1.1.2 Humane Afrikanische Trypanosomiasis (HAT) 1.1.2.1 Erkrankung Die Afrikanische Schlafkrankheit (human African trypanosomiasis, HAT) ist eine der wichtigsten, aber gleichzeitig auch die am meisten in Vergessenheit geratene tropische Infektionskrankheit. Die Erreger sind einzellige Parasiten der Gattung Trypanosoma, dem Stamm der Protozoen angehorend ¨ und werden von Tsetse-Fliegen (Glossina spp.) ubertragen. ¨ Die humane Afrikanische Trypanosomiasis existiert in zwei Formen mit unterschiedlichen klinischen Symptomen. Man unterscheidet zwischen Trypanosoma brucei gambiense (Erreger der Westafrikanischen Schlafkrankheit) und Trypanosoma brucei rhodesiense (Erreger der Ostafrikanischen Schlafkrankheit). Trypanosoma brucei brucei ein den humanpathogenen Subspezies morphologisch identischer Krankheitserreger, verursacht die bovine Trypanosomiasis (Nagana-Seuche) und wird aufgrund seiner humanen Apathogenit¨at h¨aufig als Teststamm im Labor eingesetzt [175]. Eine Klassifizierung dieser drei Erreger ist ausschließlich anhand biologischer Kriterien wie In¨ fektionsspektrum, Pathogenit¨at, Ubertragungsmodus und geographische Verbreitung moglich ¨ [1]. Durch das Biotop des Vektors, welches von Senegal bis zur nordlichen ¨ Grenze der Kalahari und Namibias reicht, ist die Erkrankung auf den afrikanischen Kontinent beschr¨ankt [175]. Berichten der WHO zufolge sind derzeit eine halbe Million Menschen mit Trypanosomen infiziert [251]. Die Erkrankung verl¨auft uber ¨ klinisch unterschiedliche Stadien. Die ersten Symptome zeigen sich nach hochstens ¨ funf ¨ Tagen nach Infektion durch eine lokale Hautreaktion an der Einstichstelle, dem sogenannten Trypanosomen-Schanker [251]. Einhergehend mit Fieber verbreiten sich die Erreger dann im weiteren Verlauf von der Einstichstelle uber ¨ Blut und Lymphe im gesamten Organismus aus (Stadium I), durchdringen allm¨ahlich die Blut-Hirn-Schranke und erreichen schließlich das Zentralnervensystem (Stadium II). Dort fuhren ¨ sie zu einer chronischen Enzephalopathie mit schweren Kopfschmerzen, Wesensver¨anderungen und unterschiedlichen neurologischen Ausf¨allen. Namensgebend fur ¨ die Erkrankung ist das Endstadium, bei dem die Patienten in einen D¨ammerzustand verfallen, immer wieder einschlafen, zu ihrer Umgebung keinen Kontakt mehr halten und schließlich versterben. W¨ahrend die Westafrikanische Schlafkrankheit langsam beginnt und unter allm¨ahlicher Progression das Stadium II erreicht, zeigt die Ostafrikanische Schlafkrankheit einen akuten Beginn mit h¨aufig auftretendem Haut-Schanker und fuhrt ¨ oft bereits nach wenigen Wochen im Stadium I zum Tod [253]. 1.1.2.2 Therapie Gegen die Afrikanische Schlafkrankheit gibt es keine Impfstoffe und die Aussichten auf eine prophylaktische Immunisierung sind schlecht, da die Parasiten ihre aus Antigenen bestehende Oberfl¨ache periodisch a¨ ndern [253,271]. Zur Therapie bleiben somit 1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 15 ausschließlich Arzneistoffe. Die therapeutischen Strategien sind weitgehend auf dem Stand der 60er Jahre stehen geblieben und basieren auf den funf ¨ Arzneistoffen: Suramin, Melarsoprol, Pentamidin, Eflornithin und Nifurtimox (Abbildung 1.2). Die einzigen wesentlichen Neuerungen ergaben sich in der Begleittherapie, wodurch unter dem Einsatz von Glukokortikoiden die schweren Therapiekomplikationen abgemildert werden konnen ¨ [201]. Nifurtimox verfugt ¨ uber ¨ keine Zulassung zur Therapie der HAT, sondern lediglich zur Therapie der Amerikanischen Trypanosomiasis (Chagas Krankheit) [26]. Dennoch wird es bei Patienten, die gegenuber ¨ Melarsoprol resistent sind und bei denen keine anderen Therapiealternativen bestehen, zur Behandlung von T.-b.-gambiense-Infektionen eingesetzt. Die Wahl des Medikamentes h¨angt vor allem davon ab, in welchem Stadium die Krankheit diagnostiziert wurde - und zwar vor oder nach dem Eindringen in die Zerebrospinalflussigkeit. ¨ In Tabelle 1.1 sind die derzeitigen Therapieoptionen zusammengefaßt: Westafrikanische Schlafkrankheit Trypanosoma brucei gambiense Stadium I 1.Wahl: Pentamidin (h¨amo-lymphatischer Befall) 2.Wahl: Suramin Stadium II 1.Wahl: Melarsoprol (Meningoenzephalitis) 2.Wahl: Eflornithin Ostafrikanische Schlafkrankheit Trypanosoma brucei rhodesiense 1.Wahl: Suramin 2.Wahl: Melarsoprol 1.Wahl: Melarsoprol 2.Wahl: Melarsoprol +Nifurtimox Tabelle 1.1: Therapiestrategien zur Behandlung der Afrikanischen Trypanosomiasis (nach Referenz [250]). Alle Therapieans¨atze sind unbefriedigend aufgrund ihrer: • Unakzeptablen hohen Toxizit¨at. Beispielsweise liegt die Letalit¨at unter Therapie beim Melarsoprol zwischen 4 % bis 12 % [84]. Mit großer Wahrscheinlichkeit wurde ¨ keines dieser Medikamente heute die Kriterien fur ¨ eine internationale FDA-Zulassung erfullen ¨ [250]. • Schlechten Wirksamkeit und ihrer aufw¨andigen Applikation [90]. Bis auf Nifurtimox, welches oral verabreicht werden kann, ist bei allen anderen Arzneistoffen nur eine intramuskul¨are bzw. intravenose ¨ Applikation moglich ¨ [49, 250]. Die Melarsoprol-Behandlung dauert minimal 10 Tage und erfordert zumindest im ¨ Stadium II eine intensive medizinische Behandlung und Uberwachung [251]. • Arzneistoffresistenz [48]. Eine zunehmende Resistenzentwicklung gegen Melarsoprol wird vor allem aus Angola und Uganda berichtet, wo in manchen Stand- 16 1. Einleitung orten eine Resistenzrate von 30 % erreicht wurde [250]. • Fehlenden internationalen Standardisierung. Trotz einiger Vorgaben der WHO sind Therapieschemata (Dosierung und Therapiedauer) international nicht standardisiert und nahezu jedes Land verwendet eigene Richtlinien und Behandlungskonzepte [250]. Suramin Na Na +- +- O3S O O N H - + SO3 Na O3S O + SO3 Na N H +Na O3S CH3H3C NH + SO3 Na NH O O N H N H Melarsoprol H N N Eflornithin HOOC H2N H2N CHF2 N NH2 N As S S NH2 OH Pentamidin Nifurtimox NH NH NH2 H2N O O O O2N O N N S O H3C Abbildung 1.2: Strukturen der Arzneistoffe, die zur Behandlung des fruhen ¨ und sp¨aten Stadiums der Afrikanischen Trypanosomiasis eingesetzt werden. Zu beachten ist, dass Nifurtimox keine Zulassung zur Therapie besitzt, jedoch bei Versagen von Melarsoprol eingesetzt wird. Im Folgenden werden die zur Verfugung ¨ stehenden funf ¨ Arzneistoffe mit ihren mogli¨ chen Wirkmechanismen n¨aher beschrieben: 1. Suramin (Germanin® , Bayer AG) Bei Suramin handelt es sich um ein farbloses vielfach sulfoniertes, symmetrisches Naphthylamin, welches erstmals 1922 zur Therapie der HAT eingesetzt 1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 17 wurde [276]. Es ist im Stadium I sowohl gegen T. b. gambiense als auch T. b. rhodesiense wirksam. Aufgrund seiner hohen negativen Ladung weist es eine hohe Affinit¨at gegenuber ¨ Serumproteinen auf, einschließlich dem “low density lipoprotein” (LDL) [272]. Fur ¨ dieses Lipoprotein besitzen Trypanosomen einen Rezeptor und man vermutet, dass Suramin uber ¨ Rezeptor-vermittelte Endozytose an LDL gebunden aufgenommen wird [70]. Sein Wirkmechanismus ist nicht vollst¨andig bekannt, beruht aber moglicher ¨ Weise auf der Hemmung zahlreicher Enzyme aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen [49]. Die Therapie mit Suramin versagt zwischen 25 % bis 35 % der F¨alle [49]. Der Grund fur ¨ diese hohe Versagensrate liegt moglicherweise ¨ in einer reduzierten LDL-Aufnahmerate. ¨ Vielfach wurden Ubelkeit, Erbrechen, Hautausschlag, vorubergehendes ¨ Fieber, Leber- und Nierensch¨aden sowie Thrombocyto- und Neutropenie als Nebenwirkungen beschrieben [26, 65]. 2. Pentamidin (Lomidine® , Aventis AG) Pentamidin ist ein aromatisches Diamidin und wurde 1937 entdeckt [235]. Es ist das Medikament der Wahl in der fruhen ¨ Phase der Westafrikanischen Schlafkrankheit. Es wirkt direkt gegen den Parasiten unabh¨angig von seiner physiologischen Stoffwechselaktivit¨at im Wirt und wird, wie auch die MelaminylphenylArsenverbindungen (Melarsoprol, vide infra), unter anderem uber ¨ P2-AminoPurin-Transporter, im Parasiten hoch-konzentriert angereichert [54, 55]. Der Verlust dieses Transporters kann bei den Parasiten zur Kreuzresistenz gegenuber ¨ Diamidinen und Arsenverbindungen fuhren. ¨ Der Wirkmechanismus ist nicht vollst¨andig gekl¨art. Aufgrund der hohen Arzneistoffkonzentrationen von einigen Millimolar [54] liegt die Vermutung nahe, dass der zytotoxische Effekt seine Ursache in der Hemmung vieler zellul¨arer Zielstrukturen (Proteine, Lipide, kleine Furche der DNA) [20, 69, 185] hat, hervorgerufen durch elektrostatische ¨ Wechselwirkungen. Als Nebenwirkungen konnen ¨ Hypotonie, Ubelkeit, Nierensch¨aden und Diabetes mellitus auftreten. Diese Folgeerscheinungen sind teilweise durch eine große Affinit¨at zu Imidazolin-Rezeptoren zu erkl¨aren [281]. 3. Melarsoprol (Mel B, Arsobal® , Aventis AG) Melarsoprol ist eine melaminhaltige Arsenverbindung und wurde 1949 als trypanozides Medikament vor allem zur Therapie der sp¨aten Phase von T. b. gambiense und T. b. rhodesiense eingefuhrt ¨ [100]. Aufgrund seiner Lipophilie diffundiert es ungehindert durch zellul¨are Membranen, wird aber zus¨atzlich durch den P2Amino-Purin-Rezeptor in den Parasiten angereichert [20, 21, 54, 55]. Melarsoprol ist ein Prodrug, in welchem die Reaktivit¨at des trivalenten Arsens des Melarsenoxids mit 2,3-Dimercaptopropanol maskiert wurde [90]. Nach Applikation spaltet sich die Schutzgruppe schnell ab und es entsteht freies Melarsenoxid (Ab- 18 1. Einleitung bildung 1.3), welches schnell und reversibel an Serumproteine insbesondere an Thiole bindet, unter anderem an Trypanothion [76, 145]. Auf diese Weise konnen ¨ wichtige Stoffwechsel- und Transportfunktionen inhibiert werden. Wahrscheinlich fuhrt ¨ ein Zusammenspiel aus Trypanothionerschopfung ¨ und Hemmung der Trypanothionreduktase zum Zelltod (Abbildung 1.5, vide infra) [90,93]. Trypanothion und Trypanothionreduktase sind die Grundbausteine des Redoxstoffwechsels der Trypanosomatiden [92, 150] und ersetzen das Glutathion/Glutathionreduktase-Paar in Pro- und fast allen Eukaryoten [91]. Da Melarsoprol in Wasser nahezu unloslich ¨ ist, wird es intravenos, ¨ in Propylenglykol gelost, ¨ verabreicht. Propylenglykol fuhrt ¨ jedoch h¨aufig zu Irritationen im Gewebe. Daruber ¨ hinaus verursacht Melarsoprol in 5 % bis 10 % der F¨alle eine akute Enzephalopathie, wobei die H¨alfte der F¨alle todlich ¨ verl¨auft [90, 200]. Weitere Nebenwirkungen sind ¨ Ubelkeit, periphere Neuropathie, Gelenkschmerzen und Thrombophlebitis [90]. H N N S As S H N OH O N N H2N As N H2N N N NH2 Melarsoprol NH2 SH HS Melarsenoxid OH 2,3-Dimercaptopropanol H N Das Grundgerüst dieser Arzneistoffgruppe wird als Melarsen (Melaminylphenyl-Arsen) bezeichnet As N N NH2 N NH2 Abbildung 1.3: Spaltung von Melarsoprol in das therapeutisch wirksame Melarsenoxid. 4. Eflornithin (Difluormethylornithin (DMFO), Ornidyl® , Aventis AG) Eflornithin wurde in den fruhen ¨ 80er Jahren ursprunglich ¨ zur Krebstherapie entwickelt, jedoch in der klinischen Prufungsphase ¨ gegen neoplastische Erkrankungen als zu toxisch eingestuft [22, 26]. Es erwies sich jedoch im Stadium II der Westafrikanischen Trypanosomiasis als wirksam und ist seit 1990 zur Therapie der HAT zugelassen. Nach seiner Einfuhrung ¨ in die Therapie gl¨anzte es durch seine Wirksamkeit und bekam den Beinamen “Resurrection Drug”, das 1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 19 “Auferstehungsmedikament” [253]. Eflornithin ist als Ornithin-Analogon ein irreversibler Inhibitor des Enzyms Ornithin-Decarboxylase (ODC) im PolyaminBiosyntheseweg [170]. Die Folgen der Hemmung sind ein Verlust an Putrescin und Spermidin und letztendlich eine Verringerung des Trypanothion-Spiegels (Abbildung 1.5, vide infra) [90]. Die Arzneistoffaufnahme geschieht sowohl uber ¨ passive Diffusion als auch uber ¨ Transporter [24, 207]. Trotz einer a¨ hnlichen Affinit¨at zur Ornithin-Decarboxylase in S¨augetierzellen wirkt Eflornithin spezifisch auf Trypanosomen aufgrund einer geringeren Replikationsrate der OrnithinDecarboxylase [206]. In vitro wirkt Eflornithin zytostatisch [51]. Zur Beseitigung der Blutstromformen in vivo ist somit ein intaktes Immunsystem notwendig, denn nichtteilungsf¨ahige Trypanosomen konnen ¨ ihre antigene Oberfl¨ache nicht mehr a¨ ndern und sind somit immunologisch angreifbar [90]. Die Nebenwirkungen sind relativ gering, obwohl es zur Beeinflussung der Blutbildung kommen kann. 5. Nifurtimox (Lampit® , Bayer AG) Nifurtimox besitzt eine Nitrofuran-Struktur und wurde in den 60er Jahren auf den Markt gebracht. Die Aufnahme erfolgt wahrscheinlich durch passive Diffusion [49]. Der Wirkmechanismus beruht auf einer periodischen Reduktion und Oxidation der Nitrogruppe am Furangerust ¨ (Abbildung 1.4). Durch ein Flavoenzym wird zun¨achst in einer Einelektronenreduktion das Radikalanion gebildet. Dieses reagiert nachfolgend mit molekularem Sauerstoff zu SuperoxidAnionen, die unter Dismutation Wasserstoffperoxid produzieren [80, 221]. Der letzte Schritt wird durch das in allen aeroben Zellen gegenw¨artige kupferhaltige Enzym Superoxid-Dismutase (SOD) katalysiert. Dieser oxidative Stress, verursacht die Zerstorung ¨ zellul¨arer Komponenten wie DNA, Membranlipide und Proteine. S¨augetierzellen haben zwar im Vergleich zu Parasiten einen besseren Schutz gegenuber ¨ oxidativer Zerstorung, ¨ dennoch sind Nebenwirkungen, wie neurologische Sch¨aden extrem h¨aufig und fuhren ¨ bei 50 % der Patienten zum Abbruch der Therapie [49, 90]. R NO2 Flavoenzym . . R NO2 - + O2 . . O2 - + O2 - + 2H + . R NO2 - R NO2 + O2 SuperoxidDismutase (SOD) H2O2 + O2 Abbildung 1.4: Enzymkatalysierte REDOX-Reaktion der Nitrogruppe des Nifurtimox und Bildung von Superoxiden und Wasserstoffperoxid. 20 1. Einleitung 1.1.2.3 Kombinationstherapie Da derzeit kein neues Medikament in Sichtweite ist, tendiert die Behandlungsstrategie zunehmend zur Kombinationstherapie. Besonders geeignet sind dabei Melarsoprol, Eflornithin und Nifurtimox, die alle drei den Trypanothion-Spiegel beeinflussen - entweder durch Hemmung der Trypanothion-Produktion, durch Eingriff in des dazugehorige ¨ REDOX-System (durch oxidativen Stress gebildetes DNA-, Lipid- oder Wasserstoffperoxid und gebildeter Radikale wird Trypanothion zu Trypanothiondisulfid oxidiert) oder durch Inhibition der Trypanothion-Reduktase (Abbildung 1.5). Ihre synergistische Wirkung konnte im Tiermodell gezeigt werden und eine Kombinationstherapie von Nifurtimox-Eflornithin wurde bereits bei Patienten, die sich gegenuber ¨ jeglicher Therapie unempfindlich zeigten, durchgefuhrt ¨ [137, 246]. S As S H N N H N OH N H2N As N H2N N N NH2 NH2 P2-PurinTransporter Ornithin DMFO ODC Nifurtimox Putrescin Melarsenoxid Spermidin COO- TRYS REDOX-System ROOH 2 RS . O H N + H3N + H3N COO- O SH SH O RSSR H N N H O Trypanothion H N N H Weitere Targets ? NH2+ O COO- N H O + H3N H2N TRYX TRYP ROH+ H2O O N NADP+ N N RSSR 2 RSH ? TRYR N H2N NADPH + H+ COO- Trypanothiondisulfid O COO- N H S S O + H3N O N H N H +H3N N H H N O NH2+ H N O O N H Mel T H N O NH2+ H N O O O S As S O N H COO- H N + H3N H N O N H Abbildung 1.5: Synergie-Effekt von Eflornithin (DMFO), Melarsoprol und Nifurtimox (Modell nach Referenz [90]). Alle drei Arzneistoffe beeinflussen den Trypanothion-Metabolismus. Abkurzungen: ¨ ODC, Ornithin-Decarboxylase; TRYP, Tryparedoxin-Peroxidase; TRYR, Trypanothion-Reduktase; TRYS, Trypanothion-Synthetase; TRYX, Tryparedoxin. 1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 21 1.1.2.4 ”Public-Private-Partnership” Um die Jahrtausendwende kam die Arzneimittelforschung und -entwicklung fur ¨ “Neglected Diseases” nahezu zum Erliegen [199, 267]. Zwischen 1975 und 1999 kamen 1393 neue Medikamente auf den Markt. Davon waren nur 13 gegen Tropenkrankheiten [268]. Das Interesse an der Arzneimittelentwicklung schwand mit dem Ende ¨ des Kolonialismus, den Anderungen in der Firmenpolitik der pharmazeutischen Industrie, den steigenden Kosten fur ¨ die Arzneimittelforschung und -entwicklung und den zunehmenden Auflagen [72]. Argumente der Unrentabilit¨at Produkte gegen Krankheiten fur ¨ eine Bevolkerungsgruppe ¨ ohne Kaufkraft zu entwickeln, fuhrten ¨ zunehmend zu einer ablehnenden Haltung seitens der Industrie. Ende der 90er Jahre wurde ein Produktionsstopp fur ¨ die Medikamente gegen die Afrikanische Schlafkrankheit angekundigt. ¨ Gleichzeitig wurde Eflornithin als Bestandteil einer Enthaarungscreme ® (Vaniqa , Bristol-Myers-Squibb) zur Behandlung des Damenbartes eingefuhrt. ¨ Eine Produktion als Injektionslosung ¨ wurde zun¨achst weiterhin abgelehnt [252]. Erst intensive Lobbyarbeit unter der Fuhrung ¨ der Nicht-Regierungsorganisation “M´edecins sans Fronti`eres”, Tr¨ager des Friedensnobelpreises 1999, bewog Entscheidungstr¨ager der ¨ pharmazeutischen Industrie zu einer Anderung ihrer Firmenpolitik. Im Mai 2001 wur¨ de zwischen dem Aventis-Konzern und der Weltgesundheitsorganisation eine Ubereinkunft getroffen, in der sich Aventis zu einer Neuproduktion und einer kostenlosen Bereitstellung von Pentamidin, Melarsoprol und Eflornithin fur ¨ die Therapie der Schlafkrankheit verpflichtet. Die BAYER AG schloss sich kurze Zeit sp¨ater mit ihren beiden Produkten Suramin und Nifurtimox dieser Vereinbarung an. Diese “PublicPrivate-Partnership” (PPP) unterliegt derzeit einer Evaluation durch die Partner. Es ist von entscheidender Bedeutung fur ¨ Kontrollprogramme der Schlafkrankheit und fur ¨ Patienten in Afrika, weiterhin verl¨asslich mit diesen essenziellen Medikamenten rechnen zu konnen. ¨ Die Bedeutung der Public-Private-Kooperationen liegt in der Verteilung von Schlusselfunktionen ¨ auf Universit¨aten, Pharmaindustrie und “Not-forprofit-Organisationen” [72]. Beispiele fur ¨ kurzlich ¨ entwickelte PPPs mit dem Ziel der antiparasit¨aren Arzneistoffauffindung sind: “Medicines for Malaria Venture” (MMV), “Drugs for Neglected Diseases Initiative” (DNDi) und das “Institute for One World Health” (IOWH). 1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 1.2.1 ”hits”, “leads” und Arzneistoffkandidaten Der einfachste Weg zur Auffindung neuer Antiinfektiva ist die sogenannte LabelExtension-Strategie. Sie wird h¨aufig bei der Suche nach Arzneimitteln gegen tropische Erkrankungen angewandt, deren Forschung nicht von kommerzieller Seite an- 22 1. Einleitung getrieben wird. Bei dieser Strategie wird die Indikation bereits bestehender Arzneimittel zur Therapie anderer humaner oder animaler Erkrankungen ausgeweitet, wodurch vor allem die Forschungs- und Entwicklungskosten erheblich gesenkt werden konnen ¨ [208, 225, 280]. Erfolgreich war diese Strategie z. B. bei Praziquantel, einem ursprunglich ¨ als Anthelminthikum zugelassenen Arzneimittel, das nun in der Therapie der Schistosomiasis eine wichtige Rolle spielt [132, 190]. Die Auffindung neuer Arzneistoffe ist jedoch zunehmend notwendig. Ihr Weg ist ein iterativer Prozess und verl¨auft wie in Abbildung 1.6 dargestellt uber ¨ viele Zwischenstufen. Testung auf Wirksamkeit und Toxizität “Target- and cellbased screening“ Potenzielle Inhibitoren Tiermodell, ADME, Toxizität “hits“ “leads“ Detailliertere Untersuchungen, Optimierung Arzneistoffkandidaten Klinische Studien Iterative medizinische Chemie Optimierung von Wirkung und pharmazeutischer Eigenschaften Arzneistoff Abbildung 1.6: Stadien der Arzneistoffauffindung, modifiziert nach [208] Der Prozess der Arzneimittelauffindung impliziert die Synthese, die Identifizierung von Vorstufen moglicher ¨ Arzneistoffkandidaten, die physikalisch-chemische Charakterisierung und die Testverfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit potenzieller Wirksubstanzen. In den letzten Jahren konnten auf dem Gebiet der Synthese große Fortschritte erzielt werden. Die Methode der kombinatorischen Chemie mit systematischer Kombination verschiedener Bausteine und die Methode der “random chemistry”, einem Verfahren, bei welchem Substanzen nach dem Zufallsprinzip aus γ-bestrahlten Ausgangs-Cocktails entstehen, ermoglichen ¨ die schnelle Erstellung großer Substanzbibliotheken. Doch unabh¨angig davon ob die Suche nach neuen Leitstrukturen von Naturstoffen, Synthese, kombinatorischer Synthese oder “random chemistry” ausgeht, der Prozess der Arzneistoffauffindung erfordert immer vollautomati- 1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 23 sierte In-vitro-Testsysteme an Enzymen, Rezeptoren, Bakterien und Zellen, sogenannte High-Throughput-Screening-Verfahren (HTS). Die Testung der Substanzen auf Wirksamkeit erfolgt dabei entweder speziell an einem bestimmten Target (”target-basedassay”) oder direkt bezuglich ¨ des ganzen Erregers (”whole-cell-based-assay”). Substanzen, welche in vitro gegen ganze Zellen eine Aktivit¨at ≤ 1 µM zeigen und diese bezuglich ¨ des Erregers mindestens 10fach st¨arker ist als gegenuber ¨ S¨augetierzellen, werden als “hits” bezeichnet [190, 208]. Diese sind Kandidaten fur ¨ weitere Testungen in Tiermodellen der Krankheit. In diesem Stadium fließen bereits Untersuchungen zu physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Loslichkeit, ¨ Permeabilit¨at, Lipophilie, pka und Stabilit¨at ein, aus deren Profilen Vorhersagen zu den pharmazeutischen Eigenschaften Adsorption, Distribution, Metabolismus und Elimination (ADME) gewonnen werden konnen. ¨ Substanzen die sich in Tiermodellen aktiv zeigen und zus¨atzlich eine hohe Selektivit¨at der Wirkung, gute Verfugbarkeit, ¨ lange Wirkdauer und eine gute Verstoffwechslung bei geringer Toxizit¨at zeigen, bezeichnet man als “leads”. In iterativen Schritten werden diese Leitsubstanzen bezuglich ¨ Wirkung und pharmazeutischer Eigenschaften (ADME) optimiert. Hierzu werden verschiedene Strukturabkommlinge ¨ einer Leitstruktur getestet, um anhand von Struktur-Wirkungs-Beziehungen (”structure activity relationship”, SAR) Zusammenh¨ange zwischen Struktur und pharmakodynamischer und -kinetischer Eigenschaften zu analysieren. Erreicht eine Substanz ein Stadium, in dem sie an Patienten erprobt werden kann, spricht man von einem Arzneistoffkandidaten. Ab hier beginnen die klinischen Studien. Bisher basierte die Testungs-Strategie haupts¨achlich auf Target-Based-HTS-Verfahren (sogenannte Piggy-Back-Strategie) [190]. Als besonders gunstig ¨ erwies es sich, wenn das mikrobielle Target auch zur Therapie anderer Erkrankungen relevant ist und somit zur Testung die gleichen Ausgangsverbindungen eingesetzt werden konnen ¨ [105]. Die Cystein-Protease, einem vielversprechenden Target in der Forschung antitrypanosomaler Arzneistoffe wurde z. B. ursprunglich ¨ fur ¨ die Entwicklung von Inhibitoren zur Therapie der Osteoporose eingesetzt [225]. Zu bemerken ist, dass die aus der ParasitenTestung hervorgegangenen Struktur-Wirkungs-Beziehungen, sich von denen der ursprunglichen ¨ Indikation stark unterscheiden. Trotz aller Bemuhungen ¨ erwies sich diese Strategie auf dem Gebiet der Antiinfektiva bis jetzt als nicht sehr erfolgreich [112, 195]. Schwierigkeiten zeigten sich vor allem in der Korrelation zwischen Enzyminhibition und der Aktivit¨at gegenuber ¨ ganzen Erregerzellen [19, 165]. Ursachen hierfur ¨ sind entweder die schlechte Permeabilit¨at der Testsubstanzen durch die Zellmembran intakter Zellen oder die fehlende Relevanz des gew¨ahlten Targets [190]. So gibt es abgesehen vom Cystein-Protease-Inhibitor K777, welcher sich zur Therapie der Chagas-Krankheit in Entwicklung befindet, derzeit keine Substanz, die als Antiinfektivum aus Target-Based-Screening-Verfahren hervorgegangen ist. Deshalb gewinnen “in-vitro-whole-cell-bioassays” zunehmend an Bedeu- 24 1. Einleitung tung [190, 208]. 1.2.2 ”In-vitro-whole-cell-bioassays” Die meisten Bioassays an ganzen Zellen basieren auf der Beobachtung der Zellproliferation bei Exposition mit Testsubstanzen in Flussigkultur, ¨ sogenannte Dilutionsverfahren. Die Auswertung erfolgt in der Regel mittels optischer Spektroskopie im visuellen Wellenl¨angenbereich. Als “Indikator” dient entweder die Zunahme der Zellzahl an ¨ sich, oder die Anderung der Zusammensetzung des Kulturmediums. Die folgenden vier Techniken sind die auf der Basis der Lichtdetektion am h¨aufigsten angewandten Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit: • Turbidimetrie: Tritt ein Lichtstrahl durch eine Zellsuspension, so wird er an den Zellen gestreut und abgeschw¨acht. Diese Lichtabschw¨achung ist in erster N¨aherung zur Zellzahl proportional und wird uber ¨ die Extinktion bzw. die optische ¨ Dichte (OD) quantifiziert. Ublicherweise wird der OD-Wert bei 600 nm zur Bestimmung des Wachstumszustandes gemessen [23]. (Siehe auch Abschnitt 3.2.2.4) ¨ • Nephelometrie: Ahnlich wie in der Turbidimetrie wird die Lichtstreuung an Zellen zur Bestimmung der Zellzahl genutzt. Jedoch wird in diesem Fall nicht die Extinktion gemessen, sondern die Intensit¨at des seitlich austretenden Streulichtes [182]. H¨aufig verwendet wird die Laser-Nephelometrie [204]. • Kolorimetrie (auch Absorptionsphotometrie genannt): Eine lichtabsorbierende ¨ Substanz wird als Indikator stoffwechselbedingter Anderungen w¨ahrend der Zellproliferation eingesetzt. Seine spektrale Charakteristik ist in der Regel pHoder REDOX-sensitiv und seine Konzentration kann durch Messung der Absorption bei einer bestimmten Wellenl¨ange nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ermittelt werden. Der Indikator kann entweder intrazellul¨are oder extrazellul¨are ¨ Anderungen, hervorgerufen durch Mediumverbrauch und Stoffwechselproduktion, indizieren. H¨aufig verwendet werden AlamarBlue, Tetrazoliumsalze oder Phenolrot [180, 189]. • Fluorimetrie: Diese Methode ist der Kolorimetrie sehr a¨ hnlich. Der Unterschied beruht lediglich auf dem Einsatz von Fluorophoren als Indikatoren (AlamarBlue oder BCECF-AM) und einer fluorimetrischen Detektion [191, 217]. Neben diesen optischen Methoden werden in bekannten Literaturwerken [204] drei weitere Methoden zur Bestimmung der Zellproliferation als brauchbar beschrieben. Zwei dieser Methoden beruhen auf der Quantifizierung der Stoffwechselaktivit¨at. Zum einen eignet sich dazu die Radiometrie. Hier kann entweder die Freisetzung 1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 25 von radioaktiv markiertem 14 CO2 (im Bac-Tec-Verfahren realisiert) oder die Aufnahme radioaktiv markierter Nukleotide wie [3 H]-Thymidin, [3 H]-Hypoxanthin oder Aminos¨auren gemessen werden [47, 78, 214]. Solche Methoden erfordern im Medium eine radioaktive Kohlenstoff- bzw. Wasserstoffquelle, wodurch ihre Durchfuhrung ¨ aufgrund gesetzlicher Auflagen problematisch ist. Eine andere Moglichkeit ¨ Stoffwechselproduktion und unter anderem CO2 -Freisetzung zu messen, stellt die Kalorimetrie dar. Hier wird mit einem Infrarot-Messsystem die durch den mikrobiellen Stoffwechsel freiwerdende W¨arme gemessen, wodurch ein Ruckschluss ¨ auf die Zahl der Mikroorganismen moglich ¨ ist. Letztendlich eignet sich noch die Impedanzmessung. Gemessen wird der Widerstand gegen den elektrischen Strom in der Zellkultur. Eine Verminderung der Impedanz ist eine Folge von Zellvermehrung und -stoffwechsel, denn N¨ahrstoffverzehr und Stoffwechselprodukte a¨ ndern die Komposition des Mediums. All diese Detektionsmethoden konnen ¨ zur Auswertung von Testsystemen zur Bestimmung von Zytotoxizit¨at angewandt werden. Sie wurden ursprunglich ¨ zur Messung eines kleinen Probenumfanges entwickelt und ihre Anwendung in High-ThroughputScreening-Verfahren mit Testungen von mehreren 100.000 Substanzen pro Tag ist durch ihre Technik beschr¨ankt. 1.2.3 ”High-throughput-screening” (HTS) Schlusselfaktoren ¨ fur ¨ Testsysteme mit großer Durchsatzzahl, sogenannte HighThroughput-Screening-Verfahren sind Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung. Diese Kriterien sind durch den gesamten etablierten Testablauf von Probenvorbereitung bis Detektion festgelegt. Zur Realisierung von Hochdurchsatz sollte das Testverfahren aus nur wenigen einfachen Schritten bestehen, die vollautomatisierbar sind. Nicht selten werden Arzneistoff-exponierte Kulturen unter Einsatz von Robotern in Mikrotiterplatten mit 1536-2080 Vertiefungen simultan pr¨apariert. Die Miniaturisierung ist dabei maßgeblich zur Senkung der Kosten fur ¨ Verbrauchsmaterialien und Reagenzien. Zur parallelen Auswertung eignet sich vor allem die optische Detektion. Ob in der Spektroskopie oder in der Bildgebung, die Turbidimetrie, Fluorimetrie und Kolorimetrie sind die am h¨aufigsten angewandten Verfahren. Diese Art der Detektoren ist relativ kostengunstig ¨ und realisiert in einem “array” konnen ¨ sie die einzelnen Proben separat aufzeichnen. Jede Methode erfordert jedoch fur ¨ den Einsatz in HighThroughput-Screening-Verfahren ein individuell angepasstes Design. Konventionell wird zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit potenzieller Antiinfektiva das Mikrodilutionsverfahren nach DIN-Vorschrift (DIN 58940) [2] angewandt. Es handelt sich dabei um ein Dilutionsverfahren mit turbidimetrischer Auswertung, das in Mikrotiterplatten durchgefuhrt ¨ wird und die antimikrobielle Wirkung 26 1. Einleitung durch den MIC(minimum inhibitory concentration)-Wert charakterisiert. Dieser entspricht der Wirkstoffkonzentration, ab welcher gerade kein sichtbares Zellwachstum, d. h. keine Trubung ¨ mehr zu erkennen ist. In anderen antimikrobiellen Testverfahren auf der Basis der Fluorimetrie und Kolorimetrie wird die Aktivit¨at einer Substanz zumeist als ED50 (effective dose, 50%)-Wert angegeben. Die Variable wird h¨aufig auch als IC50 (inhibitory concentration, 50%)- oder EC50 (effective concentration, 50%)-Wert bezeichnet und definiert diejenige Wirkkonzentration, die zu einer halbmaximalen Inhibition oder Abtotung ¨ fuhrt. ¨ Sowohl bei der turbidimetrischen Detektion als auch bei den meisten fluorimetrischen oder kolorimetrischen Methoden wird jedoch die Gesamtzellzahl erfasst, wodurch eine Differenzierung der antimikrobiellen Wirksamkeit in statisch und toxisch nicht moglich ¨ ist. In der Bakteriologie erfolgt diese meist in einem zweiten Schritt durch Ausz¨ahlung koloniebildender Einheiten (colony forming units, CFU) auf Agarplatten, in der Parasitologie dagegen durch mikroskopische Betrachtung und Untersuchung der Erreger auf Beweglichkeit. Beide Verfahren sind sehr zeitintensiv und es besteht Bedarf an schnellen Testverfahren mit hoher Aussagekraft und Differenzierbarkeit. Ein weiterer Nachteil der optischen Detektion eines Probenarrays in Mikrotiterplatten ist die fehlende Moglichkeit ¨ senkrecht zum einfallenden Licht zu detektieren. Dadurch sind nephelometrische Methoden ausgeschlossen und fluorimetrische stark limitiert. Hinzu kommt, dass die Detektion des Lichtes aus einer Vertiefung durch Streulicht aus der Umgebung gestort ¨ werden kann, wodurch Interesse an alternativen Detektionsmethoden besteht. 27 Kapitel 2 Problemstellung und Ziele der Arbeit Wie in Kapitel 1 bereits beschrieben ist die Arzneimitteltherapie der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis problematisch. Sie ist auf dem Stand der 60er Jahre stehen geblieben und es existieren keine probaten neuen Arzneistoffe. Aufgrund fehlender Rentabilit¨at zeichnet sich auf dem Gebiet der bakteriellen Infektionserkrankungen ein a¨ hnlicher Trend ab. Durch zunehmende Einstellung der Arzneistoffforschung und entwicklung ist auch hier die Therapiesicherheit gef¨ahrdet. Die notwendige Auffindung neuer Arzneimittel wird zunehmend in Public-PrivateKooperationen realisiert und erfordert neben der Synthese neuer Verbindungen zuverl¨assige High-Throughput-Screening-Verfahren zur Identifizierung potenzieller Leitstrukturen. Diese Arbeit war eingebettet in den SFB 630, dessen Ziel in der “Erkennung, Gewinnung und funktionalen Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten” lag. Auf der Suche nach neuen Leitstrukturen zur Therapie der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis sollte w¨ahrend dieser Arbeit • ein robustes In-vitro-High-Throughput-Screening-Verfahren an den Blutstromformen des TC 221-Stammes von Trypanosoma brucei brucei etabliert werden, welches sich zum “screening” großer Substanzbibliotheken eignet. • eine Vielzahl von Substanzen, die im Rahmen der verschiedenen Teilprojekte synthetisiert und isoliert wurden, auf ihre Wirksamkeit gegen Trypanosomen getestet werden. • Struktur-Wirkungs-Beziehungen analysiert werden, die zur weiteren Optimierung der antiparasit¨aren Wirkung bereits getesteter Substanzen beitragen sollen. Neben der zielgerichteten Suche nach neuen Antiinfektiva standen aber auch die Technologie und die Methodik an sich im Interesse des SFBs. Zur Evaluation der antiinfektiven Wirksamkeit neu synthetisierter Substanzen sollte nicht nur auf bekannte Methoden zuruckgegriffen ¨ werden, sondern auch die Innovationen der letzten Jahre auf 28 2. Problemstellung und Ziele der Arbeit dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (capillary elektrophoresis, CE) und der magnetischen Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR) zur Entwicklung neuer “in-vitro-whole-cell-bioassays” genutzt werden. Ziel war es Alternativen und Erg¨anzungen zum Mikrodilutionsverfahren nach DIN (DIN 58940), dem konventionell zur Testung an Bakterien angewandten HighThroughput-Verfahren, zu entwickeln. Dieses Verfahren beruht ausschließlich auf der Bestimmung der Gesamtzellzahl einer Bakterienkultur unter Exposition verschiedener Testsubstanzen mittels optischer Detektion und erlaubt keine Aussage uber ¨ die Art der antimikrobiellen Wirkung . Erst in einem zeitaufw¨andigen zweiten Schritt kann durch Ausz¨ahlen koloniebildender Einheiten zwischen bakteriostatischer und bakterizider Wirksamkeit unterschieden werden. In der Kapillarelektrophorese boten vor allem die Arbeiten von Armstrong und Mitarbeitern neue Perspektiven [13–15, 77, 240]. Es gelang sowohl die simultane kapillarelektrophoretische Trennung, Identifizierung, Quantifizierung und Charakterisierung von Bakterien und deren Agglomeraten, ohne die Mikroben bei der Messung signifikant zu sch¨adigen [86], als auch die Aufzeichnung der Elektropherogramme mittels Fluoreszenz-Detektion zur Unterscheidung lebender und toter Bakterienzellen nach Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid. Mit der Kapillarelektrophorese bestand somit ein Potenzial, durch Trennung von Agglomeraten und Ketten unter¨ schiedlicher Große ¨ bakterienspezifische “fingerprints” zu erstellen und deren Anderung unter dem Einfluss zytotoxischer Substanzen im Kontext mit der lebend/totRate der Bakterienpopulation zu diskutieren. Dadurch konnte ¨ innerhalb 15 Minuten die Wirksamkeit der Testsubstanzen differenziert bestimmt werden. Da die CE Mikroben gleichzeitig trennen und quantifizieren kann, sollte der Einfluss antiinfektiver Wirksubstanzen in einem Ansatz messbar sein, wodurch der Durchsatz des Testverfahrens erheblich gesteigert werden kann. Da bisher die antibiotische Wirksamkeit mittels SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung noch nicht bestimmt worden ist, waren Messungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Leseger¨at (FMR) mit eingeschlossen. Der Aufbau des Test-Verfahrens auf der Grundlage der CE implizierte: • Die zielorientierte Auswahl verschiedener Bakterienspezies und deren Kulturaufbau. • Die Untersuchung elektrophoretischer Eigenschaften von Mikroben und die Analyse physikalisch-chemischer Einflussfaktoren zum Verst¨andnis der kapillarelektrophoretischen Mikroben-Analyse. Da zu diesem Zeitpunkt im Arbeitskreis noch keine Erfahrung in der kapillarelektrophoretischen Charakterisierung von Biokolloiden bestand, musste zun¨achst eine dafur ¨ geeignete CE-Methode etabliert werden. 29 • Die Standardisierung einer CE-Methode zur Trennung, Identifizierung, Charakterisierung, Quantifizierung von Mikroorganismen und die Erstellung charakteristischer “fingerprints”. • Die Prufung ¨ von Moglichkeiten ¨ und Grenzen der CE-Methode. • Die Validierug der Fluoreszenzmarkierung von Bakterien mit den beiden DNAMarkern SYTO9 und Propidiumiodid am FMR und an der CE (mit Laserinduzierter-Fluoreszenz-Detektion, LIF-CE) zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation und zur Bestimmung ihrer lebend/tot-Rate. • Die Standardisierung der Zytotoxizit¨atsbestimmung verschiedener Antibiotika mit unterschiedlichem Wirkmechanismus mittels FMR und LIF-CE. Eine weitere nicht invasive Methode zur Untersuchung von Zellkulturen stellt die magnetische Kernresonanz dar. Bereits 1972 wurden die ersten Studien zum Metabolismus an lebenden Hefezellen mittels NMR-Spektroskopie durchgefuhrt ¨ [85]. Hinzu kommt, dass die NMR-Spektroskopie zunehmend zum “screening” von Wirkstoffen (Ligand-Protein-Wechselwirkungen [114]) und zur klinischen Untersuchung von Wirkstoffen gegen Infektionen in verschiedenen Wirtszellen in vitro und in vivo eingesetzt wird [79, 120]. Auch konnte im Bildgebungsexperiment die transversale Relaxation als NMR-Parameter identifiziert werden, welcher sensitiv auf wachstumsbedingte ¨ Anderungen in Bakterienkulturen reagiert [192]. Von diesen Tatsachen ausgehend, sollte ein Test-Verfahren potenzieller Wirkstoffe auf Basis der CPMG-pr¨aparierten magnetischen Kernresonanztomographie entwickelt werden. Die Etablierung der Methode beinhaltet: • Die Untersuchung der Anwendungsbreite der T2 -Parametrisierung des mikrobiellen Wachstums. • Die Quantifizierung und Interpretation der einzelnen Beitr¨age zur wachs¨ tumsbedingten T2 -Anderung durch Kombination von NMR-Spektroskopie undBildgebung, wobei Untersuchungen zum Energie- und Aminos¨aurestoffwechsel und zur Proteinkonzentration enthalten sind. • Die Quantifizierung der antibiotischen Wirksamkeit. Sowohl bei der CE- als auch bei der NMR-Methode sollte durch Vergleich der Daten mit denen aus konventionellen mikrobiologischen Standardtechniken Anwendungsbreite und Grenzen aufgezeigt werden. 30 3. Theoretische Grundlagen Kapitel 3 Theoretische Grundlagen 3.1 Mikroorganismen Mikroorganismen, auch Mikroben genannt, gelten als die kleinsten, mikroskopisch darstellbaren Lebewesen. Zu ihrer Gruppe z¨ahlen unter anderem Bakterien, Algen, Pilze, Hefen und Protozoen. Viren werden trotz ihrer geringen Große ¨ nicht den Mikroorganismen zugeordnet. Sie sind nicht in der Lage sich selbstst¨andig zu reproduzieren, sondern sind auf Stoffwechselleistungen ihrer Wirtszellen angewiesen. Unter den Mikroorganismen gibt es zwei Grundformen der Zellorganisation: Pro- und Eukaryoten, deren Unterscheidungsmerkmale in der Zellkompartimentierung liegen [101]. Da im Rahmen dieser Arbeit analytische Verfahren fur ¨ Bakterien angewandt und entwickelt werden, wird auf die Gruppe der Prokaryoten insbesondere eingegangen. 3.2 Prokaryoten Die Familie der Prokaryoten definiert sich durch einen freien nicht von einer Kernmembran umgebenen Zellkern, dem sogenannten Nucleoid, welcher aus einem zirkul¨aren gekn¨auelten DNA-Molekul ¨ besteht. Die Zelle bildet in der Regel keine Kompartimentierung in Organellen aus, so dass sie im Wesentlichen aus Zellwand, Cytoplasmamembran, Cytoplasma mit Ribosomen und Nucleoid besteht. Mitglieder dieser Familie sind Bakterien (Bakteria) einschließlich Actinomyceten und Cyanobakterien, welche zur Gruppe der Archaeen gehoren. ¨ Traditionell wird die Bezeichnung “Bakterien”, abgeleitet vom griechischen Wort “bakterion”= St¨abchen, fur ¨ alle zu den Prokaryoten gehorenden ¨ Organismen verwendet. Die meisten Bakterien besitzen eine Große ¨ zwischen 1 und 5 µm und liegen damit im oberen Großenbereich ¨ von Kolloiden [129]. Die Anwendung analytischer Methoden auf Bakterien unterliegt somit den Gesetzen der Kolloidchemie (Abschnitt 3.2.2). 3.2 Prokaryoten 31 3.2.1 Klassifikation Bakterien werden h¨aufig aufgrund ihrer Form und Organisation eingeteilt. Die folgenden morphologischen und stoffwechselphysiologischen Gesichtspunkte gelten dabei als Kriterium [237]: • Drei Grundformen: Kokken, St¨abchen, Schrauben. Diese Grundformen konnen ¨ einzeln auftreten oder sich zu typischen Formen (Cluster, Ketten) zusammenfugen. ¨ • Vier Haupttypen der Begeißelung: monotrich, monopolar polytrich, bipolar polytrich und peritrich. • Die Ausbildung von Kapseln und Schleimen, die uberwiegend ¨ aus Polysacchariden und Polypeptiden bestehen. • Die Lebensweise insbesondere der Stoffwechsel und die Umweltbedingungen wie N¨ahrstoffe, pH-Wert, Temperatur und Sauerstofftoleranz. • Der Aufbau der Zellwand, der aufgrund der Gram-F¨arbung identifiziert wird. Auf die letzten drei Gesichtspunkte wird im nachfolgenden n¨aher eingegangen. Sie spielen neben der Grundform der Bakterienzelle eine zentrale Rolle bei der Methodenentwicklung zur Charakterisierung verschiedener Bakterienst¨amme mittels Kapillarelektrophorese und MRI (magnetic resonance imaging) und der daraus abgeleiteten Etablierung von Testsystemen zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit potenzieller Wirksubstanzen. 3.2.1.1 Zellwand Die Bakterienzellwand determiniert die Form und Festigkeit der Zelle und stellt einen Schutz vor Pathogenen einschließlich Bioziden und Antibiotika dar [115, 173, 186]. Nach ihrem Verhalten bei dem von C. Gram entwickelten F¨arbeverfahren [110] unterscheidet man zwischen Gram-positiven (blau gef¨arbte) und Gram-negativen (rot gef¨arbte) Bakterien. Unterschiedliche bakterielle Oberfl¨achenstrukturen sind fur ¨ diese Unterscheidung verantwortlich. Diese sind neben morphologischen Eigenschaften auch fur ¨ spezifische Immunreaktionen maßgeblich und bestimmen die Oberfl¨achenladung, sowie das Verhalten im elektrischen Feld [77]. 3.2.1.1.1 Gram-negative Bakterien Die Zellwand Gram-negativer Bakterien (Abbildung 3.1) besteht aus einer dunnen ¨ bis 10 nm dicken Mureinschicht (Peptidoglycanlayer, geknupft ¨ aus N-Acetylmuramins¨aure, N-Acetylglucosamin und verschiedenen Aminos¨auren), die von einer zweiten 32 3. Theoretische Grundlagen Abbildung 3.1: Zellwandaufbau Gram-negativer Bakterien. Charakteristisch ist die dunne ¨ Mureinschicht und die a¨ ußere Membran, deren a¨ ußeres Blatt uber¨ wiegend aus Lipopolysacchariden besteht. Alle anderen Membranen werden von Phospholipiden gebildet. In die Membran sind Proteine integriert [143]. Zellmembran, der a¨ ußeren Membran (outer membrane, OM) bedeckt ist. Diese ist mit der Mureinschicht uber ¨ die “outer membrane proteins” (OmpA) und das MureinLipoprotein verbunden. Sie besteht im Wesentlichen aus Lipopolysacchariden (LPS), Proteinen und Phospholipiden [232]. Viele Proteine so z.B. das OmpF fungieren als Porine, uber ¨ welche Losungen ¨ in die Zelle diffundieren konnen ¨ [222]. Die Lipopolysaccharide, welche aufgrund ihrer pathophysiologischen Wirkung auf den Organismus auch als Endotoxine bezeichnet werden [82,219], bestehen aus dem Lipoid A (Zytokininduktor), dem Kern-Polysaccharid (Core) und der O-spezifischen Polysaccharidkette (das O-Antigen) und verleihen den Bakterien in w¨assriger Losung ¨ ihre Oberfl¨achenladung [77]. 3.2.1.1.2 Gram-positive Bakterien Gram-positive Bakterien haben im Vergleich zu den Gram-negativen einen relativ einfachen Zellwandaufbau (Abbildung 3.2b). Sie besitzen eine 20-80 nm dicke Mureinschicht aus bis zu 40 Mureinlagen. In dieser sind verschiedene Lipoteichon- und Teichons¨auren kovalent gebunden. Diese sind meist Polymere aus Ribitol- oder Glycerolphosphaten (Abbildung 3.2a), geknupft ¨ an Glycosyl oder D-Alaninesterresten und stellen die Haupbestandteile der Zellwand dar. Sie ragen in die Umgebung und aktivieren z.B. das Komplementsystem oder Makrophagen. Daneben sind in der Zellwand verschiedene Polysaccharide und Proteine zu finden. Letztere sind fur ¨ die Adh¨arenz und die Pathogenit¨at verantwortlich [232]. 3.2 Prokaryoten 33 (a) Strukturen der Glycerin- (b) Charakteristisch ist die Dicke der Mureinschicht, sowie die darin und Ribitol-Teichons¨aure, mo- kovalent gebundenen Lipoteichon- und Teichons¨auren [143]. difiziert nach [236]. Abbildung 3.2: Zellwandaufbau Gram-positiver Bakterien. Am Beispiel von E. coli und S. aureus konnte z. B. gezeigt werden, dass die Lipopolysaccharid-Schicht Gram-negativer Bakterien (E. coli) bei gleicher Elektrolytumgebung im Vergleich zur Peptidoglycan-Schicht Gram-positiver Bakterien (S. aureus) zu einer negativeren Oberfl¨achenladung fuhrt ¨ [151]. 3.2.1.2 Stoffwechsel aerober und anaerober Bakterien Die Lebensweisen von Bakterien sind vielf¨altig und ihre Klassifizierung erfolgt h¨aufig aufgrund ihrer unterschiedlichen Milieubedingungen wie z. B. der Wasseraktivit¨at, der N¨ahrstoffe, des pH-Wertes, der Temperatur und der Sauerstofftoleranz. Letztere definiert den Stoffwechseltypus, womit eine Unterscheidung zwischen Aerobiern und Anaerobiern ermoglicht ¨ wird. Der Gesamtstoffwechsel der Bakterien gliedert sich in die beiden Bereiche Katabolismus, der Energiegewinnung, und den Anabolismus, in dem aus einfachen Vorstufen biologische Makromolekule ¨ unter Energieverbrauch synthetisiert werden. Fur ¨ den Aufbau der Zellsubstanz sind unter anderem Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Wasserstoff, Phosphor, Schwefel, Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen notwendig. Je Bakterium konnen ¨ dabei unterschiedliche Quellen verwendet werden. Die katabolen Reaktionen und damit die Verarbeitung organischer N¨ahrsubstrate zur Herstellung der Grundbausteine fur ¨ die Synthese der Zellsubstanz erfolgt uber ¨ eine vielf¨altige Reihe enzymatischer Prozesse. Glucose stellt eine der wichtigsten C-Quellen der katabolen Reaktionen dar [237]. Aerobe Bakterien benotigen ¨ fur ¨ die Oxidation des 34 3. Theoretische Grundlagen Zuckers Sauerstoff, weisen eine hohe Energieausbeute auf und oxidieren das organische Substrat vollst¨andig zu CO2 und H2 O. Fur ¨ anaerobe Bakterien hingegen kann der Sauerstoff toxisch sein. Sie spalten den Zucker nur enzymatisch und haben dabei eine sehr geringe Energieausbeute. Bei der Fermentation entstehen je nach Art der Spaltung G¨arungsendprodukte wie Ethanol, Milchs¨aure, Essigs¨aure, Propions¨aure, Ameisens¨aure, Bernsteins¨aure. 3.2.2 Kolloidchemie Das Wort Kolloid stammt aus dem Griechischen “κoλλα”=Leim, womit eine charakteristische Eigenschaft der Kolloide, eine trube, ¨ leimartige Beschaffenheit aufzuweisen, beschrieben wird. Dem Vorschlag der “International Union of Pure and Applied Chemistry” (IUPAC) von 1971 folgend, werden Kolloide als Objekte definiert, bei denen mindestens eine Dimension im Bereich von 1 nm bis 1000 nm liegt, womit Bakterien eingeschlossen sind [128]. Aus dieser Dimension ergeben sich Eigenschaften, die das Verhalten von Bakterien im Strahlengang, in flussigem ¨ Medium oder im elektrischen Feld, bestimmen. Die geringe Dimension fuhrt ¨ z. B. zu einem sehr großen Verh¨altnis von Oberfl¨ache zu Volumen, so dass die Oberfl¨acheneigenschaften gegenuber ¨ den Festkorpereigenschaften ¨ dominieren und damit chemisches Verhalten und Reaktionen bestimmen [129]. Wie in den vorherigen Kapiteln beschrieben, besteht die Bakterienhulle ¨ großten ¨ Teils aus Aminos¨auren, Zuckerderivaten und Glykolipiden, welche aufgrund dissoziierbarer und reaktiver funktioneller Gruppen (-OH, -COOH, OPO3 H, oder -SH) geladen sein konnen. ¨ In aquatischem Medium weisen diese Biokolloide meist eine negative Oberfl¨achenladung auf. Zwei unterschiedliche Mechanismen konnen ¨ zur Entstehung der Oberfl¨achenladung beitragen: • Ionisierung der Oberfl¨achengruppen als Ergebnis der Protonierung oder Deprotonierung basischer oder azider Oberfl¨achenmolekule. ¨ Der Ionisierungsgrad der Oberfl¨ache ist vom pH-Wert des Mediums abh¨angig. Dementsprechend ist die Ladung negativ fur ¨ hohe pH-Werte und positiv fur ¨ niedrige pH-Werte. Die Chemie der a¨ ußeren Zellwand Gram-positiver und -negativer Bakterien unterscheidet sich. Es ist die uberwiegend ¨ in den Zellw¨anden Gram-positiver Bakterien auftretende Teichons¨aure, die den Zellen eine negative Ladung bei pH-Werten ≥ 5 verleiht, w¨ahrend die Oberfl¨achenladung Gram-negativer Bakterien durch die Lipopolysaccharide der a¨ ußeren Membran bestimmt wird [77]. • Adsorption von Ionen aus der umgebenden Losung ¨ [239]. Die elektrostatisch wirksamen Oberfl¨acheneigenschaften von Biokolloiden lassen sich durch ihr elektrophoretisches Verhalten in einem a¨ ußeren elektrischen Feld bestimmen. 