Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at
und
Struktur-Wirkungs-Beziehungen an
Trypanosoma brucei brucei
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Julius-Maximilians-Universit¨at Wurzburg
¨
vorgelegt von
Verena Horr
¨
aus Bad Mergentheim
Wurzburg
¨
2008
Eingereicht am:..................................................
bei der Fakult¨at fur
¨ Chemie und Pharmazie
1. Gutachter:.....................................................
2. Gutachter:.....................................................
der Dissertation
1. Prufer:.............................................................
¨
2. Prufer:.............................................................
¨
3. Prufer:.............................................................
¨
¨
des Offentlichen
Promotionskolloquiums
¨
Tag des Offentlichen
Promotionskolloquiums:.............................
Doktorurkunde ausgeh¨andigt am:.............................
The trouble with the world is
that the stupid are cocksure and
the intelligent are full of doubt.
Bertrand Russell (1872-1970)
Britischer Philosoph und Mathematiker
Nobelpreis fur
¨ Literatur 1950
INHALTSVERZEICHNIS
5
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” . . . . . . . . . . . . .
1.1.1 Bakterielle Infektionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1.1 Arzneimittelsituation . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1.2 Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft?
1.1.2 Humane Afrikanische Trypanosomiasis (HAT) . . . . . .
1.1.2.1 Erkrankung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2.2 Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2.3 Kombinationstherapie . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2.4 ”Public-Private-Partnership” . . . . . . . . . . .
1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1 ”hits”, “leads” und Arzneistoffkandidaten . . . . . . . .
1.2.2 ”In-vitro-whole-cell-bioassays” . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.3 ”High-throughput-screening” (HTS) . . . . . . . . . . . .
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25
2 Problemstellung und Ziele der Arbeit
27
3 Theoretische Grundlagen
3.1 Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Klassifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1.1 Zellwand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1.1.1 Gram-negative Bakterien . . . . . . .
3.2.1.1.2 Gram-positive Bakterien . . . . . . .
3.2.1.2 Stoffwechsel aerober und anaerober Bakterien
3.2.2 Kolloidchemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2.1 Zeta-Potenzial . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2.2 Elektrophoretische Mobilit¨at . . . . . . . . . .
3.2.2.3 Stabilit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2.4 Wechselwirkung zwischen Licht und Materie
3.2.2.5 Praktische Anwendung: Turbidimetrie . . . .
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6
INHALTSVERZEICHNIS
3.3
3.4
3.5
Optische Spektroskopie an Molekulen
¨
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3.3.1 Absorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.2 Fluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.3 Fluoreszenzloschung
¨
(”Quenching”) . . . . . .
Kapillarelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Apparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1.1 Injektion . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1.2 ”Sample stacking” . . . . . . . . . . .
3.4.1.3 Detektor . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1.4 Auflosung
¨
. . . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Trennprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.3 Elektroosmotischer Fluss (EOF) . . . . . . . . .
3.4.4 Kapillarelektrophoretische Methoden . . . . .
3.4.4.1 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) .
3.4.4.2 Kapillargelelektrophorese (CGE) . .
3.4.5 Eigenschaften von “fused silica” Oberfl¨achen .
3.4.6 Wandbeschichtung (”Coating”) . . . . . . . . .
3.4.6.1 Permanente Beschichtung . . . . . .
3.4.6.2 Dynamische Beschichtung . . . . . .
Magnetische Kernresonanz . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.1 Messprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.2 Klassische Darstellung . . . . . . . . . . . . . .
3.5.2.1 Relaxation . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.2.1.1 Bloch-Gleichungen . . . . .
3.5.2.1.2 Spinecho . . . . . . . . . . .
3.5.2.2 Chemischer Austausch . . . . . . . .
3.5.3 Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.4 Bildgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.4.1 Schichtselektionsgradient . . . . . . .
3.5.4.2 Lesegradient . . . . . . . . . . . . . .
3.5.4.3 Phasenkodiergradient . . . . . . . . .
3.5.4.4 k-Raum . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
4.1.1 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . .
4.1.2 AlamarBlue . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.3 AlamarBlue-Test . . . . . . . . . . . . . .
4.1.3.1 Losungsmittel
¨
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INHALTSVERZEICHNIS
4.2
7
4.1.3.2 Referenzsubstanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.1.3.3 Etabliertes Testsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.1.4 Struktur-Wirkungs-Beziehungen benzannelierter Systeme . . . . 71
4.1.4.1 Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) . . . . . . . . . . 71
4.1.4.1.1 C,C-verknupfte
¨
NIQs . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.1.4.1.2 N,C-verknupfte
¨
NIQs . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.1.4.2 Fluorchinolone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.2.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels Kapillarelektrophorese 80
4.2.2 Auswahl verschiedener Bakterienst¨amme . . . . . . . . . . . . . . 80
4.2.3 Problematik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.2.4 Standardisierung der Bakterienkulturen . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.2.4.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.2.4.2 Wachstumskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.2.4.3 Kalibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.2.5 Trenntechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
4.2.6 Entwicklung eines Trennpuffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
¨
4.2.6.1 Uberblick
uber
¨
literaturbekannte Puffersysteme . . . . . 86
4.2.6.2 Eignung verschiedener Puffersysteme . . . . . . . . . . 87
4.2.6.3 Optimierung der Trennmethode . . . . . . . . . . . . . . 92
4.2.6.3.1 Pufferkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.2.6.3.2 PEO Konzentration und Viskosit¨at . . . . . . . 94
4.2.6.3.3 Probenpr¨aparation . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.6.3.4 Probenkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . 98
4.2.6.4 Mechanistische Betrachtung . . . . . . . . . . . . . . . . 100
4.2.7 Reproduzierbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
4.2.7.1 Pufferinstabilit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.2.7.2 Probeninstabilit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.2.7.3 Elektrophoretische Heterogenit¨at . . . . . . . . . . . . . 104
4.2.7.4 Biologische und statistische Einflusse
¨
. . . . . . . . . . . 105
¨
4.2.8 Ubertragung
der Methode auf: P. fluorescens und S. vestibularis . . 106
4.2.9 Anwendungsbreite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.2.9.1 N. cinerea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.2.9.2 Trypanosoma brucei brucei . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
4.2.10 Trennung verschiedener Bakterienst¨amme . . . . . . . . . . . . . 110
4.2.11 Validierung der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.2.11.1 Linearit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
4.2.11.2 Pr¨azision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
8
INHALTSVERZEICHNIS
4.3
4.4
4.2.12 Fazit: CE-Analyse von Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . .
Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.1 Zustand einer Bakterienpopulation . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.2 Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid . . . . . . . . . .
4.3.3 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.4 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) . . . . . . . . . .
4.3.4.1 Validierung der Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . .
4.3.4.1.1 S¨attigungskonzentration . . . . . . . . . . . . .
4.3.4.1.2 Korrelationsfunktion 1. Ordnung . . . . . . . .
4.3.4.2 Testung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.5 LIF-CE zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation . . . . .
4.3.5.1 Injektionstechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.5.2 Validierung der Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . .
4.3.5.2.1 Korrelationsfunktion 1. Ordnung . . . . . . . .
4.3.5.2.2 Unterschiede zwischen FMR und LIF-CE . . .
4.3.5.3 Charakteristische “fingerprints” . . . . . . . . . . . . . .
4.3.5.4 Testung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.6 Moglichkeiten
¨
und Grenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.6.1 Losungsmittel-Effekt
¨
und Wirkmechanismus . . . . . .
4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick . . . . . . . . . . . . .
4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays” . . . . . . .
Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum . . . . . . . . . .
4.4.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels NMR . . . . . . . . .
4.4.2 Chemischer Austausch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.3 Anwendungsbreite des Parameters T2 . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.4 Analyse der Zellproliferation von S. vestibularis . . . . . . . . . .
4.4.4.1 Korrelation zwischen T2 , Zellzahl und pH . . . . . . . .
4.4.4.2 Komponenten im BHI-Medium . . . . . . . . . . . . . .
4.4.4.3 Metabolite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
¨
4.4.4.4 Quantitative Beitr¨age zur T2 -Anderung
w¨ahrend der
Zellproliferation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.4.4.1 N¨ahrstoffverbrauch im Medium . . . . . . . .
4.4.4.4.2 pH-Einfluss durch Bakterienmetabolismus . .
4.4.4.4.3 Effekt der Zellzunahme . . . . . . . . . . . . . .
4.4.4.4.4 Metabolitenkonzentrationen . . . . . . . . . . .
4.4.4.4.5 Maßgebende Einflussfaktoren . . . . . . . . . .
4.4.5 T2 als Maß fur
¨ die antibiotische Wirksamkeit . . . . . . . . . . . .
4.4.5.1 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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INHALTSVERZEICHNIS
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5 Experimenteller Teil
5.1 Bakteriologische Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1 Kapillarelektrophorese (CE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter . . . . . . . . . . .
5.1.1.2 Spulschritte
¨
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1.3 Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1.4 CE-Trennpuffer (pH = 8.7) . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.3 Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.4 Ultraschallbad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5 Magnetische Kernresonanz (NMR) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5.1 Bildgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter . . . . . .
5.1.5.1.2 Sequenz und Parameter . . . . . . . . . . . . .
5.1.5.1.3 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5.2 Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5.2.1 1D-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.5.2.2 2D-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.6 Fluoreszenzmarker: SYTO9 und Propidiumiodid . . . . . . . . .
5.1.7 Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7.1 Antibiotika-Losungen
¨
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7.2 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7.2.1 Bakterien-St¨amme . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7.2.2 Kultur-Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7.2.3 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7.2.4 Zellkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7.2.5 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen zur
kapillarelektrophoretischen und fluoreszenzspektroskopischen Analyse . . . . . . . . . . .
5.1.7.2.6 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen fur
¨
die NMR-Messungen . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.8 Zytotoxizit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.8.1 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) . . . . .
5.1.8.2 LIF-CE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
161
161
161
161
161
162
162
163
163
163
163
163
163
164
164
165
165
165
165
166
166
166
166
167
167
167
4.4.6
4.4.5.2 T2 -Beeinflussung durch Vancomycin . . . . .
4.4.5.3 Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit
4.4.5.4 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick . . . . . . .
Fazit: T2 als Marker fur
¨ Zellwachstum . . . . . . . . . .
9
.
.
.
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.
.
168
168
169
169
169
10
INHALTSVERZEICHNIS
5.2
5.3
5.1.8.3 Mikrodilutionsverfahren . . . . . . . . . . . . . . . .
Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei .
5.2.1 Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1.1 Baltz-Medium-Basis-Losung
¨
. . . . . . . . . . . . . .
5.2.1.2 Baltz-Medium zur Kultivierung . . . . . . . . . . . .
5.2.2 Parasitenkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2.2 Stabilate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2.3 Zellkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3 Referenz- und Testsubstanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3.1 Stammlosungen
¨
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3.2 Arbeitslosungen
¨
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.4 AlamarBlue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.5 Durchfuhrung
¨
des Zytotoxizit¨atstests . . . . . . . . . . . . . .
Berechnung von ED50 -Werten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
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170
170
170
170
171
172
172
172
172
173
173
173
174
174
175
6 Zusammenfassung
176
7 Summary
179
A Abkurzungsverzeichnis
¨
182
B Prozessierung der Rohdaten
185
C Region of Interest (ROI)
188
D Literaturverzeichnis
191
Danke
215
11
Kapitel 1
Einleitung
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases”
Der Begriff “Orphan Drugs” (Orphan auf englisch die Waise) wurde 1983 erstmals fur
¨
Arzneimittel zur Behandlung seltener Krankheiten verwendet [94]. Mit der Grundung
¨
des Orphan-Drug-Status durch das U. S. Orphan-Drug-Gesetz versuchte man die Entwicklung von Arzneistoffen gegen diese Krankheiten anzukurbeln, da unter normalen Umst¨anden aufgrund des teilweise kleinen Marktes und des geringen Umsatzes
w¨ahrend des gesetzlichen Patentschutzes fur
¨ diese Arzneimittel keine Chance besteht,
¨
die Entwicklungskosten einzuspielen. Ahnliche
Gesetzgebungen folgten in Japan, Australien und 2000 in der Europ¨aischen Union. Hier entscheidet das “Committee for
Orphan Medicinal Products” (COMP) uber
¨
die Aufnahme in die Liste der “Orphan
Drugs”. Die Zuerkennung des Status kann sich sowohl auf epidemiologische, d. h.
nicht mehr als funf
¨ Patienten unter 10.000 Personen in der EU durfen
¨
davon betroffen
sein, als auch auf wirtschaftliche Kriterien stutzen.
¨
Die EU-Verordnung vom 22.01.2000
verpflichtet dabei die europ¨aische Zulassungsagentur EMEA (”European Medicines
Agency”), Firmen bei der Entwicklung, insbesondere bei Design und Durchfuhrung
¨
klinischer Studien fur
¨ solche Arzneimittel zu unterstutzen
¨
[94].
Wirtschaftlichkeit und Rentabilit¨at definieren nicht nur den Begriff des “Orphan Drug”
sondern auch den Begriff der “Neglected Diseases”. Dabei handelt es sich um Krankheiten, die haupts¨achlich in Kaufkraft schwachen Teilen Afrikas, Asiens und Amerikas
vorkommen und deren Arzneimittelforschung und -entwicklung durch effektive Kooperationen zwischen offentlichen
¨
und privaten Unternehmen bzw. Organisationen
(”public-private-partnerships for product development”, PD-PPP) gew¨ahrleistet werden soll.
Ob Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft sind und wie sich die Arzneimittelsituation der Afrikanischen Trypanosomiasis, einer der zehn Krankheiten, die von der
“World Health Organization” (WHO) als “Neglected Diseases” gelistet sind [5], in den
12
1. Einleitung
letzten Jahren zuspitzte, wird nachfolgend diskutiert.
1.1.1 Bakterielle Infektionen
1.1.1.1 Arzneimittelsituation
In den letzten Jahren nahm die Zahl an Organ- und Systeminfektionen durch Grampositive multiresistente Bakterien wie Methicillin-resistente Staphylococcus-aureus(MRSA)-St¨amme, Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE), Penicillin-resistentem
Streptococcus pneumoniae (PRSP) und Fluorchinolon-resistentem Pseudomonas aerugino¨
sa (FQRP) stetig zu [50, 104, 113, 116, 261]. Abbildung 1.1 gibt einen Uberblick
uber
¨
die Resistenzentwicklung der letzten Jahre [50]. Vor allem stieg die Anzahl registrierter MRSA-F¨alle dramatisch an. Bei MRSA handelt es sich um Staphylococcus-aureusSt¨amme, gegen die alle β-Lactam-Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme) inklusive des Penicillinase-festen Methicillins (Oxacillin, Flucloxacillin) und
h¨aufig auch andere Antibiotika-Gruppen wie Makrolide, Clindamycin und Fluorchinolone, ihre Wirksamkeit verloren haben [197, 203]. W¨ahrend seit uber
¨
40 Jahren
MRSA-St¨amme als nosokomiale (”hospital-acquired”, HA) Problemkeime bekannt
sind, werden in letzter Zeit weltweit neue Varianten von MRSA-St¨ammen beobachtet,
sogenannte ubiquit¨ar auftretende (”community-acquired”, CA) MRSA-Keime [159].
Als letzte Waffen gegen diese multiresistenten Staphylococcus-aureus-Erreger galten
lange Zeit die beiden Glykopeptide Vancomycin und Teicoplanin, bis 2002 der erste
Fall von Vancomycinresistenz mit gleichzeitiger Kreuzresistenz gegenuber
¨
Teicoplanin auftrat [10, 27, 245].
Auch wurde die Therapie einiger Gram-negativer Keime wie Acinetobacter baumannii und “extended spectrum”-β-Lactamase (ESBL)-bildenden Enterobacteriaceae und
Klebsiella-Spezies in den letzten Jahren immer schwieriger [260]. In einigen Teilen
der Vereinigten Staaten sind viele Isolate von Acinetobacter-Keimen bereits gegen alle
Aminoglykoside, Cephalosporine und Fluorchinolone resistent [156].
Mittlerweile stehen neue Therapiealternativen zur Behandlung dieser multiresistenten, HA- und CA-Keime zur Verfugung
¨
bzw. befinden sich gerade in der klinischen Prufung
¨
[131]. Durch Molekulvariationen
¨
bekannter Wirkstoffe einer Arzneistoffgruppe versuchte man den Resistenzmechanismus zu uberwinden.
¨
Beispiele solcher Schrittinnovationen der letzten Jahre sind: Tigecyclin (Glycylcycline als Weiterentwicklung der Tetracycline), Dalbavancin und Oritavancin (Glykopeptide), Telithromycin (Ketolide als Weiterentwicklung der Makrolide) und Quinupristin/Dalfopristin
(Streptogramine). Doch wurde schon nach kurzer Zeit von Resistenzen gegen Telithromycin und Quinupristin/Dalfopristin berichtet [119, 142]. Ebenso zeigte sich bei den
im Jahr 2000 und 2003 neu auf den Markt gekommenen Wirkstoffgruppen der Oxazolidinone (Linezolid) und zyklischen Lipopeptide (Daptomycin), die erste Resistenzbil-
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases”
13
dung [167, 181, 233]. Diese schnelle Resistenzentwicklung ist vor allem auf den Einsatz
als Breitbandantibiotika zuruckzuf
¨
uhren.
¨
Abbildung 1.1: Anstieg resistenter und multiresistenter
Bakterien.
(PRSP=Penicillinresistenter Streptococcus pneumoniae,
FQRP=Fluorchinolonresistente
Pneumokokken,
MRSA=Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus,
VRE=Vancomycin-resistente
Enterokokken) [50].
1.1.1.2 Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft?
Trotz der zunehmenden H¨aufigkeit und Schwere antimikrobieller Resistenzen ist die
zukunftige
¨
Entwicklung neuer Antiinfektiva durch die Einstellung dieses Forschungsgebietes vieler großer Pharmaunternehmen bedroht [75, 183, 188, 248, 279]. Fur
¨ die
Großunternehmen ist die Entdeckung und klinische Entwicklung von neuen Antiinfektiva im Vergleich zu Arzneistoffen gegen chronische Erkrankungen unrentabel
[52, 210, 213, 244]. Kleinere Firmen unternehmen derzeit den Versuch die Antibiotikaforschung aufzunehmen und auf die medizinische Notwendigkeit aufmerksam zu
machen, doch ist ungewiß, ob die notwendigen finanziellen Mittel, die klinische Entwicklung und die Kooperationsmoglichkeiten
¨
mit den großen pharmazeutischen Unternehmen ausreichend sind, um die Therapiesicherheit bakterieller Infektionserkrankungen zu gew¨ahrleisten [211, 242]. Im M¨arz 2003 wurde die “Antimicrobial Availability Task Force” (AATF) der “Infectious Diseases Society of America” (IDSA) ins Leben
gerufen. Ihre Aufgabe besteht darin den derzeitigen Trend in Bezug auf Forschung,
Entwicklung und Herstellung von Antiinfektiva zu bewerten, und ihre zukunftige
¨
Verfugbarkeit
¨
zu gew¨ahrleisten. In ihrem Bericht vom Juli 2004: ”Bad Bugs, no drugs:
As antibiotic R&D stagnates, a public health crisis brews” schlug die IDSA deshalb
staatliche Maßnahmen zur Aufrechterhaltung der Therapiesicherheit vor [260].
Derzeit befindet sich lediglich ein Antibiotikum, das Ramoplanin, in Amerika in der
dritten Phase der klinischen Prufung.
¨
Es handelt sich dabei um eine neuartige Antibiotikaklasse, einem Lipoglykodepsipeptid, und soll bei Blutinfektionen durch Vancomycin-resistente Enterokokken zum Einsatz kommen. Die Rechte an diesem Arzneistoff
wurden 2001 von dem italienischen Biotechnologieunternehmen Biosearch Italia einlizensiert. Am 9.10.2001 bekam Ramoplanin in Europa bereits den Orphan-Drug-Status
zugesprochen, wodurch im Falle einer Zulassung das Medikament etwa 10 Jahre exklusiv vermarktet werden kann (Marktexklusivrecht) [283].
14
1. Einleitung
1.1.2 Humane Afrikanische Trypanosomiasis (HAT)
1.1.2.1 Erkrankung
Die Afrikanische Schlafkrankheit (human African trypanosomiasis, HAT) ist eine der
wichtigsten, aber gleichzeitig auch die am meisten in Vergessenheit geratene tropische
Infektionskrankheit. Die Erreger sind einzellige Parasiten der Gattung Trypanosoma,
dem Stamm der Protozoen angehorend
¨
und werden von Tsetse-Fliegen (Glossina spp.)
ubertragen.
¨
Die humane Afrikanische Trypanosomiasis existiert in zwei Formen mit
unterschiedlichen klinischen Symptomen. Man unterscheidet zwischen Trypanosoma
brucei gambiense (Erreger der Westafrikanischen Schlafkrankheit) und Trypanosoma brucei rhodesiense (Erreger der Ostafrikanischen Schlafkrankheit). Trypanosoma brucei brucei
ein den humanpathogenen Subspezies morphologisch identischer Krankheitserreger,
verursacht die bovine Trypanosomiasis (Nagana-Seuche) und wird aufgrund seiner
humanen Apathogenit¨at h¨aufig als Teststamm im Labor eingesetzt [175]. Eine Klassifizierung dieser drei Erreger ist ausschließlich anhand biologischer Kriterien wie In¨
fektionsspektrum, Pathogenit¨at, Ubertragungsmodus
und geographische Verbreitung
moglich
¨
[1]. Durch das Biotop des Vektors, welches von Senegal bis zur nordlichen
¨
Grenze der Kalahari und Namibias reicht, ist die Erkrankung auf den afrikanischen
Kontinent beschr¨ankt [175]. Berichten der WHO zufolge sind derzeit eine halbe Million Menschen mit Trypanosomen infiziert [251]. Die Erkrankung verl¨auft uber
¨
klinisch
unterschiedliche Stadien. Die ersten Symptome zeigen sich nach hochstens
¨
funf
¨ Tagen
nach Infektion durch eine lokale Hautreaktion an der Einstichstelle, dem sogenannten
Trypanosomen-Schanker [251]. Einhergehend mit Fieber verbreiten sich die Erreger
dann im weiteren Verlauf von der Einstichstelle uber
¨
Blut und Lymphe im gesamten Organismus aus (Stadium I), durchdringen allm¨ahlich die Blut-Hirn-Schranke und
erreichen schließlich das Zentralnervensystem (Stadium II). Dort fuhren
¨
sie zu einer
chronischen Enzephalopathie mit schweren Kopfschmerzen, Wesensver¨anderungen
und unterschiedlichen neurologischen Ausf¨allen. Namensgebend fur
¨ die Erkrankung
ist das Endstadium, bei dem die Patienten in einen D¨ammerzustand verfallen, immer
wieder einschlafen, zu ihrer Umgebung keinen Kontakt mehr halten und schließlich
versterben. W¨ahrend die Westafrikanische Schlafkrankheit langsam beginnt und unter allm¨ahlicher Progression das Stadium II erreicht, zeigt die Ostafrikanische Schlafkrankheit einen akuten Beginn mit h¨aufig auftretendem Haut-Schanker und fuhrt
¨
oft
bereits nach wenigen Wochen im Stadium I zum Tod [253].
1.1.2.2 Therapie
Gegen die Afrikanische Schlafkrankheit gibt es keine Impfstoffe und die Aussichten
auf eine prophylaktische Immunisierung sind schlecht, da die Parasiten ihre aus Antigenen bestehende Oberfl¨ache periodisch a¨ ndern [253,271]. Zur Therapie bleiben somit
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases”
15
ausschließlich Arzneistoffe. Die therapeutischen Strategien sind weitgehend auf dem
Stand der 60er Jahre stehen geblieben und basieren auf den funf
¨ Arzneistoffen: Suramin, Melarsoprol, Pentamidin, Eflornithin und Nifurtimox (Abbildung 1.2). Die einzigen wesentlichen Neuerungen ergaben sich in der Begleittherapie, wodurch unter
dem Einsatz von Glukokortikoiden die schweren Therapiekomplikationen abgemildert werden konnen
¨
[201]. Nifurtimox verfugt
¨ uber
¨
keine Zulassung zur Therapie der
HAT, sondern lediglich zur Therapie der Amerikanischen Trypanosomiasis (Chagas
Krankheit) [26]. Dennoch wird es bei Patienten, die gegenuber
¨
Melarsoprol resistent
sind und bei denen keine anderen Therapiealternativen bestehen, zur Behandlung von
T.-b.-gambiense-Infektionen eingesetzt. Die Wahl des Medikamentes h¨angt vor allem
davon ab, in welchem Stadium die Krankheit diagnostiziert wurde - und zwar vor
oder nach dem Eindringen in die Zerebrospinalflussigkeit.
¨
In Tabelle 1.1 sind die derzeitigen Therapieoptionen zusammengefaßt:
Westafrikanische
Schlafkrankheit
Trypanosoma brucei
gambiense
Stadium I
1.Wahl: Pentamidin
(h¨amo-lymphatischer Befall) 2.Wahl: Suramin
Stadium II
1.Wahl: Melarsoprol
(Meningoenzephalitis)
2.Wahl: Eflornithin
Ostafrikanische
Schlafkrankheit
Trypanosoma brucei
rhodesiense
1.Wahl: Suramin
2.Wahl: Melarsoprol
1.Wahl: Melarsoprol
2.Wahl: Melarsoprol
+Nifurtimox
Tabelle 1.1: Therapiestrategien zur Behandlung der Afrikanischen Trypanosomiasis (nach Referenz
[250]).
Alle Therapieans¨atze sind unbefriedigend aufgrund ihrer:
• Unakzeptablen hohen Toxizit¨at. Beispielsweise liegt die Letalit¨at unter Therapie beim Melarsoprol zwischen 4 % bis 12 % [84]. Mit großer Wahrscheinlichkeit wurde
¨
keines dieser Medikamente heute die Kriterien fur
¨ eine internationale
FDA-Zulassung erfullen
¨
[250].
• Schlechten Wirksamkeit und ihrer aufw¨andigen Applikation [90]. Bis auf Nifurtimox, welches oral verabreicht werden kann, ist bei allen anderen Arzneistoffen nur eine intramuskul¨are bzw. intravenose
¨ Applikation moglich
¨
[49, 250]. Die
Melarsoprol-Behandlung dauert minimal 10 Tage und erfordert zumindest im
¨
Stadium II eine intensive medizinische Behandlung und Uberwachung
[251].
• Arzneistoffresistenz [48]. Eine zunehmende Resistenzentwicklung gegen Melarsoprol wird vor allem aus Angola und Uganda berichtet, wo in manchen Stand-
16
1. Einleitung
orten eine Resistenzrate von 30 % erreicht wurde [250].
• Fehlenden internationalen Standardisierung. Trotz einiger Vorgaben der WHO
sind Therapieschemata (Dosierung und Therapiedauer) international nicht standardisiert und nahezu jedes Land verwendet eigene Richtlinien und Behandlungskonzepte [250].
Suramin
Na
Na
+-
+-
O3S
O
O
N
H
- +
SO3 Na
O3S
O
+
SO3 Na
N
H
+Na O3S
CH3H3C
NH
+
SO3 Na
NH
O
O
N
H
N
H
Melarsoprol
H
N
N
Eflornithin
HOOC
H2N
H2N
CHF2
N
NH2
N
As
S
S
NH2
OH
Pentamidin
Nifurtimox
NH
NH
NH2
H2N
O
O
O
O2N
O
N N
S
O
H3C
Abbildung 1.2: Strukturen der Arzneistoffe, die zur Behandlung des fruhen
¨
und sp¨aten Stadiums der
Afrikanischen Trypanosomiasis eingesetzt werden. Zu beachten ist, dass Nifurtimox keine Zulassung
zur Therapie besitzt, jedoch bei Versagen von Melarsoprol eingesetzt wird.
Im Folgenden werden die zur Verfugung
¨
stehenden funf
¨ Arzneistoffe mit ihren mogli¨
chen Wirkmechanismen n¨aher beschrieben:
1. Suramin (Germanin® , Bayer AG)
Bei Suramin handelt es sich um ein farbloses vielfach sulfoniertes, symmetrisches Naphthylamin, welches erstmals 1922 zur Therapie der HAT eingesetzt
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases”
17
wurde [276]. Es ist im Stadium I sowohl gegen T. b. gambiense als auch T. b. rhodesiense wirksam. Aufgrund seiner hohen negativen Ladung weist es eine hohe
Affinit¨at gegenuber
¨
Serumproteinen auf, einschließlich dem “low density lipoprotein” (LDL) [272]. Fur
¨ dieses Lipoprotein besitzen Trypanosomen einen Rezeptor und man vermutet, dass Suramin uber
¨
Rezeptor-vermittelte Endozytose an LDL gebunden aufgenommen wird [70]. Sein Wirkmechanismus ist nicht
vollst¨andig bekannt, beruht aber moglicher
¨
Weise auf der Hemmung zahlreicher
Enzyme aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen [49]. Die Therapie mit Suramin versagt zwischen 25 % bis 35 % der F¨alle [49]. Der Grund fur
¨ diese hohe Versagensrate liegt moglicherweise
¨
in einer reduzierten LDL-Aufnahmerate.
¨
Vielfach wurden Ubelkeit,
Erbrechen, Hautausschlag, vorubergehendes
¨
Fieber,
Leber- und Nierensch¨aden sowie Thrombocyto- und Neutropenie als Nebenwirkungen beschrieben [26, 65].
2. Pentamidin (Lomidine® , Aventis AG)
Pentamidin ist ein aromatisches Diamidin und wurde 1937 entdeckt [235]. Es
ist das Medikament der Wahl in der fruhen
¨
Phase der Westafrikanischen Schlafkrankheit. Es wirkt direkt gegen den Parasiten unabh¨angig von seiner physiologischen Stoffwechselaktivit¨at im Wirt und wird, wie auch die MelaminylphenylArsenverbindungen (Melarsoprol, vide infra), unter anderem uber
¨
P2-AminoPurin-Transporter, im Parasiten hoch-konzentriert angereichert [54, 55]. Der Verlust dieses Transporters kann bei den Parasiten zur Kreuzresistenz gegenuber
¨
Diamidinen und Arsenverbindungen fuhren.
¨
Der Wirkmechanismus ist nicht
vollst¨andig gekl¨art. Aufgrund der hohen Arzneistoffkonzentrationen von einigen Millimolar [54] liegt die Vermutung nahe, dass der zytotoxische Effekt seine Ursache in der Hemmung vieler zellul¨arer Zielstrukturen (Proteine, Lipide,
kleine Furche der DNA) [20, 69, 185] hat, hervorgerufen durch elektrostatische
¨
Wechselwirkungen. Als Nebenwirkungen konnen
¨
Hypotonie, Ubelkeit,
Nierensch¨aden und Diabetes mellitus auftreten. Diese Folgeerscheinungen sind teilweise durch eine große Affinit¨at zu Imidazolin-Rezeptoren zu erkl¨aren [281].
3. Melarsoprol (Mel B, Arsobal® , Aventis AG)
Melarsoprol ist eine melaminhaltige Arsenverbindung und wurde 1949 als trypanozides Medikament vor allem zur Therapie der sp¨aten Phase von T. b. gambiense und T. b. rhodesiense eingefuhrt
¨
[100]. Aufgrund seiner Lipophilie diffundiert
es ungehindert durch zellul¨are Membranen, wird aber zus¨atzlich durch den P2Amino-Purin-Rezeptor in den Parasiten angereichert [20, 21, 54, 55]. Melarsoprol
ist ein Prodrug, in welchem die Reaktivit¨at des trivalenten Arsens des Melarsenoxids mit 2,3-Dimercaptopropanol maskiert wurde [90]. Nach Applikation spaltet sich die Schutzgruppe schnell ab und es entsteht freies Melarsenoxid (Ab-
18
1. Einleitung
bildung 1.3), welches schnell und reversibel an Serumproteine insbesondere an
Thiole bindet, unter anderem an Trypanothion [76, 145]. Auf diese Weise konnen
¨
wichtige Stoffwechsel- und Transportfunktionen inhibiert werden. Wahrscheinlich fuhrt
¨
ein Zusammenspiel aus Trypanothionerschopfung
¨
und Hemmung der
Trypanothionreduktase zum Zelltod (Abbildung 1.5, vide infra) [90,93]. Trypanothion und Trypanothionreduktase sind die Grundbausteine des Redoxstoffwechsels der Trypanosomatiden [92, 150] und ersetzen das Glutathion/Glutathionreduktase-Paar in Pro- und fast allen Eukaryoten [91]. Da Melarsoprol in Wasser
nahezu unloslich
¨
ist, wird es intravenos,
¨ in Propylenglykol gelost,
¨ verabreicht.
Propylenglykol fuhrt
¨
jedoch h¨aufig zu Irritationen im Gewebe. Daruber
¨
hinaus
verursacht Melarsoprol in 5 % bis 10 % der F¨alle eine akute Enzephalopathie, wobei die H¨alfte der F¨alle todlich
¨
verl¨auft [90, 200]. Weitere Nebenwirkungen sind
¨
Ubelkeit, periphere Neuropathie, Gelenkschmerzen und Thrombophlebitis [90].
H
N
N
S
As
S
H
N
OH
O
N
N
H2N
As
N
H2N
N
N
NH2
Melarsoprol
NH2
SH
HS
Melarsenoxid
OH
2,3-Dimercaptopropanol
H
N
Das Grundgerüst dieser Arzneistoffgruppe
wird als Melarsen (Melaminylphenyl-Arsen) bezeichnet
As
N
N
NH2
N
NH2
Abbildung 1.3: Spaltung von Melarsoprol in das therapeutisch wirksame Melarsenoxid.
4. Eflornithin (Difluormethylornithin (DMFO), Ornidyl® , Aventis AG)
Eflornithin wurde in den fruhen
¨
80er Jahren ursprunglich
¨
zur Krebstherapie entwickelt, jedoch in der klinischen Prufungsphase
¨
gegen neoplastische Erkrankungen als zu toxisch eingestuft [22, 26]. Es erwies sich jedoch im Stadium II
der Westafrikanischen Trypanosomiasis als wirksam und ist seit 1990 zur Therapie der HAT zugelassen. Nach seiner Einfuhrung
¨
in die Therapie gl¨anzte es
durch seine Wirksamkeit und bekam den Beinamen “Resurrection Drug”, das
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases”
19
“Auferstehungsmedikament” [253]. Eflornithin ist als Ornithin-Analogon ein irreversibler Inhibitor des Enzyms Ornithin-Decarboxylase (ODC) im PolyaminBiosyntheseweg [170]. Die Folgen der Hemmung sind ein Verlust an Putrescin
und Spermidin und letztendlich eine Verringerung des Trypanothion-Spiegels
(Abbildung 1.5, vide infra) [90]. Die Arzneistoffaufnahme geschieht sowohl uber
¨
passive Diffusion als auch uber
¨
Transporter [24, 207]. Trotz einer a¨ hnlichen Affinit¨at zur Ornithin-Decarboxylase in S¨augetierzellen wirkt Eflornithin spezifisch
auf Trypanosomen aufgrund einer geringeren Replikationsrate der OrnithinDecarboxylase [206]. In vitro wirkt Eflornithin zytostatisch [51]. Zur Beseitigung
der Blutstromformen in vivo ist somit ein intaktes Immunsystem notwendig,
denn nichtteilungsf¨ahige Trypanosomen konnen
¨
ihre antigene Oberfl¨ache nicht
mehr a¨ ndern und sind somit immunologisch angreifbar [90]. Die Nebenwirkungen sind relativ gering, obwohl es zur Beeinflussung der Blutbildung kommen
kann.
5. Nifurtimox (Lampit® , Bayer AG)
Nifurtimox besitzt eine Nitrofuran-Struktur und wurde in den 60er Jahren auf
den Markt gebracht. Die Aufnahme erfolgt wahrscheinlich durch passive Diffusion [49]. Der Wirkmechanismus beruht auf einer periodischen Reduktion und
Oxidation der Nitrogruppe am Furangerust
¨ (Abbildung 1.4). Durch ein Flavoenzym wird zun¨achst in einer Einelektronenreduktion das Radikalanion gebildet. Dieses reagiert nachfolgend mit molekularem Sauerstoff zu SuperoxidAnionen, die unter Dismutation Wasserstoffperoxid produzieren [80, 221]. Der
letzte Schritt wird durch das in allen aeroben Zellen gegenw¨artige kupferhaltige Enzym Superoxid-Dismutase (SOD) katalysiert. Dieser oxidative Stress, verursacht die Zerstorung
¨
zellul¨arer Komponenten wie DNA, Membranlipide und
Proteine. S¨augetierzellen haben zwar im Vergleich zu Parasiten einen besseren
Schutz gegenuber
¨
oxidativer Zerstorung,
¨
dennoch sind Nebenwirkungen, wie
neurologische Sch¨aden extrem h¨aufig und fuhren
¨
bei 50 % der Patienten zum
Abbruch der Therapie [49, 90].
R NO2
Flavoenzym
.
.
R NO2 - + O2
.
.
O2 - + O2 - + 2H +
.
R NO2 -
R NO2 + O2 SuperoxidDismutase (SOD)
H2O2 + O2
Abbildung
1.4:
Enzymkatalysierte REDOX-Reaktion
der Nitrogruppe des Nifurtimox und Bildung von Superoxiden und Wasserstoffperoxid.
20
1. Einleitung
1.1.2.3 Kombinationstherapie
Da derzeit kein neues Medikament in Sichtweite ist, tendiert die Behandlungsstrategie zunehmend zur Kombinationstherapie. Besonders geeignet sind dabei Melarsoprol, Eflornithin und Nifurtimox, die alle drei den Trypanothion-Spiegel beeinflussen - entweder durch Hemmung der Trypanothion-Produktion, durch Eingriff in des
dazugehorige
¨
REDOX-System (durch oxidativen Stress gebildetes DNA-, Lipid- oder
Wasserstoffperoxid und gebildeter Radikale wird Trypanothion zu Trypanothiondisulfid oxidiert) oder durch Inhibition der Trypanothion-Reduktase (Abbildung 1.5). Ihre
synergistische Wirkung konnte im Tiermodell gezeigt werden und eine Kombinationstherapie von Nifurtimox-Eflornithin wurde bereits bei Patienten, die sich gegenuber
¨
jeglicher Therapie unempfindlich zeigten, durchgefuhrt
¨
[137, 246].
S
As
S
H
N
N
H
N
OH
N
H2N
As
N
H2N
N
N
NH2
NH2
P2-PurinTransporter
Ornithin
DMFO
ODC
Nifurtimox
Putrescin
Melarsenoxid
Spermidin
COO-
TRYS
REDOX-System
ROOH
2 RS
.
O
H
N
+ H3N
+ H3N
COO-
O
SH
SH
O
RSSR
H
N
N
H
O
Trypanothion
H
N
N
H
Weitere Targets ?
NH2+
O
COO-
N
H
O
+ H3N
H2N
TRYX
TRYP
ROH+
H2O
O
N
NADP+
N
N
RSSR 2 RSH
?
TRYR
N
H2N
NADPH + H+
COO-
Trypanothiondisulfid
O
COO-
N
H
S
S
O
+ H3N
O
N
H
N
H
+H3N
N
H
H
N
O
NH2+
H
N
O
O
N
H
Mel T
H
N
O
NH2+
H
N
O
O
O
S
As
S
O
N
H
COO-
H
N
+ H3N
H
N
O
N
H
Abbildung 1.5: Synergie-Effekt von Eflornithin (DMFO), Melarsoprol und Nifurtimox (Modell nach
Referenz [90]). Alle drei Arzneistoffe beeinflussen den Trypanothion-Metabolismus. Abkurzungen:
¨
ODC, Ornithin-Decarboxylase; TRYP, Tryparedoxin-Peroxidase; TRYR, Trypanothion-Reduktase; TRYS,
Trypanothion-Synthetase; TRYX, Tryparedoxin.
1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva
21
1.1.2.4 ”Public-Private-Partnership”
Um die Jahrtausendwende kam die Arzneimittelforschung und -entwicklung fur
¨ “Neglected Diseases” nahezu zum Erliegen [199, 267]. Zwischen 1975 und 1999 kamen
1393 neue Medikamente auf den Markt. Davon waren nur 13 gegen Tropenkrankheiten [268]. Das Interesse an der Arzneimittelentwicklung schwand mit dem Ende
¨
des Kolonialismus, den Anderungen
in der Firmenpolitik der pharmazeutischen Industrie, den steigenden Kosten fur
¨ die Arzneimittelforschung und -entwicklung und den
zunehmenden Auflagen [72]. Argumente der Unrentabilit¨at Produkte gegen Krankheiten fur
¨ eine Bevolkerungsgruppe
¨
ohne Kaufkraft zu entwickeln, fuhrten
¨
zunehmend zu einer ablehnenden Haltung seitens der Industrie. Ende der 90er Jahre wurde
ein Produktionsstopp fur
¨ die Medikamente gegen die Afrikanische Schlafkrankheit
angekundigt.
¨
Gleichzeitig wurde Eflornithin als Bestandteil einer Enthaarungscreme
®
(Vaniqa , Bristol-Myers-Squibb) zur Behandlung des Damenbartes eingefuhrt.
¨
Eine
Produktion als Injektionslosung
¨
wurde zun¨achst weiterhin abgelehnt [252]. Erst intensive Lobbyarbeit unter der Fuhrung
¨
der Nicht-Regierungsorganisation “M´edecins sans
Fronti`eres”, Tr¨ager des Friedensnobelpreises 1999, bewog Entscheidungstr¨ager der
¨
pharmazeutischen Industrie zu einer Anderung
ihrer Firmenpolitik. Im Mai 2001 wur¨
de zwischen dem Aventis-Konzern und der Weltgesundheitsorganisation eine Ubereinkunft getroffen, in der sich Aventis zu einer Neuproduktion und einer kostenlosen Bereitstellung von Pentamidin, Melarsoprol und Eflornithin fur
¨ die Therapie der
Schlafkrankheit verpflichtet. Die BAYER AG schloss sich kurze Zeit sp¨ater mit ihren
beiden Produkten Suramin und Nifurtimox dieser Vereinbarung an. Diese “PublicPrivate-Partnership” (PPP) unterliegt derzeit einer Evaluation durch die Partner. Es
ist von entscheidender Bedeutung fur
¨ Kontrollprogramme der Schlafkrankheit und
fur
¨ Patienten in Afrika, weiterhin verl¨asslich mit diesen essenziellen Medikamenten
rechnen zu konnen.
¨
Die Bedeutung der Public-Private-Kooperationen liegt in der Verteilung von Schlusselfunktionen
¨
auf Universit¨aten, Pharmaindustrie und “Not-forprofit-Organisationen” [72]. Beispiele fur
¨ kurzlich
¨
entwickelte PPPs mit dem Ziel der
antiparasit¨aren Arzneistoffauffindung sind: “Medicines for Malaria Venture” (MMV),
“Drugs for Neglected Diseases Initiative” (DNDi) und das “Institute for One World
Health” (IOWH).
1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva
1.2.1 ”hits”, “leads” und Arzneistoffkandidaten
Der einfachste Weg zur Auffindung neuer Antiinfektiva ist die sogenannte LabelExtension-Strategie. Sie wird h¨aufig bei der Suche nach Arzneimitteln gegen tropische Erkrankungen angewandt, deren Forschung nicht von kommerzieller Seite an-
22
1. Einleitung
getrieben wird. Bei dieser Strategie wird die Indikation bereits bestehender Arzneimittel zur Therapie anderer humaner oder animaler Erkrankungen ausgeweitet, wodurch vor allem die Forschungs- und Entwicklungskosten erheblich gesenkt werden
konnen
¨
[208, 225, 280]. Erfolgreich war diese Strategie z. B. bei Praziquantel, einem ursprunglich
¨
als Anthelminthikum zugelassenen Arzneimittel, das nun in der Therapie
der Schistosomiasis eine wichtige Rolle spielt [132, 190].
Die Auffindung neuer Arzneistoffe ist jedoch zunehmend notwendig. Ihr Weg ist ein
iterativer Prozess und verl¨auft wie in Abbildung 1.6 dargestellt uber
¨
viele Zwischenstufen.