3.2 Prokaryoten 35 3.2.2.1 Zeta-Potenzial Geladene kolloidale Partikel bilden in w¨assrigen Losungen ¨ eine Solvathulle ¨ aus, in welcher dipolare Wassermolekule ¨ und Gegenionen nahe der geladenen Oberfl¨ache des Kolloids akkumulieren und eine elektrische Doppelschicht bilden [77]. Hier lagern sich zun¨achst festgebundene Ionen an der Partikeloberfl¨ache an (Helmholtz-Schicht), gefolgt von weiteren Ionen, die zu einer lockeren, diffusen Schicht fuhren. ¨ Dadurch erscheint das Partikel in großer Entfernung elektrisch neutral. Die elektrische Doppelschicht bildet die Grundlage aller elektrokinetischen Ph¨anomene unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes [136, 164, 234]. Bewegt sich ein Partikel in flussigem ¨ Medium, bildet sich durch Reibungskr¨afte in der diffusen Schicht eine Scher-Ebene aus. An ihr ist die Geschwindigkeit der umgebenden Flussigkeit ¨ relativ zum Partikel null [193]. Durch die Aufspaltung der diffusen Schicht in einen bewegten und einen unbewegten Teil, erscheint das Partikel nicht mehr elektrisch neutral, sondern besitzt wieder ein Potenzial, welches als Zeta-Potenzial ζ an der Scher-Ebene wie folgt definiert wird [129]. q (3.1) ζ= 4·π·ε·a q : Ladung des Teilchens ε : Dielektrizit¨atskonstante a : Teilchenradius r plus bewegter elektrischer Doppelschicht Das Zeta-Potenzial ist damit abh¨angig von den Oberfl¨acheneigenschaften der Teilchen, die z. B. vom pH und der Konzentration der Elektrolyten beeinflusst werden [129]. Die Theorie der elektrischen Doppelschicht nach Gouy, Chapman, Debye und Huckel, ¨ welche sp¨ater nach Stern modifiziert wurde, ist in Abbildung 3.3 veranschaulicht [88]. Nach diesem Modell f¨allt das Potenzial im Bereich der Helmholtz-Schicht linear, in der diffusen Schicht exponentiell. Die Debye-L¨ange ( κ1 ) definiert dabei die charakteristische L¨ange, auf welcher das Potenzial des elektrischen Feldes auf des 1e -fache abgefallen ist. Sie wird h¨aufig auch als Dicke der Doppelschicht bezeichnet und ist durch folgende Gleichung definiert [88]: 1 1 =q 2 κ 1000e NA P 2 zi ci ekT e : Elementarladung NA : Avogadrokonstante k : Boltzmann-Konstante T : absolute Temperatur in Kelvin zi : Ladungszahl des Ions ci : Konzentration des Ions (3.2) 36 3. Theoretische Grundlagen BulkLösung Diffuse Schicht HelmholtzSchicht + - Gouy-Ebene + Scher-Ebene - Stern-Ebene + Partikeloberfläche 1/ : Debye-Länge, Dicke der Doppelschicht : Zeta-Potenzial + - - + + + + - + + + ++ + + + + + - - ++++ + + - - - ++ + + + - + + -- - --- + + + ++ - + + + + + + + + ++ + + + + + - + κ ς Stern-Ebene: Abgrenzung zur diffusen Schicht Gouy-Ebene: Definiert 1/ 1/ κ Potenzial ς κ Abstand von der Partikeloberfläche Abbildung 3.3: Modell der elektrischen Doppelschicht, modifiziert nach [88]. P Mit der Ionenst¨arke I = 21 zi2 ci ist folglich die reziproke Debye-L¨ange κ direkt pro√ portional zu I. Die Eigenschaften und die Dicke der elektrischen Doppelschicht ¨ sind von großer Bedeutung, denn die Uberlappung ihrer diffusen Schichten bestimmen die Interaktionen zwischen geladenen Partikeln. Leider ist es nicht moglich ¨ das Stern-Potenzial direkt zu messen, so dass das Zeta-Potenzial, welches experimentell bestimmt werden kann, h¨aufig als Maß fur ¨ das Oberfl¨achenpotenzial verwendet wird. 3.2.2.2 Elektrophoretische Mobilit¨at Die elektrophoretische Mobilit¨at µ der geladenen kolloidalen Partikel, d. h. die Partikelgeschwindigkeit pro angelegter elektrischer Feldst¨arke, ist proportional zum ZetaPotenzial ζ des Partikels. Außerdem wird die Mobilit¨at noch von einer Reihe weiterer Faktoren wie der Oberfl¨achenladungsdichte, des pH-Wertes, der Elektrolytkonzentration (Ionenst¨arke), der Dielektrizit¨atskonstante des Mediums und seiner Viskosit¨at, der Temperatur und der Partikelgeometrie und -große ¨ beeinflusst [234]. Dadurch tr¨agt die Dicke der Doppelschicht auch zur Mobilit¨at kolloidaler Partikel bei. Die einfachste mathematische Beschreibung der elektrophoretischen Mobilit¨at kolloidaler Partikel stellt die Theorie von Smoluchowski dar [275]: µ= εr ε0 ζ η (3.3) 3.2 Prokaryoten 37 εr : Dielektrizit¨atskonstante des Mediums ε0 : Dielektrizit¨atskonstante des Vakuums η : Viskosit¨at der Elektrolytlosung ¨ ζ : Zeta-Potenzial Diese Formel beschreibt die Mobilit¨at großer Kolloide ohne Berucksichtigung ¨ der Form, solange die Dimension des Partikels sehr viel großer ¨ als die Debye-L¨ange ist. Dadurch kann die Partikeloberfl¨ache lokal als planar angenommen werden. Fur ¨ eine Kugel mit Radius r ergibt sich somit die Bedingung: κr ≫ 1 [193]. Die physikalischen Zusammenh¨ange sind hier idealisiert und basieren auf den folgenden Vereinfachungen [9, 133]: 1. Das Partikel ist kugelformig, ¨ starr und nicht leitend. 2. Die umgebende Flussigkeit ¨ geht keine Wechselwirkungen ein. 3. Das Zeta-Potenzial ist uber ¨ die gesamte Partikeloberfl¨ache gleich. Diese Forderungen haben zur Folge, dass die elektrischen Ladungen bei einem nichtleitenden, starren Partikel auf der Oberfl¨ache lokalisiert sein mussen. ¨ Es wird angenommen, dass entweder das Potenzial oder die Ladungsdichte auf der Oberfl¨ache der Partikel unver¨andert bleibt. Fur ¨ eine Zelle werden diese SmoluchowskiForderungen jedoch unrealistisch, da die Zellmembran mit ihren dissoziierbaren funktionellen Gruppen ein “dynamisches System” darstellt. Auf diese Weise wird zum einen die Oberfl¨achenladung durch den Dissoziationsgrad funktioneller Gruppen reguliert [61–64, 118, 187], zum anderen ist die Oberfl¨ache einer Zelle fur ¨ Elektrolyte oft durchdringbar. Jedoch wird uber ¨ diese Tatsachen oft hinweg gesehen, um eine einfachere mathematische Behandlung zu ermoglichen ¨ [282]. Aus diesem Grund soll an dieser Stelle auf die mathematischen Formulierungen der Modelle polymerbeschichteter Partikel [81, 193, 194, 241] verzichtet werden. 3.2.2.3 Stabilit¨at Stabile Kolloide a¨ ndern w¨ahrend einer Beobachtungsphase den Dispersionsgrad nicht. Dagegen neigen instabile kolloidale Losungen ¨ zum Agglomerieren und beginnen ab einer kritischen Kolloidgroße ¨ zu sedimentieren. Ursache sind die relativ großen Oberfl¨achen dispergierter Kolloide mit einer hohen Oberfl¨achenenergie. Durch Agglomeration wird die Oberfl¨achenenergie herabgesetzt und ein thermodynamisch stabilerer Zustand erreicht [128, 257]. Zur Kolloidstabilit¨at kommen zwei grundlegend verschiedene Mechanismen in Betracht [111, 128]: 38 3. Theoretische Grundlagen Abbildung 3.4: Stabilit¨at kolloidaler Losungen ¨ in Abh¨angigkeit von der Oberfl¨achenladung (A) und der Ionenst¨arke (B), modifiziert nach [128]. • Sterische Stabilisierung: Die Adsorption von Polymeren an die Kolloidoberfl¨ache fuhrt ¨ zu einer abstoßenden Wechselwirkung, da ein Kolloid-Kolloid-Kontakt die Polymerschichten komprimieren musste. ¨ • Elektrostatische Stabilisierung: Wie in Abbildung 3.4 dargestellt, fuhren ¨ eine hohe Oberfl¨achenladung und eine geringe Ionenst¨arke zu einem flachen Abfall des Potenzials in der diffusen Doppelschicht und somit zu stabilen kolloidalen Losungen, ¨ w¨ahrend niedrige Oberfl¨achenladungen und hohe Ionenst¨arken den Potenzialabfall beschleunigen und folglich eine geringe oder vollst¨andig fehlende Energiebarriere verursachen. 3.2.2.4 Wechselwirkung zwischen Licht und Materie Lichtschw¨achung beim Durchgang durch Materie findet ihre Ursache in elastischen und inelastischen Streuprozessen. Als Lichtstreuung bezeichnet man die Wechselwirkung von Photonen an einem Ensemble von Atomen, Molekulen, ¨ Kolloiden, Staubpartikeln, Kristalliten etc. Durch Reflexion, Brechung, Beugung und Absorption a¨ ndert 3.2 Prokaryoten 39 sich meist die Intensit¨at, Polarisation und Richtung des einfallenden Lichtstrahles. W¨ahrend bei elastischer Streuung kein Energietransfer zwischen Lichtquanten und streuender Materie stattfindet und somit nur eine Impuls¨anderung der einfallenden Strahlung auftritt, wird bei der inelastischen Streuung zun¨achst Energie vom beteiligten Molekul ¨ absorbiert und darauffolgend in Form eines Lichtquantes anderer Energie wieder abgestrahlt. Fur ¨ die elastische Streuung existieren im Falle der Einzelstreuung (hier streuen die Teilchen unabh¨angig von einander unter der Voraussetzung, dass der mittlere Teilchenabstand mindestens dem doppelten Durchmesser der Teilchen entspricht) zwei strenge Theorien [202]: • Rayleigh-Streuung: bei Streuung an Molekulen, ¨ die klein sind gegen die Wellenl¨ange λ: d. h. 2πr/λ < 0.1 [148]. • Mie-Streuung: bei Streuung an isotropen, kugelformigen ¨ Teilchen beliebiger Große ¨ unter der Bedingung: 2πr/λ ≥ 10) [148, 177, 270], wobei r der Teilchenradius ist. Tritt Licht durch eine kolloidale mikrobielle Losung, ¨ so ist die Mie-Streuung der zur Lichtabschw¨achung fuhrende ¨ dominierende Prozess. Absorptionsprozesse aufgrund von Oberfl¨achenmolekulen ¨ konnen ¨ vernachl¨assigt werden [23]. Die gesamte Lichtschw¨achung beim Durchgang durch eine Probe wird als Extinktion E, oder als optische Dichte (OD) bezeichnet und ist uber ¨ den Anteil der transmittierten Lichtmenge T definiert. E(λ) = OD(λ) = −logT (λ) = −log I I0 (3.4) T : transmittierte Lichtmenge I : Intensit¨at des austretenden Lichtes I0 : Intensit¨at des eingestrahlten Lichtes Unter der Annahme, dass die Lichtschw¨achung ausschließlich durch elastische Streuung verursacht wird, verringert sich die Lichtintensit¨at I0 beim Durchgang durch eine Probe der Konzentration c und der Schichtdicke x, in Analogie zum LambertBeerschen Gesetz exponentiell (Abschnitt 3.3.1): I = I0 e−sn cx sn : naturlicher ¨ Streukoeffizient c : Zelldichte x : Schichtdicke (L¨ange des Lichtweges durch die Suspension) (3.5) 40 3. Theoretische Grundlagen 3.2.2.5 Praktische Anwendung: Turbidimetrie Aufgrund von Streuprozessen erscheint eine Bakteriensuspension bereits ab einer Konzentration von 107 Zellen/ml mit dem Auge wahrnehmbar trube. ¨ Im Labor werden fur ¨ Trubungsmessungen, ¨ die h¨aufig zur Bestimmung der Zellkonzentration und -masse dienen, meist die prim¨ar fur ¨ die Absorptionsphotometrie konstruierten Photometer verwendet. Bei der Messung mussen ¨ folgende Einflussfaktoren beachtet werden, um mogliche ¨ Fehlerquellen auszuschließen [23]: • Wellenl¨ange: Ist , Streuintensit¨at ) zeigt im Falle der Die gestreute Strahlungsleistung ( I0 , Intensit¨ at des einfallenden Lichtes −4 Rayleigh-Streuung bezuglich ¨ der Wellenl¨ange λ eine λ -Abh¨angigkeit. Mit zunehmender Partikelgroße ¨ wird der Exponent der λ-Abh¨angigkeit großer, ¨ bis die Streustrahlung von λ unabh¨angig wird. Bei kugelformigen ¨ Bakterien oder kurzen St¨abchen verh¨alt sich die gestreute Strahlungsleistung proportional zu λ−2 bei langen, dunnen, ¨ zuf¨allig orientierten St¨abchen dagegen zu λ−3 [23, 147]. Desweiteren nimmt der Streuwinkel mit großer ¨ werdender Wellenl¨ange zu. Insgesamt besitzt die Auswahl der Wellenl¨ange und die spektrale Reinheit der Messstrahlung jedoch bei der Trubungsmessung ¨ im Vergleich zur Absorptionsmessung eine geringere Bedeutung. • Ausrichtung der Zellen in der Kuvette: ¨ Wird durch Schutteln ¨ oder Ruhren ¨ eine Stromung ¨ in der Kuvette ¨ erzeugt, so richten sich st¨abchenformige ¨ Zellen aufgrund der inneren Reibung vertikal aus, wodurch es zu einer optischen Anisotropie und Zunahme der Extinktion kommt. • Zelldichte: ¨ Uberschreitet die Extinktion einer Zellsuspension einen Wert von 0.5, dann weicht mit zunehmender Zelldichte die gemessene Extinktion mehr und mehr von dem nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz zu erwartenden Wert ab. Die Extinktion f¨allt in diesem Fall zu gering aus. Ursache ist die durch die Mie-Theorie begrundete ¨ antisymmetrische Winkelverteilung der Streuintensit¨at mit bevorzugter Vorw¨artsstreuung, wodurch neben der geschw¨achten Prim¨arstrahlung auch ein Teil des Streulichtes in den Detektor f¨allt. Ferner gilt fur ¨ das Verh¨altnis zwischen Konzentration und Extinktion die in der Absorptionsphotometrie beobachtete Abweichung von der Linearit¨at bei OD-Werten <0.2 (Abschnitt 3.3.1). • Zellzahl: Es hat sich gezeigt, dass nur bei konstanter durchschnittlicher Zellgroße ¨ ein linearer Zusammenhang zwischen Extinktion und Zellzahl pro ml besteht. Da dieser Fall bei den meisten Bakterienspezies aufgrund von Agglomerat- und Ketten- 3.3 Optische Spektroskopie an Molekulen ¨ 41 bildung nicht gegeben ist, liefert die Trubungsmessung ¨ lediglich einen Orientierungswert. Eine praktische Anwendung findet die Turbidimetrie in der Mikrobiologie zur Bestimmung von Wachstumskurven, welche den zeitlichen Verlauf der Zellproliferation beschreiben (Abbildung 3.5). Dabei passt sich der Zellstoffwechsel zun¨achst in der Anlaufphase an die N¨ahrstoffbedingungen an und die Zellen nehmen lediglich in ihrer ¨ Masse, nicht jedoch in ihrer Anzahl zu [143]. Uber die Beschleunigungsphase beginnt darauffolgend die Zellvermehrung exponentiell und endet nach mehreren Stunden in der station¨aren Phase. In dieser Phase, die mehrere Stunden bzw. Tage andauern kann, sind die Zellen noch vollst¨andig lebensf¨ahig, haben aber ihren Stoffwechsel und ihre Replikation eingestellt. Letztendlich mundet ¨ die Wachstumskurve in der Absterbephase, durch allm¨ahliches Lysieren der Zellen. Neben der vollst¨andigen Beschreibung einer Zellkultur kann die Turbidimetrie naturlich ¨ auch zur Absch¨atzung der Zellzahl einer Zellsuspension herangezogen werden. Abbildung 3.5: Typische OD-Wachstumskurve von Bakterien. 3.3 Optische Spektroskopie an Molekulen ¨ Die Grundlage der optischen Spektroskopie an Molekulen ¨ bildet in der Regel die inelastische Streuung von Licht am beteiligten Molekul. ¨ Dabei wird zun¨achst ein Lichtquant einer bestimmten Energie vom Molekul ¨ durch Anregung des Elektronensystems absorbiert und darauffolgend entweder ein Lichtquant kleinerer Energie wieder emittiert oder der angeregte Zustand strahlungslos deaktiviert. Damit Licht mit Molekulen ¨ in Wechselwirkung treten kann, mussen ¨ folgende Voraussetzungen erfullt ¨ sein [155]: • Resonanzbedingung: die Energie (hν) des absorbierten Photons muss genau der Energiedifferenz ∆E zwischen Grund- und angeregtem Zustand des beteiligten Elektrons entsprechen. 42 3. Theoretische Grundlagen Abbildung 3.6: JablonskiTermschema ohne Berucksich¨ tigung der Rotationsenergieniveaus: F: Fluoreszenz, P: Phosphoreszenz, IC: Internal Conversion, ISC: Intersystem Crossing, VR: Schwingungsrelaxation, Sx : Singulettzust¨ande, Tx : Triplettzust¨ande, modifiziert nach [198]. ¨ • Die Ubergangswahrscheinlichkeit muss ungleich null sein, d. h. es darf sich nicht ¨ um einen verbotenen Ubergang handeln. Die moglichen ¨ Elektronenuberg¨ ¨ ange in einem Molekul ¨ werden im sogenannten Jablonski-Termschema (Abbildung 3.6) veranschaulicht, wodurch die beteiligten Prozesse Absorption und Emission n¨aher beschrieben werden konnen. ¨ Zur Vereinfachung wurden keine Rotationsenergieniveaus eingezeichnet. Wird vom Molekul ¨ ein Lichtquant absorbiert, so fuhrt ¨ die Anregung meist in den ersten elektronisch angeregten Singulettzustand S1. Die Anregung des Molekuls ¨ in hohere ¨ elektronische Singulettzust¨ande (S2, S3) findet zum einen selten statt, zum anderen haben diese Zust¨ande eine sehr kurze Lebensdauer und gehen innerhalb von 10−12 s strahlungslos (Internal Conversion, IC) durch Wechselwirkung mit benachbarten Losungsmittelmolek ¨ ulen ¨ und Abgabe von Schwingungsenergie in den ersten elektronisch angeregten Singulettzustand S1 uber. ¨ Im Gegensatz zu Atomen zeigen Molekule ¨ jedoch keine definierten Absorptionslinien, sondern Absorptionsbanden, die bis zu 100 nm betragen konnen. ¨ Die Ursache liegt in den zahlreichen Freiheitsgraden des Molekuls, ¨ wodurch jedem elektronisch angeregten Zustand 30-50 Schwingungs- und Rotationszust¨ande uberlagert ¨ sind. Befindet sich ein Molekul ¨ im ersten elektronisch angeregten Zustand S1 , so gibt es verschiedene Moglichkeiten, ¨ den Grundzustand S0 wieder zu erreichen, d. h. zu relaxieren: • S1 → S0 + W¨arme (Internal Conversion): Diese Art der strahlungslosen Inaktivierung ist der h¨aufigste Relaxationsprozess. Hier wird die ubersch ¨ ussige ¨ Energie uber ¨ Wechselwirkungen mit der Umgebung in Form von W¨arme abgegeben. • S1 → S0 + hν (Fluoreszenz): Innerhalb von Nanosekunden geht der angeregte S1-Singulettzustand unter 3.3 Optische Spektroskopie an Molekulen ¨ 43 Emission eines Photons in ein Rotations-Schwingungs-Niveau des Grundzustandes S0 uber. ¨ Dadurch kann die Energie der emittierten Strahlung hochstens ¨ gleich der absorbierten Energie hν sein. ¨ • Eine weitere Moglichkeit ¨ zur Relaxation ist der strahlungslose Ubergang in einen Triplettzustand (Intersystem Crossing, ISC). Wegen der fehlenden Paarungsenergie der parallel stehenden Spins liegt dieser Zustand energetisch tiefer. Aufgrund ¨ ¨ der Anderung der Spinmultiplizit¨at ist dieser Ubergang formell verboten. Von hier aus relaxieren die Elektronen unter erneuter Spin-Umkehr in den Grundzustand S0 entweder 1. strahlungslos und unter Erzeugung von W¨arme (Internal Conversion): T1 → S0 + W¨arme oder 2. unter Aussendung eines Lichtquantes (Phosphoreszenz): T1 → S0 + hν 3.3.1 Absorption Das Maß der Lichtabsorption eines Molekuls ¨ wird durch den Absorptionskoeffizienten α(λ) im Lambert-Beerschen-Gesetz beschrieben: I = I0 e−α(λ)cx (3.6) I : Intensit¨at des austretenden Lichtes I0 : Intensit¨at des eintretenden Lichtes c : Konzentration α(λ) : Absorptionskoeffizient x : L¨ange des Absorptionspfades Dieser ist der Proportionalit¨atsfaktor zwischen der Schw¨achung dI eines Lichtstrahles und dem Produkt aus der nach Durchtritt durch die Probe noch vorhandenen Intensit¨at I, der Probenkonzentration c und der durchlaufenden Schichtdicke dx: −dI = α(λ) · I · c · dx (3.7) Dieser als Bouguer-Lambert-Gesetz bekannte Zusammenhang gilt jedoch nur fur ¨ monochromatisches, kollimiertes Licht und verdunnte ¨ Losungen ¨ [238]. Ist der Absorptionskoeffizient bekannt, kann durch Messung der Extinktion (E = −log II0 ) die Probenkonzentration c bestimmt werden. In der Praxis wird die Konzentrationsbestimmung 44 3. Theoretische Grundlagen mit Hilfe einer Kalibriergerade durchgefuhrt. ¨ Hierzu misst man die Absorption mehrerer Losungen ¨ unterschiedlicher, aber bekannter Konzentrationen, die den interessierenden Messbereich abdecken. Aufgetragen in einem Diagramm wird durch die Messpunkte nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate eine Ausgleichsgerade gelegt. Diese weist jedoch sowohl im sehr kleinen (0.1-0.2) als auch im sehr großen (> 0.8) Extinktionsbereich Abweichungen vom Lambert-Beerschen-Gesetz auf. Die Ursachen hierfur ¨ liegen zum einen in der Erfassungsgrenze und Empfindlichkeit des Detektors und zum anderen, vor allem bei hoherer ¨ Konzentration, in der zunehmenden Fehlstrahlung durch Streulicht [230]. 3.3.2 Fluoreszenz Wird das Elektronensystem eines Molekuls ¨ durch Lichtabsorption angeregt, gibt es neben der Fluoreszenzemission verschiedene Moglichkeiten ¨ in den Grundzustand zu relaxieren (Abbildung 3.6). D. h. nicht jedes absorbierte Photon wird in Form eines Photons wieder emittiert. Das Verh¨altnis der Anzahl der von einem Molekul ¨ emittierten Nem - zu absorbierten Nabs -Photonen beschreibt das Maß der Fluoreszenz und definiert die Quantenausbeute Q: Q= Nem Nabs (3.8) Die gesamte, vom Detektor erfasste Intensit¨at Iλ des Fluoreszenzlichtes kann durch folgende Beziehung beschrieben werden: Iλ ∼ α(λ) · I0 · Q · K (3.9) und ist damit proportional zu: • α(λ) (Absorptionskoeffizient) • I0 (Intensit¨at des Anregungslichtes) • Q (Fluoreszenzquantenausbeute) • K (Ger¨atekonstante) 3.3.3 Fluoreszenzloschung ¨ (”Quenching”) Wechselwirkungen zwischen dem angeregten Molekul ¨ und der Umgebung konnen ¨ das Maß der Fluoreszenz negativ beeinflussen. Eine dadurch bedingte Verringerung der Quantenausbeute bezeichnet man als Fluoreszenzloschung ¨ bzw. “Quenching”. Diese Loschprozesse ¨ beruhen entweder auf Energietransfer, Stoßloschung ¨ oder chemischen Reaktionen: 3.4 Kapillarelektrophorese 45 • Energietransfer: Hier wird die Anregungsenergie eines angeregten Molekuls ¨ (Donor) durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf ein Akzeptor-Molekul ¨ (Quench-Molekul) ¨ aus der r¨aumlichen Umgebung ubertragen, ¨ d. h. der Prozess erfordert keinen direkten Kontakt der beiden Partner. Das Quench-Molekul ¨ befindet sich im Vergleich zum Donor-Molekul ¨ in einem vergleichbaren oder niedrigeren Energiezustand und sein Absorptionsspektrum uberlappt ¨ mit dem Fluoreszenzspektrum des Donors [97, 256]. • Stoßloschung: ¨ Durch einen Stoßprozess kann die Anregungsenergie des einen Stoßpartners abgegeben werden, so dass sich beide Molekule ¨ im elektronischen Grundzustand befinden, jedoch Unterschiede in ihrer Schwingungs- und Rotationsenergie aufweisen. • Chemische Reaktion: Komplexbildung, Redoxreaktionen oder S¨aure-Base-Reaktionen konnen ¨ ebenfalls eine strahlungslose Deaktivierung des Anregungszustandes bewirken. ¨ Die treibende Kraft fur ¨ diese Reaktionen sind drastische Anderungen der Redoxpotenziale und pka -Werte des Fluorophors bei Anregung in den S1Singulettzustand. 3.4 Kapillarelektrophorese 3.4.1 Apparatur Die Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) ist eine elektrophoretische Trenntechnik, bei der kleine geladene Molekule ¨ und Biokolloide wie DNA, Proteine oder Mikroorganismen unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes getrennt werden konnen. ¨ Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit und -richtung der Teilchen in mit Puffer gefullten ¨ Quarzkapillaren (amorphes SiO2 ) [87]. Diese sind außen mit Polyimid beschichtet, um das Brechen der Kapillare zu verhindern. Die Kapillaren sind ublicherweise ¨ 10 bis 100 cm lang und haben einen Innendurchmesser von 25 bis 100 µm. Darin liegt der entscheidende Vorteil gegenuber ¨ der klassischen Gelelektrophorese: Die große Oberfl¨ache der englumigen Kapillaren bezogen auf das Puffervolumen erlaubt einen schnellen Abtransport der Jouleschen W¨arme, so dass relativ hohe Spannungen (bis zu 35 KV) verwendet werden konnen, ¨ d. h. hohe Analysengeschwindigkeiten moglich ¨ sind. In Abbildung 3.7 ist der schematische Aufbau einer CE-Einheit dargestellt mit Kapillare, Spannungsquelle, Detektor, Proben- und Puffergef¨aßen. 46 3. Theoretische Grundlagen Abbildung 3.7: Schematischer Aufbau einer CE-Apparatur. 3.4.1.1 Injektion Zur Probeninjektion wird am aufgabeseitigen Ende der Kapillare das Gef¨aß mit Trennelektrolyt gegen das Probengef¨aß getauscht. Das injizierte Probenvolumen liegt meist zwischen 2 und 20 nl. Die Probenaufgabe kann anodisch oder kathodisch erfolgen. Man unterscheidet die folgenden drei Injektionstechniken: • Elektrokinetische Injektion durch elektrisches Feld: Aufgrund einer kurzzeitig angelegten Spannung U zwischen den beiden Kapillarenden, wird in der Kapillare eine Flussigkeitsstr ¨ omung ¨ erzeugt, wodurch Probenbestandteile in die Kapillare wandern. • Hydrostatische Injektion durch Siphon-Effekt: Eine Hohendifferenz ¨ ∆h zwischen den beiden Kapillarenden wird fur ¨ eine kurze Zeitspanne aufgebaut. Der daraus resultierende Fluss zieht die Probe in die Kapillare. • Hydrodynamische Injektion durch Druck bzw. Vakuum: Eine kurzzeitig aufgebaute Druckdifferenz ∆p zwischen den beiden Kapillarenden ist fur ¨ die Probenaufgabe verantwortlich. Fur ¨ den Aufbau der Druckdifferenz kann entweder der Druck beim Probengef¨aß erhoht ¨ werden oder am Kapillarende verringert werden. Die hydrodynamische Injektion ist das am h¨aufigsten angewandte Verfahren und wird auch in dieser Arbeit eingesetzt. In der Regel werden Injektionszeiten zwischen 5 und 45 s verwendet. 3.4 Kapillarelektrophorese 47 3.4.1.2 ”Sample stacking” Die Probenaufgabe ist aufgrund der kurzen Injektionszeiten in Bezug auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ein kritischer Faktor. L¨angere Injektionszeiten und damit großere ¨ injizierte Probenvolumina fuhren ¨ jedoch durch Volumenuberladung ¨ in der Kapillare sehr schnell zu Peakverzerrung und Auflosungsverlust. ¨ Man versucht somit einerseits moglichst ¨ hohe Probenvolumina aufzugeben und andererseits die aufgegebene Probenzone zu “sch¨arfen”, d. h. aufzukonzentrieren und damit Peakverzerrungen entgegenzuwirken. Letzteren Vorgang bezeichnet man als “sample stacking”. Das h¨aufigste angewandte Verfahren ist das “electro-stacking” [87]. Dieses Verfahren nutzt Unterschiede in der Leitf¨ahigkeit zwischen Trennpuffer und Probenlosung. ¨ Dabei versucht man die Probe aus einer rein w¨assrigen Losung ¨ zu injizieren, d. h. aus einer Losung ¨ mit geringer Leitf¨ahigkeit und hohem Widerstand. Nach der Injektion wird die Probe somit zun¨achst bis zum Erreichen der Puffergrenzfl¨ache in einer hohen Feldst¨arke beschleunigt und wandert dann im Trennpuffer bei niedrigerer Feldst¨arke weiter. Durch das Abbremsen der Proben beim Eintritt in den Pufferbereich werden die Proben aufkonzentriert. 3.4.1.3 Detektor In der Mehrzahl der F¨alle erfolgt die Detektion der getrennten Teilchen uber ¨ UV/VISAbsorptionsmessungen. Ein großer Nachteil ist jedoch die geringe Empfindlichkeit der Methode. Da sich die Extinktion proportional zur Schichtdicke verh¨alt (Abschnitt 3.3.1), die in diesem Fall nur einige µm betr¨agt, liegt die Detektionsgrenze normalerweise bei 10−8 M [179]. Mit einem Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektor (LIFDetektor) sind dagegen Nachweisgrenzen im Bereich einiger Yoktomol und Zeptomol (10−21 mol und 10−24 mol) keine Seltenheit [16, 95]. 3.4.1.4 Auflosung ¨ Die Auflosung ¨ (resolution, Rs) ist ein Maß fur ¨ die Qualit¨at einer Trennung und je besser die Trennung, um so zuverl¨assiger ist das Analysenergebnis [124, 162]. Ab einer Auflosung ¨ von 1.5 gelten zwei Peaks als basisliniengetrennt voneinander. In die Auflosung ¨ fließen zwei Faktoren ein: • Die Peak-zu-Peak-Trennung, d. h. die Selektivit¨at. Hier wird der Abstand zweier Peak-Maxima berechnet und • Die Trennleistung, welche durch die Breite der Peaks bestimmt und als Anzahl N der theoretischen Boden ¨ pro Meter berechnet wird. Je schmaler ein Peak desto hoher ¨ ist die Trennleistung. 48 3. Theoretische Grundlagen Die Auflosung ¨ Rs und Anzahl N der theoretischen Boden ¨ werden nach folgenden Gleichungen berechnet: Abbildung 3.8: Beitr¨age zur Auflosung, ¨ modifiziert nach [77]. D. h. je großer ¨ die Peakbreite bei halber Hohe ¨ (W1/2 ) ist, desto niedriger ist der Wert fur ¨ N. Fur ¨ eine hohe Auflosung ¨ mussen ¨ somit sowohl schmale Peaks als auch große Peakzu-Peak-Trennungen vorliegen. W¨ahrend der Trennung kommt es h¨aufig zur Dispersion des Analyten, wodurch Peakverbreiterungen verursacht werden. Diesem Effekt kann jedoch durch “sample stacking” (Abschnitt 3.4.1.2) entgegengewirkt werden. 3.4.2 Trennprinzip Die Trennung verschiedener Analyten im elektrischen Feld beruht auf ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilit¨at µelphor (Quotient aus Wanderungsgeschwindigkeit und Feldst¨arke). Sie errechnet sich aus dem Kr¨aftegleichgewicht zwischen der Beschleunigungskraft Fel des elektrischen Feldes und der Reibungskraft Fr , die durch das Stokesche Gesetz angen¨ahert wird: Fel = q · E mit Fr = −k · µelphor · E = −6 · π · η · r · µelphor · E q q ∼ µelphor = 6·π·η·r r (3.10) (3.11) (3.12) q : effektive Ladung E : elektrische Feldst¨arke k : Reibungskoeffizient η : dynamische Viskosit¨at r : Stokescher Radius, der auch die Solvathulle ¨ beinhaltet Die Zahl 6 gilt streng genommen nur fur ¨ die Betrachtung sph¨arischer Partikel und ist fur ¨ kleine Ionen, deren Große ¨ im Bereich von Losungsmittelmolek ¨ ulen ¨ liegt kleiner. 3.4 Kapillarelektrophorese 49 Die effektive Ladung ergibt sich aus der Ladung des Analyten abzuglich ¨ des Ladungsanteils der umgebenden entgegengesetzt geladenen Ionen, d. h. der Solvathulle ¨ bis zur Scher-Ebene im Modell der starren Doppelschicht der Debye-Huckel-Theorie ¨ (Abschnitt 3.2.2.1). Fur ¨ die Trennung maßgeblich ist letztendlich das Verh¨altnis q/r. 3.4.3 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Wie eingangs beschrieben bestehen die eingesetzten Kapillaren aus Quarz (fused silica). In w¨assriger Umgebung wird dessen Oberfl¨ache durch Protolyse negativ aufgeladen [278] und es kommt wie unter Abschnitt 3.2.2.1 fur ¨ die Oberfl¨ache von Kolloiden in aquatischer Losung ¨ beschrieben, zur Ausbildung einer elektrischen Doppelschicht in der Kapillare (Abbildung 3.9). Abbildung 3.9: Ausbildung der elektrischen Doppelschicht in der Kapillare, modifiziert nach [277]. Die gebildete elektrische Doppelschicht setzt sich aus der adsorbierten HelmholtzSchicht und der diffusen Debeye-Huckel-Schicht ¨ zusammen und besteht aus positiven Gegenionen und Anionen. Das an der Grenzschicht ausgebildete ζ-Potenzial ist verantwortlich fur ¨ die Elektroosmose. Liegt parallel zur Oberfl¨ache ein elektrisches Feld an, werden die Kationen in der diffusen Schicht zur negativ geladenen Kathode gezogen. Diese ziehen aufgrund ihrer Solvathulle ¨ die gesamte Pufferlosung ¨ mit sich und verursachen auf diese Weise den elektroosmotischen Fluss (EOF). Dadurch wird der elektrophoretischen Wanderung des Analyten zumeist ein mehr oder minder starker EOF uberlagert, ¨ der zwar aktiv zum Transport der Probenzone beitr¨agt, nicht aber zu ihrer Trennung. Der EOF ist somit verantwortlich, dass bei anodischer Injektion auch Anionen am Detektionsfenster “vorbeiwandern”. Die Geschwindigkeit des EOFs bzw. dessen elektroosmotische Mobilit¨at µelosm wird durch die Helmholtz-Gleichung beschrieben ε·ζ (3.13) µelosm = 4·π·η 50 3. Theoretische Grundlagen ε : Dielektrizit¨atskonstante ζ : ζ-Potenzial η : dynamische Viskosit¨at und kann experimentell aus der Migrationszeit eines Neutralmarkers bestimmt werden. 3.4.4 Kapillarelektrophoretische Methoden Die Vielseitigkeit der CE leitet sich vor allem von ihren zahlreichen Methoden ab, deren Trennmechanismen auf unterschiedlichen physikalischen Grunds¨atzen beruhen und dadurch die Gewinnung orthogonaler und komplement¨arer Informationen mog¨ lich wird. Die bedeutendsten Methoden sind die Kapillarzonenelektrophorese (CZE), die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC), die Kapillargelelektrophorese (CGE), die Kapillarelektrochromatographie (CEC), die Kapillar-Isoelektrische Fokussierung (CIEF) und die Kapillarisotachophorese (CITP). Fur ¨ diese Arbeit spielen lediglich die Kapillarzonenelektrophorese und die Kapillargelektrophorese eine Rolle, so dass nur fur ¨ diese beiden Methoden eine n¨ahere Ausfuhrung ¨ folgt: 3.4.4.1 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Die CZE wird ausschließlich mit Trennpuffer gefullten ¨ Kapillaren durchgefuhrt ¨ und gilt als das am h¨aufigsten angewandte Verfahren. Die Trennung beruht ausschließlich auf Mobilit¨atsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Ladung und Reibungskoeffizienten [87]. 3.4.4.2 Kapillargelelektrophorese (CGE) Die CGE wird haupts¨achlich zur Analyse von Makromolekulen ¨ wie DNA/RNA und Biokolloiden angewandt, welche h¨aufig uber ¨ a¨ hnliche oder gar gleiche Oberfl¨ache-zuLadungsverh¨altnisse verfugen. ¨ Die Trennung dieser effektiv gleich geladenen Analyten erfolgt in mit Polymerlosung ¨ oder Gel (Trennmatrix) gefullten ¨ Kapillaren aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekul¨ bzw. Partikelgroße. ¨ Die Gelmatrix besteht haupts¨achlich aus Acrylamid, Agarose und Cellulose. Ihr eingesetzter Konzentrationsbereich liegt zwischen 0.05 bis 15 %. Im Idealfall ist der EOF bei dieser Technik vollst¨andig unterdruckt ¨ und hat keinen Einfluss auf die Mobilit¨at. 3.4.5 Eigenschaften von “fused silica” Oberfl¨achen Bilden sich ausreichend große ζ-Potenziale auf der Quarzoberfl¨ache der Kapillare aus, besitzt die Kapillarwand Eigenschaften eines Kationenaustauschers mit etwa einer 3.4 Kapillarelektrophorese 51 Bindungsstelle fur ¨ Kationen pro nm2 [83]. Die daraus resultierenden elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen Analyten und den negativen Silanolgruppen der Kapillarwand konnen ¨ die Mobilit¨at und damit die Trennleistung und die Reproduzierbarkeit negativ beeinflussen [127]. Die Wechselwirkungen konnen ¨ vor allem bei positiv geladenen Proteinen und Zellbestandteilen sehr stark ausgepr¨agt sein. Fur ¨ gut reproduzierbare Ergebnisse sollten diese Adsorptionserscheinungen moglichst ¨ unterdruckt ¨ oder g¨anzlich unterbunden werden. Die Große ¨ des ζ-Potenzials bestimmt auch die Geschwindigkeit des EOF. Zwar tr¨agt der EOF nicht zur Trennung der Analyten bei, doch kann eine Erhohung ¨ des EOF z. B. zu einer schnelleren Trennung fuhren. ¨ Andererseits kann bei der Trennung von Analyten mit a¨ hnlichen elektrophoretischen Mobilit¨aten auch die Reduktion des EOF hilfreich sein, um den elektrophoretischen Beitrag zu erhohen ¨ und den Analyten mehr “Zeit” zur Trennung untereinander und zur Abtrennung vom EOF einzur¨aumen [15]. Sowohl die Kontrolle der unerwunschten ¨ Interaktionen zwischen Analyt und Kapillarwand und als auch die Kontrolle des EOF basieren auf der Verminderung des Oberfl¨achenpotenzials auf der Kapillarinnenseite und damit der Reduktion der Reichweite der Coulomb-Kr¨afte zwischen Kapillarwand und Analyt [255]. Dazu konnen ¨ zwei unterschiedliche Techniken angewandt werden: 1. Die direkte Beeinflussung der ionischen Interaktionen durch: • Erhohung ¨ der Ionenst¨arke im Trennpuffer durch Zugabe von Konkurrenzionen in Form von Salzen oder • Protonierung der Silanol-Gruppen durch extrem saure pH-Bedingungen oder 2. Kapillarwandmodifikationen durch • kovalente oder • dynamische Beschichtung Im Rahmen dieser Arbeit wird mit Kapillarwandmodifikationen gearbeitet, weshalb nachfolgend die Technik der Beschichtung insbesondere der dynamischen Beschichtung n¨aher beschrieben wird. 3.4.6 Wandbeschichtung (”Coating”) 3.4.6.1 Permanente Beschichtung Bei der permanenten Wandbeschichtung werden die Silanol-Gruppen der Kapillarinnenwand kovalent an Modifikatoren gebunden, wodurch der EOF und die Probe- 52 3. Theoretische Grundlagen Wand-Wechselwirkung effektiv unterdruckt ¨ werden. Die zur Beschichtung am h¨aufigsten eingesetzten Materialien sind Polyacrylamid [67], Kohlenhydrate [46] und Polyethylenglykole [218]. Die Stabilit¨at der Beschichtung h¨angt stark von der Vorbehandlung ab. Durch ausgiebige Konditionierung wird dazu die Kapillare zun¨achst gereinigt. Das bedeutendste Beschichtungsverfahren ist die Organosilanylisation [67, 127]. Hier werden uber ¨ ein reaktives, bifunktionales Silan die Polymere an die Kapillarwand gebunden. W¨ahrend die Silan-Gruppe mit der Silanol-Gruppe reagiert, bindet die zweite funktionelle Gruppe die Monomere der sp¨ateren Beschichtung. Auf der Kapillaroberfl¨ache kommt es im Anschluss zur Polymerisation und Verankerung der Polymerschicht. 3.4.6.2 Dynamische Beschichtung Auch durch dynamische Beschichtungsmethoden, bei denen dem Trennpuffer Additiva zugesetzt werden, die sich durch Coulomb-Kr¨afte und/oder Wasserstoffbrucken¨ bindungen beim Einspulen ¨ der Kapillare an die Glasoberfl¨ache binden, lassen sich die Silanol-Gruppen abschirmen. Aufgrund der schwachen Wechselwirkungskr¨afte ermoglicht ¨ der Einsatz geeigneter Spulschritte ¨ zwischen den Trennungen das vollst¨andige Ablosen ¨ der Beschichtung und seine neue Rekonstruktion im n¨achste Schritt. Als Additiva konnen ¨ sowohl niedermolekulare Substanzen wie Mono-, Di-, Oligoamine, Sulfons¨aureamine und Tenside als auch Polymere wie Alkylcellulose, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Dextran und Polyacrylamid eingesetzt werden [220, 273, 274]. Wichtig fur ¨ die richtige Auswahl hochmolekularer Modifikatoren ist ein ausgewogenes Verh¨altnis zwischen hydrophilen und lipophilen funktionellen Gruppen. Ist der Anteil hydrophiler Gruppen zu hoch, kann die Beschichtung partiell durch Wassermolekule ¨ von der Quarzoberfl¨ache verdr¨angt werden. Hingegen besteht bei zu hydrophoben Additiva die Gefahr von Adsorptionen zwischen Proteinen oder Biokolloiden und den Polymeren durch van-der-Waal-Kr¨afte. Im Extremfall konnen ¨ die hydrophoben funktionellen Gruppen auch zu großen Oberfl¨achenspannungen zwischen Puffer und Beschichtung fuhren, ¨ wodurch die Beschichtung instabil wird [71]. Je nach Polymer und dessen funktioneller Gruppen kann die Beschichtung geladen, ungeladen, polar oder unpolar sein. 3.5 Magnetische Kernresonanz 53 3.5 Magnetische Kernresonanz 3.5.1 Messprinzip Die Grundlage der magnetischen Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR) bildet die Quantenmechanik des Kernspins I~n , einer Eigenschaft von Nukleonen und seine charakterisierende Kernspinquantenzahl In , die bei Protonen und Neutronen 1/2 betr¨agt. Atomkerne, deren Gesamtspin I~ ungleich Null ist, besitzen ein magnetisches Moment ~µ, wobei im Feld-freien Raum 2I+1 energetisch a¨ quivalente Spinzust¨ande existieren. Als Konsequenz aus dem Wigner-Eckart-Theorem ist das magnetische Moment kollinear zum Spinvektor und durch folgende Gleichung definiert: ~µ = γ I~ (3.14) Das gyromagnetische Verh¨altnis γ ist fur ¨ jeden Atomkern charakteristisch und betr¨agt fur ¨ 1 H 2.68·108 rad/Ts. Sein Zahlenwert bestimmt unter anderem die Empfindlichkeit eines Atomkernes. In Gegenwart eines externen magnetischen Feldes B~0 wird die energetische Entartung der Spinzust¨ande durch den Zeeman-Effekt aufgehoben: E = −~µB~0 (3.15) Da in einem NMR-Spektrometer durch Konvention das B~0 -Feld entlang der z-Achse ausgerichtet ist, reduziert sich die Gleichung auf: Em = −γIz B0 = −m~γB0 (3.16) wobei m die magnetische Quantenzahl ist, und gem¨aß der Anzahl der Spinzust¨ande 2I+1 mogliche ¨ Werte annehmen kann. Die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Spin ein Energieniveau besetzt, wird durch die Boltzmann-Verteilung bestimmt. ¨ In Analogie zur optischen Spektroskopie konnen ¨ Uberg¨ ange zwischen den Zeeman~0 ausgerichteten, hochfrequenten, Niveaus durch Einstrahlung eines senkrecht zu B elektromagnetischen Wechselfeldes (HF-Feld) stimuliert werden. Die Auswahlregel fur ¨ magnetische Dipoluberg¨ ¨ ange ist ∆m=±1, so dass die Photonenenergie die folgende Resonanzbedingung erfullen ¨ muss: |∆E| = γB0 ~ = ω0 ~ (3.17) Die Resonanzfrequenz ω0 = γB0 wird Larmorfrequenz genannt und entspricht betragsm¨aßig der Pr¨azessionsfrequenz des magnetischen Momentes um die statische B~0 Achse (z-Achse). Sie ist charakteristisch fur ¨ eine bestimmte Atomsorte. Doch konnen ¨ sich auch Atomkerne einer Sorte in ihrer Larmorfrequenz unterscheiden, wenn sie Teil eines Molekuls ¨ sind und damit unterschiedliche chemische Umgebungen wahrnehmen. Aufgrund der teilweisen Abschirmung des a¨ ußeren Magnetfeldes durch die den 54 3. Theoretische Grundlagen Kern umgebende Elektronenhulle, ¨ befindet sich der Kernspin in einem im Vergleich zum B0 -Feld kleineren effektiven Beff -Feld: Beff = (1 − σ)B0 (3.18) σ heißt Abschirmkonstante und ist unter anderem abh¨angig von der Elektronendichte, d. h. der Bindungsart und der Elektronegativit¨at der Nachbaratome. Das Ausmaß der Abschirmung eines Kerns und damit seine Resonanzfrequenz ist typisch fur ¨ seine Position im Molekul. ¨ Sie kann zur Identifikation des Molekuls ¨ herangezogen werden und bildet die Grundlage der NMR-Spektroskopie. Die chemische Verschiebung δ, eine dimensionslose Große, ¨ die in ppm (parts per million) angegeben wird, definiert die Lage der Resonanzfrequenzen im Spektrum. Sie ist unabh¨angig von der verwendeten Feldst¨arke B0 und bezieht sich als Relativ-Maßstab in der 1 H- und 13 C-Spektroskopie auf die Resonanzfrequenz ωref von Tetramethylsilan (TMS): δ[ppm] = ω − ωref · 106 ωref (3.19) Generell wird das Verhalten eines magnetischen Kernmomentes unter dem Einfluss ~0 durch die Bewegungsgleichung beschrieben: des a¨ ußeren Magnetfeldes B d~µ = γ(~µ × B~0 ) dt (3.20) ¨ Sie folgt aus der klassischen Betrachtung des Drehimpulses, dessen zeitliche Anderung ~0 gleich dem Drehmoment ist, das auf ~µ wirkt und durch das Vektorprodukt ~µ × B gegeben ist. Prinzipiell wurde ¨ die exakte theoretische Betrachtung eines NMR-Experimentes die Losung ¨ der Bewegungsgleichung jedes Kernspins erfordern. Jedoch ermoglichen ¨ N¨aherungen sowohl im klassischen als auch quantenmechanischen Bild eine anschauliche Darstellung. 3.5.2 Klassische Darstellung ~ und der Gesamtdrehimpuls J~ einer makroskopischen Die Gesamtmagnetisierung M Probe ergibt sich aus den Vektorsummen der entsprechenden Beitr¨age der einzelnen P P ~ = Kerne: M µ~i , J~ = I~i . Im thermischen Gleichgewicht sind die transversalen Komponenten von ~µ und I~ der einzelnen Kerne unkorreliert und summieren sich zu null auf. Aus den kleinen Populationsunterschieden zwischen den Energieniveaus re~ 0 = M0 e~z . Unter der Ansultiert daraus eine longitudinale Gesamtmagnetisierung M nahme a¨ quivalenter, nicht interagierender Spinspezies in einer homogenen, isotropen Probe, gehorcht die Gesamtmagnetisierung der gleichen Bewegungsgleichung wie ein einzelner Kernspin: ~ dM ~ ×B ~0 ) = γ(M dt (3.21) 3.5 Magnetische Kernresonanz 55 Unter den experimentellen Bedingungen sind diese Annahmen aber nicht gerechtfertigt: Atomkerne interagieren miteinander und die Bewegungsgleichung wird unter anderem aufgrund von • Relaxationsmechanismen und • dynamischen Prozessen wie Diffusion und chemischem Austausch wesentlich komplizierter. Weitere Einflussfaktoren stellen unter anderem Probeninhomogenit¨aten und -anisotropien dar. Diese werden im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht berucksichtigt. ¨ 3.5.2.1 Relaxation Prinzipiell wird ein Prozess, der einen beliebigen Zustand in einen Gleichgewichtszustand zuruckf ¨ uhrt ¨ als Relaxation bezeichnet. In der NMR handelt es sich dabei um keinen spontanen Prozess, sondern er erfordert die Stimulation durch fluktuierende Magnetfelder zur Induktion von Spinuberg¨ ¨ angen. Dies geschieht durch die folgenden vier Hauptmechanismen [68]: Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Spin-Rotation, QuadrupolRelaxation und Relaxation durch chemische Verschiebungsanisotropie. 3.5.2.1.1 Bloch-Gleichungen 1946 wurden durch Einfugen ¨ zweier Relaxationsraten erster Ordnung ( T11 , T12 ) in die Bewegungsgleichung die Bloch-Gleichung [25] aufgestellt. Sie ist der einfachste theoretische Ausdruck zur Beschreibung der Relaxation. ~ (t) dM ~ (t) × B~0 ) − R(M(t) ~ ~ 0) = γ(M −M dt 1 0 0 T 2 R = 0 T12 0 0 0 T11 (3.22) (3.23) dabei ist • T2 =transversale Relaxationszeit Sie ist die fur ¨ den Zerfall der transversalen Magnetisierung charakteristische Zeitkonstante. Die transversale Relaxation, auch Spin-Spin-Relaxation genannt, beruht auf einem Energieaustausch zwischen benachbarten Atomkernen. Die Gesamtenergie und damit die Besetzungsverh¨altnisse der einzelnen Energieniveaus a¨ ndert sich dabei nicht. Es handelt sich somit um einen reinen Entropieprozess mit einem Verlust der Phasenkoh¨arenz zwischen den einzelnen Spins. 56 3. Theoretische Grundlagen • T1 =longitudinale Relaxationszeit Sie bezeichnet die Zeitkonstante, innerhalb der die longitudinale Magnetisierung nach einer Storung ¨ in den Gleichgewichtszustand zuruckkehrt. ¨ Diese Art der Relaxation wird als Spin-Gitter-Relaxation bezeichnet und ist mit einer Energie¨anderung des Systems verbunden. Der Begriff Gitter stammt ursprunglich ¨ aus der Festkorperphysik ¨ und bezeichnet auch in der Flussigphasen-NMR ¨ die gesamte Umgebung mit der Energie ausgetauscht werden kann. Prinzipiell wird bei NMR-Experimenten die zeitliche Entwicklung der transversalen Magnetisierung: M + (t) = Mx (t) + iMy (t) durch den Resonator im Probenkopf nach Anregung der Probe durch das HF-Feld B~1 betrachtet. Durch die Einfuhrung ¨ der kom+ plexen Magnetisierung M erhalten die Bloch-Gleichungen die folgenden Ausdrucke: ¨ 1 ∂M + (t) M + (t) (3.24) = − iω0 + ∂t T2 1 ∂Mz (t) = − (Mz (t) − M0 ) (3.25) ∂t T1 Die allgemeinen Losungen ¨ der Bloch-Gleichungen ergeben: t + + M (t) = M (0)exp(−iω0 t)exp − T 2 t t Mz (t) = Mz (0)exp − + M0 1 − exp − T1 T1 (3.26) (3.27) Nach Fouriertransformation der transversalen Magnetisierung bezuglich ¨ t erh¨alt man die Lorentzlinie, d. h. die Resonanzlinie im Spektrum in der Frequenz-Dom¨ane: M + (ω) = M + (0) 1 −i(ω0 − ω) − 1 T2 (3.28) wobei ω0 die Position angibt und die Signalbreite durch T12 bestimmt wird. Die Signalamplitude M + (0) zum Zeitpunkt t=0 ist abh¨angig von der Magnetisierung im Grundzustand M0 und vom Pulswinkel α = γτ B1 , wobei τ die HF-Pulsdauer ist. Betrachtet man nur magnetisch a¨ quivalente Atomkerne, so hat das aufgezeichnete Zeitsignal, free induction decay (FID), die Form einer exponentiell ged¨ampften Sinusschwingung. T2 definiert dabei die Zeitspanne, w¨ahrend der der FID beobachtet werden kann, T1 hingegen die minimale Zeit, die zum Erreichen des Gleichgewichtes benotigt ¨ wird. Die Signalst¨arke ist somit zur transversalen Magnetisierung proportional und klingt mit der Zeitkonstanten T2 ab. In der Praxis dagegen liegt eine Verteilung von Resonanzfrequenzen vor, wodurch Spins, die unmittelbar nach der Anregung noch eine identische Phase aufweisen, dephasieren. Dadurch verkleinert sich die vektorielle Summe der magnetischen Momente der einzelnen Spins und folglich die Signalintensit¨at. Die beobachtete Signalabnahme wird deshalb als empirische T∗2 Relaxation bezeichnet. Sie enth¨alt unter anderem Beitr¨age aus 3.5 Magnetische Kernresonanz 57 • der naturlichen ¨ transversalen Relaxation der Spin-Spin-Wechselwirkung, • der transversalen Relaxation aufgrund von Magnetfeldinhomogenit¨aten und Magnetfeldabschirmung und • dem Signalabfall durch die dynamischen Prozesse wie Diffusion und chemischem Austausch der Kernspins im Raum. Mit den Erweiterungstermen von Torrey [264, 265] und McConnell [172] gelang es die Diffusion (3.29) bzw. den chemischen Austausch (3.30) in die Bewegungsgleichung mit einzubeziehen und theoretisch zu beschreiben: ~ (t) dM ~ (t) × B~0 ) − R(M(t) ~ ~ 0 ) + ∇D∇M(t) ~ = γ(M −M dt ~ (t) dM ~ (t) × B~0 ) − R(M(t) ~ ~ 0 ) + KM(t) ~ = γ(M −M dt (3.29) (3.30) D ist dabei der Diffusionstensor und K der Austauschtensor. D wird bei homogenen, isotropen Proben zu einer Zahl und kann vor den Nabla-Operator gezogen werden. Gleichung (3.30) stellt lediglich eine formale Beschreibung der Entwicklung der Magnetisierung unter Einbeziehung des chemischen Austauschs dar. Hier ist die Einfuhrung ¨ weiterer Dimensionen, die die austauschenden Kerne enthalten, notwendig. 3.5.2.1.2 Spinecho Die experimentelle Bestimmung der transversalen Relaxationszeit T2 erfolgt h¨aufig mittels Spinecho-Sequenz von Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG-Sequenz) [174]. Diese Sequenz nutzt die Reversibilit¨at des Anteils des transversalen Magnetisierungszerfalles, der durch Dephasierung der Spins bedingt ist (T’2 ). Wie in Abbildung 3.10 gezeigt, wird die Probe zun¨achst mit einem 90◦x -Puls angeregt, und die verschiedenen Spins beginnen aufgrund ihrer Frequenzverteilung zu dephasieren. Nach einer Zeit τ erfolgt ein 180◦y -Puls, wodurch die Spins nach einem weiteren Zeitintervall τ wieder rephasieren. Dadurch steigt das Signal mit der Zeitkonstante T’2 an. Es entsteht somit ein Spinecho mit dem Echomaximum zum Zeitpunkt 2τ nach Einstrahlung des Anregungspulses. Die beiden Impulswinkel werden senkrecht aufeinander geschaltet und verhindern dadurch, dass Pulsimperfektionen kumulieren. Die Refokussierung findet bei jedem Echo ausschließlich in der +y-Hemisph¨are statt, wodurch sich Pulsimperfektionen nur als kleine Fehler bei ungeradzahligen Echos bemerkbar machen und sich bei geradzahligen Echos ausloschen ¨ (CPMG-Bedingung). 58 3. Theoretische Grundlagen Abbildung 3.10: Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-Sequenz und erzeugtes Spinecho, modifiziert nach [68]. Diese Sequenz ermoglicht ¨ es nicht die naturliche ¨ Spin-Spin-Relaxation, Diffusion und chemischen Austausch unabh¨angig voneinander zu messen, so dass die experimentell gemessene transversale Relaxation als apparentes bzw. gemessenes T2 bezeichnet wird. 3.5.2.2 Chemischer Austausch Als chemischen Austausch bezeichnet man den Austausch von Atomen oder ganzen Molekulen ¨ aus unterschiedlicher chemischer Umgebung. Austauschprozesse zwischen zwei Spinspezies (magnetisch unterschiedliche Kerne einer Atomsorte) konnen ¨ sowohl intramolekular durch Konformations¨anderung als auch intermolekular durch Brownsche Molekularbewegung zwischen solvatisierenden und freien Protonen oder durch S¨aure-Base-Reaktionen stattfinden. Eine detaillierte Behandlung des chemischen Austausches mit zahlreichen Beispielen ist in den Werken von Cavanagh [57], Levitt [158] und Bain [18] zu finden. Betrachtet man ein 2-Spin-System, so wird der Austausch von Kernen zwischen den beiden Kernzust¨anden A und B: kh A ⇌ B (3.31) kr durch die Reaktionsraten kh und kr beschrieben. Die Temperaturabh¨angigkeit der Reaktion ist uber ¨ die Arrhenius-Gleichung enthalten: ∆E (3.32) k = C exp − RT 3.5 Magnetische Kernresonanz 59 wobei C der pr¨a-exponentielle Faktor, R die Gaskonstante, ∆E die Aktivierungsenergie und T die Temperatur in Kelvin sind. Die Austauschgeschwindigkeit verl¨auft nach der Kinetik erster Ordnung: vh = kh · [A] (3.33) vr = kr · [B] (3.34) Zwischen Hin- und Ruckreaktion ¨ stellt sich ein Gleichgewicht ein. Die Gleichgewichtskonstante berechnet sich aus dem Konzentrationsverh¨altnis der beiden Kernzust¨ande bzw. dem Verh¨altnis der Austauschraten: K= kh [B] = [A] kr (3.35) Die Gleichgewichtskonstante an sich ist auch temperaturabh¨angig. Im Fall von S¨aureBase-Reaktionen wird das Verh¨altnis der beiden Zustandskonzentrationen und damit ihr Austausch uber ¨ die Henderson-Hasselbalch-Gleichung durch den pH-Wert bestimmt: pH = pks + log [Base] [S¨aure] (3.36) Je nach dem Verh¨altnis zwischen k und ω unterscheidet man zwischen langsamem (k < ω) und schnellem chemischem Austausch ( k > ω). Die Spektroskopie ermoglicht ¨ uber ¨ das Lorentzprofil der austauschenden Resonanzen eine genaue Analyse des chemischen Austauschs. Durch N¨aherungen wurden zahlreiche Losungen ¨ der McConnellGleichung in Abh¨angigkeit der jeweiligen Resonanzfrequenzen sowohl fur ¨ schnellen Austausch (Swift-Connick [258] und Luz-Meiboom [163]) als auch fur ¨ langsamen Austausch (Allerhand-Gutowsky [7] und Carver-Richards [56]) vorgestellt. In der Praxis werden ihre Anwendungen bei einem N-Spin-System jedoch nahezu unmoglich. ¨ In diesem Fall bietet die Bildgebung die Moglichkeit ¨ uber ¨ experimentell ermittelte Para¨ meter wie T1 , T2 , D oder MTC (Magnetisierungstransferkontrast) Anderungen im chemischen Austausch global mitzuverfolgen. Ein Formalismus zur Beschreibung eines Austausches zwischen N-Spin-Zust¨anden ist in [266] enthalten. 3.5.3 Spektroskopie In der Spektroskopie liefert nicht nur die chemische Verschiebung δ Information uber ¨ die Position des Protons im Molekul ¨ und damit zur Struktur, sondern auch die skalare J-Kopplung. Skalar bezeichnet hier die Tatsache, dass die Orientierung der Spins zueinander fur ¨ die Kopplung keine Rolle spielt. Sie wird durch die Spins der bindenden Elektronen in kovalenten Bindungen vermittelt und bewirkt eine Aufspaltung der Resonanzsignale. Die Kopplung von Kernen ist die Voraussetzung fur ¨ 2D-NMRSpektroskopie. Sie wird h¨aufig zur Strukturaufkl¨arung großer Molekule ¨ wie Steroide, 60 3. Theoretische Grundlagen Peptide und Oligosaccharide, deren 1 H-Spektren aufgrund zahlreicher Signaluberla¨ gerungen nicht mehr analysierbar sind, angewandt. Das einfachste 2D-Experiment ist das homonukleare (H,H)-korrelierte NMR-Experiment mit dem Namen COSY (COrrelation SpectroscopY) [17]. Wie in Abbildung 3.11 gezeigt, beginnt die Pulssequenz mit einem 90◦ y -Puls, welcher das Spinsystem anregt und die Pr¨aparationsphase darstellt. In der darauffolgenden Zeit t1, der Evolutionsphase, wirkt die J-Kopplung, d. h. ¨ bei zwei miteinander koppelnden Spins erh¨alt man aus den Uberg¨ angen zwischen den verschiedenen Spinzust¨anden vier Magnetisierungsvektoren, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Larmorfrequenzen auff¨achern. Der zweite 90◦ y -Puls stellt die sogenannte Mischphase dar und ist mit einem Magnetisierungstransfer zwischen den ¨ Zust¨anden koppelnder Spins verbunden, wodurch bestimmte Uberg¨ ange stimuliert werden, deren Signalemission im Zeitintervall t2 , der Detektionsphase, aufgezeichnet wird. Die Fourier-Transformation des FIDs liefert ein Spektrum in der ersten spektroskopischen Dimension des Experimentes (F2 ). Durch Wiederholung des Experimentes wird t1 inkrementiert und das Signal jeweils zum gleichen Zeitpunkt der Detektionsphase aufgezeichnet. Seine Fourier-Transformation liefert dann die zweite spektroskopische Dimension (F1). Betrachtet man zwei Spins A und B mit den Resonanzfrequenzen ωA und ωB , so befinden sich auf der Diagonalen zwei Signale an den Positionen (ωA , ωA ) und (ωB , ωB ) und bei J-Kopplung zwischen den Spins zus¨atzlich zwei Kreuzsignale an den Positionen (ωA , ωB ) und (ωB , ωA ). Abbildung 3.11: (H,H)-korreliertes Experiment, modifiziert nach [68]. COSY- 3.5.4 Bildgebung Die Anwendung der NMR fur ¨ die Bildgebung, erfordert eine ortsaufgeloste ¨ Akquisition, d. h. dem NMR-Signal muss eine Ortsinformation aufgepr¨agt werden. Dazu schal~ 0 -Feld uberlatet man mit Gradientenspulen ortsabh¨angige Magnetfelder, die dem B ¨ ~ geschaltet ist, besitzen die Spins in einer gert sind. Solange ein Magnetfeldgradient (G) Probe eine ortsabh¨angige Larmorfrequenz: ~ ω(~r) = γ(B0 + ~rG) (3.37) 3.5 Magnetische Kernresonanz 61 mit: ∂B z ∂x z ~ = G ∂B ∂y (3.38) ∂Bz ∂z Je nach Zeitpunkt und Richtung der Gradientenschaltung unterscheidet man verschiedene Moglichkeiten ¨ der Ortskodierung: 3.5.4.1 Schichtselektionsgradient In einem NMR-Experiment werden die Spins einer Probe durch einen HF-Puls der Dauer ∆t angeregt. Der Puls besitzt dabei nach: ∆ω · ∆t ∼ =1 (3.39) ~z eine Bandbreite von ∆ω. Liegt w¨ahrend der Pulseinstrahlung nun ein Gradient G senkrecht zur anzuregenden Schicht an, so erfahren nur die Spin einer Schicht der Dicke ∆z eine Anregung. Die Dicke ∆z bestimmt sich zu: ∆z = ∆ω 2πγGz (3.40) Bei Pulswinkeln bis 90◦ berechnet sich das angeregte Schichtprofil in sehr guter N¨aherung als Fouriertransformierte des Pulsprofils in der Zeit-Dom¨ane. 3.5.4.2 Lesegradient Eine weitere Moglichkeit ¨ der Ortsaufpr¨agung ergibt sich durch Anlegen eines Lese~ x w¨ahrend der Akquisition. Dadurch entspricht jeder Frequenz, die im gradienten G FID enthalten ist, ein Ort x und das Spektrum weist mit: f (x) = γ Gx x 2π (3.41) eine kontinuierliche Frequenzverteilung auf. 3.5.4.3 Phasenkodiergradient Die dritte Moglichkeit ¨ der Ortskodierung stellt die Phasenkodierung dar. Hierzu wird ein Magnetfeldgradient vor der Akquisition fur ¨ eine Zeit τ angelegt. Nach Abschalten dieses Phasenkodiergradienten besitzt das NMR-Signal dadurch eine ortsabh¨angige Phase mit: Z τ ~ r dt Φ(~r, τ ) = ω0 τ + γ G(t)~ (3.42) 0 62 3. Theoretische Grundlagen 3.5.4.4 k-Raum In Analogie zur Verwendung des Frequenzraumes als Fourier-Raum des Zeitsignals in der NMR-Spektroskopie l¨asst sich das MR-Signal der Bildgebung durch die Wellenzahlenvektoren ~k(t) beschreiben, die den k-Raum aufspannen und wie folgt definiert sind: Z t γ ~ ′ ′ ~k(t) = G(t )dt (3.43) 0 2π Um eine vollst¨andige Information uber ¨ die r¨aumliche Struktur zu erhalten, muss der gesamte k-Raum abgetastet werden. Im zweidimensionalen Bildgebungsexperiment erfolgt dies durch Schalten eines Phasenkodier- und Lesegradienten in zueinander orγ Gx t thogonalen Raumrichtungen. Nach Substitution fur ¨ die Leserichtung mit kx = 2π γ und fur ¨ die Phasenkodierrichtung mit ky = 2π Gy t erh¨alt man fur ¨ das aufgenommene Signal einer ausgedehnten Probe: Z s(~k) ∝ ρ(x, y)exp(2πixkx )exp(2πiyky )dxdy (3.44) Dabei ist ρ(x, y) die Spindichte in der xy-Ebene. Aus dem Signal im k-Raum erh¨alt man somit durch Fouriertransformation bezuglich ¨ kx und ky das Bild im Ortsraum. Das Signal, welches bei konstanter Phasenkodierzeit bei einer bestimmten Gradientenst¨arke aufgenommen wird, entspricht genau einem Bildpunkt im k-Raum. Zur Aufnahme eines 2D-Bildes muss somit die Akquisition nach der Phasenkodierung mit unterschiedlichen Gradientenst¨arken wiederholt werden. Die Gradientenst¨arke wird dabei von -Gmax bis +Gmax mit a¨ quidistanter Gradientenschrittweite ∆k variiert. Bei jeder Akquisition erfolgt die Schaltung des Lesegradienten uber ¨ die Zeitdauer t. In dieser Zeit werden TD (time domain) Datenpunkte aufgenommen, d. h. eine k-Raum-Zeile wird F OV,Gesichtsf eld ) wird somit TD Datenpunkten abgetastet. Die Auflosung ¨ (∆x = Anzahl der Bildpunkte wohl durch den Lesegradienten als auch durch den Phasengradienten bestimmt. In Leserichtung wird sie durch die Bandbreite SW und TD bestimmt, in Phasenkodierrichtung durch die Gradientenschrittweite ∆k. Fur ¨ eine hohe Auflosung ¨ ist die Phasenkodierung der zeitlimitierende Faktor. 63 Kapitel 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT ¨ Uberblick: In diesem Kapitel wird die Etablierung eines zuverl¨assigen, empfindlichen, reproduzierbaren und einfach zu handhabenden Invitro-High-Throughput-Screening-Verfahrens fur ¨ Zytotoxizit¨atsmessungen an Trypanosoma brucei brucei beschrieben. Dieses standardisierte Verfahren diente zur Untersuchung unterschiedlicher Substanzklassen aus den verschiedenen Teilprojektgruppen des SFB 630 auf ihre antitrypanosomale Aktivit¨at. Insgesamt wurden im Rahmen dieses Projektes: 23 Chinolone, 62 Piperidine, 23 Naphthalimide, 164 Naphthylisochinolin-Alkaloide und strukturverwandte, synthetisierte Substanzen, 102 Cysteinprotease-Inhibitoren und 9 Siliziumverbindungen getestet, deren Struktur-Wirkungs-Beziehungen an ausgew¨ahlten Beispielen diskutiert werden. 4.1.1 Auswahl des Testsystems Die Erreger der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis (HAT) Trypanosoma brucei rhodesiense und Trypanosoma brucei gambiense weisen mit Sicherheitsstufe 2 und 3 eine hohe Pathogenit¨at auf. Da einige genetische Untersuchungen die Verwandtschaft der human- und tierpathogenen Trypanosomenst¨amme best¨atigten [166, 249], wurde Trypanosoma brucei brucei (T. b. b.), einer der tierpathogenen Erreger der Nagana-Seuche beim Rind, als Teststamm fur ¨ die Zytotoxizit¨atsmessungen eingesetzt. In dieser Arbeit wurde mit dem Trypanosomenklon T.b.b. TC221 gearbeitet [123]. Diese Blutstromform ist an Kulturbedingungen gut adaptiert und eignet sich daher fur ¨ In-vitro-Arbeiten [140]. Zum Aufbau eines High-Throughput-Screening-Verfahrens wurde auf die in 64 4. Ergebnisse und Diskussion der Literatur beschriebenen Methoden zur Auswertung von Trypanosomenkulturen zuruckgegriffen. ¨ Die Bestimmung der Trypanosomenproliferation und -vitalit¨at kann radiometrisch durch Messung der Einbaurate radioaktiv markierter Nucleotide wie z. B. [3 H]Hypoxanthin [47, 78] oder durch Ausz¨ahlen der kultivierten Trypanosomen mittels Coulter-Counter bzw. mikroskopisch [141] erfolgen (siehe auch Abschnitt 1.2.2 und Abschnitt 1.2.3). Der Nachteil all dieser Methoden ist jedoch ihr hoher Zeitaufwand. Die meisten Verfahren basieren daher auf dem Einsatz von Farbstoffen und einer optischen Auswertung. H¨aufig zur Auswertung von Trypanosomenkulturen angewandte Indikatoren sind z. B. 2’,7’-Bis-(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein-pentaacetoxy-methylester (BCECF-AM) und AlamarBlue [191, 217]. Erfahrungsberichte zeigen, dass mit der AlamarBlue-Methode ein optimales Verfahren zur Bestimmung der Zellproliferation zur Verfugung ¨ steht [217]. Sie erfordert keine Extraktions-, Waschund Zentrifugationsschritte, ist somit zeitsparend und voll automatisierbar [6]. AlamarBlue selbst ist wasserloslich ¨ und nicht zytotoxisch [217]. Seine Anwendung auf Arzneistoff-exponierte Zellkulturen zur Auswertung des antitrypanosomalen Potenzials entspricht in Bezug auf Zuverl¨assigkeit, Sensitivit¨at, Reproduzierbarkeit, einfacher Handhabung und Finanzierbarkeit den Anforderungen eines High-ThroughputScreening-Verfahrens. 4.1.2 AlamarBlue AlamarBlue gehort ¨ zur Gruppe der Reduktions-Oxidations(REDOX)-Indikatoren und wirkt stoffwechselsensitiv. Es nutzt die Eigenschaft proliferierender Zellen das Verh¨altnis zwischen reduzierter und oxidierter Form der Coenzyme NADPH/NADP, FADH/FAD, FMNH/FMN und NADH/NAD stetig zu vergroßern. ¨ O NADPH, FADH, FMNH, NADH, Cytochrom + N O O OH Resazurin (ox.) Indigoblau Absorptionsmaximum: 600 nm N O O OH Resorulfin (red.) Pink Absorptionsmaximum: 570 nm Abbildung 4.1: REDOX-Reaktion im AlamarBlue-Assay. Im Grundzustand liegt AlamarBlue in der oxidierten Form, als Resazurin (λmax =600 nm) vor. Bei einem pH von 7 und bei 25 ◦ C besitzt es ein REDOX-Potenzial 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 65 von +380 mV. Nach Aufnahme in die Zellen wird es wie in Abbildung 4.1 gezeigt durch NADPH, FADH, FMNH, NADH und Cytochromen zum Resorulfin (λmax =570 nm) reduziert. Visuell ist diese Reaktion durch einen Farbumschlag von blau nach pink erkennbar. Die Quantifizierung der Farbreaktion kann sowohl fluorimetrisch als auch ¨ spektralphotometrisch erfolgen. Die Uberlappung der Absorptionsspektren der reduzierten und oxidierten AlamarBlue-Formen erfordert zur spektralphotometrischen Bestimmung des Ausmaßes der Zellproliferation die Messung bei zwei verschiedenen Wellenl¨angen im Bereich der beiden Absorptionsmaxima. 4.1.3 AlamarBlue-Test Der AlamarBlue-Test wird in 96-Mikrotiterplatten durchgefuhrt. ¨ Zur Validierung des Verfahrens mussen ¨ die Zelldichte, Inkubationszeiten und die Mediumzusammensetzung fur ¨ den jeweiligen Teststamm optimiert werden. In der Dissertation von Karin Merschjohann [175] wurde das AlamarBlue-Verfahren bereits auf Trypanosoma brucei brucei TC221 angewandt, so dass auf optimierte Parameter zuruckgegriffen ¨ werden 4 konnte. Dazu wird zun¨achst eine Zellsuspension mit 10 vitalen Zellen pro Milliliter in Baltz-Medium pr¨apariert und mit dem potenziellen Wirkstoff fur ¨ 24 h inkubiert. Vor jedem Versuch sollte sichergestellt werden, dass sich die Parasiten zum Zeitpunkt der Ernte in der exponentiellen Phase befinden. Anderenfalls kann ihre Vermehrungsgeschwindigkeit von Versuch zu Versuch trotz initialer gleicher Parasitendichte stark schwanken und unterschiedliche Ergebnisse fur ¨ die Wirksamkeit einer Substanz liefern. Es ist ferner darauf zu achten, dass das verwendete Losungsmittel ¨ nicht hoher ¨ als in 1 %iger Konzentration in der Zellsuspension vorliegt um eine mogliche ¨ losungsmit¨ telbedingte Zytotoxizit¨at auszuschließen. Den Arzneistoff-exponierten Inokula werden schließlich 10 % AlamarBlue zugesetzt und und der gesamte Ansatz fur ¨ weitere 24 h inkubiert. Kein Farbumschlag spricht fur ¨ eine starke Inhibition der Zellen. Eine Pinkf¨arbung ist dagegen ein Indiz fur ¨ eine schwache Inhibition und eine starke Zellproliferation. Die Auswertung erfolgte spektralphotometrisch mittels ELISAReader. Zur Bestimmung der Differenzabsorption zwischen oxidierter und reduzierter AlamarBlue-Struktur wurden die Messwellenl¨angen in Anlehnung an die Produktinformationen der Firma Trinova Biochem auf 550 nm und 630 nm festgelegt [3]. Nach der photometrischen Auswertung werden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt. Hier wird die gemessene Differenzabsorption in Bezug auf den Messwert einer Positivkontrolle (Zellsuspension mit 1 % Losungsmittel ¨ und 10 % AlamarBlue) berechnet und gegen die eingesetzten Testkonzentrationen aufgetragen. Aus den sigmoidalen DosisWirkungs-Kurven wird mittels linearer Interpolation der ED50 -Wert [134] (Abschnitt 1.2.2) berechnet. Das verwendete Testverfahren, die Mediumzusammensetzung und die Berechnung der ED50 sind im Experimentellen Teil ausfuhrlich ¨ beschrieben. 66 4. Ergebnisse und Diskussion 4.1.3.1 Losungsmittel ¨ Absorbance [% of control] Die AlamarBlue-Methode sollte zur Testung vieler verschiedener Substanzklassen angewandt werden. Dazu war es notwendig zun¨achst die einzusetzenden Losungsmit¨ tel DMSO, EtOH und 0.1 M NaOH auf ihre zytotoxische Wirkung zu untersuchen und mogliche ¨ Reaktionen mit AlamarBlue, die zu spektralen Verschiebungen fuhren ¨ konnen, ¨ auszuschließen. In Abbildung 4.2 sind die gemessenen Differenzabsorptionen inokulierter Trypanosomenkulturen unter Zusatz verschiedener Losungsmittelkon¨ zentrationen in Bezug auf den Messwert einer Kontrollsuspension (Trypanosomenkultur ohne Losungsmittelanteil) ¨ in einem Dosis-Wirkungs-Diagramm aufgetragen. W¨ahrend 0.1 M NaOH selbst bei 10 %igem Anteil keine Auswirkung auf die Zellproliferation zeigt, fuhren ¨ EtOH und DMSO ab einer Konzentration von 2.5 % zu einer nahezu vollst¨andigen Hemmung des Zellwachstums. In Anwesenheit eines 1 %igen Losungsmittelanteils ¨ bleibt die Zellproliferation bei EtOH unbeeinflusst. Bei DMSO dagegen werden nur 60 % des naturlichen ¨ Wachstums erreicht. Eine weitere Reduktion des Losungsmittelanteiles ¨ war jedoch aufgrund der teilweisen schlechten Loslichkeit ¨ der Testsubstanzen nicht moglich, ¨ so dass auch unter Verwendung von DMSO, die Zytotoxizit¨atsmessung mit 1 %igem Losungsmittelanteil ¨ durchgefuhrt ¨ wurde. Rein rechnerisch betrachtet, bringt dies keine Nachteile mit sich, denn die Zytotoxizit¨at wird stets in Bezug auf eine losungsmittelenthaltende ¨ Positivkontrolle ermittelt. Eine Verst¨arkung der antitrypanosomalen Wirkung der Testsubstanzen ist jedoch nicht auszuschließen. Hinweise auf Interaktionen zwischen AlamarBlue und verschiedenen Losungsmitteln ¨ und dadurch Verschiebungen seiner Absorptionsbanden a¨ hnlich der Solvatochromie konnten nicht gefunden werden. 140 0.1 M NaOH 120 DMSO EtOH 100 80 60 40 Abbildung 4.2: Dosis-WirkungsDiagramme verschiedener Los¨ ungsmittel fur ¨ den Teststamm Trypanosoma brucei brucei. 20 0 0 2 4 6 8 10 Concentration [%] 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 67 4.1.3.2 Referenzsubstanzen Absorbance [% of positive-control ] ¨ Zur Uberpr ufung ¨ des AlamarBlue-Test-Verfahrens unter den gegebenen Laborbedingungen wurde die Wirksamkeit der derzeitig zur Therapie der HAT eingesetzten Arzneistoffe Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na, Eflornithin-HCl, Nifurtimox und Melarsoprol auf T. brucei brucei bestimmt. Die Wirkung dieser Substanzen ist in der Literatur gut dokumentiert und eignet sich somit als Referenzwert. 120 Pentamidin diisethionat Suramin-Na 100 Eflornithin-HCl Nifurtimox 80 Melarsoprol 60 40 20 0 -5 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 1 2 10 10 Concentration [ µM] Abbildung 4.3: Dosis-Wirkungs-Kurven von Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na und Eflornithin-HCl (gelost ¨ in H2 O), Nifurtimox und Melarsoprol (gelost ¨ in DMSO). Berechnet wurden die Konzentrationen auf die Salz-freie Arzneistoffform. Aufgetragen sind die Mittelwerte aus drei unabh¨angigen Testdurchl¨aufen. (Bei den Punkten, bei welchen keine Fehlerbalken zu erkennen sind, ist die Abweichung sehr klein.) Arzneistoff T. b. b. ED50 (gemessen) [µM] T. b. b. ED50 (Literaturwert) [µM] Pentamidin diisethionat Suramin-Na Eflornithin-HCl Melarsoprol Nifurtimox 0.0029±0.0002 0.31±0.05 22.9±4.6 0.0026±0.0004 3.4±0.4 0.0002-0.002 [176] 0.007-21.3 [176] 11.5 [175] - Tabelle 4.1: Gegenuberstellung ¨ der gemessenen und der in der Literatur dokumentierten antitrypanosomalen Aktivit¨at von Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na, Eflornithin-HCl, Melarsoprol und Nifurtimox. Die Werte beziehen sich auf die Salz-freie Arzneistoffform. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei unabh¨angigen Testdurchl¨aufen berechnet. Bei Melarsoprol und Nifurtimox ließen sich Referenzwerte nicht eruieren. 68 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.3 zeigt die entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven im Konzentrationsbereich zwischen 100 µM und 10 pM. Aus diesen wurden die entsprechenden ED50 Werte mittels linearer Interpolation berechnet und mit den in der Literatur dokumentierten Ergebnissen verglichen (Tabelle 4.1). Die Literaturwerte mussen ¨ kritisch betrachtet werden, denn aufgrund der vielen Moglichkeiten ¨ Zytotoxizit¨at zu bestimmen, streuen sie uber ¨ einen breiten Wirkbereich. Die eigens ermittelten Ergebnisse liegen jedoch akzeptabel im dokumentierten Bereich und korrespondieren sehr gut mit den Ergebnissen aus dem Arbeitskreis Steverding in Norfolk (Eflornithin: ED50 =11.5 µM, Pentamidin-diisethionat: ED50 =0.0025 µM, Suramin: ED50 =0.36 µM), womit die Richtigkeit der Durchfuhrung ¨ des Testverfahrens best¨atigt ist. Die funf ¨ zur Verfugung ¨ stehenden Arzneistoffe dienten w¨ahrend des gesamten Projektes als Referenzsubstanzen und wurden von Zeit zu Zeit zur Kontrolle der Testung und der Protozoenkultur eingesetzt. Dadurch konnten Fehler in der Routine und mogliche ¨ Mutationen und Verunreinigungen der Zellkulturen schnell erkannt und die Richtigkeit des Verfahrens gew¨ahrleistet werden. Da neben der Richtigkeit der Methode auch die Reproduzierbarkeit gegeben war - die Streuung der berechneten ED50 lag unterhalb der fur ¨ Biotests ublichen ¨ 30 % [216] - waren die beiden wichtigsten Voraussetzungen zum Einsatz des AlamarBlue-Tests zur Reihenuntersuchung der Zytotoxizit¨at von Substanzen auf Trypanosomen erfullt. ¨ 4.1.3.3 Etabliertes Testsystem Routinemessungen zeigten jedoch bald Grenzen des Testsystems. So wiesen einige TestsubstanO 17 zen ein ausreichendes REDOX-Potenzial auf (< 4 5 O 3 10 6 +380 mV), um Resazurin zum Resorulfin zu re2 7 duzieren. Entdeckt wurde diese F¨ahigkeit an den 9 8 N1 H Strukturabkommlingen ¨ des Antidesmon. AntiO desmon ist ein pflanzliches Alkaloid, welches Abbildung 4.4: Antidesmon 1996 erstmals isoliert wurde und aufgrund seiner Struktur und seines Syntheseweges als erster Repr¨asentant einer neuen Klasse von Alkaloiden gilt [40, 44]. Durch spektroskopische Untersuchungen und Derivatisierungen wurde die Struktur als 3-Methoxy-2-methyl5-n-octyl-1,5,6,7-tetrahydro-chinolin-4,8-dion aufgekl¨art [40]. Interesse an dieser Strukturgruppe weckte vor allem seine hohe Aktivit¨at gegenuber ¨ Trypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit, seine schwache Wirksamkeit gegen Leishmania donovani und sein bisher unbekannter Wirkmechanismus [117]. Eine Wirksamkeit gegenuber ¨ einer Trypanosoma brucei-Spezies konnte bisher zwar nicht gezeigt werden, dennoch wurden die in Abbildung 4.6 dargestellten Strukturabkommlinge ¨ des Antidesmon auf ihre Wirksamkeit gegenuber ¨ Trypanosoma brucei brucei getestet. Auf den ersten Blick 18 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 69 O 5 OH 4 OH 3 10 6 4 5 3 10 6 2 7 2 7 9 N1 Me H 3-Hydroxy-2-methyl1H-chinolin-4-on 8 OH 9 N 8 1 Me 3,4-Dihydroxy-2-methylchinolin OH O + O OH N O N + OH O O + Me N O O Resazurin (ox.) Me N OH Resorulfin (red.) Abbildung 4.5: REDOX-Reaktion im AlamarBlue-Test. O O O OMe N Me N Me O O H Me OMe OH Me N Me OMe Me N Me H O OMe N OH O O O NH2 O O O O N H N O Abbildung 4.6: Strukturverwandte Substanzen des Antidesmon ohne Wirksamkeit gegen Trypanosoma brucei brucei (d. h. der berechnete ED50 -Wert lag uber ¨ 100 µM). zeigte keine der Strukturen eine Aktivit¨at. Selbst bei Konzentrationen von 100 µM lag Resazurin nahezu vollst¨andig zu Resorulfin reduziert vor. Die Unwirksamkeit dieser Substanzgruppe konnte allerdings erst durch visuelle, mikroskopische Kontrolle und das Ausz¨ahlen beweglicher Trypanosomen best¨atigt werden, denn es zeigte sich, dass alle Strukturen mit einem 3-Hydroxy-2-methyl-chinolin-4-on-Gerust ¨ in das REDOX-System des AlamarBlue eingreifen. Wie in Abbildung 4.5 dargestellt, liegt das 3-Hydroxy-2-methyl-chinolin-4-on in Losung ¨ im Gleichgewicht mit seinem entsprechenden 3,4-Dihydroxy-chinolin vor. Vermutlich kann dieses a¨ hnlich dem Chinon- 70 4. Ergebnisse und Diskussion k ti v i s lle ro t on o lle ro P t on e n h k c v ti ei om gl ga nos b e N pa lla Nu z Try n l sta tel + b ti te it u m s m t s s Testung potenzieller Wirksubstanzen g g es un M T sun s im Konzentrationsbereich: Lö Lö 0 µ 100 µM bis 10 pM 10 + 1% 1% + + m iu m d iu m d iu d e e e rm urm turm u t t l l l Ku Ku Ku Kulturmedium + Trypanosomen + Testsubstanzen in Verdünnungen Abbildung 4.7: Schema des etablierten AlamarBlue-Test-Verfahrens. Hydrochinon-REDOX-Paar, durch AlamarBlue zum 2-Methyl-chinolin-3,4-dion oxidiert werden. Eine Erweiterung des Test-Verfahrens um eine Negativkontrolle (Medium + Testsubstanz + AlamarBlue), in der das REDOX-Potenzial gegenuber ¨ Resazurin gepruft ¨ werden konnte, erwies sich somit als notwendig, um Substanzen, die in ihrer Wirkung f¨alschlicherweise als negativ eingestuft wurden, entdecken zu konnen. ¨ Der etablierte AlamarBlue-Test wurde optimiert nach dem Schema aus Abbildung 4.7 durchgefuhrt. ¨ Zeigte eine Testsubstanz eine positive Pink-F¨arbung der Negativkontrolle, konnte die Zytotoxizit¨at nicht mittels AlamarBlue-Verfahren bestimmt werden und die kultivierten Zellsuspensionen wurden durch mikroskopisches Ausz¨ahlen vitaler, d. h. mobiler Zellen ausgewertet. 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 71 4.1.4 Struktur-Wirkungs-Beziehungen benzannelierter Systeme 4.1.4.1 Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) Interessante Alkaloide fur ¨ die Leitstruktursuche gegen tropische Protozoen-Erkrankungen sind vor allem in der GrupN pe der Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) zu finden. Einigen dieser Substanzen wie z. B. Dioncopeltin A und Dioncophyllin B und C konnte sowohl in vitro als auch in viAbbildung 4.8: vo eine hohe Aktivit¨at gegen Plasmodium falciparum [99] Naphthylisochinolin nachgewiesen werden, andere hingegen zeigten gegen Erreger der Leishmaniose [33], Chagas-Krankheit und Afri¨ kanischen Schlafkrankheit [29, 36, 40] eine vielversprechende Aktivit¨at. Uber mogli¨ che Zielstrukturen und Wirkmechanismen liegen jedoch noch keine Erkenntnisse vor. Das Grundgerust ¨ bildet bei dieser Substanzgruppe das Isochinolin, an welches eine Naphthalin-Einheit geknupft ¨ ist. Bisher wurden 120 Naphthylisochinolin-Alkaloide aus afrikanischen Lianen-Gew¨achsen isoliert. Ihr Vorkommen beschr¨ankt sich auf die Familie der Dioncophyllaceae, die in drei Gattungen auftritt Habropetalum, Dioncophyllum und Triphyophyllum, und auf die eng verwandte Familie der Ancistrocladusaus mit der monotypischen Gattung Ancistrocladus [30, 37]. Im Rahmen dieser Studie wurde eine große Bibliothek verwandter Substanzen aus Natur und Synthese aufgebaut und in vitro auf Trypanosoma brucei brucei getestet. 5 4 3 6 7 8 1 2 4.1.4.1.1 C,C-verknupfte ¨ NIQs Die Ergebnisse einiger C,C-verknupfter ¨ NIQs sind in Abbildung 4.9 zusammengestellt. Bei dieser Alkaloid-Gruppe ist das Naphthalin mit dem Isochinolin uber ¨ eine C,C-Biaryl-Achse verbunden. Bei unseren Untersuchungen wurde zun¨achst vom Dioncophyllin A (1), einem sehr gut verfugbaren ¨ Naphthylisochinolin-Alkaloid, welches sowohl aus der westafrikanischen Triphyophyllum-peltatum-Liane isoliert [38], als auch synthetisch gewonnen wurde [34], ausgegangen. Es zeigte mit einem ED50 Wert von 3.4±1.7 µM eine vergleichbare Aktivit¨at zu Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM). ¨ Ahnliche Ergebnisse wurden mit den strukturverwandten Substanzen Dioncophyllin B (2) [41] (ED50 =2.6±0.4 µM), Dioncophyllin C (3) [39] (ED50 =4.2±2.3 µM) und 5’-O-Demethyldioncophyllin A (5) [43] (ED50 =3.8±1.3 µM) erreicht. Ausgehend von 5’-O-Demethyldioncophyllin A fuhrt ¨ eine zus¨atzlich eingefugte ¨ Hydroxy-Gruppe an den Methyl-Rest des Naphthalins im Dioncopeltin A (4) [42] zu einer Reduktion der Aktivit¨at im Großenbereich ¨ einer Zehnerpotenz (ED50 =22.2±4.8 µM). Ebenfalls zeigten Korupensamin A (6) (ED50 =48.6±4.8 µM) und Korupensamin B (7) [32] (ED50 =45.8±5.1 µM) mit jeweils zus¨atzlicher Hydroxy-Gruppe an Position 6 des Tetrahydroisochinolin-Gerustes ¨ stark verminderte Aktivit¨at, welche im dimeren Mi- 72 4. Ergebnisse und Diskussion chellamin B (8) [45] (ED50 > 65.9µM), das durch seine anti-HIV-Wirksamkeit bekannt wurde, noch weiter abnahm. Interessant erwies sich dagegen das dimere Ancistrogriffithin A (10) [45] (ED50 =0.85± 0.05 µM). Es besitzt, verglichen mit Michellamin B, zwei O-Methylierungen mehr und seine Wirkung kommt der des Suramin (ED50 =0.31±0.05 µM) sehr nahe. Fur ¨ sein monomeres Ancistrogriffin C (11) (ED50 >65.9 µM) konnte keine Wirkung nachgewiesen werden. Die Wirkung des strukturverwandten Ancistrogriffin A mit terti¨arer Amino-Gruppe (9) (ED50 =14.1±1.3 µM) lag dagegen noch im Wirkbereich von Eflornithin (ED50 =22.9±4.6 µM). Ancistroealain A (12) (ED50 =4.5 ±0.8 µM), einem der aktivsten Naphthylisochinolin-Alkaloide gegen Leishmania donovani, zeigte mit seinen zwei Methoxy-Gruppen an einem Dihydroisochinolin-Gerust ¨ eine vergleichbare Aktivit¨at mit Dioncophyllin A (1) (ED50 =3.4±1.7 µM). Mit vollst¨andig dehydriertem Isochinolin-Gerust ¨ wurden die beiden Substanzen ent-Dioncophyllein A (13) und Dioncophyllein D (14) n¨aher untersucht. Dioncophyllein D besitzt im Gegensatz zu den bisher diskutierten Substanzen keine stabile Konfiguration und liegt in der P- und M-Konfiguration im Gleichgewicht vor. Beide Substanzen wiesen gegenuber ¨ Dioncophyllin A eine um etwa eine Zehnerpotenz verminderte Wirksamkeit auf. Um die Beeinflussung der antitrypanosomalen Aktivit¨at durch O-Methylierung der Hydroxy-Gruppe am Isochinolin-Gerust ¨ und dessen Hydrierungsgrad zu untersuchen, wurden die synthetisierten Naphthalin-freien Substanzen (15-17b) getestet. Dabei zeigte Substanz (15) mit seiner 1R,3R-Konfiguration am TetrahydroisochinolinRing keine Wirkung. Ebenso erwies sich das korrespondierende Dihydroisochinolin (16a) als unwirksam. Das O-methylierte Pendant (16b) zeigte dagegen mit einem ED50 Wert von 56.1±15.3 µM eine schwache Aktivit¨at. Die Verst¨arkung der antitrypanosomalen Wirksamkeit durch O-Methylierung konnte auch bei den 3S-konfigurierten Analoga beobachtet werden (Substanzen (17a) und (17b)), wobei die Aktivit¨at von Substanz (17b) die Wirksamkeit von Eflornithin (ED50 =22.9±4.6 µM) erreichte. Fazit: Eine gute antitrypanosomale Wirksamkeit mit einem ED50 -Wert zwischen 3 und 4 µM zeigten C,C-verknupfte ¨ Naphthylisochinolin-Alkaloide • mit einer oder zwei phenolischen Hydroxy-Gruppen und • unabh¨angig vom Hydrierungsgrad des Isochinolin-Gerustes. ¨ Eine Abschw¨achung der Aktivit¨at zeigte sich vor allem bei einer zu hohen Anzahl freier Hydroxy-Funktionen. 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 73 OH OMe Me Me Me 1' 7 6' R NH 7 OH OH MeO MeO o R R NH P R OH Me P 51' Me R NH OH Dioncophyllin B (2) ED50 = 2.6 ± 0.4 µM Dioncophyllin A (1) ED50 = 3.4 ± 1.7 µM ED50 = 4.2 ± 2.3 µM Me 1' Me R M R NH 7 R P Me R NH 7 1' OH MeO HO OH MeO HO 5' Me Dioncopeltin A (4) 5'-O-Demethyldioncophyllin A (5) ED50 = 22.2 ± 5.1 µM ED50 = 3.8 ± 1.3 µM Me MeO OH HO P Me Me HO M M 5''' OH 8'' OH Me R R R OMe OH NH Me Korupensamin A (6) ED50 = 48.6 ± 4.8 µM OH 5 Me Me R R NH Korupensamin B (7) ED50 = 45.8 ± 5.1 µM Me P 8' HO OH OMe o 8' 5 R NH 2 OAc R Me 8' 5 OH HN R MeO OH Me Me Me Dioncophyllin C (3) Me HO Me R OMe Me Me OH Michellamin B (8) ED50 > 65.9 µM Me 74 4. Ergebnisse und Diskussion Me HO Me S P 1' 7 8' 7 MeO HO S NH R Me Me Me S S NH P Me OMe Me MeO HO MeO S NMe OH Me Ancistrogriffin C(11) Ancistrogriffin A(9) ED50 = 14.1 ± 1.3 µM OMe HO 7''' 8'' M Me ED50 > 65.9 µM OMe OH 6'' 6' o OMe OH MeO Me M 8' 7 OH MeO OMe Me R HN S P 8' MeO M Me 5 Me 6 Me Me S MeO MeO Ancistrogriffithin A(10) N N 1' 7 Me OH Me ED 50 = 0.85 ± 0.05 µM ent-Dioncophyllein A (13) OMe Me ED50 = 33.3 ± 20.3 µM Ancistroealain A (12) ED50 = 4.5 ± 0.8 µM Me Me 6 7' 8' 8' 7 MeO MeO N OH N P M 7' Me 6 7 fast OH MeO MeO Me Me Me Dioncophyllein D(14) ED50 = 50.9 ± 18.7 µM HO Me R R NH RO Me R a b N OMe Me 16 R ED50 [µM] H >65.9 Me 56.1 ± 15.3 OMe Me (15) ED50 > 65.9 µM RO Me S N 17 6 a b R ED50 [µM] H >65.9 Me 21.7 ± 9.2 OMe Me Abbildung 4.9: Antitrypanosomale Aktivit¨at (T. b. b.) C,C-verknupfter ¨ Naphthylisochinolin-Alkaloide und Untersuchungen zum Isochinolin-Grundgerust. ¨ 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 75 4.1.4.1.2 N,C-verknupfte ¨ NIQs Mit der Entdeckung der N,C-verknupften ¨ Naphthylisochinolin-Alkaloide konnte das Spektrum moglicher ¨ Verknupfungsarten ¨ erweitert werden [31, 287]. Abbildung 4.10 zeigt die Substanz Ancistrocladinium B [35] mit ihrer quart¨aren, kationischen Isochinolin-Struktur als Trifluoracetat-Salz. Sie wurde aus einer Ancistrocladus Spezies isoliert und steht wie das Dioncophyllein D in ihrer P- und M-Konfiguration im Gleichgewicht. Ihre antitrypanosomale Wirkung wurde zu einem ED50 -Wert von 0.35±0.02 µM bestimmt und liegt damit im Wirkbereich des Suramin (ED50 =0.31±0.05 µM). Me MeO S + N 26 OMe Me TFA OH P - OMe Me MeO slow S + M TFA N 2 6 OMe Me Me HO Me - MeO Ancistrocladinium B (18) ED50 = 0.35 ± 0.02 µM Abbildung 4.10: Ancistrocladinium B, ein Naphthylisochinolin mit C,N-Verknupfung ¨ zwischen Naphthalin und Isochinolin und ihre antitrypanosomale Aktivit¨at gegen Trypanosoma brucei brucei. Me MeO + N R ClO4 OMe Me ED50 –Werte: OMe MeO Cl Me 3.1 ± 0.1 µM (24) 1.1 ± 0.2 µM Br OMe (19) 2.0 ± 0.5 µM (25) 0.29 ± 0.01 µM (20) 0.50 ± 0.06 µM (26) 0.33 ± 0.00 µM (21) 0.39 ± 0.03 µM (27) 0.02 ± 0.00 µM (22) 3.0 ± 0.1 µM (23) (28) 0.03 ± 0.00 µM (29) 0.03 ± 0.00 µM Abbildung 4.11: Quart¨are Isochinolin-Salze mit Hetero-Biaryl-Achse und ihre antitrypanosomale Aktivit¨at gegen Trypanosoma brucei brucei. 76 4. Ergebnisse und Diskussion Die im Vergleich zu den C,C-verknupften ¨ Biarylen wie Dioncophyllin A (1), B (2) und C (3) 10-fach hohere ¨ Aktivit¨at des Ancistrocladinium B (18) lockte zunehmendes Interesse an dieser N,C-verknupften ¨ Substanzklasse. Um mehr Einsicht in die molekularen Voraussetzungen fur ¨ eine gute antitrypanosomale Wirkung zu bekommen, wurden die quart¨aren Isochinolin-Salze in Abbildung 4.11 als Perchlorate getestet. Es handelt sich dabei um vollst¨andig aromatische, von Ancistrocladinium B (18) abgeleitete Isochinolin-Analoga mit uber ¨ eine N,C-Hetero-Biaryl-Achse verknupften, ¨ einfachen Aromaten. Untersucht wurden methoxy-, chlor-, brom- und methylsubstituierte Phenyle sowie Naphthalin und Anthracen. Unter den Phenylen (Substanzen (19) bis (24)) zeigten alle Substanzen eine Aktivit¨at im Wirkbereich des Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM). Als besonders wirksam erwies sich die Methoxy-Substitution in ortho und metaStellung im Phenylisochinolin (ED50 =0.50±0.06 µM und 0.39±0.03 µM). Moglicher¨ weise begunstigt ¨ diese Konformation die Wechselwirkung mit der Zielstruktur, die bis jetzt jedoch unbekannt ist. Eine kontinuierliche Steigerung der Wirksamkeit konnte durch Substitution des aromatischen Phenyl gegen Naphthalin und Anthracen erreicht werden (Substanzen (25) bis (29)). Die vielversprechendste Wirkung zeigte das Anthracen-substituierte Isochinolin mit einem, im Vergleich zu den Phenyl-Analoga, um zwei Zehnerpotenzen niedrigeren ED50 -Wert. Ursache liegt vermutlich in der zunehmenden Lipophilie der Substanzen, wodurch die Aufnahme in die Zellen und das Erreichen der Zielstrukturen begunstigt ¨ wird. Fazit: • N,C-verknupfte ¨ Naphthylisochinolin-Alkaloide weisen im Vergleich zu C,Cverknupften ¨ eine hohere ¨ antitrypanosomale Aktivit¨at auf. • In der Reihe arylverknupfter ¨ quart¨arer Isochinoline steigt die Wirksamkeit mit hoher ¨ kondensierten Aromaten. 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 77 4.1.4.2 Fluorchinolone Fluorchinolone sind eine Klasse synthetischer Antibiotika. Mit ihrem Chinolin-Gerust ¨ sind sie den Isochinolinen strukF 4 turell sehr a¨ hnlich. Ihre bakterizide Wirkung beruht auf OH der Hemmung der DNA-Gyrase und Topoisomerase-II (AbR7 X N R2 schnitt 4.3.3). Die Topoisomerase-II ist aber auch in TrypaR1 nosomen ein Schlusselenzym ¨ fur ¨ Zellwachstum und ZellteiAbbildung 4.12: lung und eine In-vitro-Aktivit¨at von Fluorchinolonen gegen Fluorchinolon Trypanosomen konnte bereits in einigen Arbeiten gezeigt werden [144]. Die bakterizide Aktivit¨at der Fluorchinolone wird vor allem durch die funktionellen Gruppen der R1-, R5- und R7-Substituenten bestimmt. Dabei erwiesen sich Substanzen mit einer Cyclopropan-, oder Difluor-phenyl-Gruppe in Position N1 und einem Piperazin-Ring in Position 7 als besonders wirksam. Von dieser Information ausgehend wurden zur Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bezuglich ¨ der antitrypanosomalen Wirkung, die in Tabelle 4.2 gelisteten Fluorchinolone [139] gegen Trypanosoma brucei brucei getestet. Untersucht wurde dabei der Einfluss verschiedener Substituenten am Phenyl- und am Piperazin-Ring. Gute Aktivit¨aten im Wirkbereich von Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM) zeigten sich bei N1-phenyl-substituierten 4chinolonen ohne Substitution am Phenyl-Ring (30) mit einem ED50 -Wert von 9.71±1.84 µM und nach para-Methylierung (36) ( ED50 =2.66±0.07 µM) desselben. Vergleicht man die Auswirkung der Methyl-Gruppe an unterschiedlichen Positionen, so nimmt die Wirkung von der para- uber ¨ die meta- zur ortho-Position hin kontinuierlich ab. In ortho-Position war mit einem ED50 -Wert von 62.58±5.76 µM nahezu keine Aktivit¨at mehr nachweisbar. Bei Substitution der Methyl-Gruppe gegen eine freie phenolische Hydroxy-Funktion (Substanzen (45) und (46)) konnte in keiner Position eine Wirksamkeit beobachtet werden. Die Reduktion der Aktivit¨at durch Erhohung ¨ des Anteils phenolischer Hydroxy-Gruppen wurde bereits bei der Testung der NaphthylisochinolinAlkaloide festgestellt und diskutiert. Nach O-Methylierung der phenolischen OHFunktion (Substanzen (31) bis (33)), zeichnete sich auch hier wieder eine verst¨arkte Wirkung ab, die sich analog zu den Substanzen (32) bis (34) in para-Position mit einem ED50 -Wert von 8.22±0.89 µM am effektivsten zeigte. CF3 und F-Substitution (Substanzen (37) bis (42)) fuhrte ¨ zu einer Abschw¨achung der Wirkung, die jedoch noch fur ¨ alle drei Positionen im Wirkbereich des Eflornithin (ED50 =22.9±4.6 µM) lag. Bei Einfugung ¨ einer Nitro-Funktion (Substanzen (43) und (44)) wurde dagegen nur eine schwache Wirksamkeit gemessen, die unter CN-Substitution (Substanzen (47) bis (49)) g¨anzlich verschwand. Die Frage ob eine zus¨atzliche Alkylierung des Piperazin-Ringes und damit eine Erhoh¨ ung der Lipophilie zu einer Steigerung der antitrypanosomalen Aktivit¨at fuhrt, ¨ wurR5 O O 5 3 6 2 7 8 1 78 4. Ergebnisse und Diskussion de an N1-phenyl-substituierten-4-chinolonen mit Methoxy-Substitution am PhenylRing untersucht (Substanzen (50) bis (52)). Hier konnte gegenuber ¨ unsubstituierten Piperazin-Analoga keine signifikante Verbesserung gefunden werden. Fazit: • In der Gruppe der N1-phenyl-7-piperazin-substituierten Fluorchinolone weisen Substanzen mit para-Methoxy- oder para-Methyl-Funktion die hochste ¨ antitrypanosomale Aktivit¨at auf. • Analog der Naphthylisochinolin-Alkaloide wird auch bei dieser Substanzgruppe die Wirksamkeit durch Hydroxy-Substitution abgeschw¨acht. 4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT O O F N R2 79 5 4 6 3 7 N1 8 OH 2 N R1 Substanz R1 R2 T. b. b. ED50 [µM] (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) (50) (51) (52) H o-OCH3 m-OCH3 p-OCH3 o-CH3 m-CH3 p-CH3 o-CF3 m-CF3 p-CF3 o-F m-F p-F m-NO2 p-NO2 m-OH p-OH o-CN m-CN p-CN m-OCH3 p-OCH3 p-OCH3 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H CH3 CH3 C 3 H7 9.71±1.84 66.34±17.62 22.38±3.20 8.22±0.89 62.58±5.76 10.21±3.76 2.66±0.07 43.81±12.5 28.74±2.67 18.03±3.22 44.78±1.56 21.66±7.44 25.94±2.33 59.21±6.65 64.48±9.02 >65.9 >65.9 >65.9 >65.9 >65.9 23.59±8.41 19.62±2.67 10.96±0.91 Tabelle 4.2: Fluorchinolone und ihre antitrypanosomale Aktivit¨at. 80 4. Ergebnisse und Diskussion 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen ¨ Uberblick: Im Folgenden wird eine kapillarelektrophoretische (CE) Methode zur Charakterisierung und Trennung verschiedener Bakterienst¨amme und deren Agglomerate und Ketten entwickelt. Das Hauptaugenmerk liegt auf der Standardisierung und Optimierung der Bakterienproben, der Pufferlosungen ¨ und der CE-Bedingungen zur Etablierung einer robusten, reproduzierbaren und pr¨azisen AnalyseTechnik, die sich zur Weiterentwicklung als Zytotoxizit¨atstest eignet. 4.2.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels Kapillarelektrophorese Die Eigenschaft von Bakterien Agglomerate und Ketten zu bilden ist zum einen bakterienspezifisch und zum anderen abh¨angig von der a¨ ußeren Umgebung. Fur ¨ eine bestimmte Bakterienspezies ergibt sich daraus je nach pH, Ionenst¨arke und Zusammensetzung verschiedener Ionen eine charakteristische Großenverteilung ¨ verschiedener Biokolloide im Großenbereich ¨ weniger µm [224]. Zusammen mit der Ladung der Zelloberfl¨ache bestimmt diese Großenverteilung ¨ die unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilit¨aten (Abschnitt 3.2.2.2). Die Ladung einer Zelle, von deren Hulle ¨ haupts¨achlich Aminos¨aurereste, geladene Zucker und Zuckerlipide nach außen ragen, ist auch bei gleicher Elektrolytumgebung bei Gram-positiven und -negativen Bakterien unterschiedlich. Dies ist in der verschiedenartigen Zusammensetzung der Zellwand begrundet ¨ (Abschnitt 3.2.1.1). Neben der a¨ ußeren Umgebung bestimmt auch die Alterung einer Zelle die a¨ ußere Ladung. Die Verteilung der elektrophoretischen Mobilit¨aten kann somit zur Erstellung charakteristischer und bakterienspezifischer Peakmuster genutzt werden. Die Anzahl, Reihenfolge und die Form der Signale im Elektropherogramm charakterisieren dabei den elektrophoretischen Fingerabdruck (”fingerprint”). So muss z. B. eine Peakverbreiterung kein Fehler der Methode sein, sondern kann durch die Große ¨ und Form der detektierten Kolloide verursacht werden [77]. 4.2.2 Auswahl verschiedener Bakterienst¨amme Zur Entwicklung einer CE-Methode zur Trennung und Charakterisierung verschiedener Bakterien, die sich zur Etablierung eines Zytotoxizit¨atstests fur ¨ die Bestimmung antibakterieller Wirksamkeiten potenzieller Wirkstoffe eignet, wurden die folgenden Rahmenbedingungen an die auszuw¨ahlenden Bakterien gestellt: 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 81 1. Apathogene Bakterienst¨amme: Die Arbeiten fanden in einem Labor der Sicherheitsstufe 1 statt. 2. Unterschiedliche Empfindlichkeit gegenuber ¨ Antibiotika, um einen Vergleich verschiedener Wirksubstanzen zu ermoglichen. ¨ 3. Unterschiedliche elektrophoretische Eigenschaften, um den elektrophoretischen Fingerabdruck verschiedener Bakterienst¨amme vergleichen zu konnen ¨ und die elektrophoretische Trennung verschiedener Bakterienst¨amme zu ermoglichen. ¨ Die ausgew¨ahlten Bakterien sollten sich somit in ihrer • Oberfl¨achenladung, verursacht durch die unterschiedliche Zellwandzusammensetzung Gram-positiver und -negativer Bakterienst¨amme • Große ¨ und Form (Kokken und St¨abchen) einschließlich der Begeißelung, wodurch eine Eigendynamik erzeugt wird • Tendenz der Ketten- und Clusterbildung unterscheiden. Die Auswahl der Bakterienst¨amme zur Methodenentwicklung fiel auf Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens und Streptococcus vestibularis. Tabelle 4.3 zeigt eine Zusammenfassung der mikrobiologischen Eigenschaften. Die Unterscheidung zwischen Aerobiern und Anaerobiern spielt zwar fur ¨ die elektrophoretischen Eigenschaften keine Rolle, ist aber fur ¨ die Standardisierung der Bakterienkulturen in Abschnitt 4.2.4 maßgeblich. Bakterium M. luteus GramF¨arbung positiv P. fluorescens negativ S. vestibularis positiv Form Geißeln Kokken unregelm¨aßige Cluster St¨abchen gekrummte ¨ Ketten Kokken unregelm¨aßige Ketten unbeweglich eine oder mehrere Geißeln unbeweglich Aerobier/ Anaerobier strenge Aerobier strenge Aerobier fakultativ anaerob Tabelle 4.3: Charakterisierung der zur Methodenentwicklung ausgew¨ahlten Bakterienst¨amme. 82 4. Ergebnisse und Diskussion (a) Micrococcus luteus (b) Pseudomonas fluorescens (c) Streptococcus vestibularis Abbildung 4.13: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen der zur Methodenentwicklung ausgew¨ahlten Bakterienst¨amme, in der fruhen ¨ station¨aren Phase. Bildgroße: ¨ 86.5 µm x 64.6 µm. Bei allen Bakterienarten handelt es sich um apathogene Bakterienst¨amme mit naturli¨ chem Vorkommen. Die Gattung Micrococcus gehort ¨ wie die Gattung Staphylococcus zur Familie der Micrococcaceae, besitzt im Gegensatz dazu aber keine humanpathogene Bedeutung. Sie spielt als strenger Aerobier eine bedeutende Rolle in der menschlichen und tierischen Haut- und Schleimhautflora und ist auch h¨aufig in Staub und Wasser zu finden [204]. Wie in Abbildung 4.13a zu sehen, agglomerieren die unbeweglichen Gram-positiven Kokken zu einer Vielfalt unregelm¨aßiger Cluster, die von einzelnen Zellen bis hin zu Clustergroßen ¨ von 20 und mehr Zellen reichen. Der Stamm P. fluorescens (Familie: Neisseriaceae) ist ein Bewohner von Pflanzen, Feuchtstellen, Boden und Wasser. Neben seinem h¨aufigen Vorkommen im Krankenhausmilieu, kann er auch als Entzundungserreger ¨ bei abwehrgeschw¨achten Patienten gefunden werden [204]. Auch er ist strenger Aerobier und liegt neben gekrummten ¨ Ketten haupts¨achlich in einzelnen Zellen vor, die sich durch eine oder mehrere Geißeln fortbewegen (Abbildung 4.13b). Seine Gram-F¨arbung ist negativ. Bei der Bakterienspezies S. vestibularis (Familie: Streptococcaceae) handelt es sich um unbewegliche Gram-positive Diplokokken, die auch kurze Ketten bilden konnen ¨ (Abbildung 4.13c) und zur normalen menschlichen Mundschleimhautflora gehoren ¨ [231]. 4.2.3 Problematik Die CE-Technik wurde ursprunglich ¨ fur ¨ geladene Molekule ¨ entwickelt. Die Anwendung auf große, komplexe In-vivo-Systeme ist nicht unproblematisch. Herkommliche ¨ Vorgehensweisen bei der Methodenentwicklung konnen ¨ aufgrund der speziellen Eigenschaften mikrobieller Organismen nicht angewandt werden. Zum Erreichen reproduzierbarer elektrophoretischer Fingerabdrucke ¨ mit hoher Auflosung ¨ (Abschnitt 3.4.1.4) mussen ¨ verschiedene Punkte bedacht werden [15]: • Zellalter und Wachstumsphase der Bakterienst¨amme beeinflussen das Ober- 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 83 fl¨achenpotenzial, damit die Tendenz der Cluster- und Kettenbildung und wiederum das elektrophoretische Peakmuster [77]. • amphotere Oberfl¨achenstruktur. • Mikroorganismen sind sehr empfindlich gegenuber ¨ a¨ ußeren Einflussen ¨ wie pH, Ionenst¨arke und Sauerstoffgehalt, und lysieren unter ungunstigen ¨ Bedingungen oder a¨ ndern ihre elekrophoretischen Eigenschaften. Die Auswahl des Puffers ist damit erheblich eingeschr¨ankt [205]. • Viele Mikroorganismen sondern unter anderem unter oxidativem Stress eine Vielzahl von Substanzen ab. Diese konnen ¨ zu unbeabsichtigten Peaks fuhren, ¨ und Zelllyse und Ver¨anderungen in der Mobilit¨at und Migrationszeit hervorrufen. • Mikroorganismen neigen aufgrund ihrer geladenen Oberfl¨ache mit den negativ geladenen Silanolgruppen der Kapillarwand in Wechselwirkung zu treten und an diese zu adsorbieren. Auch kann es zu Interaktionen zwischen den mikrobiellen Partikeln kommen. • Bezuglich ¨ der Partikelanzahl pro Volumen sind Bakteriensuspensionen im Allgemeinen verdunnter ¨ als Losungen ¨ chemisch definierter Molekule, ¨ wodurch Injektionsprobleme verursacht werden konnen. ¨ Aus diesen Grunden ¨ mussen ¨ neben der Entwicklung geeigneter CE-Bedingungen auch die Standardisierung und Optimierung der Bakterienkulturen und deren Probenpr¨aparation vorgenommen werden. 4.2.4 Standardisierung der Bakterienkulturen 4.2.4.1 Kultivierung Die Kultivierung aller drei Bakterienspezies erfolgte in Brain-Heart-Infusion(BHI)Bouillon, einem Vollmedium fur ¨ anspruchsvolle Keime, um moglichst ¨ schnelles ◦ Wachstum zu begunstigen. ¨ Eine Temperatur von 30 C erwies sich als guter Kompromiss, um die Kultivierung aller drei Bakterienspezies in einem Brutschrank zu ermoglichen. ¨ Dem unterschiedlichen Sauerstoffbedarf bei Aerobiern und Anaerobiern (Abschnitt 3.2.1.2) wurde durch Verwendung unterschiedlicher Kultivierungsgef¨aße Rechnung getragen. M. luteus wurde in 25 cm3 Kulturflaschen mit luftdurchl¨assigem Schraubverschluss bzw. bei einem großeren ¨ Zellansatz, in Erlenmeyerkolben auf einem Schuttler ¨ bei 150 rpm/min, P. fluorescens und S. vestibularis in 15 ml Kulturrohr¨ chen mit Schraubverschluss bzw. in Erlenmeyerkolben ohne Schuttler ¨ kultiviert. 4. Ergebnisse und Diskussion OD 600 84 3.5 Micrococcus luteus 3.0 Pseudomonas fluorescens Streptococcus vestibularis 2.5 2.0 Abbildung 4.14: Wachstumskurven von M. luteus, P. fluorescens und S. vestibularis in BHI-Bouillon bei 30 ◦ C durch Auftragung der OD600 -Werte gegen die Zeit. 1.5 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 Zeit [h] 4.2.4.2 Wachstumskurven In Abbildung 4.14 wurde die optische Dichte (OD) bei 600 nm fur ¨ alle drei Bakterienarten gegen die Zeit aufgetragen. Wie in Abschnitt 3.2.2.5 beschrieben zeigt der zeitliche OD-Verlauf die verschiedenen Wachstumsphasen. Fur ¨ die kapillarelektrophoretische Analyse war vor allem der Zeitraum der station¨aren Phase relevant, in der die Zellen zwar ihren Stoffwechsel einstellen, aber dennoch vital sind. In dieser Phase sollte die chemische Umgebung der Zellen im Kulturmedium, ihre Oberfl¨achenladung und ihre Tendenz zur Ketten- und Clusterbildung bis zum Beginn der Absterbephase konstant bleiben. S. vestibularis zeigte das schnellste Zellwachstum. Die station¨are Phase wurde bereits nach 8 h erreicht, bei P. fluorescens und M. luteus dagegen erst nach 18 h bzw. nach 24 h. 4.2.4.3 Kalibrierung Die Bestimmung der Zellkonzentration durch Messung der optischen Dichte erfordert zun¨achst die Korrelation zwischen Signal und Konzentration unter Erfassung der Gesamtzellzahl. Da weder die mikroskopische Ausz¨ahlung in einer Z¨ahlkammer noch die elektronische Ausz¨ahlung mittels Coulter-Counter moglich ¨ waren, musste die Zellzahl durch Ausz¨ahlen der koloniebildenden Einheiten (colony forming units, CFU) erfolgen, wodurch genaugenommen nur vermehrungsf¨ahige Zellen berucksichtigt ¨ wurden. N¨aherungsweise kann man jedoch bei einer Kultur in der exponentiellen und fruhen ¨ station¨aren Phase von 100 % lebensf¨ahigen Zellen ausgehen. Die genaue Versuchsdurchfuhrung ¨ ist im Experimentellen Teil in Abschnitt 5.1.7.2.4 beschrieben. OD und Zellzahl korrelieren nach Abschnitt 3.2.2.4 nach einer Funktion 1. Ordnung. Fur ¨ eine Korrelationsfunktion f (x) = ax + b ergaben sich fur ¨ M. luteus, S. vestibularis und CFU/nl 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 85 500 Micrococcus luteus Pseudomonas fluorescens 400 Streptococcus vestibularis 300 200 100 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 OD 600 Abbildung 4.15: Korrelation zwischen OD600 -Werten und Zellzahl. P. fluorescens die folgenden Gleichungen und Bestimmtheitsmaße R2: M. luteus : f (x) = 353.45 · x + 11.82, R2 = 0.92 P. fluorescens : f (x) = 337.86 · x − 27.30, R2 = 0.97 S. vestibularis : f (x) = 311.61 · x − 3.67, R2 = 0.97 Die schlechteste Korrelation zeigte M. luteus. Die Ursache hierfur ¨ liegt vermutlich in seiner vielf¨altigen Clusterbildung, denn die dem Verfahren der CFU-Ausz¨ahlung zugrundeliegende Erwartung, dass aus jeder vermehrungsf¨ahigen Zelle eine makroskopisch sichtbare Kolonie entsteht, trifft in diesem Fall nicht mehr zu und fuhrt ¨ zu systematischen Fehlern. Dennoch stellten diese Kalibriergeraden gute Anhaltspunkte dar und dienten zur Berechnung der Zellzahl bei allen weiteren Experimenten. 