Testung auf Wirksamkeit und Toxizität
“Target- and cellbased screening“
Potenzielle
Inhibitoren
Tiermodell, ADME,
Toxizität
“hits“
“leads“
Detailliertere
Untersuchungen,
Optimierung
Arzneistoffkandidaten
Klinische Studien
Iterative medizinische Chemie
Optimierung von Wirkung und
pharmazeutischer Eigenschaften
Arzneistoff
Abbildung 1.6: Stadien der Arzneistoffauffindung, modifiziert nach [208]
Der Prozess der Arzneimittelauffindung impliziert die Synthese, die Identifizierung
von Vorstufen moglicher
¨
Arzneistoffkandidaten, die physikalisch-chemische Charakterisierung und die Testverfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit
potenzieller Wirksubstanzen. In den letzten Jahren konnten auf dem Gebiet der Synthese große Fortschritte erzielt werden. Die Methode der kombinatorischen Chemie
mit systematischer Kombination verschiedener Bausteine und die Methode der “random chemistry”, einem Verfahren, bei welchem Substanzen nach dem Zufallsprinzip
aus γ-bestrahlten Ausgangs-Cocktails entstehen, ermoglichen
¨
die schnelle Erstellung
großer Substanzbibliotheken. Doch unabh¨angig davon ob die Suche nach neuen Leitstrukturen von Naturstoffen, Synthese, kombinatorischer Synthese oder “random chemistry” ausgeht, der Prozess der Arzneistoffauffindung erfordert immer vollautomati-
1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva
23
sierte In-vitro-Testsysteme an Enzymen, Rezeptoren, Bakterien und Zellen, sogenannte
High-Throughput-Screening-Verfahren (HTS). Die Testung der Substanzen auf Wirksamkeit erfolgt dabei entweder speziell an einem bestimmten Target (”target-basedassay”) oder direkt bezuglich
¨
des ganzen Erregers (”whole-cell-based-assay”). Substanzen, welche in vitro gegen ganze Zellen eine Aktivit¨at ≤ 1 µM zeigen und diese
bezuglich
¨
des Erregers mindestens 10fach st¨arker ist als gegenuber
¨
S¨augetierzellen,
werden als “hits” bezeichnet [190, 208]. Diese sind Kandidaten fur
¨ weitere Testungen
in Tiermodellen der Krankheit. In diesem Stadium fließen bereits Untersuchungen zu
physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Loslichkeit,
¨
Permeabilit¨at, Lipophilie, pka
und Stabilit¨at ein, aus deren Profilen Vorhersagen zu den pharmazeutischen Eigenschaften Adsorption, Distribution, Metabolismus und Elimination (ADME) gewonnen
werden konnen.
¨
Substanzen die sich in Tiermodellen aktiv zeigen und zus¨atzlich eine hohe Selektivit¨at der Wirkung, gute Verfugbarkeit,
¨
lange Wirkdauer und eine gute
Verstoffwechslung bei geringer Toxizit¨at zeigen, bezeichnet man als “leads”. In iterativen Schritten werden diese Leitsubstanzen bezuglich
¨
Wirkung und pharmazeutischer
Eigenschaften (ADME) optimiert. Hierzu werden verschiedene Strukturabkommlinge
¨
einer Leitstruktur getestet, um anhand von Struktur-Wirkungs-Beziehungen (”structure activity relationship”, SAR) Zusammenh¨ange zwischen Struktur und pharmakodynamischer und -kinetischer Eigenschaften zu analysieren. Erreicht eine Substanz ein
Stadium, in dem sie an Patienten erprobt werden kann, spricht man von einem Arzneistoffkandidaten. Ab hier beginnen die klinischen Studien.
Bisher basierte die Testungs-Strategie haupts¨achlich auf Target-Based-HTS-Verfahren
(sogenannte Piggy-Back-Strategie) [190]. Als besonders gunstig
¨
erwies es sich, wenn
das mikrobielle Target auch zur Therapie anderer Erkrankungen relevant ist und somit zur Testung die gleichen Ausgangsverbindungen eingesetzt werden konnen
¨
[105].
Die Cystein-Protease, einem vielversprechenden Target in der Forschung antitrypanosomaler Arzneistoffe wurde z. B. ursprunglich
¨
fur
¨ die Entwicklung von Inhibitoren zur
Therapie der Osteoporose eingesetzt [225]. Zu bemerken ist, dass die aus der ParasitenTestung hervorgegangenen Struktur-Wirkungs-Beziehungen, sich von denen der ursprunglichen
¨
Indikation stark unterscheiden.
Trotz aller Bemuhungen
¨
erwies sich diese Strategie auf dem Gebiet der Antiinfektiva
bis jetzt als nicht sehr erfolgreich [112, 195]. Schwierigkeiten zeigten sich vor allem in
der Korrelation zwischen Enzyminhibition und der Aktivit¨at gegenuber
¨
ganzen Erregerzellen [19, 165]. Ursachen hierfur
¨ sind entweder die schlechte Permeabilit¨at der
Testsubstanzen durch die Zellmembran intakter Zellen oder die fehlende Relevanz des
gew¨ahlten Targets [190]. So gibt es abgesehen vom Cystein-Protease-Inhibitor K777,
welcher sich zur Therapie der Chagas-Krankheit in Entwicklung befindet, derzeit keine Substanz, die als Antiinfektivum aus Target-Based-Screening-Verfahren hervorgegangen ist. Deshalb gewinnen “in-vitro-whole-cell-bioassays” zunehmend an Bedeu-
24
1. Einleitung
tung [190, 208].
1.2.2 ”In-vitro-whole-cell-bioassays”
Die meisten Bioassays an ganzen Zellen basieren auf der Beobachtung der Zellproliferation bei Exposition mit Testsubstanzen in Flussigkultur,
¨
sogenannte Dilutionsverfahren. Die Auswertung erfolgt in der Regel mittels optischer Spektroskopie im visuellen
Wellenl¨angenbereich. Als “Indikator” dient entweder die Zunahme der Zellzahl an
¨
sich, oder die Anderung
der Zusammensetzung des Kulturmediums. Die folgenden
vier Techniken sind die auf der Basis der Lichtdetektion am h¨aufigsten angewandten
Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit:
• Turbidimetrie: Tritt ein Lichtstrahl durch eine Zellsuspension, so wird er an den
Zellen gestreut und abgeschw¨acht. Diese Lichtabschw¨achung ist in erster N¨aherung zur Zellzahl proportional und wird uber
¨
die Extinktion bzw. die optische
¨
Dichte (OD) quantifiziert. Ublicherweise
wird der OD-Wert bei 600 nm zur Bestimmung des Wachstumszustandes gemessen [23].
(Siehe auch Abschnitt 3.2.2.4)
¨
• Nephelometrie: Ahnlich
wie in der Turbidimetrie wird die Lichtstreuung an Zellen zur Bestimmung der Zellzahl genutzt. Jedoch wird in diesem Fall nicht die
Extinktion gemessen, sondern die Intensit¨at des seitlich austretenden Streulichtes [182]. H¨aufig verwendet wird die Laser-Nephelometrie [204].
• Kolorimetrie (auch Absorptionsphotometrie genannt): Eine lichtabsorbierende
¨
Substanz wird als Indikator stoffwechselbedingter Anderungen
w¨ahrend der
Zellproliferation eingesetzt. Seine spektrale Charakteristik ist in der Regel pHoder REDOX-sensitiv und seine Konzentration kann durch Messung der Absorption bei einer bestimmten Wellenl¨ange nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ermittelt werden. Der Indikator kann entweder intrazellul¨are oder extrazellul¨are
¨
Anderungen,
hervorgerufen durch Mediumverbrauch und Stoffwechselproduktion, indizieren. H¨aufig verwendet werden AlamarBlue, Tetrazoliumsalze oder
Phenolrot [180, 189].
• Fluorimetrie: Diese Methode ist der Kolorimetrie sehr a¨ hnlich. Der Unterschied
beruht lediglich auf dem Einsatz von Fluorophoren als Indikatoren (AlamarBlue
oder BCECF-AM) und einer fluorimetrischen Detektion [191, 217].
Neben diesen optischen Methoden werden in bekannten Literaturwerken [204] drei
weitere Methoden zur Bestimmung der Zellproliferation als brauchbar beschrieben.
Zwei dieser Methoden beruhen auf der Quantifizierung der Stoffwechselaktivit¨at.
Zum einen eignet sich dazu die Radiometrie. Hier kann entweder die Freisetzung
1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva
25
von radioaktiv markiertem 14 CO2 (im Bac-Tec-Verfahren realisiert) oder die Aufnahme
radioaktiv markierter Nukleotide wie [3 H]-Thymidin, [3 H]-Hypoxanthin oder Aminos¨auren gemessen werden [47, 78, 214]. Solche Methoden erfordern im Medium eine radioaktive Kohlenstoff- bzw. Wasserstoffquelle, wodurch ihre Durchfuhrung
¨
aufgrund gesetzlicher Auflagen problematisch ist. Eine andere Moglichkeit
¨
Stoffwechselproduktion und unter anderem CO2 -Freisetzung zu messen, stellt die Kalorimetrie dar.
Hier wird mit einem Infrarot-Messsystem die durch den mikrobiellen Stoffwechsel
freiwerdende W¨arme gemessen, wodurch ein Ruckschluss
¨
auf die Zahl der Mikroorganismen moglich
¨
ist.
Letztendlich eignet sich noch die Impedanzmessung. Gemessen wird der Widerstand
gegen den elektrischen Strom in der Zellkultur. Eine Verminderung der Impedanz ist
eine Folge von Zellvermehrung und -stoffwechsel, denn N¨ahrstoffverzehr und Stoffwechselprodukte a¨ ndern die Komposition des Mediums.
All diese Detektionsmethoden konnen
¨
zur Auswertung von Testsystemen zur Bestimmung von Zytotoxizit¨at angewandt werden. Sie wurden ursprunglich
¨
zur Messung
eines kleinen Probenumfanges entwickelt und ihre Anwendung in High-ThroughputScreening-Verfahren mit Testungen von mehreren 100.000 Substanzen pro Tag ist
durch ihre Technik beschr¨ankt.
1.2.3 ”High-throughput-screening” (HTS)
Schlusselfaktoren
¨
fur
¨ Testsysteme mit großer Durchsatzzahl, sogenannte HighThroughput-Screening-Verfahren sind Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung. Diese Kriterien sind durch den gesamten etablierten Testablauf von Probenvorbereitung bis Detektion festgelegt. Zur Realisierung von Hochdurchsatz sollte
das Testverfahren aus nur wenigen einfachen Schritten bestehen, die vollautomatisierbar sind. Nicht selten werden Arzneistoff-exponierte Kulturen unter Einsatz von Robotern in Mikrotiterplatten mit 1536-2080 Vertiefungen simultan pr¨apariert. Die Miniaturisierung ist dabei maßgeblich zur Senkung der Kosten fur
¨ Verbrauchsmaterialien und
Reagenzien. Zur parallelen Auswertung eignet sich vor allem die optische Detektion.
Ob in der Spektroskopie oder in der Bildgebung, die Turbidimetrie, Fluorimetrie und
Kolorimetrie sind die am h¨aufigsten angewandten Verfahren. Diese Art der Detektoren ist relativ kostengunstig
¨
und realisiert in einem “array” konnen
¨
sie die einzelnen
Proben separat aufzeichnen. Jede Methode erfordert jedoch fur
¨ den Einsatz in HighThroughput-Screening-Verfahren ein individuell angepasstes Design.
Konventionell wird zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit potenzieller Antiinfektiva das Mikrodilutionsverfahren nach DIN-Vorschrift (DIN 58940) [2] angewandt. Es handelt sich dabei um ein Dilutionsverfahren mit turbidimetrischer Auswertung, das in Mikrotiterplatten durchgefuhrt
¨
wird und die antimikrobielle Wirkung
26
1. Einleitung
durch den MIC(minimum inhibitory concentration)-Wert charakterisiert. Dieser entspricht der Wirkstoffkonzentration, ab welcher gerade kein sichtbares Zellwachstum,
d. h. keine Trubung
¨
mehr zu erkennen ist. In anderen antimikrobiellen Testverfahren
auf der Basis der Fluorimetrie und Kolorimetrie wird die Aktivit¨at einer Substanz zumeist als ED50 (effective dose, 50%)-Wert angegeben. Die Variable wird h¨aufig auch
als IC50 (inhibitory concentration, 50%)- oder EC50 (effective concentration, 50%)-Wert
bezeichnet und definiert diejenige Wirkkonzentration, die zu einer halbmaximalen Inhibition oder Abtotung
¨
fuhrt.
¨
Sowohl bei der turbidimetrischen Detektion als auch bei den meisten fluorimetrischen
oder kolorimetrischen Methoden wird jedoch die Gesamtzellzahl erfasst, wodurch
eine Differenzierung der antimikrobiellen Wirksamkeit in statisch und toxisch nicht
moglich
¨
ist. In der Bakteriologie erfolgt diese meist in einem zweiten Schritt durch
Ausz¨ahlung koloniebildender Einheiten (colony forming units, CFU) auf Agarplatten,
in der Parasitologie dagegen durch mikroskopische Betrachtung und Untersuchung
der Erreger auf Beweglichkeit. Beide Verfahren sind sehr zeitintensiv und es besteht
Bedarf an schnellen Testverfahren mit hoher Aussagekraft und Differenzierbarkeit.
Ein weiterer Nachteil der optischen Detektion eines Probenarrays in Mikrotiterplatten
ist die fehlende Moglichkeit
¨
senkrecht zum einfallenden Licht zu detektieren. Dadurch
sind nephelometrische Methoden ausgeschlossen und fluorimetrische stark limitiert.
Hinzu kommt, dass die Detektion des Lichtes aus einer Vertiefung durch Streulicht
aus der Umgebung gestort
¨ werden kann, wodurch Interesse an alternativen Detektionsmethoden besteht.
27
Kapitel 2
Problemstellung und Ziele der Arbeit
Wie in Kapitel 1 bereits beschrieben ist die Arzneimitteltherapie der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis problematisch. Sie ist auf dem Stand der 60er Jahre stehen
geblieben und es existieren keine probaten neuen Arzneistoffe. Aufgrund fehlender
Rentabilit¨at zeichnet sich auf dem Gebiet der bakteriellen Infektionserkrankungen ein
a¨ hnlicher Trend ab. Durch zunehmende Einstellung der Arzneistoffforschung und entwicklung ist auch hier die Therapiesicherheit gef¨ahrdet.
Die notwendige Auffindung neuer Arzneimittel wird zunehmend in Public-PrivateKooperationen realisiert und erfordert neben der Synthese neuer Verbindungen
zuverl¨assige High-Throughput-Screening-Verfahren zur Identifizierung potenzieller
Leitstrukturen.
Diese Arbeit war eingebettet in den SFB 630, dessen Ziel in der “Erkennung, Gewinnung und funktionalen Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten” lag.
Auf der Suche nach neuen Leitstrukturen zur Therapie der humanen Afrikanischen
Trypanosomiasis sollte w¨ahrend dieser Arbeit
• ein robustes In-vitro-High-Throughput-Screening-Verfahren an den Blutstromformen des TC 221-Stammes von Trypanosoma brucei brucei etabliert werden, welches sich zum “screening” großer Substanzbibliotheken eignet.
• eine Vielzahl von Substanzen, die im Rahmen der verschiedenen Teilprojekte
synthetisiert und isoliert wurden, auf ihre Wirksamkeit gegen Trypanosomen getestet werden.
• Struktur-Wirkungs-Beziehungen analysiert werden, die zur weiteren Optimierung der antiparasit¨aren Wirkung bereits getesteter Substanzen beitragen sollen.
Neben der zielgerichteten Suche nach neuen Antiinfektiva standen aber auch die Technologie und die Methodik an sich im Interesse des SFBs. Zur Evaluation der antiinfektiven Wirksamkeit neu synthetisierter Substanzen sollte nicht nur auf bekannte Methoden zuruckgegriffen
¨
werden, sondern auch die Innovationen der letzten Jahre auf
28
2. Problemstellung und Ziele der Arbeit
dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (capillary elektrophoresis, CE) und der magnetischen Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR) zur Entwicklung neuer
“in-vitro-whole-cell-bioassays” genutzt werden.
Ziel war es Alternativen und Erg¨anzungen zum Mikrodilutionsverfahren nach DIN
(DIN 58940), dem konventionell zur Testung an Bakterien angewandten HighThroughput-Verfahren, zu entwickeln. Dieses Verfahren beruht ausschließlich auf der
Bestimmung der Gesamtzellzahl einer Bakterienkultur unter Exposition verschiedener
Testsubstanzen mittels optischer Detektion und erlaubt keine Aussage uber
¨
die Art der
antimikrobiellen Wirkung . Erst in einem zeitaufw¨andigen zweiten Schritt kann durch
Ausz¨ahlen koloniebildender Einheiten zwischen bakteriostatischer und bakterizider
Wirksamkeit unterschieden werden.
In der Kapillarelektrophorese boten vor allem die Arbeiten von Armstrong und Mitarbeitern neue Perspektiven [13–15, 77, 240]. Es gelang sowohl die simultane kapillarelektrophoretische Trennung, Identifizierung, Quantifizierung und Charakterisierung von Bakterien und deren Agglomeraten, ohne die Mikroben bei der Messung
signifikant zu sch¨adigen [86], als auch die Aufzeichnung der Elektropherogramme
mittels Fluoreszenz-Detektion zur Unterscheidung lebender und toter Bakterienzellen
nach Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid. Mit der Kapillarelektrophorese
bestand somit ein Potenzial, durch Trennung von Agglomeraten und Ketten unter¨
schiedlicher Große
¨ bakterienspezifische “fingerprints” zu erstellen und deren Anderung unter dem Einfluss zytotoxischer Substanzen im Kontext mit der lebend/totRate der Bakterienpopulation zu diskutieren. Dadurch konnte
¨
innerhalb 15 Minuten
die Wirksamkeit der Testsubstanzen differenziert bestimmt werden. Da die CE Mikroben gleichzeitig trennen und quantifizieren kann, sollte der Einfluss antiinfektiver
Wirksubstanzen in einem Ansatz messbar sein, wodurch der Durchsatz des Testverfahrens erheblich gesteigert werden kann. Da bisher die antibiotische Wirksamkeit mittels
SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung noch nicht bestimmt worden ist, waren Messungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Leseger¨at (FMR) mit eingeschlossen.
Der Aufbau des Test-Verfahrens auf der Grundlage der CE implizierte:
• Die zielorientierte Auswahl verschiedener Bakterienspezies und deren Kulturaufbau.
• Die Untersuchung elektrophoretischer Eigenschaften von Mikroben und die
Analyse physikalisch-chemischer Einflussfaktoren zum Verst¨andnis der kapillarelektrophoretischen Mikroben-Analyse. Da zu diesem Zeitpunkt im Arbeitskreis
noch keine Erfahrung in der kapillarelektrophoretischen Charakterisierung von
Biokolloiden bestand, musste zun¨achst eine dafur
¨ geeignete CE-Methode etabliert werden.
29
• Die Standardisierung einer CE-Methode zur Trennung, Identifizierung, Charakterisierung, Quantifizierung von Mikroorganismen und die Erstellung charakteristischer “fingerprints”.
• Die Prufung
¨
von Moglichkeiten
¨
und Grenzen der CE-Methode.
• Die Validierug der Fluoreszenzmarkierung von Bakterien mit den beiden DNAMarkern SYTO9 und Propidiumiodid am FMR und an der CE (mit Laserinduzierter-Fluoreszenz-Detektion, LIF-CE) zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation und zur Bestimmung ihrer lebend/tot-Rate.
• Die Standardisierung der Zytotoxizit¨atsbestimmung verschiedener Antibiotika
mit unterschiedlichem Wirkmechanismus mittels FMR und LIF-CE.
Eine weitere nicht invasive Methode zur Untersuchung von Zellkulturen stellt die
magnetische Kernresonanz dar. Bereits 1972 wurden die ersten Studien zum Metabolismus an lebenden Hefezellen mittels NMR-Spektroskopie durchgefuhrt
¨
[85]. Hinzu kommt, dass die NMR-Spektroskopie zunehmend zum “screening” von Wirkstoffen (Ligand-Protein-Wechselwirkungen [114]) und zur klinischen Untersuchung von
Wirkstoffen gegen Infektionen in verschiedenen Wirtszellen in vitro und in vivo eingesetzt wird [79, 120]. Auch konnte im Bildgebungsexperiment die transversale Relaxation als NMR-Parameter identifiziert werden, welcher sensitiv auf wachstumsbedingte
¨
Anderungen
in Bakterienkulturen reagiert [192].
Von diesen Tatsachen ausgehend, sollte ein Test-Verfahren potenzieller Wirkstoffe
auf Basis der CPMG-pr¨aparierten magnetischen Kernresonanztomographie entwickelt
werden. Die Etablierung der Methode beinhaltet:
• Die Untersuchung der Anwendungsbreite der T2 -Parametrisierung des mikrobiellen Wachstums.
• Die Quantifizierung und Interpretation der einzelnen Beitr¨age zur wachs¨
tumsbedingten T2 -Anderung
durch Kombination von NMR-Spektroskopie undBildgebung, wobei Untersuchungen zum Energie- und Aminos¨aurestoffwechsel
und zur Proteinkonzentration enthalten sind.
• Die Quantifizierung der antibiotischen Wirksamkeit.
Sowohl bei der CE- als auch bei der NMR-Methode sollte durch Vergleich der Daten
mit denen aus konventionellen mikrobiologischen Standardtechniken Anwendungsbreite und Grenzen aufgezeigt werden.
30
3. Theoretische Grundlagen
Kapitel 3
Theoretische Grundlagen
3.1 Mikroorganismen
Mikroorganismen, auch Mikroben genannt, gelten als die kleinsten, mikroskopisch
darstellbaren Lebewesen. Zu ihrer Gruppe z¨ahlen unter anderem Bakterien, Algen,
Pilze, Hefen und Protozoen. Viren werden trotz ihrer geringen Große
¨ nicht den Mikroorganismen zugeordnet. Sie sind nicht in der Lage sich selbstst¨andig zu reproduzieren,
sondern sind auf Stoffwechselleistungen ihrer Wirtszellen angewiesen. Unter den Mikroorganismen gibt es zwei Grundformen der Zellorganisation: Pro- und Eukaryoten,
deren Unterscheidungsmerkmale in der Zellkompartimentierung liegen [101].
Da im Rahmen dieser Arbeit analytische Verfahren fur
¨ Bakterien angewandt und entwickelt werden, wird auf die Gruppe der Prokaryoten insbesondere eingegangen.
3.2 Prokaryoten
Die Familie der Prokaryoten definiert sich durch einen freien nicht von einer Kernmembran umgebenen Zellkern, dem sogenannten Nucleoid, welcher aus einem zirkul¨aren gekn¨auelten DNA-Molekul
¨ besteht. Die Zelle bildet in der Regel keine Kompartimentierung in Organellen aus, so dass sie im Wesentlichen aus Zellwand, Cytoplasmamembran, Cytoplasma mit Ribosomen und Nucleoid besteht. Mitglieder dieser
Familie sind Bakterien (Bakteria) einschließlich Actinomyceten und Cyanobakterien,
welche zur Gruppe der Archaeen gehoren.
¨
Traditionell wird die Bezeichnung “Bakterien”, abgeleitet vom griechischen Wort “bakterion”= St¨abchen, fur
¨ alle zu den Prokaryoten gehorenden
¨
Organismen verwendet. Die meisten Bakterien besitzen eine Große
¨
zwischen 1 und 5 µm und liegen damit im oberen Großenbereich
¨
von Kolloiden [129].
Die Anwendung analytischer Methoden auf Bakterien unterliegt somit den Gesetzen
der Kolloidchemie (Abschnitt 3.2.2).
3.2 Prokaryoten
31
3.2.1 Klassifikation
Bakterien werden h¨aufig aufgrund ihrer Form und Organisation eingeteilt. Die folgenden morphologischen und stoffwechselphysiologischen Gesichtspunkte gelten dabei
als Kriterium [237]:
• Drei Grundformen: Kokken, St¨abchen, Schrauben. Diese Grundformen konnen
¨
einzeln auftreten oder sich zu typischen Formen (Cluster, Ketten) zusammenfugen.
¨
• Vier Haupttypen der Begeißelung: monotrich, monopolar polytrich, bipolar polytrich und peritrich.
• Die Ausbildung von Kapseln und Schleimen, die uberwiegend
¨
aus Polysacchariden und Polypeptiden bestehen.
• Die Lebensweise insbesondere der Stoffwechsel und die Umweltbedingungen
wie N¨ahrstoffe, pH-Wert, Temperatur und Sauerstofftoleranz.
• Der Aufbau der Zellwand, der aufgrund der Gram-F¨arbung identifiziert wird.
Auf die letzten drei Gesichtspunkte wird im nachfolgenden n¨aher eingegangen. Sie
spielen neben der Grundform der Bakterienzelle eine zentrale Rolle bei der Methodenentwicklung zur Charakterisierung verschiedener Bakterienst¨amme mittels Kapillarelektrophorese und MRI (magnetic resonance imaging) und der daraus abgeleiteten
Etablierung von Testsystemen zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit potenzieller Wirksubstanzen.
3.2.1.1 Zellwand
Die Bakterienzellwand determiniert die Form und Festigkeit der Zelle und stellt einen
Schutz vor Pathogenen einschließlich Bioziden und Antibiotika dar [115, 173, 186].
Nach ihrem Verhalten bei dem von C. Gram entwickelten F¨arbeverfahren [110] unterscheidet man zwischen Gram-positiven (blau gef¨arbte) und Gram-negativen (rot
gef¨arbte) Bakterien. Unterschiedliche bakterielle Oberfl¨achenstrukturen sind fur
¨ diese Unterscheidung verantwortlich. Diese sind neben morphologischen Eigenschaften
auch fur
¨ spezifische Immunreaktionen maßgeblich und bestimmen die Oberfl¨achenladung, sowie das Verhalten im elektrischen Feld [77].
3.2.1.1.1 Gram-negative Bakterien
Die Zellwand Gram-negativer Bakterien (Abbildung 3.1) besteht aus einer dunnen
¨
bis
10 nm dicken Mureinschicht (Peptidoglycanlayer, geknupft
¨
aus N-Acetylmuramins¨aure, N-Acetylglucosamin und verschiedenen Aminos¨auren), die von einer zweiten
32
3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.1: Zellwandaufbau
Gram-negativer Bakterien. Charakteristisch ist die dunne
¨
Mureinschicht und die a¨ ußere Membran, deren a¨ ußeres Blatt uber¨
wiegend aus Lipopolysacchariden besteht. Alle anderen Membranen werden von Phospholipiden gebildet. In die Membran
sind Proteine integriert [143].
Zellmembran, der a¨ ußeren Membran (outer membrane, OM) bedeckt ist. Diese ist mit
der Mureinschicht uber
¨
die “outer membrane proteins” (OmpA) und das MureinLipoprotein verbunden. Sie besteht im Wesentlichen aus Lipopolysacchariden (LPS),
Proteinen und Phospholipiden [232]. Viele Proteine so z.B. das OmpF fungieren als Porine, uber
¨
welche Losungen
¨
in die Zelle diffundieren konnen
¨
[222]. Die Lipopolysaccharide, welche aufgrund ihrer pathophysiologischen Wirkung auf den Organismus
auch als Endotoxine bezeichnet werden [82,219], bestehen aus dem Lipoid A (Zytokininduktor), dem Kern-Polysaccharid (Core) und der O-spezifischen Polysaccharidkette
(das O-Antigen) und verleihen den Bakterien in w¨assriger Losung
¨
ihre Oberfl¨achenladung [77].
3.2.1.1.2 Gram-positive Bakterien
Gram-positive Bakterien haben im Vergleich zu den Gram-negativen einen relativ einfachen Zellwandaufbau (Abbildung 3.2b). Sie besitzen eine 20-80 nm dicke Mureinschicht aus bis zu 40 Mureinlagen. In dieser sind verschiedene Lipoteichon- und Teichons¨auren kovalent gebunden. Diese sind meist Polymere aus Ribitol- oder Glycerolphosphaten (Abbildung 3.2a), geknupft
¨
an Glycosyl oder D-Alaninesterresten und
stellen die Haupbestandteile der Zellwand dar. Sie ragen in die Umgebung und aktivieren z.B. das Komplementsystem oder Makrophagen. Daneben sind in der Zellwand
verschiedene Polysaccharide und Proteine zu finden. Letztere sind fur
¨ die Adh¨arenz
und die Pathogenit¨at verantwortlich [232].
3.2 Prokaryoten
33
(a) Strukturen der Glycerin- (b) Charakteristisch ist die Dicke der Mureinschicht, sowie die darin
und Ribitol-Teichons¨aure, mo- kovalent gebundenen Lipoteichon- und Teichons¨auren [143].
difiziert nach [236].
Abbildung 3.2: Zellwandaufbau Gram-positiver Bakterien.
Am Beispiel von E. coli und S. aureus konnte z. B. gezeigt werden, dass die Lipopolysaccharid-Schicht Gram-negativer Bakterien (E. coli) bei gleicher Elektrolytumgebung im
Vergleich zur Peptidoglycan-Schicht Gram-positiver Bakterien (S. aureus) zu einer negativeren Oberfl¨achenladung fuhrt
¨
[151].
3.2.1.2 Stoffwechsel aerober und anaerober Bakterien
Die Lebensweisen von Bakterien sind vielf¨altig und ihre Klassifizierung erfolgt h¨aufig
aufgrund ihrer unterschiedlichen Milieubedingungen wie z. B. der Wasseraktivit¨at, der
N¨ahrstoffe, des pH-Wertes, der Temperatur und der Sauerstofftoleranz. Letztere definiert den Stoffwechseltypus, womit eine Unterscheidung zwischen Aerobiern und Anaerobiern ermoglicht
¨
wird. Der Gesamtstoffwechsel der Bakterien gliedert sich in die
beiden Bereiche Katabolismus, der Energiegewinnung, und den Anabolismus, in dem
aus einfachen Vorstufen biologische Makromolekule
¨ unter Energieverbrauch synthetisiert werden. Fur
¨ den Aufbau der Zellsubstanz sind unter anderem Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Wasserstoff, Phosphor, Schwefel, Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen
notwendig. Je Bakterium konnen
¨
dabei unterschiedliche Quellen verwendet werden.
Die katabolen Reaktionen und damit die Verarbeitung organischer N¨ahrsubstrate zur
Herstellung der Grundbausteine fur
¨ die Synthese der Zellsubstanz erfolgt uber
¨
eine
vielf¨altige Reihe enzymatischer Prozesse. Glucose stellt eine der wichtigsten C-Quellen
der katabolen Reaktionen dar [237]. Aerobe Bakterien benotigen
¨
fur
¨ die Oxidation des
34
3. Theoretische Grundlagen
Zuckers Sauerstoff, weisen eine hohe Energieausbeute auf und oxidieren das organische Substrat vollst¨andig zu CO2 und H2 O. Fur
¨ anaerobe Bakterien hingegen kann der
Sauerstoff toxisch sein. Sie spalten den Zucker nur enzymatisch und haben dabei eine
sehr geringe Energieausbeute. Bei der Fermentation entstehen je nach Art der Spaltung G¨arungsendprodukte wie Ethanol, Milchs¨aure, Essigs¨aure, Propions¨aure, Ameisens¨aure, Bernsteins¨aure.
3.2.2 Kolloidchemie
Das Wort Kolloid stammt aus dem Griechischen “κoλλα”=Leim, womit eine charakteristische Eigenschaft der Kolloide, eine trube,
¨
leimartige Beschaffenheit aufzuweisen,
beschrieben wird. Dem Vorschlag der “International Union of Pure and Applied Chemistry” (IUPAC) von 1971 folgend, werden Kolloide als Objekte definiert, bei denen
mindestens eine Dimension im Bereich von 1 nm bis 1000 nm liegt, womit Bakterien
eingeschlossen sind [128]. Aus dieser Dimension ergeben sich Eigenschaften, die das
Verhalten von Bakterien im Strahlengang, in flussigem
¨
Medium oder im elektrischen
Feld, bestimmen. Die geringe Dimension fuhrt
¨
z. B. zu einem sehr großen Verh¨altnis von Oberfl¨ache zu Volumen, so dass die Oberfl¨acheneigenschaften gegenuber
¨
den
Festkorpereigenschaften
¨
dominieren und damit chemisches Verhalten und Reaktionen bestimmen [129]. Wie in den vorherigen Kapiteln beschrieben, besteht die Bakterienhulle
¨
großten
¨
Teils aus Aminos¨auren, Zuckerderivaten und Glykolipiden, welche aufgrund dissoziierbarer und reaktiver funktioneller Gruppen (-OH, -COOH, OPO3 H, oder -SH) geladen sein konnen.
¨
In aquatischem Medium weisen diese Biokolloide meist eine negative Oberfl¨achenladung auf. Zwei unterschiedliche Mechanismen
konnen
¨
zur Entstehung der Oberfl¨achenladung beitragen:
• Ionisierung der Oberfl¨achengruppen als Ergebnis der Protonierung oder Deprotonierung basischer oder azider Oberfl¨achenmolekule.
¨ Der Ionisierungsgrad der
Oberfl¨ache ist vom pH-Wert des Mediums abh¨angig. Dementsprechend ist die
Ladung negativ fur
¨ hohe pH-Werte und positiv fur
¨ niedrige pH-Werte. Die Chemie der a¨ ußeren Zellwand Gram-positiver und -negativer Bakterien unterscheidet sich. Es ist die uberwiegend
¨
in den Zellw¨anden Gram-positiver Bakterien
auftretende Teichons¨aure, die den Zellen eine negative Ladung bei pH-Werten
≥ 5 verleiht, w¨ahrend die Oberfl¨achenladung Gram-negativer Bakterien durch
die Lipopolysaccharide der a¨ ußeren Membran bestimmt wird [77].
• Adsorption von Ionen aus der umgebenden Losung
¨
[239].
Die elektrostatisch wirksamen Oberfl¨acheneigenschaften von Biokolloiden lassen sich
durch ihr elektrophoretisches Verhalten in einem a¨ ußeren elektrischen Feld bestimmen.
3.2 Prokaryoten
35
3.2.2.1 Zeta-Potenzial
Geladene kolloidale Partikel bilden in w¨assrigen Losungen
¨
eine Solvathulle
¨
aus, in
welcher dipolare Wassermolekule
¨ und Gegenionen nahe der geladenen Oberfl¨ache
des Kolloids akkumulieren und eine elektrische Doppelschicht bilden [77]. Hier lagern
sich zun¨achst festgebundene Ionen an der Partikeloberfl¨ache an (Helmholtz-Schicht),
gefolgt von weiteren Ionen, die zu einer lockeren, diffusen Schicht fuhren.
¨
Dadurch
erscheint das Partikel in großer Entfernung elektrisch neutral. Die elektrische Doppelschicht bildet die Grundlage aller elektrokinetischen Ph¨anomene unter dem Einfluss
eines elektrischen Feldes [136, 164, 234]. Bewegt sich ein Partikel in flussigem
¨
Medium,
bildet sich durch Reibungskr¨afte in der diffusen Schicht eine Scher-Ebene aus. An ihr
ist die Geschwindigkeit der umgebenden Flussigkeit
¨
relativ zum Partikel null [193].
Durch die Aufspaltung der diffusen Schicht in einen bewegten und einen unbewegten
Teil, erscheint das Partikel nicht mehr elektrisch neutral, sondern besitzt wieder ein Potenzial, welches als Zeta-Potenzial ζ an der Scher-Ebene wie folgt definiert wird [129].
q
(3.1)
ζ=
4·π·ε·a
q : Ladung des Teilchens
ε : Dielektrizit¨atskonstante
a : Teilchenradius r plus bewegter elektrischer Doppelschicht
Das Zeta-Potenzial ist damit abh¨angig von den Oberfl¨acheneigenschaften der Teilchen,
die z. B. vom pH und der Konzentration der Elektrolyten beeinflusst werden [129].
Die Theorie der elektrischen Doppelschicht nach Gouy, Chapman, Debye und Huckel,
¨
welche sp¨ater nach Stern modifiziert wurde, ist in Abbildung 3.3 veranschaulicht [88].
Nach diesem Modell f¨allt das Potenzial im Bereich der Helmholtz-Schicht linear, in
der diffusen Schicht exponentiell. Die Debye-L¨ange ( κ1 ) definiert dabei die charakteristische L¨ange, auf welcher das Potenzial des elektrischen Feldes auf des 1e -fache abgefallen ist. Sie wird h¨aufig auch als Dicke der Doppelschicht bezeichnet und ist durch
folgende Gleichung definiert [88]:
1
1
=q
2
κ
1000e NA P 2
zi ci
ekT
e : Elementarladung
NA : Avogadrokonstante
k : Boltzmann-Konstante
T : absolute Temperatur in Kelvin
zi : Ladungszahl des Ions
ci : Konzentration des Ions
(3.2)
36
3. Theoretische Grundlagen
BulkLösung
Diffuse
Schicht
HelmholtzSchicht
+
-
Gouy-Ebene
+
Scher-Ebene
-
Stern-Ebene
+
Partikeloberfläche
1/ : Debye-Länge,
Dicke der Doppelschicht
: Zeta-Potenzial
+
-
- + +
+
+ - + + +
++ + + + +
+
- - ++++ +
+ - - - ++ + +
+
- + + -- - --- + + +
++ - + + + +
+
+ + + ++ +
+
+ +
+ - +
κ
ς
Stern-Ebene: Abgrenzung zur
diffusen Schicht
Gouy-Ebene: Definiert 1/
1/
κ
Potenzial
ς
κ
Abstand von der
Partikeloberfläche
Abbildung 3.3: Modell der elektrischen Doppelschicht, modifiziert nach [88].
P
Mit der Ionenst¨arke I = 21 zi2 ci ist folglich die reziproke Debye-L¨ange κ direkt pro√
portional zu I. Die Eigenschaften und die Dicke der elektrischen Doppelschicht
¨
sind von großer Bedeutung, denn die Uberlappung
ihrer diffusen Schichten bestimmen die Interaktionen zwischen geladenen Partikeln. Leider ist es nicht moglich
¨
das
Stern-Potenzial direkt zu messen, so dass das Zeta-Potenzial, welches experimentell
bestimmt werden kann, h¨aufig als Maß fur
¨ das Oberfl¨achenpotenzial verwendet wird.
3.2.2.2 Elektrophoretische Mobilit¨at
Die elektrophoretische Mobilit¨at µ der geladenen kolloidalen Partikel, d. h. die Partikelgeschwindigkeit pro angelegter elektrischer Feldst¨arke, ist proportional zum ZetaPotenzial ζ des Partikels. Außerdem wird die Mobilit¨at noch von einer Reihe weiterer
Faktoren wie der Oberfl¨achenladungsdichte, des pH-Wertes, der Elektrolytkonzentration (Ionenst¨arke), der Dielektrizit¨atskonstante des Mediums und seiner Viskosit¨at, der
Temperatur und der Partikelgeometrie und -große
¨ beeinflusst [234]. Dadurch tr¨agt die
Dicke der Doppelschicht auch zur Mobilit¨at kolloidaler Partikel bei. Die einfachste mathematische Beschreibung der elektrophoretischen Mobilit¨at kolloidaler Partikel stellt
die Theorie von Smoluchowski dar [275]:
µ=
εr ε0
ζ
η
(3.3)
3.2 Prokaryoten
37
εr : Dielektrizit¨atskonstante des Mediums
ε0 : Dielektrizit¨atskonstante des Vakuums
η : Viskosit¨at der Elektrolytlosung
¨
ζ : Zeta-Potenzial
Diese Formel beschreibt die Mobilit¨at großer Kolloide ohne Berucksichtigung
¨
der
Form, solange die Dimension des Partikels sehr viel großer
¨
als die Debye-L¨ange ist.
Dadurch kann die Partikeloberfl¨ache lokal als planar angenommen werden. Fur
¨ eine
Kugel mit Radius r ergibt sich somit die Bedingung: κr ≫ 1 [193]. Die physikalischen
Zusammenh¨ange sind hier idealisiert und basieren auf den folgenden Vereinfachungen [9, 133]:
1. Das Partikel ist kugelformig,
¨
starr und nicht leitend.
2. Die umgebende Flussigkeit
¨
geht keine Wechselwirkungen ein.
3. Das Zeta-Potenzial ist uber
¨
die gesamte Partikeloberfl¨ache gleich.
Diese Forderungen haben zur Folge, dass die elektrischen Ladungen bei einem nichtleitenden, starren Partikel auf der Oberfl¨ache lokalisiert sein mussen.
¨
Es wird angenommen, dass entweder das Potenzial oder die Ladungsdichte auf der Oberfl¨ache der Partikel unver¨andert bleibt. Fur
¨ eine Zelle werden diese SmoluchowskiForderungen jedoch unrealistisch, da die Zellmembran mit ihren dissoziierbaren funktionellen Gruppen ein “dynamisches System” darstellt. Auf diese Weise wird zum
einen die Oberfl¨achenladung durch den Dissoziationsgrad funktioneller Gruppen reguliert [61–64, 118, 187], zum anderen ist die Oberfl¨ache einer Zelle fur
¨ Elektrolyte oft
durchdringbar. Jedoch wird uber
¨
diese Tatsachen oft hinweg gesehen, um eine einfachere mathematische Behandlung zu ermoglichen
¨
[282]. Aus diesem Grund soll an
dieser Stelle auf die mathematischen Formulierungen der Modelle polymerbeschichteter Partikel [81, 193, 194, 241] verzichtet werden.
3.2.2.3 Stabilit¨at
Stabile Kolloide a¨ ndern w¨ahrend einer Beobachtungsphase den Dispersionsgrad nicht.
Dagegen neigen instabile kolloidale Losungen
¨
zum Agglomerieren und beginnen ab
einer kritischen Kolloidgroße
¨ zu sedimentieren. Ursache sind die relativ großen Oberfl¨achen dispergierter Kolloide mit einer hohen Oberfl¨achenenergie. Durch Agglomeration wird die Oberfl¨achenenergie herabgesetzt und ein thermodynamisch stabilerer
Zustand erreicht [128, 257]. Zur Kolloidstabilit¨at kommen zwei grundlegend verschiedene Mechanismen in Betracht [111, 128]:
38
3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.4: Stabilit¨at kolloidaler Losungen
¨
in Abh¨angigkeit von der Oberfl¨achenladung (A) und der
Ionenst¨arke (B), modifiziert nach [128].
• Sterische Stabilisierung:
Die Adsorption von Polymeren an die Kolloidoberfl¨ache fuhrt
¨
zu einer abstoßenden Wechselwirkung, da ein Kolloid-Kolloid-Kontakt die Polymerschichten
komprimieren musste.
¨
• Elektrostatische Stabilisierung:
Wie in Abbildung 3.4 dargestellt, fuhren
¨
eine hohe Oberfl¨achenladung und eine geringe Ionenst¨arke zu einem flachen Abfall des Potenzials in der diffusen
Doppelschicht und somit zu stabilen kolloidalen Losungen,
¨
w¨ahrend niedrige
Oberfl¨achenladungen und hohe Ionenst¨arken den Potenzialabfall beschleunigen
und folglich eine geringe oder vollst¨andig fehlende Energiebarriere verursachen.
3.2.2.4 Wechselwirkung zwischen Licht und Materie
Lichtschw¨achung beim Durchgang durch Materie findet ihre Ursache in elastischen
und inelastischen Streuprozessen. Als Lichtstreuung bezeichnet man die Wechselwirkung von Photonen an einem Ensemble von Atomen, Molekulen,
¨
Kolloiden, Staubpartikeln, Kristalliten etc. Durch Reflexion, Brechung, Beugung und Absorption a¨ ndert
3.2 Prokaryoten
39
sich meist die Intensit¨at, Polarisation und Richtung des einfallenden Lichtstrahles.
W¨ahrend bei elastischer Streuung kein Energietransfer zwischen Lichtquanten und
streuender Materie stattfindet und somit nur eine Impuls¨anderung der einfallenden
Strahlung auftritt, wird bei der inelastischen Streuung zun¨achst Energie vom beteiligten Molekul
¨ absorbiert und darauffolgend in Form eines Lichtquantes anderer Energie
wieder abgestrahlt. Fur
¨ die elastische Streuung existieren im Falle der Einzelstreuung
(hier streuen die Teilchen unabh¨angig von einander unter der Voraussetzung, dass der
mittlere Teilchenabstand mindestens dem doppelten Durchmesser der Teilchen entspricht) zwei strenge Theorien [202]:
• Rayleigh-Streuung: bei Streuung an Molekulen,
¨
die klein sind gegen die Wellenl¨ange λ: d. h. 2πr/λ < 0.1 [148].
• Mie-Streuung: bei Streuung an isotropen, kugelformigen
¨
Teilchen beliebiger
Große
¨ unter der Bedingung: 2πr/λ ≥ 10) [148, 177, 270],
wobei r der Teilchenradius ist. Tritt Licht durch eine kolloidale mikrobielle Losung,
¨
so
ist die Mie-Streuung der zur Lichtabschw¨achung fuhrende
¨
dominierende Prozess. Absorptionsprozesse aufgrund von Oberfl¨achenmolekulen
¨
konnen
¨
vernachl¨assigt werden [23]. Die gesamte Lichtschw¨achung beim Durchgang durch eine Probe wird als
Extinktion E, oder als optische Dichte (OD) bezeichnet und ist uber
¨
den Anteil der
transmittierten Lichtmenge T definiert.
E(λ) = OD(λ) = −logT (λ) = −log
I
I0
(3.4)
T : transmittierte Lichtmenge
I : Intensit¨at des austretenden Lichtes
I0 : Intensit¨at des eingestrahlten Lichtes
Unter der Annahme, dass die Lichtschw¨achung ausschließlich durch elastische Streuung verursacht wird, verringert sich die Lichtintensit¨at I0 beim Durchgang durch
eine Probe der Konzentration c und der Schichtdicke x, in Analogie zum LambertBeerschen Gesetz exponentiell (Abschnitt 3.3.1):
I = I0 e−sn cx
sn : naturlicher
¨
Streukoeffizient
c : Zelldichte
x : Schichtdicke (L¨ange des Lichtweges durch die Suspension)
(3.5)
40
3. Theoretische Grundlagen
3.2.2.5 Praktische Anwendung: Turbidimetrie
Aufgrund von Streuprozessen erscheint eine Bakteriensuspension bereits ab einer
Konzentration von 107 Zellen/ml mit dem Auge wahrnehmbar trube.
¨
Im Labor werden fur
¨ Trubungsmessungen,
¨
die h¨aufig zur Bestimmung der Zellkonzentration und
-masse dienen, meist die prim¨ar fur
¨ die Absorptionsphotometrie konstruierten Photometer verwendet. Bei der Messung mussen
¨
folgende Einflussfaktoren beachtet werden, um mogliche
¨
Fehlerquellen auszuschließen [23]:
• Wellenl¨ange:
Ist , Streuintensit¨at
) zeigt im Falle der
Die gestreute Strahlungsleistung ( I0 , Intensit¨
at des einfallenden Lichtes
−4
Rayleigh-Streuung bezuglich
¨
der Wellenl¨ange λ eine λ -Abh¨angigkeit. Mit zunehmender Partikelgroße
¨ wird der Exponent der λ-Abh¨angigkeit großer,
¨
bis die
Streustrahlung von λ unabh¨angig wird. Bei kugelformigen
¨
Bakterien oder kurzen St¨abchen verh¨alt sich die gestreute Strahlungsleistung proportional zu λ−2 bei
langen, dunnen,
¨
zuf¨allig orientierten St¨abchen dagegen zu λ−3 [23, 147]. Desweiteren nimmt der Streuwinkel mit großer
¨
werdender Wellenl¨ange zu. Insgesamt
besitzt die Auswahl der Wellenl¨ange und die spektrale Reinheit der Messstrahlung jedoch bei der Trubungsmessung
¨
im Vergleich zur Absorptionsmessung eine geringere Bedeutung.
• Ausrichtung der Zellen in der Kuvette:
¨
Wird durch Schutteln
¨
oder Ruhren
¨
eine Stromung
¨
in der Kuvette
¨
erzeugt, so richten sich st¨abchenformige
¨
Zellen aufgrund der inneren Reibung vertikal aus, wodurch es zu einer optischen Anisotropie und Zunahme der Extinktion kommt.
• Zelldichte:
¨
Uberschreitet
die Extinktion einer Zellsuspension einen Wert von 0.5, dann
weicht mit zunehmender Zelldichte die gemessene Extinktion mehr und mehr
von dem nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz zu erwartenden Wert ab. Die Extinktion f¨allt in diesem Fall zu gering aus. Ursache ist die durch die Mie-Theorie
begrundete
¨
antisymmetrische Winkelverteilung der Streuintensit¨at mit bevorzugter Vorw¨artsstreuung, wodurch neben der geschw¨achten Prim¨arstrahlung
auch ein Teil des Streulichtes in den Detektor f¨allt. Ferner gilt fur
¨ das Verh¨altnis
zwischen Konzentration und Extinktion die in der Absorptionsphotometrie beobachtete Abweichung von der Linearit¨at bei OD-Werten <0.2 (Abschnitt 3.3.1).
• Zellzahl:
Es hat sich gezeigt, dass nur bei konstanter durchschnittlicher Zellgroße
¨ ein linearer Zusammenhang zwischen Extinktion und Zellzahl pro ml besteht. Da dieser
Fall bei den meisten Bakterienspezies aufgrund von Agglomerat- und Ketten-
3.3 Optische Spektroskopie an Molekulen
¨
41
bildung nicht gegeben ist, liefert die Trubungsmessung
¨
lediglich einen Orientierungswert.
Eine praktische Anwendung findet die Turbidimetrie in der Mikrobiologie zur Bestimmung von Wachstumskurven, welche den zeitlichen Verlauf der Zellproliferation beschreiben (Abbildung 3.5). Dabei passt sich der Zellstoffwechsel zun¨achst in der Anlaufphase an die N¨ahrstoffbedingungen an und die Zellen nehmen lediglich in ihrer
¨
Masse, nicht jedoch in ihrer Anzahl zu [143]. Uber
die Beschleunigungsphase beginnt
darauffolgend die Zellvermehrung exponentiell und endet nach mehreren Stunden in
der station¨aren Phase. In dieser Phase, die mehrere Stunden bzw. Tage andauern kann,
sind die Zellen noch vollst¨andig lebensf¨ahig, haben aber ihren Stoffwechsel und ihre Replikation eingestellt. Letztendlich mundet
¨
die Wachstumskurve in der Absterbephase, durch allm¨ahliches Lysieren der Zellen. Neben der vollst¨andigen Beschreibung
einer Zellkultur kann die Turbidimetrie naturlich
¨
auch zur Absch¨atzung der Zellzahl
einer Zellsuspension herangezogen werden.
Abbildung
3.5:
Typische
OD-Wachstumskurve
von
Bakterien.
3.3 Optische Spektroskopie an Molekulen
¨
Die Grundlage der optischen Spektroskopie an Molekulen
¨
bildet in der Regel die inelastische Streuung von Licht am beteiligten Molekul.
¨ Dabei wird zun¨achst ein Lichtquant einer bestimmten Energie vom Molekul
¨ durch Anregung des Elektronensystems
absorbiert und darauffolgend entweder ein Lichtquant kleinerer Energie wieder emittiert oder der angeregte Zustand strahlungslos deaktiviert. Damit Licht mit Molekulen
¨
in Wechselwirkung treten kann, mussen
¨
folgende Voraussetzungen erfullt
¨ sein [155]:
• Resonanzbedingung: die Energie (hν) des absorbierten Photons muss genau der
Energiedifferenz ∆E zwischen Grund- und angeregtem Zustand des beteiligten
Elektrons entsprechen.
42
3. Theoretische Grundlagen
Abbildung
3.6:
JablonskiTermschema ohne Berucksich¨
tigung der Rotationsenergieniveaus: F: Fluoreszenz, P:
Phosphoreszenz, IC: Internal
Conversion, ISC: Intersystem
Crossing, VR: Schwingungsrelaxation, Sx : Singulettzust¨ande,
Tx : Triplettzust¨ande, modifiziert
nach [198].
¨
• Die Ubergangswahrscheinlichkeit
muss ungleich null sein, d. h. es darf sich nicht
¨
um einen verbotenen Ubergang
handeln.
Die moglichen
¨
Elektronenuberg¨
¨
ange in einem Molekul
¨ werden im sogenannten
Jablonski-Termschema (Abbildung 3.6) veranschaulicht, wodurch die beteiligten Prozesse Absorption und Emission n¨aher beschrieben werden konnen.
¨
Zur Vereinfachung
wurden keine Rotationsenergieniveaus eingezeichnet.
Wird vom Molekul
¨ ein Lichtquant absorbiert, so fuhrt
¨
die Anregung meist in den
ersten elektronisch angeregten Singulettzustand S1. Die Anregung des Molekuls
¨ in
hohere
¨
elektronische Singulettzust¨ande (S2, S3) findet zum einen selten statt, zum anderen haben diese Zust¨ande eine sehr kurze Lebensdauer und gehen innerhalb von
10−12 s strahlungslos (Internal Conversion, IC) durch Wechselwirkung mit benachbarten Losungsmittelmolek
¨
ulen
¨
und Abgabe von Schwingungsenergie in den ersten
elektronisch angeregten Singulettzustand S1 uber.
¨
Im Gegensatz zu Atomen zeigen Molekule
¨ jedoch keine definierten Absorptionslinien,
sondern Absorptionsbanden, die bis zu 100 nm betragen konnen.
¨
Die Ursache liegt in
den zahlreichen Freiheitsgraden des Molekuls,
¨ wodurch jedem elektronisch angeregten Zustand 30-50 Schwingungs- und Rotationszust¨ande uberlagert
¨
sind.
Befindet sich ein Molekul
¨ im ersten elektronisch angeregten Zustand S1 , so gibt es verschiedene Moglichkeiten,
¨
den Grundzustand S0 wieder zu erreichen, d. h. zu relaxieren:
• S1 → S0 + W¨arme (Internal Conversion):
Diese Art der strahlungslosen Inaktivierung ist der h¨aufigste Relaxationsprozess.
Hier wird die ubersch
¨
ussige
¨
Energie uber
¨
Wechselwirkungen mit der Umgebung
in Form von W¨arme abgegeben.
• S1 → S0 + hν (Fluoreszenz):
Innerhalb von Nanosekunden geht der angeregte S1-Singulettzustand unter
3.3 Optische Spektroskopie an Molekulen
¨
43
Emission eines Photons in ein Rotations-Schwingungs-Niveau des Grundzustandes S0 uber.
¨
Dadurch kann die Energie der emittierten Strahlung hochstens
¨
gleich
der absorbierten Energie hν sein.
¨
• Eine weitere Moglichkeit
¨
zur Relaxation ist der strahlungslose Ubergang
in einen
Triplettzustand (Intersystem Crossing, ISC). Wegen der fehlenden Paarungsenergie der parallel stehenden Spins liegt dieser Zustand energetisch tiefer. Aufgrund
¨
¨
der Anderung
der Spinmultiplizit¨at ist dieser Ubergang
formell verboten. Von
hier aus relaxieren die Elektronen unter erneuter Spin-Umkehr in den Grundzustand S0 entweder
1. strahlungslos und unter Erzeugung von W¨arme (Internal Conversion):
T1 → S0 + W¨arme oder
2. unter Aussendung eines Lichtquantes (Phosphoreszenz):
T1 → S0 + hν
3.3.1 Absorption
Das Maß der Lichtabsorption eines Molekuls
¨ wird durch den Absorptionskoeffizienten
α(λ) im Lambert-Beerschen-Gesetz beschrieben:
I = I0 e−α(λ)cx
(3.6)
I : Intensit¨at des austretenden Lichtes
I0 : Intensit¨at des eintretenden Lichtes
c : Konzentration
α(λ) : Absorptionskoeffizient
x : L¨ange des Absorptionspfades
Dieser ist der Proportionalit¨atsfaktor zwischen der Schw¨achung dI eines Lichtstrahles
und dem Produkt aus der nach Durchtritt durch die Probe noch vorhandenen Intensit¨at I, der Probenkonzentration c und der durchlaufenden Schichtdicke dx:
−dI = α(λ) · I · c · dx
(3.7)
Dieser als Bouguer-Lambert-Gesetz bekannte Zusammenhang gilt jedoch nur fur
¨ monochromatisches, kollimiertes Licht und verdunnte
¨
Losungen
¨
[238]. Ist der Absorptionskoeffizient bekannt, kann durch Messung der Extinktion (E = −log II0 ) die Probenkonzentration c bestimmt werden. In der Praxis wird die Konzentrationsbestimmung
44
3. Theoretische Grundlagen
mit Hilfe einer Kalibriergerade durchgefuhrt.
¨
Hierzu misst man die Absorption mehrerer Losungen
¨
unterschiedlicher, aber bekannter Konzentrationen, die den interessierenden Messbereich abdecken. Aufgetragen in einem Diagramm wird durch die Messpunkte nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate eine Ausgleichsgerade gelegt.
Diese weist jedoch sowohl im sehr kleinen (0.1-0.2) als auch im sehr großen (> 0.8)
Extinktionsbereich Abweichungen vom Lambert-Beerschen-Gesetz auf. Die Ursachen
hierfur
¨ liegen zum einen in der Erfassungsgrenze und Empfindlichkeit des Detektors
und zum anderen, vor allem bei hoherer
¨
Konzentration, in der zunehmenden Fehlstrahlung durch Streulicht [230].
3.3.2 Fluoreszenz
Wird das Elektronensystem eines Molekuls
¨ durch Lichtabsorption angeregt, gibt es
neben der Fluoreszenzemission verschiedene Moglichkeiten
¨
in den Grundzustand zu
relaxieren (Abbildung 3.6). D. h. nicht jedes absorbierte Photon wird in Form eines
Photons wieder emittiert. Das Verh¨altnis der Anzahl der von einem Molekul
¨ emittierten Nem - zu absorbierten Nabs -Photonen beschreibt das Maß der Fluoreszenz und
definiert die Quantenausbeute Q:
Q=
Nem
Nabs
(3.8)
Die gesamte, vom Detektor erfasste Intensit¨at Iλ des Fluoreszenzlichtes kann durch
folgende Beziehung beschrieben werden:
Iλ ∼ α(λ) · I0 · Q · K
(3.9)
und ist damit proportional zu:
• α(λ) (Absorptionskoeffizient)
• I0 (Intensit¨at des Anregungslichtes)
• Q (Fluoreszenzquantenausbeute)
• K (Ger¨atekonstante)
3.3.3 Fluoreszenzloschung
¨
(”Quenching”)
Wechselwirkungen zwischen dem angeregten Molekul
¨ und der Umgebung konnen
¨
das Maß der Fluoreszenz negativ beeinflussen. Eine dadurch bedingte Verringerung
der Quantenausbeute bezeichnet man als Fluoreszenzloschung
¨
bzw. “Quenching”.
Diese Loschprozesse
¨
beruhen entweder auf Energietransfer, Stoßloschung
¨
oder chemischen Reaktionen:
3.4 Kapillarelektrophorese
45
• Energietransfer:
Hier wird die Anregungsenergie eines angeregten Molekuls
¨ (Donor) durch
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf ein Akzeptor-Molekul
¨ (Quench-Molekul)
¨
aus der r¨aumlichen Umgebung ubertragen,
¨
d. h. der Prozess erfordert keinen
direkten Kontakt der beiden Partner. Das Quench-Molekul
¨ befindet sich im Vergleich zum Donor-Molekul
¨ in einem vergleichbaren oder niedrigeren Energiezustand und sein Absorptionsspektrum uberlappt
¨
mit dem Fluoreszenzspektrum
des Donors [97, 256].
• Stoßloschung:
¨
Durch einen Stoßprozess kann die Anregungsenergie des einen Stoßpartners abgegeben werden, so dass sich beide Molekule
¨ im elektronischen Grundzustand
befinden, jedoch Unterschiede in ihrer Schwingungs- und Rotationsenergie aufweisen.
• Chemische Reaktion:
Komplexbildung, Redoxreaktionen oder S¨aure-Base-Reaktionen konnen
¨
ebenfalls eine strahlungslose Deaktivierung des Anregungszustandes bewirken.
¨
Die treibende Kraft fur
¨ diese Reaktionen sind drastische Anderungen
der
Redoxpotenziale und pka -Werte des Fluorophors bei Anregung in den S1Singulettzustand.
3.4 Kapillarelektrophorese
3.4.1 Apparatur
Die Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) ist eine elektrophoretische
Trenntechnik, bei der kleine geladene Molekule
¨ und Biokolloide wie DNA, Proteine
oder Mikroorganismen unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes getrennt werden
konnen.
¨
Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit und -richtung der Teilchen in mit Puffer gefullten
¨
Quarzkapillaren (amorphes
SiO2 ) [87]. Diese sind außen mit Polyimid beschichtet, um das Brechen der Kapillare
zu verhindern. Die Kapillaren sind ublicherweise
¨
10 bis 100 cm lang und haben einen
Innendurchmesser von 25 bis 100 µm. Darin liegt der entscheidende Vorteil gegenuber
¨
der klassischen Gelelektrophorese: Die große Oberfl¨ache der englumigen Kapillaren
bezogen auf das Puffervolumen erlaubt einen schnellen Abtransport der Jouleschen
W¨arme, so dass relativ hohe Spannungen (bis zu 35 KV) verwendet werden konnen,
¨
d. h. hohe Analysengeschwindigkeiten moglich
¨
sind. In Abbildung 3.7 ist der schematische Aufbau einer CE-Einheit dargestellt mit Kapillare, Spannungsquelle, Detektor,
Proben- und Puffergef¨aßen.
46
3. Theoretische Grundlagen
Abbildung
3.7:
Schematischer Aufbau
einer CE-Apparatur.
3.4.1.1 Injektion
Zur Probeninjektion wird am aufgabeseitigen Ende der Kapillare das Gef¨aß mit Trennelektrolyt gegen das Probengef¨aß getauscht. Das injizierte Probenvolumen liegt meist
zwischen 2 und 20 nl. Die Probenaufgabe kann anodisch oder kathodisch erfolgen.
Man unterscheidet die folgenden drei Injektionstechniken:
• Elektrokinetische Injektion durch elektrisches Feld:
Aufgrund einer kurzzeitig angelegten Spannung U zwischen den beiden Kapillarenden, wird in der Kapillare eine Flussigkeitsstr
¨
omung
¨
erzeugt, wodurch Probenbestandteile in die Kapillare wandern.
• Hydrostatische Injektion durch Siphon-Effekt:
Eine Hohendifferenz
¨
∆h zwischen den beiden Kapillarenden wird fur
¨ eine kurze Zeitspanne aufgebaut. Der daraus resultierende Fluss zieht die Probe in die
Kapillare.
• Hydrodynamische Injektion durch Druck bzw. Vakuum:
Eine kurzzeitig aufgebaute Druckdifferenz ∆p zwischen den beiden Kapillarenden ist fur
¨ die Probenaufgabe verantwortlich. Fur
¨ den Aufbau der Druckdifferenz kann entweder der Druck beim Probengef¨aß erhoht
¨ werden oder am Kapillarende verringert werden.
Die hydrodynamische Injektion ist das am h¨aufigsten angewandte Verfahren und wird
auch in dieser Arbeit eingesetzt. In der Regel werden Injektionszeiten zwischen 5 und
45 s verwendet.
3.4 Kapillarelektrophorese
47
3.4.1.2 ”Sample stacking”
Die Probenaufgabe ist aufgrund der kurzen Injektionszeiten in Bezug auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ein kritischer Faktor. L¨angere Injektionszeiten und damit
großere
¨
injizierte Probenvolumina fuhren
¨
jedoch durch Volumenuberladung
¨
in der
Kapillare sehr schnell zu Peakverzerrung und Auflosungsverlust.
¨
Man versucht somit einerseits moglichst
¨
hohe Probenvolumina aufzugeben und andererseits die aufgegebene Probenzone zu “sch¨arfen”, d. h. aufzukonzentrieren und damit Peakverzerrungen entgegenzuwirken. Letzteren Vorgang bezeichnet man als “sample stacking”.
Das h¨aufigste angewandte Verfahren ist das “electro-stacking” [87]. Dieses Verfahren
nutzt Unterschiede in der Leitf¨ahigkeit zwischen Trennpuffer und Probenlosung.
¨
Dabei versucht man die Probe aus einer rein w¨assrigen Losung
¨
zu injizieren, d. h. aus
einer Losung
¨
mit geringer Leitf¨ahigkeit und hohem Widerstand. Nach der Injektion
wird die Probe somit zun¨achst bis zum Erreichen der Puffergrenzfl¨ache in einer hohen
Feldst¨arke beschleunigt und wandert dann im Trennpuffer bei niedrigerer Feldst¨arke
weiter. Durch das Abbremsen der Proben beim Eintritt in den Pufferbereich werden
die Proben aufkonzentriert.
3.4.1.3 Detektor
In der Mehrzahl der F¨alle erfolgt die Detektion der getrennten Teilchen uber
¨
UV/VISAbsorptionsmessungen. Ein großer Nachteil ist jedoch die geringe Empfindlichkeit
der Methode. Da sich die Extinktion proportional zur Schichtdicke verh¨alt (Abschnitt
3.3.1), die in diesem Fall nur einige µm betr¨agt, liegt die Detektionsgrenze normalerweise bei 10−8 M [179]. Mit einem Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektor (LIFDetektor) sind dagegen Nachweisgrenzen im Bereich einiger Yoktomol und Zeptomol
(10−21 mol und 10−24 mol) keine Seltenheit [16, 95].
3.4.1.4 Auflosung
¨
Die Auflosung
¨
(resolution, Rs) ist ein Maß fur
¨ die Qualit¨at einer Trennung und je
besser die Trennung, um so zuverl¨assiger ist das Analysenergebnis [124, 162]. Ab einer Auflosung
¨
von 1.5 gelten zwei Peaks als basisliniengetrennt voneinander. In die
Auflosung
¨
fließen zwei Faktoren ein:
• Die Peak-zu-Peak-Trennung, d. h. die Selektivit¨at. Hier wird der Abstand zweier
Peak-Maxima berechnet und
• Die Trennleistung, welche durch die Breite der Peaks bestimmt und als Anzahl
N der theoretischen Boden
¨
pro Meter berechnet wird. Je schmaler ein Peak desto
hoher
¨
ist die Trennleistung.
48
3. Theoretische Grundlagen
Die Auflosung
¨
Rs und Anzahl N der theoretischen Boden
¨
werden nach folgenden Gleichungen berechnet:
Abbildung 3.8: Beitr¨age zur Auflosung,
¨
modifiziert nach [77].
D. h. je großer
¨
die Peakbreite bei halber Hohe
¨ (W1/2 ) ist, desto niedriger ist der Wert fur
¨
N. Fur
¨ eine hohe Auflosung
¨
mussen
¨
somit sowohl schmale Peaks als auch große Peakzu-Peak-Trennungen vorliegen. W¨ahrend der Trennung kommt es h¨aufig zur Dispersion des Analyten, wodurch Peakverbreiterungen verursacht werden. Diesem Effekt
kann jedoch durch “sample stacking” (Abschnitt 3.4.1.2) entgegengewirkt werden.
3.4.2 Trennprinzip
Die Trennung verschiedener Analyten im elektrischen Feld beruht auf ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilit¨at µelphor (Quotient aus Wanderungsgeschwindigkeit und Feldst¨arke). Sie errechnet sich aus dem Kr¨aftegleichgewicht zwischen der Beschleunigungskraft Fel des elektrischen Feldes und der Reibungskraft Fr ,
die durch das Stokesche Gesetz angen¨ahert wird:
Fel = q · E
mit
Fr = −k · µelphor · E = −6 · π · η · r · µelphor · E
q
q
∼
µelphor =
6·π·η·r
r
(3.10)
(3.11)
(3.12)
q : effektive Ladung
E : elektrische Feldst¨arke
k : Reibungskoeffizient
η : dynamische Viskosit¨at
r : Stokescher Radius, der auch die Solvathulle
¨ beinhaltet
Die Zahl 6 gilt streng genommen nur fur
¨ die Betrachtung sph¨arischer Partikel und ist
fur
¨ kleine Ionen, deren Große
¨ im Bereich von Losungsmittelmolek
¨
ulen
¨
liegt kleiner.
3.4 Kapillarelektrophorese
49
Die effektive Ladung ergibt sich aus der Ladung des Analyten abzuglich
¨
des Ladungsanteils der umgebenden entgegengesetzt geladenen Ionen, d. h. der Solvathulle
¨
bis
zur Scher-Ebene im Modell der starren Doppelschicht der Debye-Huckel-Theorie
¨
(Abschnitt 3.2.2.1). Fur
¨ die Trennung maßgeblich ist letztendlich das Verh¨altnis q/r.
3.4.3 Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Wie eingangs beschrieben bestehen die eingesetzten Kapillaren aus Quarz (fused silica). In w¨assriger Umgebung wird dessen Oberfl¨ache durch Protolyse negativ aufgeladen [278] und es kommt wie unter Abschnitt 3.2.2.1 fur
¨ die Oberfl¨ache von Kolloiden
in aquatischer Losung
¨
beschrieben, zur Ausbildung einer elektrischen Doppelschicht
in der Kapillare (Abbildung 3.9).
Abbildung 3.9: Ausbildung der elektrischen Doppelschicht
in der Kapillare, modifiziert nach [277].
Die gebildete elektrische Doppelschicht setzt sich aus der adsorbierten HelmholtzSchicht und der diffusen Debeye-Huckel-Schicht
¨
zusammen und besteht aus positiven Gegenionen und Anionen. Das an der Grenzschicht ausgebildete ζ-Potenzial ist
verantwortlich fur
¨ die Elektroosmose. Liegt parallel zur Oberfl¨ache ein elektrisches
Feld an, werden die Kationen in der diffusen Schicht zur negativ geladenen Kathode
gezogen. Diese ziehen aufgrund ihrer Solvathulle
¨
die gesamte Pufferlosung
¨
mit sich
und verursachen auf diese Weise den elektroosmotischen Fluss (EOF). Dadurch wird
der elektrophoretischen Wanderung des Analyten zumeist ein mehr oder minder starker EOF uberlagert,
¨
der zwar aktiv zum Transport der Probenzone beitr¨agt, nicht aber
zu ihrer Trennung. Der EOF ist somit verantwortlich, dass bei anodischer Injektion
auch Anionen am Detektionsfenster “vorbeiwandern”. Die Geschwindigkeit des EOFs
bzw. dessen elektroosmotische Mobilit¨at µelosm wird durch die Helmholtz-Gleichung
beschrieben
ε·ζ
(3.13)
µelosm =
4·π·η
50
3. Theoretische Grundlagen
ε : Dielektrizit¨atskonstante
ζ : ζ-Potenzial
η : dynamische Viskosit¨at
und kann experimentell aus der Migrationszeit eines Neutralmarkers bestimmt werden.
3.4.4 Kapillarelektrophoretische Methoden
Die Vielseitigkeit der CE leitet sich vor allem von ihren zahlreichen Methoden ab,
deren Trennmechanismen auf unterschiedlichen physikalischen Grunds¨atzen beruhen
und dadurch die Gewinnung orthogonaler und komplement¨arer Informationen mog¨
lich wird. Die bedeutendsten Methoden sind die Kapillarzonenelektrophorese (CZE),
die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC), die Kapillargelelektrophorese (CGE), die Kapillarelektrochromatographie (CEC), die Kapillar-Isoelektrische Fokussierung (CIEF) und die Kapillarisotachophorese (CITP). Fur
¨ diese Arbeit spielen
lediglich die Kapillarzonenelektrophorese und die Kapillargelektrophorese eine Rolle,
so dass nur fur
¨ diese beiden Methoden eine n¨ahere Ausfuhrung
¨
folgt:
3.4.4.1 Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Die CZE wird ausschließlich mit Trennpuffer gefullten
¨
Kapillaren durchgefuhrt
¨
und
gilt als das am h¨aufigsten angewandte Verfahren. Die Trennung beruht ausschließlich
auf Mobilit¨atsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Ladung und Reibungskoeffizienten [87].
3.4.4.2 Kapillargelelektrophorese (CGE)
Die CGE wird haupts¨achlich zur Analyse von Makromolekulen
¨
wie DNA/RNA und
Biokolloiden angewandt, welche h¨aufig uber
¨
a¨ hnliche oder gar gleiche Oberfl¨ache-zuLadungsverh¨altnisse verfugen.
¨
Die Trennung dieser effektiv gleich geladenen Analyten erfolgt in mit Polymerlosung
¨
oder Gel (Trennmatrix) gefullten
¨
Kapillaren aufgrund
ihrer unterschiedlichen Molekul¨ bzw. Partikelgroße.
¨
Die Gelmatrix besteht haupts¨achlich aus Acrylamid, Agarose und Cellulose. Ihr eingesetzter Konzentrationsbereich
liegt zwischen 0.05 bis 15 %. Im Idealfall ist der EOF bei dieser Technik vollst¨andig
unterdruckt
¨
und hat keinen Einfluss auf die Mobilit¨at.
3.4.5 Eigenschaften von “fused silica” Oberfl¨achen
Bilden sich ausreichend große ζ-Potenziale auf der Quarzoberfl¨ache der Kapillare aus,
besitzt die Kapillarwand Eigenschaften eines Kationenaustauschers mit etwa einer
3.4 Kapillarelektrophorese
51
Bindungsstelle fur
¨ Kationen pro nm2 [83]. Die daraus resultierenden elektrostatischen
Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen Analyten und den negativen Silanolgruppen der Kapillarwand konnen
¨
die Mobilit¨at und damit die Trennleistung und die
Reproduzierbarkeit negativ beeinflussen [127]. Die Wechselwirkungen konnen
¨
vor allem bei positiv geladenen Proteinen und Zellbestandteilen sehr stark ausgepr¨agt sein.
Fur
¨ gut reproduzierbare Ergebnisse sollten diese Adsorptionserscheinungen moglichst
¨
unterdruckt
¨
oder g¨anzlich unterbunden werden.
Die Große
¨ des ζ-Potenzials bestimmt auch die Geschwindigkeit des EOF. Zwar tr¨agt
der EOF nicht zur Trennung der Analyten bei, doch kann eine Erhohung
¨
des EOF z. B.
zu einer schnelleren Trennung fuhren.
¨
Andererseits kann bei der Trennung von Analyten mit a¨ hnlichen elektrophoretischen Mobilit¨aten auch die Reduktion des EOF hilfreich sein, um den elektrophoretischen Beitrag zu erhohen
¨
und den Analyten mehr
“Zeit” zur Trennung untereinander und zur Abtrennung vom EOF einzur¨aumen [15].
Sowohl die Kontrolle der unerwunschten
¨
Interaktionen zwischen Analyt und Kapillarwand und als auch die Kontrolle des EOF basieren auf der Verminderung des Oberfl¨achenpotenzials auf der Kapillarinnenseite und damit der Reduktion der Reichweite
der Coulomb-Kr¨afte zwischen Kapillarwand und Analyt [255]. Dazu konnen
¨
zwei unterschiedliche Techniken angewandt werden:
1. Die direkte Beeinflussung der ionischen Interaktionen durch:
• Erhohung
¨
der Ionenst¨arke im Trennpuffer durch Zugabe von Konkurrenzionen in Form von Salzen oder
• Protonierung der Silanol-Gruppen durch extrem saure pH-Bedingungen
oder
2. Kapillarwandmodifikationen durch
• kovalente oder
• dynamische Beschichtung
Im Rahmen dieser Arbeit wird mit Kapillarwandmodifikationen gearbeitet, weshalb
nachfolgend die Technik der Beschichtung insbesondere der dynamischen Beschichtung n¨aher beschrieben wird.
3.4.6 Wandbeschichtung (”Coating”)
3.4.6.1 Permanente Beschichtung
Bei der permanenten Wandbeschichtung werden die Silanol-Gruppen der Kapillarinnenwand kovalent an Modifikatoren gebunden, wodurch der EOF und die Probe-
52
3. Theoretische Grundlagen
Wand-Wechselwirkung effektiv unterdruckt
¨
werden. Die zur Beschichtung am h¨aufigsten eingesetzten Materialien sind Polyacrylamid [67], Kohlenhydrate [46] und Polyethylenglykole [218]. Die Stabilit¨at der Beschichtung h¨angt stark von der Vorbehandlung ab. Durch ausgiebige Konditionierung wird dazu die Kapillare zun¨achst gereinigt. Das bedeutendste Beschichtungsverfahren ist die Organosilanylisation [67, 127].
Hier werden uber
¨
ein reaktives, bifunktionales Silan die Polymere an die Kapillarwand gebunden. W¨ahrend die Silan-Gruppe mit der Silanol-Gruppe reagiert, bindet
die zweite funktionelle Gruppe die Monomere der sp¨ateren Beschichtung. Auf der Kapillaroberfl¨ache kommt es im Anschluss zur Polymerisation und Verankerung der Polymerschicht.
3.4.6.2 Dynamische Beschichtung
Auch durch dynamische Beschichtungsmethoden, bei denen dem Trennpuffer Additiva zugesetzt werden, die sich durch Coulomb-Kr¨afte und/oder Wasserstoffbrucken¨
bindungen beim Einspulen
¨
der Kapillare an die Glasoberfl¨ache binden, lassen sich
die Silanol-Gruppen abschirmen. Aufgrund der schwachen Wechselwirkungskr¨afte
ermoglicht
¨
der Einsatz geeigneter Spulschritte
¨
zwischen den Trennungen das vollst¨andige Ablosen
¨
der Beschichtung und seine neue Rekonstruktion im n¨achste Schritt. Als
Additiva konnen
¨
sowohl niedermolekulare Substanzen wie Mono-, Di-, Oligoamine,
Sulfons¨aureamine und Tenside als auch Polymere wie Alkylcellulose, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Dextran und Polyacrylamid eingesetzt werden [220, 273, 274].
Wichtig fur
¨ die richtige Auswahl hochmolekularer Modifikatoren ist ein ausgewogenes Verh¨altnis zwischen hydrophilen und lipophilen funktionellen Gruppen. Ist der
Anteil hydrophiler Gruppen zu hoch, kann die Beschichtung partiell durch Wassermolekule
¨ von der Quarzoberfl¨ache verdr¨angt werden. Hingegen besteht bei zu hydrophoben Additiva die Gefahr von Adsorptionen zwischen Proteinen oder Biokolloiden
und den Polymeren durch van-der-Waal-Kr¨afte. Im Extremfall konnen
¨
die hydrophoben funktionellen Gruppen auch zu großen Oberfl¨achenspannungen zwischen Puffer
und Beschichtung fuhren,
¨
wodurch die Beschichtung instabil wird [71]. Je nach Polymer und dessen funktioneller Gruppen kann die Beschichtung geladen, ungeladen,
polar oder unpolar sein.
3.5 Magnetische Kernresonanz
53
3.5 Magnetische Kernresonanz
3.5.1 Messprinzip
Die Grundlage der magnetischen Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR)
bildet die Quantenmechanik des Kernspins I~n , einer Eigenschaft von Nukleonen und
seine charakterisierende Kernspinquantenzahl In , die bei Protonen und Neutronen 1/2
betr¨agt. Atomkerne, deren Gesamtspin I~ ungleich Null ist, besitzen ein magnetisches
Moment ~µ, wobei im Feld-freien Raum 2I+1 energetisch a¨ quivalente Spinzust¨ande existieren. Als Konsequenz aus dem Wigner-Eckart-Theorem ist das magnetische Moment kollinear zum Spinvektor und durch folgende Gleichung definiert:
~µ = γ I~
(3.14)
Das gyromagnetische Verh¨altnis γ ist fur
¨ jeden Atomkern charakteristisch und betr¨agt
fur
¨ 1 H 2.68·108 rad/Ts. Sein Zahlenwert bestimmt unter anderem die Empfindlichkeit
eines Atomkernes. In Gegenwart eines externen magnetischen Feldes B~0 wird die energetische Entartung der Spinzust¨ande durch den Zeeman-Effekt aufgehoben:
E = −~µB~0
(3.15)
Da in einem NMR-Spektrometer durch Konvention das B~0 -Feld entlang der z-Achse
ausgerichtet ist, reduziert sich die Gleichung auf:
Em = −γIz B0 = −m~γB0
(3.16)
wobei m die magnetische Quantenzahl ist, und gem¨aß der Anzahl der Spinzust¨ande
2I+1 mogliche
¨
Werte annehmen kann. Die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Spin ein
Energieniveau besetzt, wird durch die Boltzmann-Verteilung bestimmt.
¨
In Analogie zur optischen Spektroskopie konnen
¨
Uberg¨
ange zwischen den Zeeman~0 ausgerichteten, hochfrequenten,
Niveaus durch Einstrahlung eines senkrecht zu B
elektromagnetischen Wechselfeldes (HF-Feld) stimuliert werden. Die Auswahlregel
fur
¨ magnetische Dipoluberg¨
¨
ange ist ∆m=±1, so dass die Photonenenergie die folgende Resonanzbedingung erfullen
¨
muss:
|∆E| = γB0 ~ = ω0 ~
(3.17)
Die Resonanzfrequenz ω0 = γB0 wird Larmorfrequenz genannt und entspricht betragsm¨aßig der Pr¨azessionsfrequenz des magnetischen Momentes um die statische B~0 Achse (z-Achse). Sie ist charakteristisch fur
¨ eine bestimmte Atomsorte. Doch konnen
¨
sich auch Atomkerne einer Sorte in ihrer Larmorfrequenz unterscheiden, wenn sie Teil
eines Molekuls
¨ sind und damit unterschiedliche chemische Umgebungen wahrnehmen. Aufgrund der teilweisen Abschirmung des a¨ ußeren Magnetfeldes durch die den
54
3. Theoretische Grundlagen
Kern umgebende Elektronenhulle,
¨
befindet sich der Kernspin in einem im Vergleich
zum B0 -Feld kleineren effektiven Beff -Feld:
Beff = (1 − σ)B0
(3.18)
σ heißt Abschirmkonstante und ist unter anderem abh¨angig von der Elektronendichte, d. h. der Bindungsart und der Elektronegativit¨at der Nachbaratome. Das Ausmaß
der Abschirmung eines Kerns und damit seine Resonanzfrequenz ist typisch fur
¨ seine
Position im Molekul.
¨ Sie kann zur Identifikation des Molekuls
¨ herangezogen werden
und bildet die Grundlage der NMR-Spektroskopie. Die chemische Verschiebung δ, eine dimensionslose Große,
¨
die in ppm (parts per million) angegeben wird, definiert die
Lage der Resonanzfrequenzen im Spektrum. Sie ist unabh¨angig von der verwendeten
Feldst¨arke B0 und bezieht sich als Relativ-Maßstab in der 1 H- und 13 C-Spektroskopie
auf die Resonanzfrequenz ωref von Tetramethylsilan (TMS):
δ[ppm] =
ω − ωref
· 106
ωref
(3.19)
Generell wird das Verhalten eines magnetischen Kernmomentes unter dem Einfluss
~0 durch die Bewegungsgleichung beschrieben:
des a¨ ußeren Magnetfeldes B
d~µ
= γ(~µ × B~0 )
dt
(3.20)
¨
Sie folgt aus der klassischen Betrachtung des Drehimpulses, dessen zeitliche Anderung
~0
gleich dem Drehmoment ist, das auf ~µ wirkt und durch das Vektorprodukt ~µ × B
gegeben ist.
Prinzipiell wurde
¨
die exakte theoretische Betrachtung eines NMR-Experimentes die
Losung
¨
der Bewegungsgleichung jedes Kernspins erfordern. Jedoch ermoglichen
¨
N¨aherungen sowohl im klassischen als auch quantenmechanischen Bild eine anschauliche Darstellung.
3.5.2 Klassische Darstellung
~ und der Gesamtdrehimpuls J~ einer makroskopischen
Die Gesamtmagnetisierung M
Probe ergibt sich aus den Vektorsummen der entsprechenden Beitr¨age der einzelnen
P
P
~ =
Kerne: M
µ~i , J~ =
I~i . Im thermischen Gleichgewicht sind die transversalen
Komponenten von ~µ und I~ der einzelnen Kerne unkorreliert und summieren sich zu
null auf. Aus den kleinen Populationsunterschieden zwischen den Energieniveaus re~ 0 = M0 e~z . Unter der Ansultiert daraus eine longitudinale Gesamtmagnetisierung M
nahme a¨ quivalenter, nicht interagierender Spinspezies in einer homogenen, isotropen
Probe, gehorcht die Gesamtmagnetisierung der gleichen Bewegungsgleichung wie ein
einzelner Kernspin:
~
dM
~ ×B
~0 )
= γ(M
dt
(3.21)
3.5 Magnetische Kernresonanz
55
Unter den experimentellen Bedingungen sind diese Annahmen aber nicht gerechtfertigt: Atomkerne interagieren miteinander und die Bewegungsgleichung wird unter anderem aufgrund von
• Relaxationsmechanismen und
• dynamischen Prozessen wie Diffusion und chemischem Austausch
wesentlich komplizierter. Weitere Einflussfaktoren stellen unter anderem Probeninhomogenit¨aten und -anisotropien dar. Diese werden im Rahmen dieser Arbeit jedoch
nicht berucksichtigt.
¨
3.5.2.1 Relaxation
Prinzipiell wird ein Prozess, der einen beliebigen Zustand in einen Gleichgewichtszustand zuruckf
¨ uhrt
¨
als Relaxation bezeichnet. In der NMR handelt es sich dabei um keinen spontanen Prozess, sondern er erfordert die Stimulation durch fluktuierende Magnetfelder zur Induktion von Spinuberg¨
¨
angen. Dies geschieht durch die folgenden vier
Hauptmechanismen [68]: Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Spin-Rotation, QuadrupolRelaxation und Relaxation durch chemische Verschiebungsanisotropie.
3.5.2.1.1 Bloch-Gleichungen
1946 wurden durch Einfugen
¨
zweier Relaxationsraten erster Ordnung ( T11 , T12 ) in die
Bewegungsgleichung die Bloch-Gleichung [25] aufgestellt. Sie ist der einfachste theoretische Ausdruck zur Beschreibung der Relaxation.
~ (t)
dM
~ (t) × B~0 ) − R(M(t)
~
~ 0)
= γ(M
−M
dt


1
0
0
T
 2

R =  0 T12 0 
0 0 T11
(3.22)
(3.23)
dabei ist
• T2 =transversale Relaxationszeit
Sie ist die fur
¨ den Zerfall der transversalen Magnetisierung charakteristische
Zeitkonstante. Die transversale Relaxation, auch Spin-Spin-Relaxation genannt,
beruht auf einem Energieaustausch zwischen benachbarten Atomkernen. Die Gesamtenergie und damit die Besetzungsverh¨altnisse der einzelnen Energieniveaus
a¨ ndert sich dabei nicht. Es handelt sich somit um einen reinen Entropieprozess
mit einem Verlust der Phasenkoh¨arenz zwischen den einzelnen Spins.
56
3. Theoretische Grundlagen
• T1 =longitudinale Relaxationszeit
Sie bezeichnet die Zeitkonstante, innerhalb der die longitudinale Magnetisierung
nach einer Storung
¨
in den Gleichgewichtszustand zuruckkehrt.
¨
Diese Art der
Relaxation wird als Spin-Gitter-Relaxation bezeichnet und ist mit einer Energie¨anderung des Systems verbunden. Der Begriff Gitter stammt ursprunglich
¨
aus der Festkorperphysik
¨
und bezeichnet auch in der Flussigphasen-NMR
¨
die
gesamte Umgebung mit der Energie ausgetauscht werden kann.
Prinzipiell wird bei NMR-Experimenten die zeitliche Entwicklung der transversalen
Magnetisierung: M + (t) = Mx (t) + iMy (t) durch den Resonator im Probenkopf nach
Anregung der Probe durch das HF-Feld B~1 betrachtet. Durch die Einfuhrung
¨
der kom+
plexen Magnetisierung M erhalten die Bloch-Gleichungen die folgenden Ausdrucke:
¨
1
∂M + (t)
M + (t)
(3.24)
= − iω0 +
∂t
T2
1
∂Mz (t)
= − (Mz (t) − M0 )
(3.25)
∂t
T1
Die allgemeinen Losungen
¨
der Bloch-Gleichungen ergeben:
t
+
+
M (t) = M (0)exp(−iω0 t)exp −
T
2
t
t
Mz (t) = Mz (0)exp −
+ M0 1 − exp −
T1
T1
(3.26)
(3.27)
Nach Fouriertransformation der transversalen Magnetisierung bezuglich
¨
t erh¨alt man
die Lorentzlinie, d. h. die Resonanzlinie im Spektrum in der Frequenz-Dom¨ane:
M + (ω) = M + (0)
1
−i(ω0 − ω) −
1
T2
(3.28)
wobei ω0 die Position angibt und die Signalbreite durch T12 bestimmt wird. Die Signalamplitude M + (0) zum Zeitpunkt t=0 ist abh¨angig von der Magnetisierung im Grundzustand M0 und vom Pulswinkel α = γτ B1 , wobei τ die HF-Pulsdauer ist.
Betrachtet man nur magnetisch a¨ quivalente Atomkerne, so hat das aufgezeichnete
Zeitsignal, free induction decay (FID), die Form einer exponentiell ged¨ampften Sinusschwingung. T2 definiert dabei die Zeitspanne, w¨ahrend der der FID beobachtet
werden kann, T1 hingegen die minimale Zeit, die zum Erreichen des Gleichgewichtes benotigt
¨
wird. Die Signalst¨arke ist somit zur transversalen Magnetisierung proportional und klingt mit der Zeitkonstanten T2 ab. In der Praxis dagegen liegt eine
Verteilung von Resonanzfrequenzen vor, wodurch Spins, die unmittelbar nach der Anregung noch eine identische Phase aufweisen, dephasieren. Dadurch verkleinert sich
die vektorielle Summe der magnetischen Momente der einzelnen Spins und folglich
die Signalintensit¨at. Die beobachtete Signalabnahme wird deshalb als empirische T∗2 Relaxation bezeichnet. Sie enth¨alt unter anderem Beitr¨age aus
3.5 Magnetische Kernresonanz
57
• der naturlichen
¨
transversalen Relaxation der Spin-Spin-Wechselwirkung,
• der transversalen Relaxation aufgrund von Magnetfeldinhomogenit¨aten und
Magnetfeldabschirmung und
• dem Signalabfall durch die dynamischen Prozesse wie Diffusion und chemischem Austausch der Kernspins im Raum.