4.2.5 Trenntechnik Die sp¨atere Weiterentwicklung der Methode zur Bestimmung von Zytotoxizit¨at stellte auch Anforderungen an die kapillarelektrophoretische Trenntechnik. In der Literatur sind derzeit zwei Techniken fur ¨ eine Mikroben-Analyse beschrieben: Kapillarzonenelektrophorese (CZE) und Kapillarisoelektrische Fokussierung (CIEF) (Abschnitt 3.4). W¨ahrend in der CZE die Trennung verschiedener Analyten auf Unterschieden in den elektrophoretischen Mobilit¨aten basiert, werden die Bakterien in der CIEF aufgrund ihrer amphoteren Oberfl¨ache und somit nach dem isoelektrischen Punkt getrennt. Aufgrund der zur Toxizit¨atsbestimmung notwendigen Zellmarkierung mittels SYTO9 und Propidiumiodid zur Ermittlung des lebend/tot-Verh¨altnisses der Bakterienpopulation, war eine Auswirkung auf den isoelektrischen Punkt nicht auszuschließen, so dass die CZE der CIEF als Trenntechnik vorgezogen wurde. Ferner sollten die verwendeten Kapillaren beschichtet sein, um: 86 4. Ergebnisse und Diskussion 1. Den EOF zu eliminieren [126]: Ohne Modifikator ist der EOF sehr groß. Aufgrund der geringen elektrophoretischen Unterschiede verschiedener Bakterien und ihrer Ketten und Agglomerate ist deren Trennung ohne Modifikator nur mit sehr langen Kapillaren erreichbar (250 cm) [77, 86]. Anderenfalls werden alle Bakterienspezies mit dem EOF eluiert [212]. 2. Wandadsorptionen vorzubeugen [126]. Aufgrund der hohen Kosten fur ¨ kovalent beschichtete Kapillaren, der mangelhaften Reaktionskontrolle bei der Eigenherstellung und der schnellen Abnutzung sollte die Methode der dynamischen Beschichtung angewandt werden (Abschnitt 3.4.6). Der Vorteil liegt darin, dass es durch geeignete Spulmethoden ¨ gelingt, die Kapillare nach jeder Trennung vollst¨andig zu regenerieren und unmittelbar vor der n¨achsten Trennung erneut zu beschichten (siehe Experimenteller Teil). Desweiteren unterstutzen ¨ die zugesetzten Polymere im Trennpuffer die Trennung verschiedener Bakterienspezies, Agglomerate und Ketten aufgrund: • Eines Siebeffektes bedingt durch die Erhohung ¨ der Viskosit¨at [15]. • Zus¨atzlicher Probenstabilit¨at der Biokolloide in der Pufferlosung: ¨ Bei PartikelPartikel-Interaktionen fuhren ¨ die polymeren Ketten zur sterischen Abstoßung (Abschnitt 3.2.2.3) [11, 259]. 4.2.6 Entwicklung eines Trennpuffers ¨ 4.2.6.1 Uberblick uber ¨ literaturbekannte Puffersysteme Aus den experimentellen Erfahrungen (Tabelle 4.4) der letzten 20 Jahre, in denen versucht wurde, die Analyse und Charakterisierung intakter Mikroorganismen mittels Kapillarelektrophorese zu standardisieren und zu verbessern, ergeben sich auf der Grundlage der dynamischen Beschichtung zur mikrobiellen Trennung im wesentlichen zwei grundlegend verschiedene Puffersysteme, mit denen eine Auflosung ¨ bis zu 850.000 theoretischer Boden/m ¨ (M. luteus [15]) erreicht wurde (Abschnitt 3.4.1.4): 1. Puffersystem nach Armstrong [15]: Der Trennpuffer besteht aus 0.56 mM TrisBorat, 0.013 mM Na2 EDTA und 0.0125% gelostem ¨ Poly(ethylen)oxid (PEO, Mr = 600.000, polymere Matrix zur Beschichtung) bei einem pH von 8.4. Die Ionenst¨arke des Puffers lag unter Berucksichtigung ¨ von Tris+ , EDTA3− und Na+ bei 0.35 mM. Bei PEO handelt es sich um ein Polykondensationsprodukt der allgemeinen Formel HO-(CH2 -CH2 -O-)n H. Es wird durch Mikroorganismen nicht angegriffen und ist nicht empfindlich gegenuber ¨ Elektrolyten. Die Ethersauerstoffbrucken, ¨ ebenso wie die endst¨andigen Hydroxylgruppen, ermoglichen ¨ die Ausbildung von Wasserstoffbruckenbindungen ¨ und Dipolwechselwirkungen. Die 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 87 heterogene Polymerlosung ¨ wurde in einer Konzentration von 0.5 % durch Ultraschallbehandlung fur ¨ 4 h bei 55 ◦ C hergestellt. Die dynamische Viskosit¨at betrug danach 4.36 cP. Eine erfolgreiche kapillarelektrophoretische Analyse wurde an den in Tabelle 4.4 gelisteten Bakterienspezies durchgefuhrt. ¨ 2. Puffersystem nach Shintani [243]: Der Trennpuffer enth¨alt 0.1 M Tris, 0.1 M Bors¨aure, 2 mM Na2 EDTA, 0.2 % NaCl und 0.01 % Natrium-Alginat (polymere Matrix zur Beschichtung) bei einem pH von 8.4 und zeigt damit eine Ionenst¨arke von 122 mM. Die polymere Losung ¨ wurde durch Ruhren ¨ bei Raumtemperatur uber ¨ Nacht vollst¨andig gelost. ¨ Die Algins¨aure besteht aus einer Kette von 1,4β-glykosidisch verknupfter ¨ Mannurons¨aure. Die Methode wurde an Salmonella enteritidis und Salmonella typhimurium durchgefuhrt. ¨ Scharfe Peaks und hohe Auflosung ¨ konnen ¨ somit entweder mit extrem verdunnten ¨ oder extrem konzentrierten Tris-Borat-Puffern erreicht werden. 4.2.6.2 Eignung verschiedener Puffersysteme In Abbildung 4.17 sind die Elektropherogramme von M. luteus, P. fluorescens und S. vestibularis unter Verwendung der Puffersysteme nach Armstrong und Shintani gegenubergestellt. ¨ Da die station¨are Phase einer Bakterienkultur uber ¨ mehrere Stunden bis hin zu Tagen andauert, wurden die Proben bei allen drei Bakterienspezies nach einer Inkubationszeit von 24 h entnommen. Die Proben wurden in Anlehnung an Referenz [53] in Wasser gewaschen und durch sanftes Pipettieren in Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 suspendiert (siehe Experimenteller Teil). Bei beiden Methoden wurden die gleichen CE-Bedingungen verwendet: Quarzkapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm und einer Detektionsl¨ange von 21 cm; dies war aufgrund der Ger¨atemaße die kurzest ¨ mogliche ¨ L¨ange; konstant angelegte Spannung von ◦ 10 kV; Temperatur 23 C; anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur ¨ 10 s; Detektion bei 214 nm. Zur Detektion erwiesen sich aufgrund der Korrelation der Mie-Streuung mit λ−3 kleine Wellenl¨angen (Abschnitt 3.2.2.4) als besonders gunstig ¨ (Abbildung 4.16). W¨ahrend bei Micrococcus (Elektropherogramm A, Abbildung 4.17b) im ersten Versuch mit beiden Puffersystemen scharfe Peaks erhalten wurden, scheiterte die Anwendung des Puffersystems nach Shintani bei Streptococcus (Elektropherogramm B, Abbildung 4.17b) und Pseudomonas (Elektropherogramm C, Abbildung 4.17b). In beiden F¨allen waren breite und teilweise aufgef¨acherte Peakstrukturen zu erkennen. Bei Pseudomonas konnte mikroskopisch Zelllyse nachgewiesen werden, vermutlich bedingt durch die hohe Ionenst¨arke. Die Auflosung ¨ der Elektropherogramme der Micrococcus-Spezies lag bei beiden Puffersystemen bei ca. 200.000 theoretischen Boden/m. ¨ Aufgrund der Kompatibilit¨at aller drei relevanten Bakterienspezies - auch der Streptokokken, die mit diesem System derzeit noch nicht 88 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.16: PseudomonasProbe bei drei verschiedenen Wellenl¨angen gemessen: 214 nm (a) 400 nm (b) und 580 nm (c). Fur ¨ CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung 4.17. analysiert worden waren - mit dem Puffersystem nach Armstrong, wurde dieses als Basis der Methodenentwicklung verwendet. 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 89 (a) Puffersystem nach Shintani (b) Puffersystem nach Armstrong Abbildung 4.17: Eignung verschiedener Puffersysteme zur kapillarelektrophoretischen Analyse von M. luteus (A), P. fluorescens (B) und S. vestibularis (C) unter gleicher Probenpr¨aparation: Bakterienernte nach 24 h; in Wasser gewaschen; durch Pipettieren in Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 suspendiert und unter gleichen CE-Bedingungen: Quarzkapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm, einer Detektionsl¨ange von 21 cm; konstant angelegte Spannung von 10 KV; Temperatur 23 ◦ C; anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur ¨ 10 s; Detektion bei 214 nm. Fur ¨ CEPufferzusammensetzung siehe Abschnitt 4.2.6.1 90 ¨ Tabelle 4.4: Uberblick uber ¨ literaturbekannte Puffersysteme [151]. Mikroorganismen Lactobacillus casei Streptococcus pyrogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis Pseudomonas spezies, Pseudomonas putida, Alcaligenes eutrophu, Rhodococcus erythropolis, Methanobrevilbacter smithii A1264, CD1, PL2W31 (Wasserbakterien) Trennpuffer 100 mmol/L Tris-Acetat, pH 7.5 TBE-Puffer, pH 9.5 [125] [86] unbeschichtet TBE-Puffer, pH 9.6 [205] unbeschichtet 10 mmol/L MOPS-Puffer pH 7.02 Phosphat-Puffer, pH 7.0 [107] TBE-Puffer, pH 8.4 0.0125% PEO als Modifikator [15] [240] [178] unbeschichtet unbeschichtet Ref. [263] 4. Ergebnisse und Diskussion Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas denitrificans, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti, Bifidibacterium longum, Serratia marcescens, Sacharomyces cerevisiae Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, Micrococcus luteus, Saccharomyces cerevisiae, Alcaligenes faecalis, Micrococcus lysodeikticus Quarzkapillare beschichtet mit Methylcellulose unbeschichtet unbeschichtet Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Saccharomyces cerevisiae unbeschichtet Cellulomonas cartae, Agrobacterium tumefaciens Arthrobacter oxydans unbeschichtet Escherichia coli, Proteus vulgaris, Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens Escherichia coli unbeschichtet beschichtet mit Polyvinylalkohol beschichtet mit Acrylamid beschichtet mit Poly-N-hydroxy -ethylacrylamid TBE-Puffer, [243] 0.2% NaCl und 0.01% Na-Alginat als Modifikator TBE-Puffer, pH 9.0 [13] 0.025% PEO als Modifikator TBE-Puffer, pH 8.4 [12, 14] 0.0125% PEO als Modifikator [106] [288] 20 mmol/L Borat-Puffer [286] pH 9.3 10 mmol/L Tris-HCl [269] pH 7.1 Tris-Puffer [53] pH 8.0 10 mmol/L TBE-Puffer [149] 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen Salmonella enterititis, Salmonella typhimurium 91 92 4. Ergebnisse und Diskussion 4.2.6.3 Optimierung der Trennmethode Trotz aller Bemuhungen ¨ zeigten die Elektropherogramme der Mikroben unter Verwendung der Methode nach Armstrong teilweise eine schlechte Auflosung ¨ und fehlende Reproduzierbarkeit, die aber fur ¨ den Einsatz der CE zur Zytotoxizit¨atsbestimmung unerl¨aßlich ist. Aus diesem Grund wurden nachfolgend • die Pufferkonzentration • die polymere Matrix • und die Probenpr¨aparation variiert und fur ¨ den Teststamm M. luteus optimiert. 4.2.6.3.1 Pufferkonzentration Eine mogliche ¨ Ursache fur ¨ die schlechte Auflosung ¨ und die fehlende Reproduzierbarkeit war die extrem geringe Ionenst¨arke im Trennpuffer. Die daraus resultierende, sehr geringe Stromst¨arke lag bei einer Spannung von 10 KV unter 1 µA, wodurch sich naturliche ¨ Schwankungen in der Temperatur, Spannung oder Wasserreinheit leicht bemerkbar machten. Gegen eine Erhohung ¨ der Pufferkonzentration spricht jedoch die dadurch sinkende Mobilit¨at des EOFs (Abschnitt 3.4). In w¨assriger Losung ¨ sind Mikroben meist negativ geladen. Bei anodischer Injektion und konventioneller Polung (Abschnitt 3.4) wurden ¨ die Biokolloide alleine aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilit¨at uberhaupt ¨ nicht durch die Kapillare wandern. Ist der EOF jedoch groß genug, zieht er die Probenzonen am Detektor vorbei. Der EOF liefert bei Mikroben den wesentlichen Beitrag zur Analysenzeit, denn aufgrund der großen Masse m der Mikroorganismen ist ihre Beschleunigung a aufgrund des elektrischen Feldes E (Fel = q · E = m · a) sehr klein und damit auch ihre Gleichgewichtsgeschwindigkeit vel . Zur Festlegung eines sinnvollen Konzentrationsbereiches des Trennpuffers wurde zun¨achst der Einfluss verschiedener Pufferkonzentrationen auf den EOF analysiert. Dazu wurde eine Stammlosung ¨ mit 0.445 M Tris-Borat und 10 mM Na2 EDTA (siehe Experimenteller Teil) zu verschiedenen Konzentrationen verdunnt ¨ und jeder Verdunnung ¨ 0.0125 % PEO 600.000 als Modifikator zugesetzt. In Abbildung 4.18 ist der EOF, markiert durch Benzylalkohol, in Abh¨angigkeit von der Pufferkonzentration und Ionenst¨arke dargestellt. Die verwendeten Pufferlosungen ¨ (A-I) sind in Tabelle 4.5 gelistet. Die Elektrolyte wurden im Konzentrationsbereich von 0.11 mM Tris-Borat und 0.003 mM Na2 EDTA bis 3.90 mM Tris-Borat und 0.088 mM Na2 EDTA eingesetzt. W¨ahrend sich der EOF bei einer Ionenst¨arke zwischen 0.069 mM und 0.49 mM kaum a¨ nderte und bei ca. 3 Minuten lag, fiel er ab einer Ionenst¨arke >0.69 mM stark ab und benotigte ¨ bei einer Ionenst¨arke von 2.43 mM bereits nahezu 10 Minuten. Der interessante Konzentra- 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 93 Abbildung 4.18: Auswirkung verschiedener TBE-Puffer-Konzentrationen (A-I) auf den EOF. Als EOF-Marker wurde eine 0.00005% Benzylalkohol enthaltende Pufferlosung ¨ verwendet. Fur ¨ CE-Bedingungen siehe Abbildung 4.17. Pufferbezeichnung A B C D E F G H I Ionenst¨arke [mM] 0.069 0.349 0.486 0.693 1.041 1.390 1.733 2.083 2.426 Tris-Borat [mM] 0.11 0.56 0.78 1.11 1.67 2.22 2.78 3.34 3.89 Na2 EDTA [mM] 0.0025 0.0125 0.0175 0.0250 0.0375 0.0500 0.0625 0.0750 0.0875 Tabelle 4.5: Definition der in Abbildung 4.18 verwendeten TBE-Trennpuffer tionsbereich lag somit bei einer Ionenst¨arke zwischen 0.069 mM und 0.486 mM, d. h. zwischen Puffer A und C. Nachfolgend wurde der Einfluss der drei verschiedenen Pufferkonzentrationen (A, B und C) auf die Trennung von M. luteus getestet (Abbildung 4.19). Die Pufferlosung ¨ mit der hochsten ¨ Verdunnung ¨ (Puffer A) fuhrte ¨ zu einer einzigen breiten Bande, die vermutlich durch das Platzen von Zellen aufgrund zu geringer Ionenst¨arke des verwendeten Trennpuffers bedingt ist. Bei Erhohung ¨ der Pufferkonzentration zeigten die Elektropherogramme einige sehr schmale Signale mit zun¨achst schlechter Auflosung ¨ (Puffer B), welche durch Einsatz der dritten Pufferlosung ¨ (Puffer C) mit 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2 EDTA verbessert werden konnte. Diese Pufferlosung ¨ erwies sich als optimal fur ¨ eine Trennung unterschiedlich großer Agglomerate, zumal eine hohe Ionenst¨arke wie z. B. bei Puffer I zu einer erheblichen Verl¨angerung der Migrationszeit fuhrte ¨ und kein Signal unter 40 Minuten beobachtet 94 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.19: Auswirkung verschiedener TBE-Puffer-Konzentrationen auf die Trennung unterschiedlich großer Aggregate von M. luteus. Der Trennpuffer enthielt 0.0125 % PEO mit (A) 0.11 mM Tris-Borat und 0.003 mM Na2 EDTA, (B) 0.56 mM Tris-Borat und 0.013 mM Na2 EDTA, (C) 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2 EDTA, bei einem pH-Wert von 8.7. Fur ¨ CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung 4.17. Abbildung 4.20: Auswirkung der hohen Ionenenst¨arke des TBE-Puffers I auf die Migrationszeit von M. luteus. Der Trennpuffer enthielt 0.0125 % PEO mit 3.89 mM Tris-Borat und 0.0875 mM Na2 EDTA bei einem pH-Wert von 8.7. Fur ¨ CE- und Probenbedingungen siehe Abbildung 4.17. werden konnte (Abbildung 4.20). ⇒ Die Zusammensetzung des Trennpuffers wurde auf 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2 EDTA optimiert. Die Losung ¨ enthielt 0.0125 % PEO und ergab einen pH von 8.7 4.2.6.3.2 PEO Konzentration und Viskosit¨at Zur dynamischen Beschichtung wird nach Armstrong 0.0125 % PEO 600.000 als polymere Matrix verwendet. Dazu verdunnt ¨ man eine 0.5 %ige PEO-Stammlosung, ¨ die zum effizienteren Losen ¨ einer vierstundigen ¨ Ultraschallbehandlung ausgesetzt wird. In der Routine-Herstellung zeigten sich jedoch Probleme in der Reproduzierbarkeit der Viskosit¨at der polymeren Losung. ¨ In Abbildung 4.21 sind die Elektropherogramme a und b zweier identisch pr¨aparierter M. luteus-Proben unter Verwendung der beiden PEO-Losungen ¨ 1 und 2, hergestellt nach der gleichen Vorgehensweise, dargestellt. Das Elektropherogramm a zeigt zwar mit ca. 400.000 theoretischen Boden/m ¨ eine gu- 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 95 Abbildung 4.21: Polymerherstellung als Ursache fur ¨ fehlende Reproduzierbarkeit am Beispiel von M. luteusElektropherogrammen. PEO 600.000 wurde in beiden F¨allen durch vierstundige ¨ Ultraschallbehandlung zu einer Konzentration von 0.5 % vollst¨andig gelost. ¨ Der Trennpuffer enthielt 0.0125 % PEO mit 0.78 mM TrisBorat und 0.018 mM Na2 EDTA, bei einem pH-Wert von 8.7. Fur ¨ CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung 4.17. te Trennleistung aber keine Selektivit¨at. Dagegen erfullt ¨ Elektropherogramm b beide Bedingungen. Rheologische Untersuchungen mittels Rotationsviskosimeter zeigten im Scherbereich von 1 bis 1000 1/s Unterschiede zwischen den beiden PEO-Stammlosungen. ¨ Beide Losungen ¨ wiesen zwar Newtonsches Verhalten auf, unterschieden sich aber in ihrer berechneten Viskosit¨at (PEO-Losung ¨ 1 zu 3.5 mPas, Losung ¨ 2 zu 4.8 mPas). Vermutlich ist eine zu geringe Viskosit¨at der PEO-Losung ¨ 1 verantwortlich fur ¨ die schlechte Auflosung ¨ in Elektropherogramm a. Die Hauptfehlerquelle w¨ahrend der Herstellung ¨ der Polymerlosung ¨ liegt in der langen Ultraschallbehandlung. Uber diese Zeit kann sich das Bad sehr stark aufheizen und bei fehlender Kuhlvorrichtung, ¨ wie es bei uns der Fall war, zum Aufbrechen der langen PEO-Ketten fuhren. ¨ Da die hocheffiziente Trennung der Armstrong-Methode, nicht nur uber ¨ die Viskosit¨at bestimmt wird, sondern auch uber ¨ die Chemie des PEOs an sich [11], sollte das Polymer selbst nicht substituiert werden. So wurde in einigen Publikationen zur Aufkl¨arung der Methode der Trennung, PEO aufgrund seiner Hydrophilie ein additiver fokussierender Effekt der Probenzonen zugesprochen, welcher bei Substitution von PEO mit Glycerol trotz gleicher Viskosit¨at ausblieb [11, 106]. Um hohere ¨ Reproduzierbarkeit des Trennsystems zu erreichen, wurde zun¨achst niedermolekulares PEO als Additivum zum Trennpuffer eingesetzt. Interessant war vor allem der niedermolekulare Bereich von 400 bis 4000, da hier PEOs flussig ¨ und mit Wasser mischbar sind. In Abbildung 4.22 sind die Elektropherogramme a bis d unter Zusatz von PEO 400 und 4000 in unterschiedlichen Konzentrationen dargestellt. W¨ahrend mit PEO 400 in einer Konzentration von 0.05 % (Elektropherogramm a) keine Abtrennung der M. luteus-Cluster vom EOF erzielt wurde, verbesserte sich die Auflosung ¨ zunehmend bei Erhohung ¨ der Konzentration auf 0.5 % und 5 % (Elek- 96 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.22: Elektropherogramme von M. luteus. Verschiedene Konzentrationen unterschiedlich langkettiger PEOs wurden als Modifikatoren zum dynamischen Beschichten der Kapillare eingesetzt: 0.05 % PEO 400 (a), 0.5 % PEO 400 (b), 5 % PEO 400 (c) und 1 % PEO 4000 (d). Fur ¨ Trennpuffer, CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung 4.21. tropherogramm b und c). Keine signifikante Verbesserung brachte der Einsatz von PEO 4000 bei einer Konzentration von 1 % (Elektropherogramm d). Bei einer weiteren Erhohung ¨ der Konzentration auf 10 % konnte dagegen in einer Zeitspanne von 60 Minuten kein Signal detektiert werden. Das beste Ergebnis wurde mit PEO 400 bei einer Konzentration von 5 % erreicht. Doch stellte sich, vermutlich durch die kurzen PEO-Ketten eine schlechte Reproduzierbarkeit bei der dynamischen Beschichtung der Kapillare heraus, so dass dieser Losungsansatz ¨ scheiterte. Es wurde somit nach einem besser zu kontrollierenden Losungsverfahren ¨ fur ¨ PEO 600.000 gesucht. Als geeignet ◦ erwies sich das Losen ¨ in einem auf 30 C temperierten Schrank fur ¨ mindestens 12 h. Rheologische Untersuchungen zeigten fur ¨ die 0.5 %ige polymere Stammlosung ¨ eine reproduzierbare Viskosit¨at von 5.0±0.2 mPas. ⇒ Zur Herstellung der polymeren Matrix wurde PEO 600.000 in einer Konzentration von 0.5 % bei 30 ◦ C fur ¨ mindestens 12 h gelost. ¨ Die Losung ¨ zeigte eine reproduzierbare Viskosit¨at von 5.0±0.2 mPas. 4.2.6.3.3 Probenpr¨aparation Fur ¨ eine erfolgreiche CE-Analyse von Mikroorganismen ist neben der CE-Methode vor allem die Probenpr¨aparation relevant, denn Ladung, Große ¨ und Form der Mikroben a¨ ndern sich mit den experimentellen Bedingungen [224]. Generell sind zwei pr¨aparative Schritte zur Herstellung der Bakterienproben notwendig: 1. Waschen der Bakterienzellen zur Entfernung von Kulturmedium. 2. Resuspendieren der Zellen in Trennpuffer. In Abbildung 4.23 ist der Stromverlauf w¨ahrend der CE- Analyse der beiden Micrococcus-Proben a und b gezeigt. Probe a wurde mit physiologischer Kochsalzlosung ¨ gewa- 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 97 Abbildung 4.23: Vergleich der Stromverl¨aufe w¨ahrend der Micrococcus-Analyse nach Waschung der Bakterienzellen (a) mit physiologischer Kochsalzlosung ¨ (0.9%) und (b) mit Millipore-Wasser zur Entfernung des Kulturmediums. Beide Bakterienproben wurden nach einer Inkubationszeit von 24 h pr¨apariert und nach der Waschung in einer Konzentration von 0.5 OD600 in Trennpuffer resuspendiert. Fur ¨ Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21 schen, Probe b dagegen mit Millipore-Wasser. Anschließend wurden beide Proben in Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 resuspendiert. Der Stromverlauf von Probe a steigt unmittelbar nach der Injektion an und f¨allt nach einer Minute wieder ab. Dagegen bleibt der Strom bei Probe b nahezu konstant. Fur ¨ den initialen Stromanstieg in Probe a sind vermutlich an die Zellmembran adsorbierte Na+ - und Cl− -Ionen verantwortlich, wodurch die Leitf¨ahigkeit erhoht ¨ wird und damit der Strom ansteigt. Unter diesen Bedingungen konnte jedoch kein Signal detektiert werden. Der bei beiden ¨ Proben beobachtete kontinuierliche Stromabfall kann unter Umst¨anden an der Anderung der Elektrolytzusammensetzung unter dem Einfluss des elektrischen Feldes liegen, welche durch die geringe Ionenst¨arke besonders begunstigt ¨ wird oder an Ablagerungen an der Kapillarwand. Neben diesen elektrostatischen und -dynamischen ¨ Einflussfaktoren fuhren ¨ auch Anderungen in der mechanischen Beanspruchung der Probe zu unterschiedlichen Elektropherogrammen. Abbildung 4.24 zeigt drei charakteristische Elektropherogramme a-c des Teststammes M. luteus mit unterschiedlichen Resuspendierungsverfahren. Sanfte Resuspendierungsverfahren wie Ruhren ¨ oder Pipettieren fuhrten ¨ h¨aufig zu fehlender Refokussierung der Zellsignale (Elektropherogramm a). Vermutlich treten bei ungenugender ¨ Resuspendierung Lufteinschlusse ¨ in ¨ der Probensuspension auf, die das Peakmuster storen. ¨ Ahnliche Ergebnisse wurden in Dai et al. [73] fur ¨ den Teststamm Escherichia coli unter Verwendung eines 150 mM Tris-Borat-Puffers beschrieben. Elektropherogramm b zeigt nach einer einminutigen ¨ Ultraschallbehandlung bei 120 W und 35 kHz haupts¨achlich Einzelzellen, w¨ahrend in Elektropherogramm c nach einminutigem ¨ Vortexen die Micrococcus-Cluster in schmalen Peaks voneinander getrennt sind. Untersuchungen zur St¨arke und Zeit des Vortexens zeigten keine signifikanten ¨ Anderungen. Letztendlich konnte eine scharfe Trennung verschiedener Aggregate nur 98 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.24: Messung einer M. luteus-Probe (a) ohne einminutigem ¨ Vortexen (b) mit einminutiger ¨ Ultraschallbehandlung (c) mit einminutigem ¨ Vortexen vor der Injektion. Die Bakterienproben wurden nach einer Inkubationszeit von 24 h pr¨apariert, in H2 O gewaschen und in einer Konzentration von 0.5 OD600 in Trennpuffer resuspendiert. Fur ¨ Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21. durch einminutiges ¨ Vortexen erreicht werden. Eine Ultraschallbehandlung fuhrte ¨ dagegen in unserem Experiment zur Dispersion der Aggregate. Unter Verwendung eines 5 mM Phosphat-Puffers beobachteten Buszewski et al. [53] bereits durch Schutteln ¨ der Bakterienprobe eine Zunahme an Einzelzellen. Die Auswirkung verschiedener Vorbehandlungen auf die Zellpopulation scheint somit extrem von den die Bakterienzellen umgebenden Elektrolyten abh¨angig zu sein. ⇒ Optimierte Probenpr¨aparation: Reinigung der Bakterienzellen von Medium in Millipore-Wasser; Resuspendieren der Zellen in Trennpuffer durch einminutiges ¨ Vortexen. 4.2.6.3.4 Probenkonzentration Routinemessungen zeigten, dass die CE-Methode hohe Zellkonzentrationen erfordert. In Abbildung 4.25a sind die elektrophoretischen Fingerabdrucke ¨ von M. luteus in Abh¨angigkeit der Konzentration dargestellt. Im Falle geringer Bakterienkonzentrationen, d. h. im OD600 -Bereich zwischen 0.2 und 0.3 (Zellkonzentration: 9 x 107 - 14 x 107 Zellen/ml, Elektropherogramme A und B in Abbildung 4.25a), ist nur ein Signal mit Migrationszeiten uber ¨ 15 Minuten detektierbar. Mit zunehmender Zellkonzentration werden die Peaks schmaler und zahlreicher, einhergehend mit kurzeren ¨ Migrationszeiten (Elektropherogramm C). Die Elektropherogramme D und E spiegeln bei einer Zellkonzentration ≥ 0.5 OD600 (≥2.3 x 108 Zellen/ml) die vielf¨altigen Cluster in der Bakterienpopulation wider, wobei bei einer Konzentration von 0.6 OD600 bereits durch ¨ Uberladung der Kapillare Peakverbreiterungen auftreten. ¨ Ahnliche Resultate wurden durch Variation der Injektionszeiten bei 0.5 psi und einer Zellkonzentration von 0.5 OD600 erreicht. In Abbildung 4.25b sind die entsprechenden Elektropherogramme nach einer Injektionszeit von 1, 4, 7, 10 und 13 Sekunden dar- 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 99 (a) Variation der Probenkonzentration. Injiziert wurde fur ¨ 10 s bei 0.5 psi. (b) Eine Bakterienprobe mit einer Konzentration von 0.5 OD600 wurde bei einem Druck von 0.5 psi unterschiedliche Zeiten injiziert. Abbildung 4.25: Abh¨angigkeit der Elektropherogramme der Micrococcus-Spezies von der injizierten Zellmenge. Die Bakterien wurden fur ¨ 24 h inkubiert, in Wasser gewaschen, in Trennpuffer mittels einminutigem ¨ Vortexen suspendiert. Fur ¨ Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21. 100 4. Ergebnisse und Diskussion gestellt. Bei einer Injektion von 1 s und 4 s zeigte sich a¨ hnlich wie unter Verwendung geringer Bakterienkonzentrationen ein Signal mit langer Migrationszeit. Zur Detektion der verschiedenen Cluster in der Micrococcus-Population erwies sich eine Injektionszeit von mindestens 7 Sekunden als notwendig. Auch hier zeigten sich bei einer Injektionszeit von 13 s bereits Peakverbreiterungen. Die Konzentrationsabh¨angigkeit der Elektropherogramme wird vermutlich durch Wechselwirkungen zwischen Zelle und PEO-Beschichtung und einer dadurch hervorgerufenen unkontrollierten Adsorption verursacht. Diese Hypothese konnte durch Untersuchungen zur Linearit¨at best¨atigt werden (Abschnitt 4.2.11.1) ⇒ Die Probenkonzentration wurde auf einen OD600 -Wert von 0.5 standardisiert. 4.2.6.4 Mechanistische Betrachtung 2002 untersuchten Armstrong et al. [11] den Mechanismus ihrer CE-Methode, durch welche die erste hochaufgeloste ¨ Trennung von Mikroben moglich ¨ wurde. Unklar war die Rolle der hydrophilen polymeren Additiva, wie PEO, deren Effekt auf die Migrationszeit und Auflosung ¨ durch Viskosit¨atserhohung ¨ und Reduktion des EOF allein, nicht erkl¨art werden konnte. Fur ¨ die Fokussierung der Probenzonen unter PEO-Zusatz wurden die folgenden drei Hauptfaktoren als maßgeblich definiert: • Gelostes ¨ polymeres Additivum im Trennpuffer • Elektrisches Feld • Elektroosmotischer Fluss in Gegenrichtung zur elektrophoretischen Mobilit¨at Es konnte mittels CCD-Kamera gezeigt werden, dass vor allem der letzte Punkt, der zu einer Art “sample stacking” fuhrt, ¨ w¨ahrend der Wanderung der Mikroben in der Kapillare eine Verengung des anf¨anglich 2 cm großen Injektionsplugs in eine Bande von 0.1 cm bewirkt (Abbildung 4.26). Es stellte sich jedoch heraus, dass der fokussierende Effekt w¨ahrend der gesamten Bewegung durch die Kapillare fortbesteht. Fur ¨ Aggregation und Fokussierung von Kolloiden in Losung ¨ unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes bestehen derzeit die folgenden drei Mechanismen: • Feld-induzierte Aggregation, welche durch die Partikelpolarisation bestimmt wird. Die Bakterien richten sich dadurch wie ein induzierter elektrischer Dipol aus und interagieren miteinander. • Das “hairy-particle-model”: Durch die rauhe Partikeloberfl¨ache kann die Mobilit¨at kleiner Ionen beeinflusst werden, wodurch die Leitf¨ahigkeit im Probenplug 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 101 verringert ist, und sich zwei entgegengesetzte Ladungen am Anfang und am Ende der Probenzone ausbilden konnen ¨ [96, 196, 215]. • Formabh¨angige Mobilit¨at: Nichtsph¨arische Partikel und Aggregate haben in Abh¨angigkeit ihrer Orientierung unterschiedliche Mobilit¨aten. Dieser Mechanismus macht sich zum Beispiel bei st¨abchenformigen ¨ Bakterien bemerkbar, deren Orientierung im Feld nach der Injektion zun¨achst zuf¨allig ist. Durch ihre unterschiedliche Ausrichtung besitzt die Probe eine Geschwindigkeitsverteilung, wodurch es zu Zusammenstoßen ¨ verschiedener Partikel kommt. Abbildung 4.26: Unerl¨assliche Bedingung fur ¨ Fokussierung mikrobieller Probenzonen: Elektroosmotischer Fluss in Gegenrichtung zur elektrophoretischen Mobilit¨at. Eine mogliche ¨ Begunstigung ¨ der Fokussierung durch PEO ließe sich z.B. durch die Beeinflussung der Polarisation durch Adsorption erkl¨aren [11]. Betrachtet man jedoch das konzentrationsabh¨angige Peakmuster in Abbildung 4.25, gelang eine Fokussierung der Bakterien erst ab einer bestimmten Zellzahl im Injektionsplug. Nach dem Hagen-Poiseuilleschen Gesetz (4.1) gen¨ahert, errechnete sich mit den standardisierten CE-Bedingungen (dynamische Viskosit¨at des Puffers: 5 mPas, Kapillarradius: 50 µm, L¨ange der Kapillare: 100 µm, Injektionsdruck: 0.5 psi, Injektionszeit: 10 s und Zellkonzentration: 2.3 x 108 Zellen/ml) das Injektionsvolumen zu 16.9 µl und die injizierte Zellzahl zu 3892. π · r4 V = ∆p t 8·η·L V (4.1) : Injektionsvolumen t : Injektionszeit r : Kapillarradius η : dyn. Viskosit¨at der Probe (angen¨ahert durch Pufferviskosit¨at) L : Kapillarl¨ange Daraus ergibt sich die Option, dass neben elektrostatischen und -dynamischen Aspekten auch mechanische Grunde ¨ fur ¨ eine Fokussierung mikrobieller Banden in Frage kommen konnen. ¨ Diese konnten ¨ im Kr¨aftegleichgewicht zwischen antreibender Kraft der durch den EOF bewegten Zellmasse und der Bremskraft, bedingt durch Adsorptionskr¨afte zwischen Zellen und PEO und der Viskosit¨at im Trennpuffer, liegen. 102 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.27: Wiederholte Messungen der gleichen M. luteus-Probe unter Verwendung des gleichen Pufferansatzes. Bei jeder Trennung wurde ein neues Puffergef¨aß der gleichen Puffercharge verwendet. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25 4.2.7 Reproduzierbarkeit Zur Eignung und Weiterentwicklung der CE-Methode zur Bestimmung der Aktivit¨at antibiotischer Substanzen ist vor allem die Reproduzierbarkeit der elektrophoretischen Fingerabdrucke ¨ in qualitativer und quantitativer Hinsicht maßgeblich. Wiederholmessungen der gleichen Bakterienprobe von M. luteus zur Untersuchung der Pr¨azision bezuglich ¨ der Quantifizierung und der Migrationszeiten fielen jedoch selbst unter Verwendung der in den letzten Abschnitten optimierten CE- und Probenbedingungen entt¨auschend aus. Die Trennungen wurden zwar mit dem gleichen Pufferansatz durchgefuhrt, ¨ doch wurden fur ¨ jede Trennung neue Puffervials verwendet, so dass die ¨ fehlende Reproduzierbarkeit nicht durch die Anderungen in der Elektrolytzusammensetztung aufgrund der hohen anliegenden Spannung begrundet ¨ werden konnte. Das von Trennung zu Trennung sich sowohl in Signalanzahl, Migrationszeit als auch in Signalintensit¨at a¨ ndernde Peakmuster ist in Abbildung 4.27A dargestellt. Abbildung 4.27B zeigt einen neben den variierenden Elektropherogrammen beobachteten kontinuierlichen Stromanstieg, welcher moglicherweise ¨ die Ursache fur ¨ die schlechte Reproduzierbarkeit ist, und durch die Zunahme der Ionenst¨arke hervorgerufen wird. Diese kann sowohl durch Zelllyse in der Probensuspension als auch durch Instabilit¨at der Pufferlosung ¨ bedingt sein. Eine weitere mogliche ¨ Ursache fur ¨ die fehlende Reproduzierbarkeit der Elektropherogramme liegt im Alterungsprozess der Zellen selbst. ¨ Durch Anderungen der Oberfl¨achenladung und vermehrter Clusterbildung a¨ ndert sich das Große-zu-Ladungsverh¨ ¨ altnis und damit die elektrophoretische Mobilit¨at. Um den Beitrag von Pufferlosung ¨ und Zellalterung zu bestimmen, wurden die folgenden 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 103 Experimente durchgefuhrt: ¨ 4.2.7.1 Pufferinstabilit¨at 9.2 unter Sauerstoffzufuhr 9.0 inerte Atmosphaere 8.8 8.6 8.4 conductivity [µS/cm] pH Wiederholte CE-Messungen wurden an reiner Pufferlosung ¨ in Abwesenheit suspendierter Zellen vorgenommen. Dazu wurde fur ¨ jede Trennung Puffer aus einem neuen Vial aber von der gleichen Puffercharge verwendet. Von Messung zu Messung stieg auch hier der Strom kontinuierlich, wodurch es einen ersten Hinweis fur ¨ die Unbest¨andigkeit des Puffers uber ¨ mehrere Stunden gab. Ein Vergleich der pH-Werte und Leitf¨ahigkeiten von Pufferlosungen ¨ unter inerter Argon-Atmosph¨are und Pufferlosun¨ gen, bei welchen durch Ruhren ¨ Begasung mit Luft-Atmosph¨are stattfand, ist in Abbildung 4.28 dargestellt. 50 unter Sauerstoffzufuhr 45 inerte Atmosphaere 40 35 30 8.2 25 8.0 20 7.8 15 7.6 0 1 2 3 4 5 6 (a) pH-Verlauf uber ¨ die Zeit. 7 time [h] 10 0 1 2 3 4 5 6 7 time [h] (b) Verlauf der Konduktivit¨at uber ¨ die Zeit. Abbildung 4.28: Zeitlicher Verlauf der Instabilit¨at des Trennpuffers W¨ahrend die Pufferlosung ¨ unter inerter Atmosph¨are nur eine sehr langsame Ver¨anderungen der Leitf¨ahigkeit und des pH-Wertes zeigt, fuhrt ¨ Begasung und damit ein verst¨arkter CO2 -Gasaustausch zu einem raschen Anstieg der Ionenst¨arke und einem raschen pH-Abfall. Vermutlich erhoht ¨ gelostes ¨ CO2 im Puffer (CO2 + H2 O ⇒ HCO3− + H + ) die Protonenkonzentration und fuhrt ¨ damit, bedingt durch den schwach molaren ¨ Trennpuffer, zum Uberschreiten der Pufferkapazit¨at und zu einem pH-Wert-Abfall. ⇒ Es empfiehlt sich deshalb die Pufferlosung ¨ unmittelbar vor jeder Trennung neu herzustellen. 4.2.7.2 Probeninstabilit¨at Unter Verwendung eines unmittelbar vor jeder Trennung neu hergestellten Puffers wurden CE-Messungen der gleichen Micrococcus-Probe viermal hintereinander wiederholt (Elektropherogramme 1-4 in Abbildung 4.29). Bei gleichbleibendem Strom 104 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.29: Wiederholte Messungen der gleichen M. luteus-Probe. Bei jeder Trennung wurde eine neu hergestellte Pufferlosung ¨ verwendet. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25. zeigten sich auch hier von Experiment zu Experiment Unterschiede im elektrophoreti¨ schen Fingerabdruck. Als Hauptursache werden Anderungen der Oberfl¨achenladung ¨ vermutet, zumal eine visuelle mikroskopische Analyse keine signifikanten Anderungen in der Clusterverteilung erkennen ließ. ⇒ Es erwies sich als notwendig, neben neu hergestellten Pufferlosungen ¨ auch neu hergestellte Probensuspensionen fur ¨ jede Trennung zu verwenden. 4.2.7.3 Elektrophoretische Heterogenit¨at In Abbildung 4.30 sind die Elektropherogramme einer Micrococcus-Probe an funf ¨ aufeinanderfolgenden Tagen unter den jetzt standardisierten Bedingungen dargestellt. Repr¨asentativ fur ¨ alle Messungen wurde der EOF mit Benzylalkohol im Elektropherogramm des funften ¨ Tages markiert. Die Elektropherogramme zeigen scharfe, gut getrennte Signale, die sich jedoch im Muster erneut von Trennung zu Trennung unterscheiden. Trennpuffer und Zellalterung konnten als Ursache ausgeschlossen werden. Mogliche ¨ Ursachen sind: • Die elektrophoretische Heterogenit¨at der Bakterienprobe an sich. Aufgrund der Bildung von Aggregaten unterschiedlicher Große ¨ und Form besitzt eine einzelne Probe eine Verteilung elektrophoretischer Mobilit¨aten, die sich z. B. auch durch geringfugige ¨ Unterschiede in der Kultivierung ver¨andern kann. • Partikel-Kapillarwand-Interaktionen, Partikel-Partikel-Interaktionen und Partikelinstabilit¨at in der Pufferlosung. ¨ Wiederholmessungen am gleichen Tag sollten mehr Einblick geben. 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 105 Abbildung 4.30: Elektropherogramme von M. luteus an funf ¨ verschiedenen Tagen unter den standardisierten Probenund Pufferbedingungen. Am funften ¨ Tag wurde zur EOFMarkierung eine 0.00005 % Benzylalkohol enthaltende Pufferlosung ¨ verwendet. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25. 4.2.7.4 Biologische und statistische Einflusse ¨ Abbildung 4.31 zeigt die Elektropherogramme von M. luteus aus Wiederholmessungen der gleichen Zellkultur nach unterschiedlichen Inkubationszeiten (a-d). Bei den Wiederholmessungen innerhalb eines Tages, die eine Inkubationsspanne von 6 h abdeckten, konnte eine relativ gute Reproduzierbarkeit erreicht werden. Auff¨allig war jedoch: 1. Das Fehlen einzelner Signale in den drei aufeinanderfolgenden Elektropherogrammen des gleichen Tages. 2. Der generelle Trend zu großerer ¨ Peakanzahl im Laufe der vier aufeinanderfolgenden Tage. Der erste Punkt ist besonders gut in Abbildung 4.31c zu erkennen. Das, abgesehen von einem im zweiten Elektropherogramm fehlenden Peak, ansonsten gleiche Peakmuster ist ein Hinweis auf statistische Imperfektionen, wenn man bedenkt, dass durch die Probeninjektion eine Stichprobe von Aggregaten unterschiedlicher Große ¨ und Form gezogen wird, die von den Zellen mit einer unterschiedlichen Wahrscheinlichkeit gebildet werden. Der zweite Punkt fuhrt ¨ zu biologischen Einflussfaktoren. Obgleich, wie in Abbildung 4.14 dargestellt, die station¨are Phase nach einer Inkubationszeit von 24 h beginnt, und damit die Bakterienkultur uber ¨ mehrere Stunden/Tage stabil sein sollte, a¨ ndert sich die Zusammensetzung der Bakterienpopulation weiterhin durch zunehmende Agglomeratbildung. Berucksichtigt ¨ man die naturlichen ¨ Schwankungen im Zellwachstum, so ist ein reproduzierbares Peakmuster von Tag zu Tag nahezu ausgeschlossen. Hinweise auf Partikel-Kapillarwand und Partikel-Partikel-Interaktionen konnten in diesem Experiment nicht gefunden werden. 106 4. Ergebnisse und Diskussion (a) Inkubationszeit 6-12 h (b) Inkubationszeit 24-36 h (c) Inkubationszeit 48-60 h (d) Inkubationszeit 72-84 h Abbildung 4.31: Analyse von M. luteus-Proben nach unterschiedlichen Inkubationszeiten. Zur EOFMarkierung wurde eine 0.00005 % Benzylalkohol enthaltende Pufferlosung ¨ verwendet. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25. ⇒ Statistische und biologische Imperfektionen sind die Hauptursache der fehlenden Reproduzierbarkeit des elektrophoretischen Fingerabdrucks von M. luteus. ¨ 4.2.8 Ubertragung der Methode auf: P. fluorescens und S. vestibularis Im letzten Abschnitt konnte gezeigt werden, dass die Ursache fur ¨ die schlecht reproduzierbaren Elektropherogramme des Micrococcus-Stammes in der Natur dieser Bakterienspezies selbst zu finden ist. Im n¨achsten Schritt wurde deshalb, in der Hoffnung auf bessere Ergebnisse, die entwickelte CE-Methode auf die beiden Bakterienspezies P. fluorescens und S. vestibularis ubertragen. ¨ Fur ¨ P. fluorescens (Abbildung 4.32) lagen zwar die detektierten Peaks im Elektropherogramm mit hoher Auflosung ¨ vor, doch spiegelte das Peakmuster keineswegs eine gesunde Bakterienpopulation der station¨aren Phase wider. Wie in Abschnitt 4.2.2 bereits beschrieben, liegt die Pseudomonas-Spezies in Kultur uberwiegend ¨ in Einzelzellen vor, welche aufgrund ihrer geringen Große ¨ die kurzeste ¨ Migrationszeit haben sollten. Dieser dominante erste Peak fehlte jedoch im 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 107 Abbildung 4.32: Analyse einer P. fluorescens-Probe nach einer Inkubationszeit von 24 h. Nach Waschung erfolgte die Resuspendierung in Trennpuffer mittels einminutigem ¨ Vortexen in einer Konzentration von 0.5 OD600 . Fur ¨ Trennpuffer und CEBedingungen, siehe Abbildung 4.21. Abbildung 4.33: Analyse einer P. fluorescens-Probe nach einer Inkubationszeit von 8 h, 19 h und 30 h, aus der gleichen Zellkultur. Nach Bakterienernte erfolgte Waschung und Resuspendierung in Trennpuffer unter sanftem Pipettieren zu einer Konzentration von 0.5 OD600 . Fur ¨ Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21. Elektropherogramm. Eine mikroskopische Analyse der Bakterienprobe gab Aufschluss uber ¨ die Ursache. Es zeigten sich teilweise lysierte Bakterienzellen und abgerissene Ketten. Offensichtlich musste eine sanftere Vorgehensweise in der Probenpr¨aparation gefunden werden. Durch Einsatz von Pasteurpipetten gelang eine sanfte Resuspendierung der von N¨ahrmedium gereinigten Zellkultur in Trennpuffer und fuhrte ¨ zu einem charakteristischen Peakmuster mit guter Reproduzierbarkeit (Abbildung 4.33). ¨ Ahnlich der M. luteus-Studie wurde auch bei P. fluorescens der Einfluss verschiedener Inkubationszeiten auf den elektrophoretischen Fingerabdruck untersucht. Wie in Abbildung 4.14 zu sehen, ist die station¨are Phase nach 18 h erreicht. Um unterschiedliche Wachstumsstadien analysieren zu konnen, ¨ wurde nach einer Inkubationszeit von 8 h, 19 h und 30 h jeweils eine Bakterienprobe vermessen. Dadurch war ein Zustandsbereich von der exponentiellen Phase bis weit in die station¨are Phase hinein abgedeckt. Die jeweiligen Elektropherogramme in Abbildung 4.33 zeigten in diesem Zeitfenster ¨ qualitativ keine signifikanten Anderungen. Auch bei S. vestibularis gelang die Anwendung der entwickelten CE-Methode nur un- 108 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.34: Analyse einer S. vestibularis-Probe nach einer Inkubationszeit von 4 h bis 24 h, aus der gleichen Zellkultur. Zur EOF-Markierung eine 0.00005 % Benzylalkohol enthaltende Pufferlosung ¨ verwendet. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.33. ter sanften Resuspendierungsbedingungen. In Abbildung 4.34 sind die Elektropherogramme zu unterschiedlichen Inkubationszeiten abgebildet. W¨ahrend bei der Pseudomonas-Spezies die Wachstumsphasen CE-analytisch nicht mitverfolgt werden konnten, erwiesen sich die Elektropherogramme der Streptokokken-Spezies wachstumsphasenspezifisch. Die Elektropherogramme von Bakterienproben aus der exponentiellen Phase, d. h. zu 4 h, 6 h und 8 h zeigen einen Peak nach einer Migrationszeit von ca. 10 Minuten. Eine mikroskopische Betrachtung in dieser Phase best¨atigte dieses analytische Ergebnis - die Zellpopulation bestand nahezu ausschließlich aus Diplokokken. Die Elektropherogramme a¨ nderten sich jedoch drastisch mit dem Beginn der station¨aren Phase. Drei Signale in Folge, sogenannte Tripletts, charakterisieren die Elektropherogramme der Bakterienproben nach einer Inkubationszeit von 10 h, 15 h 20 h und 25 h und sind wie eine mikroskopische Analyse zeigte, auf Kettenbildung zuruckzuf ¨ uhren. ¨ 4.2.9 Anwendungsbreite Trennpuffer, CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation der optimierten CE-Methode sollten fur ¨ eine große Anzahl von Mikroorganismen anwendbar sein, um sp¨ater den entwickelten Zytotoxizit¨atstest moglichst ¨ leicht auf verschiedene Erregerspezies uber¨ tragen zu konnen. ¨ 4.2.9.1 N. cinerea Aus diesem Grund wurde die Bakterienspezies Neisseria cinerea, mittels optimierter CE-Methode analysiert. Sie ist bisher kapillarelektrophoretisch nicht untersucht worden und wird auch in anderen analytischen Verfahren selten angewandt. Unter ihrer Gattung Neisseriaceae sind jedoch unter anderem Erreger der Meningitis zu finden, womit N. cinerea ein interessanter apathogener Repr¨asentant wichtiger Krankheitserre- 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 109 Abbildung 4.35: Analyse von N. cinerea-Proben nach einer Inkubationszeit von jeweils 24 h, gemessen an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Fur ¨ Trennpuffer, CE und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25. ¨ ger darstellt. Ahnlich der Micrococcus-Spezies bildet er unregelm¨aßige Cluster, lieferte jedoch im Gegensatz zu M. luteus auch an drei aufeinanderfolgenden Tagen, abgesehen von Verschiebungen in den Migrationszeiten, qualitativ reproduzierbare Ergebnisse (Abbildung 4.35). 4.2.9.2 Trypanosoma brucei brucei Mit dem Aufkommen bioanalytischer Anwendungen in der CE wurden auch kapillarelektrophoretische Untersuchungen an Erythrozyten [226, 289] und Trennungen von Organellen aus lysierten Zellen [66, 130, 285] durchgefuhrt. ¨ Auch bei Trypanosomen (Abschnitt 1.1.2), die mit einem Durchmesser von 10 µm noch im Großenbereich ¨ von Erythrozyten lagen, gaben ihre negative Oberfl¨achenstruktur und ihre gelungene Field-Flow-Fraktionierung [103] Hinweise auf eine mogliche ¨ kapillarelektrophoretische Anwendung. In einem ersten Versuch wurden mit der fur ¨ Bakterien optimierten CE-Methode die Trypanosomen-Spezies T. brucei brucei analysiert. Nach dem Reinigungsprozess wurden die Trypanosomen durch sanftes Pipettieren in Puffer suspen¨ diert und auf einen OD600 -Wert von 0.5 eingestellt. Eine mikroskopische Uberpr ufung ¨ der Zellsuspensionen zeigte, dass bereits die Zellpr¨aparation zum Lysieren der Trypanosomen gefuhrt ¨ hat - moglicherweise ¨ aufgrund dem im Puffer fehlenden, aber lebensnotwendigen N¨ahrstoff Glukose oder ungunstiger ¨ Osmolarit¨at. Dennoch wurde die CE-Analyse von zwei unabh¨angigen Zellsuspensionen durchgefuhrt. ¨ Die Elektropherogramme in Abbildung 4.36 zeigen zwar nicht das Peak-Muster intakter Trypanosomen, doch konnten die verschiedenen Zellbestandteile mit guter Auflosung ¨ voneinander getrennt werden. Ebenfalls wurde eine relativ gute Reproduzierbarkeit erreicht, obgleich in den jeweiligen Elektropherogrammen nicht alle Komponenten detektier¨ bar waren. Ahnlich der M. luteus-Analyse konnten ¨ auch hier statistische Imperfektionen (Abschnitt 4.2.7.4) die Ursache sein. Eine gleichzeitige mikroskopische Detektion 110 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.36: Kapillarelektrophoretische Trennung trypanosomaler Zellbestandteile aus zwei unterschiedlichen Proben, gemessen am gleichen Tag. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.33. konnte ¨ zeigen, ob es sich bei den detektierten Signalen tats¨achlich um Zellorganellen handelt, wodurch die Aufkl¨arung von Angriffspunkten neuer Wirkstoffe uber ¨ Fluoreszenzmarkierung kapillarelektrophoretisch moglich ¨ wurde. ¨ 4.2.10 Trennung verschiedener Bakterienst¨amme Parallelisierung ist das Schlagwort fur ¨ High-Throughput-Screening-Verfahren. Zu seiner Realisierung bzw. zumindest zur Steigerung des Durchsatzes der bisherigen CEMethode sollten die drei Bakterienspezies M. luteus, P. fluorescens und S. vestibularis in einem Elektropherogramm von einander getrennt werden. Dadurch sollte es sp¨ater moglich ¨ sein, die Toxizit¨at von Testsubstanzen auf alle drei Erreger simultan zu untersuchen. In Abbildung 4.24 wurde bereits gezeigt, dass verschieden große Zellagglomerate mittels Ultraschallbehandlung in Einzelzellen separiert werden konnen, ¨ wodurch die Voraussetzung fur ¨ die elektrophoretische Parallelisierung verschiedener Bakterienspezies gegeben ist. Mittels optimierter CE-Methode und 1-minutiger ¨ Ultraschallbehandlung gelang die Separation der drei Bakterienarten (siehe Abbildung 4.37). Die injizierte Probe enthielt die einzelnen Komponenten in gleichem Anteil und wurde auf eine Gesamtzellzahl von 0.5 OD600 eingestellt. Wie das Elektropherogramm zeigt, sind in der Zellsuspension jedoch trotz Ultraschallbehandlung zu einem geringen Anteil Zellagglomerate und -ketten vorhanden, die auch mit Hilfe anderer Dispergierverfahren, wie z. B. unter Zusatz geringer Mengen von Tween 80, nicht vereinzelt werden konnten. Dennoch gelang mittels der einzelnen Referenzbakterien bzw. Referenzmischungen die Identifizierung der einzelnen Peaks im Elektropherogramm. Aufgrund der geringen elektrophoretischen Unterschiede zwischen P. fluorescens und S. vestibularis und der moglichen ¨ Schwankungen in der Migrationszeit, wird eine endgultige ¨ Zuordnung dieser St¨amme erst durch simultane Mikroskopie des Detektionsfensters moglich ¨ (dieses Equipment stand uns nicht zur Verfugung). ¨ 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 111 Abbildung 4.37: Kapillarelektrophoretische Trennung der drei Bakterienspezies: M. luteus, P. fluorescens und S. vestibularis. Die Proben wurden nach einer Gesamtinkubationszeit von 24 h pr¨apariert und vor der Injektion 1 Minute im Ultraschallbad behandelt. Die Probenkonzentration im Gemisch betrug 0.5 OD600 . Fur ¨ Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21. 4.2.11 Validierung der Methode Rein visuell zeigte sich die beste Reproduzierbarkeit der CE-Analyse intakter Mikroorganismen bei den beiden Bakterienst¨ammen P. fluorescens und S. vestibularis. Aus diesem Grund sollte mit diesen die CE-Methode zum Zytotoxizit¨atstest weiterentwickelt werden. Um die Frage nach der Eignung der Methode zur weiteren Entwicklung zu beantworten, musste die Methode validiert werden - denn Validierung ist der Nachweis der Eignung fur ¨ einen bestimmten Gebrauch fitness for use” [152]. Zur Validie” rung der fundamentalen Parameter wie Richtigkeit, Pr¨azision, Linearit¨at, Selektivit¨at, Spezifizit¨at, Sensitivit¨at und Robustheit wurde den Richtlinien der “International Conference of Harmonization, ICH” und “Food and Drug Administration, FDA” [58–60] gefolgt. Einige dieser Parameter wurden bereits w¨ahrend der Methodenentwicklung berucksichtigt: ¨ So wurde die Methode darauf ausgerichtet, eine gute Wiederholpr¨azision, einen Anwendungsbereich auf mindestens drei Bakterienspezies, und ein relativ hohes Maß an Robustheit zu besitzen. Auf diesem Wege wurden Grenzen in der Stabilit¨at des Trennpuffers und der mikrobiellen Analyte festgestellt und optimiert. Mit der optimierten CE-Methode war zwar die Sensitivit¨at aufgrund der Konzentrationsabh¨angigkeit der Elektropherogramme beschr¨ankt, die Selektivit¨at und Spezifizit¨at dagegen, wie die Trennung verschiedener Bakterienspezies und deren Agglomerate zeigte, gegeben. Um neben diesen bisher qualitativen Betrachtungen, die Methode quantitativ zu charakterisieren, wurden die Wiederholpr¨azision und Linearit¨at am Beispiel P. fluorescens genauer untersucht. Auf Richtigkeit der Methode konnte erst im eigentlichen Zytotoxizit¨atstest durch Vergleich des errechneten antimikrobiellen Potenzials verschiedener Referenzsubstanzen mit dem aus konventionellen Methoden gepruft ¨ werden. 