Mit den Erweiterungstermen von Torrey [264, 265] und McConnell [172] gelang es die
Diffusion (3.29) bzw. den chemischen Austausch (3.30) in die Bewegungsgleichung mit
einzubeziehen und theoretisch zu beschreiben:
~ (t)
dM
~ (t) × B~0 ) − R(M(t)
~
~ 0 ) + ∇D∇M(t)
~
= γ(M
−M
dt
~ (t)
dM
~ (t) × B~0 ) − R(M(t)
~
~ 0 ) + KM(t)
~
= γ(M
−M
dt
(3.29)
(3.30)
D ist dabei der Diffusionstensor und K der Austauschtensor. D wird bei homogenen, isotropen Proben zu einer Zahl und kann vor den Nabla-Operator gezogen
werden. Gleichung (3.30) stellt lediglich eine formale Beschreibung der Entwicklung
der Magnetisierung unter Einbeziehung des chemischen Austauschs dar. Hier ist die
Einfuhrung
¨
weiterer Dimensionen, die die austauschenden Kerne enthalten, notwendig.
3.5.2.1.2 Spinecho
Die experimentelle Bestimmung der transversalen Relaxationszeit T2 erfolgt h¨aufig
mittels Spinecho-Sequenz von Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG-Sequenz) [174].
Diese Sequenz nutzt die Reversibilit¨at des Anteils des transversalen Magnetisierungszerfalles, der durch Dephasierung der Spins bedingt ist (T’2 ). Wie in Abbildung 3.10
gezeigt, wird die Probe zun¨achst mit einem 90◦x -Puls angeregt, und die verschiedenen
Spins beginnen aufgrund ihrer Frequenzverteilung zu dephasieren. Nach einer Zeit τ
erfolgt ein 180◦y -Puls, wodurch die Spins nach einem weiteren Zeitintervall τ wieder
rephasieren. Dadurch steigt das Signal mit der Zeitkonstante T’2 an. Es entsteht somit
ein Spinecho mit dem Echomaximum zum Zeitpunkt 2τ nach Einstrahlung des Anregungspulses. Die beiden Impulswinkel werden senkrecht aufeinander geschaltet und
verhindern dadurch, dass Pulsimperfektionen kumulieren. Die Refokussierung findet
bei jedem Echo ausschließlich in der +y-Hemisph¨are statt, wodurch sich Pulsimperfektionen nur als kleine Fehler bei ungeradzahligen Echos bemerkbar machen und sich bei
geradzahligen Echos ausloschen
¨
(CPMG-Bedingung).
58
3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.10: Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-Sequenz und erzeugtes Spinecho, modifiziert nach
[68].
Diese Sequenz ermoglicht
¨
es nicht die naturliche
¨
Spin-Spin-Relaxation, Diffusion und
chemischen Austausch unabh¨angig voneinander zu messen, so dass die experimentell gemessene transversale Relaxation als apparentes bzw. gemessenes T2 bezeichnet
wird.
3.5.2.2 Chemischer Austausch
Als chemischen Austausch bezeichnet man den Austausch von Atomen oder ganzen Molekulen
¨
aus unterschiedlicher chemischer Umgebung. Austauschprozesse zwischen zwei Spinspezies (magnetisch unterschiedliche Kerne einer Atomsorte) konnen
¨
sowohl intramolekular durch Konformations¨anderung als auch intermolekular durch
Brownsche Molekularbewegung zwischen solvatisierenden und freien Protonen oder
durch S¨aure-Base-Reaktionen stattfinden. Eine detaillierte Behandlung des chemischen Austausches mit zahlreichen Beispielen ist in den Werken von Cavanagh [57],
Levitt [158] und Bain [18] zu finden. Betrachtet man ein 2-Spin-System, so wird der
Austausch von Kernen zwischen den beiden Kernzust¨anden A und B:
kh
A ⇌ B
(3.31)
kr
durch die Reaktionsraten kh und kr beschrieben. Die Temperaturabh¨angigkeit der Reaktion ist uber
¨
die Arrhenius-Gleichung enthalten:
∆E
(3.32)
k = C exp −
RT
3.5 Magnetische Kernresonanz
59
wobei C der pr¨a-exponentielle Faktor, R die Gaskonstante, ∆E die Aktivierungsenergie und T die Temperatur in Kelvin sind. Die Austauschgeschwindigkeit verl¨auft nach
der Kinetik erster Ordnung:
vh = kh · [A]
(3.33)
vr = kr · [B]
(3.34)
Zwischen Hin- und Ruckreaktion
¨
stellt sich ein Gleichgewicht ein. Die Gleichgewichtskonstante berechnet sich aus dem Konzentrationsverh¨altnis der beiden Kernzust¨ande
bzw. dem Verh¨altnis der Austauschraten:
K=
kh
[B]
=
[A]
kr
(3.35)
Die Gleichgewichtskonstante an sich ist auch temperaturabh¨angig. Im Fall von S¨aureBase-Reaktionen wird das Verh¨altnis der beiden Zustandskonzentrationen und damit ihr Austausch uber
¨
die Henderson-Hasselbalch-Gleichung durch den pH-Wert bestimmt:
pH = pks + log
[Base]
[S¨aure]
(3.36)
Je nach dem Verh¨altnis zwischen k und ω unterscheidet man zwischen langsamem (k <
ω) und schnellem chemischem Austausch ( k > ω). Die Spektroskopie ermoglicht
¨
uber
¨
das Lorentzprofil der austauschenden Resonanzen eine genaue Analyse des chemischen Austauschs. Durch N¨aherungen wurden zahlreiche Losungen
¨
der McConnellGleichung in Abh¨angigkeit der jeweiligen Resonanzfrequenzen sowohl fur
¨ schnellen
Austausch (Swift-Connick [258] und Luz-Meiboom [163]) als auch fur
¨ langsamen Austausch (Allerhand-Gutowsky [7] und Carver-Richards [56]) vorgestellt. In der Praxis
werden ihre Anwendungen bei einem N-Spin-System jedoch nahezu unmoglich.
¨
In
diesem Fall bietet die Bildgebung die Moglichkeit
¨
uber
¨
experimentell ermittelte Para¨
meter wie T1 , T2 , D oder MTC (Magnetisierungstransferkontrast) Anderungen
im chemischen Austausch global mitzuverfolgen. Ein Formalismus zur Beschreibung eines
Austausches zwischen N-Spin-Zust¨anden ist in [266] enthalten.
3.5.3 Spektroskopie
In der Spektroskopie liefert nicht nur die chemische Verschiebung δ Information uber
¨
die Position des Protons im Molekul
¨ und damit zur Struktur, sondern auch die skalare J-Kopplung. Skalar bezeichnet hier die Tatsache, dass die Orientierung der Spins
zueinander fur
¨ die Kopplung keine Rolle spielt. Sie wird durch die Spins der bindenden Elektronen in kovalenten Bindungen vermittelt und bewirkt eine Aufspaltung
der Resonanzsignale. Die Kopplung von Kernen ist die Voraussetzung fur
¨ 2D-NMRSpektroskopie. Sie wird h¨aufig zur Strukturaufkl¨arung großer Molekule
¨ wie Steroide,
60
3. Theoretische Grundlagen
Peptide und Oligosaccharide, deren 1 H-Spektren aufgrund zahlreicher Signaluberla¨
gerungen nicht mehr analysierbar sind, angewandt. Das einfachste 2D-Experiment ist
das homonukleare (H,H)-korrelierte NMR-Experiment mit dem Namen COSY (COrrelation SpectroscopY) [17]. Wie in Abbildung 3.11 gezeigt, beginnt die Pulssequenz
mit einem 90◦ y -Puls, welcher das Spinsystem anregt und die Pr¨aparationsphase darstellt. In der darauffolgenden Zeit t1, der Evolutionsphase, wirkt die J-Kopplung, d. h.
¨
bei zwei miteinander koppelnden Spins erh¨alt man aus den Uberg¨
angen zwischen
den verschiedenen Spinzust¨anden vier Magnetisierungsvektoren, die aufgrund ihrer
unterschiedlichen Larmorfrequenzen auff¨achern. Der zweite 90◦ y -Puls stellt die sogenannte Mischphase dar und ist mit einem Magnetisierungstransfer zwischen den
¨
Zust¨anden koppelnder Spins verbunden, wodurch bestimmte Uberg¨
ange stimuliert
werden, deren Signalemission im Zeitintervall t2 , der Detektionsphase, aufgezeichnet
wird. Die Fourier-Transformation des FIDs liefert ein Spektrum in der ersten spektroskopischen Dimension des Experimentes (F2 ). Durch Wiederholung des Experimentes
wird t1 inkrementiert und das Signal jeweils zum gleichen Zeitpunkt der Detektionsphase aufgezeichnet. Seine Fourier-Transformation liefert dann die zweite spektroskopische Dimension (F1). Betrachtet man zwei Spins A und B mit den Resonanzfrequenzen ωA und ωB , so befinden sich auf der Diagonalen zwei Signale an den Positionen
(ωA , ωA ) und (ωB , ωB ) und bei J-Kopplung zwischen den Spins zus¨atzlich zwei Kreuzsignale an den Positionen (ωA , ωB ) und (ωB , ωA ).
Abbildung 3.11: (H,H)-korreliertes
Experiment, modifiziert nach [68].
COSY-
3.5.4 Bildgebung
Die Anwendung der NMR fur
¨ die Bildgebung, erfordert eine ortsaufgeloste
¨
Akquisition, d. h. dem NMR-Signal muss eine Ortsinformation aufgepr¨agt werden. Dazu schal~ 0 -Feld uberlatet man mit Gradientenspulen ortsabh¨angige Magnetfelder, die dem B
¨
~ geschaltet ist, besitzen die Spins in einer
gert sind. Solange ein Magnetfeldgradient (G)
Probe eine ortsabh¨angige Larmorfrequenz:
~
ω(~r) = γ(B0 + ~rG)
(3.37)
3.5 Magnetische Kernresonanz
61
mit:
 ∂B 
z
∂x

z
~ =
G
 ∂B
∂y 
(3.38)
∂Bz
∂z
Je nach Zeitpunkt und Richtung der Gradientenschaltung unterscheidet man verschiedene Moglichkeiten
¨
der Ortskodierung:
3.5.4.1 Schichtselektionsgradient
In einem NMR-Experiment werden die Spins einer Probe durch einen HF-Puls der
Dauer ∆t angeregt. Der Puls besitzt dabei nach:
∆ω · ∆t ∼
=1
(3.39)
~z
eine Bandbreite von ∆ω. Liegt w¨ahrend der Pulseinstrahlung nun ein Gradient G
senkrecht zur anzuregenden Schicht an, so erfahren nur die Spin einer Schicht der
Dicke ∆z eine Anregung. Die Dicke ∆z bestimmt sich zu:
∆z =
∆ω
2πγGz
(3.40)
Bei Pulswinkeln bis 90◦ berechnet sich das angeregte Schichtprofil in sehr guter N¨aherung als Fouriertransformierte des Pulsprofils in der Zeit-Dom¨ane.
3.5.4.2 Lesegradient
Eine weitere Moglichkeit
¨
der Ortsaufpr¨agung ergibt sich durch Anlegen eines Lese~ x w¨ahrend der Akquisition. Dadurch entspricht jeder Frequenz, die im
gradienten G
FID enthalten ist, ein Ort x und das Spektrum weist mit:
f (x) =
γ
Gx x
2π
(3.41)
eine kontinuierliche Frequenzverteilung auf.
3.5.4.3 Phasenkodiergradient
Die dritte Moglichkeit
¨
der Ortskodierung stellt die Phasenkodierung dar. Hierzu wird
ein Magnetfeldgradient vor der Akquisition fur
¨ eine Zeit τ angelegt. Nach Abschalten
dieses Phasenkodiergradienten besitzt das NMR-Signal dadurch eine ortsabh¨angige
Phase mit:
Z τ
~ r dt
Φ(~r, τ ) = ω0 τ +
γ G(t)~
(3.42)
0
62
3. Theoretische Grundlagen
3.5.4.4 k-Raum
In Analogie zur Verwendung des Frequenzraumes als Fourier-Raum des Zeitsignals
in der NMR-Spektroskopie l¨asst sich das MR-Signal der Bildgebung durch die Wellenzahlenvektoren ~k(t) beschreiben, die den k-Raum aufspannen und wie folgt definiert
sind:
Z t
γ ~ ′ ′
~k(t) =
G(t )dt
(3.43)
0 2π
Um eine vollst¨andige Information uber
¨
die r¨aumliche Struktur zu erhalten, muss der
gesamte k-Raum abgetastet werden. Im zweidimensionalen Bildgebungsexperiment
erfolgt dies durch Schalten eines Phasenkodier- und Lesegradienten in zueinander orγ
Gx t
thogonalen Raumrichtungen. Nach Substitution fur
¨ die Leserichtung mit kx = 2π
γ
und fur
¨ die Phasenkodierrichtung mit ky = 2π Gy t erh¨alt man fur
¨ das aufgenommene
Signal einer ausgedehnten Probe:
Z
s(~k) ∝ ρ(x, y)exp(2πixkx )exp(2πiyky )dxdy
(3.44)
Dabei ist ρ(x, y) die Spindichte in der xy-Ebene. Aus dem Signal im k-Raum erh¨alt man
somit durch Fouriertransformation bezuglich
¨
kx und ky das Bild im Ortsraum. Das Signal, welches bei konstanter Phasenkodierzeit bei einer bestimmten Gradientenst¨arke
aufgenommen wird, entspricht genau einem Bildpunkt im k-Raum. Zur Aufnahme eines 2D-Bildes muss somit die Akquisition nach der Phasenkodierung mit unterschiedlichen Gradientenst¨arken wiederholt werden. Die Gradientenst¨arke wird dabei von
-Gmax bis +Gmax mit a¨ quidistanter Gradientenschrittweite ∆k variiert. Bei jeder Akquisition erfolgt die Schaltung des Lesegradienten uber
¨
die Zeitdauer t. In dieser Zeit
werden TD (time domain) Datenpunkte aufgenommen, d. h. eine k-Raum-Zeile wird
F OV,Gesichtsf eld
) wird somit TD Datenpunkten abgetastet. Die Auflosung
¨
(∆x = Anzahl
der Bildpunkte
wohl durch den Lesegradienten als auch durch den Phasengradienten bestimmt. In
Leserichtung wird sie durch die Bandbreite SW und TD bestimmt, in Phasenkodierrichtung durch die Gradientenschrittweite ∆k. Fur
¨ eine hohe Auflosung
¨
ist die Phasenkodierung der zeitlimitierende Faktor.
63
Kapitel 4
Ergebnisse und Diskussion
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
¨
Uberblick:
In diesem Kapitel wird die Etablierung eines zuverl¨assigen, empfindlichen, reproduzierbaren und einfach zu handhabenden Invitro-High-Throughput-Screening-Verfahrens fur
¨ Zytotoxizit¨atsmessungen an Trypanosoma brucei brucei beschrieben. Dieses standardisierte Verfahren diente zur Untersuchung unterschiedlicher Substanzklassen aus den verschiedenen Teilprojektgruppen des SFB 630
auf ihre antitrypanosomale Aktivit¨at. Insgesamt wurden im Rahmen
dieses Projektes: 23 Chinolone, 62 Piperidine, 23 Naphthalimide, 164
Naphthylisochinolin-Alkaloide und strukturverwandte, synthetisierte Substanzen, 102 Cysteinprotease-Inhibitoren und 9 Siliziumverbindungen getestet, deren Struktur-Wirkungs-Beziehungen an ausgew¨ahlten Beispielen diskutiert werden.
4.1.1 Auswahl des Testsystems
Die Erreger der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis (HAT) Trypanosoma brucei
rhodesiense und Trypanosoma brucei gambiense weisen mit Sicherheitsstufe 2 und 3 eine hohe Pathogenit¨at auf. Da einige genetische Untersuchungen die Verwandtschaft
der human- und tierpathogenen Trypanosomenst¨amme best¨atigten [166, 249], wurde
Trypanosoma brucei brucei (T. b. b.), einer der tierpathogenen Erreger der Nagana-Seuche
beim Rind, als Teststamm fur
¨ die Zytotoxizit¨atsmessungen eingesetzt. In dieser Arbeit
wurde mit dem Trypanosomenklon T.b.b. TC221 gearbeitet [123]. Diese Blutstromform
ist an Kulturbedingungen gut adaptiert und eignet sich daher fur
¨ In-vitro-Arbeiten
[140]. Zum Aufbau eines High-Throughput-Screening-Verfahrens wurde auf die in
64
4. Ergebnisse und Diskussion
der Literatur beschriebenen Methoden zur Auswertung von Trypanosomenkulturen
zuruckgegriffen.
¨
Die Bestimmung der Trypanosomenproliferation und -vitalit¨at kann
radiometrisch durch Messung der Einbaurate radioaktiv markierter Nucleotide wie
z. B. [3 H]Hypoxanthin [47, 78] oder durch Ausz¨ahlen der kultivierten Trypanosomen
mittels Coulter-Counter bzw. mikroskopisch [141] erfolgen (siehe auch Abschnitt 1.2.2
und Abschnitt 1.2.3). Der Nachteil all dieser Methoden ist jedoch ihr hoher Zeitaufwand. Die meisten Verfahren basieren daher auf dem Einsatz von Farbstoffen und einer optischen Auswertung. H¨aufig zur Auswertung von Trypanosomenkulturen angewandte Indikatoren sind z. B. 2’,7’-Bis-(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein-pentaacetoxy-methylester (BCECF-AM) und AlamarBlue [191, 217]. Erfahrungsberichte zeigen, dass mit der AlamarBlue-Methode ein optimales Verfahren zur Bestimmung der
Zellproliferation zur Verfugung
¨
steht [217]. Sie erfordert keine Extraktions-, Waschund Zentrifugationsschritte, ist somit zeitsparend und voll automatisierbar [6]. AlamarBlue selbst ist wasserloslich
¨
und nicht zytotoxisch [217]. Seine Anwendung auf
Arzneistoff-exponierte Zellkulturen zur Auswertung des antitrypanosomalen Potenzials entspricht in Bezug auf Zuverl¨assigkeit, Sensitivit¨at, Reproduzierbarkeit, einfacher Handhabung und Finanzierbarkeit den Anforderungen eines High-ThroughputScreening-Verfahrens.
4.1.2 AlamarBlue
AlamarBlue gehort
¨ zur Gruppe der Reduktions-Oxidations(REDOX)-Indikatoren und
wirkt stoffwechselsensitiv. Es nutzt die Eigenschaft proliferierender Zellen das Verh¨altnis zwischen reduzierter und oxidierter Form der Coenzyme NADPH/NADP,
FADH/FAD, FMNH/FMN und NADH/NAD stetig zu vergroßern.
¨
O
NADPH, FADH, FMNH,
NADH, Cytochrom
+
N
O
O
OH
Resazurin (ox.)
Indigoblau
Absorptionsmaximum: 600 nm
N
O
O
OH
Resorulfin (red.)
Pink
Absorptionsmaximum: 570 nm
Abbildung 4.1: REDOX-Reaktion im AlamarBlue-Assay.
Im Grundzustand liegt AlamarBlue in der oxidierten Form, als Resazurin
(λmax =600 nm) vor. Bei einem pH von 7 und bei 25 ◦ C besitzt es ein REDOX-Potenzial
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
65
von +380 mV. Nach Aufnahme in die Zellen wird es wie in Abbildung 4.1 gezeigt durch
NADPH, FADH, FMNH, NADH und Cytochromen zum Resorulfin (λmax =570 nm) reduziert. Visuell ist diese Reaktion durch einen Farbumschlag von blau nach pink erkennbar. Die Quantifizierung der Farbreaktion kann sowohl fluorimetrisch als auch
¨
spektralphotometrisch erfolgen. Die Uberlappung
der Absorptionsspektren der reduzierten und oxidierten AlamarBlue-Formen erfordert zur spektralphotometrischen Bestimmung des Ausmaßes der Zellproliferation die Messung bei zwei verschiedenen
Wellenl¨angen im Bereich der beiden Absorptionsmaxima.
4.1.3 AlamarBlue-Test
Der AlamarBlue-Test wird in 96-Mikrotiterplatten durchgefuhrt.
¨
Zur Validierung des
Verfahrens mussen
¨
die Zelldichte, Inkubationszeiten und die Mediumzusammensetzung fur
¨ den jeweiligen Teststamm optimiert werden. In der Dissertation von Karin
Merschjohann [175] wurde das AlamarBlue-Verfahren bereits auf Trypanosoma brucei
brucei TC221 angewandt, so dass auf optimierte Parameter zuruckgegriffen
¨
werden
4
konnte. Dazu wird zun¨achst eine Zellsuspension mit 10 vitalen Zellen pro Milliliter
in Baltz-Medium pr¨apariert und mit dem potenziellen Wirkstoff fur
¨ 24 h inkubiert.
Vor jedem Versuch sollte sichergestellt werden, dass sich die Parasiten zum Zeitpunkt
der Ernte in der exponentiellen Phase befinden. Anderenfalls kann ihre Vermehrungsgeschwindigkeit von Versuch zu Versuch trotz initialer gleicher Parasitendichte stark
schwanken und unterschiedliche Ergebnisse fur
¨ die Wirksamkeit einer Substanz liefern. Es ist ferner darauf zu achten, dass das verwendete Losungsmittel
¨
nicht hoher
¨
als
in 1 %iger Konzentration in der Zellsuspension vorliegt um eine mogliche
¨
losungsmit¨
telbedingte Zytotoxizit¨at auszuschließen. Den Arzneistoff-exponierten Inokula werden schließlich 10 % AlamarBlue zugesetzt und und der gesamte Ansatz fur
¨ weitere 24 h inkubiert. Kein Farbumschlag spricht fur
¨ eine starke Inhibition der Zellen.
Eine Pinkf¨arbung ist dagegen ein Indiz fur
¨ eine schwache Inhibition und eine starke Zellproliferation. Die Auswertung erfolgte spektralphotometrisch mittels ELISAReader. Zur Bestimmung der Differenzabsorption zwischen oxidierter und reduzierter
AlamarBlue-Struktur wurden die Messwellenl¨angen in Anlehnung an die Produktinformationen der Firma Trinova Biochem auf 550 nm und 630 nm festgelegt [3]. Nach
der photometrischen Auswertung werden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt. Hier wird
die gemessene Differenzabsorption in Bezug auf den Messwert einer Positivkontrolle (Zellsuspension mit 1 % Losungsmittel
¨
und 10 % AlamarBlue) berechnet und gegen die eingesetzten Testkonzentrationen aufgetragen. Aus den sigmoidalen DosisWirkungs-Kurven wird mittels linearer Interpolation der ED50 -Wert [134] (Abschnitt
1.2.2) berechnet. Das verwendete Testverfahren, die Mediumzusammensetzung und
die Berechnung der ED50 sind im Experimentellen Teil ausfuhrlich
¨
beschrieben.
66
4. Ergebnisse und Diskussion
4.1.3.1 Losungsmittel
¨
Absorbance [% of control]
Die AlamarBlue-Methode sollte zur Testung vieler verschiedener Substanzklassen angewandt werden. Dazu war es notwendig zun¨achst die einzusetzenden Losungsmit¨
tel DMSO, EtOH und 0.1 M NaOH auf ihre zytotoxische Wirkung zu untersuchen
und mogliche
¨
Reaktionen mit AlamarBlue, die zu spektralen Verschiebungen fuhren
¨
konnen,
¨
auszuschließen. In Abbildung 4.2 sind die gemessenen Differenzabsorptionen inokulierter Trypanosomenkulturen unter Zusatz verschiedener Losungsmittelkon¨
zentrationen in Bezug auf den Messwert einer Kontrollsuspension (Trypanosomenkultur ohne Losungsmittelanteil)
¨
in einem Dosis-Wirkungs-Diagramm aufgetragen.
W¨ahrend 0.1 M NaOH selbst bei 10 %igem Anteil keine Auswirkung auf die Zellproliferation zeigt, fuhren
¨
EtOH und DMSO ab einer Konzentration von 2.5 % zu einer
nahezu vollst¨andigen Hemmung des Zellwachstums. In Anwesenheit eines 1 %igen
Losungsmittelanteils
¨
bleibt die Zellproliferation bei EtOH unbeeinflusst. Bei DMSO
dagegen werden nur 60 % des naturlichen
¨
Wachstums erreicht. Eine weitere Reduktion
des Losungsmittelanteiles
¨
war jedoch aufgrund der teilweisen schlechten Loslichkeit
¨
der Testsubstanzen nicht moglich,
¨
so dass auch unter Verwendung von DMSO, die
Zytotoxizit¨atsmessung mit 1 %igem Losungsmittelanteil
¨
durchgefuhrt
¨
wurde. Rein
rechnerisch betrachtet, bringt dies keine Nachteile mit sich, denn die Zytotoxizit¨at
wird stets in Bezug auf eine losungsmittelenthaltende
¨
Positivkontrolle ermittelt. Eine Verst¨arkung der antitrypanosomalen Wirkung der Testsubstanzen ist jedoch nicht
auszuschließen. Hinweise auf Interaktionen zwischen AlamarBlue und verschiedenen
Losungsmitteln
¨
und dadurch Verschiebungen seiner Absorptionsbanden a¨ hnlich der
Solvatochromie konnten nicht gefunden werden.
140
0.1 M NaOH
120
DMSO
EtOH
100
80
60
40
Abbildung 4.2: Dosis-WirkungsDiagramme verschiedener Los¨
ungsmittel fur
¨ den Teststamm
Trypanosoma brucei brucei.
20
0
0
2
4
6
8
10
Concentration [%]
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
67
4.1.3.2 Referenzsubstanzen
Absorbance [% of positive-control ]
¨
Zur Uberpr
ufung
¨
des AlamarBlue-Test-Verfahrens unter den gegebenen Laborbedingungen wurde die Wirksamkeit der derzeitig zur Therapie der HAT eingesetzten Arzneistoffe Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na, Eflornithin-HCl, Nifurtimox und Melarsoprol auf T. brucei brucei bestimmt. Die Wirkung dieser Substanzen ist in der Literatur gut dokumentiert und eignet sich somit als Referenzwert.
120
Pentamidin diisethionat
Suramin-Na
100
Eflornithin-HCl
Nifurtimox
80
Melarsoprol
60
40
20
0 -5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
1
2
10
10
Concentration [ µM]
Abbildung 4.3: Dosis-Wirkungs-Kurven von Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na und Eflornithin-HCl
(gelost
¨ in H2 O), Nifurtimox und Melarsoprol (gelost
¨ in DMSO). Berechnet wurden die Konzentrationen auf die Salz-freie Arzneistoffform. Aufgetragen sind die Mittelwerte aus drei unabh¨angigen Testdurchl¨aufen. (Bei den Punkten, bei welchen keine Fehlerbalken zu erkennen sind, ist die Abweichung
sehr klein.)
Arzneistoff
T. b. b. ED50 (gemessen)
[µM]
T. b. b. ED50 (Literaturwert)
[µM]
Pentamidin diisethionat
Suramin-Na
Eflornithin-HCl
Melarsoprol
Nifurtimox
0.0029±0.0002
0.31±0.05
22.9±4.6
0.0026±0.0004
3.4±0.4
0.0002-0.002 [176]
0.007-21.3 [176]
11.5 [175]
-
Tabelle 4.1: Gegenuberstellung
¨
der gemessenen und der in der Literatur dokumentierten antitrypanosomalen Aktivit¨at von Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na, Eflornithin-HCl, Melarsoprol und Nifurtimox. Die Werte beziehen sich auf die Salz-freie Arzneistoffform. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei unabh¨angigen Testdurchl¨aufen berechnet. Bei Melarsoprol und Nifurtimox
ließen sich Referenzwerte nicht eruieren.
68
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.3 zeigt die entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven im Konzentrationsbereich zwischen 100 µM und 10 pM. Aus diesen wurden die entsprechenden ED50 Werte mittels linearer Interpolation berechnet und mit den in der Literatur dokumentierten Ergebnissen verglichen (Tabelle 4.1). Die Literaturwerte mussen
¨
kritisch betrachtet werden, denn aufgrund der vielen Moglichkeiten
¨
Zytotoxizit¨at zu bestimmen,
streuen sie uber
¨
einen breiten Wirkbereich. Die eigens ermittelten Ergebnisse liegen
jedoch akzeptabel im dokumentierten Bereich und korrespondieren sehr gut mit den
Ergebnissen aus dem Arbeitskreis Steverding in Norfolk (Eflornithin: ED50 =11.5 µM,
Pentamidin-diisethionat: ED50 =0.0025 µM, Suramin: ED50 =0.36 µM), womit die Richtigkeit der Durchfuhrung
¨
des Testverfahrens best¨atigt ist. Die funf
¨ zur Verfugung
¨
stehenden Arzneistoffe dienten w¨ahrend des gesamten Projektes als Referenzsubstanzen
und wurden von Zeit zu Zeit zur Kontrolle der Testung und der Protozoenkultur eingesetzt. Dadurch konnten Fehler in der Routine und mogliche
¨
Mutationen und Verunreinigungen der Zellkulturen schnell erkannt und die Richtigkeit des Verfahrens
gew¨ahrleistet werden. Da neben der Richtigkeit der Methode auch die Reproduzierbarkeit gegeben war - die Streuung der berechneten ED50 lag unterhalb der fur
¨ Biotests ublichen
¨
30 % [216] - waren die beiden wichtigsten Voraussetzungen zum Einsatz
des AlamarBlue-Tests zur Reihenuntersuchung der Zytotoxizit¨at von Substanzen auf
Trypanosomen erfullt.
¨
4.1.3.3 Etabliertes Testsystem
Routinemessungen zeigten jedoch bald Grenzen
des Testsystems. So wiesen einige TestsubstanO
17
zen ein ausreichendes REDOX-Potenzial auf (<
4
5
O
3
10
6
+380 mV), um Resazurin zum Resorulfin zu re2
7
duzieren. Entdeckt wurde diese F¨ahigkeit an den
9
8
N1
H
Strukturabkommlingen
¨
des Antidesmon. AntiO
desmon ist ein pflanzliches Alkaloid, welches
Abbildung 4.4: Antidesmon
1996 erstmals isoliert wurde und aufgrund seiner
Struktur und seines Syntheseweges als erster Repr¨asentant einer neuen Klasse von Alkaloiden gilt [40, 44]. Durch spektroskopische
Untersuchungen und Derivatisierungen wurde die Struktur als 3-Methoxy-2-methyl5-n-octyl-1,5,6,7-tetrahydro-chinolin-4,8-dion aufgekl¨art [40]. Interesse an dieser Strukturgruppe weckte vor allem seine hohe Aktivit¨at gegenuber
¨
Trypanosoma cruzi, dem
Erreger der Chagas-Krankheit, seine schwache Wirksamkeit gegen Leishmania donovani und sein bisher unbekannter Wirkmechanismus [117]. Eine Wirksamkeit gegenuber
¨
einer Trypanosoma brucei-Spezies konnte bisher zwar nicht gezeigt werden, dennoch
wurden die in Abbildung 4.6 dargestellten Strukturabkommlinge
¨
des Antidesmon auf
ihre Wirksamkeit gegenuber
¨
Trypanosoma brucei brucei getestet. Auf den ersten Blick
18
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
69
O
5
OH
4
OH
3
10
6
4
5
3
10
6
2
7
2
7
9
N1
Me
H
3-Hydroxy-2-methyl1H-chinolin-4-on
8
OH
9
N
8
1
Me
3,4-Dihydroxy-2-methylchinolin
OH
O
+
O
OH
N
O
N
+
OH
O
O
+
Me
N
O
O
Resazurin (ox.)
Me
N
OH
Resorulfin (red.)
Abbildung 4.5: REDOX-Reaktion im AlamarBlue-Test.
O
O
O
OMe
N
Me
N
Me
O
O
H
Me
OMe
OH
Me
N
Me
OMe
Me
N
Me
H
O
OMe
N
OH
O
O
O
NH2
O
O
O
O
N
H
N
O
Abbildung 4.6: Strukturverwandte Substanzen des Antidesmon ohne Wirksamkeit gegen Trypanosoma
brucei brucei (d. h. der berechnete ED50 -Wert lag uber
¨
100 µM).
zeigte keine der Strukturen eine Aktivit¨at. Selbst bei Konzentrationen von 100 µM
lag Resazurin nahezu vollst¨andig zu Resorulfin reduziert vor. Die Unwirksamkeit dieser Substanzgruppe konnte allerdings erst durch visuelle, mikroskopische Kontrolle und das Ausz¨ahlen beweglicher Trypanosomen best¨atigt werden, denn es zeigte
sich, dass alle Strukturen mit einem 3-Hydroxy-2-methyl-chinolin-4-on-Gerust
¨ in das
REDOX-System des AlamarBlue eingreifen. Wie in Abbildung 4.5 dargestellt, liegt das
3-Hydroxy-2-methyl-chinolin-4-on in Losung
¨
im Gleichgewicht mit seinem entsprechenden 3,4-Dihydroxy-chinolin vor. Vermutlich kann dieses a¨ hnlich dem Chinon-
70
4. Ergebnisse und Diskussion
k
ti v
i
s
lle
ro
t
on
o
lle
ro P
t
on e n
h
k
c
v
ti
ei
om
gl
ga nos
b
e
N pa
lla
Nu z Try
n
l sta tel +
b
ti te
it
u
m
s
m
t
s
s
Testung potenzieller Wirksubstanzen
g
g
es
un M T sun
s
im Konzentrationsbereich:
Lö
Lö 0 µ
100 µM bis 10 pM
10 + 1%
1%
+
+
m
iu m d iu m d iu
d
e
e
e
rm urm turm
u
t
t
l
l
l
Ku
Ku
Ku
Kulturmedium
+ Trypanosomen
+ Testsubstanzen in Verdünnungen
Abbildung 4.7: Schema des etablierten AlamarBlue-Test-Verfahrens.
Hydrochinon-REDOX-Paar, durch AlamarBlue zum 2-Methyl-chinolin-3,4-dion oxidiert werden. Eine Erweiterung des Test-Verfahrens um eine Negativkontrolle (Medium + Testsubstanz + AlamarBlue), in der das REDOX-Potenzial gegenuber
¨
Resazurin
gepruft
¨ werden konnte, erwies sich somit als notwendig, um Substanzen, die in ihrer Wirkung f¨alschlicherweise als negativ eingestuft wurden, entdecken zu konnen.
¨
Der etablierte AlamarBlue-Test wurde optimiert nach dem Schema aus Abbildung 4.7
durchgefuhrt.
¨
Zeigte eine Testsubstanz eine positive Pink-F¨arbung der Negativkontrolle, konnte die Zytotoxizit¨at nicht mittels AlamarBlue-Verfahren bestimmt werden
und die kultivierten Zellsuspensionen wurden durch mikroskopisches Ausz¨ahlen vitaler, d. h. mobiler Zellen ausgewertet.
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
71
4.1.4 Struktur-Wirkungs-Beziehungen benzannelierter Systeme
4.1.4.1 Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs)
Interessante Alkaloide fur
¨ die Leitstruktursuche gegen tropische Protozoen-Erkrankungen sind vor allem in der GrupN
pe der Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) zu finden. Einigen dieser Substanzen wie z. B. Dioncopeltin A und Dioncophyllin B und C konnte sowohl in vitro als auch in viAbbildung 4.8:
vo eine hohe Aktivit¨at gegen Plasmodium falciparum [99]
Naphthylisochinolin
nachgewiesen werden, andere hingegen zeigten gegen Erreger der Leishmaniose [33], Chagas-Krankheit und Afri¨
kanischen Schlafkrankheit [29, 36, 40] eine vielversprechende Aktivit¨at. Uber
mogli¨
che Zielstrukturen und Wirkmechanismen liegen jedoch noch keine Erkenntnisse vor.
Das Grundgerust
¨ bildet bei dieser Substanzgruppe das Isochinolin, an welches eine
Naphthalin-Einheit geknupft
¨
ist. Bisher wurden 120 Naphthylisochinolin-Alkaloide
aus afrikanischen Lianen-Gew¨achsen isoliert. Ihr Vorkommen beschr¨ankt sich auf die
Familie der Dioncophyllaceae, die in drei Gattungen auftritt Habropetalum, Dioncophyllum und Triphyophyllum, und auf die eng verwandte Familie der Ancistrocladusaus mit
der monotypischen Gattung Ancistrocladus [30, 37]. Im Rahmen dieser Studie wurde
eine große Bibliothek verwandter Substanzen aus Natur und Synthese aufgebaut und
in vitro auf Trypanosoma brucei brucei getestet.
5
4
3
6
7
8
1
2
4.1.4.1.1 C,C-verknupfte
¨
NIQs
Die Ergebnisse einiger C,C-verknupfter
¨
NIQs sind in Abbildung 4.9 zusammengestellt. Bei dieser Alkaloid-Gruppe ist das Naphthalin mit dem Isochinolin uber
¨
eine C,C-Biaryl-Achse verbunden. Bei unseren Untersuchungen wurde zun¨achst vom
Dioncophyllin A (1), einem sehr gut verfugbaren
¨
Naphthylisochinolin-Alkaloid, welches sowohl aus der westafrikanischen Triphyophyllum-peltatum-Liane isoliert [38], als
auch synthetisch gewonnen wurde [34], ausgegangen. Es zeigte mit einem ED50 Wert von 3.4±1.7 µM eine vergleichbare Aktivit¨at zu Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM).
¨
Ahnliche
Ergebnisse wurden mit den strukturverwandten Substanzen Dioncophyllin B (2) [41] (ED50 =2.6±0.4 µM), Dioncophyllin C (3) [39] (ED50 =4.2±2.3 µM) und
5’-O-Demethyldioncophyllin A (5) [43] (ED50 =3.8±1.3 µM) erreicht. Ausgehend von
5’-O-Demethyldioncophyllin A fuhrt
¨
eine zus¨atzlich eingefugte
¨
Hydroxy-Gruppe an
den Methyl-Rest des Naphthalins im Dioncopeltin A (4) [42] zu einer Reduktion der Aktivit¨at im Großenbereich
¨
einer Zehnerpotenz (ED50 =22.2±4.8 µM). Ebenfalls zeigten Korupensamin A (6) (ED50 =48.6±4.8 µM) und Korupensamin B (7) [32]
(ED50 =45.8±5.1 µM) mit jeweils zus¨atzlicher Hydroxy-Gruppe an Position 6 des
Tetrahydroisochinolin-Gerustes
¨
stark verminderte Aktivit¨at, welche im dimeren Mi-
72
4. Ergebnisse und Diskussion
chellamin B (8) [45] (ED50 > 65.9µM), das durch seine anti-HIV-Wirksamkeit bekannt
wurde, noch weiter abnahm. Interessant erwies sich dagegen das dimere Ancistrogriffithin A (10) [45] (ED50 =0.85± 0.05 µM). Es besitzt, verglichen mit Michellamin B, zwei
O-Methylierungen mehr und seine Wirkung kommt der des Suramin (ED50 =0.31±0.05
µM) sehr nahe. Fur
¨ sein monomeres Ancistrogriffin C (11) (ED50 >65.9 µM) konnte keine Wirkung nachgewiesen werden. Die Wirkung des strukturverwandten Ancistrogriffin A mit terti¨arer Amino-Gruppe (9) (ED50 =14.1±1.3 µM) lag dagegen noch im
Wirkbereich von Eflornithin (ED50 =22.9±4.6 µM). Ancistroealain A (12) (ED50 =4.5 ±0.8
µM), einem der aktivsten Naphthylisochinolin-Alkaloide gegen Leishmania donovani,
zeigte mit seinen zwei Methoxy-Gruppen an einem Dihydroisochinolin-Gerust
¨ eine
vergleichbare Aktivit¨at mit Dioncophyllin A (1) (ED50 =3.4±1.7 µM). Mit vollst¨andig
dehydriertem Isochinolin-Gerust
¨ wurden die beiden Substanzen ent-Dioncophyllein
A (13) und Dioncophyllein D (14) n¨aher untersucht. Dioncophyllein D besitzt im Gegensatz zu den bisher diskutierten Substanzen keine stabile Konfiguration und liegt
in der P- und M-Konfiguration im Gleichgewicht vor. Beide Substanzen wiesen gegenuber
¨
Dioncophyllin A eine um etwa eine Zehnerpotenz verminderte Wirksamkeit
auf. Um die Beeinflussung der antitrypanosomalen Aktivit¨at durch O-Methylierung
der Hydroxy-Gruppe am Isochinolin-Gerust
¨ und dessen Hydrierungsgrad zu untersuchen, wurden die synthetisierten Naphthalin-freien Substanzen (15-17b) getestet.
Dabei zeigte Substanz (15) mit seiner 1R,3R-Konfiguration am TetrahydroisochinolinRing keine Wirkung. Ebenso erwies sich das korrespondierende Dihydroisochinolin
(16a) als unwirksam. Das O-methylierte Pendant (16b) zeigte dagegen mit einem ED50 Wert von 56.1±15.3 µM eine schwache Aktivit¨at. Die Verst¨arkung der antitrypanosomalen Wirksamkeit durch O-Methylierung konnte auch bei den 3S-konfigurierten
Analoga beobachtet werden (Substanzen (17a) und (17b)), wobei die Aktivit¨at von
Substanz (17b) die Wirksamkeit von Eflornithin (ED50 =22.9±4.6 µM) erreichte.
Fazit:
Eine gute antitrypanosomale Wirksamkeit mit einem ED50 -Wert zwischen 3 und 4 µM
zeigten C,C-verknupfte
¨
Naphthylisochinolin-Alkaloide
• mit einer oder zwei phenolischen Hydroxy-Gruppen und
• unabh¨angig vom Hydrierungsgrad des Isochinolin-Gerustes.
¨
Eine Abschw¨achung der Aktivit¨at zeigte sich vor allem bei einer zu hohen Anzahl
freier Hydroxy-Funktionen.
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
73
OH OMe
Me
Me
Me
1' 7
6'
R NH
7
OH
OH
MeO
MeO
o
R
R NH
P
R
OH
Me
P 51'
Me
R NH
OH
Dioncophyllin B (2)
ED50 = 2.6 ± 0.4 µM
Dioncophyllin A (1)
ED50 = 3.4 ± 1.7 µM
ED50 = 4.2 ± 2.3 µM
Me
1'
Me
R
M
R NH
7
R
P
Me
R NH
7
1'
OH
MeO
HO
OH
MeO
HO 5'
Me
Dioncopeltin A (4)
5'-O-Demethyldioncophyllin A (5)
ED50 = 22.2 ± 5.1 µM
ED50 = 3.8 ± 1.3 µM
Me
MeO OH
HO
P
Me
Me
HO
M
M 5'''
OH
8''
OH
Me
R
R
R
OMe OH
NH
Me
Korupensamin A (6)
ED50 = 48.6 ± 4.8 µM
OH
5
Me
Me
R
R NH
Korupensamin B (7)
ED50 = 45.8 ± 5.1 µM
Me
P 8'
HO
OH
OMe
o
8'
5
R NH
2 OAc
R
Me
8'
5
OH
HN R
MeO OH
Me
Me
Me
Dioncophyllin C (3)
Me
HO
Me
R
OMe
Me
Me
OH
Michellamin B (8)
ED50 > 65.9 µM
Me
74
4. Ergebnisse und Diskussion
Me
HO
Me
S
P
1' 7
8' 7
MeO
HO
S NH
R
Me
Me
Me
S
S NH
P
Me
OMe Me
MeO
HO
MeO
S NMe
OH
Me
Ancistrogriffin C(11)
Ancistrogriffin A(9)
ED50 = 14.1 ± 1.3 µM
OMe
HO 7'''
8'' M
Me
ED50 > 65.9 µM
OMe
OH
6'' 6'
o
OMe OH
MeO
Me
M 8'
7
OH
MeO OMe
Me
R
HN S
P 8'
MeO
M
Me
5
Me
6
Me
Me
S
MeO
MeO
Ancistrogriffithin A(10)
N
N
1'
7
Me
OH
Me
ED 50 = 0.85 ± 0.05 µM
ent-Dioncophyllein A (13)
OMe Me
ED50 = 33.3 ± 20.3 µM
Ancistroealain A (12)
ED50 = 4.5 ± 0.8 µM
Me
Me
6
7' 8'
8' 7
MeO
MeO
N
OH
N
P
M
7'
Me
6
7
fast
OH
MeO
MeO
Me
Me
Me
Dioncophyllein D(14)
ED50 = 50.9 ± 18.7 µM
HO
Me
R
R NH
RO
Me
R
a
b
N
OMe Me
16
R
ED50 [µM]
H
>65.9
Me 56.1 ± 15.3
OMe Me
(15) ED50 > 65.9 µM
RO
Me
S
N
17
6
a
b
R
ED50 [µM]
H
>65.9
Me 21.7 ± 9.2
OMe Me
Abbildung 4.9: Antitrypanosomale Aktivit¨at (T. b. b.) C,C-verknupfter
¨
Naphthylisochinolin-Alkaloide
und Untersuchungen zum Isochinolin-Grundgerust.
¨
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
75
4.1.4.1.2 N,C-verknupfte
¨
NIQs
Mit der Entdeckung der N,C-verknupften
¨
Naphthylisochinolin-Alkaloide konnte
das Spektrum moglicher
¨
Verknupfungsarten
¨
erweitert werden [31, 287]. Abbildung
4.10 zeigt die Substanz Ancistrocladinium B [35] mit ihrer quart¨aren, kationischen
Isochinolin-Struktur als Trifluoracetat-Salz. Sie wurde aus einer Ancistrocladus Spezies
isoliert und steht wie das Dioncophyllein D in ihrer P- und M-Konfiguration im Gleichgewicht. Ihre antitrypanosomale Wirkung wurde zu einem ED50 -Wert von 0.35±0.02
µM bestimmt und liegt damit im Wirkbereich des Suramin (ED50 =0.31±0.05 µM).
Me
MeO
S
+
N
26
OMe Me
TFA
OH
P
-
OMe
Me
MeO
slow
S
+
M
TFA
N
2 6
OMe Me
Me
HO
Me
-
MeO
Ancistrocladinium B (18)
ED50 = 0.35 ± 0.02 µM
Abbildung 4.10: Ancistrocladinium B, ein Naphthylisochinolin mit C,N-Verknupfung
¨
zwischen Naphthalin und Isochinolin und ihre antitrypanosomale Aktivit¨at gegen Trypanosoma brucei brucei.
Me
MeO
+
N
R
ClO4
OMe Me
ED50 –Werte:
OMe
MeO
Cl
Me
3.1 ± 0.1 µM
(24)
1.1 ± 0.2 µM
Br
OMe
(19)
2.0 ± 0.5 µM
(25)
0.29 ± 0.01 µM
(20)
0.50 ± 0.06 µM
(26)
0.33 ± 0.00 µM
(21)
0.39 ± 0.03 µM
(27)
0.02 ± 0.00 µM
(22)
3.0 ± 0.1 µM
(23)
(28)
0.03 ± 0.00 µM
(29)
0.03 ± 0.00 µM
Abbildung 4.11: Quart¨are Isochinolin-Salze mit Hetero-Biaryl-Achse und ihre antitrypanosomale Aktivit¨at gegen Trypanosoma brucei brucei.
76
4. Ergebnisse und Diskussion
Die im Vergleich zu den C,C-verknupften
¨
Biarylen wie Dioncophyllin A (1), B (2) und
C (3) 10-fach hohere
¨
Aktivit¨at des Ancistrocladinium B (18) lockte zunehmendes Interesse an dieser N,C-verknupften
¨
Substanzklasse. Um mehr Einsicht in die molekularen Voraussetzungen fur
¨ eine gute antitrypanosomale Wirkung zu bekommen, wurden die quart¨aren Isochinolin-Salze in Abbildung 4.11 als Perchlorate getestet. Es handelt sich dabei um vollst¨andig aromatische, von Ancistrocladinium B (18) abgeleitete Isochinolin-Analoga mit uber
¨
eine N,C-Hetero-Biaryl-Achse verknupften,
¨
einfachen
Aromaten. Untersucht wurden methoxy-, chlor-, brom- und methylsubstituierte Phenyle sowie Naphthalin und Anthracen. Unter den Phenylen (Substanzen (19) bis (24))
zeigten alle Substanzen eine Aktivit¨at im Wirkbereich des Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4
µM). Als besonders wirksam erwies sich die Methoxy-Substitution in ortho und metaStellung im Phenylisochinolin (ED50 =0.50±0.06 µM und 0.39±0.03 µM). Moglicher¨
weise begunstigt
¨
diese Konformation die Wechselwirkung mit der Zielstruktur, die
bis jetzt jedoch unbekannt ist. Eine kontinuierliche Steigerung der Wirksamkeit konnte durch Substitution des aromatischen Phenyl gegen Naphthalin und Anthracen erreicht werden (Substanzen (25) bis (29)). Die vielversprechendste Wirkung zeigte das
Anthracen-substituierte Isochinolin mit einem, im Vergleich zu den Phenyl-Analoga,
um zwei Zehnerpotenzen niedrigeren ED50 -Wert. Ursache liegt vermutlich in der zunehmenden Lipophilie der Substanzen, wodurch die Aufnahme in die Zellen und das
Erreichen der Zielstrukturen begunstigt
¨
wird.
Fazit:
• N,C-verknupfte
¨
Naphthylisochinolin-Alkaloide weisen im Vergleich zu C,Cverknupften
¨
eine hohere
¨
antitrypanosomale Aktivit¨at auf.
• In der Reihe arylverknupfter
¨
quart¨arer Isochinoline steigt die Wirksamkeit mit
hoher
¨
kondensierten Aromaten.
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
77
4.1.4.2 Fluorchinolone
Fluorchinolone sind eine Klasse synthetischer Antibiotika.
Mit ihrem Chinolin-Gerust
¨ sind sie den Isochinolinen strukF
4
turell sehr a¨ hnlich. Ihre bakterizide Wirkung beruht auf
OH
der Hemmung der DNA-Gyrase und Topoisomerase-II (AbR7
X
N
R2
schnitt 4.3.3). Die Topoisomerase-II ist aber auch in TrypaR1
nosomen ein Schlusselenzym
¨
fur
¨ Zellwachstum und ZellteiAbbildung 4.12:
lung und eine In-vitro-Aktivit¨at von Fluorchinolonen gegen
Fluorchinolon
Trypanosomen konnte bereits in einigen Arbeiten gezeigt
werden [144].
Die bakterizide Aktivit¨at der Fluorchinolone wird vor allem durch die funktionellen
Gruppen der R1-, R5- und R7-Substituenten bestimmt. Dabei erwiesen sich Substanzen mit einer Cyclopropan-, oder Difluor-phenyl-Gruppe in Position N1 und einem
Piperazin-Ring in Position 7 als besonders wirksam. Von dieser Information ausgehend wurden zur Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bezuglich
¨
der antitrypanosomalen Wirkung, die in Tabelle 4.2 gelisteten Fluorchinolone [139] gegen
Trypanosoma brucei brucei getestet. Untersucht wurde dabei der Einfluss verschiedener Substituenten am Phenyl- und am Piperazin-Ring. Gute Aktivit¨aten im Wirkbereich von Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM) zeigten sich bei N1-phenyl-substituierten 4chinolonen ohne Substitution am Phenyl-Ring (30) mit einem ED50 -Wert von 9.71±1.84
µM und nach para-Methylierung (36) ( ED50 =2.66±0.07 µM) desselben. Vergleicht man
die Auswirkung der Methyl-Gruppe an unterschiedlichen Positionen, so nimmt die
Wirkung von der para- uber
¨
die meta- zur ortho-Position hin kontinuierlich ab. In
ortho-Position war mit einem ED50 -Wert von 62.58±5.76 µM nahezu keine Aktivit¨at
mehr nachweisbar. Bei Substitution der Methyl-Gruppe gegen eine freie phenolische
Hydroxy-Funktion (Substanzen (45) und (46)) konnte in keiner Position eine Wirksamkeit beobachtet werden. Die Reduktion der Aktivit¨at durch Erhohung
¨
des Anteils phenolischer Hydroxy-Gruppen wurde bereits bei der Testung der NaphthylisochinolinAlkaloide festgestellt und diskutiert. Nach O-Methylierung der phenolischen OHFunktion (Substanzen (31) bis (33)), zeichnete sich auch hier wieder eine verst¨arkte
Wirkung ab, die sich analog zu den Substanzen (32) bis (34) in para-Position mit einem
ED50 -Wert von 8.22±0.89 µM am effektivsten zeigte. CF3 und F-Substitution (Substanzen (37) bis (42)) fuhrte
¨
zu einer Abschw¨achung der Wirkung, die jedoch noch fur
¨ alle
drei Positionen im Wirkbereich des Eflornithin (ED50 =22.9±4.6 µM) lag. Bei Einfugung
¨
einer Nitro-Funktion (Substanzen (43) und (44)) wurde dagegen nur eine schwache
Wirksamkeit gemessen, die unter CN-Substitution (Substanzen (47) bis (49)) g¨anzlich
verschwand.
Die Frage ob eine zus¨atzliche Alkylierung des Piperazin-Ringes und damit eine Erhoh¨
ung der Lipophilie zu einer Steigerung der antitrypanosomalen Aktivit¨at fuhrt,
¨
wurR5
O
O
5
3
6
2
7
8
1
78
4. Ergebnisse und Diskussion
de an N1-phenyl-substituierten-4-chinolonen mit Methoxy-Substitution am PhenylRing untersucht (Substanzen (50) bis (52)). Hier konnte gegenuber
¨
unsubstituierten
Piperazin-Analoga keine signifikante Verbesserung gefunden werden.
Fazit:
• In der Gruppe der N1-phenyl-7-piperazin-substituierten Fluorchinolone weisen Substanzen mit para-Methoxy- oder para-Methyl-Funktion die hochste
¨
antitrypanosomale Aktivit¨at auf.
• Analog der Naphthylisochinolin-Alkaloide wird auch bei dieser Substanzgruppe
die Wirksamkeit durch Hydroxy-Substitution abgeschw¨acht.
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
O
O
F
N
R2
79
5
4
6
3
7
N1
8
OH
2
N
R1
Substanz
R1
R2
T. b. b. ED50
[µM]
(30)
(31)
(32)
(33)
(34)
(35)
(36)
(37)
(38)
(39)
(40)
(41)
(42)
(43)
(44)
(45)
(46)
(47)
(48)
(49)
(50)
(51)
(52)
H
o-OCH3
m-OCH3
p-OCH3
o-CH3
m-CH3
p-CH3
o-CF3
m-CF3
p-CF3
o-F
m-F
p-F
m-NO2
p-NO2
m-OH
p-OH
o-CN
m-CN
p-CN
m-OCH3
p-OCH3
p-OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
CH3
CH3
C 3 H7
9.71±1.84
66.34±17.62
22.38±3.20
8.22±0.89
62.58±5.76
10.21±3.76
2.66±0.07
43.81±12.5
28.74±2.67
18.03±3.22
44.78±1.56
21.66±7.44
25.94±2.33
59.21±6.65
64.48±9.02
>65.9
>65.9
>65.9
>65.9
>65.9
23.59±8.41
19.62±2.67
10.96±0.91
Tabelle 4.2: Fluorchinolone und ihre antitrypanosomale Aktivit¨at.
80
4. Ergebnisse und Diskussion
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
¨
Uberblick:
Im Folgenden wird eine kapillarelektrophoretische (CE) Methode zur
Charakterisierung und Trennung verschiedener Bakterienst¨amme
und deren Agglomerate und Ketten entwickelt. Das Hauptaugenmerk liegt auf der Standardisierung und Optimierung der Bakterienproben, der Pufferlosungen
¨
und der CE-Bedingungen zur Etablierung einer robusten, reproduzierbaren und pr¨azisen AnalyseTechnik, die sich zur Weiterentwicklung als Zytotoxizit¨atstest eignet.
4.2.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels Kapillarelektrophorese
Die Eigenschaft von Bakterien Agglomerate und Ketten zu bilden ist zum einen bakterienspezifisch und zum anderen abh¨angig von der a¨ ußeren Umgebung. Fur
¨ eine bestimmte Bakterienspezies ergibt sich daraus je nach pH, Ionenst¨arke und Zusammensetzung verschiedener Ionen eine charakteristische Großenverteilung
¨
verschiedener
Biokolloide im Großenbereich
¨
weniger µm [224]. Zusammen mit der Ladung der
Zelloberfl¨ache bestimmt diese Großenverteilung
¨
die unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilit¨aten (Abschnitt 3.2.2.2). Die Ladung einer Zelle, von deren Hulle
¨
haupts¨achlich Aminos¨aurereste, geladene Zucker und Zuckerlipide nach außen ragen,
ist auch bei gleicher Elektrolytumgebung bei Gram-positiven und -negativen Bakterien unterschiedlich. Dies ist in der verschiedenartigen Zusammensetzung der Zellwand begrundet
¨
(Abschnitt 3.2.1.1). Neben der a¨ ußeren Umgebung bestimmt auch die
Alterung einer Zelle die a¨ ußere Ladung. Die Verteilung der elektrophoretischen Mobilit¨aten kann somit zur Erstellung charakteristischer und bakterienspezifischer Peakmuster genutzt werden. Die Anzahl, Reihenfolge und die Form der Signale im Elektropherogramm charakterisieren dabei den elektrophoretischen Fingerabdruck (”fingerprint”). So muss z. B. eine Peakverbreiterung kein Fehler der Methode sein, sondern
kann durch die Große
¨ und Form der detektierten Kolloide verursacht werden [77].
4.2.2 Auswahl verschiedener Bakterienst¨amme
Zur Entwicklung einer CE-Methode zur Trennung und Charakterisierung verschiedener Bakterien, die sich zur Etablierung eines Zytotoxizit¨atstests fur
¨ die Bestimmung
antibakterieller Wirksamkeiten potenzieller Wirkstoffe eignet, wurden die folgenden
Rahmenbedingungen an die auszuw¨ahlenden Bakterien gestellt:
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
81
1. Apathogene Bakterienst¨amme: Die Arbeiten fanden in einem Labor der Sicherheitsstufe 1 statt.
2. Unterschiedliche Empfindlichkeit gegenuber
¨
Antibiotika, um einen Vergleich
verschiedener Wirksubstanzen zu ermoglichen.
¨
3. Unterschiedliche elektrophoretische Eigenschaften, um den elektrophoretischen
Fingerabdruck verschiedener Bakterienst¨amme vergleichen zu konnen
¨
und die
elektrophoretische Trennung verschiedener Bakterienst¨amme zu ermoglichen.
¨
Die ausgew¨ahlten Bakterien sollten sich somit in ihrer
• Oberfl¨achenladung, verursacht durch die unterschiedliche Zellwandzusammensetzung Gram-positiver und -negativer Bakterienst¨amme
• Große
¨
und Form (Kokken und St¨abchen) einschließlich der Begeißelung,
wodurch eine Eigendynamik erzeugt wird
• Tendenz der Ketten- und Clusterbildung
unterscheiden.
Die Auswahl der Bakterienst¨amme zur Methodenentwicklung fiel auf Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens und Streptococcus vestibularis. Tabelle 4.3 zeigt eine Zusammenfassung der mikrobiologischen Eigenschaften. Die Unterscheidung zwischen
Aerobiern und Anaerobiern spielt zwar fur
¨ die elektrophoretischen Eigenschaften keine Rolle, ist aber fur
¨ die Standardisierung der Bakterienkulturen in Abschnitt 4.2.4
maßgeblich.
Bakterium
M. luteus
GramF¨arbung
positiv
P. fluorescens
negativ
S. vestibularis
positiv
Form
Geißeln
Kokken
unregelm¨aßige Cluster
St¨abchen
gekrummte
¨
Ketten
Kokken
unregelm¨aßige Ketten
unbeweglich
eine oder mehrere
Geißeln
unbeweglich
Aerobier/
Anaerobier
strenge
Aerobier
strenge
Aerobier
fakultativ
anaerob
Tabelle 4.3: Charakterisierung der zur Methodenentwicklung ausgew¨ahlten Bakterienst¨amme.
82
4. Ergebnisse und Diskussion
(a) Micrococcus luteus
(b) Pseudomonas fluorescens
(c) Streptococcus vestibularis
Abbildung 4.13: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen der zur Methodenentwicklung ausgew¨ahlten Bakterienst¨amme, in der fruhen
¨
station¨aren Phase. Bildgroße:
¨
86.5 µm x 64.6 µm.
Bei allen Bakterienarten handelt es sich um apathogene Bakterienst¨amme mit naturli¨
chem Vorkommen.
Die Gattung Micrococcus gehort
¨ wie die Gattung Staphylococcus zur Familie der Micrococcaceae, besitzt im Gegensatz dazu aber keine humanpathogene Bedeutung. Sie
spielt als strenger Aerobier eine bedeutende Rolle in der menschlichen und tierischen
Haut- und Schleimhautflora und ist auch h¨aufig in Staub und Wasser zu finden [204].
Wie in Abbildung 4.13a zu sehen, agglomerieren die unbeweglichen Gram-positiven
Kokken zu einer Vielfalt unregelm¨aßiger Cluster, die von einzelnen Zellen bis hin zu
Clustergroßen
¨
von 20 und mehr Zellen reichen.
Der Stamm P. fluorescens (Familie: Neisseriaceae) ist ein Bewohner von Pflanzen,
Feuchtstellen, Boden und Wasser. Neben seinem h¨aufigen Vorkommen im Krankenhausmilieu, kann er auch als Entzundungserreger
¨
bei abwehrgeschw¨achten Patienten
gefunden werden [204]. Auch er ist strenger Aerobier und liegt neben gekrummten
¨
Ketten haupts¨achlich in einzelnen Zellen vor, die sich durch eine oder mehrere Geißeln fortbewegen (Abbildung 4.13b). Seine Gram-F¨arbung ist negativ.
Bei der Bakterienspezies S. vestibularis (Familie: Streptococcaceae) handelt es sich um
unbewegliche Gram-positive Diplokokken, die auch kurze Ketten bilden konnen
¨
(Abbildung 4.13c) und zur normalen menschlichen Mundschleimhautflora gehoren
¨
[231].
4.2.3 Problematik
Die CE-Technik wurde ursprunglich
¨
fur
¨ geladene Molekule
¨ entwickelt. Die Anwendung auf große, komplexe In-vivo-Systeme ist nicht unproblematisch. Herkommliche
¨
Vorgehensweisen bei der Methodenentwicklung konnen
¨
aufgrund der speziellen Eigenschaften mikrobieller Organismen nicht angewandt werden. Zum Erreichen reproduzierbarer elektrophoretischer Fingerabdrucke
¨
mit hoher Auflosung
¨
(Abschnitt
3.4.1.4) mussen
¨
verschiedene Punkte bedacht werden [15]:
• Zellalter und Wachstumsphase der Bakterienst¨amme beeinflussen das Ober-
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
83
fl¨achenpotenzial, damit die Tendenz der Cluster- und Kettenbildung und wiederum das elektrophoretische Peakmuster [77].
• amphotere Oberfl¨achenstruktur.
• Mikroorganismen sind sehr empfindlich gegenuber
¨
a¨ ußeren Einflussen
¨
wie pH,
Ionenst¨arke und Sauerstoffgehalt, und lysieren unter ungunstigen
¨
Bedingungen
oder a¨ ndern ihre elekrophoretischen Eigenschaften. Die Auswahl des Puffers ist
damit erheblich eingeschr¨ankt [205].
• Viele Mikroorganismen sondern unter anderem unter oxidativem Stress eine
Vielzahl von Substanzen ab. Diese konnen
¨
zu unbeabsichtigten Peaks fuhren,
¨
und Zelllyse und Ver¨anderungen in der Mobilit¨at und Migrationszeit hervorrufen.
• Mikroorganismen neigen aufgrund ihrer geladenen Oberfl¨ache mit den negativ
geladenen Silanolgruppen der Kapillarwand in Wechselwirkung zu treten und
an diese zu adsorbieren. Auch kann es zu Interaktionen zwischen den mikrobiellen Partikeln kommen.
• Bezuglich
¨
der Partikelanzahl pro Volumen sind Bakteriensuspensionen im Allgemeinen verdunnter
¨
als Losungen
¨
chemisch definierter Molekule,
¨ wodurch Injektionsprobleme verursacht werden konnen.
¨
Aus diesen Grunden
¨
mussen
¨
neben der Entwicklung geeigneter CE-Bedingungen
auch die Standardisierung und Optimierung der Bakterienkulturen und deren Probenpr¨aparation vorgenommen werden.
4.2.4 Standardisierung der Bakterienkulturen
4.2.4.1 Kultivierung
Die Kultivierung aller drei Bakterienspezies erfolgte in Brain-Heart-Infusion(BHI)Bouillon, einem Vollmedium fur
¨ anspruchsvolle Keime, um moglichst
¨
schnelles
◦
Wachstum zu begunstigen.
¨
Eine Temperatur von 30 C erwies sich als guter Kompromiss, um die Kultivierung aller drei Bakterienspezies in einem Brutschrank zu
ermoglichen.
¨
Dem unterschiedlichen Sauerstoffbedarf bei Aerobiern und Anaerobiern
(Abschnitt 3.2.1.2) wurde durch Verwendung unterschiedlicher Kultivierungsgef¨aße
Rechnung getragen. M. luteus wurde in 25 cm3 Kulturflaschen mit luftdurchl¨assigem
Schraubverschluss bzw. bei einem großeren
¨
Zellansatz, in Erlenmeyerkolben auf einem Schuttler
¨
bei 150 rpm/min, P. fluorescens und S. vestibularis in 15 ml Kulturrohr¨
chen mit Schraubverschluss bzw. in Erlenmeyerkolben ohne Schuttler
¨
kultiviert.
4. Ergebnisse und Diskussion
OD 600
84
3.5
Micrococcus luteus
3.0
Pseudomonas fluorescens
Streptococcus vestibularis
2.5
2.0
Abbildung 4.14: Wachstumskurven von M. luteus, P.
fluorescens und S. vestibularis in
BHI-Bouillon bei 30 ◦ C durch
Auftragung der OD600 -Werte
gegen die Zeit.
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
4.2.4.2 Wachstumskurven
In Abbildung 4.14 wurde die optische Dichte (OD) bei 600 nm fur
¨ alle drei Bakterienarten gegen die Zeit aufgetragen. Wie in Abschnitt 3.2.2.5 beschrieben zeigt der zeitliche
OD-Verlauf die verschiedenen Wachstumsphasen. Fur
¨ die kapillarelektrophoretische
Analyse war vor allem der Zeitraum der station¨aren Phase relevant, in der die Zellen
zwar ihren Stoffwechsel einstellen, aber dennoch vital sind. In dieser Phase sollte die
chemische Umgebung der Zellen im Kulturmedium, ihre Oberfl¨achenladung und ihre
Tendenz zur Ketten- und Clusterbildung bis zum Beginn der Absterbephase konstant
bleiben. S. vestibularis zeigte das schnellste Zellwachstum. Die station¨are Phase wurde
bereits nach 8 h erreicht, bei P. fluorescens und M. luteus dagegen erst nach 18 h bzw.
nach 24 h.
4.2.4.3 Kalibrierung
Die Bestimmung der Zellkonzentration durch Messung der optischen Dichte erfordert zun¨achst die Korrelation zwischen Signal und Konzentration unter Erfassung der
Gesamtzellzahl. Da weder die mikroskopische Ausz¨ahlung in einer Z¨ahlkammer noch
die elektronische Ausz¨ahlung mittels Coulter-Counter moglich
¨
waren, musste die Zellzahl durch Ausz¨ahlen der koloniebildenden Einheiten (colony forming units, CFU) erfolgen, wodurch genaugenommen nur vermehrungsf¨ahige Zellen berucksichtigt
¨
wurden. N¨aherungsweise kann man jedoch bei einer Kultur in der exponentiellen und
fruhen
¨
station¨aren Phase von 100 % lebensf¨ahigen Zellen ausgehen. Die genaue Versuchsdurchfuhrung
¨
ist im Experimentellen Teil in Abschnitt 5.1.7.2.4 beschrieben. OD
und Zellzahl korrelieren nach Abschnitt 3.2.2.4 nach einer Funktion 1. Ordnung. Fur
¨
eine Korrelationsfunktion f (x) = ax + b ergaben sich fur
¨ M. luteus, S. vestibularis und
CFU/nl
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
85
500
Micrococcus luteus
Pseudomonas fluorescens
400
Streptococcus vestibularis
300
200
100
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
OD 600
Abbildung 4.15: Korrelation
zwischen OD600 -Werten und
Zellzahl.
P. fluorescens die folgenden Gleichungen und Bestimmtheitsmaße R2:
M. luteus : f (x) = 353.45 · x + 11.82, R2 = 0.92
P. fluorescens : f (x) = 337.86 · x − 27.30, R2 = 0.97
S. vestibularis : f (x) = 311.61 · x − 3.67, R2 = 0.97
Die schlechteste Korrelation zeigte M. luteus. Die Ursache hierfur
¨ liegt vermutlich in
seiner vielf¨altigen Clusterbildung, denn die dem Verfahren der CFU-Ausz¨ahlung zugrundeliegende Erwartung, dass aus jeder vermehrungsf¨ahigen Zelle eine makroskopisch sichtbare Kolonie entsteht, trifft in diesem Fall nicht mehr zu und fuhrt
¨
zu systematischen Fehlern. Dennoch stellten diese Kalibriergeraden gute Anhaltspunkte dar
und dienten zur Berechnung der Zellzahl bei allen weiteren Experimenten.
4.2.5 Trenntechnik
Die sp¨atere Weiterentwicklung der Methode zur Bestimmung von Zytotoxizit¨at stellte
auch Anforderungen an die kapillarelektrophoretische Trenntechnik. In der Literatur
sind derzeit zwei Techniken fur
¨ eine Mikroben-Analyse beschrieben: Kapillarzonenelektrophorese (CZE) und Kapillarisoelektrische Fokussierung (CIEF) (Abschnitt 3.4).
W¨ahrend in der CZE die Trennung verschiedener Analyten auf Unterschieden in den
elektrophoretischen Mobilit¨aten basiert, werden die Bakterien in der CIEF aufgrund
ihrer amphoteren Oberfl¨ache und somit nach dem isoelektrischen Punkt getrennt. Aufgrund der zur Toxizit¨atsbestimmung notwendigen Zellmarkierung mittels SYTO9 und
Propidiumiodid zur Ermittlung des lebend/tot-Verh¨altnisses der Bakterienpopulation, war eine Auswirkung auf den isoelektrischen Punkt nicht auszuschließen, so dass
die CZE der CIEF als Trenntechnik vorgezogen wurde. Ferner sollten die verwendeten
Kapillaren beschichtet sein, um:
86
4. Ergebnisse und Diskussion
1. Den EOF zu eliminieren [126]: Ohne Modifikator ist der EOF sehr groß. Aufgrund
der geringen elektrophoretischen Unterschiede verschiedener Bakterien und ihrer Ketten und Agglomerate ist deren Trennung ohne Modifikator nur mit sehr
langen Kapillaren erreichbar (250 cm) [77, 86]. Anderenfalls werden alle Bakterienspezies mit dem EOF eluiert [212].
2. Wandadsorptionen vorzubeugen [126].
Aufgrund der hohen Kosten fur
¨ kovalent beschichtete Kapillaren, der mangelhaften
Reaktionskontrolle bei der Eigenherstellung und der schnellen Abnutzung sollte die
Methode der dynamischen Beschichtung angewandt werden (Abschnitt 3.4.6). Der
Vorteil liegt darin, dass es durch geeignete Spulmethoden
¨
gelingt, die Kapillare nach
jeder Trennung vollst¨andig zu regenerieren und unmittelbar vor der n¨achsten Trennung erneut zu beschichten (siehe Experimenteller Teil).
Desweiteren unterstutzen
¨
die zugesetzten Polymere im Trennpuffer die Trennung verschiedener Bakterienspezies, Agglomerate und Ketten aufgrund:
• Eines Siebeffektes bedingt durch die Erhohung
¨
der Viskosit¨at [15].
• Zus¨atzlicher Probenstabilit¨at der Biokolloide in der Pufferlosung:
¨
Bei PartikelPartikel-Interaktionen fuhren
¨
die polymeren Ketten zur sterischen Abstoßung
(Abschnitt 3.2.2.3) [11, 259].
4.2.6 Entwicklung eines Trennpuffers
¨
4.2.6.1 Uberblick
uber
¨
literaturbekannte Puffersysteme
Aus den experimentellen Erfahrungen (Tabelle 4.4) der letzten 20 Jahre, in denen versucht wurde, die Analyse und Charakterisierung intakter Mikroorganismen mittels
Kapillarelektrophorese zu standardisieren und zu verbessern, ergeben sich auf der
Grundlage der dynamischen Beschichtung zur mikrobiellen Trennung im wesentlichen zwei grundlegend verschiedene Puffersysteme, mit denen eine Auflosung
¨
bis zu
850.000 theoretischer Boden/m
¨
(M. luteus [15]) erreicht wurde (Abschnitt 3.4.1.4):
1. Puffersystem nach Armstrong [15]: Der Trennpuffer besteht aus 0.56 mM TrisBorat, 0.013 mM Na2 EDTA und 0.0125% gelostem
¨
Poly(ethylen)oxid (PEO, Mr =
600.000, polymere Matrix zur Beschichtung) bei einem pH von 8.4. Die Ionenst¨arke des Puffers lag unter Berucksichtigung
¨
von Tris+ , EDTA3− und Na+ bei
0.35 mM. Bei PEO handelt es sich um ein Polykondensationsprodukt der allgemeinen Formel HO-(CH2 -CH2 -O-)n H. Es wird durch Mikroorganismen nicht angegriffen und ist nicht empfindlich gegenuber
¨
Elektrolyten. Die Ethersauerstoffbrucken,
¨
ebenso wie die endst¨andigen Hydroxylgruppen, ermoglichen
¨
die Ausbildung von Wasserstoffbruckenbindungen
¨
und Dipolwechselwirkungen. Die
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
87
heterogene Polymerlosung
¨
wurde in einer Konzentration von 0.5 % durch Ultraschallbehandlung fur
¨ 4 h bei 55 ◦ C hergestellt. Die dynamische Viskosit¨at betrug
danach 4.36 cP. Eine erfolgreiche kapillarelektrophoretische Analyse wurde an
den in Tabelle 4.4 gelisteten Bakterienspezies durchgefuhrt.
¨
2. Puffersystem nach Shintani [243]: Der Trennpuffer enth¨alt 0.1 M Tris, 0.1 M
Bors¨aure, 2 mM Na2 EDTA, 0.2 % NaCl und 0.01 % Natrium-Alginat (polymere
Matrix zur Beschichtung) bei einem pH von 8.4 und zeigt damit eine Ionenst¨arke
von 122 mM. Die polymere Losung
¨
wurde durch Ruhren
¨
bei Raumtemperatur
uber
¨
Nacht vollst¨andig gelost.
¨ Die Algins¨aure besteht aus einer Kette von 1,4β-glykosidisch verknupfter
¨
Mannurons¨aure. Die Methode wurde an Salmonella
enteritidis und Salmonella typhimurium durchgefuhrt.
¨
Scharfe Peaks und hohe Auflosung
¨
konnen
¨
somit entweder mit extrem verdunnten
¨
oder extrem konzentrierten Tris-Borat-Puffern erreicht werden.
4.2.6.2 Eignung verschiedener Puffersysteme
In Abbildung 4.17 sind die Elektropherogramme von M. luteus, P. fluorescens und S.
vestibularis unter Verwendung der Puffersysteme nach Armstrong und Shintani gegenubergestellt.
¨
Da die station¨are Phase einer Bakterienkultur uber
¨
mehrere Stunden
bis hin zu Tagen andauert, wurden die Proben bei allen drei Bakterienspezies nach
einer Inkubationszeit von 24 h entnommen. Die Proben wurden in Anlehnung an Referenz [53] in Wasser gewaschen und durch sanftes Pipettieren in Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 suspendiert (siehe Experimenteller Teil). Bei beiden
Methoden wurden die gleichen CE-Bedingungen verwendet: Quarzkapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm und einer Detektionsl¨ange von 21 cm; dies war aufgrund der Ger¨atemaße die kurzest
¨
mogliche
¨
L¨ange; konstant angelegte Spannung von
◦
10 kV; Temperatur 23 C; anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes
von 0.5 psi fur
¨ 10 s; Detektion bei 214 nm. Zur Detektion erwiesen sich aufgrund
der Korrelation der Mie-Streuung mit λ−3 kleine Wellenl¨angen (Abschnitt 3.2.2.4) als
besonders gunstig
¨
(Abbildung 4.16). W¨ahrend bei Micrococcus (Elektropherogramm
A, Abbildung 4.17b) im ersten Versuch mit beiden Puffersystemen scharfe Peaks erhalten wurden, scheiterte die Anwendung des Puffersystems nach Shintani bei Streptococcus (Elektropherogramm B, Abbildung 4.17b) und Pseudomonas (Elektropherogramm C, Abbildung 4.17b). In beiden F¨allen waren breite und teilweise aufgef¨acherte
Peakstrukturen zu erkennen. Bei Pseudomonas konnte mikroskopisch Zelllyse nachgewiesen werden, vermutlich bedingt durch die hohe Ionenst¨arke. Die Auflosung
¨
der
Elektropherogramme der Micrococcus-Spezies lag bei beiden Puffersystemen bei ca.
200.000 theoretischen Boden/m.
¨
Aufgrund der Kompatibilit¨at aller drei relevanten
Bakterienspezies - auch der Streptokokken, die mit diesem System derzeit noch nicht
88
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.16: PseudomonasProbe bei drei verschiedenen
Wellenl¨angen gemessen: 214 nm
(a) 400 nm (b) und 580 nm (c).
Fur
¨ CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung
4.17.
analysiert worden waren - mit dem Puffersystem nach Armstrong, wurde dieses als
Basis der Methodenentwicklung verwendet.
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
89
(a) Puffersystem nach Shintani
(b) Puffersystem nach Armstrong
Abbildung 4.17: Eignung verschiedener Puffersysteme zur kapillarelektrophoretischen Analyse von M.
luteus (A), P. fluorescens (B) und S. vestibularis (C) unter gleicher Probenpr¨aparation: Bakterienernte nach
24 h; in Wasser gewaschen; durch Pipettieren in Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 suspendiert und unter gleichen CE-Bedingungen: Quarzkapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm, einer Detektionsl¨ange von 21 cm; konstant angelegte Spannung von 10 KV; Temperatur 23 ◦ C; anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur
¨ 10 s; Detektion bei 214 nm. Fur
¨ CEPufferzusammensetzung siehe Abschnitt 4.2.6.1
90
¨
Tabelle 4.4: Uberblick
uber
¨
literaturbekannte Puffersysteme [151].
Mikroorganismen
Lactobacillus casei
Streptococcus pyrogenes, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis
Pseudomonas spezies, Pseudomonas putida,
Alcaligenes eutrophu, Rhodococcus erythropolis,
Methanobrevilbacter smithii
A1264, CD1, PL2W31 (Wasserbakterien)
Trennpuffer
100 mmol/L Tris-Acetat,
pH 7.5
TBE-Puffer, pH 9.5
[125]
[86]
unbeschichtet
TBE-Puffer, pH 9.6
[205]
unbeschichtet
10 mmol/L MOPS-Puffer
pH 7.02
Phosphat-Puffer, pH 7.0
[107]
TBE-Puffer, pH 8.4
0.0125% PEO als Modifikator
[15]
[240]
[178]
unbeschichtet
unbeschichtet
Ref.
[263]
4. Ergebnisse und Diskussion
Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas denitrificans, Acetobacter
pasteurianus, Acetobacter aceti,
Bifidibacterium longum, Serratia marcescens,
Sacharomyces cerevisiae
Pseudomonas fluorescens, Enterobacter
aerogenes, Micrococcus luteus,
Saccharomyces cerevisiae, Alcaligenes faecalis,
Micrococcus lysodeikticus
Quarzkapillare
beschichtet mit
Methylcellulose
unbeschichtet
unbeschichtet
Escherichia coli, Staphylococcus
saprophyticus
Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium
infantis, Saccharomyces cerevisiae
unbeschichtet
Cellulomonas cartae, Agrobacterium
tumefaciens
Arthrobacter oxydans
unbeschichtet
Escherichia coli, Proteus
vulgaris, Bacillus cereus,
Pseudomonas fluorescens
Escherichia coli
unbeschichtet
beschichtet mit
Polyvinylalkohol
beschichtet mit
Acrylamid
beschichtet mit
Poly-N-hydroxy
-ethylacrylamid
TBE-Puffer,
[243]
0.2% NaCl und 0.01% Na-Alginat
als Modifikator
TBE-Puffer, pH 9.0
[13]
0.025% PEO als Modifikator
TBE-Puffer, pH 8.4
[12, 14]
0.0125% PEO als Modifikator
[106]
[288]
20 mmol/L Borat-Puffer
[286]
pH 9.3
10 mmol/L Tris-HCl
[269]
pH 7.1
Tris-Puffer
[53]
pH 8.0
10 mmol/L TBE-Puffer
[149]
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
Salmonella enterititis,
Salmonella typhimurium
91
92
4. Ergebnisse und Diskussion
4.2.6.3 Optimierung der Trennmethode
Trotz aller Bemuhungen
¨
zeigten die Elektropherogramme der Mikroben unter Verwendung der Methode nach Armstrong teilweise eine schlechte Auflosung
¨
und fehlende
Reproduzierbarkeit, die aber fur
¨ den Einsatz der CE zur Zytotoxizit¨atsbestimmung
unerl¨aßlich ist. Aus diesem Grund wurden nachfolgend
• die Pufferkonzentration
• die polymere Matrix
• und die Probenpr¨aparation
variiert und fur
¨ den Teststamm M. luteus optimiert.
4.2.6.3.1 Pufferkonzentration
Eine mogliche
¨
Ursache fur
¨ die schlechte Auflosung
¨
und die fehlende Reproduzierbarkeit war die extrem geringe Ionenst¨arke im Trennpuffer. Die daraus resultierende,
sehr geringe Stromst¨arke lag bei einer Spannung von 10 KV unter 1 µA, wodurch sich
naturliche
¨
Schwankungen in der Temperatur, Spannung oder Wasserreinheit leicht bemerkbar machten. Gegen eine Erhohung
¨
der Pufferkonzentration spricht jedoch die
dadurch sinkende Mobilit¨at des EOFs (Abschnitt 3.4).
In w¨assriger Losung
¨
sind Mikroben meist negativ geladen. Bei anodischer Injektion
und konventioneller Polung (Abschnitt 3.4) wurden
¨
die Biokolloide alleine aufgrund
ihrer elektrophoretischen Mobilit¨at uberhaupt
¨
nicht durch die Kapillare wandern. Ist
der EOF jedoch groß genug, zieht er die Probenzonen am Detektor vorbei. Der EOF
liefert bei Mikroben den wesentlichen Beitrag zur Analysenzeit, denn aufgrund der
großen Masse m der Mikroorganismen ist ihre Beschleunigung a aufgrund des elektrischen Feldes E (Fel = q · E = m · a) sehr klein und damit auch ihre Gleichgewichtsgeschwindigkeit vel .
Zur Festlegung eines sinnvollen Konzentrationsbereiches des Trennpuffers wurde zun¨achst der Einfluss verschiedener Pufferkonzentrationen auf den EOF analysiert. Dazu
wurde eine Stammlosung
¨
mit 0.445 M Tris-Borat und 10 mM Na2 EDTA (siehe Experimenteller Teil) zu verschiedenen Konzentrationen verdunnt
¨
und jeder Verdunnung
¨
0.0125 % PEO 600.000 als Modifikator zugesetzt. In Abbildung 4.18 ist der EOF, markiert durch Benzylalkohol, in Abh¨angigkeit von der Pufferkonzentration und Ionenst¨arke dargestellt. Die verwendeten Pufferlosungen
¨
(A-I) sind in Tabelle 4.5 gelistet.
Die Elektrolyte wurden im Konzentrationsbereich von 0.11 mM Tris-Borat und 0.003
mM Na2 EDTA bis 3.90 mM Tris-Borat und 0.088 mM Na2 EDTA eingesetzt. W¨ahrend
sich der EOF bei einer Ionenst¨arke zwischen 0.069 mM und 0.49 mM kaum a¨ nderte und
bei ca. 3 Minuten lag, fiel er ab einer Ionenst¨arke >0.69 mM stark ab und benotigte
¨
bei
einer Ionenst¨arke von 2.43 mM bereits nahezu 10 Minuten. Der interessante Konzentra-
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
93
Abbildung 4.18: Auswirkung
verschiedener TBE-Puffer-Konzentrationen (A-I) auf den EOF.
Als EOF-Marker wurde eine
0.00005% Benzylalkohol enthaltende Pufferlosung
¨
verwendet.
Fur
¨ CE-Bedingungen siehe Abbildung 4.17.
Pufferbezeichnung
A
B
C
D
E
F
G
H
I
Ionenst¨arke
[mM]
0.069
0.349
0.486
0.693
1.041
1.390
1.733
2.083
2.426
Tris-Borat
[mM]
0.11
0.56
0.78
1.11
1.67
2.22
2.78
3.34
3.89
Na2 EDTA
[mM]
0.0025
0.0125
0.0175
0.0250
0.0375
0.0500
0.0625
0.0750
0.0875
Tabelle 4.5: Definition der in Abbildung 4.18 verwendeten TBE-Trennpuffer
tionsbereich lag somit bei einer Ionenst¨arke zwischen 0.069 mM und 0.486 mM, d. h.
zwischen Puffer A und C. Nachfolgend wurde der Einfluss der drei verschiedenen Pufferkonzentrationen (A, B und C) auf die Trennung von M. luteus getestet (Abbildung
4.19). Die Pufferlosung
¨
mit der hochsten
¨
Verdunnung
¨
(Puffer A) fuhrte
¨
zu einer einzigen breiten Bande, die vermutlich durch das Platzen von Zellen aufgrund zu geringer
Ionenst¨arke des verwendeten Trennpuffers bedingt ist. Bei Erhohung
¨
der Pufferkonzentration zeigten die Elektropherogramme einige sehr schmale Signale mit zun¨achst
schlechter Auflosung
¨
(Puffer B), welche durch Einsatz der dritten Pufferlosung
¨
(Puffer C) mit 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2 EDTA verbessert werden konnte.
Diese Pufferlosung
¨
erwies sich als optimal fur
¨ eine Trennung unterschiedlich großer
Agglomerate, zumal eine hohe Ionenst¨arke wie z. B. bei Puffer I zu einer erheblichen
Verl¨angerung der Migrationszeit fuhrte
¨
und kein Signal unter 40 Minuten beobachtet
94
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.19: Auswirkung
verschiedener TBE-Puffer-Konzentrationen auf die Trennung
unterschiedlich
großer
Aggregate von M. luteus. Der
Trennpuffer enthielt 0.0125 %
PEO mit (A) 0.11 mM Tris-Borat
und 0.003 mM Na2 EDTA,
(B) 0.56 mM Tris-Borat und
0.013 mM Na2 EDTA, (C)
0.78
mM
Tris-Borat
und
0.018 mM Na2 EDTA, bei einem pH-Wert von 8.7. Fur
¨
CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung
4.17.
Abbildung 4.20: Auswirkung
der hohen Ionenenst¨arke des
TBE-Puffers I auf die Migrationszeit von M. luteus. Der
Trennpuffer enthielt 0.0125 %
PEO mit 3.89 mM Tris-Borat und
0.0875 mM Na2 EDTA bei einem
pH-Wert von 8.7. Fur
¨ CE- und
Probenbedingungen siehe Abbildung 4.17.
werden konnte (Abbildung 4.20).
⇒ Die Zusammensetzung des Trennpuffers wurde auf 0.78 mM Tris-Borat und
0.018 mM Na2 EDTA optimiert. Die Losung
¨
enthielt 0.0125 % PEO und ergab einen
pH von 8.7
4.2.6.3.2 PEO Konzentration und Viskosit¨at
Zur dynamischen Beschichtung wird nach Armstrong 0.0125 % PEO 600.000 als polymere Matrix verwendet. Dazu verdunnt
¨
man eine 0.5 %ige PEO-Stammlosung,
¨
die
zum effizienteren Losen
¨
einer vierstundigen
¨
Ultraschallbehandlung ausgesetzt wird.
In der Routine-Herstellung zeigten sich jedoch Probleme in der Reproduzierbarkeit
der Viskosit¨at der polymeren Losung.
¨
In Abbildung 4.21 sind die Elektropherogramme a und b zweier identisch pr¨aparierter M. luteus-Proben unter Verwendung der beiden PEO-Losungen
¨
1 und 2, hergestellt nach der gleichen Vorgehensweise, dargestellt.