112 4. Ergebnisse und Diskussion 4.2.11.1 Linearit¨at Die richtige Kalibrierung und damit die Bestimmung der Korrelation zwischen Signal und Analytkonzentration ist die Grundvoraussetzung fur ¨ quantitativ-analytisches Arbeiten, welches sp¨atestens bei der Quantifizierung der Elektropherogramme zur Bestimmung der Zytotoxizit¨at zur Anwendung kommen sollte. In der Kalibrierarbeit wurden sechs Elektropherogramme von Pseudomonas-Suspensionen in einem Konzentrationbereich zwischen 0.1 und 0.6 OD600 aufgenommen (Abbildung 4.38a). Jedes Elektropherogramm entsprach nach Integration der einzelnen Signale uber ¨ die gesamte Zeitskala des Elektropherogrammes, einem Messpunkt, welcher der empirischen, aus der OD-Messung (Abschnitt 4.2.4.3) ermittelten Probenmenge zugeordnet wurde. Die Integrale wurden als korrigierte Peakfl¨achen berechnet, d. h. sie enthalten bereits einen Korrekturfaktor zum Ausgleich der Peakverbreiterung bedingt durch l¨angere Migrationszeiten. Der gemessene Konzentrationsbereich ergab sich aus den Bedingungen fur ¨ die Erstellung mikrobieller Elektropherogramme (Abschnitt 4.2.6.3.4). Die Instabilit¨at der Proben erforderte die Herstellung jeder Zellonzentration aus einer neuen Bakterienkultur in einer Inkubationsphase von 24 h bis 36 h. Es wurden somit keine in der pharmazeutischen Analytik ublichen ¨ Stammlosungen ¨ verwendet. Die Auswertung der Korrelation zwischen Signal und Konzentration erfolgte visuell und uber ¨ 2 die Bestimmung des Bestimmtheitsmaßes (R ). Betrachtet man in Abbildung 4.38b die Auftragung der erhaltenen Wertepaare, wird ein aus der Messtechnik resultierender systematischer Fehler deutlich. Die Konzentration der Bakteriensuspension kann nur indirekt uber ¨ die optische Dichte bestimmt werden und enth¨alt auf diese Weise an sich eine Korrelationsfunktion. Die Korrelation zwischen Zellzahl und optischer Dichte wurde in Abschnitt 4.2.4.3 uber ¨ den gesamten Messbereich bestimmt. Wie in Abschnitt 3.3.1 bereits besprochen gilt eine Linearit¨at zwischen optischer Dichte und Zellzahl jedoch genaugenommen erst ab einem OD-Wert von 0.2 bis 0.3. L¨asst man aus diesem Grund das erste Wertepaar (0.113,8916) außer Acht und fittet die restlichen Wertepaare an eine Korrelationsfunktion 1. Ordnung: y(x) = ax + b, so erh¨alt man die folgende Geradengleichung: y(x) = 665374x − 132538 (4.2) mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0.993. Der negative Y-Achsenabschnitt ergibt physikalisch zun¨achst keinen Sinn. Er unterstutzt ¨ jedoch die bei der Konzentrationsabh¨angigkeit der Elektropherogramme (Abschnitt 4.2.6.3.4) aufgestellte Hypothese, dass unkontrollierte Adsorption des Analyten, d. h. der Mikroorganismen an der PEObeschichtung, w¨ahrend der kapillarelektrophoretischen Trennung stattfindet. Dieses Ph¨anomen ist nicht nur von der Temperatur, dem Losungsmittel ¨ und der Beschaffenheit der betreffenden Oberfl¨achen abh¨angig, sondern auch von der Konzentration des Analyten [153]. Vermutlich ist gerade diese Konzentrationsabh¨angigkeit der Adsorpti- 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 113 (a) Elektropherogramme von P. fluorescens bei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen und einheitlicher Injektion von 10 s bei 0.5 psi. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.21. Integral 3 ×10 300 250 200 150 100 50 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 OD600 (b) Auftragung der korrigierten Gesamtfl¨achen der einzelnen Elektropherogramme von P. fluorescens gegen die eingesetzten Bakterienkonzentrationen. Fur ¨ die Korrelationsfunktion 1. Ordnung wurde im Konzentrationsbereich 0.2-0.6 OD600 die Geradengleichung f (x) = 665374x − 132538 mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0.993 erhalten. Abbildung 4.38: Prufung ¨ auf Linearit¨at der Pseudomonas-Spezies. on an die “hungrigen Oberfl¨achen” dafur ¨ verantwortlich, dass mit einem R2 -Wert von 0.993 dennoch eine gute Linearit¨at zwischen Messsignal und Zellmenge vorliegt. Aus der Kalibrierfunktion konnen ¨ aber noch weitere Informationen gewonnen werden. Die Steigung erscheint mit einem Wert von 66537 zun¨achst sehr groß, wodurch eine hohe Empfindlichkeit suggeriert wird. Wie sich die Empfindlichkeit auf die Pr¨azision auswirkt wird nachfolgend diskutiert. 114 4. Ergebnisse und Diskussion 4.2.11.2 Pr¨azision Bei der Methodenentwicklung am Stamm M. luteus zeigte sich, dass die Durchfuhrung ¨ von Wiederholmessungen mikrobieller Proben aus einem Inkubationszeitfenster von ca. 12 h am gleichen Tag die beste Reproduzierbarkeit lieferte (Abschnitt 4.2.7.4). Zur Bestimmung der Pr¨azision, dem quantitativen Maß fur ¨ die Robustheit einer Methode, welche als Standardabweichung s berechnet wird [153], wurden deshalb in Abbildung 4.39 sechs Pseudomonas-Proben nach einer Inkubationszeit von 24 h bis 36 h in kurzen Zeitabst¨anden unter gleichen CE-Bedingungen analysiert. Die Probenkonzentrationen zeigten jeweils einen OD600 -Wert von 0.5. Die Integration der Elektropherogramme ergab eine korrigierte Gesamtfl¨ache von: 330290.46 ± 41010.17 normiert auf einen OD600 Wert von 1. Dies entspricht einer Standardabweichung von 12.42% und liegt damit im Bereich biometrischer Großen ¨ [216]. Eine große Fehlerquelle in der CE-Methode stellt die Injektion dar, die aufgrund der geringen Anzahl der Partikel pro Volumen zu statistischen Imperfektionen fuhrt, ¨ die sich neben den in Abschnitt 4.2.7.4 beschrie¨ benen qualitativen Anderungen des Peakmusters auch in quantitativen Schwankungen a¨ ußern kann. Bezuglich ¨ der Schwankungen in den Migrationszeiten wurde fur ¨ den Einzelzellen-repr¨asentierenden-ersten-Peak eine Migrationszeit von 7.04 ± 0.23 Minuten gemessen. Dies entspricht einer Standardabweichung von 3.29 %, womit die Schwankung durchaus noch im Rahmen der ublichen ¨ Arzneistoff-Analytik lag [153]. Abbildung 4.39: Analyse von P. fluorescens-Proben nach einer Inkubationszeit zwischen 24 h bis 30 h, am gleichen Tag gemessen. Fur ¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.33. 4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 115 4.2.12 Fazit: CE-Analyse von Mikroorganismen • Die CE-Methode bewies sich in guter Pr¨azision, Selektivit¨at, Spezifizit¨at, Linearit¨at und in einem weiten Anwendungsbereich. (Trennpuffer: 0.78 mM TrisBorat, 0.018 mM Na2 EDTA und 0.0125% PEO bei einem pH von 8.7; polymere Matrix: PEO 600.000 wurde in einer Konzentration von 0.5 % bei 30 ◦ C fur ¨ mindestens 12 h gelost ¨ und anschließend mit Puffer auf 0.0125 % verdunnt; ¨ CEBedingungen: Quarzkapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm und einer Detektionsl¨ange von 21 cm, konstant angelegte Spannung von 10 kV, Temperatur 23 ◦ C, anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur ¨ 10 s, Detektion bei 214 nm; Bakterienproben und Puffer: Neue Herstellung vor jeder Messung; eine Zellkonzentration von 0.5 OD600 ) • Die Probenpr¨aparation muss dem Mikroorganismus entsprechend individuell optimiert werden. • Die Grenze der Reproduzierbarkeit der kapillarelektrophoretischen Analyse intakter Mikroorganismen ergibt sich aufgrund der statistischen Verteilung der Grundgesamtheit einer Bakterienpopulation. 116 4. Ergebnisse und Diskussion 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung ¨ Uberblick: In diesem Abschnitt werden zwei neue Methoden zur Bestimmung der bakteriziden Wirksamkeit auf der Grundlage der Fluoreszenzspektroskopie entwickelt. Die Auswertung erfolgt sowohl am Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (fluorescence microplate reader, FMR) als auch mittels der in Abschnitt 4.2 beschriebenen kapillarelektrophoretischen Methode unter Verwendung eines Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektors (LIF-CE). Die Nutzung der Membranunversehrtheit bei lebenden gegenuber ¨ toten Zellen ermoglicht ¨ nach Zellmarkierung mit den beiden Nucleins¨aurebindenden Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid (”LIVE/DEAD BacLight viability kit”) schnell zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. 4.3.1 Zustand einer Bakterienpopulation Zur Klassifizierung der antimikrobiellen Wirkung getesteter Substanzen in bakterizid und statisch ist eine Analyse verschiedener Zellmerkmale notwendig. Konventionell dient die Replikationsf¨ahigkeit als Kriterium fur ¨ die Prufung ¨ auf Lebensf¨ahigkeit. Deren Bestimmung in einer Zellkultur erfolgt meist durch Ausplattieren einer definierten Menge Zellsuspension und anschließendem Z¨ahlen koloniebildender Einheiten [254]. Diese Methode hat jedoch durch Verklumpung der Zellen oder gegenseitiger Beeinflussung bei der Koloniebildung [168] einige Fehlerquellen und ist nicht zuletzt sehr zeitintensiv (24 h bis 5 Tage) [254]. Auf der Suche nach neuen Losungs¨ ans¨atzen wurden in den letzten Jahren vor allem auf dem Gebiet der Fluoreszenzspektroskopie verschiedene rasche Methoden zur Bestimmung der Lebensf¨ahigkeit entwickelt. Sie basieren zum einen auf der Membranunversehrtheit, die darauf beruht, dass bestimmte Marker die Zellmembran nicht penetrieren konnen. ¨ Dazu gehoren ¨ Methylenblau, Kongo-Rot [227] und DNA-Marker wie SYTOX Green [157], Propidiumiodid [135] und Ethidiumbromid [184]. Zum anderen wird die Aktivit¨at von Stoffwechselvorg¨angen gemessen wie z. B. Zellatmung (Tetrazoliumfarbstoffe [8, 223]), Enzymaktivit¨at (Fluoresceindiacetat [229, 247]), Membranpotenzial (Rhodamine 123, DiOC6 (3)(3,3-Dihexyloxacarbocyaniniodid) und DiBAC4 (Bis-(1,3-Dibutylbarbiturs¨aure)-Trimethinoxonol) [138, 169]) oder pH-Gradient (Fluorescein und 5(und6-)-carboxyfluorescein [98]). 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 117 4.3.2 Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid Die fluoreszenzspektroskopische Analyse einer Zellpopulation auf der Basis der SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung (Abbildung 4.40) hat den Vorteil, dass sowohl lebende als auch tote Bakterienzellen bei verschiedenen Wellenl¨angen simultan erfasst werden und aus der relativen Fluoreszenzintensit¨at die Konstitution einer Bakterienpopulation quantitativ beschrieben werden kann. Dies hat zur Folge, dass sich bei Kopplung der fluorimetrischen Detektion mit analytischen Trenntechniken wie z. B. der Kapillarelektrophorese die Verwendung eines internen Standards erubrigt. ¨ Die Lebend-Tot-Markierung mit den beiden Nucleins¨aure-bindenden Farbstoffen beruht auf ihren unterschiedlichen spektralen Eigenschaften und ihrer unterschiedlichen F¨ahigkeit in Bakterienzellen einzudringen [4]. W¨ahrend SYTO9 membranpermeabel ist und alle Zellen einer Bakterienpopulation grun ¨ f¨arbt, wird Propidiumiodid mit seiner charakteristischen roten Fluoreszenz von gesunden Zellen durch seine Membranimpermeabilit¨at ausgeschlossen. Einige Bakterienst¨amme verfugen ¨ desweiteren uber ¨ Efflux-Pumpen, womit Propidiumiodid aktiv aus lebenden Zellen transportiert werden kann [254]. In toten Zellen fuhrt ¨ sowohl die Verdr¨angung von SYTO9 durch Propidiumiodid aufgrund st¨arkerer DNA-Bindung als auch die Fluoreszenzausloschung ¨ der SYTO9 Emission durch “fluorescence resonance energy transfer”(FRET, Abschnitt 3.3.3) zum Ersetzen der grunen ¨ gegen die rote Fluoreszenz [254]. Der letztere Mecha¨ nismus ist aufgrund der spektralen Uberlappung der beiden Marker moglich. ¨ Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid verl¨auft sehr schnell und erfordert lediglich eine Inkubationszeit von 15 Minuten [12,14]. Dann zeigen lebende Zellen eine grune ¨ und tote Zellen eine rote Fluoreszenz. Die Routineanwendung der SYTO9-Propidiumiodid-Markierung ist jedoch nicht unproblematisch. Zwar ist unbestritten, dass Bakterienzellen, die sich mittels Propidiumiodid anf¨arben lassen weder lebensf¨ahig noch kultivierbar sind, doch wurde bei gleichzeitiger Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid auch von F¨allen berichtet, bei denen sowohl fur ¨ lebende als auch fur ¨ tote Zellen die gleiche rote oder grune ¨ Fluoreszenzintensit¨at detektiert wurde [254]. Solche konfusen, zweideutigen Situationen konnen ¨ durch die extrem großen Unterschiede in der Emissionsintensit¨at von SYTO9 und Propidiumiodid verursacht werden. W¨ahrend SYTO9 an DNA gebunden eine starke Fluoreszenz aufweist [228], zeigen Propidiumiodid-markierte Proben nur eine sehr geringe Fluoreszenzintensit¨at bedingt durch den sehr kleinen Extinktionskoeffizienten des Propidiumiodids [28]. Zum anderen muss aber auch berucksich¨ tigt werden, dass das Emissionsspektrum von SYTO9 mit dem Anregungsspektrum von Propidiumiodid uberlagert. ¨ Diese Tatsache ist die Grundlage dafur, ¨ dass eine gegenseitige Fluoreszenzausloschung ¨ und damit die simultane Lebend-Tot-Bestimmung uberhaupt ¨ moglich ¨ ist - fuhrt ¨ aber bei einem Missverh¨altnis der Markerkonzentrationen unter Umst¨anden zu uneindeutigen Fluoreszenzerscheinungen. In jedem Fall er- 118 H3C 4. Ergebnisse und Diskussion (CH2)3 N NH2 H2N + N CH O I + N CH3 SYTO9: Anregungsmaximum: 480 nm Emissionsmaximum: 500 nm (CH2)3 C2H5 2I + N CH3 C2H5 Propidiumiodid: Anregungsmaximum: 490 nm Emissionsmaximum: 635 nm Abbildung 4.40: Chemische Strukturen und spektrale Eigenschaften der beiden Komponenten SYTO9 und Propidiumiodid des “LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits” L-7012. Im Kit liegt SYTO9 in 3.34 mM und Propidiumiodid in 20 mM Konzentration, jeweils gelost ¨ in DMSO, vor [4]. fordert eine routinem¨aßige Anwendung zun¨achst eine solide Validierung der Fluoreszenzmarkierung. 4.3.3 Auswahl des Testsystems Zum Aufbau neuer Testverfahren zur Bestimmung bakterizider Wirksamkeit einiger Antiinfektiva mittels SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung wurden die beiden Testst¨amme P. fluorescens und S. vestibularis ausgew¨ahlt. Sie wurden im vorhergehenden Kapitel bereits kapillarelektrophoretisch analysiert, wodurch die Entwicklung zweier orthogonaler Methoden mittels FMR und LIF-CE moglich ¨ sein sollte. Die Etablierung und Validierung neuer Methoden erfordert aber auch den Einsatz in der Literatur gut dokumentierter Referenzsubstanzen. Die dafur ¨ geeigneten Antibiotika sollten: • Bakterizid wirksam sein, ¨ • Uber eine gute Wasserloslichkeit ¨ verfugen, ¨ um zun¨achst eine Losungsmittel ¨ bedingte Zytotoxizit¨at ausschließen zu konnen ¨ und • Unterschiedliche Angriffspunkte und Wirkmechanismen besitzen, die sich even- 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 119 tuell unterschiedlich auf die Membranunversehrtheit auswirken konnen. ¨ Vancomycin H H OH HO H O HN - OOC Cl O O N HH H Cl H N O H O H O H H N N H O O N H H + CH3 NH2 CH3 H CH3 NH2 OH OH HO Ciprofloxacin 4-Chinolon-3-carbonsäure O O O F O OH OH N H N N N H Abbildung 4.41: Strukturen der Arzneistoffe, die als Referenzsubstanzen zur Entwicklung und Etablierung der neuen Testverfahren zur Bestimmung der bakteriziden Wirksamkeit verwendet wurden. Die Auswahl fiel auf Ciprofloxacin gegen P. fluorescens und Vancomycin-HCl gegen S. vestibularis. Die Arzneistoffe sind in Abbildung 4.41 dargestellt. Bei Ciprofloxacin handelt es sich um ein Derivat der 4-Chinolon-3-carbons¨aure. Es gehort ¨ zur Gruppe der Gyrase(TopoisomeraseII)-Hemmstoffe. Die Gyrase stellt in Bakterien ein wichtiges Schlusselenzym ¨ fur ¨ die lebenswichtige DNS- und RNS-Transkription dar und ¨ ist verantwortlich fur ¨ die Offnung und den Verschluss der Chromosomenf¨aden des DNS-Kn¨auels. Ihre Hemmung verhindert vor allem das Schließen der geoffneten ¨ DNSStr¨ange und unterbindet somit Zellwachstum und Zellteilung und fuhrt ¨ zum Zelltod. Vancomycin gehort ¨ zur Gruppe der Glykopeptide und wird aus der Fermentationslos¨ ung von Streptomyces orientalis gewonnen. Es hemmt den Einbau von DisaccharidEinheiten in die Proteoglycan-Kette der Zellwand und wirkt bakterizid gegenuber ¨ Gram-positiven Bakterien. Beide Substanzen verfugen ¨ uber ¨ eine sehr gute Wasserlos¨ lichkeit, welche die Herstellung von Stammlosungen ¨ in einer Konzentration von 10 mM zuließ (siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.1). 120 4. Ergebnisse und Diskussion 4.3.4 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) 4.3.4.1 Validierung der Fluoreszenzmarkierung In der Fluoreszenzspektroskopie wird die gesamte Lumineszenz einer Probe gemessen. Sie muss folglich proportional zur vorhandenen Zellzahl sein, d. h. alle Bakterienzellen mussen ¨ mit Farbstoff ges¨attigt sein. Aufgrund der gegenseitigen Beeinflussung der beiden Fluoreszenzmarker SYTO9 und Propidiumiodid durch Verdr¨angung und Fluoreszenzloschung ¨ bildet die S¨attigung der Probe mit SYTO9 die Grundlage der fluorimetrischen Auswertung. Ferner muss fur ¨ eine korrekte Fluoreszenzmarkierung ¨ und Auswertung Propidiumiodid in ausreichendem Uberschuss vorhanden sein, so dass die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration erst durch die Herstellung” ei” ner Korrelation 1. Ordnung (vide infra) zwischen dem grun/roten ¨ Fluoreszenzverh¨altnis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen angepasst werden kann [4, 254]. Die Bestimmung der erforderlichen Konzentrationen erfolgte zun¨achst am FMR bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und Emissionswellenl¨angen von 520 nm (SYTO9) und 655 nm (Propidiumiodid). Diese entsprachen zwar nicht den Anregungs- und Emissionsmaxima, doch bestand dadurch Einklang mit den Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, die zu Visualisierungszwecken eingesetzt wurde, und der LIF-CE. 4.3.4.1.1 S¨attigungskonzentration Die S¨attigungskonzentration von SYTO9 wurde fur ¨ eine Bakterienpopulation in der fruhen ¨ station¨aren Phase bestimmt. In diesem Stadium, kurz nach Abschließen des Zellwachstums besteht eine Bakterienkultur aus fast 100 % lebenden Zellen. Die verwendeten Bakterienzellen waren in 200 µl Wasser suspendiert, um eine mogliche ¨ Bindung von SYTO9 an Mediumbestandteile auszuschließen. In Vorversuchen wurden unterschiedliche Zellkonzentrationen zur Zellmarkierung eingesetzt. Eine Fluoreszenzmarkierung von 1.5 x 107 Zellen/ml (1:10 Verdunnung ¨ einer 0.5 OD600 -Stammlosung, ¨ siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) fuhrte ¨ zu einer Fluoreszenzintensit¨at im Bereich 100 bis 200 RFU (relative fluorescence unit) und erwies sich somit als geeignet fur ¨ alle nachfolgenden Experimente. Abbildung 4.42 zeigt die Fluoreszenzintensit¨aten von acht Pseudomonas-Proben, die zuvor mit unterschiedlichen SYTO9-Konzentrationen in einem Konzentrationsbereich zwischen 15 nM und 10 µM unter Lichtausschluss fur ¨ 15 Minuten inkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensit¨at der markierten Pseudomonas-Proben steigt als Funktion der SYTO9-Konzentration um mehr als das Doppelte. Bei einer Konzentration von > 1.5 µM stagniert die Fluoreszenzintensit¨at und mundet ¨ in einem Plateau, das die S¨attigung der Zellen mit SYTO9 markiert. Ein Vergleich zu den ungebundenen SYTO9-Intensit¨aten, die in rein w¨assriger Umgebung gemessen wurden, verdeutlicht die starke Fluoreszenz des DNAgebundenen SYTO9. Fur ¨ S. vestibularis ergab sich bei a¨ hnlichem Fluoreszenzverhalten green fluorescent intensity [RFU] 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 121 250 SYTO9 + 1.5x107 Zellen/ml SYTO9 ohne Zellen 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 Concentration SYTO9 [µM] Abbildung 4.42: S¨attigungskurve von P. fluorescens fur ¨ den Fluoreszenzmarker SYTO9. Die verwendeten Bakteriensuspensionen enthalten 1.5 x 107 Zellen/ml aus der fruhen ¨ station¨aren Phase in w¨assrigem Milieu. Die Messungen erfolgten am FMR bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und einer Emission von 520 nm. eine identische S¨attigungskonzentration. Fur ¨ alle weiteren Messungen wurde zur S¨attigung von 1.5 x 107 Zellen/ml eine SYTO9Konzentration von 1.67 µM eingesetzt. 4.3.4.1.2 Korrelationsfunktion 1. Ordnung Im zweiten Schritt wurde die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration auf der Basis der optimierten SYTO9-Konzentration eingestellt. Dazu wurden zwei Zellsuspensionen bestehend aus je 100 % lebenden und toten Zellen mit einem OD600 -Wert von 0.5 pr¨apariert, 1:10 verdunnt, ¨ so dass sich eine Gesamtzellzahl von 1.5 x 107 Zellen/ml ergab, und in funf ¨ unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen gemischt: 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, und 0:100. Die exakte Herstellung dieser Referenzsuspensionen und die Abtotung ¨ der Bakterienzellen mit Isopropanol ist im Experimentellen Teil Abschnitt 5.1.7.2.5 beschrieben. Ist das zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzte Verh¨altnis zwischen SYTO9 und Propidiumiodid richtig”, dann beschreibt eine Korrelationsfunk” tion 1. Ordnung die Beziehung zwischen dem Verh¨altnis gruner ¨ zu roter Fluoreszenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen. Unterschiedliche PropidiumiodidKonzentrationen im Bereich 1 bis 100 µM wurden somit auf Linearit¨at getestet. Abbildung 4.43 zeigt am Beispiel der SYTO9-markierten Pseudomonas-Spezies die erhaltenen Vitalit¨atskurven” in Abh¨angigkeit von der eingesetzten Propidiumiodid” Konzentration. 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.44: Vitalit¨atsgera” den” von P. fluorescens und S. vestibularis aus der Mittelung uber ¨ vier Wiederholexperimente. Die Zellmarkierung von 1.5 x 107 Zellen/ml erfolgte mit 1.67 µM SYTO9 und 10 µM Propidiumiodid. Gemessen wurden am FMR bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und 655 nm. 4.0 Prop.= 1 µM Prop.= 10 µM 3.5 Prop.= 100 µM 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 ratio of green/red fluorescence Abbildung 4.43: Vitalit¨ats” kurven” von P. fluorescens in Abh¨angigkeit unterschiedlicher Propidiumiodid-Konzentrationen. Die Bakteriensuspensionen enthalten 1.5 x 107 Zellen/ml in unterschiedlichen lebend/totVerh¨altnissen und wurden mit SYTO9 in einer Konzentration von 1.67 µM ges¨attigt. Gemessen wurde am FMR bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und 655 nm. ratio of green/red fluorescence 122 7 20 40 60 40 60 80 100 percentage of live cells P. fluorescens S. vestibularis 6 5 4 3 2 0 20 80 100 percentage of live cells Fur ¨ eine lineare Korrelation zwischen grun/rotem ¨ Fluoreszenzverh¨altnis und dem Anteil lebender Bakterienzellen erwies sich fur ¨ eine Bakteriensuspension von P. fluorescens und S. vestibularis mit einer Zellkonzentration von 1.5 x 107 Zellen/ml die Markierung mit 1.67 µM SYTO9 und 10 µM Propidiumiodid als geeignet. Die Markierung der Zellen erfolgte nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten unter Lichtausschluss. Die entsprechenden Vitalit¨atsgeraden” von P. fluorescens und S. vestibularis sind in ” Abbildung 4.44 dargestellt. Gemittelt uber ¨ vier unabh¨angige Experimente (d. h. an verschiedenen Tagen durchgefuhrt) ¨ ergaben sich fur ¨ die Korrelationsfunktion f (x) = ax + b die folgenden Gleichungen und Bestimmtheitsmaße: P. fluorescens : f (x) = 0.0152 · x + 1.3879, R2 = 0.999 S. vestibularis : f (x) = 0.0511 · x + 2.0985, R2 = 0.991 Die Streuungen der einzelnen Messwerte sind als Fehlerbalken eingezeichnet und ergeben eine relative Standardabweichung von ≤ 8 % fur ¨ P. fluorescens und ≤ 4 % fur ¨ S. 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 123 vestibularis. Die beiden Ausgleichsgeraden enthalten sowohl • die Vitalit¨atsbestimmung, ¨ • die Korrektur der spektralen Uberlappung von SYTO9 und Propidiumiodid • als auch die Hintergrundfluoreszenz, wobei die letzten beiden Faktoren zu den beobachteten positiven Y-Achsenabschnitten fuhren. ¨ Die Vitalit¨atsgeraden” bilden die Basis fur ¨ alle weiteren Vitalit¨atsbestimmun” gen Arzneistoff-exponierter Bakterienproben und ihre pr¨azise Bestimmung ist unentbehrlich. 4.3.4.2 Testung Antibiotika greifen direkt in den katabolen und anabolen Stoffwechsel der Bakterienzellen ein; das bedeutet, dass sich die zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit verwendeten Bakterienkulturen in der exponentiellen Phase befinden mussen ¨ [182]. Die Bakterienkulturen zeichnen sich in dieser Phase durch starke Stoffwechselaktivit¨at und Zellvermehrung aus, so dass die Auswirkung der Antibiotika auf Zellwachstum und -zustand leicht sichtbar wird. Die Antibiotika wurden in einem Konzentrationsbereich zwischen 0.01 µM und 100 µM auf ihre toxische Wirkung getestet. Nach einer Inkubationszeit von 18 h bei 30 ◦ C wurden die Arzneistoff-exponierten Bakterienzellen geerntet, gewaschen, mit den optimierten Markerkonzentrationen Fluoreszenzmarkiert und zusammen mit einer Positiv(100 % lebende Zellen)- und einer Negativ(100 % tote Zellen)kontrolle am FMR mit einer Extinktion bei 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und 655 nm gemessen. Anhand des ermittelten grun/roten ¨ Fluoreszenzver¨altnisses wurde aus der Kalibrierfunktion der prozentuale Anteil lebender Zellen der jeweiligen Bakterienproben errechnet und in Abh¨angigkeit der eingesetzten Antibiotikakonzentrationen aufgetragen. Abbildung 4.45 zeigt die beiden DosisWirkungs-Kurven von Ciprofloxacin fur ¨ P. fluorescens und Vancomycin fur ¨ S. vestibularis. Insgesamt wurde die Bestimmung der Zytotoxizit¨at dreimal durchgefuhrt. ¨ Die entsprechenden ED50 -Werte berechneten sich mittels linearer Interpolation [134] (Abschnitt 5.3) fur ¨ Ciprofloxacin zu 5.1±1.6 µM und fur ¨ Vancomycin zu 2.4±0.7 µM. Dies entspricht einer Standardabweichung von 31.4 % bei Ciprofloxacin und 29.2 % bei Vancomycin, womit die Streuung im Rahmen der ublichen ¨ Abweichungen von 30 % bei ¨ biologischen Testverfahren liegt [175]. Zur Uberprufung ¨ und Interpretation der Ergebnisse wurde die Testung mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren wiederholt und die entsprechenden MIC-Werte bestimmt (Abschnitt 5.1.8.3). Fur ¨ Ciprofloxacin ¨ ergab sich ein MIC-Wert von 3.0 µM und fur ¨ Vancomycin ein Wert von 0.7 µM. Ahnliche Aktivit¨atskonzentrationen sind auch in der Literatur beschrieben, weshalb auf 4. Ergebnisse und Diskussion percentage of live cells 124 120 Ciprofloxacin VancomycinHCl 100 80 60 Abbildung 4.45: Dosis-Wirkungs-Kurven von Ciprofloxacin fur ¨ P. fluorescens und Vancomycin fur ¨ S. vestibularis mittels FMR. Fur ¨ die Messbedingungen siehe Abbildung 4.44 40 20 0 -3 10 -2 10 -1 10 1 2 10 10 Concentration [ µM] eine Wiederholung der Zytotoxizit¨atsbestimmung verzichtet wurde [102, 122]. Die Toxizit¨atskonzentrationen von beiden Methoden liegen im gleichen Großenbereich, ¨ wodurch die Eignung der fluorimetrischen Auswertung mittels FMR zun¨achst best¨atigt ist. 4.3.5 LIF-CE zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation Zur Entwicklung eines zur FMR-Methode orthogonalen Zytotoxizit¨atstestes auf der Grundlage der LIF-CE wurde auf die im vorangegangenen Kapitel beschriebene kapillarelektrophoretische Methode zuruckgegriffen. ¨ Sie verwendet eine UV-Detektion bei 214 nm und setzt fur ¨ die Erstellung charakteristischer Fingerabdrucke ¨ den Einsatz 8 einer hohen Zellkonzentration mit einem OD600 -Wert von 0.5 (≈1.5 x 10 Zellen/ml) voraus (Abbildung 4.38a). Die Ankopplung der Kapillarelektrophorese an den ArgonLaser-induzierten-Fluoreszenz-Detektor (Anregungswellenl¨ange ist 488 nm) erfordert jedoch das Arbeiten mit wesentlich geringeren Probenkonzentrationen, um das Detektionsmaximum von 1000 RFU nicht zu uberschreiten ¨ (Abschnitt 3.4.1.3). Aufgrund der starken Fluoreszenzintensit¨at musste die Anzahl der Zellen im Vergleich zur UVDetektion um einen Faktor 100 reduziert werden, wodurch aufgrund von Wechselwirkungen mit dem PEO der mobilen Wandbeschichtung die elektrophoretische Wanderung der Zellen so stark beeinflusst wurde, dass keine Zellen mehr am Detektor ankamen. In einem ersten Schritt musste die etablierte UV-CE-Methode fur ¨ kleinere Probenkonzentrationen anwendbar gemacht werden, ohne dass die Charakterisierung einer Bakterienkultur anhand des Peakmusters verloren ging. Eine Konzentrationsabh¨angigkeit des elektrophoretischen Verhaltens von Bakterienzellen wurde kurzlich ¨ auch am Beispiel E. coli beschrieben [262]. Durch Erhohung ¨ der Ionenst¨arke unter Verwendung eines 10 mM Boratpuffers und der Substitution von PEO gegen Natriumalginat oder anionischer Kohlenhydratpolymere konnten die Interaktionen zwischen 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 125 Bakterium und mobiler Beschichtung unterbunden und damit das Problem der Konzentrationsabh¨angigkeit behoben werden. Die Voruntersuchungen zur Entwicklung der UV-CE-Methode in Abschnitt 4.2.6.2 zeigten jedoch, dass vor allem der Teststamm P. fluorescens sehr empfindlich auf hohe Ionenst¨arken reagiert, wodurch eine Kontrolle der Bakterienadsorption an der Beschichtung auf elektrostatischem Wege in unserem Fall nicht moglich ¨ war und in der Injektionstechnik nach einer Losung ¨ des Problems gesucht wurde. 4.3.5.1 Injektionstechnik Offensichtlich kommt es bei der Injektion einer relativ großen Zelldichte zu Wechselwirkungen der Bakterienzellen untereinander, wodurch “sample stacking” erreicht wird und die Verzogerung ¨ der elektrophoretischen Wanderung durch Wandadsorption verhindert wird (Abschnitt 4.2.6.4). Die Fokussierung der Signale stark verdunnter ¨ 5 7 Fluoreszenz-markierter Bakteriensuspensionen (10 -10 Zellen/ml) gelang schließlich durch eine zweite Injektion einer unmarkierten Zellsuspension mit einer Konzentration von 0.5 OD600 (≈1.5 x 108 Zellen/ml). In Abbildung 4.46 ist der fokussierende Effekt der Nachinjektion am Beispiel der Pseudomonas-Spezies dargestellt. Die Elektropherogramme Fluoreszenz-markierter gesunder Bakteriensuspensionen mit einer Konzentration von 1.5 x 106 Zellen/ml wurden unter dem Einfluss verschiedener unmarkierter Bakterienkonzentrationen der zweiten Injektion bei 520 nm aufgezeichnet. Zur Fluoreszenzmarkierung wurden die im n¨achsten Abschnitt (Abschnitt 4.3.5.2) be¨ schriebenen und validierten Markerkonzentrationen eingesetzt. Ahnlich wie in Abbildung 4.38a zeigten sich charakteristische Peakmuster in Abh¨angigkeit der Zelldichte in der zweiten Injektion. W¨ahrend Elektropherogramme Fluoreszenz-markierter Bakteriensuspensionen ohne nachfolgende Injektion keine Signale innerhalb 30 Minuten aufwiesen (Abbildung 4.46(A)), wurden die Peaks mit zunehmender Zellkonzentration in der nachinjizierten Bakteriensuspension mehr und mehr fokussiert. Mit einer nachinjizierten 0.1-OD600 -Zellsuspension wurde ein breites Signal nach einer Migrationszeit von 30 Minuten (Abbildung 4.46(B)) erhalten, das mit einer 0.5-OD600 -Suspension zu einem scharfen Peakmuster mit einer Trennleistung von ca. 200.000 theoretischer Boden/m ¨ fuhrte ¨ und die Zusammensetzung der Bakterienpopulation, bestehend aus Einzelzellen und Zellketten, beschrieb (Abbildung 4.46(C)). 126 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.46: ”Sample stacking” durch zweite Injektion einer unmarkierten hoch-konzentrierten Bakteriensuspension (OD600 =0.5, d.h. 1.5 x 108 Zellen/ml ). Elektropherogramme einer Fluoreszenzmarkierten Pseudomonas-Suspension mit einer Konzentration von 1.5 x 106 Zellen/ml (A) ohne Zweitinjektion unmarkierter Zellen, (B) mit Zweitinjektion einer unmarkierten Zellsuspension in einer Konzentration von 0.1 OD600 und (C) mit Zweitinjektion einer unmarkierten Zellsuspension in einer Konzentration von 0.5 OD600 . Fluoreszenzmarkierung: fur ¨ 200 µl Zellsuspension mit 1.5 x 106 Zellen/ml wurde je 1 µl einer 0.033 mM SYTO9- und 20 mM Propidiumiodid-Losung ¨ verwendet. Die markierte und unmarkierte Probe wurde hintereinander bei einem Druck von 0.5 psi fur ¨ 10 s injiziert. Trennpuffer: 0.0125 % PEO, 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2 EDTA bei einem pH-Wert von 8.7. CEBedingungen: Quarzglaskapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm, einer Detektionsl¨ange von 21 cm; Spannung konstant angelegt von 10 kV; Temperatur 23 ◦ C und LIF-Detektion: Anregung bei 488 nm und Emission bei 520 nm. 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 127 4.3.5.2 Validierung der Fluoreszenzmarkierung 4.3.5.2.1 Korrelationsfunktion 1. Ordnung Die Validierung der Markerkonzentration und des Verh¨altnisses beider Marker in der LIF-CE-Methode geschah auf der Grundlage der Ergebnisse der FMR-Methode. Die zur S¨attigung einer Zellkonzentration von 1.5 x 107 Zellen/ml eingesetzte SYTO9Konzentration von 1.67 µM wurde 1:10 verdunnt ¨ und in der LIF-CE-Methode angewandt, zumal die zur Fokussierung notwendige zweite Injektion unmarkierter Zellen die direkte Bestimmung der Markers¨attigung verhinderte. Dagegen konnte die richtige” Propidiumiodid-Konzentration durch Prufung ¨ der Korrelation zwischen ” grun/roter ¨ Fluoreszenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen auf Linearit¨at neu ermittelt werden. Fur ¨ eine lineare Korrelation zwischen dem Verh¨altnis grun/roter ¨ Fluoreszenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen wurden 1.5 x 106 Zellen/ml mit 0.167 µM SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid fur ¨ 15 Minuten unter Lichtausschluss inkubiert. Die entsprechenden Elektropherogramme wurden fur ¨ P. fluorescens und S. vestibularis unter Verwendung einer Nachinjektion unmarkierter Bakterien in einer Konzentration von 0.5 OD600 im Zwei-Kanal-Modus des Argon-Laser-induzierten-FluoreszenzDetektors bei 520 nm und 655 nm aufgezeichnet und sind in Abbildung 4.48 und Abbildung 4.49 dargestellt. Sie enthalten • den Anteil lebender Zellen bei 520 nm, • den Anteil toter Zellen bei 655 nm, ¨ • die spektrale Uberlappung von SYTO9 und Propidiumiodid und • nahezu keine Hintergrundfluoreszenz. Ihre Auswertung erfolgte durch Integration aller Signale uber ¨ das gesamte aufgezeich¨ nete Zeitfenster. Die Anderungen der elektrophoretischen Fingerabdrucke ¨ je nach Zustand einer Bakterienpopulation werden im n¨achsten Abschnitt diskutiert. In Abbildung 4.47 sind die zur Kalibrierung der Vitalit¨at bestimmten Vitalit¨atsgeraden” von P. ” fluorescens und S. vestibularis abgebildet. Fur ¨ die Korrelationsfunktion f (x) = ax + b ergaben sich folgende Geradengleichungen und Bestimmtheitsmaße: P. fluorescens : f (x) = 4.71 · x + 0.43, R2 = 0.981 S. vestibularis : f (x) = 22.38 · x + 0.56, R2 = 0.996 4. Ergebnisse und Diskussion ratio of green/red fluorescence 128 25 Abbildung 4.47: Vitalit¨atsgera” den” von P. fluorescens und S. vestibularis aus der Mittelung uber ¨ vier Wiederholexperimente. Die Zellmarkierung von 1.5 x 106 Zellen/ml erfolgte mit 0.167 µM SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid. Gemessen wurde an der LIF-CE bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und 655 nm. P. fluorescens S. vestibularis 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 percentage of live cells Wie bei der FMR-Methode wurde die Korrelation zwischen dem grun/roten ¨ Fluoreszenzverh¨altnis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen insgesamt viermal gemessen. Fur ¨ die Streuung der einzelnen Messergebnisse ergab sich eine relative Standardabweichung von ≤ 18% fur ¨ P. fluorescens und ≤ 12% fur ¨ S. vestibularis. Vermutlich verursacht die geringe Probenmenge die im Vergleich zur FMR-Methode (P. fluorescens ≤ 8% ,S. vestibularis ≤ 4%) hoheren ¨ Standardabweichungen. 2 Die angemessenen R -Werte sind jedoch ein Indiz dafur, ¨ dass die unmarkierten Zellen der zweiten Injektion lediglich als “stacking front” dienen und durch ubersch ¨ ussi¨ ¨ ge Fluoreszenzmarker nicht wesentlich beeinflusst werden. Eine genaue Uberprufung ¨ durch Waschen der markierten Zellen zur Entfernung ubersch ¨ ussiger ¨ Fluoreszenzmarker war jedoch aufgrund der geringen Zellmenge selbst mittels Ultrazentrifugation nicht moglich. ¨ 4.3.5.2.2 Unterschiede zwischen FMR und LIF-CE Vergleicht man das optimale Markerverh¨altnis der FMR- und der LIF-CE-Methode miteinander, so ist bei der LIF-CE-Methode bezogen auf die gleiche Zellzahl die 100fache Propidiumiodid-Konzentration notwendig. Ursache liegt vermutlich in der unterschiedlichen Art der Detektion. Beim FMR wird die gesamte Fluoreszenz aus einem Gesamtvolumen von 200 µl in einer Vertiefung mit einem Durchmesser von 0.8 cm erfasst. Dadurch liefert die Hintergrundfluoreszenz den großten ¨ Beitrag zur detektierten Lichtintensit¨at, wenn man berucksichtigt, ¨ dass bei einem durchschnittlichen Zellradius von 0.5 µm die Bakterienzellen eine Volumenfraktion von unter 10−5 besetzen. Fur ¨ die Messungen von rein mit SYTO9 markierten Zellen f¨allt der extrazellul¨are Beitrag aufgrund der verst¨arkten Fluoreszenzintensit¨at von SYTO9 bei DNA-Bindung weniger stark ins Gewicht. Propidiumiodid jedoch zeigt bei DNA-Bindung im Vergleich zur frei vorliegenden Form nur eine geringfugig ¨ hohere ¨ Intensit¨at [28, 254], so dass die detektierte Emission stark von der Hintergrundfluoreszenz abh¨angt, wodurch zum 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 129 Beispiel auch eine unvollst¨andige Zellmarkierung kompensiert werden kann. Die Kalibrierung der ermittelten grun/rot-Verh¨ ¨ altnisse auf den prozentualen Anteil lebender Zellen l¨asst zwar insgesamt Ruckschl ¨ usse ¨ auf die Konstitution einer Bakterienkultur zu, gibt jedoch keine korrekte Markierung der Zellen wieder. Hierzu ist es notwendig, die Zellen wie in der Kapillarelektrophorese als Einzelobjekte zu detektieren. Die ermittelten Markerkonzentrationen stehen in Einklang mit zahlreichen in der Literatur beschriebenen Beispielen [4, 14]. 4.3.5.3 Charakteristische “fingerprints” In Abbildung 4.48 und Abbildung 4.49 sind die Elektropherogramme der Pseudomonas- und Streptococcus-Spezies bei unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen und dualer Detektion bei 520 nm und 655 nm dargestellt. Bei n¨aherer Betrachtung kann zwischen den Fingerabdrucken ¨ bei 520 nm und 655 nm und der Konstitution der Bakterienpopulation eine Korrelation gefunden werden. Sie wird nachfolgend am Beispiel der Pseudomonas-Spezies diskutiert, gilt aber in a¨ hnlicher Weise auch fur ¨ den ¨ Streptococcus-Stamm. Uberwiegt der Anteil gesunder Zellen in der Probe - repr¨asentiert durch Bakterienproben bei einem lebend-Anteil von 60-100 % - sind die Peakmuster bei 520 nm denen UVmetrisch vermessener Bakterienproben aus der station¨aren Phase sehr a¨ hnlich (Abbildung 4.33). Die Fingerabdrucke ¨ der LIF-CE zeigen lediglich eine Verschiebung zu l¨angeren Migrationszeiten. Die Ursache hierfur ¨ liegt vermutlich im hoheren ¨ Strom, hervorgerufen durch eine hohere ¨ Leitf¨ahigkeit aufgrund der Markerkonzentration in der Probe. Ein großes Signal nach einer Migrationszeit von 12 Minuten repr¨asentiert Einzelzellen und dominiert das Elektropherogramm dieser Konstitutionsklasse. Im Gegensatz dazu erscheint die Fluoreszenz der Signale der Ketten bei l¨angeren Migrationszeiten sehr schwach (Abbildung 4.48(A)). Die entsprechenden Signale bei 655 nm (Abbildung 4.48(B)), welche durch tote Zellen und der spektralen ¨ Uberlappung zwischen SYTO9 und Propidiumiodid hervorgerufen werden, zeigen eine sehr geringe Intensit¨at. Mit steigendem tot-Anteil - repr¨asentiert durch Bakterienproben mit einem lebendAnteil von 0-40 % - nimmt das Einzel-Zell-Signal bei 520 nm stark ab (Abbildung 4.48(A)). Gleichzeitig steigt die Intensit¨at der Signale mit l¨angerer Migrationszeit bei 655 nm (Abbildung 4.48(B)). Auf diese Weise korreliert der Zelltod mit der Kettenbildung, die durch Potenzial¨anderungen in der a¨ ußeren Zellmembran hervorgerufen ¨ wird. Anderungen in der Konstitution einer Bakterienkultur konnen ¨ somit anhand elektrophoretischer Peakmuster mitverfolgt werde. Die Abh¨angigkeit der Kettenbildung von der Zellkonstitution konnte in Abbildung 4.50 mikroskopisch verifiziert werden. 130 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.48: Elektropherogramme von P. fluorescens (Fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid) bei unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen (100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, 0 %). Die Elektropherogramme wurden nach Anregung bei 488 nm im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A) 520 nm (grun, ¨ lebende Zellen) und (B) 655 nm (rot, tote Zellen) aufgezeichnet. Fur ¨ CE-Bedingungen und Probenmarkierung siehe Abbildung 4.46 und Abbildung 4.47. Aufgrund der ¨ spektralen Uberlappung der beiden Fluoreszenzmarker zeigen auch 100 % lebende Zellen eine geringe Intensit¨at der fur ¨ tote Zellen charakteristischen roten Fluoreszenz. 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 131 Abbildung 4.49: Elektropherogramme von S. vestibularis (fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid) bei unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen (100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, 0 %). Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A) 520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. Fur ¨ CE-Bedingungen und Detektion siehe Abbildung 4.48. 132 4. Ergebnisse und Diskussion (a) (b) Abbildung 4.50: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen SYTO9- und Propidiumiodid-markierter P. fluorescens-Spezies in einer Zellsuspension mit 1.5 x 108 Zellen/ml. (a) Bakterienprobe aus der station¨aren Phase mit ca. 100 % lebenden Zellen. (b) 100 % tote Zellen. Die Abtotung ¨ erfolgte mit Isopropanol (siehe Abschnitt 5.1.7.2.5). Aufgenommen wurde die Emission nach einer Anregung bei 488 nm bei 520 und 655 nm. In Anlehnung an die fluorimetrischen Messungen wurden zur Zellmarkierung 16.7 µM SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid verwendet. Bildgroße: ¨ 86.5 µm x 64.6 µm. ¨ Ahnliche Ergebnisse beschrieben auch De Carvalho et al. [74]. In ihrer Studie wurde an den Testst¨ammen Mycobakterium sp. NRRL B-3805, Rhodococcus erythropolis DCL14 und Pseudomonas putida S12 die Bildung von Clustern in Abh¨angigkeit verschiedener Losungsmittel ¨ mikroskopisch untersucht. So bildete z. B. die Pseudomonas-Spezies unter dem Einfluss von Toluen und Bis(2-ethylhexyl)phthalat zahlreichere und großere ¨ Cluster als bei Zusatz von n-Dodecan. Die zus¨atzliche Fluoreszenzmarkierung mit SY¨ TO9 und Propidiumiodid brachte Einblick in die zeitliche Anderung der Konstitution der jeweiligen Bakterienproben und zeigte bei diesen beiden Losungsmitteln ¨ im Vergleich zu anderen einen wesentlich schnelleren Vitalit¨atsverlust. Die Ursachen fur ¨ die ¨ ausgepr¨agte Clusterbildung liegt vermutlich in der Anderung der Hydrophobizit¨at ¨ und Hydrophilizit¨at der Zellmembran. Anderungen in der Hydrophobizit¨at der Zelloberfl¨ache und in der Zusammensetzung der Membranproteine und damit der Oberfl¨achenladung wurden auch fur ¨ mehrere Pseudomonas-Spezies nach Exposition mit Cefotaxim, Amoxicillin/Clavulans¨aure und Amikacin von Kustos et al. [154] berichtet. 4.3.5.4 Testung In der LIF-CE erfolgte die Untersuchung der antibiotischen Wirkung anhand der ¨ Anderungen im elektrophoretischen Profil der Bakterien und gleichzeitiger LebendTot-Bestimmung. Dazu wurden Elektropherogramme der P. fluorescens- und S. vestibularis-Spezies nach Exposition mit Ciprofloxacin bzw. Vancomycin im Konzentrationsbereich zwischen 0.01 und 100 µM bei 520 nm und 655 nm simultan aufgezeichnet (Abbildung 4.52 und Abbildung 4.53). Fur ¨ jede Konzentration wurde nach Integration der percentage of live cells 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 120 133 Ciprofloxacin VancomycinHCl 100 80 60 40 20 0 -3 10 -2 10 -1 10 1 2 10 10 Concentration [ µM] Abbildung 4.51: Dosis-Wirkungs-Kurven von Ciprofloxacin fur ¨ P. fluorescens und Vancomycin fur ¨ S. vestibularis mittels LIF-CE. Fur ¨ die Messbedingungen siehe Abbildung 4.47 Elektropherogramme aus den grun/rot-Fluoreszenzintensit¨ ¨ aten mittels der erstellten Korrelationsgeraden das Verh¨altnis lebender zu toter Zellen berechnet. Die entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven in Abbildung 4.51 sind denen aus der FMR-Methode sehr a¨ hnlich und zeigen einen typischen sigmoidalen Kurvenverlauf. Insgesamt wurde die Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit dreimal durchgefuhrt. ¨ Mittels linearer Interpolation [134] ergab sich fur ¨ Ciprofloxacin gegen P. fluorescens ein ED50 -Wert von 1.9±1.0 (Standardabweichung: 52.6 %) und fur ¨ Vancomycin gegen S. vestibularis ein ED50 -Wert von 0.2±0.07 (Standardabweichung: 35.0 % ). Damit stehen beide ED50 Werte bei zwar etwas hoheren ¨ Standardabweichungen in gutem Einklang mit den Ergebnissen aus der FMR-Methode und dem Mikrodilutionsverfahren. Betrachtet man die entsprechenden Elektropherogramme in Abbildung 4.52 und Abbildung 4.53, erkennt man bei P. fluorescens und S. vestibularis deutlich die ansteigende Kettenbildung ab einer antibiotischen Behandlung mit einer Konzentration von 1 µM. Die visuelle Auswertung ergibt somit eine gute Absch¨atzung fur ¨ die berechneten Toxizit¨aten. 134 4. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 4.52: Elektropherogramme der P. fluorescens-Spezies nach Inkubation mit unterschiedlichen Ciprofloxacin-Konzentrationen. Fur ¨ CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung 4.46. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A) 520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 135 Abbildung 4.53: Elektropherogramme der S. vestibularis-Spezies nach Inkubation mit unterschiedlichen Vancomycin-Konzentrationen. Fur ¨ CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung 4.46. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A) 520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. 136 4. Ergebnisse und Diskussion 4.3.6 Moglichkeiten ¨ und Grenzen 4.3.6.1 Losungsmittel-Effekt ¨ und Wirkmechanismus ¨ Zur Uberpr ufung ¨ der Eignung der beiden neuen Screening-Verfahren wurden zwei weitere, in Abbildung 4.54 abgebildete Antibiotika zur Testung ausgew¨ahlt: • Ofloxacin gegen P. fluorescens: Ofloxacin ist wie Ciprofloxacin ein 4-Chinolon-3-carbons¨aure-Derivat und gehort ¨ ebenfalls zur Gruppe der Gyrase-Hemmstoffe. Es ist im Gegensatz zu Ciprofloxacin in Wasser schlecht loslich. ¨ Eine ausreichende Loslichkeit ¨ ist nur in Gegenwart schwacher S¨auren oder Laugen gegeben, womit der Einfluss von Losungsmitteln ¨ auf die Testung und Fluoreszenzemission gepruft ¨ werden konnte. • Ampicillin-Na gegen S. vestibularis: Dieses Penicillin-Derivat ist ein Hemmstoff der Zellwandsynthese. Es hemmt das Enzym Transpeptidase, welches die Aminozuckerketten in der Zellwand verknupft. ¨ Die Folge kann ein Anschwellen und Platzen der Zellen sein. Das Testverfahren konnte somit bei einem weiteren antibiotischen Wirkmechanismus angewandt werden. Ampicillin-Na ist sehr gut wasserloslich. ¨ Penicillin O R Ampicillin COO - N S H H O CH3 * CH3 H3N + H O Ofloxacin O COO N S N H H H F CH3 CH3 H3C COOH N N N O * CH3 ¨ Abbildung 4.54: Strukturen der Arzneistoffe, die zur Uberpr ufung ¨ der Eignung der FMR- und LIF-CEMethode eingesetzt wurden. Zur Bestimmung der antiinfektiven Wirksamkeit wurde Ofloxacin in 0.1 M NaOH und Ampicillin-Na in H2 O gelost. ¨ Tabelle 4.6 fasst alle bisher ermittelten ED50 und MICWerte aus der FMR-, LIF-CE-Methode und dem Mikrodilutionsverfahren und die verwendeten Losungsmittel ¨ zusammen. Die Bestimmung der ED50 -Werte wurde zweimal wiederholt. Die MIC-Werte wurden dagegen nur einmal gemessen und standen auch fur ¨ Ampicillin und Ofloxacin in Einklang zu berichteten Ergebnissen [102, 122]. Die antibiotische Wirkung von Ciprofloxacin auf P. fluorescens und Ampicillin und Vancomycin auf S. vestibularis fuhrte ¨ unter allen drei Testmethoden zu a¨ hnlichen Ergebnissen: W¨ahrend die ED50 -Werte des Ciprofloxacins den MIC-Wert sehr gut wiedergaben, zeigten beide ED50 -Werte des Ampicillin und bei Vancomycin der ED50 -Wert mittels 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 137 FMR-Methode eine Abweichung von einer 10er Potenz, was jedoch immer noch im Rahmen der ublichen ¨ Streuungen bei In-vitro-Testverfahren [175] liegt. Dagegen wurden bei Ofloxacin gegen P. fluorescens mit dem “BacLight viability kit” sowohl mit der FMR- als auch der LIF-CE-Methode irrefuhrende ¨ hohe ED50 -Konzentrationen erhalten. Ofloxacin Ciprofloxacin in 0.1 M NaOH in H2 O ED50 (FMR) >100 5.1±1.6 ED50 (LIF-CE) >100 1.9±1.0 MIC 3.0 3.0 Ampicillin-Na Vancomycin-HCl in H2 O in H2 O 5.8±1.6 2.4±0.7 9.5±1.5 0.2±0.07 0.7 0.7 Tabelle 4.6: Ergebnisse der antibiotischen Wirksamkeit von Ofloxacin, Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und Vancomycin-HCl. Bestimmt wurden die Ergebnisse mittels FMR, LIF-CE und Mikrodilutionsverfahren. Die Zahlenwerte sind in µM angegeben und beziehen sich auf die Salz-freie Arzneistoffform. Die Messungen mittels FMR und LIF-CE wurden zweimal wiederholt, w¨ahrend die MIC-Werte einmal bestimmt wurden. Ofloxacin und Ciprofloxacin wurden gegen P. fluorescens getestet. Ampicillin-Na und Vancomycin-HCl gegen S. vestibularis. Mehr Aufschluss uber ¨ das Versagen der fluorimetrischen Methoden am Beispiel Ofloxacin brachten die entsprechenden elektrophoretischen Fingerabdrucke ¨ bei 520 und 655 nm. In Abbildung 4.55 sind die Elektropherogramme von P. fluorescens nach Exposition mit unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen zusammen mit einer Positivkontrolle abgebildet. Fur ¨ niedrige Ofloxacin-Konzentrationen im Bereich 0.01 bis 0.1 µM, weisen die Elektropherogramme das charakteristische Lebend-Muster auf, d. h. ein großes Signal bei einer Migrationszeit von ca. 10 Minuten dominiert die Elektropherogramme bei 520 nm (Abbildung 4.55(A)) w¨ahrend die Peakmuster bei 655 nm eine verminderte Fluoreszenzintensit¨at aufweisen (Abbildung 4.55(B)). Mit ansteigender Ofloxacin-Konzentration nimmt die Fluoreszenzintensit¨at der Signale der Ketten bei 655 nm mehr und mehr zu (Abbildung 4.55(B)), gleichzeitig nimmt die Fluoreszenzemission des Einzel-Zell-Signals bei 520 nm immer mehr ab (Abbildung 4.55(A)) und das charakteristische Tot-Muster erscheint bei einer 10 µM Losung. ¨ Bei einer OfloxacinKonzentration von 100 µM verschwindet dieses Muster jedoch und nimmt eine vitale Populationscharakteristik an. Die Vermutung liegt nahe, dass dieser Effekt losungs¨ mittelbedingt ist. Wahrscheinlich kumuliert bei dieser Konzentration der zytotoxische Effekt des Antibiotikums mit dem der 1 %igen 0.1 M NaOH-Losung ¨ (durch den Einsatz 10 mM Antibiotika-Stammlosungen ¨ befindet sich bei der Testung nur 1 % des Losungs¨ mittels in der Bakterienkultur, siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) und verursacht das Lysieren der Bakterienzellen, wodurch ein falsches grun/rot-Verh¨ ¨ altnis ¨ beobachtet wird. Ahnliche Resultate ergaben sich auch bei Einsatz von DMSO als Losungsmittel. ¨ Die Hypothese der zytotoxischen Kumulation konnte durch die erneu- 138 4. Ergebnisse und Diskussion te Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit des Ciprofloxacins unter der Verwendung von 0.1 M NaOH und DMSO als Losungsmittel ¨ best¨atigt werden. Abbildung 4.55: Elektropherogramme von P. fluorescens (Fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid) bei unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen. Ofloxacin ist in der Stammlosung ¨ in 0.1 M NaOH gelost. ¨ Durch Verdunnung ¨ mit Medium befinden sich in den Zellinokula ledig1ich 1 % 0.1 M NaOH. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-System bei einer Emissionswellenl¨ange von (A) 520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. Fur ¨ CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung 4.46. 4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 139 4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick Die Fluoreszenzmarkierung Arzneistoff-exponierter Bakterienkulturen mit den beiden Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid ermoglicht ¨ eine schnelle, differenzierte Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit. Die beiden fluorimetrischen Methoden mittels FMR und LIF-CE konnen ¨ im Gegensatz zum konventionell, im HTS angewandten Mikrodilutionsverfahren nach DIN 58940-8 schnell zwischen zytotoxischer und zytostatischer Wirkung unterscheiden. Dennoch sind die fluorimetrischen Methoden eher zur Erg¨anzung als zur Substitution des Mikrodilutionsverfahrens geeignet. Zwar erfullt ¨ die LIF-CE-Methode die Voraussetzung der Miniaturisierung, doch erweisen sich Parallelisierung und Automatisierung, die Schlusselworte ¨ fur ¨ Verfahren mit hohem Durchsatz aufgrund einiger Waschschritte als schwierig. Das Potenzial der LIF-CE-Methode besteht darin, dass aus dem elektrophoretischen Profil einer Bakterienprobe aufgrund verschiedener Aggregate unterschiedlicher Große ¨ Ruckschl ¨ usse ¨ auf die Bakterienkonstitution unter Exposition eines Antibiotikums gezogen werden kann. Dies verhindert jedoch die simultane Analyse verschiedener Bakterien-Spezies. Dennoch eignet sich vor allem die LIF-CE-Methode aufgrund ihrer hohen Aussagekraft auch bezuglich ¨ der Erkennung von Losungsmittelinkompatibilit¨ ¨ aten als erg¨anzende Methode zum Mikrodilutionsverfahren im HTS und erlaubt eine differenzierte Aktivit¨atsbestimmung innerhalb von 30 Minuten. 4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays” • Die beiden neuen fluorimetrischen Zytotoxizit¨ats-Assays mittels FMR und LIFCE stellen eine gute Erg¨anzung zum konventionellen Mikrodilutionsverfahren dar und verhindern das zeitaufw¨andige Z¨ahlen koloniebildender Einheiten. • Die Korrelation der grun/rot-Fluoreszenzverh¨ ¨ altnisse mit dem prozentualen Anteil lebender Zellen erlaubt eine schnelle Erstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven und die Berechnung von ED50 -Werten. • Die neue LIF-CE-Methode gelang unter Verwendung einer “stacking front” durch Nachinjektion unmarkierter Zellen und l¨asst aus dem elektrophoretischen Profil einer Bakterienkultur Ruckschl ¨ usse ¨ auf die Zytotoxizit¨at einer Testsubstanz zu, wodurch ein neuer Ansatzpunkt fur ¨ Testverfahren offensteht. • Inkompatibilit¨aten zwischen Bakterien, Losungsmittel ¨ und Arzneistoff limitieren den Anwendungsbereich der beiden Methoden, konnen ¨ aber mittels LIF-CE erkannt werden. 140 4. Ergebnisse und Diskussion 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum ¨ Uberblick: Im Folgenden wird auf der Basis der magnetischen Kernresonanztomographie (magnetic resonance tomography, MRT) ein HighThroughput-Screening-Verfahren fur ¨ potenzielle Wirkstoffe gegen Bakterien entwickelt. Die transversale Relaxation T2 dient dabei als charakteristischer Parameter fur ¨ die Beschreibung des Zellwachs¨ tums, das durch wirksame Substanzen inhibiert wird. Anderungen dieses Parameters werden sowohl durch den Energie- und Aminos¨aurestoffwechsel der Erreger, als auch durch den Effekt von Wirk¨ stoffen hervorgerufen und basieren auf Anderungen im chemischen Austausch. Durch Kombination von MR-Spektroskopie (magnetic resonance spectroscopy, MRS) und -Bildgebung (magnetic resonance imaging, MRI) werden die T2 -Variationen quantifiziert und interpretiert, wodurch eine Quantifizierung der antibiotischen Wirksamkeit moglich ¨ wird. 4.4.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels NMR W¨ahrend der Proliferation von Mikroorganismen a¨ ndern sich sowohl die stoffliche Zusammensetzung als auch die chemischen und physikalischen Parameter der Zellkultur. Mit der NMR-Spektroskopie steht ein gut etabliertes Verfahren zur Analyse der Mediumzusammensetzung zur Verfugung. ¨ Durch N¨ahrstoffverzehr und Stoffwechselproduktion a¨ ndert sich dieses mit fortschreitendem Wachstum. Anhand hoch aufgeloster ¨ NMR-Spektren konnen ¨ metabolische Profile, sogenannter Fingerabdrucke ¨ (”fingerprints”) erstellt werden, wodurch eine chemotaxonomische Identifizierung ¨ und Charakterisierung von Bakterien moglich ¨ wird [120, 121]. Die Anderungen der chemischen und physikalischen Parameter wie Viskosit¨at, pH-Wert und Ionenst¨arke haben einen großen Einfluss auf den chemischen Austausch und spiegeln sich vor al¨ lem in Anderungen der NMR-Parameter wie Diffusion, Magnetisierungstransfer und Relaxationszeiten wider. Der Zusammenhang zwischen pH-Wert und Zellproliferation bildet unter Verwendung von pH-Indikatoren auch die Basis kolorimetrischer Zytotoxizit¨ats-Assays (Abschnitt 1.2.2), womit NMR-Parameter interessante Alternativen darstellen. 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 141 4.4.2 Chemischer Austausch Betrachtet man im Kulturmedium, welches in der Regel aus einer Protein-WasserMischung besteht, das Wassersignal, so kann es sich dabei um Protonen aus gebundenem Wasser, freiem Wasser oder um protonierte basische oder saure funktionelle Gruppen des Proteins wie -NH, -NH2 , -OH, -SH und COOH handeln [108]. In jedem Zustand unterscheiden sie sich bezuglich ¨ ihrer translatorischen Mobilit¨aten, ihrer Larmorfrequenzen und ihrer unterschiedlichen lokalen Relaxationsraten. Die theoretische Betrachtung der Fluktuation zwischen unterschiedlichen Zust¨anden wird ublicherweise ¨ als chemischer Austausch bezeichnet und basiert auf den erweiterten Bloch-Gleichungen von McConnell [172] (Abschnitt 3.5.2.2). Spektroskopisch kann der schnelle chemische Austausch als Linienverbreiterung des austauschenden Protons beobachtet werden [18]. Eine Temperatur- und pH-Abh¨angigkeit der Linienbreite aufgrund des chemischen Austausches wurde z. B. fur ¨ das Aminoproton + NH der Nucleins¨aure Cytosin beschrieben [171]. Bei einem komplexen N3 Spin-System, wie es bei Bakterienkulturen vorliegt, wird eine quantiN tative Auswertung spektroskopisch jedoch sehr schwierig. Die Bildge¨ bung ermoglicht ¨ dagegen Anderungen des chemischen Austausches N O w¨ahrend der Zellproliferation global mitzuverfolgen. Der DiffusionsH Abbildung 4.56: koeffizient, welcher mit einer pulsed-field-gradient-spin-echo-Sequenz (PGSE) gemessen werden kann, ist zwar ein moglicher ¨ Parameter, erCytosin fordert jedoch fur ¨ die Charakterisierung von Bakterienkulturen extrem starke Gradienten [209], die bei den meisten Gradientensystemen nicht verfugbar ¨ sind. In der Diplomarbeit von M. Oechsner [192] konnte am Teststamm E. coli gezeigt werden, dass sich in der Bildgebung der Parameter T2 zur Beschreibung des Zellwachstums von Bakterienkulturen am besten eignet. Er kann mittels Carr-Purcell-MeiboomGill(CPMG)-Sequenz [174] gemessen werden und zeigt im Vergleich zur longitudinalen Relaxation und dem Magnetisierungstransferkontrast die wachstumsbedingten ¨ Anderungen am ausgepr¨agtesten. Die transversale Relaxation unter dem chemischen Austausch beinhaltet zum einen die Fluktuation der Protonen selbst und zum anderen den innewohnenden Relaxationsprozess und ist in der Literatur solide beschrieben (Abschnitt 3.5.2.2). 4.4.3 Anwendungsbreite des Parameters T2 In der Diplomarbeit von M. Oechsner [192] konnte zwar die Eignung der transversalen Relaxation zur Beschreibung der Zellproliferation am Beispiel E. coli gezeigt werden, doch gab es keinen Hinweis darauf, inwieweit die Methode auf andere Bakterienarten anwendbar war. Aufschluss daruber ¨ sollten die charakteristischen T2 -Kurven der vier bereits kapillarelektrophoretisch analysierten und standardisierten Bakterienspe- 142 4. Ergebnisse und Diskussion zies S. vestibularis, P. fluorescens, M. luteus und N. cinerea geben. Die Messung erfolgte in vier 5 mm-NMR-Rohrchen, ¨ die zwei Milliliter der jeweiligen Zellsuspension enthielten. Die Zellen waren in Brain-Heart-Infusion(BHI)-Bouillon suspendiert und ihre Konzentration wurde bei allen Bakterienspezies auf einen OD600 -Wert von 0.015 eingestellt. Zur Erstellung der T2 -Kurven wurde die transversale Relaxation der vier Bakterienproben zusammen mit einer Negativkontrolle, die aus reinem Medium bestand, bei 30 ◦ C uber ¨ einen Zeitraum von 48 h mittels CPMG-pr¨aparierter MRT bei 17.6 T simultan gemessen. Dazu wurde im Abstand von 10 Minuten eine Bildserie aufgenommen und fur ¨ jede Probe aus dem exponentiellen Intensit¨atsabfall jedes Pixels der entsprechende T2 -Wert, gemittelt uber ¨ ein ROI (region of interest), berechnet. Die genauen Mess- und Ger¨ateparameter, die Probenpr¨aparation, die Auswertung der Bilder und die verwendeten und teilweise programmierten MATLAB-Routinen sind in Abschnitt 5.1.5.1, Abschnitt 5.1.7.2.6 und Anhang A und B n¨aher beschrieben. Wie aus den erweiterten Bloch-Gleichungen zu sehen ist , enthalten die gemessenen T2 -Werte in gewissem Maße eine Diffusionswichtung. Da jedoch die experimentellen Parameter w¨ahrend der Messserien unver¨andert blieben, wurde der Einfluss der Diffusion als konstant angenommen und T2 als gemessenes T2 definiert. Vergleicht man die gemessenen T2 -Kurven in Abbildung 4.57, so weist die T2 -Kurve von S. vestibularis w¨ahrend ¨ des Zellwachstums mit 40 ms eine besonders starke T2 -Anderung auf. Abgesehen von einem kleinen T2 -Anstieg von 85 ms auf 92 ms in der ersten Messstunde, f¨allt die Kurve innerhalb der ersten funf ¨ Stunden auf einen Wert von 75 ms ab, um anschließend bis auf einen Wert von ca. 115 ms steil anzusteigen und dort in einem Plateau zu enden. Der anf¨angliche T2 -Anstieg wird auch von der Negativkontrolle durchlaufen und wird durch eine verzogerte ¨ Temperierung des Messsystems (Messtemperatur ist 30 ◦ C) hervorgerufen. Der ansonsten konstante T2 -Wert der Negativkontrolle ist ein Indiz dafur, ¨ dass a¨ ußere Storfaktoren ¨ w¨ahrend der Messung wie z. B. Temperaturschwankungen ¨ ausgeschlossen werden konnen. ¨ Die starke T2 -Anderung spricht somit fur ¨ ein schnelles und intensives Zellwachstum der Streptococcus-Spezies. Bei P. fluorescens und N. cinerea dagegen sind die T2 -Kurven zum einen zeitlich verzogert ¨ und zum anderen be¨ tr¨agt die gesamte T2 -Anderung weniger als 5 ms, woraus auf ein verzogertes ¨ und gehemmtes Wachstum geschlossen werden kann. Die M. luteus-Kurve verl¨auft w¨ahrend ¨ der gesamten Messzeit parallel zur Kontroll-Kurve und zeigt keinerlei Anderungen. Visuelle Untersuchungen der Proben nach der Messung best¨atigten diese Ergebnisse: W¨ahrend die S. vestibularis-Probe einen starken weißen Zellniederschlag zeigte, konnte bei den beiden Bakterienspezies P. fluorescens und N. cinerea lediglich eine leichte Trubung ¨ des Mediums festgestellt werden. Bei der M. luteus-Probe blieb dagegen das Kulturmedium klar, ohne sichtbare Kolloidpartikel. Offensichtlich fand hier in der Messapparatur innerhalb der 48 h keine Zellproliferation statt. Maßgeblich fur ¨ die unterschiedlichen T2 -Kurven der vier verschiedenen Bakterienspezies waren in diesem 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 143 Experiment vor allem ihre spezifischen Wachstumsvoraussetzungen. W¨ahrend P. fluorescens, M. luteus und N. cinerea der Gruppe der strengen Aerobier angehort, ¨ ist ein fakultativ anaerobes Wachstum bei S. vestibularis moglich. ¨ Ihre Kultivierung zeigte sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen ein schnelles intensives Wachstum. Eine Abh¨angigkeit der Zellproliferation von der Gef¨aßgeometrie ist daher nicht gegeben. Die Ursache fur ¨ die verzogerte ¨ bzw. gehemmte Zellproliferation des Pseudomonas-, Neisserien- und Micrococcus-Stammes liegt dagegen vermutlich im zu geringen Sauerstoffgehalt w¨ahrend der Kultivierung in den schmalen 5 mm-NMRRohrchen ¨ begrundet, ¨ so dass die Methode unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur auf Anaerobier anwendbar ist. 93 110 92 105 91 100 90 T2 [ms] 94 115 T2 [ms] 120 95 89 90 88 85 87 80 86 P.fluorescens S. vestibularis 75 70 85 Medium 0 500 1000 1500 2000 2500 84 3000 Medium 0 500 1000 t [min] 1500 2000 2500 3000 t [min] (a) Streptococcus vestibularis (b) Pseudomonas fluorescens 96 94 93 94 92 91 92 T2 [ms] T2 [ms] 90 90 89 88 88 87 86 86 M.luteus N.cinerea 85 Medium Medium 84 0 500 1000 1500 2000 t [min] (c) Micrococcus luteus 2500 3000 84 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 t [min] (d) Neisseria cinerea Abbildung 4.57: T2 -Kurven verschiedener Bakterienspezies w¨ahrend ihrer Zellproliferation in BHIMedium bei 30 ◦ C, gemessen bei 17.6 T Ein Vergleich der unter identischen Versuchsbedingungen (30 ◦ C, BHI-Medium, 17.6 T) aufgenommenen T2 -Wachstumskurven von S. vestibularis und E. coli zeigt bei Anaero- 144 4. Ergebnisse und Diskussion biern eine Bakterienspezifizit¨at. Damit besteht die Moglichkeit ¨ T2 -Kurven zur Erstellung mikrobieller Fußabdrucke ¨ (”footprints”) zu nutzen. 100 95 T2 [ms] 90 85 80 Abbildung 4.58: T2 -Wachstumskurve von E. coli in BHI-Medium bei 30 ◦ C und 17.6 T 75 E.coli Medium 70 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 t [min] 4.4.4 Analyse der Zellproliferation von S. vestibularis Von den analysierten Bakterienspezies eignete sich S. vestibularis am besten zur Untersuchung der Korrelation zwischen transversaler Relaxation und Zellwachstum und damit zur Untersuchung des physikalischen Hintergrundes. Zur Quantifizierung und ¨ Interpretation der Anderung des Parameters T2 mit zunehmender Zellzahl wurden NMR-Bildgebung und -Spektroskopie miteinander kombiniert und von einem Satz von Bakterienproben neben der transversalen Relaxation • der pH-Wert (sensitiver Parameter zur Beschreibung der Stoffwechselaktivit¨at), • die optische Dichte bei 600 nm, OD600 (Charakteristikum fur ¨ die Zellzahl), und • 1 H-NMR-Spektren zu unterschiedlichen Inkubationszeiten uber ¨ einen Zeitraum von 12 h gemessen. Da¨ durch war es moglich, ¨ stoffwechselbedingte Anderungen der Metaboliten-, Aminos¨aure- und Proteinkonzentration im extrazellul¨aren Kulturmedium zeitlich mitzuverfolgen. Die Bildgebungsexperimente wurden bei 17.6 T durchgefuhrt, ¨ die Protonenspektren bei 9.4 T aufgezeichnet. 4.4.4.1 Korrelation zwischen T2 , Zellzahl und pH Der Probensatz bestand aus sechs 5 mm-NMR-Rohrchen, ¨ die mit 2 ml Zellsuspension des Streptococcus-Stammes mit einer Anfangskonzentration von 0.015 OD600 gefullt ¨ 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum Abbildung 4.59: Zeitlicher Verlauf der gemessenen T2 -Werte von sechs identischen Inokula der Bakterienspezies S. vestibularis und einer Negativkontrolle. Gemessen wurde in BHIMedium im Abstand von 10 Minuten bei 30 ◦ C und 17.6 T. Die Bakterienproben wurden nacheinander zu unterschiedlichen Inkubationszeiten zur weiteren Messung der optischen Dichte und des pH-Wertes aus dem Magneten herausgenommen. Zu diesen Zeitpunkten fallen die T2 Kurven auf Null ab. 180 medium tube 1 tube 2 tube 3 tube 4 tube 5 tube 6 160 120 2 T [ms] 140 100 80 60 100 200 300 400 500 600 700 1 pH OD600 t [min] OD600 pH 0.9 145 7.5 0.8 0.7 7 0.6 6.5 0.5 0.4 6 0.3 0.2 5.5 0.1 0 100 200 300 400 500 600 700 t [min] 5 Abbildung 4.60: OD600 - und pH-Werte der StreptococcusSuspensionen, unmittelbar nach der Probenentnahme aus dem Magneten. waren. Ein siebtes, welches ausschließlich Medium enthielt, diente als Negativkon¨ trolle, und sollte w¨ahrend der gesamten Messzeit keine T2 -Anderungen aufweisen. Der zeitliche T2 -Verlauf der jeweiligen Proben ist in Abbildung 4.59 dargestellt. Zu unterschiedlichen Wachstumsstadien der Bakterienkultur wurde die Akquisition gestoppt und zu jedem dieser Zeitpunkte der OD600 - und pH-Wert einer Bakterienprobe gemessen. Diese Zeitpunkte sind durch auf Null abfallende Linien in Abbildung 4.59 markiert. Die Durchfuhrung ¨ der OD600 - und pH-Messungen erforderte die Herausnahme der Proben aus dem Magneten, wodurch es zu unvermeidbaren Temperaturschwankungen kam. Diese verursachten die im T2 -Verlauf der Bakterienproben beobachtbaren lokalen Minima zu den Zeitpunkten des Akquisitionsstopps. Die identischen Minima traten auch in der Negativkontrolle auf, weshalb ein Sedimentationsprozess der Bakterienkulturen als Ursache ausgeschlossen werden kann. Die OD-pH-Bestimmung erfolgte zus¨atzlich zu Beginn und am Ende der tomographischen 146 4. Ergebnisse und Diskussion Messung. Insgesamt wurde der OD und pH-Wert 1.8 h, 3.1 h, 4.3 h, 5.5 h, 6.7 h, 8.1 h und 11.6 h nach Herstellung der Inokula gemessen und in einem Diagramm in Abbildung 4.60 aufgetragen. Mit zunehmender Zellzahl, d. h. mit steigendem OD-Wert f¨allt der pH stetig und stagniert in der station¨aren Phase des Bakterienwachstums. Die T2 -Kurve steigt, wie bereits in Abschnitt 4.4.3 beschrieben, nach initialem Abfall steil an und endet ebenfalls in einem Plateau in der station¨aren Phase. Die Stagnation der OD-, pH und T2 -Werte beginnt nahezu zum gleichen Zeitpunkt und indiziert die Einstellung der Bakterienproliferation. 4.4.4.2 Komponenten im BHI-Medium Der erste Schritt zur Aufkl¨arung der physikalischen Zusammenh¨ange bestand in der Identifizierung maßgeblicher Komponenten im BHI-Vollmedium. Dieses Vollmedium besitzt eine komplexe Zusammensetzung und besteht unter anderem aus Kalbs-Hirnund Rinder-Herz-Extrakt und Pepton (Abschnitt 5.1.7.2.2). Die Komponenten-Analyse erfolgte anhand eines 1D-1 H-Spektrums und 2D-COSY-Diagramms, welche bei 9.4 T gemessen wurden (Abbildung 4.61). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.7 zusammengefasst und ergeben sich in Anlehnung an die Arbeiten von Govindaraju [109], Lindon [160] und Evans [89]. Im COSY- und 1D-Spektrum sind die identifizierten Substanzen nummeriert aufgefuhrt. ¨ Neben zahlreichen Aminos¨auren und Kohlenhydraten konnten die funf ¨ Hauptmetabolite des anaeroben Stoffwechsels Acetat, Ethanol, Formiat, Laktat und Succinat zugeordnet werden. Struktur Funktionelle Gruppe 1 6 CH2OH O 4 4 HO HO 2 5 1 OH 3 2 OH α-Glukose 6 4 4 CH2OH O HO HO 5 3 2 2 OH β-Glukose CH CH 3 CH 4 CH 5 CH 6 CH 1 CH 2 CH 3 CH 4 CH 5 CH 6 CH 2 OH 1 chem. Versch. (ppm) in H2 O + 10 % D2 O 5.2 3.5 3.7 3.4 3.8 nicht aufgelost ¨ 4.6 3.2 nicht aufgelost ¨ nicht aufgelost ¨ 3.4 3.8 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 1 2 - OOC CH3 2 CH3 147 1.8 Acetat 3 1 2 - OOC CH CH3 NH3+ 2 3 CH CH3 3.7 1.4 Alanin + NH2 C N CH2 H 4 3 CH2 2 CH - OOC NH+ 3 2 NH2 5 CH2 1 CH CH2 4 CH2 5 CH2 4.1 1.8 1.6 3.1 2 CH CH2 3.8 2.6 CH2 CH3 3.6 1.1 3 Arginin 1 2 4 3 - OOC CH CH2 COO NH3+ 3 Aspartat 1 2 1 HO CH2 CH3 2 Ethanol 1 - OOC H 1 CH 8.4 CH CH2 4 CH2 3.8 2.1 nicht aufgelost ¨ Formiat 4 1 2 3 - OOC CH CH2 CH2 NH3+ Glutamat 1 2 3 - OOC CH CH3 NH3+ Laktat 5 COO - 2 3 2 3 CH CH3 4.0 1.3 148 4. Ergebnisse und Diskussion NH3+ 6 CH2 5 4 CH2 2 1 - OOC 4.1 1.8 nicht aufgelost ¨ 1.6 2.9 a 3.9 3.2 7.2, nicht aufgelost ¨ 7.3, nicht aufgelost ¨ CH 3 CH2 4 CH2 5 CH2 6 CH2 CH2 CH2 3 2 CH NH3+ Lysin a 2 3 6 5 CH b CH2 2 4 CH, CH, 6 CH 3 CH, 5 CH b - OOC CH 1 CH2 NH3+ 4 Phenylalanin 1 2 - OOC CH 2 3 4 COO - CH2 2 CH2 , 3 CH2 2.3 Succinat 1 2 - OOC CH 2 4 3 CH CH3 NH3+ OH Threonin 3 2 a b - OOC CH CH 2 NH3+ CH CH 4 CH3 3.5 4.2 1.2 a 3.9 3.1 7.2 6.8 3 4 1 OH 5 6 Tyrosin CH CH2 2 CH, 6 CH 3 CH, 5 CH b a CH CH2 4 CH 5 CH 6 CH 7 CH 2 CH,3 CH b a b - OOC CH CH2 NH3+ 4 3 2 5 6 1 N H 7 Tryptophan 4 1 2 - OOC CH 3 CH NH3+ CH3 CH3 4' 3.9 3.4, 3.2 7.7 7.1 7.2 7.5 nicht aufgelost ¨ 2 CH CH ′ 4 CH, 4 CH 3 Valin Tabelle 4.7: Identifizierte Komponenten im BHI-Medium. 3.5 2.2 1.0 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 149 Abbildung 4.61: COSY-Diagramm des BHI-Kulturmediums, gemessen bei 9.4 T und 300 K. An der xund y-Achse sind die 1D-1 H-Spektren der gleichen Probe abgebildet. α-Glukose: 1 (1 CH-2 CH), 2 (4 CH5 CH), 3 (3 CH-4 CH); β-Glukose: 4 (1 CH-2 CH), 5 (5 CH-6 CH); Acetat: 25 (2 CH3 ); Alanin: 6 (2 CH-3 CH3 ); Arginin: 7 (2 CH-3 CH2 ), 8 (4 CH2 -5 CH2 ); Aspartat: 9 (2 CH-3 CH2 ); Ethanol: 10 (1 CH2 -2 CH3 ); Formiat: 23 (1 CH); Glutamat: 11 (2 CH-3 CH2 ); Laktat: 12 (2 CH-3 CH3 ); Lysin: 13 (2 CH-3 CH2 ) , 14 (5 CH2 -6 CH2 ); Phenylalanin: 15 (α CH-β CH2 ); Succinat: 24 (2 CH2 und 3 CH2 ); Threonin: 16 (3 CH-4 CH3 ), 17 (2 CH-3 CH); Tryptophan: 18 (α CH-β CH2 ), 19 (α CH-β CH2 ); Tyrosin: 20 (α CH-β CH2 ); Valin: 21 (3 CH-4 CH) und (3 CH4′ CH), 22 (2 CH-3 CH). 150 4. Ergebnisse und Diskussion 4.4.4.3 Metabolite Im zweiten Schritt wurden die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Wachstumskurve (1.8 h, 3.1 h, 4.3 h, 5.5 h, 6.7 h, 8.1 h und 11.6 h nach Herstellung der Inokula) aufgenommenen 1D-Protonenspektren miteinander verglichen und semiquantitativ ausgewertet, d. h. die Protonensignale wurden auf die gleiche y-Achse skaliert, jedoch nicht auf einen internen Standard bezogen. Eine Analyse zeigte vor allem Konzentrations¨anderungen der funf ¨ Hauptmetabolite fur ¨ Anaerobier. Ihre Protonensignale sind in Abh¨angigkeit des Kulturstadiums zusammen mit den gemessenen pH-Werten in Abbildung 4.62 dargestellt. Lediglich Ethanol lag in zu geringer Konzentration und teilweise durch andere Resonanzen uberlagert ¨ vor, so dass eine ubersichtliche ¨ Abbildung nicht moglich ¨ war. Abbildung 4.62: Wasserstoff-Resonanzlinien der vier Hauptmetaboliten zu unterschiedlichen Zeiten der Wachstumskurve von S. vestibularis und der sich dazu entwickelnde pH-Wert im extrazellul¨aren Medium. Die Resonanzlinien von Formiat, Acetat und Laktat zeigen ab einer Inkubationszeit von ca. 5 h einen starken Intensit¨atsanstieg. Die Succinat-Konzentration hingegen steigt in den ersten Stunden des Zellwachstums kontinuierlich an, um dann nach einer Inkubationszeit von 5 h wieder abzufallen. Die Ursache liegt moglicherweise ¨ im 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 151 Umbau der Bernsteins¨aure zur Propions¨aure begrundet. ¨ Die zunehmende Produktion an Metaboliten w¨ahrend der Zellproliferation bewirkt aufgrund ihrer sauren Carboxylfunktionen (Ameisens¨aure: pks =3.7, Essigs¨aure: pks =4.7, Bernsteins¨aure: pks =4.7 und 5.6, Milchs¨aure: pks =3.9) eine Konzentrationserhohung ¨ an H+ -Ionen im Medi¨ um. Wird ihre Konzentration zu hoch, kommt es zum Uberschreiten der Pufferkapazit¨at des Phosphatpuffers in der BHI-Bouillon und folglich zu dem beobachteten pH-Abfall w¨ahrend des Bakterienwachstums. Die zunehmende Protonenkonzentration wirkt sich auch auf die chemische Verschiebung der Resonanzsignale aus. Ihre Ur¨ sache liegt in der Anderung der Protonierungs- zu Deprotonierungsverh¨altnisse und ¨ in der damit verbundenen Anderung der Abschirmung der betrachteten Wasserstoffkerne. Besonders deutlich wird dieser Effekt fur ¨ die CH3 -Resonanz des Acetats (hier a¨ ndert sich die chemische Verschiebung von 1.84 ppm auf 1.92 ppm). ¨ 4.4.4.4 Quantitative Beitr¨age zur T2 -Anderung w¨ahrend der Zellproliferation Die T2 -Kurven von S. vestibularis in Abbildung 4.59 repr¨asentieren das Mittel aller ¨ Anderungen in der Zellkultur, die w¨ahrend der Zellproliferation stattfinden. Anhand von Referenz-Modellen werden nachfolgend die einzelnen Beitr¨age aus N¨ahrstoffverzehr, Zellzunahme, Metabolitenkonzentration und pH-Abfall quantitativ analysiert und diskutiert. 4.4.4.4.1 N¨ahrstoffverbrauch im Medium Im Medium dienen haupts¨achlich Aminos¨auren und Kohlenhydrate als C-und NQuellen fur ¨ den Bakterienstoffwechsel (Abschnitt 3.2.1.2). Wie in Abschnitt 4.4.4.2 gezeigt, konnten neben der α- und β-Glukose die meisten Aminos¨auren im ppm-Bereich zwischen 4 und 2.5 ppm, der charakteristisch fur ¨ das Cα H-Atom ist, gefunden werden. Eine Quantifizierung dieses ppm-Bereiches stellt somit eine gute N¨aherung bezuglich ¨ des Gehaltes aller austauschbaren funktionellen Gruppen (-NH, -NH2 , -OH, -SH und -COOH) in den verschiedenen Aminos¨aureresten dar. Ferner sind in diesem Bereich die Kohlenhydrate enthalten, welche zusammen mit den Proteinen den wesentlichen Anteil des gebundenen Wassers bestimmen und somit Einfluss auf die transversale Relaxation nehmen konnen. ¨ Zur Quantifizierung des maßgeblichen ppm-Bereiches wurden 1 H-Spektren der Streptococcus-Suspension zum Zeitpunkt t=0 h nach Herstellung des Inokulums und nach einer Inkubationszeit von 12 h aufgenommen (Abbildung 4.63). Die Inkubation fand wie bei allen NMR-Experimenten bei 30 ◦ C in 5 mm-NMR-Rohrchen ¨ statt. Beiden Proben wurde Maleins¨aure als interner Standard in einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt und die Fl¨ache unter der Kurve des Maleins¨auresignals auf eins normiert. Die quantitative Auswertung der NMR-Spektren ergab im ppm-Bereich zwischen 4.0 152 4. Ergebnisse und Diskussion bis 2.5 aufgrund des N¨ahrstoffverzehrs w¨ahrend der Zellproliferation eine Gehaltsabnahme von 18 % (Abbildung 4.64a). Abbildung 4.63: 1 H-Spektren einer Zellsuspension von S. vestibularis zu den Zeitpunkten (a) t=0 h und (b) t=12 h der Wachstumskurve. (M = Maleins¨aure, interner Standard in einer Konzentration von 1 mg/ml; L = Laktat; S = Succinat; A = Acetat; F = Formiat; E = Ethanol). Zur Quantifizierung der Spektren wurde das Maleins¨auresignal auf eins normiert. Um ihre Auswirkung auf die transversale Relaxation absch¨atzen zu konnen, ¨ wurde ◦ in Abbildung 4.64b das BHI-Medium bei 17.6 T und 30 C kalibriert, indem T2 mit verschiedenen BHI-Konzentrationen korreliert wurde. Die hochste ¨ eingesetzte Konzentration entsprach mit 0.185 g/5 ml, der zur Kultivierung eingesetzten Mediumkonzentration. In Abbildung 4.64b zeigen sich die beiden Parameter abgesehen vom hochsten ¨ und niedrigsten Wert linear zueinander. Mit abnehmender Mediumkonzentration steigt T2 an. Aufgrund des komplexen multifunktionalen Systems wurde eine mathematische Beschreibung des Zusammenhanges nicht versucht und die Daten fur ¨ die Bestimmung der Auswirkung des N¨ahrstoffverzehrs direkt aus dem Diagramm in Abbildung 4.64b abgelesen. Unter der Annahme, dass die Abnahme der Aminos¨aureund Kohlenhydrat-Konzentration durch den N¨ahrstoffverzehr w¨ahrend der Zellproli- 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 153 feration einer Verdunnung ¨ des Mediums um 18 % entspricht, verursacht die Konzentrationsabnahme somit einen T2 -Anstieg von 15 ms. 135 130 125 120 T2 [ms] 115 110 105 100 95 90 85 0.11 0.12 0.13 0.14 0.15 0.16 0.17 0.18 0.19 Concentration [g/5ml] (a) (b) Abbildung 4.64: Auswirkung des N¨ahrstoffverbrauches auf T2 w¨ahrend der Zellproliferation. (a) Ausschnitt der Spektren aus Abbildung 4.63 zur anschaulichen Darstellung des N¨ahrstoffverbrauches im ppm-Bereich 4 bis 2.5. (b) T2 -Relaxation in Abh¨angigkeit der BHI-Konzentration, gemessen bei 17.6 T und 30 ◦ C. 4.4.4.4.2 pH-Einfluss durch Bakterienmetabolismus Der pH-Wert einer Losung ¨ hat vor allem bei Molekulen ¨ mit ionisierbarer und austauschbarer funktioneller Gruppe, und damit auch bei zahlreichen Aminos¨auren, eine große Wirkung auf die transversale Relaxation. Ver¨andert sich der pH, so a¨ ndert sich das Verh¨altnis zwischen protoniertem und deprotoniertem Zustand und damit die chemische Austauschrate. Theoretisch beschreibt die Luz-Meiboom-Gleichung fur ¨ ein Zwei-Spin-System mit schnellem chemischen Austausch die Relaxationsrate in Abh¨angigkeit der 180◦ -Puls-Rate in der CPMG-Sequenz [163] (Abschnitt 3.5.2.2): X 2 kb τ 1 1− tanh Pi δωi2 (4.3) R2 (τ ) = R2 (0) + kb kb τ 2 mit τ , der zeitlichen Verzogerung ¨ zwischen dem 90◦ und dem 180◦ Puls, R2 (0) der transversalen Relaxationsrate in Abwesenheit von Austausch, kb der chemischen Austauschrate, Pi der Protonenfraktion in der chemischen Umgebung i und δωi , der Differenz der chemischen Verschiebung zwischen den austauschenden Spin-Spezies in Einheit der Frequenz. Pi kann hier direkt aus der Henderson-Hasselbalch-Gleichung ¨ berechnet und damit der pH miteinbezogen werden. In Ubereinstimmung mit theoretischen Berechnungen konnte die starke pH-Abh¨angigkeit der Austauschrate kb fur ¨ Abbildung 4.65: pH-Abh¨angigkeit der T2 Relaxation des BHI Mediums bei einer Konzentration von 0.185 g/5ml, gemessen bei 30 ◦ C und 17.6 T. Die T2 -Kurve beschreibt die chemische Austauschrate eines NSpin-Systems. Die gemessenen Daten wurden zu Anschauungszwecken an ein Polynom vierter Ordnung angepasst. Die Kurve repr¨asentiert kein physikalisches Modell. 4. Ergebnisse und Diskussion T2 [ms] 154 110 100 90 80 70 5 5.5 6 6.5 7 7.5 pH die Aminos¨auren L-Glycin, L-Arginin und L-Tryptophan experimentell gezeigt werden [146]. Die Luz-Meiboom-Gleichung gilt fur ¨ einen weiten Bereich und ist auch ¨ fur ¨ die Beschreibung der T2 -Anderungen w¨ahrend der Bakterienproliferation geeignet. Das BHI-Medium besteht jedoch, wie in Abschnitt 4.4.4.2 identifiziert, aus einem Gemisch vieler freier und zu Peptiden verknupfter ¨ Aminos¨auren und seine Komple¨ xit¨at verhindert eine Vorhersage der pH-abh¨angigen Anderung der chemischen Austauschrate nach der Luz-Meiboom-Gleichung. In einem Referenz-Modell (Abbildung 4.65) wurde die transversale Relaxation der Protein-Wasser-Mischung (0.185 g BHI/5 ml) bei 30 ◦ C und 17.6 T fur ¨ unterschiedliche pH-Werte gemessen. Die pH-Werte wurden mit 1 molarer NaOH und HCl eingestellt, so dass durch die Einstellung an sich kein Verdunnungseffekt ¨ auftrat. Der T2 -Verlauf zeigt ein breites Minimum bei einem pH von 6.25. Bei diesem pH-Wert ist die chemische Austauschrate kb maximal. Korrekterweise musste ¨ der chemische Austausch solch einer komplexen Mischung durch ein N-Spin-Modell beschrieben werden. Dies ist praktisch jedoch nicht durchfuhrbar. ¨ Aufgrund des gut definierten Minimums in Abbildung 4.65 wurde angenommen, dass der chemische Austausch dieses Systems n¨aherungsweise mit einer durchschnittlichen Austauschrate k¯b fur ¨ einen zweiseitigen Austausch zweier repr¨asentativer Spin-Spezies beschrieben werden kann. Insgesamt wurde im pH-Bereich zwischen 5.0 und 7.5 ein T2 -Unterschied von 40 ms bewirkt. 4.4.4.4.3 Effekt der Zellzunahme Der von einer Bakterienkultur experimentell ermittelte T2 -Wert setzt sich aus intraund extrazellul¨aren Beitr¨agen zusammen. Maßgeblich ist dabei das relative Volumen, welches von beiden Komponenten besetzt wird. Berechnet man die Volumenfraktion fur ¨ Bakterien, die in einer Zellsuspension mit einem OD600 -Wert < 1 eingenommen wird, kommt man unter Annahme eines Bakterienradius von 0.5 µm auf einen Wert von unter 10−5 . Ein OD-Wert von 1 ist in diesem Beispiel repr¨asentativ fur ¨ verschie- 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 155 dene Bakterienkulturen und wird h¨aufig in der station¨aren Phase erreicht. Das Ergebnis rechtfertigt somit in erster N¨aherung die Vernachl¨assigung des Einflusses zellbe¨ dingter Anderungen der Bakterienkultur auf den beobachteten T2 -Verlauf w¨ahrend der Zellproliferation. 4.4.4.4.4 Metabolitenkonzentrationen In Abschnitt 4.4.4.3 konnte bereits gezeigt werden, dass w¨ahrend der Zellproliferation von S. vestibularis haupts¨achlich die Metaboliten Acetat, Formiat, Succinat und Laktat in das extrazellul¨are Medium freigesetzt werden und damit seine Zusammensetzung a¨ ndern. Zur Bestimmung der Zunahme der Metabolitenkonzentration wurden nun die entsprechenden Protonensignale der Kultur-Spektren in Abbildung 4.63 zu den Zeitpunkten t=0 und t=12 h integriert. Die Ergebnisse wurden relativ zur Maleins¨aureresonanz berechnet und sind in Tabelle 4.8 zusammengefasst. Innerhalb von 12 h zeigte sich fur ¨ Formiat eine Zunahme um den Faktor 4.3, fur ¨ Acetat um 3.2 und fur ¨ Laktat um den Faktor 7. Laktat ist somit im Stoffwechsel der dominante Metabolit. Ethanol lag zur quantitativen Auswertung in zu geringer Konzentration vor. Pro Molekul ¨ Maleat werden zwei Protonen erfasst (Struktur − OOC-CH=CH-COO− ). Bei einem Molekulargewicht von 116.1 g/mol und einer Konzentration von 1 mg/ml ist eine Stoffmenge von 8.61 mmol in einem Liter Medium enthalten. Unter Einbeziehung der Avogadro-Konstante (NA =6.022 x 1023 Teilchen pro mol) beinhaltet die Signalfl¨ache 1.04 x 1022 Wasserstoffkerne/l. Fur ¨ die Metabolite errechnen sich daraus die folgenden Endkonzentrationen: • Formiat (Mr=46.03 g/mol, 1 H pro Molekul): ¨ 0.41 mg/ml • Acetat (Mr=60.05 g/mol, 3 H pro Molekul): ¨ 0.83 mg/ml • Succinat (Mr=118.1 g/mol, 4 H pro Molekul): ¨ 0.47 mg/ml • Laktat (Mr=90.08 g/mol, 3 H pro Molekul): ¨ 0.93 mg/ml Alle quantifizierbaren Metabolite liegen in einer Konzentration von weniger als 1 mg pro ml vor. Berucksichtigt ¨ man, dass das Medium zu Beginn des Bakterienwachstums in einer Konzentration von 0.037 g/ml eingesetzt wird, liegen die Metabolitenkonzentrationen um einen Faktor 50 bis 100 niedriger vor. Der Beitrag der Metaboliten zur ¨ Anderung von T2 kann somit in guter N¨aherung vernachl¨assigt werden. Die mogliche ¨ Untersch¨atzung der Metabolitenkonzentrationen aufgrund unvollst¨andiger longitudinaler Relaxation bei der Messung wurde mittels Ernst-Gleichung abgesch¨atzt: − TR M0 1 − e T1 sinα (4.4) s(0) ∝ − TTR 1 1−e cosα 156 4. Ergebnisse und Diskussion Unter der Annahme einer maximalen Relaxationszeit von 3 s und Einbeziehung des bei der Messung verwendeten Relaxationsdelays von 2 s berechnet sich der Fehler im Metabolitengehalt zu 22 %, womit die N¨ahrstoffkonzentration immer noch mindestens um einen Faktor 39 hoher ¨ liegt. Metabolit Gehalt* (t = 0h) Gehalt* (t = 12h) Formiat Acetat Succinat 0.12 0.74 1.37 Dublett 0.25 0.24 Quartett nicht detektierbar 0.52 2.40 0.92 Dublett 1.78 1.70 Quartett 0.24 0.37 0.34 0.18 Laktat Tabelle 4.8: Quantifizierung der Metaboliten zu den Zeitpunkten t=0 h und t=12 h der Wachstumskurve von S. vestibularis. *Der Gehalt wurde durch Integration der Spektren in Abbildung 4.63 bestimmt und ist als Fl¨ache unter der Kurve relativ zum Maleins¨auresignal (interner Standard, 1 mg/ml) angegeben. 4.4.4.4.5 Maßgebende Einflussfaktoren In den letzten Abschnitten konnte der N¨ahrstoffverzehr und die Beeinflussung der chemischen Austauschrate durch den pH-Wert als Hauptursachen fur ¨ die beobach¨ teten Anderungen der transversalen Relaxation w¨ahrend der Zellproliferation identifiziert werden. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden zu den gemessenen pHWerten in Abbildung 4.60 die entsprechenden T2 -Werte aus Abbildung 4.65 abgelesen und zusammen mit der gemessenen T2 -Kurve aus Abbildung 4.59 in einem Diagramm aufgetragen (Abbildung 4.66). In den ersten 5 h bis zum Erreichen des globalen T2 -Minimums von 70 ms sind die aus der pH-Kalibrierung des Mediums errechnete und gemessene T2 -Kurve nahezu deckungsgleich. In dieser Zeitspanne erhohte ¨ sich die Metabolitenkonzentrationen von Formiat, Acetat, Succinat und Laktat nur schleichend und bewirkten lediglich eine pH-Absenkung um ca. 0.5 Einheiten (Abbildung 4.62). Betrachtet man die Wachstumskurve in Abbildung 4.60, so ist in diesem Stadium mit einem OD600 von 0.416 die H¨alfte des maximalen Zellwachstums erreicht und die Bakterienpopulation befindet sich mitten in der exponentiellen Phase. Durch die exponentielle Zellproliferation setzt ab einer Inkubationszeit von 5 h beschleunigte Me- T2 [ms] 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 157 130 gemessene T -Kurve 2 120 berechnet aus pH-T -BHI-Kurve 2 110 100 90 80 70 60 100 200 300 400 500 600 700 t [min] Abbildung 4.66: Gegenuber¨ stellung der gemessenen und den aus der pH-Kalibrierung (Abbildung 4.65) berechneten T2 -Werten. Zu Anschauungszwecken sind die einzelnen Datenpunkte mit einer SplineKurve interpoliert. Die Kurven stellen kein physikalisches Modell dar. tabolitenproduktion von Formiat, Acetat und Laktat ein. Der pH-Wert f¨allt rapide auf 5.16 ab und die T2 -Kurven in Abbildung 4.66 driften zunehmend auseinander. Der maximale T2 -Unterschied wird in der station¨aren Phase bei 11.6 h erreicht und betr¨agt 20 ms. Dieses Ergebnis entspricht etwa der zu 15 ms berechneten Wirkung des N¨ahrstoffverbrauchs durch die mikrobielle Stoffwechselaktivit¨at. Zusammengefasst l¨asst sich sagen, dass die erste H¨alfte der T2 -Wachstumskurve nahezu ausschließlich durch den ¨ pH-Wert bestimmt wird, w¨ahrend sich in der zweiten H¨alfte die Effekte aus pH-Anderung und N¨ahrstoffverbrauch uberlagern. ¨ 4.4.5 T2 als Maß fur ¨ die antibiotische Wirksamkeit 4.4.5.1 Auswahl des Testsystems In “whole-cell-bioassays” (Abschnitt 1.2.2) erfolgt die Toxizit¨atsbestimmung einer Testsubstanz ublicherweise ¨ uber ¨ ihre Auswirkung auf die Zellproliferation und mittels optischer Detektion. In der Regel wird die hemmende Wirkung der Testsubstanz als minimale Hemmkonzentration (MIC, Abschnitt 1.2.3) angegeben. In den vorhergehenden Abschnitten zeigte sich, dass mit der transversalen Relaxation ein geeigneter ¨ NMR-Parameter gefunden war, wachstumsbedingte Anderungen einer Bakterienkultur zu erfassen. Der Parameter liefert somit Informationen uber ¨ das Stadium der Zellkultur und kann zur Unterscheidung einer wachsenden und statischen Kultur herangezogen werden. Der Zytotoxizit¨atstest wurde am Teststamm S. vestibularis entwickelt. Sein Metabolismus war grundlich ¨ untersucht und seine Vancomycin-Empfindlichkeit sowohl fluorimetrisch als auch mittels Mikrodilutionsverfahren (Abschnitt 4.3) uber¨ pruft. ¨ Als Losungsmittel ¨ konnte H2 O verwendet werden, so dass auf eine Untersuchung der T2 -Beeinflussung durch Losungsmittel ¨ verzichtet werden konnte. 158 4. Ergebnisse und Diskussion 4.4.5.2 T2 -Beeinflussung durch Vancomycin T2/T 2 0 Bevor die Wirkung des Vancomycin auf S. vestibularis uber ¨ T2 -Wachstumskurven untersucht werden konnte, musste sicher gestellt werden, dass die gemessenen T2 -Werte von den eingesetzten Vancomycin-Konzentrationen an sich nicht beeinflusst werden. Bei Vancomycin handelt es sich, wie bereits in Abschnitt 4.3.3 beschrieben, um ein Glykopeptid mit zahlreichen ionisierbaren funktionellen Gruppen, wodurch eine Beein¨ flussung der transversalen Relaxation mit abnehmendem pH-Wert und damit Ande¨ rung der chemischen Austauschrate nicht auszuschließen war. Zur Uberpr ufung ¨ wurden T2 -Werte von BHI-Medium mit Vancomycin-Konzentrationen im Bereich von 0.01 µM bis 100 µM bei unterschiedlichen pH-Werten und bei 30 ◦ C und 17.6 T bestimmt. Die Verh¨altnisse zwischen diesen Relaxationszeiten und ihren entsprechenden Blindwerten (T02 ) aus reinem Medium bei den verschiedenen pH-Werten sind in Abbildung 4.67 dargestellt. Sie zeigen abgesehen von kleinen Fehlern, die innerhalb der experimentellen Schwankungen durch Mittlung der T2 -Werte uber ¨ ca. 140 Pixeln lagen (siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.5.1.3), konstante Linien. Hierdurch ist die Vancomycin-Unabh¨angigkeit der T2 -Relaxation im betrachteten Konzentrationsbereich bewiesen. 1.30 1.25 pH=4.98 pH=5.49 pH=5.98 pH=6.45 pH=7.13 1.20 Abbildung 4.67: pH-Abh¨angigkeit der T2 -Werte des BHIMediums mit unterschiedlichen Vancomycin-Konzentrationen, normiert auf die pH-abh¨angigen T2 -Werte von reinem BHI-Medium. Gemessen wurden die T2 -Werte bei 30 ◦ C und 17.6 T. 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 -2 10 -1 10 1 2 10 10 Concentration [µM] 4.4.5.3 Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit Zur Bestimmung der antibiotischen Wirkung des Vancomycins auf S.vestibularis wurde ¨ ein Probensatz von sieben 5 mm-NMR-Rohrchen ¨ pr¨apariert. Ahnlich der Makrodilutionsmethode (DIN 58940-5) wurden funf ¨ dieser Rohrchen ¨ mit 2 ml Bakteriensuspension in einer Konzentration von 0.015 OD600 befullt. ¨ Jedes dieser Inokula enthielt eine 1:10 Verdunnung ¨ von Vancomycin in einem Konzentrationsbereich von 0.01 µM bis 100 µM. Die sechste und siebte Probe bestand aus reinem Medium und einer unbehandelten Bakteriensuspension und diente als Negativ- bzw. Positivkontrolle. Von diesem 4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur ¨ Zellwachstum 159 Probensatz wurde die transversale Relaxation uber ¨ einen Zeitraum von 12 h bei 30 ◦ C und 17.6 T simultan gemessen. 125 120 control medium 115 110 2 T [ms] 105 100 0.01 µM 0.1 µM 1 µM 10 µM 100 µM 95 90 85 80 75 70 100 200 300 400 500 600 t [min] 700 Abbildung 4.68: T2 -Wachstumskurven von S. vestibularis unter dem Einfluss unterschiedlicher Vancomycin-Konzentrationen, gemessen bei 30 ◦ C und 17.6 T. Das Diagramm in Abbildung 4.68 zeigt die T2 -Kurven der jeweiligen Proben. Bei den Bakterienproben in Gegenwart von Vancomycin-Konzentrationen ≥ 1 µM wurde keine zeitliche Ver¨anderung der transversalen Relaxation festgestellt und damit kein Zellwachstum beobachtet. Hingegen zeigten die Bakteriensuspensionen bei einem Vancomycin-Gehalt unter ≤ 0.1 µM gegenuber ¨ der Positivkontrolle keinen Unterschied in ihrer Wachstumscharakteristik. Zur genaueren Untersuchung des Konzentrationsbereiches 0.1 µM bis 1 µM wurde das Experiment mit intermedi¨aren Zwischenstufen (1:8, 2:8 etc. Verdunnungsstufen) ¨ wiederholt. Auch hier zeigte die inhibitorische Wirkung des Vancomycin ein typisches Schwellenverhalten ohne Zwischenzust¨ande. Diese sollten sich in einer unterschiedlichen Steigung und einer zeitlichen Verzogerung ¨ der T2 Kurven bemerkbar machen. Gemittelt uber ¨ drei Messwerte wurde der MIC-Wert zu 0.33 ± 0.08 µM bestimmt. Dies entspricht einer Standardabweichung von 24.2 %. Verglichen mit den Ergebnissen aus der FMR- (ED50 =2.4 ± 0.7 µM) LIF-CE- (ED50 =0.24 ± 0.07 µM) und der Mikrodilutionsmethode nach DIN 58940-8 [2] (MIC=0.7 µM) liegt dieses Ergebnis im gleichen Großenbereich. ¨ Die Eignung von T2 als Marker fur ¨ Zellwachstum im Rahmen eines “in-vitro-whole-cell-bioassays” und die Richtigkeit der Methode sind damit zun¨achst best¨atigt. 4.4.5.4 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick MRI als Methode zur Detektion mikrobiellen Wachstums eroffnet ¨ in HighThroughput-Screening-Verfahren eine neue Perspektive. Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung, die Schlusselfaktoren ¨ fur ¨ Methoden mit hohem Testdurchsatz konnen ¨ in der MRI in hohem Maße erfullt ¨ werden. In der Bildgebung ist 160 4. Ergebnisse und Diskussion das Pixel die kleinste Informationseinheit. Berucksichtigt ¨ man, dass eine Mittelung uber ¨ 100 Pixel bereits einen aussagekr¨aftigen Wert liefert, und MRI-Experimente mit einer Matrixgroße ¨ von 1024 x 1024 oder 2048 x 512 in Ganzkorpertomographen ¨ keine Seltenheit sind, werden Messprotokolle mit 10.000 Proben moglich. ¨ Die Detektion kann somit fur ¨ viele Proben parallel erfolgen, ohne dass fur ¨ jede Probe eine separate Anregung und Detektion notwendig ist, wie es bei den optischen Methoden der Fall ist. Verwendet man fur ¨ den Testansatz die Mikrodilution in Mikrotiterplatten (Abschnitt 1.2.3), so w¨are der gesamte Ablauf des Testverfahrens voll automatisierbar und ein Durchsatz von 40.000 Testsubstanzen pro Stunde w¨are moglich. ¨ Bisher wurde die Eignung der MRI-Detektion nur an einem kleinen Probensatz von 20 Stuck ¨ bei hoher Feldst¨arke (17.6 T) und anaeroben Mikroorganismen gezeigt. Zur Realisierung der Detektionsmethode in High-Throughput-Verfahren unter Verwendung von Ganzkorper¨ tomographen mit Feldst¨arken von 1.5 und 3 T mussen ¨ somit die Parameter T2 , OD600 und pH neu korreliert werden. Auch w¨are noch zu kl¨aren, ob unter Sauerstoffbegasung eine Detektion der Zellproliferation auch fur ¨ Aerobier moglich ¨ ist. Letztendlich wird erst durch die Testung vieler Substanzen im Routinelabor die Eignung der Methode beurteilt werden konnen. ¨ 4.4.6 Fazit: T2 als Marker fur ¨ Zellwachstum ¨ • Hauptursachen der wachstumsbedingten T2 -Anderung sind der N¨ahrstoffver¨ zehr und die stoffwechselbedingte pH-Anderung im extrazellul¨aren Medium. • Der T2 -Verlauf zur Beschreibung von Wachstumskurven erwies sich als bakterienspezifisch. Charakteristische T2 -Kurven ergaben sich in 5 mm-NMR-Rohrchen ¨ nur fur ¨ Anaerobier. • Die MIC-Werte des Vancomycin fur ¨ S. vestibularis zeigten im Dilutionsverfahren sowohl bei MRI- als auch bei spektralphotometrischer Detektion vergleichbare Ergebnisse. 161 Kapitel 5 Experimenteller Teil 5.1 Bakteriologische Untersuchungen 5.1.1 Kapillarelektrophorese (CE) 5.1.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter Die elektrophoretische Charakterisierung der Bakterien-Spezies wurde an einem Beckman-Ger¨at P/ACE System MDQ (Fullerton, CA, USA) unter Verwendung eines UVDetektors bei 214 nm vorgenommen. Fur ¨ die Aktivit¨atsbestimmungen verschiedener Antibiotika diente ein Argon-Laser-induzierter-Fluoreszenz-(LIF)-Detektor (488 nm) (Beckman, Krefeld, Deutschland), welcher im Zwei-Kanal-System mit einem 520 nm Bandpass- und einem 655 nm Longpass-Filter (Beckman) betrieben wurde. Die elektrophoretische Trennung erfolgte unter Verwendung einer Quarzglaskapillare (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm, einer Detektionsl¨ange von 21.0 cm und einem Innendurchmesser von 100 µm bei einer konstant angelegten Spannung von 10 kV bei 23 ◦ C. Die Proben wurden an der Anode der Kapillare durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur ¨ eine Dauer von 10 s injiziert. 5.1.1.2 Spulschritte ¨ Konditionierung einer neuen Kapillare 0.1 M HCl : 10 min, 20 psi 0.1 M NaOH : 20 min, 20 psi H2 O : 10 min, 20 psi Tageskonditionierung 0.1 M NaOH : 20 min, 20 psi H2 O : 10 min, 20 psi 162 5. Experimenteller Teil Spulschritte ¨ zwischen jeder Trennung 0.33 M H3 PO4 : 16 min, 20 psi H2 O : 1 min, 20 psi 0.1 M NaOH : 3 min, 20 psi H2 O : 1 min, 20 psi CE-Trennpuffer : 2.5 min, 20 psi Durch 0.33 molaren Phosphatpuffer wird die polymere Polyethylenoxid-Losung, ¨ die im Puffer zum mobilen Beschichten der Kapillare verwendet wird, vollst¨andig von der Kapillarwand gelost. ¨ Das Einspulen ¨ von CE-Puffer vor jeder Trennung beschichtet die Kapillare neu. Spulschritte ¨ zur Lagerung der Kapillare 0.1 M NaOH : 2 min, 20 psi H2 O : 10 min, 20 psi H2 O : 1 min, 5 psi 5.1.1.3 Wasser Wenn nicht anders beschrieben, wurde das mittels Millipore-Reinigungssystem (MilliQ, Eschborn, Deutschland) gereinigte Wasser benutzt. 5.1.1.4 CE-Trennpuffer (pH = 8.7) Tris-Borat-Na2 EDTA (TBE)-Puffer (pH = 8.3) Es wurde eine Stammlosung ¨ von 0.445 M Tris-Borat und 10 mM Na2 EDTA bei einem pH von 8.3 hergestellt. Dazu wurde das Produkt No T7527 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) in 1 l Wasser gelost. ¨ Der hochkonzentrierte TBE-Puffer war, ◦ aufbewahrt bei 4 C, uber ¨ mehrere Monate haltbar. Polyethylenoxid (PEO)-Losung ¨ 0.5 % 0.2 g Polyethylenoxid (Mr=600.000; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) werden in 40 ml Wasser dispergiert, woraus sich ein 0.5 %iger Polymergehalt ergibt. Das heterogene Gel wurde zur kompletten Losung ¨ uber ¨ Nacht bei 30 ◦ C gelagert. Diese Losung ¨ wurde uber ¨ einen Zeitraum von einer Woche verwendet. Fur ¨ die Herstellung von 10 ml Trennpuffer wurden 17.5 µl TBE-Puffer und 250 5.1 Bakteriologische Untersuchungen 163 µl 0.5 %ige PEO-Losung ¨ auf 10 ml mit Wasser verdunnt. ¨ Es ergibt sich daraus eine Konzentration von 0.78 mM Tris-Borat, 0.018 mM Na2 EDTA und 0.0125 % PEO bei einem pH von 8.7. Der Trennpuffer wurde unmittelbar vor jeder Trennung hergestellt und mittels Ultraschallbad 2 Minuten entgast. 5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie Ger¨at: Cary Eclipse Fluorimeter mit Mikrotiterplatten-Leseger¨at (Varian, Darmstadt, Deutschland). Messwellenl¨angen: Anregungswellenl¨ange bei 488 nm und duale Emission bei 520 nm und 655 nm. Verwendetes Messprogramm: “Scan” (Varian). 