Das Elektropherogramm a zeigt zwar mit ca. 400.000 theoretischen Boden/m
¨
eine gu-
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
95
Abbildung
4.21:
Polymerherstellung als Ursache fur
¨
fehlende
Reproduzierbarkeit
am Beispiel von M. luteusElektropherogrammen.
PEO
600.000 wurde in beiden F¨allen
durch vierstundige
¨
Ultraschallbehandlung zu einer Konzentration von 0.5 % vollst¨andig
gelost.
¨
Der Trennpuffer enthielt
0.0125 % PEO mit 0.78 mM TrisBorat und 0.018 mM Na2 EDTA,
bei einem pH-Wert von 8.7. Fur
¨
CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung
4.17.
te Trennleistung aber keine Selektivit¨at. Dagegen erfullt
¨ Elektropherogramm b beide
Bedingungen.
Rheologische Untersuchungen mittels Rotationsviskosimeter zeigten im Scherbereich
von 1 bis 1000 1/s Unterschiede zwischen den beiden PEO-Stammlosungen.
¨
Beide
Losungen
¨
wiesen zwar Newtonsches Verhalten auf, unterschieden sich aber in ihrer
berechneten Viskosit¨at (PEO-Losung
¨
1 zu 3.5 mPas, Losung
¨
2 zu 4.8 mPas). Vermutlich ist eine zu geringe Viskosit¨at der PEO-Losung
¨
1 verantwortlich fur
¨ die schlechte
Auflosung
¨
in Elektropherogramm a. Die Hauptfehlerquelle w¨ahrend der Herstellung
¨
der Polymerlosung
¨
liegt in der langen Ultraschallbehandlung. Uber
diese Zeit kann
sich das Bad sehr stark aufheizen und bei fehlender Kuhlvorrichtung,
¨
wie es bei uns
der Fall war, zum Aufbrechen der langen PEO-Ketten fuhren.
¨
Da die hocheffiziente Trennung der Armstrong-Methode, nicht nur uber
¨
die Viskosit¨at bestimmt wird,
sondern auch uber
¨
die Chemie des PEOs an sich [11], sollte das Polymer selbst nicht
substituiert werden. So wurde in einigen Publikationen zur Aufkl¨arung der Methode
der Trennung, PEO aufgrund seiner Hydrophilie ein additiver fokussierender Effekt
der Probenzonen zugesprochen, welcher bei Substitution von PEO mit Glycerol trotz
gleicher Viskosit¨at ausblieb [11, 106].
Um hohere
¨
Reproduzierbarkeit des Trennsystems zu erreichen, wurde zun¨achst niedermolekulares PEO als Additivum zum Trennpuffer eingesetzt. Interessant war vor
allem der niedermolekulare Bereich von 400 bis 4000, da hier PEOs flussig
¨
und mit
Wasser mischbar sind. In Abbildung 4.22 sind die Elektropherogramme a bis d unter Zusatz von PEO 400 und 4000 in unterschiedlichen Konzentrationen dargestellt.
W¨ahrend mit PEO 400 in einer Konzentration von 0.05 % (Elektropherogramm a) keine Abtrennung der M. luteus-Cluster vom EOF erzielt wurde, verbesserte sich die
Auflosung
¨
zunehmend bei Erhohung
¨
der Konzentration auf 0.5 % und 5 % (Elek-
96
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung
4.22:
Elektropherogramme von M. luteus.
Verschiedene Konzentrationen
unterschiedlich
langkettiger
PEOs wurden als Modifikatoren
zum dynamischen Beschichten
der Kapillare eingesetzt: 0.05 %
PEO 400 (a), 0.5 % PEO 400
(b), 5 % PEO 400 (c) und 1 %
PEO 4000 (d). Fur
¨ Trennpuffer,
CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation siehe Abbildung
4.21.
tropherogramm b und c). Keine signifikante Verbesserung brachte der Einsatz von
PEO 4000 bei einer Konzentration von 1 % (Elektropherogramm d). Bei einer weiteren Erhohung
¨
der Konzentration auf 10 % konnte dagegen in einer Zeitspanne von
60 Minuten kein Signal detektiert werden. Das beste Ergebnis wurde mit PEO 400 bei
einer Konzentration von 5 % erreicht. Doch stellte sich, vermutlich durch die kurzen
PEO-Ketten eine schlechte Reproduzierbarkeit bei der dynamischen Beschichtung der
Kapillare heraus, so dass dieser Losungsansatz
¨
scheiterte. Es wurde somit nach einem
besser zu kontrollierenden Losungsverfahren
¨
fur
¨ PEO 600.000 gesucht. Als geeignet
◦
erwies sich das Losen
¨
in einem auf 30 C temperierten Schrank fur
¨ mindestens 12 h.
Rheologische Untersuchungen zeigten fur
¨ die 0.5 %ige polymere Stammlosung
¨
eine
reproduzierbare Viskosit¨at von 5.0±0.2 mPas.
⇒ Zur Herstellung der polymeren Matrix wurde PEO 600.000 in einer Konzentration
von 0.5 % bei 30 ◦ C fur
¨ mindestens 12 h gelost.
¨ Die Losung
¨
zeigte eine reproduzierbare
Viskosit¨at von 5.0±0.2 mPas.
4.2.6.3.3 Probenpr¨aparation
Fur
¨ eine erfolgreiche CE-Analyse von Mikroorganismen ist neben der CE-Methode vor
allem die Probenpr¨aparation relevant, denn Ladung, Große
¨ und Form der Mikroben
a¨ ndern sich mit den experimentellen Bedingungen [224]. Generell sind zwei pr¨aparative Schritte zur Herstellung der Bakterienproben notwendig:
1. Waschen der Bakterienzellen zur Entfernung von Kulturmedium.
2. Resuspendieren der Zellen in Trennpuffer.
In Abbildung 4.23 ist der Stromverlauf w¨ahrend der CE- Analyse der beiden Micrococcus-Proben a und b gezeigt. Probe a wurde mit physiologischer Kochsalzlosung
¨
gewa-
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
97
Abbildung 4.23: Vergleich der
Stromverl¨aufe w¨ahrend der
Micrococcus-Analyse
nach
Waschung der Bakterienzellen (a) mit physiologischer
Kochsalzlosung
¨
(0.9%) und
(b) mit Millipore-Wasser zur
Entfernung des Kulturmediums.
Beide Bakterienproben wurden
nach einer Inkubationszeit von
24 h pr¨apariert und nach der
Waschung in einer Konzentration von 0.5 OD600 in Trennpuffer
resuspendiert. Fur
¨ Trennpuffer
und CE-Bedingungen, siehe
Abbildung 4.21
schen, Probe b dagegen mit Millipore-Wasser. Anschließend wurden beide Proben in
Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 resuspendiert. Der Stromverlauf von
Probe a steigt unmittelbar nach der Injektion an und f¨allt nach einer Minute wieder ab.
Dagegen bleibt der Strom bei Probe b nahezu konstant. Fur
¨ den initialen Stromanstieg
in Probe a sind vermutlich an die Zellmembran adsorbierte Na+ - und Cl− -Ionen verantwortlich, wodurch die Leitf¨ahigkeit erhoht
¨ wird und damit der Strom ansteigt. Unter diesen Bedingungen konnte jedoch kein Signal detektiert werden. Der bei beiden
¨
Proben beobachtete kontinuierliche Stromabfall kann unter Umst¨anden an der Anderung der Elektrolytzusammensetzung unter dem Einfluss des elektrischen Feldes liegen, welche durch die geringe Ionenst¨arke besonders begunstigt
¨
wird oder an Ablagerungen an der Kapillarwand. Neben diesen elektrostatischen und -dynamischen
¨
Einflussfaktoren fuhren
¨
auch Anderungen
in der mechanischen Beanspruchung der
Probe zu unterschiedlichen Elektropherogrammen. Abbildung 4.24 zeigt drei charakteristische Elektropherogramme a-c des Teststammes M. luteus mit unterschiedlichen
Resuspendierungsverfahren. Sanfte Resuspendierungsverfahren wie Ruhren
¨
oder Pipettieren fuhrten
¨
h¨aufig zu fehlender Refokussierung der Zellsignale (Elektropherogramm a). Vermutlich treten bei ungenugender
¨
Resuspendierung Lufteinschlusse
¨
in
¨
der Probensuspension auf, die das Peakmuster storen.
¨
Ahnliche
Ergebnisse wurden
in Dai et al. [73] fur
¨ den Teststamm Escherichia coli unter Verwendung eines 150 mM
Tris-Borat-Puffers beschrieben.
Elektropherogramm b zeigt nach einer einminutigen
¨
Ultraschallbehandlung bei 120 W
und 35 kHz haupts¨achlich Einzelzellen, w¨ahrend in Elektropherogramm c nach einminutigem
¨
Vortexen die Micrococcus-Cluster in schmalen Peaks voneinander getrennt
sind. Untersuchungen zur St¨arke und Zeit des Vortexens zeigten keine signifikanten
¨
Anderungen.
Letztendlich konnte eine scharfe Trennung verschiedener Aggregate nur
98
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.24: Messung einer M. luteus-Probe (a) ohne
einminutigem
¨
Vortexen (b) mit
einminutiger
¨
Ultraschallbehandlung (c) mit einminutigem
¨
Vortexen vor der Injektion. Die Bakterienproben wurden nach einer Inkubationszeit von 24 h
pr¨apariert, in H2 O gewaschen
und in einer Konzentration von
0.5 OD600 in Trennpuffer resuspendiert. Fur
¨ Trennpuffer und
CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21.
durch einminutiges
¨
Vortexen erreicht werden. Eine Ultraschallbehandlung fuhrte
¨
dagegen in unserem Experiment zur Dispersion der Aggregate. Unter Verwendung eines
5 mM Phosphat-Puffers beobachteten Buszewski et al. [53] bereits durch Schutteln
¨
der
Bakterienprobe eine Zunahme an Einzelzellen. Die Auswirkung verschiedener Vorbehandlungen auf die Zellpopulation scheint somit extrem von den die Bakterienzellen
umgebenden Elektrolyten abh¨angig zu sein.
⇒ Optimierte Probenpr¨aparation: Reinigung der Bakterienzellen von Medium in
Millipore-Wasser; Resuspendieren der Zellen in Trennpuffer durch einminutiges
¨
Vortexen.
4.2.6.3.4 Probenkonzentration
Routinemessungen zeigten, dass die CE-Methode hohe Zellkonzentrationen erfordert.
In Abbildung 4.25a sind die elektrophoretischen Fingerabdrucke
¨
von M. luteus in Abh¨angigkeit der Konzentration dargestellt. Im Falle geringer Bakterienkonzentrationen,
d. h. im OD600 -Bereich zwischen 0.2 und 0.3 (Zellkonzentration: 9 x 107 - 14 x 107 Zellen/ml, Elektropherogramme A und B in Abbildung 4.25a), ist nur ein Signal mit
Migrationszeiten uber
¨
15 Minuten detektierbar. Mit zunehmender Zellkonzentration
werden die Peaks schmaler und zahlreicher, einhergehend mit kurzeren
¨
Migrationszeiten (Elektropherogramm C). Die Elektropherogramme D und E spiegeln bei einer
Zellkonzentration ≥ 0.5 OD600 (≥2.3 x 108 Zellen/ml) die vielf¨altigen Cluster in der
Bakterienpopulation wider, wobei bei einer Konzentration von 0.6 OD600 bereits durch
¨
Uberladung
der Kapillare Peakverbreiterungen auftreten.
¨
Ahnliche
Resultate wurden durch Variation der Injektionszeiten bei 0.5 psi und einer
Zellkonzentration von 0.5 OD600 erreicht. In Abbildung 4.25b sind die entsprechenden
Elektropherogramme nach einer Injektionszeit von 1, 4, 7, 10 und 13 Sekunden dar-
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
99
(a) Variation der Probenkonzentration. Injiziert wurde fur
¨ 10 s bei 0.5 psi.
(b) Eine Bakterienprobe mit einer Konzentration von 0.5 OD600 wurde bei einem
Druck von 0.5 psi unterschiedliche Zeiten injiziert.
Abbildung 4.25: Abh¨angigkeit der Elektropherogramme der Micrococcus-Spezies von der injizierten
Zellmenge. Die Bakterien wurden fur
¨ 24 h inkubiert, in Wasser gewaschen, in Trennpuffer mittels einminutigem
¨
Vortexen suspendiert. Fur
¨ Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21.
100
4. Ergebnisse und Diskussion
gestellt. Bei einer Injektion von 1 s und 4 s zeigte sich a¨ hnlich wie unter Verwendung
geringer Bakterienkonzentrationen ein Signal mit langer Migrationszeit. Zur Detektion
der verschiedenen Cluster in der Micrococcus-Population erwies sich eine Injektionszeit von mindestens 7 Sekunden als notwendig. Auch hier zeigten sich bei einer Injektionszeit von 13 s bereits Peakverbreiterungen. Die Konzentrationsabh¨angigkeit der
Elektropherogramme wird vermutlich durch Wechselwirkungen zwischen Zelle und
PEO-Beschichtung und einer dadurch hervorgerufenen unkontrollierten Adsorption
verursacht. Diese Hypothese konnte durch Untersuchungen zur Linearit¨at best¨atigt
werden (Abschnitt 4.2.11.1)
⇒ Die Probenkonzentration wurde auf einen OD600 -Wert von 0.5 standardisiert.
4.2.6.4 Mechanistische Betrachtung
2002 untersuchten Armstrong et al. [11] den Mechanismus ihrer CE-Methode, durch
welche die erste hochaufgeloste
¨
Trennung von Mikroben moglich
¨
wurde. Unklar war
die Rolle der hydrophilen polymeren Additiva, wie PEO, deren Effekt auf die Migrationszeit und Auflosung
¨
durch Viskosit¨atserhohung
¨
und Reduktion des EOF allein,
nicht erkl¨art werden konnte. Fur
¨ die Fokussierung der Probenzonen unter PEO-Zusatz
wurden die folgenden drei Hauptfaktoren als maßgeblich definiert:
• Gelostes
¨
polymeres Additivum im Trennpuffer
• Elektrisches Feld
• Elektroosmotischer Fluss in Gegenrichtung zur elektrophoretischen Mobilit¨at
Es konnte mittels CCD-Kamera gezeigt werden, dass vor allem der letzte Punkt, der zu
einer Art “sample stacking” fuhrt,
¨
w¨ahrend der Wanderung der Mikroben in der Kapillare eine Verengung des anf¨anglich 2 cm großen Injektionsplugs in eine Bande von
0.1 cm bewirkt (Abbildung 4.26). Es stellte sich jedoch heraus, dass der fokussierende
Effekt w¨ahrend der gesamten Bewegung durch die Kapillare fortbesteht. Fur
¨ Aggregation und Fokussierung von Kolloiden in Losung
¨
unter dem Einfluss eines elektrischen
Feldes bestehen derzeit die folgenden drei Mechanismen:
• Feld-induzierte Aggregation, welche durch die Partikelpolarisation bestimmt
wird. Die Bakterien richten sich dadurch wie ein induzierter elektrischer Dipol
aus und interagieren miteinander.
• Das “hairy-particle-model”: Durch die rauhe Partikeloberfl¨ache kann die Mobilit¨at kleiner Ionen beeinflusst werden, wodurch die Leitf¨ahigkeit im Probenplug
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
101
verringert ist, und sich zwei entgegengesetzte Ladungen am Anfang und am Ende der Probenzone ausbilden konnen
¨
[96, 196, 215].
• Formabh¨angige Mobilit¨at: Nichtsph¨arische Partikel und Aggregate haben in Abh¨angigkeit ihrer Orientierung unterschiedliche Mobilit¨aten. Dieser Mechanismus
macht sich zum Beispiel bei st¨abchenformigen
¨
Bakterien bemerkbar, deren Orientierung im Feld nach der Injektion zun¨achst zuf¨allig ist. Durch ihre unterschiedliche Ausrichtung besitzt die Probe eine Geschwindigkeitsverteilung, wodurch es zu Zusammenstoßen
¨
verschiedener Partikel kommt.
Abbildung 4.26: Unerl¨assliche
Bedingung fur
¨
Fokussierung
mikrobieller
Probenzonen:
Elektroosmotischer Fluss in
Gegenrichtung zur elektrophoretischen Mobilit¨at.
Eine mogliche
¨
Begunstigung
¨
der Fokussierung durch PEO ließe sich z.B. durch die Beeinflussung der Polarisation durch Adsorption erkl¨aren [11]. Betrachtet man jedoch
das konzentrationsabh¨angige Peakmuster in Abbildung 4.25, gelang eine Fokussierung der Bakterien erst ab einer bestimmten Zellzahl im Injektionsplug. Nach dem
Hagen-Poiseuilleschen Gesetz (4.1) gen¨ahert, errechnete sich mit den standardisierten
CE-Bedingungen (dynamische Viskosit¨at des Puffers: 5 mPas, Kapillarradius: 50 µm,
L¨ange der Kapillare: 100 µm, Injektionsdruck: 0.5 psi, Injektionszeit: 10 s und Zellkonzentration: 2.3 x 108 Zellen/ml) das Injektionsvolumen zu 16.9 µl und die injizierte
Zellzahl zu 3892.
π · r4
V
=
∆p
t
8·η·L
V
(4.1)
: Injektionsvolumen
t : Injektionszeit
r : Kapillarradius
η : dyn. Viskosit¨at der Probe (angen¨ahert durch Pufferviskosit¨at)
L : Kapillarl¨ange
Daraus ergibt sich die Option, dass neben elektrostatischen und -dynamischen Aspekten auch mechanische Grunde
¨
fur
¨ eine Fokussierung mikrobieller Banden in Frage
kommen konnen.
¨
Diese konnten
¨
im Kr¨aftegleichgewicht zwischen antreibender Kraft
der durch den EOF bewegten Zellmasse und der Bremskraft, bedingt durch Adsorptionskr¨afte zwischen Zellen und PEO und der Viskosit¨at im Trennpuffer, liegen.
102
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.27: Wiederholte Messungen der gleichen M. luteus-Probe unter Verwendung des gleichen
Pufferansatzes. Bei jeder Trennung wurde ein neues Puffergef¨aß der gleichen Puffercharge verwendet.
Fur
¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25
4.2.7 Reproduzierbarkeit
Zur Eignung und Weiterentwicklung der CE-Methode zur Bestimmung der Aktivit¨at
antibiotischer Substanzen ist vor allem die Reproduzierbarkeit der elektrophoretischen
Fingerabdrucke
¨
in qualitativer und quantitativer Hinsicht maßgeblich. Wiederholmessungen der gleichen Bakterienprobe von M. luteus zur Untersuchung der Pr¨azision
bezuglich
¨
der Quantifizierung und der Migrationszeiten fielen jedoch selbst unter
Verwendung der in den letzten Abschnitten optimierten CE- und Probenbedingungen entt¨auschend aus. Die Trennungen wurden zwar mit dem gleichen Pufferansatz
durchgefuhrt,
¨
doch wurden fur
¨ jede Trennung neue Puffervials verwendet, so dass die
¨
fehlende Reproduzierbarkeit nicht durch die Anderungen
in der Elektrolytzusammensetztung aufgrund der hohen anliegenden Spannung begrundet
¨
werden konnte. Das
von Trennung zu Trennung sich sowohl in Signalanzahl, Migrationszeit als auch in
Signalintensit¨at a¨ ndernde Peakmuster ist in Abbildung 4.27A dargestellt. Abbildung
4.27B zeigt einen neben den variierenden Elektropherogrammen beobachteten kontinuierlichen Stromanstieg, welcher moglicherweise
¨
die Ursache fur
¨ die schlechte Reproduzierbarkeit ist, und durch die Zunahme der Ionenst¨arke hervorgerufen wird.
Diese kann sowohl durch Zelllyse in der Probensuspension als auch durch Instabilit¨at
der Pufferlosung
¨
bedingt sein. Eine weitere mogliche
¨
Ursache fur
¨ die fehlende Reproduzierbarkeit der Elektropherogramme liegt im Alterungsprozess der Zellen selbst.
¨
Durch Anderungen
der Oberfl¨achenladung und vermehrter Clusterbildung a¨ ndert
sich das Große-zu-Ladungsverh¨
¨
altnis und damit die elektrophoretische Mobilit¨at. Um
den Beitrag von Pufferlosung
¨
und Zellalterung zu bestimmen, wurden die folgenden
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
103
Experimente durchgefuhrt:
¨
4.2.7.1 Pufferinstabilit¨at
9.2
unter Sauerstoffzufuhr
9.0
inerte Atmosphaere
8.8
8.6
8.4
conductivity [µS/cm]
pH
Wiederholte CE-Messungen wurden an reiner Pufferlosung
¨
in Abwesenheit suspendierter Zellen vorgenommen. Dazu wurde fur
¨ jede Trennung Puffer aus einem neuen
Vial aber von der gleichen Puffercharge verwendet. Von Messung zu Messung stieg
auch hier der Strom kontinuierlich, wodurch es einen ersten Hinweis fur
¨ die Unbest¨andigkeit des Puffers uber
¨
mehrere Stunden gab. Ein Vergleich der pH-Werte und
Leitf¨ahigkeiten von Pufferlosungen
¨
unter inerter Argon-Atmosph¨are und Pufferlosun¨
gen, bei welchen durch Ruhren
¨
Begasung mit Luft-Atmosph¨are stattfand, ist in Abbildung 4.28 dargestellt.
50
unter Sauerstoffzufuhr
45
inerte Atmosphaere
40
35
30
8.2
25
8.0
20
7.8
15
7.6
0
1
2
3
4
5
6
(a) pH-Verlauf uber
¨
die Zeit.
7
time [h]
10
0
1
2
3
4
5
6
7
time [h]
(b) Verlauf der Konduktivit¨at uber
¨
die Zeit.
Abbildung 4.28: Zeitlicher Verlauf der Instabilit¨at des Trennpuffers
W¨ahrend die Pufferlosung
¨
unter inerter Atmosph¨are nur eine sehr langsame Ver¨anderungen der Leitf¨ahigkeit und des pH-Wertes zeigt, fuhrt
¨
Begasung und damit ein verst¨arkter CO2 -Gasaustausch zu einem raschen Anstieg der Ionenst¨arke und einem raschen pH-Abfall. Vermutlich erhoht
¨ gelostes
¨
CO2 im Puffer (CO2 + H2 O ⇒ HCO3− +
H + ) die Protonenkonzentration und fuhrt
¨
damit, bedingt durch den schwach molaren
¨
Trennpuffer, zum Uberschreiten der Pufferkapazit¨at und zu einem pH-Wert-Abfall.
⇒ Es empfiehlt sich deshalb die Pufferlosung
¨
unmittelbar vor jeder Trennung neu herzustellen.
4.2.7.2 Probeninstabilit¨at
Unter Verwendung eines unmittelbar vor jeder Trennung neu hergestellten Puffers
wurden CE-Messungen der gleichen Micrococcus-Probe viermal hintereinander wiederholt (Elektropherogramme 1-4 in Abbildung 4.29). Bei gleichbleibendem Strom
104
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.29: Wiederholte
Messungen der gleichen M.
luteus-Probe. Bei jeder Trennung
wurde eine neu hergestellte
Pufferlosung
¨
verwendet. Fur
¨
Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung
4.25.
zeigten sich auch hier von Experiment zu Experiment Unterschiede im elektrophoreti¨
schen Fingerabdruck. Als Hauptursache werden Anderungen
der Oberfl¨achenladung
¨
vermutet, zumal eine visuelle mikroskopische Analyse keine signifikanten Anderungen in der Clusterverteilung erkennen ließ.
⇒ Es erwies sich als notwendig, neben neu hergestellten Pufferlosungen
¨
auch neu
hergestellte Probensuspensionen fur
¨ jede Trennung zu verwenden.
4.2.7.3 Elektrophoretische Heterogenit¨at
In Abbildung 4.30 sind die Elektropherogramme einer Micrococcus-Probe an funf
¨ aufeinanderfolgenden Tagen unter den jetzt standardisierten Bedingungen dargestellt.
Repr¨asentativ fur
¨ alle Messungen wurde der EOF mit Benzylalkohol im Elektropherogramm des funften
¨
Tages markiert. Die Elektropherogramme zeigen scharfe, gut getrennte Signale, die sich jedoch im Muster erneut von Trennung zu Trennung unterscheiden. Trennpuffer und Zellalterung konnten als Ursache ausgeschlossen werden.
Mogliche
¨
Ursachen sind:
• Die elektrophoretische Heterogenit¨at der Bakterienprobe an sich. Aufgrund der
Bildung von Aggregaten unterschiedlicher Große
¨ und Form besitzt eine einzelne
Probe eine Verteilung elektrophoretischer Mobilit¨aten, die sich z. B. auch durch
geringfugige
¨
Unterschiede in der Kultivierung ver¨andern kann.
• Partikel-Kapillarwand-Interaktionen, Partikel-Partikel-Interaktionen und Partikelinstabilit¨at in der Pufferlosung.
¨
Wiederholmessungen am gleichen Tag sollten mehr Einblick geben.
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
105
Abbildung
4.30:
Elektropherogramme von M. luteus an
funf
¨ verschiedenen Tagen unter
den standardisierten Probenund Pufferbedingungen. Am
funften
¨
Tag wurde zur EOFMarkierung eine 0.00005 %
Benzylalkohol
enthaltende
Pufferlosung
¨
verwendet. Fur
¨
Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung
4.25.
4.2.7.4 Biologische und statistische Einflusse
¨
Abbildung 4.31 zeigt die Elektropherogramme von M. luteus aus Wiederholmessungen der gleichen Zellkultur nach unterschiedlichen Inkubationszeiten (a-d). Bei den
Wiederholmessungen innerhalb eines Tages, die eine Inkubationsspanne von 6 h abdeckten, konnte eine relativ gute Reproduzierbarkeit erreicht werden. Auff¨allig war
jedoch:
1. Das Fehlen einzelner Signale in den drei aufeinanderfolgenden Elektropherogrammen des gleichen Tages.
2. Der generelle Trend zu großerer
¨
Peakanzahl im Laufe der vier aufeinanderfolgenden Tage.
Der erste Punkt ist besonders gut in Abbildung 4.31c zu erkennen. Das, abgesehen von
einem im zweiten Elektropherogramm fehlenden Peak, ansonsten gleiche Peakmuster
ist ein Hinweis auf statistische Imperfektionen, wenn man bedenkt, dass durch die
Probeninjektion eine Stichprobe von Aggregaten unterschiedlicher Große
¨ und Form
gezogen wird, die von den Zellen mit einer unterschiedlichen Wahrscheinlichkeit gebildet werden. Der zweite Punkt fuhrt
¨
zu biologischen Einflussfaktoren. Obgleich, wie
in Abbildung 4.14 dargestellt, die station¨are Phase nach einer Inkubationszeit von 24 h
beginnt, und damit die Bakterienkultur uber
¨
mehrere Stunden/Tage stabil sein sollte, a¨ ndert sich die Zusammensetzung der Bakterienpopulation weiterhin durch zunehmende Agglomeratbildung. Berucksichtigt
¨
man die naturlichen
¨
Schwankungen im
Zellwachstum, so ist ein reproduzierbares Peakmuster von Tag zu Tag nahezu ausgeschlossen. Hinweise auf Partikel-Kapillarwand und Partikel-Partikel-Interaktionen
konnten in diesem Experiment nicht gefunden werden.
106
4. Ergebnisse und Diskussion
(a) Inkubationszeit 6-12 h
(b) Inkubationszeit 24-36 h
(c) Inkubationszeit 48-60 h
(d) Inkubationszeit 72-84 h
Abbildung 4.31: Analyse von M. luteus-Proben nach unterschiedlichen Inkubationszeiten. Zur EOFMarkierung wurde eine 0.00005 % Benzylalkohol enthaltende Pufferlosung
¨
verwendet. Fur
¨ Trennpuffer,
CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25.
⇒ Statistische und biologische Imperfektionen sind die Hauptursache der fehlenden
Reproduzierbarkeit des elektrophoretischen Fingerabdrucks von M. luteus.
¨
4.2.8 Ubertragung
der Methode auf: P. fluorescens und S. vestibularis
Im letzten Abschnitt konnte gezeigt werden, dass die Ursache fur
¨ die schlecht reproduzierbaren Elektropherogramme des Micrococcus-Stammes in der Natur dieser Bakterienspezies selbst zu finden ist. Im n¨achsten Schritt wurde deshalb, in der Hoffnung
auf bessere Ergebnisse, die entwickelte CE-Methode auf die beiden Bakterienspezies P.
fluorescens und S. vestibularis ubertragen.
¨
Fur
¨ P. fluorescens (Abbildung 4.32) lagen zwar
die detektierten Peaks im Elektropherogramm mit hoher Auflosung
¨
vor, doch spiegelte
das Peakmuster keineswegs eine gesunde Bakterienpopulation der station¨aren Phase
wider. Wie in Abschnitt 4.2.2 bereits beschrieben, liegt die Pseudomonas-Spezies in
Kultur uberwiegend
¨
in Einzelzellen vor, welche aufgrund ihrer geringen Große
¨
die
kurzeste
¨
Migrationszeit haben sollten. Dieser dominante erste Peak fehlte jedoch im
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
107
Abbildung 4.32: Analyse einer P. fluorescens-Probe nach
einer Inkubationszeit von 24 h.
Nach Waschung erfolgte die
Resuspendierung in Trennpuffer
mittels einminutigem
¨
Vortexen
in einer Konzentration von 0.5
OD600 . Fur
¨ Trennpuffer und CEBedingungen, siehe Abbildung
4.21.
Abbildung 4.33: Analyse einer P.
fluorescens-Probe nach einer Inkubationszeit von 8 h, 19 h und
30 h, aus der gleichen Zellkultur. Nach Bakterienernte erfolgte Waschung und Resuspendierung in Trennpuffer unter sanftem Pipettieren zu einer Konzentration von 0.5 OD600 . Fur
¨ Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21.
Elektropherogramm. Eine mikroskopische Analyse der Bakterienprobe gab Aufschluss
uber
¨
die Ursache. Es zeigten sich teilweise lysierte Bakterienzellen und abgerissene
Ketten. Offensichtlich musste eine sanftere Vorgehensweise in der Probenpr¨aparation
gefunden werden. Durch Einsatz von Pasteurpipetten gelang eine sanfte Resuspendierung der von N¨ahrmedium gereinigten Zellkultur in Trennpuffer und fuhrte
¨
zu
einem charakteristischen Peakmuster mit guter Reproduzierbarkeit (Abbildung 4.33).
¨
Ahnlich
der M. luteus-Studie wurde auch bei P. fluorescens der Einfluss verschiedener
Inkubationszeiten auf den elektrophoretischen Fingerabdruck untersucht. Wie in Abbildung 4.14 zu sehen, ist die station¨are Phase nach 18 h erreicht. Um unterschiedliche
Wachstumsstadien analysieren zu konnen,
¨
wurde nach einer Inkubationszeit von 8 h,
19 h und 30 h jeweils eine Bakterienprobe vermessen. Dadurch war ein Zustandsbereich von der exponentiellen Phase bis weit in die station¨are Phase hinein abgedeckt.
Die jeweiligen Elektropherogramme in Abbildung 4.33 zeigten in diesem Zeitfenster
¨
qualitativ keine signifikanten Anderungen.
Auch bei S. vestibularis gelang die Anwendung der entwickelten CE-Methode nur un-
108
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.34: Analyse einer S.
vestibularis-Probe nach einer Inkubationszeit von 4 h bis 24 h,
aus der gleichen Zellkultur. Zur
EOF-Markierung eine 0.00005 %
Benzylalkohol enthaltende Pufferlosung
¨
verwendet. Fur
¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.33.
ter sanften Resuspendierungsbedingungen. In Abbildung 4.34 sind die Elektropherogramme zu unterschiedlichen Inkubationszeiten abgebildet. W¨ahrend bei der Pseudomonas-Spezies die Wachstumsphasen CE-analytisch nicht mitverfolgt werden konnten, erwiesen sich die Elektropherogramme der Streptokokken-Spezies wachstumsphasenspezifisch. Die Elektropherogramme von Bakterienproben aus der exponentiellen Phase, d. h. zu 4 h, 6 h und 8 h zeigen einen Peak nach einer Migrationszeit
von ca. 10 Minuten. Eine mikroskopische Betrachtung in dieser Phase best¨atigte dieses analytische Ergebnis - die Zellpopulation bestand nahezu ausschließlich aus Diplokokken. Die Elektropherogramme a¨ nderten sich jedoch drastisch mit dem Beginn
der station¨aren Phase. Drei Signale in Folge, sogenannte Tripletts, charakterisieren die
Elektropherogramme der Bakterienproben nach einer Inkubationszeit von 10 h, 15 h
20 h und 25 h und sind wie eine mikroskopische Analyse zeigte, auf Kettenbildung
zuruckzuf
¨
uhren.
¨
4.2.9 Anwendungsbreite
Trennpuffer, CE-Bedingungen und Probenpr¨aparation der optimierten CE-Methode
sollten fur
¨ eine große Anzahl von Mikroorganismen anwendbar sein, um sp¨ater den
entwickelten Zytotoxizit¨atstest moglichst
¨
leicht auf verschiedene Erregerspezies uber¨
tragen zu konnen.
¨
4.2.9.1 N. cinerea
Aus diesem Grund wurde die Bakterienspezies Neisseria cinerea, mittels optimierter
CE-Methode analysiert. Sie ist bisher kapillarelektrophoretisch nicht untersucht worden und wird auch in anderen analytischen Verfahren selten angewandt. Unter ihrer
Gattung Neisseriaceae sind jedoch unter anderem Erreger der Meningitis zu finden,
womit N. cinerea ein interessanter apathogener Repr¨asentant wichtiger Krankheitserre-
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
109
Abbildung 4.35: Analyse von N.
cinerea-Proben nach einer Inkubationszeit von jeweils 24 h, gemessen an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Fur
¨ Trennpuffer,
CE und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25.
¨
ger darstellt. Ahnlich
der Micrococcus-Spezies bildet er unregelm¨aßige Cluster, lieferte
jedoch im Gegensatz zu M. luteus auch an drei aufeinanderfolgenden Tagen, abgesehen von Verschiebungen in den Migrationszeiten, qualitativ reproduzierbare Ergebnisse (Abbildung 4.35).
4.2.9.2 Trypanosoma brucei brucei
Mit dem Aufkommen bioanalytischer Anwendungen in der CE wurden auch kapillarelektrophoretische Untersuchungen an Erythrozyten [226, 289] und Trennungen von
Organellen aus lysierten Zellen [66, 130, 285] durchgefuhrt.
¨
Auch bei Trypanosomen
(Abschnitt 1.1.2), die mit einem Durchmesser von 10 µm noch im Großenbereich
¨
von Erythrozyten lagen, gaben ihre negative Oberfl¨achenstruktur und ihre gelungene Field-Flow-Fraktionierung [103] Hinweise auf eine mogliche
¨
kapillarelektrophoretische Anwendung. In einem ersten Versuch wurden mit der fur
¨ Bakterien optimierten
CE-Methode die Trypanosomen-Spezies T. brucei brucei analysiert. Nach dem Reinigungsprozess wurden die Trypanosomen durch sanftes Pipettieren in Puffer suspen¨
diert und auf einen OD600 -Wert von 0.5 eingestellt. Eine mikroskopische Uberpr
ufung
¨
der Zellsuspensionen zeigte, dass bereits die Zellpr¨aparation zum Lysieren der Trypanosomen gefuhrt
¨
hat - moglicherweise
¨
aufgrund dem im Puffer fehlenden, aber lebensnotwendigen N¨ahrstoff Glukose oder ungunstiger
¨
Osmolarit¨at. Dennoch wurde
die CE-Analyse von zwei unabh¨angigen Zellsuspensionen durchgefuhrt.
¨
Die Elektropherogramme in Abbildung 4.36 zeigen zwar nicht das Peak-Muster intakter Trypanosomen, doch konnten die verschiedenen Zellbestandteile mit guter Auflosung
¨
voneinander getrennt werden. Ebenfalls wurde eine relativ gute Reproduzierbarkeit erreicht,
obgleich in den jeweiligen Elektropherogrammen nicht alle Komponenten detektier¨
bar waren. Ahnlich
der M. luteus-Analyse konnten
¨
auch hier statistische Imperfektionen (Abschnitt 4.2.7.4) die Ursache sein. Eine gleichzeitige mikroskopische Detektion
110
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung
4.36:
Kapillarelektrophoretische
Trennung
trypanosomaler Zellbestandteile
aus zwei unterschiedlichen
Proben, gemessen am gleichen
Tag. Fur
¨ Trennpuffer, CE- und
Probenbedingungen,
siehe
Abbildung 4.33.
konnte
¨
zeigen, ob es sich bei den detektierten Signalen tats¨achlich um Zellorganellen
handelt, wodurch die Aufkl¨arung von Angriffspunkten neuer Wirkstoffe uber
¨
Fluoreszenzmarkierung kapillarelektrophoretisch moglich
¨
wurde.
¨
4.2.10 Trennung verschiedener Bakterienst¨amme
Parallelisierung ist das Schlagwort fur
¨ High-Throughput-Screening-Verfahren. Zu seiner Realisierung bzw. zumindest zur Steigerung des Durchsatzes der bisherigen CEMethode sollten die drei Bakterienspezies M. luteus, P. fluorescens und S. vestibularis
in einem Elektropherogramm von einander getrennt werden. Dadurch sollte es sp¨ater
moglich
¨
sein, die Toxizit¨at von Testsubstanzen auf alle drei Erreger simultan zu untersuchen. In Abbildung 4.24 wurde bereits gezeigt, dass verschieden große Zellagglomerate mittels Ultraschallbehandlung in Einzelzellen separiert werden konnen,
¨
wodurch
die Voraussetzung fur
¨ die elektrophoretische Parallelisierung verschiedener Bakterienspezies gegeben ist. Mittels optimierter CE-Methode und 1-minutiger
¨
Ultraschallbehandlung gelang die Separation der drei Bakterienarten (siehe Abbildung 4.37). Die
injizierte Probe enthielt die einzelnen Komponenten in gleichem Anteil und wurde auf
eine Gesamtzellzahl von 0.5 OD600 eingestellt. Wie das Elektropherogramm zeigt, sind
in der Zellsuspension jedoch trotz Ultraschallbehandlung zu einem geringen Anteil
Zellagglomerate und -ketten vorhanden, die auch mit Hilfe anderer Dispergierverfahren, wie z. B. unter Zusatz geringer Mengen von Tween 80, nicht vereinzelt werden
konnten. Dennoch gelang mittels der einzelnen Referenzbakterien bzw. Referenzmischungen die Identifizierung der einzelnen Peaks im Elektropherogramm. Aufgrund
der geringen elektrophoretischen Unterschiede zwischen P. fluorescens und S. vestibularis und der moglichen
¨
Schwankungen in der Migrationszeit, wird eine endgultige
¨
Zuordnung dieser St¨amme erst durch simultane Mikroskopie des Detektionsfensters
moglich
¨
(dieses Equipment stand uns nicht zur Verfugung).
¨
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
111
Abbildung 4.37: Kapillarelektrophoretische Trennung der drei
Bakterienspezies: M. luteus, P.
fluorescens und S. vestibularis. Die
Proben wurden nach einer Gesamtinkubationszeit von 24 h
pr¨apariert und vor der Injektion 1 Minute im Ultraschallbad behandelt. Die Probenkonzentration im Gemisch betrug
0.5 OD600 . Fur
¨ Trennpuffer und
CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21.
4.2.11 Validierung der Methode
Rein visuell zeigte sich die beste Reproduzierbarkeit der CE-Analyse intakter Mikroorganismen bei den beiden Bakterienst¨ammen P. fluorescens und S. vestibularis. Aus diesem Grund sollte mit diesen die CE-Methode zum Zytotoxizit¨atstest weiterentwickelt
werden. Um die Frage nach der Eignung der Methode zur weiteren Entwicklung zu
beantworten, musste die Methode validiert werden - denn Validierung ist der Nachweis der Eignung fur
¨ einen bestimmten Gebrauch fitness for use” [152]. Zur Validie”
rung der fundamentalen Parameter wie Richtigkeit, Pr¨azision, Linearit¨at, Selektivit¨at,
Spezifizit¨at, Sensitivit¨at und Robustheit wurde den Richtlinien der “International Conference of Harmonization, ICH” und “Food and Drug Administration, FDA” [58–60]
gefolgt. Einige dieser Parameter wurden bereits w¨ahrend der Methodenentwicklung
berucksichtigt:
¨
So wurde die Methode darauf ausgerichtet, eine gute Wiederholpr¨azision, einen Anwendungsbereich auf mindestens drei Bakterienspezies, und ein relativ hohes Maß an Robustheit zu besitzen. Auf diesem Wege wurden Grenzen in der
Stabilit¨at des Trennpuffers und der mikrobiellen Analyte festgestellt und optimiert.
Mit der optimierten CE-Methode war zwar die Sensitivit¨at aufgrund der Konzentrationsabh¨angigkeit der Elektropherogramme beschr¨ankt, die Selektivit¨at und Spezifizit¨at dagegen, wie die Trennung verschiedener Bakterienspezies und deren Agglomerate zeigte, gegeben. Um neben diesen bisher qualitativen Betrachtungen, die Methode quantitativ zu charakterisieren, wurden die Wiederholpr¨azision und Linearit¨at am
Beispiel P. fluorescens genauer untersucht. Auf Richtigkeit der Methode konnte erst im
eigentlichen Zytotoxizit¨atstest durch Vergleich des errechneten antimikrobiellen Potenzials verschiedener Referenzsubstanzen mit dem aus konventionellen Methoden
gepruft
¨ werden.
112
4. Ergebnisse und Diskussion
4.2.11.1 Linearit¨at
Die richtige Kalibrierung und damit die Bestimmung der Korrelation zwischen Signal
und Analytkonzentration ist die Grundvoraussetzung fur
¨ quantitativ-analytisches Arbeiten, welches sp¨atestens bei der Quantifizierung der Elektropherogramme zur Bestimmung der Zytotoxizit¨at zur Anwendung kommen sollte. In der Kalibrierarbeit
wurden sechs Elektropherogramme von Pseudomonas-Suspensionen in einem Konzentrationbereich zwischen 0.1 und 0.6 OD600 aufgenommen (Abbildung 4.38a). Jedes
Elektropherogramm entsprach nach Integration der einzelnen Signale uber
¨
die gesamte Zeitskala des Elektropherogrammes, einem Messpunkt, welcher der empirischen,
aus der OD-Messung (Abschnitt 4.2.4.3) ermittelten Probenmenge zugeordnet wurde.
Die Integrale wurden als korrigierte Peakfl¨achen berechnet, d. h. sie enthalten bereits
einen Korrekturfaktor zum Ausgleich der Peakverbreiterung bedingt durch l¨angere
Migrationszeiten. Der gemessene Konzentrationsbereich ergab sich aus den Bedingungen fur
¨ die Erstellung mikrobieller Elektropherogramme (Abschnitt 4.2.6.3.4). Die Instabilit¨at der Proben erforderte die Herstellung jeder Zellonzentration aus einer neuen
Bakterienkultur in einer Inkubationsphase von 24 h bis 36 h. Es wurden somit keine in der pharmazeutischen Analytik ublichen
¨
Stammlosungen
¨
verwendet. Die Auswertung der Korrelation zwischen Signal und Konzentration erfolgte visuell und uber
¨
2
die Bestimmung des Bestimmtheitsmaßes (R ). Betrachtet man in Abbildung 4.38b die
Auftragung der erhaltenen Wertepaare, wird ein aus der Messtechnik resultierender
systematischer Fehler deutlich. Die Konzentration der Bakteriensuspension kann nur
indirekt uber
¨
die optische Dichte bestimmt werden und enth¨alt auf diese Weise an sich
eine Korrelationsfunktion. Die Korrelation zwischen Zellzahl und optischer Dichte
wurde in Abschnitt 4.2.4.3 uber
¨
den gesamten Messbereich bestimmt. Wie in Abschnitt
3.3.1 bereits besprochen gilt eine Linearit¨at zwischen optischer Dichte und Zellzahl jedoch genaugenommen erst ab einem OD-Wert von 0.2 bis 0.3. L¨asst man aus diesem
Grund das erste Wertepaar (0.113,8916) außer Acht und fittet die restlichen Wertepaare an eine Korrelationsfunktion 1. Ordnung: y(x) = ax + b, so erh¨alt man die folgende
Geradengleichung:
y(x) = 665374x − 132538
(4.2)
mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0.993. Der negative Y-Achsenabschnitt ergibt
physikalisch zun¨achst keinen Sinn. Er unterstutzt
¨
jedoch die bei der Konzentrationsabh¨angigkeit der Elektropherogramme (Abschnitt 4.2.6.3.4) aufgestellte Hypothese,
dass unkontrollierte Adsorption des Analyten, d. h. der Mikroorganismen an der PEObeschichtung, w¨ahrend der kapillarelektrophoretischen Trennung stattfindet. Dieses
Ph¨anomen ist nicht nur von der Temperatur, dem Losungsmittel
¨
und der Beschaffenheit der betreffenden Oberfl¨achen abh¨angig, sondern auch von der Konzentration des
Analyten [153]. Vermutlich ist gerade diese Konzentrationsabh¨angigkeit der Adsorpti-
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
113
(a) Elektropherogramme von P. fluorescens bei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen und einheitlicher Injektion von 10 s bei 0.5 psi.
Fur
¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.21.
Integral
3
×10
300
250
200
150
100
50
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
OD600
(b) Auftragung der korrigierten Gesamtfl¨achen der einzelnen Elektropherogramme von P. fluorescens gegen die eingesetzten Bakterienkonzentrationen. Fur
¨ die Korrelationsfunktion 1. Ordnung wurde im
Konzentrationsbereich 0.2-0.6 OD600 die Geradengleichung f (x) =
665374x − 132538 mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0.993 erhalten.
Abbildung 4.38: Prufung
¨
auf Linearit¨at der Pseudomonas-Spezies.
on an die “hungrigen Oberfl¨achen” dafur
¨ verantwortlich, dass mit einem R2 -Wert von
0.993 dennoch eine gute Linearit¨at zwischen Messsignal und Zellmenge vorliegt. Aus
der Kalibrierfunktion konnen
¨
aber noch weitere Informationen gewonnen werden. Die
Steigung erscheint mit einem Wert von 66537 zun¨achst sehr groß, wodurch eine hohe
Empfindlichkeit suggeriert wird. Wie sich die Empfindlichkeit auf die Pr¨azision auswirkt wird nachfolgend diskutiert.
114
4. Ergebnisse und Diskussion
4.2.11.2 Pr¨azision
Bei der Methodenentwicklung am Stamm M. luteus zeigte sich, dass die Durchfuhrung
¨
von Wiederholmessungen mikrobieller Proben aus einem Inkubationszeitfenster von
ca. 12 h am gleichen Tag die beste Reproduzierbarkeit lieferte (Abschnitt 4.2.7.4). Zur
Bestimmung der Pr¨azision, dem quantitativen Maß fur
¨ die Robustheit einer Methode,
welche als Standardabweichung s berechnet wird [153], wurden deshalb in Abbildung
4.39 sechs Pseudomonas-Proben nach einer Inkubationszeit von 24 h bis 36 h in kurzen
Zeitabst¨anden unter gleichen CE-Bedingungen analysiert. Die Probenkonzentrationen
zeigten jeweils einen OD600 -Wert von 0.5. Die Integration der Elektropherogramme ergab eine korrigierte Gesamtfl¨ache von: 330290.46 ± 41010.17 normiert auf einen OD600 Wert von 1. Dies entspricht einer Standardabweichung von 12.42% und liegt damit
im Bereich biometrischer Großen
¨
[216]. Eine große Fehlerquelle in der CE-Methode
stellt die Injektion dar, die aufgrund der geringen Anzahl der Partikel pro Volumen
zu statistischen Imperfektionen fuhrt,
¨
die sich neben den in Abschnitt 4.2.7.4 beschrie¨
benen qualitativen Anderungen des Peakmusters auch in quantitativen Schwankungen a¨ ußern kann. Bezuglich
¨
der Schwankungen in den Migrationszeiten wurde fur
¨
den Einzelzellen-repr¨asentierenden-ersten-Peak eine Migrationszeit von 7.04 ± 0.23
Minuten gemessen. Dies entspricht einer Standardabweichung von 3.29 %, womit die
Schwankung durchaus noch im Rahmen der ublichen
¨
Arzneistoff-Analytik lag [153].
Abbildung 4.39: Analyse von P.
fluorescens-Proben nach einer Inkubationszeit zwischen 24 h bis
30 h, am gleichen Tag gemessen.
Fur
¨ Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.33.
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen
115
4.2.12 Fazit: CE-Analyse von Mikroorganismen
• Die CE-Methode bewies sich in guter Pr¨azision, Selektivit¨at, Spezifizit¨at, Linearit¨at und in einem weiten Anwendungsbereich. (Trennpuffer: 0.78 mM TrisBorat, 0.018 mM Na2 EDTA und 0.0125% PEO bei einem pH von 8.7; polymere Matrix: PEO 600.000 wurde in einer Konzentration von 0.5 % bei 30 ◦ C fur
¨
mindestens 12 h gelost
¨ und anschließend mit Puffer auf 0.0125 % verdunnt;
¨
CEBedingungen: Quarzkapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm und einer Detektionsl¨ange von 21 cm, konstant angelegte Spannung von 10 kV, Temperatur 23
◦
C, anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur
¨ 10 s,
Detektion bei 214 nm; Bakterienproben und Puffer: Neue Herstellung vor jeder
Messung; eine Zellkonzentration von 0.5 OD600 )
• Die Probenpr¨aparation muss dem Mikroorganismus entsprechend individuell
optimiert werden.
• Die Grenze der Reproduzierbarkeit der kapillarelektrophoretischen Analyse intakter Mikroorganismen ergibt sich aufgrund der statistischen Verteilung der
Grundgesamtheit einer Bakterienpopulation.
116
4. Ergebnisse und Diskussion
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch
Fluoreszenzmarkierung
¨
Uberblick:
In diesem Abschnitt werden zwei neue Methoden zur Bestimmung der bakteriziden Wirksamkeit auf der Grundlage der Fluoreszenzspektroskopie entwickelt. Die Auswertung erfolgt sowohl
am Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (fluorescence microplate reader, FMR) als auch mittels der in Abschnitt 4.2 beschriebenen kapillarelektrophoretischen Methode unter Verwendung eines Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektors (LIF-CE). Die Nutzung
der Membranunversehrtheit bei lebenden gegenuber
¨
toten Zellen ermoglicht
¨
nach Zellmarkierung mit den beiden Nucleins¨aurebindenden Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid (”LIVE/DEAD BacLight viability kit”) schnell zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden.
4.3.1 Zustand einer Bakterienpopulation
Zur Klassifizierung der antimikrobiellen Wirkung getesteter Substanzen in bakterizid
und statisch ist eine Analyse verschiedener Zellmerkmale notwendig. Konventionell
dient die Replikationsf¨ahigkeit als Kriterium fur
¨ die Prufung
¨
auf Lebensf¨ahigkeit. Deren Bestimmung in einer Zellkultur erfolgt meist durch Ausplattieren einer definierten
Menge Zellsuspension und anschließendem Z¨ahlen koloniebildender Einheiten [254].
Diese Methode hat jedoch durch Verklumpung der Zellen oder gegenseitiger Beeinflussung bei der Koloniebildung [168] einige Fehlerquellen und ist nicht zuletzt sehr zeitintensiv (24 h bis 5 Tage) [254]. Auf der Suche nach neuen Losungs¨
ans¨atzen wurden in den letzten Jahren vor allem auf dem Gebiet der Fluoreszenzspektroskopie verschiedene rasche Methoden zur Bestimmung der Lebensf¨ahigkeit entwickelt. Sie basieren zum einen auf der Membranunversehrtheit, die darauf
beruht, dass bestimmte Marker die Zellmembran nicht penetrieren konnen.
¨
Dazu
gehoren
¨
Methylenblau, Kongo-Rot [227] und DNA-Marker wie SYTOX Green [157],
Propidiumiodid [135] und Ethidiumbromid [184]. Zum anderen wird die Aktivit¨at
von Stoffwechselvorg¨angen gemessen wie z. B. Zellatmung (Tetrazoliumfarbstoffe
[8, 223]), Enzymaktivit¨at (Fluoresceindiacetat [229, 247]), Membranpotenzial (Rhodamine 123, DiOC6 (3)(3,3-Dihexyloxacarbocyaniniodid) und DiBAC4 (Bis-(1,3-Dibutylbarbiturs¨aure)-Trimethinoxonol) [138, 169]) oder pH-Gradient (Fluorescein und 5(und6-)-carboxyfluorescein [98]).
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
117
4.3.2 Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid
Die fluoreszenzspektroskopische Analyse einer Zellpopulation auf der Basis der SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung (Abbildung 4.40) hat den Vorteil, dass sowohl
lebende als auch tote Bakterienzellen bei verschiedenen Wellenl¨angen simultan erfasst werden und aus der relativen Fluoreszenzintensit¨at die Konstitution einer Bakterienpopulation quantitativ beschrieben werden kann. Dies hat zur Folge, dass sich
bei Kopplung der fluorimetrischen Detektion mit analytischen Trenntechniken wie
z. B. der Kapillarelektrophorese die Verwendung eines internen Standards erubrigt.
¨
Die Lebend-Tot-Markierung mit den beiden Nucleins¨aure-bindenden Farbstoffen beruht auf ihren unterschiedlichen spektralen Eigenschaften und ihrer unterschiedlichen
F¨ahigkeit in Bakterienzellen einzudringen [4]. W¨ahrend SYTO9 membranpermeabel
ist und alle Zellen einer Bakterienpopulation grun
¨ f¨arbt, wird Propidiumiodid mit seiner charakteristischen roten Fluoreszenz von gesunden Zellen durch seine Membranimpermeabilit¨at ausgeschlossen. Einige Bakterienst¨amme verfugen
¨
desweiteren uber
¨
Efflux-Pumpen, womit Propidiumiodid aktiv aus lebenden Zellen transportiert werden kann [254]. In toten Zellen fuhrt
¨
sowohl die Verdr¨angung von SYTO9 durch Propidiumiodid aufgrund st¨arkerer DNA-Bindung als auch die Fluoreszenzausloschung
¨
der SYTO9 Emission durch “fluorescence resonance energy transfer”(FRET, Abschnitt
3.3.3) zum Ersetzen der grunen
¨
gegen die rote Fluoreszenz [254]. Der letztere Mecha¨
nismus ist aufgrund der spektralen Uberlappung
der beiden Marker moglich.
¨
Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid verl¨auft sehr schnell und erfordert lediglich eine Inkubationszeit von 15 Minuten [12,14]. Dann zeigen lebende Zellen
eine grune
¨ und tote Zellen eine rote Fluoreszenz.
Die Routineanwendung der SYTO9-Propidiumiodid-Markierung ist jedoch nicht unproblematisch. Zwar ist unbestritten, dass Bakterienzellen, die sich mittels Propidiumiodid anf¨arben lassen weder lebensf¨ahig noch kultivierbar sind, doch wurde bei
gleichzeitiger Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid auch von F¨allen berichtet, bei denen sowohl fur
¨ lebende als auch fur
¨ tote Zellen die gleiche rote oder
grune
¨ Fluoreszenzintensit¨at detektiert wurde [254]. Solche konfusen, zweideutigen Situationen konnen
¨
durch die extrem großen Unterschiede in der Emissionsintensit¨at
von SYTO9 und Propidiumiodid verursacht werden. W¨ahrend SYTO9 an DNA gebunden eine starke Fluoreszenz aufweist [228], zeigen Propidiumiodid-markierte Proben
nur eine sehr geringe Fluoreszenzintensit¨at bedingt durch den sehr kleinen Extinktionskoeffizienten des Propidiumiodids [28]. Zum anderen muss aber auch berucksich¨
tigt werden, dass das Emissionsspektrum von SYTO9 mit dem Anregungsspektrum
von Propidiumiodid uberlagert.
¨
Diese Tatsache ist die Grundlage dafur,
¨ dass eine gegenseitige Fluoreszenzausloschung
¨
und damit die simultane Lebend-Tot-Bestimmung
uberhaupt
¨
moglich
¨
ist - fuhrt
¨
aber bei einem Missverh¨altnis der Markerkonzentrationen unter Umst¨anden zu uneindeutigen Fluoreszenzerscheinungen. In jedem Fall er-
118
H3C
4. Ergebnisse und Diskussion
(CH2)3
N
NH2
H2N
+
N
CH
O
I
+
N CH3
SYTO9:
Anregungsmaximum: 480 nm
Emissionsmaximum: 500 nm
(CH2)3
C2H5
2I
+
N CH3
C2H5
Propidiumiodid:
Anregungsmaximum: 490 nm
Emissionsmaximum: 635 nm
Abbildung 4.40: Chemische Strukturen und spektrale Eigenschaften der beiden Komponenten SYTO9
und Propidiumiodid des “LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits” L-7012. Im Kit liegt SYTO9 in
3.34 mM und Propidiumiodid in 20 mM Konzentration, jeweils gelost
¨ in DMSO, vor [4].
fordert eine routinem¨aßige Anwendung zun¨achst eine solide Validierung der Fluoreszenzmarkierung.
4.3.3 Auswahl des Testsystems
Zum Aufbau neuer Testverfahren zur Bestimmung bakterizider Wirksamkeit einiger Antiinfektiva mittels SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung wurden die beiden Testst¨amme P. fluorescens und S. vestibularis ausgew¨ahlt. Sie wurden im vorhergehenden Kapitel bereits kapillarelektrophoretisch analysiert, wodurch die Entwicklung zweier orthogonaler Methoden mittels FMR und LIF-CE moglich
¨
sein sollte. Die
Etablierung und Validierung neuer Methoden erfordert aber auch den Einsatz in der
Literatur gut dokumentierter Referenzsubstanzen. Die dafur
¨ geeigneten Antibiotika
sollten:
• Bakterizid wirksam sein,
¨
• Uber
eine gute Wasserloslichkeit
¨
verfugen,
¨
um zun¨achst eine Losungsmittel
¨
bedingte Zytotoxizit¨at ausschließen zu konnen
¨
und
• Unterschiedliche Angriffspunkte und Wirkmechanismen besitzen, die sich even-
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
119
tuell unterschiedlich auf die Membranunversehrtheit auswirken konnen.
¨
Vancomycin
H
H OH
HO
H
O
HN
- OOC
Cl
O
O
N
HH H
Cl
H
N
O
H O
H O H H
N
N
H
O
O
N
H H
+
CH3
NH2
CH3
H
CH3
NH2
OH
OH
HO
Ciprofloxacin
4-Chinolon-3-carbonsäure
O
O
O
F
O
OH
OH
N
H
N
N
N
H
Abbildung 4.41: Strukturen der Arzneistoffe, die als Referenzsubstanzen zur Entwicklung und Etablierung der neuen Testverfahren zur Bestimmung der bakteriziden Wirksamkeit verwendet wurden.
Die Auswahl fiel auf Ciprofloxacin gegen P. fluorescens und Vancomycin-HCl gegen
S. vestibularis. Die Arzneistoffe sind in Abbildung 4.41 dargestellt. Bei Ciprofloxacin
handelt es sich um ein Derivat der 4-Chinolon-3-carbons¨aure. Es gehort
¨ zur Gruppe der Gyrase(TopoisomeraseII)-Hemmstoffe. Die Gyrase stellt in Bakterien ein wichtiges Schlusselenzym
¨
fur
¨ die lebenswichtige DNS- und RNS-Transkription dar und
¨
ist verantwortlich fur
¨ die Offnung
und den Verschluss der Chromosomenf¨aden des
DNS-Kn¨auels. Ihre Hemmung verhindert vor allem das Schließen der geoffneten
¨
DNSStr¨ange und unterbindet somit Zellwachstum und Zellteilung und fuhrt
¨
zum Zelltod.
Vancomycin gehort
¨ zur Gruppe der Glykopeptide und wird aus der Fermentationslos¨
ung von Streptomyces orientalis gewonnen. Es hemmt den Einbau von DisaccharidEinheiten in die Proteoglycan-Kette der Zellwand und wirkt bakterizid gegenuber
¨
Gram-positiven Bakterien. Beide Substanzen verfugen
¨
uber
¨
eine sehr gute Wasserlos¨
lichkeit, welche die Herstellung von Stammlosungen
¨
in einer Konzentration von
10 mM zuließ (siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.1).
120
4. Ergebnisse und Diskussion
4.3.4 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR)
4.3.4.1 Validierung der Fluoreszenzmarkierung
In der Fluoreszenzspektroskopie wird die gesamte Lumineszenz einer Probe gemessen. Sie muss folglich proportional zur vorhandenen Zellzahl sein, d. h. alle Bakterienzellen mussen
¨
mit Farbstoff ges¨attigt sein. Aufgrund der gegenseitigen Beeinflussung der beiden Fluoreszenzmarker SYTO9 und Propidiumiodid durch Verdr¨angung
und Fluoreszenzloschung
¨
bildet die S¨attigung der Probe mit SYTO9 die Grundlage der
fluorimetrischen Auswertung. Ferner muss fur
¨ eine korrekte Fluoreszenzmarkierung
¨
und Auswertung Propidiumiodid in ausreichendem Uberschuss
vorhanden sein, so
dass die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration erst durch die Herstellung” ei”
ner Korrelation 1. Ordnung (vide infra) zwischen dem grun/roten
¨
Fluoreszenzverh¨altnis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen angepasst werden kann [4, 254]. Die
Bestimmung der erforderlichen Konzentrationen erfolgte zun¨achst am FMR bei einer
Anregungswellenl¨ange von 488 nm und Emissionswellenl¨angen von 520 nm (SYTO9)
und 655 nm (Propidiumiodid). Diese entsprachen zwar nicht den Anregungs- und
Emissionsmaxima, doch bestand dadurch Einklang mit den Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, die zu Visualisierungszwecken eingesetzt wurde, und der LIF-CE.
4.3.4.1.1 S¨attigungskonzentration
Die S¨attigungskonzentration von SYTO9 wurde fur
¨ eine Bakterienpopulation in der
fruhen
¨
station¨aren Phase bestimmt. In diesem Stadium, kurz nach Abschließen des
Zellwachstums besteht eine Bakterienkultur aus fast 100 % lebenden Zellen. Die verwendeten Bakterienzellen waren in 200 µl Wasser suspendiert, um eine mogliche
¨
Bindung von SYTO9 an Mediumbestandteile auszuschließen. In Vorversuchen wurden unterschiedliche Zellkonzentrationen zur Zellmarkierung eingesetzt. Eine Fluoreszenzmarkierung von 1.5 x 107 Zellen/ml (1:10 Verdunnung
¨
einer 0.5 OD600 -Stammlosung,
¨
siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) fuhrte
¨
zu einer Fluoreszenzintensit¨at im Bereich 100 bis 200 RFU (relative fluorescence unit) und erwies sich somit als geeignet fur
¨ alle nachfolgenden Experimente. Abbildung 4.42 zeigt die Fluoreszenzintensit¨aten von acht Pseudomonas-Proben, die zuvor mit unterschiedlichen
SYTO9-Konzentrationen in einem Konzentrationsbereich zwischen 15 nM und 10 µM
unter Lichtausschluss fur
¨ 15 Minuten inkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensit¨at der
markierten Pseudomonas-Proben steigt als Funktion der SYTO9-Konzentration um
mehr als das Doppelte. Bei einer Konzentration von > 1.5 µM stagniert die Fluoreszenzintensit¨at und mundet
¨
in einem Plateau, das die S¨attigung der Zellen mit SYTO9
markiert. Ein Vergleich zu den ungebundenen SYTO9-Intensit¨aten, die in rein w¨assriger Umgebung gemessen wurden, verdeutlicht die starke Fluoreszenz des DNAgebundenen SYTO9. Fur
¨ S. vestibularis ergab sich bei a¨ hnlichem Fluoreszenzverhalten
green fluorescent intensity [RFU]
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
121
250
SYTO9 + 1.5x107 Zellen/ml
SYTO9 ohne Zellen
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
Concentration SYTO9 [µM]
Abbildung 4.42: S¨attigungskurve von P. fluorescens fur
¨ den
Fluoreszenzmarker
SYTO9.
Die verwendeten Bakteriensuspensionen enthalten 1.5 x
107 Zellen/ml aus der fruhen
¨
station¨aren Phase in w¨assrigem
Milieu. Die Messungen erfolgten
am FMR bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und
einer Emission von 520 nm.
eine identische S¨attigungskonzentration.
Fur
¨ alle weiteren Messungen wurde zur S¨attigung von 1.5 x 107 Zellen/ml eine SYTO9Konzentration von 1.67 µM eingesetzt.
4.3.4.1.2 Korrelationsfunktion 1. Ordnung
Im zweiten Schritt wurde die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration auf der Basis der optimierten SYTO9-Konzentration eingestellt. Dazu wurden zwei Zellsuspensionen bestehend aus je 100 % lebenden und toten Zellen mit einem OD600 -Wert von
0.5 pr¨apariert, 1:10 verdunnt,
¨
so dass sich eine Gesamtzellzahl von 1.5 x 107 Zellen/ml
ergab, und in funf
¨ unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen gemischt: 100:0, 75:25,
50:50, 25:75, und 0:100. Die exakte Herstellung dieser Referenzsuspensionen und die
Abtotung
¨
der Bakterienzellen mit Isopropanol ist im Experimentellen Teil Abschnitt
5.1.7.2.5 beschrieben. Ist das zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzte Verh¨altnis zwischen SYTO9 und Propidiumiodid richtig”, dann beschreibt eine Korrelationsfunk”
tion 1. Ordnung die Beziehung zwischen dem Verh¨altnis gruner
¨
zu roter Fluoreszenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen. Unterschiedliche PropidiumiodidKonzentrationen im Bereich 1 bis 100 µM wurden somit auf Linearit¨at getestet. Abbildung 4.43 zeigt am Beispiel der SYTO9-markierten Pseudomonas-Spezies die erhaltenen Vitalit¨atskurven” in Abh¨angigkeit von der eingesetzten Propidiumiodid”
Konzentration.
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.44: Vitalit¨atsgera”
den” von P. fluorescens und S. vestibularis aus der Mittelung uber
¨
vier Wiederholexperimente. Die
Zellmarkierung von 1.5 x 107
Zellen/ml erfolgte mit 1.67 µM
SYTO9 und 10 µM Propidiumiodid. Gemessen wurden am
FMR bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und
655 nm.
4.0
Prop.= 1 µM
Prop.= 10 µM
3.5
Prop.= 100 µM
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0
ratio of green/red fluorescence
Abbildung 4.43:
Vitalit¨ats”
kurven” von P. fluorescens in
Abh¨angigkeit unterschiedlicher
Propidiumiodid-Konzentrationen. Die Bakteriensuspensionen
enthalten 1.5 x 107 Zellen/ml in
unterschiedlichen lebend/totVerh¨altnissen und wurden mit
SYTO9 in einer Konzentration
von 1.67 µM ges¨attigt. Gemessen
wurde am FMR bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm
und dualer Emission bei 520 nm
und 655 nm.
ratio of green/red fluorescence
122
7
20
40
60
40
60
80
100
percentage of live cells
P. fluorescens
S. vestibularis
6
5
4
3
2
0
20
80
100
percentage of live cells
Fur
¨ eine lineare Korrelation zwischen grun/rotem
¨
Fluoreszenzverh¨altnis und dem Anteil lebender Bakterienzellen erwies sich fur
¨ eine Bakteriensuspension von P. fluorescens
und S. vestibularis mit einer Zellkonzentration von 1.5 x 107 Zellen/ml die Markierung
mit 1.67 µM SYTO9 und 10 µM Propidiumiodid als geeignet. Die Markierung der Zellen erfolgte nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten unter Lichtausschluss.
Die entsprechenden Vitalit¨atsgeraden” von P. fluorescens und S. vestibularis sind in
”
Abbildung 4.44 dargestellt. Gemittelt uber
¨
vier unabh¨angige Experimente (d. h. an
verschiedenen Tagen durchgefuhrt)
¨
ergaben sich fur
¨ die Korrelationsfunktion f (x) =
ax + b die folgenden Gleichungen und Bestimmtheitsmaße:
P. fluorescens : f (x) = 0.0152 · x + 1.3879, R2 = 0.999
S. vestibularis : f (x) = 0.0511 · x + 2.0985, R2 = 0.991
Die Streuungen der einzelnen Messwerte sind als Fehlerbalken eingezeichnet und ergeben eine relative Standardabweichung von ≤ 8 % fur
¨ P. fluorescens und ≤ 4 % fur
¨ S.
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
123
vestibularis. Die beiden Ausgleichsgeraden enthalten sowohl
• die Vitalit¨atsbestimmung,
¨
• die Korrektur der spektralen Uberlappung
von SYTO9 und Propidiumiodid
• als auch die Hintergrundfluoreszenz,
wobei die letzten beiden Faktoren zu den beobachteten positiven Y-Achsenabschnitten
fuhren.
¨
Die Vitalit¨atsgeraden” bilden die Basis fur
¨ alle weiteren Vitalit¨atsbestimmun”
gen Arzneistoff-exponierter Bakterienproben und ihre pr¨azise Bestimmung ist unentbehrlich.
4.3.4.2 Testung
Antibiotika greifen direkt in den katabolen und anabolen Stoffwechsel der Bakterienzellen ein; das bedeutet, dass sich die zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit
verwendeten Bakterienkulturen in der exponentiellen Phase befinden mussen
¨
[182].
Die Bakterienkulturen zeichnen sich in dieser Phase durch starke Stoffwechselaktivit¨at
und Zellvermehrung aus, so dass die Auswirkung der Antibiotika auf Zellwachstum
und -zustand leicht sichtbar wird. Die Antibiotika wurden in einem Konzentrationsbereich zwischen 0.01 µM und 100 µM auf ihre toxische Wirkung getestet. Nach einer Inkubationszeit von 18 h bei 30 ◦ C wurden die Arzneistoff-exponierten Bakterienzellen geerntet, gewaschen, mit den optimierten Markerkonzentrationen Fluoreszenzmarkiert und zusammen mit einer Positiv(100 % lebende Zellen)- und einer Negativ(100 % tote Zellen)kontrolle am FMR mit einer Extinktion bei 488 nm und dualer
Emission bei 520 nm und 655 nm gemessen. Anhand des ermittelten grun/roten
¨
Fluoreszenzver¨altnisses wurde aus der Kalibrierfunktion der prozentuale Anteil lebender
Zellen der jeweiligen Bakterienproben errechnet und in Abh¨angigkeit der eingesetzten Antibiotikakonzentrationen aufgetragen. Abbildung 4.45 zeigt die beiden DosisWirkungs-Kurven von Ciprofloxacin fur
¨ P. fluorescens und Vancomycin fur
¨ S. vestibularis.
Insgesamt wurde die Bestimmung der Zytotoxizit¨at dreimal durchgefuhrt.
¨
Die entsprechenden ED50 -Werte berechneten sich mittels linearer Interpolation [134] (Abschnitt 5.3) fur
¨ Ciprofloxacin zu 5.1±1.6 µM und fur
¨ Vancomycin zu 2.4±0.7 µM. Dies
entspricht einer Standardabweichung von 31.4 % bei Ciprofloxacin und 29.2 % bei Vancomycin, womit die Streuung im Rahmen der ublichen
¨
Abweichungen von 30 % bei
¨
biologischen Testverfahren liegt [175]. Zur Uberprufung
¨
und Interpretation der Ergebnisse wurde die Testung mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren wiederholt
und die entsprechenden MIC-Werte bestimmt (Abschnitt 5.1.8.3). Fur
¨ Ciprofloxacin
¨
ergab sich ein MIC-Wert von 3.0 µM und fur
¨ Vancomycin ein Wert von 0.7 µM. Ahnliche Aktivit¨atskonzentrationen sind auch in der Literatur beschrieben, weshalb auf
4. Ergebnisse und Diskussion
percentage of live cells
124
120
Ciprofloxacin
VancomycinHCl
100
80
60
Abbildung 4.45: Dosis-Wirkungs-Kurven von Ciprofloxacin
fur
¨ P. fluorescens und Vancomycin fur
¨ S. vestibularis mittels
FMR. Fur
¨ die Messbedingungen
siehe Abbildung 4.44
40
20
0 -3
10
-2
10
-1
10
1
2
10
10
Concentration [ µM]
eine Wiederholung der Zytotoxizit¨atsbestimmung verzichtet wurde [102, 122]. Die Toxizit¨atskonzentrationen von beiden Methoden liegen im gleichen Großenbereich,
¨
wodurch die Eignung der fluorimetrischen Auswertung mittels FMR zun¨achst best¨atigt
ist.
4.3.5 LIF-CE zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation
Zur Entwicklung eines zur FMR-Methode orthogonalen Zytotoxizit¨atstestes auf der
Grundlage der LIF-CE wurde auf die im vorangegangenen Kapitel beschriebene kapillarelektrophoretische Methode zuruckgegriffen.
¨
Sie verwendet eine UV-Detektion
bei 214 nm und setzt fur
¨ die Erstellung charakteristischer Fingerabdrucke
¨
den Einsatz
8
einer hohen Zellkonzentration mit einem OD600 -Wert von 0.5 (≈1.5 x 10 Zellen/ml)
voraus (Abbildung 4.38a). Die Ankopplung der Kapillarelektrophorese an den ArgonLaser-induzierten-Fluoreszenz-Detektor (Anregungswellenl¨ange ist 488 nm) erfordert
jedoch das Arbeiten mit wesentlich geringeren Probenkonzentrationen, um das Detektionsmaximum von 1000 RFU nicht zu uberschreiten
¨
(Abschnitt 3.4.1.3). Aufgrund
der starken Fluoreszenzintensit¨at musste die Anzahl der Zellen im Vergleich zur UVDetektion um einen Faktor 100 reduziert werden, wodurch aufgrund von Wechselwirkungen mit dem PEO der mobilen Wandbeschichtung die elektrophoretische Wanderung der Zellen so stark beeinflusst wurde, dass keine Zellen mehr am Detektor
ankamen. In einem ersten Schritt musste die etablierte UV-CE-Methode fur
¨ kleinere
Probenkonzentrationen anwendbar gemacht werden, ohne dass die Charakterisierung
einer Bakterienkultur anhand des Peakmusters verloren ging. Eine Konzentrationsabh¨angigkeit des elektrophoretischen Verhaltens von Bakterienzellen wurde kurzlich
¨
auch am Beispiel E. coli beschrieben [262]. Durch Erhohung
¨
der Ionenst¨arke unter Verwendung eines 10 mM Boratpuffers und der Substitution von PEO gegen Natriumalginat oder anionischer Kohlenhydratpolymere konnten die Interaktionen zwischen
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
125
Bakterium und mobiler Beschichtung unterbunden und damit das Problem der Konzentrationsabh¨angigkeit behoben werden. Die Voruntersuchungen zur Entwicklung
der UV-CE-Methode in Abschnitt 4.2.6.2 zeigten jedoch, dass vor allem der Teststamm
P. fluorescens sehr empfindlich auf hohe Ionenst¨arken reagiert, wodurch eine Kontrolle
der Bakterienadsorption an der Beschichtung auf elektrostatischem Wege in unserem
Fall nicht moglich
¨
war und in der Injektionstechnik nach einer Losung
¨
des Problems
gesucht wurde.
4.3.5.1 Injektionstechnik
Offensichtlich kommt es bei der Injektion einer relativ großen Zelldichte zu Wechselwirkungen der Bakterienzellen untereinander, wodurch “sample stacking” erreicht
wird und die Verzogerung
¨
der elektrophoretischen Wanderung durch Wandadsorption verhindert wird (Abschnitt 4.2.6.4). Die Fokussierung der Signale stark verdunnter
¨
5
7
Fluoreszenz-markierter Bakteriensuspensionen (10 -10 Zellen/ml) gelang schließlich
durch eine zweite Injektion einer unmarkierten Zellsuspension mit einer Konzentration von 0.5 OD600 (≈1.5 x 108 Zellen/ml). In Abbildung 4.46 ist der fokussierende
Effekt der Nachinjektion am Beispiel der Pseudomonas-Spezies dargestellt. Die Elektropherogramme Fluoreszenz-markierter gesunder Bakteriensuspensionen mit einer
Konzentration von 1.5 x 106 Zellen/ml wurden unter dem Einfluss verschiedener unmarkierter Bakterienkonzentrationen der zweiten Injektion bei 520 nm aufgezeichnet.
Zur Fluoreszenzmarkierung wurden die im n¨achsten Abschnitt (Abschnitt 4.3.5.2) be¨
schriebenen und validierten Markerkonzentrationen eingesetzt. Ahnlich
wie in Abbildung 4.38a zeigten sich charakteristische Peakmuster in Abh¨angigkeit der Zelldichte in
der zweiten Injektion. W¨ahrend Elektropherogramme Fluoreszenz-markierter Bakteriensuspensionen ohne nachfolgende Injektion keine Signale innerhalb 30 Minuten aufwiesen (Abbildung 4.46(A)), wurden die Peaks mit zunehmender Zellkonzentration
in der nachinjizierten Bakteriensuspension mehr und mehr fokussiert. Mit einer nachinjizierten 0.1-OD600 -Zellsuspension wurde ein breites Signal nach einer Migrationszeit von 30 Minuten (Abbildung 4.46(B)) erhalten, das mit einer 0.5-OD600 -Suspension
zu einem scharfen Peakmuster mit einer Trennleistung von ca. 200.000 theoretischer
Boden/m
¨
fuhrte
¨
und die Zusammensetzung der Bakterienpopulation, bestehend aus
Einzelzellen und Zellketten, beschrieb (Abbildung 4.46(C)).
126
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.46: ”Sample stacking” durch zweite Injektion einer unmarkierten hoch-konzentrierten
Bakteriensuspension (OD600 =0.5, d.h. 1.5 x 108 Zellen/ml ). Elektropherogramme einer Fluoreszenzmarkierten Pseudomonas-Suspension mit einer Konzentration von 1.5 x 106 Zellen/ml (A) ohne Zweitinjektion unmarkierter Zellen, (B) mit Zweitinjektion einer unmarkierten Zellsuspension in einer Konzentration von 0.1 OD600 und (C) mit Zweitinjektion einer unmarkierten Zellsuspension in einer Konzentration von 0.5 OD600 . Fluoreszenzmarkierung: fur
¨ 200 µl Zellsuspension mit 1.5 x 106 Zellen/ml
wurde je 1 µl einer 0.033 mM SYTO9- und 20 mM Propidiumiodid-Losung
¨
verwendet. Die markierte
und unmarkierte Probe wurde hintereinander bei einem Druck von 0.5 psi fur
¨ 10 s injiziert. Trennpuffer: 0.0125 % PEO, 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2 EDTA bei einem pH-Wert von 8.7. CEBedingungen: Quarzglaskapillare mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm, einer Detektionsl¨ange von 21 cm;
Spannung konstant angelegt von 10 kV; Temperatur 23 ◦ C und LIF-Detektion: Anregung bei 488 nm
und Emission bei 520 nm.
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
127
4.3.5.2 Validierung der Fluoreszenzmarkierung
4.3.5.2.1 Korrelationsfunktion 1. Ordnung
Die Validierung der Markerkonzentration und des Verh¨altnisses beider Marker in der
LIF-CE-Methode geschah auf der Grundlage der Ergebnisse der FMR-Methode. Die
zur S¨attigung einer Zellkonzentration von 1.5 x 107 Zellen/ml eingesetzte SYTO9Konzentration von 1.67 µM wurde 1:10 verdunnt
¨
und in der LIF-CE-Methode angewandt, zumal die zur Fokussierung notwendige zweite Injektion unmarkierter Zellen die direkte Bestimmung der Markers¨attigung verhinderte. Dagegen konnte die
richtige” Propidiumiodid-Konzentration durch Prufung
¨
der Korrelation zwischen
”
grun/roter
¨
Fluoreszenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen auf Linearit¨at
neu ermittelt werden.
Fur
¨ eine lineare Korrelation zwischen dem Verh¨altnis grun/roter
¨
Fluoreszenz und dem
prozentualen Anteil lebender Zellen wurden 1.5 x 106 Zellen/ml mit 0.167 µM SYTO9
und 100 µM Propidiumiodid fur
¨ 15 Minuten unter Lichtausschluss inkubiert.
Die entsprechenden Elektropherogramme wurden fur
¨ P. fluorescens und S. vestibularis
unter Verwendung einer Nachinjektion unmarkierter Bakterien in einer Konzentration von 0.5 OD600 im Zwei-Kanal-Modus des Argon-Laser-induzierten-FluoreszenzDetektors bei 520 nm und 655 nm aufgezeichnet und sind in Abbildung 4.48 und Abbildung 4.49 dargestellt. Sie enthalten
• den Anteil lebender Zellen bei 520 nm,
• den Anteil toter Zellen bei 655 nm,
¨
• die spektrale Uberlappung
von SYTO9 und Propidiumiodid und
• nahezu keine Hintergrundfluoreszenz.
Ihre Auswertung erfolgte durch Integration aller Signale uber
¨
das gesamte aufgezeich¨
nete Zeitfenster. Die Anderungen
der elektrophoretischen Fingerabdrucke
¨
je nach Zustand einer Bakterienpopulation werden im n¨achsten Abschnitt diskutiert. In Abbildung 4.47 sind die zur Kalibrierung der Vitalit¨at bestimmten Vitalit¨atsgeraden” von P.
”
fluorescens und S. vestibularis abgebildet. Fur
¨ die Korrelationsfunktion f (x) = ax + b
ergaben sich folgende Geradengleichungen und Bestimmtheitsmaße:
P. fluorescens : f (x) = 4.71 · x + 0.43, R2 = 0.981
S. vestibularis : f (x) = 22.38 · x + 0.56, R2 = 0.996
4. Ergebnisse und Diskussion
ratio of green/red fluorescence
128
25
Abbildung 4.47: Vitalit¨atsgera”
den” von P. fluorescens und S. vestibularis aus der Mittelung uber
¨
vier Wiederholexperimente. Die
Zellmarkierung von 1.5 x 106
Zellen/ml erfolgte mit 0.167 µM
SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid. Gemessen wurde an der
LIF-CE bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und
655 nm.
P. fluorescens
S. vestibularis
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
percentage of live cells
Wie bei der FMR-Methode wurde die Korrelation zwischen dem grun/roten
¨
Fluoreszenzverh¨altnis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen insgesamt viermal gemessen. Fur
¨ die Streuung der einzelnen Messergebnisse ergab sich eine relative Standardabweichung von ≤ 18% fur
¨ P. fluorescens und ≤ 12% fur
¨ S. vestibularis. Vermutlich
verursacht die geringe Probenmenge die im Vergleich zur FMR-Methode (P. fluorescens
≤ 8% ,S. vestibularis ≤ 4%) hoheren
¨
Standardabweichungen.
2
Die angemessenen R -Werte sind jedoch ein Indiz dafur,
¨ dass die unmarkierten Zellen der zweiten Injektion lediglich als “stacking front” dienen und durch ubersch
¨
ussi¨
¨
ge Fluoreszenzmarker nicht wesentlich beeinflusst werden. Eine genaue Uberprufung
¨
durch Waschen der markierten Zellen zur Entfernung ubersch
¨
ussiger
¨
Fluoreszenzmarker war jedoch aufgrund der geringen Zellmenge selbst mittels Ultrazentrifugation
nicht moglich.
¨
4.3.5.2.2 Unterschiede zwischen FMR und LIF-CE
Vergleicht man das optimale Markerverh¨altnis der FMR- und der LIF-CE-Methode
miteinander, so ist bei der LIF-CE-Methode bezogen auf die gleiche Zellzahl die 100fache Propidiumiodid-Konzentration notwendig. Ursache liegt vermutlich in der unterschiedlichen Art der Detektion. Beim FMR wird die gesamte Fluoreszenz aus einem
Gesamtvolumen von 200 µl in einer Vertiefung mit einem Durchmesser von 0.8 cm erfasst. Dadurch liefert die Hintergrundfluoreszenz den großten
¨
Beitrag zur detektierten
Lichtintensit¨at, wenn man berucksichtigt,
¨
dass bei einem durchschnittlichen Zellradius von 0.5 µm die Bakterienzellen eine Volumenfraktion von unter 10−5 besetzen. Fur
¨
die Messungen von rein mit SYTO9 markierten Zellen f¨allt der extrazellul¨are Beitrag
aufgrund der verst¨arkten Fluoreszenzintensit¨at von SYTO9 bei DNA-Bindung weniger stark ins Gewicht. Propidiumiodid jedoch zeigt bei DNA-Bindung im Vergleich
zur frei vorliegenden Form nur eine geringfugig
¨
hohere
¨
Intensit¨at [28, 254], so dass
die detektierte Emission stark von der Hintergrundfluoreszenz abh¨angt, wodurch zum
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
129
Beispiel auch eine unvollst¨andige Zellmarkierung kompensiert werden kann. Die Kalibrierung der ermittelten grun/rot-Verh¨
¨
altnisse auf den prozentualen Anteil lebender
Zellen l¨asst zwar insgesamt Ruckschl
¨
usse
¨
auf die Konstitution einer Bakterienkultur
zu, gibt jedoch keine korrekte Markierung der Zellen wieder. Hierzu ist es notwendig,
die Zellen wie in der Kapillarelektrophorese als Einzelobjekte zu detektieren. Die ermittelten Markerkonzentrationen stehen in Einklang mit zahlreichen in der Literatur
beschriebenen Beispielen [4, 14].
4.3.5.3 Charakteristische “fingerprints”
In Abbildung 4.48 und Abbildung 4.49 sind die Elektropherogramme der Pseudomonas- und Streptococcus-Spezies bei unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen und
dualer Detektion bei 520 nm und 655 nm dargestellt. Bei n¨aherer Betrachtung kann
zwischen den Fingerabdrucken
¨
bei 520 nm und 655 nm und der Konstitution der
Bakterienpopulation eine Korrelation gefunden werden. Sie wird nachfolgend am Beispiel der Pseudomonas-Spezies diskutiert, gilt aber in a¨ hnlicher Weise auch fur
¨ den
¨
Streptococcus-Stamm. Uberwiegt
der Anteil gesunder Zellen in der Probe - repr¨asentiert durch Bakterienproben bei einem lebend-Anteil von 60-100 % - sind die Peakmuster bei 520 nm denen UVmetrisch vermessener Bakterienproben aus der station¨aren
Phase sehr a¨ hnlich (Abbildung 4.33). Die Fingerabdrucke
¨
der LIF-CE zeigen lediglich
eine Verschiebung zu l¨angeren Migrationszeiten. Die Ursache hierfur
¨ liegt vermutlich
im hoheren
¨
Strom, hervorgerufen durch eine hohere
¨
Leitf¨ahigkeit aufgrund der Markerkonzentration in der Probe. Ein großes Signal nach einer Migrationszeit von 12 Minuten repr¨asentiert Einzelzellen und dominiert das Elektropherogramm dieser Konstitutionsklasse. Im Gegensatz dazu erscheint die Fluoreszenz der Signale der Ketten
bei l¨angeren Migrationszeiten sehr schwach (Abbildung 4.48(A)). Die entsprechenden
Signale bei 655 nm (Abbildung 4.48(B)), welche durch tote Zellen und der spektralen
¨
Uberlappung
zwischen SYTO9 und Propidiumiodid hervorgerufen werden, zeigen eine sehr geringe Intensit¨at.
Mit steigendem tot-Anteil - repr¨asentiert durch Bakterienproben mit einem lebendAnteil von 0-40 % - nimmt das Einzel-Zell-Signal bei 520 nm stark ab (Abbildung
4.48(A)). Gleichzeitig steigt die Intensit¨at der Signale mit l¨angerer Migrationszeit bei
655 nm (Abbildung 4.48(B)). Auf diese Weise korreliert der Zelltod mit der Kettenbildung, die durch Potenzial¨anderungen in der a¨ ußeren Zellmembran hervorgerufen
¨
wird. Anderungen
in der Konstitution einer Bakterienkultur konnen
¨
somit anhand
elektrophoretischer Peakmuster mitverfolgt werde. Die Abh¨angigkeit der Kettenbildung von der Zellkonstitution konnte in Abbildung 4.50 mikroskopisch verifiziert
werden.
130
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.48: Elektropherogramme von P. fluorescens (Fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid) bei unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen (100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, 0 %). Die
Elektropherogramme wurden nach Anregung bei 488 nm im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A) 520 nm (grun,
¨ lebende Zellen) und (B) 655 nm (rot, tote Zellen) aufgezeichnet.
Fur
¨ CE-Bedingungen und Probenmarkierung siehe Abbildung 4.46 und Abbildung 4.47. Aufgrund der
¨
spektralen Uberlappung
der beiden Fluoreszenzmarker zeigen auch 100 % lebende Zellen eine geringe
Intensit¨at der fur
¨ tote Zellen charakteristischen roten Fluoreszenz.
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
131
Abbildung 4.49: Elektropherogramme von S. vestibularis (fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid) bei unterschiedlichen lebend/tot-Verh¨altnissen (100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, 0 %). Die
Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A) 520 nm
(lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. Fur
¨ CE-Bedingungen und Detektion siehe
Abbildung 4.48.