5.1.3 Mikroskopie Ger¨ate: Olympus CH-2, CK2 mit 10-, 20-, 40- und 100-facher Vergroßerung ¨ (Hamburg, Deutschland). 5.1.4 Ultraschallbad Ger¨at: SONOREX RK 156 (Bandelin, Morfelden-Walldorf, ¨ Deutschland). Leistung: 120 W. Frequenz: 35 KHz. 5.1.5 Magnetische Kernresonanz (NMR) 5.1.5.1 Bildgebung 5.1.5.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter Die kernspintomographischen Messungen zur Bestimmung der transversalen Relaxation (T2 ) wurden am Bruker Avance 17.6 Tesla Spektrometer (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Deutschland) durchgefuhrt. ¨ Zur Schaltung der Bildgebungsgradienten wurde in die vertikale Bohrung des Magneten mit einem Durchmesser von 89 mm ein Micro-2.5-Gradientenrohr (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten) mit einem Innendurchmesser von 40 mm und einer maximalen St¨arke von G=1000 mT/m pro Raumrichtung eingebracht. In das Gradientenrohr wurde der Probenkopf montiert, auf dem sich als Sende-/Empfangsspule ein 20 mm 1 H-Birdcage-Resonator (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten) befand, in welchem der jeweilige Probensatz in 5 mm-NMRRohrchen ¨ fixiert wurde. Das Gradientensystem wurde auf 30 ◦ C temperiert. Die An- 164 5. Experimenteller Teil steuerung des Spektrometers erfolgte durch einen angeschlossenen Rechner mit den Softwarepaketen Paravision 3.0.2 und xwin 3.5 (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten). 5.1.5.1.2 Sequenz und Parameter Abbildung 5.1: Multi-Spinecho Sequenz zur Messung von T2 . Die Transversalmagnetisierung wurde mit einem schichtselektiven 90◦ sinc3-Puls erzeugt und nach der H¨alfte der Echozeit τ mit einem schichtselektiven 180◦ sinc3-Puls zur Rephasierung invertiert. Nach jeder Pulsanregung wurden 64 Echos ausgelesen. Die Schichtdicke betrug 2 mm, die Matrixgroße ¨ 64 x 64, das Gesichtsfeld 20 x 20 mm2 , die Echozeit 10 ms und die Repetitionszeit 5 s. 5.1.5.1.3 Auswertung Die aufgenommenen Echos wurden mittels MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA) ausgewertet. Es wurden entsprechende T2 -Karten berechnet indem die Intensit¨at jedes Pixels nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate an eine Monoexponential− n2τ funktion (I(n) = I0 e T2 ) angepasst wurde. Abbildung 5.2: T2 -Karte eines Probensatzes von sieben 5 mm-NMR-Rohrchen ¨ mit Zellsuspension. Die Annahme einer Monoexponentialfunktion fur ¨ Zweiphasensysteme (Zellsuspensionen) ist eine Vereinfachung, die jedoch aufgrund des geringen Volumenanteils der Zellen gerechtfertigt ist. Bei einer Zellsuspension von einem OD600 -Wert< 1 ergibt sich bei einem durchschnittlichen Bakterienradius von 0.5 µm eine Volumenfraktion < 10−5 . Aus diesem Grund konnen ¨ intrazellul¨are Beitr¨age und eine direkte Beeinflus- 5.1 Bakteriologische Untersuchungen 165 sung durch die Zellen vernachl¨assigt werden. In der T2 -Karte wurde fur ¨ jedes 5 mmNMR-Rohrchen ¨ ein ROI (region of interest) mit durchschnittlich 140 Pixeln definiert und T2 als Mittelwert in den ROIs bestimmt. In die gemessenen T2 -Werte gehen unter anderem Diffusionseffekte mit ein. Aufgrund konstanter experimenteller Parameter w¨ahrend einer Messserie, wurde der Einfluss der Diffusion als konstant angenommen und T2 als gemessenes T2 definiert. 5.1.5.2 Spektroskopie Die NMR-Spektren der Bakteriensuspensionen wurden am 9.4 T Bruker-Avance-NMRSpektrometer (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Deutschland) gemessen. Verwendet wurde dabei ein BBO(Broadband Observe)-Probenkopf mit Z-Gradientensystem. Jede Bakterienprobe enthielt 10 % D2 O zur Setzung des Locksignals. 5.1.5.2.1 1D-Spektroskopie Die Messungen erfolgten unter Verwendung von Watergate-W5-Wasserunterdruck¨ ungspulsen und wurden bei 300 K mit den folgenden Parametern durchgefuhrt: ¨ Punkte, 64 K; Anzahl der Mittlungen, 64; Spektrale Breite, 16 ppm; Akquisitionszeit, 5.1 s und Relaxationsdelay, 2 s. Die Quantifizierung erfolgte durch Integration der Fl¨achen unter den Protonensignalen. Maleins¨aure in einer Konzentration von 1 mg/ml diente als interner Standard (δ=6.2 ppm), dessen Fl¨ache unter der Kurve auf eins normiert wurde. 5.1.5.2.2 2D-Spektroskopie 2D-Doppelquanten-gefilterte-COSY-Experimente wurden bei 300 K unter Verwendung von 3-9-19 Wasserunterdruckungspulsen ¨ (Watergate) und mit den folgenden Parametern durchgefuhrt: ¨ Punkte, 2048 K; Anzahl der Mittlungen, 80; Spektrale Breite, 12.32 ppm; Akquisitionszeit, 0.208 s; Relaxationsdelay, 2 s; Inkremente von t1, 256. 5.1.6 Fluoreszenzmarker: SYTO9 und Propidiumiodid Der “Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit” (L-7012) zur Markierung lebender und toter Bakterienzellen wurde uber ¨ Molecular Probes (MobiTec, Gottingen, ¨ Deutschland) bezogen. Er besteht aus den beiden Fluoreszenzfarbstoffen SYTO9 und Propidiumiodid. SYTO9 liegt in 3.34 mM, Propidiumiodid in 20 mM Konzentration, gelost ¨ in DMSO, vor. Fur ¨ die Verwendung in den Zytotoxizit¨atsbestimmungen wurden diese Stammlosungen ¨ mit DMSO 1:10 bzw. 1:100 verdunnt. ¨ Die Anregungs-/Emissionsmaxima fur ¨ diese Farbstoffe liegen fur ¨ SYTO9 bei 480/500 nm und bei 490/635 nm fur ¨ Propidiumiodid. Die zwei Nucleins¨aure-bindenden Farbstoffe unterscheiden sich in 166 5. Experimenteller Teil ihrer F¨ahigkeit in lebende Zellen einzudringen. SYTO9 f¨arbt lebende Zellen mit intakter Membran grun, ¨ w¨ahrend Propidiumiodid tote Zellen mit gesch¨adigter Membran rot f¨arbt. 5.1.7 Proben 5.1.7.1 Antibiotika-Losungen ¨ Stammlosungen: ¨ 10 mM Stammlosungen ¨ verschiedener Referenz-Antibiotika wurden in geeigneten, moglichst ¨ nicht-toxischen Losungsmitteln ¨ und damit bevorzugt in Wasser hergestellt. W¨assrige Losungen ¨ wurden mit Membranfiltern der Porengroße ¨ von 0.2 µm steril filtriert. Zur Verminderung von Aktivit¨atsverlust durch Zersetzung der Proben empfiehlt sich eine Lagerung bei -30 ◦ C. Ciprofloxacin (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) Vancomycin-HCl (Ratiopharm, Ulm, Deutschland) Ampicillin-Na (Pfizer Pharma GmbH, Karlsruhe, Deutschland) Ofloxacin (Hoechst, Frankfurt, Deutschland) : : : : H2 O H2 O H2 O 0.1 M NaOH Arbeitslosungen: ¨ Die Arbeitslosungen ¨ im Konzentrationsbereich 1 mM bis 1 µM ergaben sich aus den Stammlosungen ¨ durch serielle 1:10-Verdunnung ¨ mit den entsprechenden Losungsmitteln. ¨ 200 µl jeder Verdunnung ¨ wurden unmittelbar vor der Testung zubereitet. 5.1.7.2 Bakterien 5.1.7.2.1 Bakterien-St¨amme Die bakteriologischen Messungen mittels Kapillarelektrophorese, NMR und Fluoreszenzspektroskopie wurden an den folgenden funf ¨ Bakterien-St¨ammen durchgefuhrt: ¨ • Aerobier Pseudomonas fluorescens (DSM-No 50090; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland) Micrococcus luteus (DSM-No 20030; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland) Neisseria cinerea (DSM-No 4630; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland) • Anaerobier Escherichia coli (Top 10, Institut fur ¨ Biotechnologie, Universit¨at Wurzburg, ¨ Deutschland) • Fakultativer Anaerobier Streptococcus vestibularis (DSM-No 5636; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland) *DSMZ=Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen 5.1 Bakteriologische Untersuchungen 167 5.1.7.2.2 Kultur-Medien Muller-Hinton-Agarplatten ¨ Muller-Hinton-Agarplatten ¨ wurden von Oxoid (Wesel, Deutschland) mit der folgenden Zusammensetzung bezogen: Getrockneter Rinderextrakt : 2 g/l Caseinhydrolysat : 17.5 g/l St¨arke : 1.5 g/l Brain-Hart-Infusion(BHI)-Bouillon Das pulverisierte BHI-Medium wurde von Oxoid (Wesel, Deutschland) mit folgender Zusammensetzung bezogen: Getrockneter Rinder-Herz-Extrakt : 12.5 g/l Getrockneter Kalbs-Hirn-Extrakt : 5.0 g/l Pepton : 10 g/l Glukose : 2 g/l Chloride : 5 g/l Dinatrium-Phosphat : 2.5 g/l 5.1.7.2.3 Kultivierung Die Bakterien-Spezies wurden in gefriergetrocknetem Zustand von der DSMZ bezogen. Suspendiert in BHI-Bouillon wurden sie zun¨achst auf Muller-Hinton-Agarplatten ¨ ◦ ausgestrichen und bei 30 C angezuchtet. ¨ Die Agarkultur diente fur ¨ den Zeitraum von einer Woche als Bakterienreservoir. Vor der Analyse wurden Bakterien in 5 ml der BHI-Bouillon uberimpft ¨ und bei 30 ◦ C fur ¨ 12 h inkubiert. Diese Bakteriensuspension diente zur Vorbereitung der verschiedenen CE-, NMR- und fluoreszenzspektroskopischen Proben. 5.1.7.2.4 Zellkonzentration Die Zellkonzentration wurde UV/VIS-spektroskopisch durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm und anschließendem Z¨ahlen der koloniebildenden Einheiten (CFU) bestimmt. Zur letzteren Bestimmung wurden Bakterienproben in der exponentiellen Phase mit einem bestimmten OD-Wert serienm¨aßig 1:10 verdunnt ¨ und ein definiertes Volumen (1 ml) wurde auf BHI-Agar ausplattiert. Die Zellkonzentration ergab sich durch visuelles Ausz¨ahlen der gebildeten Kolonien nach einer Inkubation von 24 h bei 37 ◦ C. 168 5. Experimenteller Teil 5.1.7.2.5 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen zur kapillarelektrophoretischen und fluoreszenzspektroskopischen Analyse 20 µl einer 12h-Bakterienkultur wurden in 2 ml BHI-Bouillon suspendiert und in 15 mlRohrchen ¨ bei 30 ◦ C fur ¨ 24 h bis zum Erreichen der fruhen ¨ station¨aren Phase inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde in einer Zentrifuge (EBA 12; Hettich, Kirchlengern, ¨ Deutschland) bei 3400 rpm fur ¨ 5 min pelletiert. Der Uberstand wurde abdekantiert, die Zellen mit 500 µl Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen entweder in Wasser (fluorimetrische Bestimmungen) oder in Trennpuffer (CE-Bestimmungen) resuspendiert. Aufgrund der Bakterienernte in der fruhen ¨ station¨aren Phase, stellen die Bakterien in diesem Zustand nahezu 100 % lebende Zellen dar. Fur ¨ die Kalibrierung des zur Zellmarkierung erforderlichen Konzentrationsverh¨altnisses von SYTO9 und Propidiumiodid waren Bakterienproben mit unterschiedlichem Gehalt an lebenden und toten Zellen erforderlich. Zur Herstellung einer Bakteriensuspension mit 100 %igem Tot-Anteil wurden gewaschene Zellen fur ¨ eine Stunde in 50 %igem Isopropanol suspendiert und nach einem Waschschritt entweder in Wasser (fluorimetrische Bestimmung) oder Trennpuffer (CE-Bestimmung) uberf ¨ uhrt. ¨ Die Stammbakteriensuspensionen lebender und toter Zellen wurden auf eine OD600 -Wert von 0.5 eingestellt und unmittelbar vor jeder Messung pr¨apariert. Diese Zellkonzentration wurde fur ¨ CE-Messungen mit UV-Detektion bei 214 nm verwendet. Fluoreszenz-Messungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Leseger¨at oder an der Kapillarelektrophorese wurden mit 1:10 (Fluorimeter) bzw. 1:100 (LIF-CE) verdunnten ¨ Bakterienproben durchgefuhrt. ¨ Die Entwicklung eines Zytotoxizit¨atstests mittels LIFCE und Fluorimeter erforderte Arzneistoff-behandelte Bakterienproben. Dazu wurden 1980 µl einer sich in der exponentiellen Phase befindlichen Bakterienkultur in BHIMedium (OD600 =0.3) in funf ¨ 15 ml Zentrifugenrohrchen ¨ aliquotiert. Die Zugabe von 20 µl verschiedener Konzentrationen einer 10fachen Verdunnungsreihe ¨ der AntibiotikaStammlosungen ¨ mit den entsprechenden Losungsmitteln ¨ fuhrte ¨ zu einem Testbereich von 0.01 µM bis 100 µM an Antibiotika-Konzentration unter Verwendung von 1 % Losungsmittel ¨ (vgl. Abschnitt 5.2.5). Zusammen mit einer Positivkontrolle (Inokulum mit 1 % Losungsmittel) ¨ wurden die Ans¨atze bei 30 ◦ C fur ¨ 18 h inkubiert, d. h. so lange, bis unbeeinflusste Bakterienproben den station¨aren Zustand erreichten. Anschließend wurden die Bakterienzellen geerntet, wie zuvor beschrieben, gewaschen, in Wasser bzw. in Trennpuffer in den entsprechenden Konzentrationen suspendiert, und fur ¨ Fluoreszenz-Messungen verwendet. 5.1.7.2.6 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen fur ¨ die NMR-Messungen 20 µl einer 12h-Kultur wurden in 2.0 ml BHI-Medium suspendiert und in 5 mm-NMRRohrchen ¨ uberf ¨ uhrt. ¨ Das Inokulum zeigte einen OD600 -Wert von 0.015. Zur Bestim- 5.1 Bakteriologische Untersuchungen 169 mung der T2 -Wachstumskurven wurden diese Proben uber ¨ einen Zeitraum von 24 h gemessen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) erfolgte durch Messung von T2 -Wachstumskurven in Abh¨angigkeit unterschiedlicher AntibiotikaKonzentrationen. Dazu wurden 1.980 µl Bakteriensuspension mit einem OD600 -Wert von ca. 0.015 in funf ¨ 5 mm-NMR-Rohrchen ¨ aliquotiert und mit 20 µl einer AntibiotikaStammlosung ¨ bzw. -Arbeitslosung ¨ versetzt, so dass sich eine Testkonzentration zwischen 100 µM und 0.01 µM unter Verwendung von 1 % Losungsmittel ¨ ergab. 5.1.8 Zytotoxizit¨at 5.1.8.1 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) 200 µl Arzneistoff-behandelter Bakterienproben (Abschnitt 5.1.7.2.5), die zuvor auf einen OD600 -Wert von 0.5 eingestellt und anschließend 1:10 verdunnt ¨ wurden (ca. 107 Zellen/ml), wurden in die Vertiefungen einer weißen Mikrotiterplatte gegeben. Die Zellmarkierung erfolgte durch hinzufugen ¨ von je 1 µl 0.33 mM SYTO9 und 2 mM Propidiumiodid und anschließender Inkubation von 15 Minuten unter Lichtausschluss. Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Leseger¨at bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und Zwei-Kanal-Emission bei 520 nm (grun, ¨ lebend) und 655 nm (rot, tot) ausgelesen. Durch Vergleich mit einer Standard-LebendigkeitsKurve (beschreibt die Beziehung zwischen den Verh¨altnissen grun/roter ¨ Fluoreszenzintensit¨aten und unterschiedlichen Verh¨altnissen lebender zu toter Zellen) konnte das Verh¨altnis grun/rot ¨ fur ¨ jede Konzentration einer getesteten Substanz mit dem prozentualen Anteil lebender Zellen korreliert werden. Die Testung einer Substanz wurde zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Aktivit¨at der getesteten Substanzen erfolgte durch Berechnung von ED50 -Werten (Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolation. 5.1.8.2 LIF-CE 200 µl einer Arzneistoff-behandelten Bakteriensuspension (Abschnitt 5.1.7.2.5) wurde auf einen OD600 -Wert von 0.5 eingestellt, anschließend 1:100 verdunnt ¨ (ca. 106 Zellen/ml) und mit jeweils 1 µl von 0.033 mM SYTO9- und 20 mM PropidiumiodidLosung ¨ versetzt. Die Fluoreszenzmarkierung erfolgte fur ¨ 15 Minuten unter Lichtausschluss. Die markierten Bakterienproben wurden an der Anode der Kapillare injiziert durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur ¨ eine Dauer von 10 s. Um die Peaks der niedrig konzentrierten Bakterienproben fokussieren zu konnen, ¨ folgte der Probeninjektion eine zweite Injektion aus einer unmarkierten Bakteriensuspension hoher¨ 8 er Konzentration (OD600 =0.5; d. h. ca. 10 Zellen/ml), ebenfalls durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur ¨ 10 s. Die Elektropherogramme wurden mit einer Anregungs- 170 5. Experimenteller Teil wellenl¨ange von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und 655 nm ausgelesen (siehe Abschnitt 5.1.1.1). Die Auswertung der Elektropherogramme erfolgte durch Integration aller Signale im aufgezeichneten Zeitfenster und die Bestimmung der Zytotoxizit¨at in Anlehnung an Abschnitt 5.1.8.1. 5.1.8.3 Mikrodilutionsverfahren Die Bestimmungen der minimalen Hemmkonzentration mittels Mikrodilutionsverfahren fanden am Institut fur ¨ Molekulare Infektionsbiologie der Universit¨at Wurzburg ¨ statt. Es konnte auf ein etabliertes Testsystem, welches gem¨aß den DIN 58940-8 Richtlinien [2] unter leicht modifizierten Bedingungen durchgefuhrt ¨ wurde, zuruckgegrif¨ fen werden. Dazu wurden Kulturen aus der exponentiellen Phase mit Medium auf eine Zelldichte von 2 x 107 Zellen/ml eingestellt. In Mikrotiterplatten erfolgte die Inkubation von 100 µl dieser Zellsuspension unter Zusatz von 100 µl einer serienm¨aßigen 2fach-Verdunnung ¨ einer antimikrobiellen Substanz in Kulturmedium, bei 37 ◦ C fur ¨ 24 h. Die Verdunnungsreihe ¨ lag im Bereich 1 µg bis 32 µg. S. vestibularis wurde in Todd-Hewitt-Bouillon (Oxoid, Basingstoke, England) mit 0.5 % Hefeextrakt und P. fluorescens in konventioneller Muller-Hinton-Bouillon ¨ kultiviert. Der Test wurde mit einem Mikrotiterplatten-Leseger¨at bei 550 nm ausgewertet und das Ergebnis als MICWert angegeben, d. h. der niedrigsten Konzentration, bei welcher nach einer Inkubationszeit von 24 h das Zellwachstum immer noch inhibiert war. 5.2 Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei Die Etablierung des Testsystems auf Trypanosoma brucei brucei (T. b. b.) erfolgte im Armauer-Hansen-Institut der Missions¨arztlichen Klinik. Alle Arbeitsschritte wurden unter der Sterilbank (Hera soft, Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland) durchgefuhrt. ¨ 5.2.1 Medium 5.2.1.1 Baltz-Medium-Basis-Losung ¨ Die zur Zellkultivierung eingesetzte MEM-Basis-Losung ¨ (+ Earle‘s-Reagenz, -L-Glutamin, 500 ml Flasche, Gibco, Karlsruhe, Deutschland) enthielt zur besseren visuel¨ len Uberpr ufung ¨ einer intakten Zellkultur und Zelldichte Phenolrot als pH-Indikator¨ Zusatz. Bei zu hoher Zelldichte kommt es durch Ubers¨ auerung des Mediums, hervorgerufen durch eine zu hohe Konzentration verschiedener Stoffwechselprodukte 5.2 Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei 171 zum Absterben der Zellen. Der Zytotoxizit¨atstest wurde hingegen in Abwesenheit von Phenolrot durchgefuhrt ¨ aufgrund der spektralphotometrischen Auswertung des Toxizit¨atseffektes. Zur Herstellung der Baltz-Medium-Basis-Losungen ¨ wurden die nachfolgenden Substanzen in 50 ml MEM-Medium (ohne Phenolrot bzw. mit Phenolrot) gelost, ¨ der pH auf 7.5 eingestellt, anschließend der Ansatz steril filtriert und mit MEMMedium unter Zusatz von 5 ml nicht-essenzieller Aminos¨auren (NEAA, 100x, Gibco, Karlsruhe, Deutschland) auf 500 ml erg¨anzt. HEPES Glukose-Monohydrat Na-Pyruvat Hypoxanthin : : : : 3g 500 mg 110 mg 7 mg Thymidin Adenosin Bathocuproninsulfonat L-Gluthamin : : : : 2 mg 10.7 mg 14.1 mg 146 mg Alle Substanzen wurden von Roth, Karlsruhe, Deutschland bezogen. Die BaltzMedium-Basis-Losungen ¨ waren gelagert bei 5 ◦ C uber ¨ mehrere Wochen stabil. 5.2.1.2 Baltz-Medium zur Kultivierung Das Baltz-Medium zur Kultivierung wurde nach folgender Vorschrift hergestellt: Baltz-Medium-Basis-Losung ¨ β-Mercapto-Stammlosung ¨ Penicillin/Streptomycin* Inaktiviertes fotales ¨ Rinderserum : : : : 40 ml 0.4 ml 0.4 ml 8 ml Es sollte bei 5 ◦ C aufbewahrt nicht l¨anger als zwei Wochen verwendet werden. Inaktiviertes fotales ¨ Rinderserum: Das Rinderserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) war in 500 ml Flaschen erh¨altlich. Es wurde steril filtriert in zehn 50 ml Plastikrohrchen ¨ aliquotiert und bei -30 ◦ C aufbewahrt. Vor Gebrauch erfolgte nach Auftauen eines 50 ml Aliquotes bei 37 ◦ C Inaktivierung des Rinderserums im Wasserbad bei 56 ◦ C fur ¨ 30 Minuten. β-Mercaptoethanol-Stammlosung: ¨ β-Mercaptoethanol 50 mM* : H2 O, bidestilliert, Ampuwa : 4 ml 6 ml *Substanzen wurden von Biochrom, Berlin, Deutschland bezogen. 172 5. Experimenteller Teil 5.2.2 Parasitenkultur 5.2.2.1 Kultivierung Trypomastigote Formen von Trypanosoma brucei brucei des Laborstammes TC 221 wurden in 5 ml Baltz-Medium in 25 cm3 Kulturflaschen mit luftdurchl¨assigem Schraubverschluss (Biochrom, Berlin, Deutschland) bei 37 ◦ C und 5 % CO2 kultiviert. Die w¨ahrend des Wachstums der Parasitenkultur vermehrte Stoffwechselproduktion fuhrt ¨ zum Absterben der Zellen, so dass die Kultur im Abstand von 2 Tagen mit ca. 0.1 ml Zellkultur in neues Medium uberimpft ¨ werden musste. Eine Erneuerung der Kultur erfolgte im Abstand von 6 Monaten durch Auftauen und Anzuchten ¨ neuer Stabilate (Abschnitt 5.2.2.2). Dabei sollte darauf geachtet werden, dass die Zellkultur grundlich ¨ mit Medium (d. h. mindestens dreimal) gewaschen und restliches Glycerin aufgrund seiner toxischen Wirkung entfernt wird. Das Abdekantieren erfolgte durch Zentrifugation bei 3000 rpm fur ¨ 10 Minuten (Potanta TRC, Hettich, Kirchlengern, Deutschland). 5.2.2.2 Stabilate Zur Herstellung der Stabilate wurde eine in der exponentiellen Phase befindliche Trypanosomenkultur durch Zentrifugation (Potanta TRC, Hettich, Kirchlengern, Deutschland) bei 3000 rpm fur ¨ 10 min pelletiert. Auf Eis gekuhlt ¨ wurde das Pellet in 90 % Baltz-Medium und 10 % Glycerol aufgenommen, so dass sich eine Zellkonzentration von 106 Trypanosomen/ml ergab. Diese Zellsuspension, Stabilat genannt, ist bei -80 ◦ C uber ¨ mehrere Monate stabil. Ein Zellansatz wurde in 10 Eppendorf-Caps aliqotiert. 5.2.2.3 Zellkonzentration Die Bestimmung der Zytotoxizit¨at an Trypanosomen erforderte eine Zellsuspension von 105 Zellen/ml. Die Zelldichte und die notwendige Verdunnung ¨ der aktuellen Trypanosomenkultur wurde durch Ausz¨ahlung mittels Z¨ahlkammer nach Neubauer [23] bestimmt. Dazu wurde die Z¨ahlkammer mit einem geschliffenen Deckglas pr¨apariert und mit einer 100 µl Eppendorfpipette vorsichtig mit Zellkultur gefullt. ¨ Ausgez¨ahlt wurde das rote Quadrat in der Mitte der Abbildung 5.3. Eine Zellzahl von zehn entsprach einer Trypanosomenkonzentration von 105 Zellen/ml. 5.2 Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei 173 Abbildung 5.3: Z¨ahlkammer nach Neubauer 4, modifiziert nach [284]. Die Kammertiefe betr¨agt 0.100 mm. Die Netzteilung dieser Kammer weist 3 mal 3 große Quadrate von je 1 mm2 Fl¨ache auf. Fur ¨ die Trypanosomenz¨ahlung wurde nur das große, rot markierte Quadrat in der Mitte verwendet. 5.2.3 Referenz- und Testsubstanzen 5.2.3.1 Stammlosungen ¨ Die Referenz- und Testsubstanzen wurden entweder in Wasser, DMSO oder Ethanol gelost. ¨ Die Konzentration der Stammlosungen ¨ betrug dabei 10 mM. W¨assrige Losun¨ gen wurden mit Membranfiltern der Porengroße ¨ von 0.2 µm steril filtriert. Zur Verminderung des Aktivit¨atsverlustes durch Zersetzung der Proben empfiehlt sich eine Lagerung bei -30 ◦ C. Die folgenden Substanzen wurden als Referenz-Substanzen zur Etablierung des Testsystems eingesetzt. Suramin-Na (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) : H2 O Pentamidin-diisethionat (Aventis, Bad Soden, Deutschland) : H2 O Melarsoprol (Aventis) : DMSO Eflornithin-HCl (Aventis) : H2 O Nifurtimox (Bayer AG) : DMSO 5.2.3.2 Arbeitslosungen ¨ Die Arbeitslosungen ¨ im Konzentrationsbereich 1 mM bis 100 pM (Arbeitslosungen ¨ 18) ergaben sich aus den Stammlosungen ¨ durch serielle 1:10-Verdunnung ¨ mit BaltzMedium. Aufgrund der nachgewiesenen Toxizit¨at einiger Losungsmittel ¨ war darauf 174 5. Experimenteller Teil zu achten, dass jede Verdunnung ¨ den gleichen Anteil Losungsmittel ¨ enthielt. Dazu wurde die erste Verdunnungsstufe ¨ mit reinem Medium, alle weiteren mit Medium unter Zusatz von 10 % Losungsmittel ¨ hergestellt. Unmittelbar vor der Testung wurden 200 µl jeder Verdunnung ¨ zubereitet. 5.2.4 AlamarBlue AlamarBlue wurde als Resazurin-Natriumsalz von Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland bezogen. Es handelt sich dabei um die reduzierte Form des REDOXIndikators AlamarBlue. Fur ¨ die Anwendung im Zytotoxizit¨atstest wurden 11 mg Resazurin-Na in 100 ml 0.9 % NaCl gelost. ¨ Bei 4 ◦ C aufbewahrt, war die Losung ¨ uber ¨ mehrere Wochen stabil. 5.2.5 Durchfuhrung ¨ des Zytotoxizit¨atstests 1 2 Blindneg. wert Kontrolle A M: 180 M: 180 ML: 20 A1: 20 B M: 180 ML: 20 M: 180 A1: 20 C M: 180 ML: 20 M: 180 B1: 20 D M: 180 ML: 20 M: 180 B1: 20 E . . . . . . 3 pos. Kontrolle M: 160 ML: 20 T: 20 M: 160 ML: 20 T: 20 M: 160 ML: 20 T: 20 M: 160 ML: 20 T: 20 . . . 4-11 Testsubstanz 100 µM - 10 pM M: 160 A1: 20 - A8: 20 T: 20 M: 160 A1: 20 - A8: 20 T: 20 M: 160 B1: 20 - B8: 20 T: 20 M: 160 B1: 20 - B8: 20 T: 20 Substanz C Tabelle 5.1: Pipettierschema des Zytotoxizit¨atstests an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei. M=Medium; ML=Medium mit 10 % Losungsmittelanteil; ¨ T=Trypanosomensuspension (105 Zellen/ml); A/B1-A/B8=Arbeitslosungen ¨ der Testsubstanzen A-B. Die Zahlen in der Tabelle sind in µl angegeben. In 96-Mikrotiterplatten wurden 20 µl der Arbeitslosungen ¨ 1-8 in 160 µl vorgelegtes Baltz-Medium pipettiert und anschließend 20 µl einer Trypanosomensus- 5.3 Berechnung von ED50 -Werten 175 pension der Konzentration 105 Zellen/ml hinzugefugt ¨ (Tabelle 5.1). Der Testbereich lag damit zwischen 100 µM und 10 pM mit einem Losungsmittelanteil ¨ von 1 %. Positiv(Trypanosomen in Baltz Medium mit 1 % Losungsmittel)¨ und Negativ(Testsubstanz in Medium ohne Trypanosomen zur Erfassung der Eigenabsorption)kontrollen wurden bei jedem Test zus¨atzlich inokuliert. Die Platten wurden anschließend bei 37 ◦ C in einer Atmosph¨are von 5 % CO2 fur ¨ 24 h inkubiert. Nach Zugabe von 20 µl steril filtriertem AlamarBlue in jede Vertiefung erfolgte erneute Inkubation. Nach einer Gesamtinkubationszeit von 48 h wurden die Platten durch Messung der Lichtabsorption an einem MR 700 Mikrotiterplatten-Leseger¨at (Dynatech, Ruckers¨ dorf, Deutschland) bei einer Wellenl¨ange von 550 nm und einer Referenzwellenl¨ange von 630 nm ausgelesen. Die Testung einer Substanz erfolgte als Doppelbestimmung (siehe Pipettierschema) und wurde zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Aktivit¨at der getesteten Substanzen erfolgte durch Berechnung von ED50 -Werten (siehe Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolation. 5.3 Berechnung von ED50-Werten Die Auswertung des AlamarBlue-Testes auf Trypanosomen sowie der antibakteriellen Testung auf der Basis der SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung erfolgte uber ¨ die Bestimmung der ED50 -Werte mittels linearer Interpolation. Der ED50 -Wert definiert diejenige Konzentration, bei der 50 % der maximalen Inhibition bzw. Toxizit¨at eintritt. Zu seiner Bestimmung war es zun¨achst notwendig bei jeder getesteten Konzentration einer bestimmten Substanz die beobachtete Zelldichte bzw. den prozentualen Anteil lebender Zellen in Bezug auf die eingesetzten Positivkontrollen und StandardLebendigkeits-Kurven zu berechnen. Nach folgender Gleichung konnte daraus der entsprechende ED50 -Wert ermittelt werden. log(ED50 ) = log(x1 ) + y1 − 0.5 (log(x2 ) − log(x1 )) y1 − y2 (5.1) mit y1 : x1 : y2 : x2 : Bezuglich ¨ der getesteten absteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz, der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der oberhalb 0.5 liegt. Die zum Wert y1 gehorige ¨ Konzentration der Substanz. Bezuglich ¨ der getesteten aufsteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz, der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der unterhalb 0.5 liegt. Die zum Wert y2 gehorige ¨ Konzentration der Substanz. 176 6. Zusammenfassung Kapitel 6 Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurden potenzielle Wirksubstanzen zur Behandlung trypanosomaler und bakterieller Infektionen gesucht. W¨ahrend auf dem Gebiet der Trypanosomiasis das Ziel in der Testung großer Substanzbibliotheken auf antitrypanosomale Wirkung und in der Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bestand, lag im Bereich der bakteriellen Infektion der Schwerpunkt in der Entwicklung neuer Testmethoden. Zu diesem Zweck wurde im ersten Teil der Arbeit mit dem AlamarBlue-Bioassay ein In-vitro-High-Throughput-Screening-Verfahren zur antitrypanosomalen Aktivit¨atsbestimmung verschiedener Substanzklassen etabliert (Abschnitt 4.1). In der Gruppe der Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) mit C,C-verknupfter ¨ Biaryl-Achse (Abschnitt 4.1.4.1.1) zeigten Dioncophyllin A (ED50 =3.4±1.7 µM), B (ED50 =2.6±0.4 µM) und C (ED50 =4.2±2.3 µM) sowie das dimere Ancistrogriffithin A (ED50 =0.85±0.05 µM) die st¨arkste Aktivit¨at gegen Trypanosoma brucei brucei und lagen damit im Wirkbereich des Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM). Wie am Beispiel des unwirksamen dimeren Michellamin B mit sechs freien Hydroxy-Gruppen gezeigt werden konnte, war fur ¨ eine gute antitrypanosomale Wirksamkeit die begrenzte Anzahl phenolischer Gruppen auf eine oder zwei maßgeblich. Untersuchungen am Isochinolin-Gerust ¨ ergaben, dass unter diesen Bedingungen auch vereinfachte Analoga ohne Naphthalin-Einheit aktiv sind. Mit Ancistrocladinium B, ein NIQ mit N,C-verknupfter ¨ Hetero-Biaryl-Achse (Abschnitt 4.1.4.1.2) konnte ein neuer in der antitrypanosomalen Aktivit¨at wirksamerer Alkaloidtypus gefunden werden (ED50 = 0.35±0.02 µM). In dieser Gruppe zeigte sich von phenyl- zu anthracensubstituierten Isochinolinen eine großere ¨ Wirksamkeit, die sich durch zunehmende Lipophilie erkl¨aren ließ. Der Einfluss der Hydroxy-Gruppe auf die antitrypanosomale Wirkung konnte auch am Beispiel der Fluorchinolone (Abschnitt 4.1.4.2) nachgewiesen werden. Fur ¨ wirksame Substanzen war somit auch das Lipinski Kriterium [161] fur ¨ “drug-like”-Substanzen erfullt. ¨ Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zum konventionell angewandten Mikrodilutionsverfahren nach DIN 58940-8 [2], alternative und erg¨anzende Methoden zur Be- 177 stimmung der antimikrobiellen Aktivit¨at potenzieller Wirksubstanzen entwickelt. Dazu wurde auf dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (CE) (Abschnitt 4.2) und der magnetischen Kernresonanz (NMR) (Abschnitt 4.4) nach Methoden zur Beschreibung von Bakterienkulturen gesucht und diese Zytotoxizit¨atsbestimmungen zug¨anglich gemacht. Nach Entwicklung geeigneter CE-Bedingungen und Optimierung der Bakterienkulturen und deren Probenpr¨aparation konnte fur ¨ Pseudomonas fluorescens und Streptococcus vestibularis eine kapillarelektrophoretische UV-Methode mit guter Pr¨azision, Selektivit¨at, Spezifizit¨at und Linearit¨at etabliert werden. Sie erlaubte die Trennung verschieden großer Agglomerate und Ketten und die Erstellung charakteristischer Fingerabdrucke. ¨ Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid, den beiden Fluoreszenzmarkern im “LIVE/DEAD BacLight viability kit”, ermoglichte ¨ mittels LIF-CE die Konstitution der Bakterienkulturen zu untersuchen. Die beiden Nucleins¨aurebindenden Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden sich in ihrer Eigenschaft in gesunde Zellen einzudringen, wodurch eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen moglich ¨ wird: SYTO9 f¨arbt alle Zellen grun, ¨ Propidiumiodid f¨arbt alle Zellen mit besch¨adigter Membran rot. Die Aufzeichnung mikrobieller Elektropherogramme im Zwei-Kanal-Modus mittels LIF-Detektion ermoglichte ¨ das Verh¨altnis lebender zu toter Zellen mit charakteristischen elektrophoretischen Profilen zu korrelieren. Mit dieser neuen LIF-CE Methode, die erst durch Nachinjektion unmarkierter Bakterienzellen als “stacking front” moglich ¨ wurde, konnte die Tendenz der mi¨ krobiellen Kettenbildung und die Anderung des lebend/tot-Verh¨altnisses der Bakterienkultur in Gegenwart unterschiedlicher Antibiotikakonzentrationen direkt beobachtet werden. Mit Hilfe der Korrelation des grun/rot-Fluoreszenzverh¨ ¨ altnisses mit dem prozentualen Anteil lebender Zellen wurden fur ¨ Arzneistoff-exponierte Bakterienkulturen Dosis-Wirkungs-Diagramme erstellt und die entsprechenden ED50 Werte berechnet. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurden die ED50 -Messung auch am Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) durchgefuhrt ¨ und ebenso die entsprechenden MHK-Werte mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren nach DIN bestimmt. Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und Vancomycin-HCl zeigten fur ¨ die fluorimetrischen Methoden als auch fur ¨ das Mikrodilutionsverfahren vergleichbare Ergebnisse. Die fluorimetrischen Verfahren ermoglichten ¨ eine schnelle Differenzierung zwischen zytostatischer und zytotoxischer Wirksamkeit, was mittels Mikrodilutionsverfahren nicht moglich ¨ ist. Mittels NMR konnte bei 17.6 Tesla im Bildgebungsexperiment gezeigt werden, dass sich die transversale Relaxation T2 gut zur Beschreibung der Bakterienproliferation verschiedener Anaerobier eignet. Der Parameter T2 , welcher durch den chemischen ¨ Austausch beeinflusst wird, erfasst dabei das Mittel aller wachstumsbedingten Anderung in der Zellkultur. Durch N¨ahrstoffverzehr, Metabolitenproduktion und steigen- 178 6. Zusammenfassung der Zelldichte a¨ ndern sich sowohl Zusammensetzung und Konzentration des Mediums als auch der pH-Wert, die Ionenst¨arke und die Viskosit¨at. Zur Aufkl¨arung der einzelnen Beitr¨age und des Zusammenhangs zwischen Zellproliferation und T2 wurden am Beispiel der Bakterien-Spezies Streptococcus vestibularis 1 H-NMR-Spektren von Bakterienkulturen unterschiedlicher Wachstumsstadien mit den extrazellul¨aren Parame¨ tern T2 , OD600 und pH korreliert. Dabei konnten N¨ahrstoffverzehr und pH-Wert-Anderung durch Metabolitenproduktion als Hauptursachen fur ¨ die T2 -Parameterisierung der Zellproliferation identifiziert werden. Die Bildgebung erlaubte die Aufzeichnung des zeitlichen T2 -Verlaufes mehrerer Bakterienproben simultan. Aus den T2 Wachstumskurven der Streptococcus-Spezies ließ sich in Gegenwart unterschiedlicher Vancomycin-Konzentrationen der MHK-Wert des Antibiotikums zu 0.33±0.08 µM bestimmen. Er stand in gutem Einklang mit dem Ergebnis aus dem konventionellen Mikrodilutionsverfahren nach DIN (MHK=0.7 µM), der LIF-CE- (ED50 = 0.24±=0.07 µM)und der FMR- (ED50 =2.4±0.7 µM) Methode. 179 Kapitel 7 Summary The purpose of this investigation was the search for new potential drugs for treatment of trypanosomal and bacterial infections. According to trypanosomiasis, this study aimed at screening large compound libraries for their antitrypanosomal activity and analyzing structure activity relationships. In the field of bacterial infections the development of new screening methods was of main interest. In the first part of this thesis (Section 4.1) the AlamarBlue assay was established. The assay showed great potential for the determination of drug sensitivities of African trypanosomes in vitro and was suitable for high-throughput-screening of different compound classes. At first the series of naphthylisoquinolin alkaloids (NIQs) having a C,C-biaryl-axis (Section 4.1.4.1.1) were tested against Trypanosoma brucei brucei. The most active compounds of this NIQ-class were Dioncophyllin A (ED50 =3.4±1.7 µM), B (ED50 =2.6±0.4 µM), and C (ED50 =4.2±2.3 µM), and the dimeric Ancistrogriffithin A (ED50 =0.85±0.05 µM). Their ED50 values were in the same range of inhibition concentration as Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM). Michellamin B which consists of two identical naphthylisoquinoline portions including six free hydroxy functions was inactive. Thus, for good antitrypanosomal potency, the number of phenolic hydroxy functions has to be limited to one or two. Under these circumstances even some naphthalene-free tetrahydroisoquinolines were active to some extent. Ancistrocladinium B, a representative of the novel-type N,C coupled NIQ alkaloid with hetero-biaryl-axis exhibited significantly higher antitrypanosomal activities (ED50 = 0.35±0.02 µM) (Section 4.1.4.1.2). Investigations of this novel-type alkaloid showed an increase in efficiency when going from phenyl to anthracen substituted isoquinolines which is probably evoked by the increase in the lipophilic character of the compounds. The influence of the hydroxygroup on the potency was also verified for fluoroquinolones by structure-activity relationship (Section 4.1.4.2). Thus, for potent compounds the Lipinski’s criterion [161] for drug-like compounds was met as well. Further aim of this thesis was to find alternative and adjunct methods to the broth microdilution test according to DIN 58940-8 [2], which is conventionally used for the 180 7. Summary determination of the antibacterial activity of potential drugs. Therefore novel methods were developed based on capillary electrophoresis (CE) (Section 4.2) and nuclear magnetic resonance (NMR) (Section 4.4), which were suitable for the description of cell cultures and could be employed for activity screening. Having developed suitable CE-conditions, and optimized bacterial cultures and sample preparation a reliable CE-method was established for the bacterial strains Streptococcus vestibularis and Pseudomonas fluorescens. The method was performed by UV detection and showed good precision, selectivity, specificity, and linearity. It allowed for separation of microbial agglomerates and chains of different size, and was used to create characteristic fingerprints. Staining bacteria by using the LIVE/DEAD BacLight viability kit the constitution of a bacterial population could be examined by means of LIF-CE. The kit consists of the two fluorescent nucleic acid stains SYTO9 and propidium iodide, which differ in their ability to penetrate healthy cells making a distinction between live and dead cells possible: SYTO9 stains all cells green, propidium iodide stains cells with damaged membrane red. Monitoring electropherograms of bacterial samples by dual LIF detection, the ratio of live to dead cells was correlated with the electrophoretic profile. Therefore, the new LIF-CE method, based on the use of a second unlabeled bacteria injection as a stacking front, allowed for the direct observation of the tendency of chain formation and alterations in the live/dead ratio of the bacterial composition in presence of different antibiotics. By correlation of the ratio of green and red fluorescence with the percentage of live cells dose response curves of drug-treated bacterial samples were calculated, which allowed for the assessment of ED50 values. To verify the results the determination of the antibacterial activity was repeated by fluorescence microplate reader (FMR) measurements and broth microdilution method. For ciprofloxacin, ampicillin-Na, and vancomycin-HCl similar results were obtained for each of the three methods. The fluorometric methods allowed for a rapid differentiation between cytostatic and cytotoxic efficiency, which was previously not possible with broth microdilution. Using NMR experiments, it was shown by magnetic resonance imaging (MRI) at 17.6 T that the transverse relaxation T2 is suitable for the description of anaerobical, bacterial proliferation. The parameter T2 , which is influenced by chemical exchange, is sensitive to all variations of the bacterial culture. Consumption of the medium, metabolism, and varying cell density change the composition and the concentration of medium as well as pH, ionic strength and viscosity. To establish the dependence of T2 on cell proliferation 1 H NMR spectra of Streptococcus vestibularis samples of different growth stages were correlated with the extracellular parameters T2 , OD600 , and pH. The consumption of medium and the pH-variation evoked by the production of metabolites during cell growth were identified to be the basis for the successful parametrization of cell growth by T2 . MRI allowed for measuring growth curves on the basis of T2 of several 181 bacterial cultures simultaneously. From T2 -growth curves of Streptococcus vestibularis in the presence of varying concentrations of vancomycin, MIC of the antibiotic could be determined to be 0.33±0.08 µM. This value was in good agreement with the results obtained by conventional broth microdilution (MIC=0.7 µM), LIF-CE- (ED50 = 0.24±0.07 µM), and FMR- (ED50 =2.4±0.7 µM) method. 182 A. Abkurzungsverzeichnis ¨ Anhang A Abkurzungsverzeichnis ¨ AATF ADME BHI CA CE CEC CFU CGE CIEF CITP COMP COSY CPMG CZE D DNDi DMFO DSMZ EC50 ED50 EMEA EOF FDA FID FMR FQRP FRET HAT Antimicrobial Availability Task Force Adsorption, Distribution, Metabolismus und Elimination Brain-Heart-Infusion Community-acquired, ubiquit¨ar auftretend Kapillarelektrophorese Kapillarelektrochromatographie Colony forming units, koloniebildende Einheiten Kapillargelelektrophorese Kapillar-Isoelektrische Fokussierung Kapillarisotachophorese Committee for Orphan Medicinal Products COrrelation SpectroscopY Carr-Purcell-Meiboom-Gill Kapillarzonenelektrophorese Diffusionskoeffizient Drugs for Neglected Diseases Initiative Eflornithin, Difluormethylornithin Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Effective concentration, 50 % Effective dose, 50 % European Medicines Agency Elektoosmotischer Fluss Food and Drug Administration Free induction decay Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at Fluorchinolon-resistenter Pseudomonas aeruginosa Fluorescence resonance energy transfer Human African Trypanosomiasis 183 HA HTS IC50 IC ICH IDSA IOWH ISC IUPAC LDL LIF LIF-CE LPS MEKC MIC MMV MRI MRS MRT MRSA MTC NIQ NMR OD ODC OM PEO PGSE ppm PPP PRSP PD-PPP REDOX RFU ROI SAR SOD SW T Hospital-acquired, nosokomial High-throughput-screening Inhibitory concentration, 50 % Internal conversion International Conference of Harmonization Infectious Diseases Society of America Institute for One World Health Intersystem crossing International Union of Pure and Applied Chemistry Low density lipoprotein Laser-induzierte Fluoreszenz Kapillarelektrophorese mit Laser-induziertem-Fluoreszenz-Detektor Lipopolysaccharide Mizellare elektrokinetische Chromatographie Minimum inhibitory concentration Medicines for Malaria Venture Magnetic resonance imaging Magnetic resonance spectroscopy Magnetic resonance tomography Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus Magnetisierungstransferkontrast Naphthylisochinolin-Alkaloide Nuclear magnetic resonance Optische Dichte Ornithin-Decarboxylase Outer membrane Poly(ethylen)oxid Pulsed-field-gradient-spin-echo Parts per million Public-private-partnership Penicillin-resistenter Streptococcus pneumoniae Public-private-partnerships for product development Reduktion-Oxidation relative fluorescence unit Region of interest Structure activity relationship, Struktur-Wirkungs-Beziehungen Superoxid-Dismutase Bandbreite Tesla 184 T1 T2 T. b. b. TBE TD TMS VRE WHO A. Abkurzungsverzeichnis ¨ longitudinale Relaxation transversale Relaxation Trypanosoma brucei brucei Tris-Borat-EDTA Time domain Tetramethylsilan Vancomycin-resistenter Enterococcus World Health Organization 185 Anhang B Prozessierung der Rohdaten Mit nachfolgendem MATLAB-Code wurde aus den Multispin-Images T2 von jedem Pixel durch Anfitten des Intensit¨atsverlaufs an eine Monoexponentialfunktion berechnet und T2 -Karten erstellt. clear all; patient_name = ’T2_va060305’; scan_number = [3:134]; verz=’va060305.Ar1’; %vez=’mo04-10-11’; path=strcat(’/mamba/q_home/vahoerr/Daten/’,verz,’/’); directory=’/mamba/q_home/vahoerr/Ergebnisse/’; processed_data_directory = strcat(directory,’/’); l=size(scan_number) %clear all; for u=1:l(2); s=scan_number(u); ordner=num2str(scan_number(u)); full_path=strcat(path,ordner) cd(full_path); % read TE values pvm = read_acqp(’method’); TE = read_acqp_value(pvm, ’$PVM_EchoTime=’); TE_value = str2num(TE); 186 B. Prozessierung der Rohdaten % read number of echo images number_of_echo_images_str = read_acqp_value(pvm, ’$PVM_NEchoImages=’); number_of_echo_images = str2num(number_of_echo_images_str); echo_times = TE_value*(1:number_of_echo_images)’; % read NA acqp = read_acqp(’acqp’); n_avg = read_acqp_value(acqp, ’$NA’); % read number of slices number_of_slices = read_acqp_array(pvm,’$PVM_SPackArrNSlices’); process_number=’1’; % read matrix size filename_reco = strcat(full_path,’/pdata/’,process_number,... ’/reco’); reco = read_acqp(filename_reco); matrix_size = read_acqp_array(reco,’$RECO_ft_size=’); %t=echo_times t=echo_times(2:64); clear bild; clear t2; tic for slice = 1:number_of_slices; dateiname = strcat(full_path, ’/pdata/’,process_number,... ’/2dseq’); bild = read_2dseq(matrix_size(1),matrix_size(2), ... number_of_echo_images*number_of_slices, ... (slice-1)*number_of_echo_images+1:slice*.... number_of_echo_images, dateiname, ’l’); max_signal_int = max(max(max(bild))); for kx=1:matrix_size(1); [slice kx]; 187 for ky=1:matrix_size(2); signalint = reshape(bild(:,kx,ky),... number_of_echo_images,1); end end end for k=1:64; for kk=1:64; [k kk]; data = bild([2:1:64],k,kk); if data(1) > 3000; [k kk]; options = optimset(’Display’,’off’,’MaxIter’, 1000, ’MaxFunEvals’, 1000); [y err] =fminsearch(’t2fit_2’,[data(1) 100],options,... t , data ); t2(k,kk)=y(2); Mo(k,kk)=y(1); err; error(k,kk)=err; end end end toc write_verzeichnis = strcat(processed_data_directory,... patient_name, ’/’); cd(processed_data_directory); if (exist(patient_name) ˜= 7) mkdir(patient_name); end datei1 = strcat(write_verzeichnis,’t2_’,ordner); datei2 = strcat(write_verzeichnis,’bild_’,ordner); save(datei1,’t2’); save(datei2,’bild’); end 188 C. Region of Interest (ROI) Anhang C Region of Interest (ROI) Zur Definition der ROIs wurde der nachfolgende MATLAB-Code verwendet. clear all; patient_name = ’T2_va060320.AG1’; scan_number = [126:243]; proben=17; teil=’1’; t=[0:12:1404]; directory=’/mamba/q_home/vahoerr/Ergebnisse’; directory1 = strcat(directory,’/’); directory2 = strcat(directory1,patient_name,’/’); cd(directory2); l=size(scan_number) m=zeros(proben,l(2)); st=zeros(proben,l(2)); w=1; s=scan_number(w); ord=num2str(scan_number(w)) datei1 = strcat(’t2_’,ord,’.mat’) load(datei1); imagesc(t2) 189 for k=1:proben, w=1; s=scan_number(w); ord=num2str(scan_number(w)); datei1 = strcat(’t2_’,ord,’.mat’) load(datei1); datei1 size(t2) maske=roipoly; size(maske) for z=1:l(2), ord2=num2str(scan_number(z)); datei2 = strcat(’t2_’,ord2,’.mat’); load(datei2); myS = size(maske) t3 = t2(1:myS(1),1:myS(2)); clear t2 t2 = t3; if size(t2,1)>116 t2=t2(1:116,:); end roi=maske.*t2; m(k,z)=mean(roi(roi>0)); st(k,z)=std(roi(roi>0)); end end m st directory4=strcat(’t2_std’,teil); cd(directory2) if (exist(directory4)˜=7) mkdir(directory4) end directory3=strcat(directory2,’t2_std’,teil,’/’); datei6=strcat(directory3,’m’); 190 datei7=strcat(directory3,’st’); datei8=strcat(directory3,’t’); save(datei6,’m’) save(datei7,’st’) save(datei8,’t’) C. Region of Interest (ROI) LITERATURVERZEICHNIS 191 Literaturverzeichnis [1] Epidemiology and control of African Trypanosomiasis. WHO Tech. Rep. Ser. No 739. [2] Deutsches Institut fur ¨ Normierung e. V. Methoden zur Empfindlichkeitsprufung ¨ von bakteriellen Krankheitserregern (ausser Mykobakterien) gegen Chemotherapeutika - Mikrodilution. DIN 58940 Teil 8, 1990. [3] Trinova Biochem GmbH. Product information., Januar 2003. [4] Molecular Probes. LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kits. Product information, Juli 2004. [5] Attention for Neglected Diseases. Medicinal News, 2005. [6] S. A. Ahmed, R. M. Gogal, and J. E. Walsh. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3 H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods, 170:211– 224, 1994. [7] A. Allerhand and H. S. Gutowsky. Spin-echo studies of chemical exchange. II. Closed formulas for two sites. J. Chem. Phys., 42:1587–1599, 1965. [8] F. P. Altman. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem., 9:1–56, 1976. [9] J. L. Anderson. Effect of nonuniform zeta potential on particle movement in electric fields. J. Colloid. Interface Sci., 105:45–54, 1985. [10] P. C. Appelbaum and B. Bozdogan. Vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. Clin. Lab. Med., 24:381–402, 2004. [11] D. W. Armstrong, M. Girod, L. He, M. A. Rodriguez, W. Wei, J. Zheng, and E. S. Yeung. Mechanistic aspects in the generation of apparent ultrahigh efficiencies for colloidal (microbial) electrokinetic separations. Anal. Chem., 74:5523–5530, 2002. 192 LITERATURVERZEICHNIS [12] D. W. Armstrong and L. He. Determination of cell viability in single or mixed samples using capillary electrophoresis laser-induced fluorescence microfluidic systems. Anal. Chem., 73:4551–4557, 2001. [13] D. W. Armstrong and J. M. Schneiderheinze. Rapid identification of the bacterial pathogens responsible for urinary tract infections using direct injection CE. Anal. Chem., 72:4474–4476, 2000. [14] D. W. Armstrong, J. M. Schneiderheinze, J. P. Kullman, and L. He. Rapid CE microbial assays for consumer products that contain active bacteria. FEMS Microbiol. Lett., 194:33–37, 2001. [15] D. W. Armstrong, G. Schulte, J. M. Schneiderheinze, and D. J. Westenberg. Separating microbes in the manner of molecules. 1. Capillary electrokinetic approaches. Anal. Chem., 71:5465–5469, 1999. [16] E. A. Arriaga, Y. Zhang, and N. J. Dovichi. Use of 3-p-carboxybenzoylquinoline2-carboxaldehyde to label amino acids for high-sensitivity fluorescence detection in capillary electrophoresis. Anal. Chim. Acta, 299:319–326, 1995. [17] W. P. Aue, E. Bartholdi, and R. R. Ernst. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys., 64:2229–2246, 1976. [18] A. D. Bain. Chemical Exchange in NMR. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc., 43:63–103, 2003. [19] J. Bajorath. Integration of virtual and high-throughput screening. Nature Rev. Drug Discov., 1:882–893, 2002. [20] M. P. Barrett and A. H. Fairlamb. The biochemical basis of arsenical-diamidine crossresistance in African trypanosomes. Parasitol. Today, 15:136–140, 1999. [21] M. P. Barrett, Z. Q. Zhang, H. Denise, C. Giroud, and T. Baltz. A diamidineresistant Trypanosoma equiperdum clone contains a P2 purine transporter with reduced substrate affinity. Mol. Biochem. Parasitol., 73:223–229, 1995. [22] S. V. Barrett and M. P. Barrett. Anti-sleeping sickness drugs and cancer chemotherapy. Parasitol. Today, 16:7–9, 2000. [23] E. Bast. Mikrobiologische Methoden. Spektrum Akademischer Verlag, 2001. [24] A. J. Bitonti, C. J. Bacchi, P. P. McCann, and A. Sjoerdsma. Uptake of alphadifluoromethylornithine by Trypanosoma brucei brucei. Biochem. Pharmacol., 35:351–354, 1986. LITERATURVERZEICHNIS 193 [25] F. Bloch. Nuclear Induction. Phys. Rev., 70:460–474, 1946. [26] B. Bouteille, O. Oukem, S. Bisser, and M. Dumas. Treatment perspectives for human African trypanosomiasis. Fundam. Clin. Pharmacol., 17:171–181, 2003. [27] B. Bozdogan, D. Esel, C. Whitener, F. A. Browne, and P. C. Appelbaum. Antibacterial susceptibility of a vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strain isolated at the Hershey Medical Center. J. Antimicrob. Chemother., 52:864–868, 2003. [28] P. Breeuwer and T. Abee. Assessment of viability of microorganisms employing fluorescence techniques. Int. J. Food Microbiol., 55:193–200, 2000. [29] G. Bringmann. Guidelines and issue for the discovery and drug development against tropical diseases. World Health Organization, Geneva, 2003. [30] G. Bringmann, G. Francois, L. Ak´e Assi, and J. Schlauer. The Alkaloids of Triphyophyllum peltatum (Dioncophyllaceae). Chimia, 52:18–28, 1998. [31] G. Bringmann, T. Gulder, M. Reichert, and F. Meyer. Ancisheynine, the first N,Ccoupled Naphthylisochinoline alkaloid: Total synthesis and stereochemical analysis. Org. Lett., 8:1037–1040, 2005. [32] G. Bringmann, C. Gunther, ¨ S. Busemann, M. Sch¨affer, J. D. Olowokudejo, and B. I. Alo. Ancistroguineines A and B as well as ancistrotectorinenaphthylisoquinoline alkaloids from Ancistrocladus guinensis. Phytochemistry, 47:37–43, 1998. [33] G. Bringmann, A. Hamm, C. Gunther, ¨ M. Michel, R. Brun, and V. Mudogo. Ancistroealaines A and B, two new bioactive naphthylisochinolines, and related naphthoic acids from Ancistrocladus ealaensis. J. Nat. Prod., 63:1465–1470, 2000. [34] G. Bringmann, J. R. Jansen, H. Reuscher, M. Rubenacker, ¨ K. Peters, and H. G. von Schnering. First total synthesis of (-)-dioncophylline a (Triphyophylline“) and of selected stereoisomers: Complete (revised) stereostructure. Tetrahedron Lett., 31:643–646, 1990. [35] G. Bringmann, I. Kajahn, M. Reichert, S. E. H. Pedersen, J. H. Faber, T. Gulder, R. Brun, S. B. Christensen, A. Ponte-Sucre, H. Moll, G. Heubl, and V. Mudogo. Ancistrocladinium A and B, the first N,C-coupled naphthyldihydroisochinoline alkaloids, from a Congolese Ancistrocladus species. J. Org. Chem., 71:9348–9356, 2006. [36] G. Bringmann, K. Messer, K. Wolf, J. Muhlbacher, ¨ M. Grune, ¨ R. Brun, and A. M. Louis. Dioncophyllin E from Dioncophyllum thollonii, the first 7,3’-coupled dioncophyllaceous naphthylisoquinoline alkaloid. Phytochemistry, 60:389–397, 2002. 194 LITERATURVERZEICHNIS [37] G. Bringmann and F. Pokorny. The Alkaloids. Academic Press, New York, 1995. [38] G. Bringmann, M. Rubenacker, ¨ J. R. Jansen, D. Scheutzow, and L. A. Assi. On the structure of the dioncophyllaceae alkaloids dioncophylline a (triphyophylline“) ¨ and O-Methyl-Triphyophylline“. Tetrahedron Lett., 31:639–642, 1990. [39] G. Bringmann, M. Rubenacker, ¨ W. Weirich, and L. A. Assi. Dioncophylline C from the roots of Triphyophyllum peltatum, the first 5,1’-coupled dioncophyllaceae alkaloid. Phytochemistry, 31:4019–4025, 1992. [40] G. Bringmann, H. Rischer, M. Wohlfahrt, and J. Schlauer. Biosynthesis of Antidesmone in cell cultures Antidesma membranaceum (Euphorbiaceae). J. Am. Chem. Soc., 122:9905–9910, 2000. [41] G. Bringmann, M. Rubenacker, ¨ T. Geuder, and L. A. Assi. Dioncophylline B, a naphthylisoquinoline alkaloid with a new coupling type from Triphyophyllum peltatum. Phytochemistry, 30:3845–3847, 1991. [42] G. Bringmann, M. Rubenacker, ¨ P. Vogt, H. Busse, L. A. Assi, K. Peters, and H. G. von Schnering. Dioncopeltine A and dioncolactone A: Alkaloids from Triphyophyllum peltatum. Phytochemistry, 30:1691–1696, 1991. [43] G. Bringmann, W. Saeb, R. God, M. Sch¨affer, G. Francois, K. Peters, E.-M. Peters, P. Proksch, K. Hostettmann, and L. A. Assi. 5’-O-Demethyldioncophylline A, a new antimalarial alkaloid from Triphyophyllum peltatum. Phytochemistry, 49:1667– 1673, 1998. [44] G. Bringmann, M. Wohlfarth, R. Haller, S. Baer, and R. Brun. Antidesmone, a novel antitrypanosomal alkaloid. Pharm. Pharmacol. Lett., 11:47–48, 2001. [45] G. Bringmann, M. Wohlfarth, H. Rischer, J. Schlauer, and R. Brun. Extract screening by HPLC coupled to MS-MS, NMR, and CD: a dimeric and three monomeric naphthylisoquinoline alkaloids from Ancistrocladus griffithii. Phytochemistry, 61:195–204, 2002. [46] G. J. M. Bruin, R. Huisden, J. C. Kraak, and H. Poppe. Performance of carbohydrate-modified fused silica capillaries for the separation of proteins by zone electrophoresis. J. Chromatogr. A, 480:339–349, 1989. [47] R. Brun and C. Kunz. In vitro drug sensitivity test for Trypanosoma brucei subgroup bloodstream trypomastigotes. Acta Trop., 46:361–368, 1989. [48] R. Brun, R. Schumacher, C. Schmid, C. Kunz, and C. Burri. The phenomenon of treatment failures in Human African Trypanosomiasis. Trop. Med. Int. Health, 6:906–914, 2001. LITERATURVERZEICHNIS 195 [49] R. J. S. Burchmore, P. O. J. Ogbunude, B. Enanga, and M. P. Barrett. Chemotherapy of human African trypanosomiasis. Curr. Pharm. Des., 8:257–267, 2002. [50] O. Burkhardt, H. Derendorf, and T. Welte. Neuere Antibiotika fur ¨ die Behandlung von MRSA-Infektionen. Med. Monatsschr. Pharm., 29:56–62, 2006. [51] C. Burri and R. Brun. Eflornithine for the treatment of human African trypanosomiasis. Parasitol. Res., 90:49–52, 2003. [52] K. Bush. Why it is important to continue antibacterial drug discovery. AMS News, 70:282–287, 2004. [53] B. Buszewski, M. Szumski, E. Klodzinska, and H. Dahm. Separation of bacteria by capillary electrophoresis. J. Sep. Sci., 26:1045–1049, 2003. [54] N. S. Carter, B. J. Berger, and A. H. Fairlamb. Uptake of diamidine drugs by the P2 nucleoside transporter in melarsen-sensitive and -resistent Trypanosoma brucei brucei. J. Biol. Chem., 270:28153–28157, 1995. [55] N. S. Carter and A. H. Fairlamb. Arsenical-resistant trypanosomes lack an unusual adenosine transporter. Nature, 361:173–175, 1993. [56] J. P. Carver and R. E. Richards. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. J. Magn. Reson., 6:89–105, 1972. [57] J. Cavanagh, W. J. Fairbrother, A. G. PalmerIII, and N. J. Skelton. Protein NMR spectroscopy: principles and practice. Academic Press, 2007. [58] Center for Drug Evaluation and Research, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.pdf. [59] Center for Drug Evaluation and Research, Guidance for Industry: Q2B Validation of Analytical Procedures: methodology, http:// www.fda.gov/cder/ guidance/1320fnl.pdf. [60] Center for Drug Evaluation and Research, Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures, http://www.fda.gov/cder/guidance/ichq2a.pdf. [61] D. Y. C. Chan, J. W. Perram, L. R. White, and T. W. Healy. Regulation of surface potential at amphoteric surfaces during particle-particle interaction. J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1, 71:1046–1057, 1975. [62] Y. I. Chang. Divalent cations can increase cell-substrate repulsion at small distances. Colloid. Surface, 41:245–254, 1989. 196 LITERATURVERZEICHNIS [63] Y. I. Chang. The effect of cationic electrolytes on the electrostatic behavior of cellular surfaces with ionizable groups. J. Theor. Biol., 139:561–571, 1989. [64] Y. I. Chang and J. P. Hsu. The effect of multivalent cations on adhesion time for cellular adhesion to solid surfaces. J. Theor. Biol., 147:509–516, 1990. [65] B. D. Cheson, A. M. Levine, D. Mildvan, L. D. Kaplan, P. Wolfe, A. Rios, J. E. Groopman, P. Gill, P. A. Volberding, and B. J. Poiesz. Suramin therapy in AIDS and related disorders. Report of the US Suramin Working Group. J. Amer. Med. Assoc., 258:1347–1351, 1987. [66] N. H. Cheung and E. S. Yeung. Distribution of sodium and potassium within individual human erythrocytes by pulsed-laser vaporization in a sheath flow. Anal. Chem., 66:929–936, 1994. [67] M. Chiari, M. Cretich, M. Stastna, S. P. Radko, and A. Chrambach. Rapid capillary coating by epoxy-poly-(dimethylacrylamide): performance in capillary zone electrophoresis of protein and polystyrene carboxylate. Electrophoresis, 22:656– 659, 2001. [68] T. D. W. Claridge. High-resolution NMR techniques in organic chemistry. Elsevier Oxford, 1999. [69] A. C. Coelho, S. M. Beverley, and P. C. Cotrim. Functional genetic identification of PRP1, an ABC transporter superfamily member conferring pentamidine resistance in Leishmania major. Mol. Biochem. Parasitol., 130:83–90, 2003. [70] I. Coppens, F. R. Opperdoes, P. J. Courtoy, and P. Baudhuin. Receptor-mediated endocytosis in the bloodstream form of Trypanosoma brucei. J. Protozool., 34:465– 473, 1987. [71] M. Cretich, M. Stastna, A. Chrambach, and M. Chiari. Decreased protein peak asymmetry and width due to static capillary coating with hydrophilic derivatives of polydimethylacrylamide. Electrophoresis, 23:2274–2278, 2002. [72] S. L. Croft. Public-private partnership: from there to here. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 99:9–14, 2005. [73] D. Dai, Y. Chen, L. Qi, and X. Yu. Critical factors for reproducible capillary electrophoresis of escherichia coli cells. Electrophoresis, 24:3219–3223, 2003. [74] C. C. de Carvalho, A. A. da Cruz, M. N. Pons, H. M. Pinheiro, J. M. Cabral, M. M. da Fonseca, B. S. Ferreira, and P. Fernandes. Mycobacterium sp., Rhodococcus erythropolis, and Pseudomonas putida behaviour in the presence of organic solvents. Microsc. Res. Tech., 64:215–222, 2004. LITERATURVERZEICHNIS 197 [75] A. DeMaria. Challenges of sexually transmitted disease prevention and control: no magic bullet, but some bullets would still be appreciated. Clin. Infect. Dis., 41:804–807, 2005. [76] H. Denise, C. Giroud, M. P. Barrett, and T. Baltz. Affinity chromatography using trypanocidal arsenical drugs identifies a specific interaction between glycerol3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma brucei and Cymelarsan. Eur. J. Biochem., 259:339–346, 1999. [77] M. J. Desai and D. W. Armstrong. Separation, identification, and characterization of microorganisms by capillary electrophoresis. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67:38– 51, 2003. [78] R. E. Desjardins, R. A. Casero, G. P. Willet, G. E. Childs, and C. J. Canfield. Trypanosoma rhodesiense: Semiautomated microtesting for quantitation of trypanosomal activity in vitro. Exp. Parasitol., 50:260–271, 1980. [79] R. Dev, R. K. Gupta, H. Poptani, R. Roy, S. Sharma, and M. Husain. Role of in Vivo Proton Magnetic Resonance Spectroscopy in the Diagnosis and Management of Brain Abscesses. Neurosurgery, 42:37–43, 1998. [80] R. Docampo. Sensitivity of parasites to free radical damage by antiparasitic drugs. Chem. Biol. Interact., 73:1–27, 1990. [81] E. Donath and V. Pastushenko. Electrophoretical investigation of cell surface properties. Bioelectrochem. Bioenerg., 6:543–554, 1979. [82] J. E. Doran. Biological effects of endotoxin. Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus., 59:66–99, 1992. [83] A. M. Dougherty, N. Cooke, and P. Shieh. Capillary surface modification in capillary elektrophoresis. CRC Press, Boca Raton, 1997. [84] M. Dumas and B. Bouteille. Treatment of human African trypanosomiasis. Bull. WHO, 78:1474–1475, 2000. [85] R. T. Eakin, L. O. Morgan, C. T. Gregg, and N. A. Matwyoff. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of living cells and their metabolism of a specifically labeled 13 C substrate. FEBS Lett., 28:259–264, 1972. [86] R. C. Ebersole and R. M. McCormick. Separation and isolation of viable bacteria by capillary zone electrophoresis. Bio/Technol., 11:1278–1282, 1993. [87] H. Engelhardt, W. Beck, and T. Schmitt. Kapillarelektrophorese. Vieweg und Sohn Verlagsgesellschaft mbH, Braunschweig, 1994. 198 LITERATURVERZEICHNIS [88] Y. Erbil. Handbook of surface and colloid chemistry. CRC Press, Boca Raton, 1997. [89] J. N. S. Evans. Biomolecular NMR Spectroscopy. Oxford University Press, 1995. [90] A. H. Fairlamb. Chemotherapy of human African trypanosomiasis: current and future prospects. Trends Parasitol., 19:488–494, 2003. [91] A. H. Fairlamb, P. Blackburn, P. Ulrich, B. T. Chait, and A. Cerami. Trypanothione: a novel bis(glutathionyl)spermidine cofactor for glutathione reductase in trypanosomatids. Science, 227:1485–1487, 1985. [92] A. H. Fairlamb and A. Cerami. Metabolism and functions of trypanothione in the kinetoplastida. Annu. Rev. Microbiol., 46:695–729, 1992. [93] A. H. Fairlamb, G. B. Henderson, and A. Cerami. Trypanothione is the primary target for arsenical drugs against African trypanosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:2607–2611, 1989. [94] A. Fehr, P. Thurmann, ¨ and O. Razum. Editorial: Drug development for neglected diseases: a public health challenge. Trop. Med. Int. Health, 11:1335–1338, 2006. [95] D. Figeys, E. Arriaga, A. Renborg, and N. J. Dovichi. Use of the fluorescent intercalating deys POPO-3, YOYO-3 and YOYO-1 for ultrasensitive detection of double-stranded DNA separated by capillary electrophoresis with hydroxypropylmethyl cellulose and non-cross-linked polyacrylamide. J. Chromatogr. A, 669:205–216, 1994. [96] F. Foret, V. Sustacek, and P. Bocek. On-line isotachophoretic sample preconcentration for enhancement of zone detectability in capillary zone electrophoresis. J. Microcolumn Sep., 2:229–233, 1990. [97] T. Forster. ¨ Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Phys., 437:55–75, 1948. [98] J. W. Foster and H. K. Hall. Inducible pH homeostasis and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 173:5129–5135, 1991. [99] G. Francois, B. Chimanuka, G. Timperman, J. Holenz, J. Plaizier-Vercammen, L. A. Assi, and G. Bringmann. Differential sensitivity of erythrocytic stages of the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi chabaudi to dioncophylline B, a highly active naphthylisoquinoline alkaloid. Parasitol. Res., 85:935–941, 1999. [100] E. A. H. Friedheim. Mel B in the treatment of human trypanosomiasis. Am. J. Trop. Med., 29:173–180, 1949. LITERATURVERZEICHNIS 199 [101] W. Fritsche. Mikrobiologie. Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg, 1999. [102] J. C. Fung-Tomc, B. Minassian, B. Kolek, E. Huczko, L. Aleksundes, T. Stickle, T. Washo, E. Gradelski, L. Valera, and D. P. Bonner. Antibacterial spectrum of a novel Des-Fluoro(6)Quinolone, BMS-284756. Antimicrob. Agents Chemother., 44:3351–3356, 2000. [103] S. Gallet, J. M. M´etreau, P. M. Loiseau, C. Bories, and P. J. P. Cardot. Isolation of bloodstream Trypanosomes by sedimentation field-flow fractionation. J. Micro. Sep., 9:469–477, 1997. [104] P. Gastmeier, D. Sohr, C. Geffers, A. Nassauer, M. Dettenkofer, and H. Ruden. ¨ Occurrence of methicillin-resistent Staphylococcus aureus infections in German intensive care units. Infection, 30:198–202, 2002. [105] M. H. Gelb. Protein farnesyl and N-myristoyl transferases:piggy-back medicinal chemistry targets for the development of antitrypanosomatid and antimalarial therapeutics. Mol. Biochem. Parasitol., 126:155–163, 2003. [106] M. Girod and D. W. Armstrong. Monitoring the migration behaviour of living microorganisms in capillary electrophoresis using laser-induced fluorescence detection with a charge-coupled device imaging system. Electrophoresis, 23:2048– 2056, 2002. [107] R. J. Glynn, B. M. Belongia, R. G. Arnold, K. L. Ogden, and J. C. Baygents. Capillary electrophoresis measurements of electrophoretic mobility for colloidal particles of biological interest. Appl. Environ. Microbiol., 64:2572–2577, 1998. [108] A. Gottwald, L. K. Creamer, P. L. Hubbard, and P. T. Callaghan. Diffusion, Relaxation, and Chemical Exchange in Casein Gels: A Nuclear Magnetic Resonance Study. J. Chem. Phys., 122:034506.1–.10, 2005. [109] V. Govindaraju, K. Young, and A. A. Maudsley. Proton NMR chemical shifts and coupling constants for brain metabolites. NMR in Biomedicine, 13:129–153, 2000. ¨ [110] C. Gram. Uber die isolierte F¨arbung der Schizomyceten in Schnitt und Trockenpr¨aparaten. Fortschr. Med., 2:185–189, 1884. [111] D. Grasso, K. Subramaniam, M. Butkus, K. Strevett, and J. Bergendahl. A review of non-DLVO interactions in environmental colloid systems. Environ. Sci. and Bio/Technol., 1:17–38, 2002. [112] P. Gribbon and A. Sewing. High throughput drug discovery: what can we expect from HTS? Drug Discov. Today, 10:17–22, 2005. 200 LITERATURVERZEICHNIS [113] A. S. Haddadin, S. A. Fappiano, and P. A. Lipsett. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the intensive care unit. Postgrad. Med. J., 78:385–392, 2002. [114] P. J. Hajduk, R. P. Meadows, and S. W. Fesik. NMR-Based Screening in Drug Discovery. Quart. Rev. Biophys., 32:211–240, 1999. [115] R. E. W. Hancock and A. Bell. Antibiotic uptake into Gram-negative bacteria. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 7:713–720, 1988. [116] K. J. Hardy, P. M. Hawkey, F. Gao, and B. A. Oppenheim. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the critically ill. Br. J. Anaesth., 92:121–130, 2004. [117] A. H¨aring. Neue antiparasit¨are Substanzen mit Wirkung auf humanpathogene Protozoen. PhD thesis, Martin-Luther-Universit¨at Halle-Wittenberg, 2005. [118] T. W. Healy and L. R. White. Ionizable surface group models of aqueous interfaces. Adv. Colloid Interface Sci., 9:303–345, 1978. [119] E. Hershberger, S. Donabedian, K. Konstantinou, and M. J. Zervos. QuinupristinDalfopristin resistance in gram-positive bacteria: mechanism of resistance and epidemiology. Clin. Infect. Dis., 38:92–98, 2004. [120] U. Himmelreich, R. Accurso, R. Malik, B. Dolenko, R. L. Somorjai, R. K. Gupta, L. Gomes, C. E. Mountford, and T. C. Sorrell. Identification of Staphylococcus aureus Brain Abscesses: Rat and Human Studies with 1 H MR Spectroscopy. Radiology, 236:261–270, 2005. [121] U. Himmelreich, R. L. Somorjai, B. Dolenko, H. M. Daniel, and T. C. Sorrell. A rapid screening test to distinguish between Candida albicans and Candida dubliniensis using NMR spectroscopy. FEMS Microbiol. Lett., 251:327–332, 2005. [122] Y. Hirakata, J. Matsuda, M. Nakando, T. Hayashi, S. Tozaka, T. Takezawa, H. Takahashi, Y. Higashiyama, Y. Miyazaki, S. Kamihira, and S. Kohno. Evaluation of the BD Phoenix Automated Microbiology System SMIC/ID panel for identification and antimicrobial susceptibility testing of Streptococcus spp. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 53:169–173, 2005. [123] H. Hirumi, K. Hirumi, J. J. Doyle, and G. A. M. Cross. In vitro cloning of animalinfective bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Parasitology, 80:371–382, 1980. [124] S. Hjert´en. Zone broadening in electrophoresis with special reference to high performance electrophoresis in capillaries: an interplay between theory and practice. Electrophoresis, 11:665–690, 1990. LITERATURVERZEICHNIS 201 [125] S. Hjert´en, K. Elenbring, F. Kil´ar, J. L. Liao, A. J. Chen, C. J. Siebert, and M. D. Zhu. Carrier-free zone electrophoresis, displacement electrophoresis and isoelectric focusing in a high-performance electrophoresis apparatus. J. Chromatogr., 403:47–61, 1987. [126] S. Hjert´en and K. Kubo. A new type of pH- and detergent-stable coating for elimination of electroendosmosis and adsorption in (capillary) electrophoresis. Electrophoresis, 14:390–395, 1993. [127] S. Hjert´en, J. L. Liao, and K. Yao. High-performance electrophoresis elimination of electroendosmosis and solute adsorption. J. Chromatogr., 347:191–198, 1985. [128] T. Hofmann. Die Welt der vernachl¨assigten Dimensionen: Kolloide. Chem. Unserer Zeit, 38:24–35, 2004. [129] T. Hofmann, T. Baumann, T. Bundschuh, F. von der Kammer, A. Leis, D. Schmitt, T. Sch¨afer, J. Thieme, K.-U. Totsche, and H. Z¨anker. Aquatische Kolloide I: Eine ¨ Ubersichtsarbeit zur Definition, zu Systemen und zur Relevanz. GrundwasserZeitschrift der Fachsektion Hydrogeologie, 4:203–212, 2003. [130] B. L. Hogan and E. S. Yeung. Determination of intracellular species at the level of a single erythrocyte via capillary electrophoresis with direct and indirect fluorescence detection. Anal. Chem., 64:2841–2845, 1992. [131] U. Holzgrabe. Sprung- und Schrittinnovationen bei Antibiotika. DAZ, 146:55–61, 2006. [132] J. Horton. Drug development for tropical diseases - present situation, future perspectives. Trends Parasitol., 19:6–7, 2003. [133] J.-P. Hsu, W.-C. Hsu, and Y.-I. Chang. Effects of fixed-charge distribution and pH on the electrophoretic mobility of biological cells. Colloid. Polym. Sci., 272:251– 260, 1994. [134] W. Huber and J. C. Koella. A comparison of three methods of estimating EC50 in studies of drug resistance of malaria parasites. Acta Trop., 55:257–261, 1993. [135] M. J. Humphreys, R. Allman, and D. Lloyd. Determination of viability of Trichomonas vaginalis using flow cytometry. Cytometry, 15:343–348, 1994. [136] R. J. Hunter. Zeta Potential in Colloid Science. Principles and Applications. Academic Press, New York, 1981. [137] F. W. Jennings. Combination chemotherapy of CNS trypanosomiasis. Acta Trop., 54:205–213, 1993. 202 LITERATURVERZEICHNIS [138] R. I. Jepras, J. Carter, S. C. Pearson, F. E. Paul, and M. J. Wilkinson. Development of a robust flow cytometric assay for determining number of viable bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 61:2696–2701, 1995. [139] J. Jurgens, ¨ H. Schedletzky, P. Heisig, J. K. Seydel, B. Wiedemann, and U. Holzgrabe. Syntheses and biological activities of new N1-aryl substituted quinolone antibacterials. Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem., 329:179–190, 1996. [140] R. Kaminsky and R. Brun. In vitro assays to determine drug sensitivities of African trypanosomes: a review. Acta Trop., 54:279–289, 1993. [141] R. Kaminsky and E. Zweygarth. Feeder layer-free in vitro assay for screening antitrypanosomal compounds against Trypanosoma brucei brucei and T.evans. Antimicrob. Agents Chemother., 33:881–885, 1989. [142] L. Katz and G. W. Ashley. Translation and protein synthesis: Macrolides. Chem. Rev., 105:499–528, 2005. [143] F. H. Kayser, K. A. Bienz, J. Eckert, and R. M. Zinkernagel. Medizinische Mikrobiologie. Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1998. [144] J. Keiser and C. Burri. Evaluation of quinolone derivatives for antitrypanosomal activity. Trop. Med. Int. Health, 6:369–389, 2001. [145] J. Keiser, O. Ericsson, and C. Burri. Investigations of the metabolites of the trypanocidal drug melarsoprol. Clin. Pharmacol. Ther., 67:478–488, 2000. [146] M. Khallouk, D. N. Rutledge, A. M. S. Silva, and I. Delgadillo. Study of the behaviour of amino acids in aqueous solution by time-domain NMR and highresolution NMR. Magn. Reson. Chem., 43:309–315, 2005. [147] A. L. Koch. Some calculations on the turbidity of mitochondria and bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 51:429–441, 1961. [148] G. Kortum. ¨ Reflexionsspektroskopie. Springer Verlag, Berlin, 1969. [149] I. V. Kourkine, M. Ristic-Petrovic, E. Davis, C. G. Ruffolo, A. Kapsalis, and A. E. Barron. Detection of Escherichia coli O157:H7 bacteria by a combination of immunofluorescent staining and capillary electrophoresis. Electrophoresis, 24:655–661, 2003. [150] R. L. Krauth-Siegel, H. Bauer, and R. H. Schirmer. Dithiolproteine als Huter ¨ des intrazellul¨aren Redoxmilieus bei Parasiten: alte und neue Wirkstoff-Targets bei Trypanosomiasis und Malaria. Angew. Chem., 117:698–724, 2005. LITERATURVERZEICHNIS 203 [151] L. Kremser, D. Blaas, and E. Kenndler. Capillary electrophoresis of biological particles: viruses, bacteria, and eukaryotic cells. Electrophoresis, 25:2282–2291, 2004. [152] S. Kromidas. Qualit¨at im analytischen Labor. VCH Verlag Weinheim, 1995. [153] S. Kromidas. Validierung in der Analytik. VCH Verlag Weinheim, 1999. [154] T. Kustos, I. Kustos, E. Gonda, B. Kocsis, G. Szabo, ´ and F. Kil´ar. Capillary electrophoresis study of outer membrane proteins of pseudomonas strains upon antibiotic treatment. J. Chromatogr. A, 979:277–284, 2002. [155] J. R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Press, New York, 1983. [156] D. Landman, J. M. Quale, D. Mayorga, A. Adedeji, K. Vangala, J. Ravishankar, C. Flores, and S. Brooks. Citywide clonal outbreak of multiresistant Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa in Brooklyn, NY: the preantibiotic era has returned. Arch. Intern. Med., 162:1515–1520, 2002. [157] S. Langsrud and G. Sundheim. Flow cytometry for rapid assessment of viability after exposure to a quaternary ammonium compound. J. Appl. Bacteriol., 81:411– 418, 1996. [158] M. H. Levitt. Spin dynamics: basics of nuclear magnetic resonance. John Wiley & Sons LDT, Chichester, 2006. [159] H. Linde and N. Lehn. β-Lactam-Resistenz “trifft” Virulenz Methicillinresistenter Staphylococcus aureus. Pharm. Unserer Zeit, 35:422–425, 2006. [160] J. C. Lindon, J. K. Nicholson, E. Holmes, and J. R. Everett. Metabonomics: Metabolic processes studied by NMR spectroscopy of biofluids. Concepts Magn. Reson., 12:289–320, 2000. [161] C. A. Lipinski. Drug-like properties and the causes of poor solubility and poor permeability. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 44:235–249, 2000. [162] K. D. Lukacs and J. W. Jorgenson. Capillary zone electrophoresis: effect of physical parameters on separation efficiency and quantitation. J. High Res. Chromatogr., 8:407–411, 1985. [163] Z. Luz and S. Meiboom. Nuclear magnetic resonance study of the protolysis of trimethylammonium ion in aqueous solution-order of the reaction with respect to solvent. J. Chem. Phys., 39:366–370, 1963. 204 LITERATURVERZEICHNIS [164] J. Lyklema. Fundamentals of Interface and Colloid Science. Solid-Liquid Interfaces. Academic Press, London, 1995. [165] Z. B. Mackey. Discovery of trypanocidal compounds by whole cell HTS of Trypanosoma brucei. Chem. Biol. Drug Des., 67:355–363, 2006. [166] A. MacLeod, S. Welburn, I. Maudlin, C. M. R. Turner, and A. Tait. Evidence for multiple origins of human infectivity in Trypanosoma brucei revealed by minisatellite variant repeat mapping. J. Mol. Evol., 52:290–301, 2001. [167] A. Mangili, I. Bica, D. R. Snydman, and D. H. Hamer. Daptomycin-resistant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis, 40:1058– 1060, 2005. [168] C. A. Mason, G. Hamer, and J. D. Bryers. The death and lysis of microorganisms in environmental processes. FEMS Microbiol. Rev., 39:373–401, 1986. [169] T. Matsuyama. Staining of living bacteria with Rhodamin 123. FEMS Microbiol. Lett., 21:153–157, 1984. [170] P. P. McCann and A. E. Pegg. Ornithine decarboxylase as an enzyme target for therapy. Pharmacol. Ther., 54:195–215, 1992. [171] B. McConnell and P. C. Seawell. Amino Protons of Cytosine. Chemical Exchange, Rotational Exchange, and Salt-Induced Proton Magnetic Resonance Chemical Shifts of Aqueous 2’, 3’-Cyclic Cytidine Monophosphate. Biochemistry, 12:4426– 4434, 1973. [172] H. M. McConnell. Reaction Rates by Nuclear Magnetic Resonance. J. Chem. Phys., 28:430–431, 1958. [173] C. McManus. Mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents. Am. J. Health-Syst. Pharm., 57:1420–1433, 1997. [174] S. Meiboom and D. Gill. Modified Spin-Echo Method for Measuring Nuclear Relaxation Times. Rev. Sci. Instrum., 29:688–691, 1958. [175] K. Merschjohann. Entwicklung eines kolorimetrischen Testverfahrens zur Bestimmung der trypanoziden Wirkung von chemischen Verbindungen und Pflanzenstoffen in vitro. PhD thesis, Ruprecht-Karls-Universit¨at Heidelberg, 1997. [176] K. Merschjohann, F. Sporer, D. Steverding, and M. Wink. In vitro effect of alkaloids on bloodstream forms of Trypanosoma brucei and T. congolense. Planta Med., 67:623–627, 2001. LITERATURVERZEICHNIS 205 [177] G. Mie. Beitr¨age zur Optik truber ¨ Medien, speziell kolloidaler Metalllosungen. ¨ Ann. Phys., 25:377–445, 1908. [178] B. G. Moon, Y.-I. Lee, S. H. Kang, and Y. Kim. Capillary electrophoresis of microbes. Bull. Korean Chem. Soc., 24:81–85, 2003. [179] S. E. Moring, R. T. Reel, and R. E. J. van Soest. Optical improvements of a Zshaped cell for high-sensitivity UV absorbance detection in capillary electrophoresis. Anal. Chem., 65:3454–3459, 1993. [180] T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65:55–63, 1983. [181] L. S. Munoz-Price, K. Lolans, and J. P. Quinn. Emergence of resistance to daptomycin during treatment of vancomycin-resistant Enterococcus faecalis infection. Clin. Infect. Dis., 41:565–566, 2005. [182] J. Murray, D. W. L. Hukins, and P. Evans. Application of Mie theory and cubic splines to the representation of light scattering patterns from bacteria in the logarithmic growth phase. Phys. Med. Biol., 24:408–415, 1979. [183] C. Nathan and F. M. Goldberg. Outlook: the profit problem in antibiotic R&D. Nat. Rev. Drug Discov., 4:887–891, 2005. [184] G. Nebe-von Caron, P. Stephens, and R. A. Badley. Assessment of bacterial viability status by flow cytometry and single cell sorting. J. Appl. Microbiol., 84:988– 998, 1998. [185] B. Nguyen, M. P. Lee, D. Hamelberg, A. Joubert, C. Bailly, R. Brun, S. Neidle, and W. D. Wilson. Strong binding in the DNA minor groove by an aromatic diamidine with a shape that does not match the curvature of the groove. J. Am. Chem. Soc., 124:13680–13681, 2002. [186] H. Nikaido. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67:593–656, 2003. [187] B. W. Ninham and V. A. Persegian. Electrostatic potential between surfaces bearing ionizable groups in ionic equilibrium with physiological saline solution. J. Theor. Biol., 31:405–428, 1975. [188] S. R. Norrby, C. E. Nord, and R. Finch. Lack of development of new antimicrobial drugs: a potential serious threat to public health. Lancet Infect. Dis., 5:115–119, 2005. 206 LITERATURVERZEICHNIS [189] S. M. Novak, J. Hindler, and D. A. Bruckner. Reliability of two novel methods, alamar and E test, for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 31:3056–3057, 1993. [190] S. Nwaka and A. Hudson. Innovative lead discovery strategies for tropical diseases. Nature Rev. Drug Discov., 5:941–955, 2006. [191] W. Obexer, C. Schmid, and R. Brun. A novel in vitro screening assay for trypanocidal activity using the fluorescent dye BCECF-AM. Trop. Med. Parasitol., 46:45– 48, 1995. [192] M. Oechsner. Untersuchungen von Bakterien und Antibiotika mit NMRBildgebung. Master’s thesis, Julius-Maximilians-Universit¨at Wurzburg, ¨ 2004. [193] H. Ohshima. Electrophoresis of soft particles: Analytic approximations. Electrophoresis, 27:526–533, 2006. [194] H. Ohshima and T. Kondo. On the electrophoretic mobility of biological cells. Biophys. Chem., 39:191–198, 1991. [195] K. M. Overbye and J. F. Barrett. Antibiotics: where did we go wrong? Drug Discov. Today, 10:45–52, 2005. [196] J. Palmer, N. J. Munro, and J. P. Landers. A universal concept for stacking neutral analytes in micellar capillary electrophoresis. Anal. Chem., 71:1679–1687, 1999. [197] F. Paradisi, G. Corti, and D. Messeri. Antistaphylococcal (MSSA, MRSA, MSSE, MRSE) antibiotics. Med. Clin. North. Am., 85:1–17, 2001. [198] C.-W. Park. Laserspektroskopische Mehrfachdetektion einzelner Molekule ¨ in Submikrometerkan¨alen. PhD thesis, Ruprecht-Karls-Universit¨at Heidelberg, 2003. [199] B. P´ecoul, P. Chirac, P. Trouiller, and J. Pinel. Access to essential drugs in poor countries: a lost battle? JAMA, 281:361–367, 1999. [200] J. P´epin and F. Milord. The treatment of human African trypanosomiasis. Adv. Parasitol., 33:1–47, 1994. [201] J. P´epin, F. Milord, C. Guern, B. Mpia, L. Ethier, and D. Mansinsa. Trial of prednisolone for prevention of melarsoprol-induced encephalophathy in gambiense sleeping sickness. Lancet, 1:1246–1250, 1989. [202] H. Perkampus. Lexikon Spektroskopie. VCH Weinheim, 1993. [203] G. Peters and K. Becker. Epidemiology, control and treatment of methicillinresistant Staphylococcus aureus. Drugs, 52:50–54, 1996. LITERATURVERZEICHNIS 207 [204] G. Peters and F. Schumacher-Perdreau. Mikrobiologische Diagnostik. Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1992. [205] A. Pfetsch and T. Welsch. Determination of the electrophoretic mobility of bacteria and their separation by capillary zone electrophoresis. Fresenius J. Anal. Chem., 359:198–201, 1997. [206] M. A. Phillips, P. Coffino, and C. C. Wang. Cloning and sequencing of the ornithine decarboxylase gene from Trypanosoma brucei. Implications for enzyme turnover and selective difluoromethylornithine inhibition. J. Biol. Chem., 262:8721– 8727, 1987. [207] M. A. Phillips and C. C. Wang. A Trypanosoma brucei mutant resistant to alphadifluoromethylornithine. Mol. Biochem. Parasitol., 22:9–17, 1987. [208] R. Pink, A. Hodson, M.-A. Mouri`es, and M. Bendig. Opportunities and challenges in antiparasitic drug discovery. Nature Rev. Drug Discov., 4:727–740, 2005. [209] K. Potter, R. L. Kleinberg, F. J. Brockman, and E. W. McFarland. Assay for Bacteria in Porous Media by Diffusion-Weighted NMR. J. Magn. Reson. B, 113:9–15, 1996. [210] J. H. Powers. Development of drugs antimicrobial-resistant pathogens. Curr. Opin. Infect. Dis., 16:547–551, 2003. [211] J. H. Powers. Antimicrobial drug development-the past, the present, and the future. Clin. Microbiol. Infect., 10:23–31, 2004. [212] J. Preisler and E. S. Yeung. Characterization of nonbonded poly(ethylene oxide) coating for capillary electrophoresis via continuous monitoring of electroosmotic flow. Anal. Chem., 68:2885–2889, 1996. [213] S. J. Projan. Why is big Pharma getting out of antibacterial drug discovery? Curr. Opin. Microbiol., 6:427–430, 2003. [214] M. Protopopova, C. Hanrahan, B. Nikonenko, R. Samala, P. Chen, J. Gearhart, L. Einck, and C. A. Nacy. Identification of a new antitubercular drug candidate, SQ109, from a Combinatorial Library of 1,2-ethylenediamines. J. Antimicrob. Chemother, 56:968–974, 2005. [215] J. P. Quirino and S. Terabe. Exceeding 5000-fold concentration of dilute analytes in micellar electrokinetic chromatography. Science, 282:465–468, 1998. [216] D. Rasch. Biometrie: Einfuhrung ¨ in die Biostatistik. Verlag Harri Deutsch, Thun, 2. Auflage, 1987. 208 LITERATURVERZEICHNIS [217] B. R¨az, M. Iten, Y. Grether-Buhler, ¨ R. Kaminsky, and R. Brun. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Trop., 68:139–147, 1997. [218] X. Ren, Y. Shen, and M. Lee. Poly(ethylene-propylene-glycol)-modified fused silica columns for capillary electrophoresis using resin as intermediate coating. j. Chromatogr. A, 741:115–122, 1996. [219] E. T. Rietschel, T. Kirikae, F. U. Schade, U. Mamat, G. Schmidt, H. Loppnow, A. J. Ulmer, U. Z¨ahringer, U. Seydel, F. D. Padova, M. Schreier, and H. Brade. Bacterial endotoxin: molecular relationship of structure of activity and function. FASEB J., 8:217–225, 1994. [220] P. G. Righetti, B. Verzola, C. Gelfi, and L. Castelletti. The state of the art of dynamic coatings. Electrophoresis, 22:603–611, 2001. [221] M. Rister and K. Bauermeister. Superoxid-Dismutase und Superoxid-RadikalFreisetzung bei juveniler rheumatoider Arthritis. Klin. Wochenschr., 60:561–565, 1982. [222] A. E. Rizzitello, J. R. Harper, and T. J. Silhavy. Genetic evidence for parallel pathways of chaperone activity in the periplasm of Escherichia coli. J. Bacteriol., 183:6794–7000, 2001. [223] G. G. Rodriguez, D. Phipps, K. Ishiguro, and H. F. Ridgway. Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 58:1801–1808, 1992. [224] M. A. Rodriguez and D. W. Armstrong. Separation and analysis of colloidal/nano-particles including microorganisms by capillary electrophoresis: a fundamental review. J. Chromatogr. B, 800:7–25, 2004. [225] P. J. Rosenthal. Antimalarial drug discovery: old and new approaches. J. Exp. Biol., 206:3735–3744, 2003. [226] Z. Rosenzweig and E. S. Yeung. Laser-based particle-counting microimmunoassay for the analysis of single human erythrocytes. Anal. Chem., 66:1771–1776, 1994. [227] D. B. Roszak and R. R. Colwell. Survival strategies of bacteria in the natural environment. Microbiol. Rev., 51:365–379, 1987. [228] B. L. Roth, M. Poot, S. T. Yue, and P. J. Millard. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX Green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol., 63:2421–2431, 1997. LITERATURVERZEICHNIS 209 [229] B. Rotman and B. W. Papermaster. Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic esters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55:134–141, 1996. [230] G. Rucker, ¨ M. Neugebauer, and G. G. Willems. Instrumentelle Pharmazeutische Analytik. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbh, Stuttgart, 1992. [231] K. L. Ruoff. Miscellaneous catalase-negative, Gram-positive cocci: emerging opportunists. J. Clin. Microbiol., 40:1129–1133, 2002. [232] A. D. Russell. Bacterial outer membrane and cell wall penetration and cell destruction by polluting chemical agents and physical conditions. Sci. Prog., 86:283–312, 2003. [233] K. Sabol, J. E. Patterson, J. S. Lewis II, A. Owens, J. Cadena, and J. H. Jorgensen. Emergence of daptomycin resistance in Enterococcus faecium during daptomycin therapy. Antimicrob. Agents Chemother., 49:1664–1665, 2005. [234] O. L. S´anchez Munoz, ˜ E. P. Hern´andez, M. L¨ammerhofer, W. Lindner, and E. Kenndler. Estimation and comparison of zeta-potentials of silica-based anionexchange type porous particles for capillary electrochromatography from electrophoretic and electroosmotic mobility. Electrophoresis, 24:390–398, 2003. [235] M. Sands, M. A. Kron, and R. B. Brown. Pentamidine: a review. Rev. Infect. Dis., 7:625–634, 1985. [236] M. Schaechter, J. L. Ingraham, and F. C. Neidhardt. Microbe. Elsevier GmbH (Spektrum Akademischer Verlag), Munchen, ¨ 2007. [237] H. G. Schlegel. Allgemeine Mikrobiologie. Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1976. [238] W. Schmidt. Optische Spektroskopie. Wiley-VCH, 2000. [239] U. Schnabel, C. H. Fischer, and E. Kenndler. Characterization of colloidal gold nanoparticles according to size by capillary zone electrophoresis. J. Microcol. Separ., 9:529–534, 1997. [240] J. M. Schneiderheinze, D. W. Armstrong, G. Schulte, and D. J. Westenberg. High efficiency separation of microbial aggregates using capillary electrophoresis. FEMS Microbiol. Lett., 189:39–44, 2000. [241] K. A. Sharp and D. E. Brooks. Calculation of the electrophoretic mobility of a particle bearing bounce polyelectrolyte using the nonlinear Poisson-Boltzmann equation. Biophys., 47:563–566, 1985. 210 LITERATURVERZEICHNIS [242] C. Sheridan. Antiinfective biotechs face partnering gap. Nat. Biotechnol., 23:155– 156, 2005. [243] T. Shintani, K. Yamada, and M. Torimura. Optimization of a rapid and sensitive identification system for Salmonella enteritidis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence. FEMS Microbiol. Lett., 210:245–249, 2002. [244] D. M. Shlaes, S. J. Projan, and J. E. Edwards. Antibiotic discovery: state of the state. ASM News, 70:275–281, 2004. [245] K. Sieradzki, R. B. Roberts, S. W. Haber, and A. Tomasz. The development of vancomycin resistance in a patient with methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. N. Engl. J. Med., 340:517–523, 1999. [246] P. P. Simarro and P. Ndong-Asumo. Gambian trypanosomiasis and synergism between melarsoprol and eflornithin. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 90:315–316, 1996. [247] B. E. Soderstr ¨ om. ¨ Vital staining of fungi in pure cultures and in soil with fluorescein diacetate. Soil Biol. Biochem., 9:59–63, 1977. [248] B. Spellberg, J. H. Powers, E. P. Brass, L. G. Miller, and J. E. Edwards. Trends in antimicrobial drug development: implications for the future. Clin. Infect. Dis., 38:1279–1286, 2004. [249] J. R. Stevens and W. Gibson. The molecular evolution of trypanosomes. Parasitology, 15:432–437, 1999. [250] A. Stich. Die Ruckkehr ¨ der Schlafkrankheit: Therapie der afrikanischen Trypanosomiasis. Tropenmedizin, 2:14–15, 2003. [251] A. Stich, P. M. Abel, and S. Krishna. Human African trypanosomiasis. BMJ, 325:203–206, 2002. [252] A. Stich and P. Firmenich. Afrikanische Schlafkrankheit-Die Karriere eines Me¨ dikaments. Deutsches Arzteblatt, 98:1381–1383, 2001. [253] A. Stich and D. Steverding. Die Ruckkehr ¨ einer Seuche. BUIZ, 32:294–302, 2002. [254] S. M. Stocks. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A, 61:189–195, 2004. [255] I. Strelec, V. Pacakova, Z. Bosakova, P. Coufal, V. Guryca, and K. Stulik. Modification of capillary electrophoresis capillaries by poly(hydroxyethyl methacrylat), poly(diethylene glycol monomethacrylate) and poly(triethylene glycol monomethacrylate). Electrophoresis, 23:528–535, 2002. LITERATURVERZEICHNIS 211 [256] L. Stryer. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Ann. Rev. Biochem., 47:819–846, 1978. [257] W. Stumm and J. J. Morgan. Aquatic chemistry. Chemical equilibria and rates in natural waters. Wiley-Interscience, New York, 1996. [258] T. J. Swift and R. E. Connick. NMR-relaxation mechanisms of O17 in aqueous solution of paramagnetic cations and the lifetime of water molecules in the first coordination sphere. J. Chem. Phys., 37:308–320, 1962. [259] T. F. Tadros. Steric stabilisation and flocculation by polymers. Polymer J., 23:683– 696, 1991. [260] G. H. Talbot, J. Bradley, J. E. Edwards, D. Gilbert, M. Scheld, and J. G. Bartlett. Bad bugs need drugs: an update on the development pipeline from the Antimicrobial Availability Task Force of the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis., 42:657–668, 2006. [261] D. Thompson. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a general intensive care unit. J. R. Soc. Med., 97:521–526, 2004. [262] M. Torimura, S. Inagaki, H. Tao, T. Shintani, and T. Manabe. MSB´2006 20th International Symposium on Microscale Bioseparations, Final Program and Book of Abstracts, Amsterdam, The Netherlands, January 22-26,PA26. [263] M. Torimura, S. Ito, K. Kano, T. Ikeda, Y. Esaka, and T. Ueda. Surface characterization and on-line activity measurements of microorganisms by capillary zone electrophoresis. J. Chromatogr. B, 721:31–37, 1999. [264] H. C. Torrey. Nuclear spin relaxation by translational diffusion. Phys. Rev., 92:962–969, 1953. [265] H. C. Torrey. Bloch equations with diffusion terms. Phys. Rev., 104:563–565, 1956. [266] O. Trott and A. G. PalmerIII. Theoretical study of R1ρ rotating-frame and R2 freeprecession relaxation in the presence of n-site chemical exchange. J. Magn. Reson., 170:104–112, 2004. [267] P. Trouiller and P. Olliaro. Drug development output from 1975 to 1996: what proportion for tropical diseases? Int. J. Infect. Dis., 3:61–63, 1999. [268] P. Trouiller, P. Olliaro, E. Torreele, J. Orbinski, R. Laing, and N. Ford. Drug development for neglected diseases: a deficient market and a public-health policy failure. Lancet, 359:2188–2194, 2002. 212 LITERATURVERZEICHNIS [269] N. Y. Tsibakhashvili, N. V. Asatiani, M. K. Abuladze, B. G. Birkaya, N. A. Sapojnikova, L. M. Mosulishvili, and H. Y. Holman. Capillary electrophoresis of Cr(VI) reducer Arthrobacter oxydans. Biomed. Chromatogr., 16:327–331, 2002. [270] H. C. van de Hulst. ¨ Light scattering by small particles. John Wiley & Sons, New York, 1957. [271] L. H. T. van der Ploeg, K. Gottesdiener, and M. G. S. Lee. Antigenic variation in African trypanosomes. Trends Genet., 8:452–457, 1992. [272] E. L. M. Vansterkenburg, I. Coppens, J. Wilting, O. J. Bos, M. J. Fischer, L. H. Janssen, and F. R. Opperdoes. The uptake of the trypanocidal drug suramin in combination with low-density lipoproteins by Trypanosoma brucei and its possible mode of action. Acta Trop., 54:237–250, 1993. [273] B. Verzola, C. Gelfi, and P. G. Righetti. Protein adsorption to the bare fused silica wall in capillary electrophoresis quantitative studies on the chemical composition of the background electrolyte for minimizing the phenomenon. J. Chromatogr. A, 868:85–99, 2000. [274] B. Verzola, C. Gelfi, and P. G. Righetti. Quantitative studies on the adsorption of proteins to the bare fused silica wall in capillary electrophoresis II: Effects of adsorbed, neutral polymers on quenching the interaction. J. Chromatogr. A, 874:293–303, 2000. [275] M. von Smoluchowski. Handbuch der Elektrizit¨at und des Magnetismus. Barth, Leipzig, 1921. [276] T. E. Voogd, E. L. M. Vansterkenburg, J. Wilting, and L. H. M. Janssen. Recent research on the biological activity of suramin. Pharmacol. Rev., 45:177–203, 1993. [277] H. W¨atzig and S. Gunter. ¨ Capillary electrophoresis-a high performance analytical separation technique. Clin. Chem. Lab. Med., 41:724–738, 2003. [278] H. W¨atzig, S. Kaupp, and M. Graf. Inner surface properties of capillaries for electrophoresis. Trends in Analyt. Chem., 22:588–604, 2003. [279] R. P. Wenzel. The antibiotic pipeline-challenges, costs, and values. N. Engl. J. Med., 351:523–526, 2004. [280] M. Witty. Current strategies in the search for novel antiparasitic agents. Int. J. Parasitol., 29:95–103, 1999. LITERATURVERZEICHNIS 213 [281] D. H. Wood, J. E. Hall, B. G. Rose, and R. R. Tidwell. 1,5-Bis(43 amidinophenoxy)pentane (pentamidine) is a potent inhibitor of [ H]idazoxan binding to imidazoline I2 binding sites. Eur. J. Pharmacol., 353:97–103, 1998. [282] R. W. Wunderlich. The effects of surface structure on the electrophoretic mobilities of large particles. J. Colloid Interface Sci., 88:385–397, 1982. [283] www.finanznachrichten.de/nachrichten-2001-10/artikel 1039252.asp. [284] www.lo-laboroptik.de. [285] Q. Xue and E. S. Yeung. Variability of intracellular lactate dehydrogenase isoenzymes in single human erythrocytes. Anal. Chem., 66:1175–1178, 1994. [286] K. Yamada, M. Torimura, S. Kurata, Y. Kamagata, T. Kanagawa, K. Kano, T. Ikeda, T. Yokomaku, and R. Kurane. Application of capillary electrophoresis to monitor populations of Cellulomonas cartae KYM-7 and Agrobacterium tumefaciens KYM-8 in mixed culture. Electrophoresis, 22:3413–3417, 2001. [287] L.-K. Yang, R. P. Glover, K. Yonganathan, J. P. Sarnaik, A. J. Godbole, D. D. Soejarto, A. D. Buss, and M. S. Butler. Ancisheynine, a novel naphthylisoquinolinium alkaloid from Ancistrocladus heyneanus. Tetrahedron Lett., 44:5827–5833, 2003. [288] J. Zheng and E. S. Yeung. Mechanism of microbial aggregation during capillary electrophoresis. Anal. Chem., 75:818–824, 2003. [289] A. Zhu and Y. Chen. High-voltage capillary zone electrophoresis of red blood cells. J. Chromatogr. A, 470:251–260, 1989. 214 215 Danke Zum Schluss mochte ¨ ich mich bei all den Pharmazeuten, Chemikern, Physikern, Medizinern und Biologen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt: Professor Dr. Ulrike Holzgrabe fur ¨ die Betrauung mit diesem interdisziplin¨aren Thema, die wissenschaftlichen Freiheiten, die Bereitschaft zur freien Zeiteinteilung, wodurch mein Zweitstudium der Physik m¨oglich wurde und fur ¨ ihre Unterstutzung ¨ meiner Zukunftspl¨ane. Professor Dr. Peter Jakob fur ¨ seinen Pragmatismus, der das Leben um so vieles leichter macht und fur ¨ die Erstellung des Zweitgutachtens. Professor Dr. Tanja Schirmeister fur ¨ die gute Zusammenarbeit bei der Betreuung des zweiten Semesters und bei unserem gemeinsamen Projekt zur Auffindung neuer Leitstrukturen gegen die Afrikanische Trypanosomiasis, ihre stets aufmunternden Worte zur richtigen Zeit und fur ¨ ihre Hilfe bei der Realisierung meiner zukunftigen ¨ Projekte. PD Dr. Wilma Ziebuhr, Dr. Svetlana Kozitskaya und Elena Katzowitsch fur ¨ die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen verschiedener Antibiotika mittels Mikrodilutionsverfahren und fur ¨ die Diskussionen zum Thema mikrobieller Testverfahren. PD Dr. Michael Steinert und Dr. Markus Wehrl fur ¨ hilfreiche Diskussionen rund um die Mikrobiologie. Dr. Cornelius Faber, Dr. Martin Horstmann und Kerstin Hoffmann fur ¨ die Ermogli¨ chung des Bakterien-Projektes mittels magnetischer Kernresonanz. Dr. Curd Schollmayer fur ¨ die Hilfe bei der Messung der NMR-Spektren. Dem Missions¨arztlichen Institut insbesondere Professor Dr. Klaus Fleischer, PD Dr. August Stich, Andreas Fabrizius, Silvia Miksch und Hanne Fleischmann fur ¨ die zahlreichen Gespr¨ache und Vortr¨age, die mir einen Einblick in die Tropenmedizin gaben; Melanie Glaser fur ¨ ihre Hilfe bei der Testung an Trypanosoma brucei brucei; und Andrea Roggers und Daniela Heuer fur ¨ ihre logistische Unterstutzung. ¨ PD Dr. Dietmar Steverding fur ¨ seine elektronische Pr¨asenz im fernen Norfolk und die vielen Tipps und Tricks im Umgang mit Trypanosomen. Professor Dr. Simon Croft, Dr. Vanessa Yardley, Howard Kendrick and Lauren Rattrey fur ¨ die freundliche Aufnahme in ihren Arbeitskreis w¨ahrend meines For- 216 schungsaufenthaltes in London und das Lehren des Umgangs mit humanpathogenen Trypanosomen-St¨ammen. Den Professoren Dr. Chris Curtis und Dr. Jill Curtis fur ¨ ihre Gastfreundschaft in London. Dr. Peer Lobmann ¨ und Holger Friedrich fur ¨ die Ermoglichung ¨ der rheologischen Untersuchungen polymerer PEO-Losungen. ¨ Den Arbeitskreisen Professor Dr. Dr. h.c. Gerhard Bringmann und Professor Dr. Reinhold Tacke fur ¨ die Zusammenarbeit bei der Suche nach neuen Leitstrukturen gegen die Afrikanische Trypanosomiasis in der Gruppe der Naphthylisochinolin-Alkaloide und der Siliziumverbindungen. Dem AK Ho und der EP5 fur ¨ die abwechslungsreichen und lustigen letzten Jahre, insbesondere dem CE-Team: Susanne Kopec, Alexandra Deubel, Stefanie Laug und Christine Weber und meinen Buro-Kollegen ¨ in EP5: Volker Sturm, Florian Schmid, Jochen Lorenscheid, Gert Schneider und Dr. Gerd Klug. Und das Beste kommt immer zum Schluss, dem harten Kern: Cat, Schnurff, Igel, Boppi ¨ und M¨auserich.
© Copyright 2025 ExpyDoc