132
4. Ergebnisse und Diskussion
(a)
(b)
Abbildung 4.50: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen SYTO9- und Propidiumiodid-markierter P.
fluorescens-Spezies in einer Zellsuspension mit 1.5 x 108 Zellen/ml. (a) Bakterienprobe aus der station¨aren Phase mit ca. 100 % lebenden Zellen. (b) 100 % tote Zellen. Die Abtotung
¨
erfolgte mit Isopropanol (siehe Abschnitt 5.1.7.2.5). Aufgenommen wurde die Emission nach einer Anregung bei 488 nm bei
520 und 655 nm. In Anlehnung an die fluorimetrischen Messungen wurden zur Zellmarkierung 16.7 µM
SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid verwendet. Bildgroße:
¨
86.5 µm x 64.6 µm.
¨
Ahnliche
Ergebnisse beschrieben auch De Carvalho et al. [74]. In ihrer Studie wurde
an den Testst¨ammen Mycobakterium sp. NRRL B-3805, Rhodococcus erythropolis DCL14
und Pseudomonas putida S12 die Bildung von Clustern in Abh¨angigkeit verschiedener
Losungsmittel
¨
mikroskopisch untersucht. So bildete z. B. die Pseudomonas-Spezies unter dem Einfluss von Toluen und Bis(2-ethylhexyl)phthalat zahlreichere und großere
¨
Cluster als bei Zusatz von n-Dodecan. Die zus¨atzliche Fluoreszenzmarkierung mit SY¨
TO9 und Propidiumiodid brachte Einblick in die zeitliche Anderung
der Konstitution
der jeweiligen Bakterienproben und zeigte bei diesen beiden Losungsmitteln
¨
im Vergleich zu anderen einen wesentlich schnelleren Vitalit¨atsverlust. Die Ursachen fur
¨ die
¨
ausgepr¨agte Clusterbildung liegt vermutlich in der Anderung
der Hydrophobizit¨at
¨
und Hydrophilizit¨at der Zellmembran. Anderungen
in der Hydrophobizit¨at der Zelloberfl¨ache und in der Zusammensetzung der Membranproteine und damit der Oberfl¨achenladung wurden auch fur
¨ mehrere Pseudomonas-Spezies nach Exposition mit Cefotaxim, Amoxicillin/Clavulans¨aure und Amikacin von Kustos et al. [154] berichtet.
4.3.5.4 Testung
In der LIF-CE erfolgte die Untersuchung der antibiotischen Wirkung anhand der
¨
Anderungen
im elektrophoretischen Profil der Bakterien und gleichzeitiger LebendTot-Bestimmung. Dazu wurden Elektropherogramme der P. fluorescens- und S. vestibularis-Spezies nach Exposition mit Ciprofloxacin bzw. Vancomycin im Konzentrationsbereich zwischen 0.01 und 100 µM bei 520 nm und 655 nm simultan aufgezeichnet (Abbildung 4.52 und Abbildung 4.53). Fur
¨ jede Konzentration wurde nach Integration der
percentage of live cells
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
120
133
Ciprofloxacin
VancomycinHCl
100
80
60
40
20
0 -3
10
-2
10
-1
10
1
2
10
10
Concentration [ µM]
Abbildung 4.51: Dosis-Wirkungs-Kurven von Ciprofloxacin
fur
¨ P. fluorescens und Vancomycin fur
¨ S. vestibularis mittels
LIF-CE. Fur
¨ die Messbedingungen siehe Abbildung 4.47
Elektropherogramme aus den grun/rot-Fluoreszenzintensit¨
¨
aten mittels der erstellten
Korrelationsgeraden das Verh¨altnis lebender zu toter Zellen berechnet. Die entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven in Abbildung 4.51 sind denen aus der FMR-Methode
sehr a¨ hnlich und zeigen einen typischen sigmoidalen Kurvenverlauf. Insgesamt wurde
die Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit dreimal durchgefuhrt.
¨
Mittels linearer Interpolation [134] ergab sich fur
¨ Ciprofloxacin gegen P. fluorescens ein ED50 -Wert
von 1.9±1.0 (Standardabweichung: 52.6 %) und fur
¨ Vancomycin gegen S. vestibularis
ein ED50 -Wert von 0.2±0.07 (Standardabweichung: 35.0 % ). Damit stehen beide ED50 Werte bei zwar etwas hoheren
¨
Standardabweichungen in gutem Einklang mit den Ergebnissen aus der FMR-Methode und dem Mikrodilutionsverfahren. Betrachtet man
die entsprechenden Elektropherogramme in Abbildung 4.52 und Abbildung 4.53, erkennt man bei P. fluorescens und S. vestibularis deutlich die ansteigende Kettenbildung
ab einer antibiotischen Behandlung mit einer Konzentration von 1 µM. Die visuelle
Auswertung ergibt somit eine gute Absch¨atzung fur
¨ die berechneten Toxizit¨aten.
134
4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.52: Elektropherogramme der P. fluorescens-Spezies nach Inkubation mit unterschiedlichen
Ciprofloxacin-Konzentrationen. Fur
¨ CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung
4.46. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A)
520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet.
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
135
Abbildung 4.53: Elektropherogramme der S. vestibularis-Spezies nach Inkubation mit unterschiedlichen Vancomycin-Konzentrationen. Fur
¨ CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung
4.46. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenl¨ange von (A)
520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet.
136
4. Ergebnisse und Diskussion
4.3.6 Moglichkeiten
¨
und Grenzen
4.3.6.1 Losungsmittel-Effekt
¨
und Wirkmechanismus
¨
Zur Uberpr
ufung
¨
der Eignung der beiden neuen Screening-Verfahren wurden zwei
weitere, in Abbildung 4.54 abgebildete Antibiotika zur Testung ausgew¨ahlt:
• Ofloxacin gegen P. fluorescens:
Ofloxacin ist wie Ciprofloxacin ein 4-Chinolon-3-carbons¨aure-Derivat und gehort
¨
ebenfalls zur Gruppe der Gyrase-Hemmstoffe. Es ist im Gegensatz zu Ciprofloxacin in Wasser schlecht loslich.
¨
Eine ausreichende Loslichkeit
¨
ist nur in Gegenwart
schwacher S¨auren oder Laugen gegeben, womit der Einfluss von Losungsmitteln
¨
auf die Testung und Fluoreszenzemission gepruft
¨ werden konnte.
• Ampicillin-Na gegen S. vestibularis:
Dieses Penicillin-Derivat ist ein Hemmstoff der Zellwandsynthese. Es hemmt das
Enzym Transpeptidase, welches die Aminozuckerketten in der Zellwand verknupft.
¨
Die Folge kann ein Anschwellen und Platzen der Zellen sein. Das Testverfahren konnte somit bei einem weiteren antibiotischen Wirkmechanismus angewandt werden. Ampicillin-Na ist sehr gut wasserloslich.
¨
Penicillin
O
R
Ampicillin
COO -
N
S
H H
O
CH3
*
CH3
H3N
+
H
O
Ofloxacin O
COO N
S
N
H H H
F
CH3
CH3
H3C
COOH
N
N
N
O
* CH3
¨
Abbildung 4.54: Strukturen der Arzneistoffe, die zur Uberpr
ufung
¨
der Eignung der FMR- und LIF-CEMethode eingesetzt wurden.
Zur Bestimmung der antiinfektiven Wirksamkeit wurde Ofloxacin in 0.1 M NaOH und
Ampicillin-Na in H2 O gelost.
¨ Tabelle 4.6 fasst alle bisher ermittelten ED50 und MICWerte aus der FMR-, LIF-CE-Methode und dem Mikrodilutionsverfahren und die verwendeten Losungsmittel
¨
zusammen. Die Bestimmung der ED50 -Werte wurde zweimal wiederholt. Die MIC-Werte wurden dagegen nur einmal gemessen und standen
auch fur
¨ Ampicillin und Ofloxacin in Einklang zu berichteten Ergebnissen [102, 122].
Die antibiotische Wirkung von Ciprofloxacin auf P. fluorescens und Ampicillin und Vancomycin auf S. vestibularis fuhrte
¨
unter allen drei Testmethoden zu a¨ hnlichen Ergebnissen: W¨ahrend die ED50 -Werte des Ciprofloxacins den MIC-Wert sehr gut wiedergaben,
zeigten beide ED50 -Werte des Ampicillin und bei Vancomycin der ED50 -Wert mittels
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
137
FMR-Methode eine Abweichung von einer 10er Potenz, was jedoch immer noch im
Rahmen der ublichen
¨
Streuungen bei In-vitro-Testverfahren [175] liegt. Dagegen wurden bei Ofloxacin gegen P. fluorescens mit dem “BacLight viability kit” sowohl mit der
FMR- als auch der LIF-CE-Methode irrefuhrende
¨
hohe ED50 -Konzentrationen erhalten.
Ofloxacin
Ciprofloxacin
in 0.1 M NaOH
in H2 O
ED50 (FMR)
>100
5.1±1.6
ED50 (LIF-CE)
>100
1.9±1.0
MIC
3.0
3.0
Ampicillin-Na Vancomycin-HCl
in H2 O
in H2 O
5.8±1.6
2.4±0.7
9.5±1.5
0.2±0.07
0.7
0.7
Tabelle 4.6: Ergebnisse der antibiotischen Wirksamkeit von Ofloxacin, Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und
Vancomycin-HCl. Bestimmt wurden die Ergebnisse mittels FMR, LIF-CE und Mikrodilutionsverfahren. Die Zahlenwerte sind in µM angegeben und beziehen sich auf die Salz-freie Arzneistoffform. Die
Messungen mittels FMR und LIF-CE wurden zweimal wiederholt, w¨ahrend die MIC-Werte einmal bestimmt wurden. Ofloxacin und Ciprofloxacin wurden gegen P. fluorescens getestet. Ampicillin-Na und
Vancomycin-HCl gegen S. vestibularis.
Mehr Aufschluss uber
¨
das Versagen der fluorimetrischen Methoden am Beispiel Ofloxacin brachten die entsprechenden elektrophoretischen Fingerabdrucke
¨
bei 520 und
655 nm. In Abbildung 4.55 sind die Elektropherogramme von P. fluorescens nach Exposition mit unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen zusammen mit einer Positivkontrolle abgebildet. Fur
¨ niedrige Ofloxacin-Konzentrationen im Bereich 0.01 bis 0.1
µM, weisen die Elektropherogramme das charakteristische Lebend-Muster auf, d. h.
ein großes Signal bei einer Migrationszeit von ca. 10 Minuten dominiert die Elektropherogramme bei 520 nm (Abbildung 4.55(A)) w¨ahrend die Peakmuster bei 655 nm eine verminderte Fluoreszenzintensit¨at aufweisen (Abbildung 4.55(B)). Mit ansteigender
Ofloxacin-Konzentration nimmt die Fluoreszenzintensit¨at der Signale der Ketten bei
655 nm mehr und mehr zu (Abbildung 4.55(B)), gleichzeitig nimmt die Fluoreszenzemission des Einzel-Zell-Signals bei 520 nm immer mehr ab (Abbildung 4.55(A)) und
das charakteristische Tot-Muster erscheint bei einer 10 µM Losung.
¨
Bei einer OfloxacinKonzentration von 100 µM verschwindet dieses Muster jedoch und nimmt eine vitale
Populationscharakteristik an. Die Vermutung liegt nahe, dass dieser Effekt losungs¨
mittelbedingt ist. Wahrscheinlich kumuliert bei dieser Konzentration der zytotoxische
Effekt des Antibiotikums mit dem der 1 %igen 0.1 M NaOH-Losung
¨
(durch den Einsatz
10 mM Antibiotika-Stammlosungen
¨
befindet sich bei der Testung nur 1 % des Losungs¨
mittels in der Bakterienkultur, siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) und verursacht das Lysieren der Bakterienzellen, wodurch ein falsches grun/rot-Verh¨
¨
altnis
¨
beobachtet wird. Ahnliche Resultate ergaben sich auch bei Einsatz von DMSO als
Losungsmittel.
¨
Die Hypothese der zytotoxischen Kumulation konnte durch die erneu-
138
4. Ergebnisse und Diskussion
te Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit des Ciprofloxacins unter der Verwendung von 0.1 M NaOH und DMSO als Losungsmittel
¨
best¨atigt werden.
Abbildung 4.55: Elektropherogramme von P. fluorescens (Fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid) bei unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen. Ofloxacin ist in der Stammlosung
¨
in 0.1 M
NaOH gelost.
¨ Durch Verdunnung
¨
mit Medium befinden sich in den Zellinokula ledig1ich 1 % 0.1 M
NaOH. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-System bei einer Emissionswellenl¨ange von
(A) 520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. Fur
¨ CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung 4.46.
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung
139
4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick
Die Fluoreszenzmarkierung Arzneistoff-exponierter Bakterienkulturen mit den beiden
Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid ermoglicht
¨
eine schnelle, differenzierte Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit. Die beiden fluorimetrischen Methoden mittels FMR und LIF-CE konnen
¨
im Gegensatz zum konventionell, im HTS angewandten Mikrodilutionsverfahren nach DIN 58940-8 schnell zwischen zytotoxischer
und zytostatischer Wirkung unterscheiden. Dennoch sind die fluorimetrischen Methoden eher zur Erg¨anzung als zur Substitution des Mikrodilutionsverfahrens geeignet.
Zwar erfullt
¨ die LIF-CE-Methode die Voraussetzung der Miniaturisierung, doch erweisen sich Parallelisierung und Automatisierung, die Schlusselworte
¨
fur
¨ Verfahren
mit hohem Durchsatz aufgrund einiger Waschschritte als schwierig. Das Potenzial der
LIF-CE-Methode besteht darin, dass aus dem elektrophoretischen Profil einer Bakterienprobe aufgrund verschiedener Aggregate unterschiedlicher Große
¨ Ruckschl
¨
usse
¨
auf
die Bakterienkonstitution unter Exposition eines Antibiotikums gezogen werden kann.
Dies verhindert jedoch die simultane Analyse verschiedener Bakterien-Spezies. Dennoch eignet sich vor allem die LIF-CE-Methode aufgrund ihrer hohen Aussagekraft
auch bezuglich
¨
der Erkennung von Losungsmittelinkompatibilit¨
¨
aten als erg¨anzende
Methode zum Mikrodilutionsverfahren im HTS und erlaubt eine differenzierte Aktivit¨atsbestimmung innerhalb von 30 Minuten.
4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays”
• Die beiden neuen fluorimetrischen Zytotoxizit¨ats-Assays mittels FMR und LIFCE stellen eine gute Erg¨anzung zum konventionellen Mikrodilutionsverfahren
dar und verhindern das zeitaufw¨andige Z¨ahlen koloniebildender Einheiten.
• Die Korrelation der grun/rot-Fluoreszenzverh¨
¨
altnisse mit dem prozentualen Anteil lebender Zellen erlaubt eine schnelle Erstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven
und die Berechnung von ED50 -Werten.
• Die neue LIF-CE-Methode gelang unter Verwendung einer “stacking front”
durch Nachinjektion unmarkierter Zellen und l¨asst aus dem elektrophoretischen
Profil einer Bakterienkultur Ruckschl
¨
usse
¨
auf die Zytotoxizit¨at einer Testsubstanz zu, wodurch ein neuer Ansatzpunkt fur
¨ Testverfahren offensteht.
• Inkompatibilit¨aten zwischen Bakterien, Losungsmittel
¨
und Arzneistoff limitieren den Anwendungsbereich der beiden Methoden, konnen
¨
aber mittels LIF-CE
erkannt werden.
140
4. Ergebnisse und Diskussion
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
¨
Uberblick:
Im Folgenden wird auf der Basis der magnetischen Kernresonanztomographie (magnetic resonance tomography, MRT) ein HighThroughput-Screening-Verfahren fur
¨ potenzielle Wirkstoffe gegen
Bakterien entwickelt. Die transversale Relaxation T2 dient dabei als
charakteristischer Parameter fur
¨ die Beschreibung des Zellwachs¨
tums, das durch wirksame Substanzen inhibiert wird. Anderungen
dieses Parameters werden sowohl durch den Energie- und Aminos¨aurestoffwechsel der Erreger, als auch durch den Effekt von Wirk¨
stoffen hervorgerufen und basieren auf Anderungen
im chemischen
Austausch. Durch Kombination von MR-Spektroskopie (magnetic resonance spectroscopy, MRS) und -Bildgebung (magnetic resonance
imaging, MRI) werden die T2 -Variationen quantifiziert und interpretiert, wodurch eine Quantifizierung der antibiotischen Wirksamkeit
moglich
¨
wird.
4.4.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels NMR
W¨ahrend der Proliferation von Mikroorganismen a¨ ndern sich sowohl die stoffliche
Zusammensetzung als auch die chemischen und physikalischen Parameter der Zellkultur. Mit der NMR-Spektroskopie steht ein gut etabliertes Verfahren zur Analyse der Mediumzusammensetzung zur Verfugung.
¨
Durch N¨ahrstoffverzehr und Stoffwechselproduktion a¨ ndert sich dieses mit fortschreitendem Wachstum. Anhand hoch
aufgeloster
¨
NMR-Spektren konnen
¨
metabolische Profile, sogenannter Fingerabdrucke
¨
(”fingerprints”) erstellt werden, wodurch eine chemotaxonomische Identifizierung
¨
und Charakterisierung von Bakterien moglich
¨
wird [120, 121]. Die Anderungen
der
chemischen und physikalischen Parameter wie Viskosit¨at, pH-Wert und Ionenst¨arke
haben einen großen Einfluss auf den chemischen Austausch und spiegeln sich vor al¨
lem in Anderungen
der NMR-Parameter wie Diffusion, Magnetisierungstransfer und
Relaxationszeiten wider. Der Zusammenhang zwischen pH-Wert und Zellproliferation bildet unter Verwendung von pH-Indikatoren auch die Basis kolorimetrischer Zytotoxizit¨ats-Assays (Abschnitt 1.2.2), womit NMR-Parameter interessante Alternativen
darstellen.
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
141
4.4.2 Chemischer Austausch
Betrachtet man im Kulturmedium, welches in der Regel aus einer Protein-WasserMischung besteht, das Wassersignal, so kann es sich dabei um Protonen aus gebundenem Wasser, freiem Wasser oder um protonierte basische oder saure funktionelle Gruppen des Proteins wie -NH, -NH2 , -OH, -SH und COOH handeln [108]. In
jedem Zustand unterscheiden sie sich bezuglich
¨
ihrer translatorischen Mobilit¨aten,
ihrer Larmorfrequenzen und ihrer unterschiedlichen lokalen Relaxationsraten. Die
theoretische Betrachtung der Fluktuation zwischen unterschiedlichen Zust¨anden wird
ublicherweise
¨
als chemischer Austausch bezeichnet und basiert auf den erweiterten
Bloch-Gleichungen von McConnell [172] (Abschnitt 3.5.2.2). Spektroskopisch kann der
schnelle chemische Austausch als Linienverbreiterung des austauschenden Protons beobachtet werden [18]. Eine Temperatur- und pH-Abh¨angigkeit der Linienbreite aufgrund des chemischen Austausches wurde z. B. fur
¨ das Aminoproton
+ NH
der Nucleins¨aure Cytosin beschrieben [171]. Bei einem komplexen N3
Spin-System, wie es bei Bakterienkulturen vorliegt, wird eine quantiN
tative Auswertung spektroskopisch jedoch sehr schwierig. Die Bildge¨
bung ermoglicht
¨
dagegen Anderungen
des chemischen Austausches
N
O w¨ahrend der Zellproliferation global mitzuverfolgen. Der DiffusionsH
Abbildung 4.56: koeffizient, welcher mit einer pulsed-field-gradient-spin-echo-Sequenz
(PGSE) gemessen werden kann, ist zwar ein moglicher
¨
Parameter, erCytosin
fordert jedoch fur
¨ die Charakterisierung von Bakterienkulturen extrem
starke Gradienten [209], die bei den meisten Gradientensystemen nicht verfugbar
¨
sind.
In der Diplomarbeit von M. Oechsner [192] konnte am Teststamm E. coli gezeigt werden, dass sich in der Bildgebung der Parameter T2 zur Beschreibung des Zellwachstums von Bakterienkulturen am besten eignet. Er kann mittels Carr-Purcell-MeiboomGill(CPMG)-Sequenz [174] gemessen werden und zeigt im Vergleich zur longitudinalen Relaxation und dem Magnetisierungstransferkontrast die wachstumsbedingten
¨
Anderungen
am ausgepr¨agtesten. Die transversale Relaxation unter dem chemischen
Austausch beinhaltet zum einen die Fluktuation der Protonen selbst und zum anderen den innewohnenden Relaxationsprozess und ist in der Literatur solide beschrieben
(Abschnitt 3.5.2.2).
4.4.3 Anwendungsbreite des Parameters T2
In der Diplomarbeit von M. Oechsner [192] konnte zwar die Eignung der transversalen
Relaxation zur Beschreibung der Zellproliferation am Beispiel E. coli gezeigt werden,
doch gab es keinen Hinweis darauf, inwieweit die Methode auf andere Bakterienarten anwendbar war. Aufschluss daruber
¨
sollten die charakteristischen T2 -Kurven der
vier bereits kapillarelektrophoretisch analysierten und standardisierten Bakterienspe-
142
4. Ergebnisse und Diskussion
zies S. vestibularis, P. fluorescens, M. luteus und N. cinerea geben. Die Messung erfolgte
in vier 5 mm-NMR-Rohrchen,
¨
die zwei Milliliter der jeweiligen Zellsuspension enthielten. Die Zellen waren in Brain-Heart-Infusion(BHI)-Bouillon suspendiert und ihre
Konzentration wurde bei allen Bakterienspezies auf einen OD600 -Wert von 0.015 eingestellt. Zur Erstellung der T2 -Kurven wurde die transversale Relaxation der vier Bakterienproben zusammen mit einer Negativkontrolle, die aus reinem Medium bestand,
bei 30 ◦ C uber
¨
einen Zeitraum von 48 h mittels CPMG-pr¨aparierter MRT bei 17.6 T
simultan gemessen. Dazu wurde im Abstand von 10 Minuten eine Bildserie aufgenommen und fur
¨ jede Probe aus dem exponentiellen Intensit¨atsabfall jedes Pixels der
entsprechende T2 -Wert, gemittelt uber
¨
ein ROI (region of interest), berechnet. Die genauen Mess- und Ger¨ateparameter, die Probenpr¨aparation, die Auswertung der Bilder
und die verwendeten und teilweise programmierten MATLAB-Routinen sind in Abschnitt 5.1.5.1, Abschnitt 5.1.7.2.6 und Anhang A und B n¨aher beschrieben. Wie aus
den erweiterten Bloch-Gleichungen zu sehen ist , enthalten die gemessenen T2 -Werte
in gewissem Maße eine Diffusionswichtung. Da jedoch die experimentellen Parameter w¨ahrend der Messserien unver¨andert blieben, wurde der Einfluss der Diffusion als
konstant angenommen und T2 als gemessenes T2 definiert. Vergleicht man die gemessenen T2 -Kurven in Abbildung 4.57, so weist die T2 -Kurve von S. vestibularis w¨ahrend
¨
des Zellwachstums mit 40 ms eine besonders starke T2 -Anderung
auf. Abgesehen von
einem kleinen T2 -Anstieg von 85 ms auf 92 ms in der ersten Messstunde, f¨allt die Kurve innerhalb der ersten funf
¨ Stunden auf einen Wert von 75 ms ab, um anschließend bis
auf einen Wert von ca. 115 ms steil anzusteigen und dort in einem Plateau zu enden.
Der anf¨angliche T2 -Anstieg wird auch von der Negativkontrolle durchlaufen und wird
durch eine verzogerte
¨
Temperierung des Messsystems (Messtemperatur ist 30 ◦ C) hervorgerufen. Der ansonsten konstante T2 -Wert der Negativkontrolle ist ein Indiz dafur,
¨
dass a¨ ußere Storfaktoren
¨
w¨ahrend der Messung wie z. B. Temperaturschwankungen
¨
ausgeschlossen werden konnen.
¨
Die starke T2 -Anderung
spricht somit fur
¨ ein schnelles und intensives Zellwachstum der Streptococcus-Spezies. Bei P. fluorescens und N.
cinerea dagegen sind die T2 -Kurven zum einen zeitlich verzogert
¨
und zum anderen be¨
tr¨agt die gesamte T2 -Anderung weniger als 5 ms, woraus auf ein verzogertes
¨
und gehemmtes Wachstum geschlossen werden kann. Die M. luteus-Kurve verl¨auft w¨ahrend
¨
der gesamten Messzeit parallel zur Kontroll-Kurve und zeigt keinerlei Anderungen.
Visuelle Untersuchungen der Proben nach der Messung best¨atigten diese Ergebnisse:
W¨ahrend die S. vestibularis-Probe einen starken weißen Zellniederschlag zeigte, konnte bei den beiden Bakterienspezies P. fluorescens und N. cinerea lediglich eine leichte Trubung
¨
des Mediums festgestellt werden. Bei der M. luteus-Probe blieb dagegen
das Kulturmedium klar, ohne sichtbare Kolloidpartikel. Offensichtlich fand hier in der
Messapparatur innerhalb der 48 h keine Zellproliferation statt. Maßgeblich fur
¨ die unterschiedlichen T2 -Kurven der vier verschiedenen Bakterienspezies waren in diesem
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
143
Experiment vor allem ihre spezifischen Wachstumsvoraussetzungen. W¨ahrend P. fluorescens, M. luteus und N. cinerea der Gruppe der strengen Aerobier angehort,
¨ ist ein
fakultativ anaerobes Wachstum bei S. vestibularis moglich.
¨
Ihre Kultivierung zeigte sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen ein schnelles intensives
Wachstum. Eine Abh¨angigkeit der Zellproliferation von der Gef¨aßgeometrie ist daher
nicht gegeben. Die Ursache fur
¨ die verzogerte
¨
bzw. gehemmte Zellproliferation des
Pseudomonas-, Neisserien- und Micrococcus-Stammes liegt dagegen vermutlich im
zu geringen Sauerstoffgehalt w¨ahrend der Kultivierung in den schmalen 5 mm-NMRRohrchen
¨
begrundet,
¨
so dass die Methode unter den gegebenen Versuchsbedingungen
nur auf Anaerobier anwendbar ist.
93
110
92
105
91
100
90
T2 [ms]
94
115
T2 [ms]
120
95
89
90
88
85
87
80
86
P.fluorescens
S. vestibularis
75
70
85
Medium
0
500
1000
1500
2000
2500
84
3000
Medium
0
500
1000
t [min]
1500
2000
2500
3000
t [min]
(a) Streptococcus vestibularis
(b) Pseudomonas fluorescens
96
94
93
94
92
91
92
T2 [ms]
T2 [ms]
90
90
89
88
88
87
86
86
M.luteus
N.cinerea
85
Medium
Medium
84
0
500
1000
1500
2000
t [min]
(c) Micrococcus luteus
2500
3000
84
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
t [min]
(d) Neisseria cinerea
Abbildung 4.57: T2 -Kurven verschiedener Bakterienspezies w¨ahrend ihrer Zellproliferation in BHIMedium bei 30 ◦ C, gemessen bei 17.6 T
Ein Vergleich der unter identischen Versuchsbedingungen (30 ◦ C, BHI-Medium, 17.6 T)
aufgenommenen T2 -Wachstumskurven von S. vestibularis und E. coli zeigt bei Anaero-
144
4. Ergebnisse und Diskussion
biern eine Bakterienspezifizit¨at. Damit besteht die Moglichkeit
¨
T2 -Kurven zur Erstellung mikrobieller Fußabdrucke
¨
(”footprints”) zu nutzen.
100
95
T2 [ms]
90
85
80
Abbildung 4.58: T2 -Wachstumskurve von E. coli in
BHI-Medium bei 30 ◦ C und
17.6 T
75
E.coli
Medium
70
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
t [min]
4.4.4 Analyse der Zellproliferation von S. vestibularis
Von den analysierten Bakterienspezies eignete sich S. vestibularis am besten zur Untersuchung der Korrelation zwischen transversaler Relaxation und Zellwachstum und
damit zur Untersuchung des physikalischen Hintergrundes. Zur Quantifizierung und
¨
Interpretation der Anderung
des Parameters T2 mit zunehmender Zellzahl wurden
NMR-Bildgebung und -Spektroskopie miteinander kombiniert und von einem Satz
von Bakterienproben neben der transversalen Relaxation
• der pH-Wert (sensitiver Parameter zur Beschreibung der Stoffwechselaktivit¨at),
• die optische Dichte bei 600 nm, OD600 (Charakteristikum fur
¨ die Zellzahl), und
• 1 H-NMR-Spektren
zu unterschiedlichen Inkubationszeiten uber
¨
einen Zeitraum von 12 h gemessen. Da¨
durch war es moglich,
¨
stoffwechselbedingte Anderungen
der Metaboliten-, Aminos¨aure- und Proteinkonzentration im extrazellul¨aren Kulturmedium zeitlich mitzuverfolgen. Die Bildgebungsexperimente wurden bei 17.6 T durchgefuhrt,
¨
die Protonenspektren bei 9.4 T aufgezeichnet.
4.4.4.1 Korrelation zwischen T2 , Zellzahl und pH
Der Probensatz bestand aus sechs 5 mm-NMR-Rohrchen,
¨
die mit 2 ml Zellsuspension
des Streptococcus-Stammes mit einer Anfangskonzentration von 0.015 OD600 gefullt
¨
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
Abbildung 4.59: Zeitlicher Verlauf der gemessenen T2 -Werte
von sechs identischen Inokula
der Bakterienspezies S. vestibularis und einer Negativkontrolle. Gemessen wurde in BHIMedium im Abstand von 10 Minuten bei 30 ◦ C und 17.6 T. Die
Bakterienproben wurden nacheinander zu unterschiedlichen
Inkubationszeiten zur weiteren
Messung der optischen Dichte
und des pH-Wertes aus dem
Magneten herausgenommen. Zu
diesen Zeitpunkten fallen die T2 Kurven auf Null ab.
180
medium
tube 1
tube 2
tube 3
tube 4
tube 5
tube 6
160
120
2
T [ms]
140
100
80
60
100
200
300
400
500
600
700
1
pH
OD600
t [min]
OD600
pH
0.9
145
7.5
0.8
0.7
7
0.6
6.5
0.5
0.4
6
0.3
0.2
5.5
0.1
0
100
200
300
400
500
600
700
t [min]
5
Abbildung 4.60: OD600 - und
pH-Werte der StreptococcusSuspensionen, unmittelbar nach
der Probenentnahme aus dem
Magneten.
waren. Ein siebtes, welches ausschließlich Medium enthielt, diente als Negativkon¨
trolle, und sollte w¨ahrend der gesamten Messzeit keine T2 -Anderungen
aufweisen.
Der zeitliche T2 -Verlauf der jeweiligen Proben ist in Abbildung 4.59 dargestellt.
Zu unterschiedlichen Wachstumsstadien der Bakterienkultur wurde die Akquisition
gestoppt und zu jedem dieser Zeitpunkte der OD600 - und pH-Wert einer Bakterienprobe gemessen. Diese Zeitpunkte sind durch auf Null abfallende Linien in Abbildung 4.59 markiert. Die Durchfuhrung
¨
der OD600 - und pH-Messungen erforderte die
Herausnahme der Proben aus dem Magneten, wodurch es zu unvermeidbaren Temperaturschwankungen kam. Diese verursachten die im T2 -Verlauf der Bakterienproben beobachtbaren lokalen Minima zu den Zeitpunkten des Akquisitionsstopps. Die
identischen Minima traten auch in der Negativkontrolle auf, weshalb ein Sedimentationsprozess der Bakterienkulturen als Ursache ausgeschlossen werden kann. Die
OD-pH-Bestimmung erfolgte zus¨atzlich zu Beginn und am Ende der tomographischen
146
4. Ergebnisse und Diskussion
Messung. Insgesamt wurde der OD und pH-Wert 1.8 h, 3.1 h, 4.3 h, 5.5 h, 6.7 h, 8.1 h
und 11.6 h nach Herstellung der Inokula gemessen und in einem Diagramm in Abbildung 4.60 aufgetragen. Mit zunehmender Zellzahl, d. h. mit steigendem OD-Wert
f¨allt der pH stetig und stagniert in der station¨aren Phase des Bakterienwachstums. Die
T2 -Kurve steigt, wie bereits in Abschnitt 4.4.3 beschrieben, nach initialem Abfall steil
an und endet ebenfalls in einem Plateau in der station¨aren Phase. Die Stagnation der
OD-, pH und T2 -Werte beginnt nahezu zum gleichen Zeitpunkt und indiziert die Einstellung der Bakterienproliferation.
4.4.4.2 Komponenten im BHI-Medium
Der erste Schritt zur Aufkl¨arung der physikalischen Zusammenh¨ange bestand in der
Identifizierung maßgeblicher Komponenten im BHI-Vollmedium. Dieses Vollmedium
besitzt eine komplexe Zusammensetzung und besteht unter anderem aus Kalbs-Hirnund Rinder-Herz-Extrakt und Pepton (Abschnitt 5.1.7.2.2). Die Komponenten-Analyse
erfolgte anhand eines 1D-1 H-Spektrums und 2D-COSY-Diagramms, welche bei 9.4 T
gemessen wurden (Abbildung 4.61). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.7 zusammengefasst und ergeben sich in Anlehnung an die Arbeiten von Govindaraju [109], Lindon [160] und Evans [89]. Im COSY- und 1D-Spektrum sind die identifizierten Substanzen nummeriert aufgefuhrt.
¨
Neben zahlreichen Aminos¨auren und Kohlenhydraten konnten die funf
¨ Hauptmetabolite des anaeroben Stoffwechsels Acetat, Ethanol,
Formiat, Laktat und Succinat zugeordnet werden.
Struktur
Funktionelle
Gruppe
1
6
CH2OH O
4
4
HO
HO
2
5
1
OH
3
2
OH
α-Glukose
6
4
4
CH2OH O
HO
HO
5
3
2
2
OH
β-Glukose
CH
CH
3
CH
4
CH
5
CH
6
CH
1
CH
2
CH
3
CH
4
CH
5
CH
6
CH
2
OH
1
chem. Versch.
(ppm) in
H2 O + 10 % D2 O
5.2
3.5
3.7
3.4
3.8
nicht aufgelost
¨
4.6
3.2
nicht aufgelost
¨
nicht aufgelost
¨
3.4
3.8
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
1
2
- OOC
CH3
2
CH3
147
1.8
Acetat
3
1
2
- OOC
CH CH3
NH3+
2
3
CH
CH3
3.7
1.4
Alanin
+
NH2
C
N
CH2 H
4
3
CH2
2
CH
- OOC NH+
3
2
NH2
5
CH2
1
CH
CH2
4
CH2
5
CH2
4.1
1.8
1.6
3.1
2
CH
CH2
3.8
2.6
CH2
CH3
3.6
1.1
3
Arginin
1
2
4
3
- OOC
CH CH2 COO NH3+
3
Aspartat
1
2
1
HO CH2 CH3
2
Ethanol
1
- OOC
H
1
CH
8.4
CH
CH2
4
CH2
3.8
2.1
nicht aufgelost
¨
Formiat
4
1
2
3
- OOC
CH CH2 CH2
NH3+
Glutamat
1
2
3
- OOC
CH CH3
NH3+
Laktat
5
COO -
2
3
2
3
CH
CH3
4.0
1.3
148
4. Ergebnisse und Diskussion
NH3+
6
CH2
5
4
CH2
2
1
-
OOC
4.1
1.8
nicht aufgelost
¨
1.6
2.9
a
3.9
3.2
7.2, nicht aufgelost
¨
7.3, nicht aufgelost
¨
CH
3
CH2
4
CH2
5
CH2
6
CH2
CH2
CH2
3
2
CH
NH3+
Lysin
a
2
3
6
5
CH
b
CH2
2
4
CH, CH, 6 CH
3
CH, 5 CH
b
- OOC CH
1
CH2
NH3+
4
Phenylalanin
1
2
- OOC CH
2
3
4
COO -
CH2
2
CH2 , 3 CH2
2.3
Succinat
1
2
- OOC
CH
2
4
3
CH CH3
NH3+ OH
Threonin
3
2
a
b
- OOC CH CH
2
NH3+
CH
CH
4
CH3
3.5
4.2
1.2
a
3.9
3.1
7.2
6.8
3
4
1
OH
5
6
Tyrosin
CH
CH2
2
CH, 6 CH
3
CH, 5 CH
b
a
CH
CH2
4
CH
5
CH
6
CH
7
CH
2
CH,3 CH
b
a
b
- OOC CH
CH2
NH3+
4
3
2
5
6
1
N
H
7
Tryptophan
4
1
2
- OOC CH
3
CH
NH3+
CH3
CH3
4'
3.9
3.4, 3.2
7.7
7.1
7.2
7.5
nicht aufgelost
¨
2
CH
CH
′
4
CH, 4 CH
3
Valin
Tabelle 4.7: Identifizierte Komponenten im BHI-Medium.
3.5
2.2
1.0
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
149
Abbildung 4.61: COSY-Diagramm des BHI-Kulturmediums, gemessen bei 9.4 T und 300 K. An der xund y-Achse sind die 1D-1 H-Spektren der gleichen Probe abgebildet. α-Glukose: 1 (1 CH-2 CH), 2 (4 CH5
CH), 3 (3 CH-4 CH); β-Glukose: 4 (1 CH-2 CH), 5 (5 CH-6 CH); Acetat: 25 (2 CH3 ); Alanin: 6 (2 CH-3 CH3 );
Arginin: 7 (2 CH-3 CH2 ), 8 (4 CH2 -5 CH2 ); Aspartat: 9 (2 CH-3 CH2 ); Ethanol: 10 (1 CH2 -2 CH3 ); Formiat:
23 (1 CH); Glutamat: 11 (2 CH-3 CH2 ); Laktat: 12 (2 CH-3 CH3 ); Lysin: 13 (2 CH-3 CH2 ) , 14 (5 CH2 -6 CH2 );
Phenylalanin: 15 (α CH-β CH2 ); Succinat: 24 (2 CH2 und 3 CH2 ); Threonin: 16 (3 CH-4 CH3 ), 17 (2 CH-3 CH);
Tryptophan: 18 (α CH-β CH2 ), 19 (α CH-β CH2 ); Tyrosin: 20 (α CH-β CH2 ); Valin: 21 (3 CH-4 CH) und (3 CH4′
CH), 22 (2 CH-3 CH).
150
4. Ergebnisse und Diskussion
4.4.4.3 Metabolite
Im zweiten Schritt wurden die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Wachstumskurve (1.8 h, 3.1 h, 4.3 h, 5.5 h, 6.7 h, 8.1 h und 11.6 h nach Herstellung der Inokula) aufgenommenen 1D-Protonenspektren miteinander verglichen und semiquantitativ ausgewertet, d. h. die Protonensignale wurden auf die gleiche y-Achse skaliert, jedoch
nicht auf einen internen Standard bezogen. Eine Analyse zeigte vor allem Konzentrations¨anderungen der funf
¨ Hauptmetabolite fur
¨ Anaerobier. Ihre Protonensignale sind
in Abh¨angigkeit des Kulturstadiums zusammen mit den gemessenen pH-Werten in
Abbildung 4.62 dargestellt. Lediglich Ethanol lag in zu geringer Konzentration und
teilweise durch andere Resonanzen uberlagert
¨
vor, so dass eine ubersichtliche
¨
Abbildung nicht moglich
¨
war.
Abbildung 4.62: Wasserstoff-Resonanzlinien der vier Hauptmetaboliten zu unterschiedlichen Zeiten der
Wachstumskurve von S. vestibularis und der sich dazu entwickelnde pH-Wert im extrazellul¨aren Medium.
Die Resonanzlinien von Formiat, Acetat und Laktat zeigen ab einer Inkubationszeit
von ca. 5 h einen starken Intensit¨atsanstieg. Die Succinat-Konzentration hingegen
steigt in den ersten Stunden des Zellwachstums kontinuierlich an, um dann nach einer Inkubationszeit von 5 h wieder abzufallen. Die Ursache liegt moglicherweise
¨
im
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
151
Umbau der Bernsteins¨aure zur Propions¨aure begrundet.
¨
Die zunehmende Produktion an Metaboliten w¨ahrend der Zellproliferation bewirkt aufgrund ihrer sauren Carboxylfunktionen (Ameisens¨aure: pks =3.7, Essigs¨aure: pks =4.7, Bernsteins¨aure: pks =4.7
und 5.6, Milchs¨aure: pks =3.9) eine Konzentrationserhohung
¨
an H+ -Ionen im Medi¨
um. Wird ihre Konzentration zu hoch, kommt es zum Uberschreiten
der Pufferkapazit¨at des Phosphatpuffers in der BHI-Bouillon und folglich zu dem beobachteten
pH-Abfall w¨ahrend des Bakterienwachstums. Die zunehmende Protonenkonzentration wirkt sich auch auf die chemische Verschiebung der Resonanzsignale aus. Ihre Ur¨
sache liegt in der Anderung
der Protonierungs- zu Deprotonierungsverh¨altnisse und
¨
in der damit verbundenen Anderung
der Abschirmung der betrachteten Wasserstoffkerne. Besonders deutlich wird dieser Effekt fur
¨ die CH3 -Resonanz des Acetats (hier
a¨ ndert sich die chemische Verschiebung von 1.84 ppm auf 1.92 ppm).
¨
4.4.4.4 Quantitative Beitr¨age zur T2 -Anderung
w¨ahrend der Zellproliferation
Die T2 -Kurven von S. vestibularis in Abbildung 4.59 repr¨asentieren das Mittel aller
¨
Anderungen
in der Zellkultur, die w¨ahrend der Zellproliferation stattfinden. Anhand
von Referenz-Modellen werden nachfolgend die einzelnen Beitr¨age aus N¨ahrstoffverzehr, Zellzunahme, Metabolitenkonzentration und pH-Abfall quantitativ analysiert
und diskutiert.
4.4.4.4.1 N¨ahrstoffverbrauch im Medium
Im Medium dienen haupts¨achlich Aminos¨auren und Kohlenhydrate als C-und NQuellen fur
¨ den Bakterienstoffwechsel (Abschnitt 3.2.1.2). Wie in Abschnitt 4.4.4.2 gezeigt, konnten neben der α- und β-Glukose die meisten Aminos¨auren im ppm-Bereich
zwischen 4 und 2.5 ppm, der charakteristisch fur
¨ das Cα H-Atom ist, gefunden werden.
Eine Quantifizierung dieses ppm-Bereiches stellt somit eine gute N¨aherung bezuglich
¨
des Gehaltes aller austauschbaren funktionellen Gruppen (-NH, -NH2 , -OH, -SH und
-COOH) in den verschiedenen Aminos¨aureresten dar. Ferner sind in diesem Bereich
die Kohlenhydrate enthalten, welche zusammen mit den Proteinen den wesentlichen
Anteil des gebundenen Wassers bestimmen und somit Einfluss auf die transversale
Relaxation nehmen konnen.
¨
Zur Quantifizierung des maßgeblichen ppm-Bereiches wurden 1 H-Spektren der Streptococcus-Suspension zum Zeitpunkt t=0 h nach Herstellung des Inokulums und nach
einer Inkubationszeit von 12 h aufgenommen (Abbildung 4.63). Die Inkubation fand
wie bei allen NMR-Experimenten bei 30 ◦ C in 5 mm-NMR-Rohrchen
¨
statt. Beiden Proben wurde Maleins¨aure als interner Standard in einer Konzentration von 1 mg/ml
zugesetzt und die Fl¨ache unter der Kurve des Maleins¨auresignals auf eins normiert.
Die quantitative Auswertung der NMR-Spektren ergab im ppm-Bereich zwischen 4.0
152
4. Ergebnisse und Diskussion
bis 2.5 aufgrund des N¨ahrstoffverzehrs w¨ahrend der Zellproliferation eine Gehaltsabnahme von 18 % (Abbildung 4.64a).
Abbildung 4.63: 1 H-Spektren einer Zellsuspension von S. vestibularis zu den Zeitpunkten (a) t=0 h
und (b) t=12 h der Wachstumskurve. (M = Maleins¨aure, interner Standard in einer Konzentration von
1 mg/ml; L = Laktat; S = Succinat; A = Acetat; F = Formiat; E = Ethanol). Zur Quantifizierung der
Spektren wurde das Maleins¨auresignal auf eins normiert.
Um ihre Auswirkung auf die transversale Relaxation absch¨atzen zu konnen,
¨
wurde
◦
in Abbildung 4.64b das BHI-Medium bei 17.6 T und 30 C kalibriert, indem T2 mit
verschiedenen BHI-Konzentrationen korreliert wurde. Die hochste
¨
eingesetzte Konzentration entsprach mit 0.185 g/5 ml, der zur Kultivierung eingesetzten Mediumkonzentration. In Abbildung 4.64b zeigen sich die beiden Parameter abgesehen vom
hochsten
¨
und niedrigsten Wert linear zueinander. Mit abnehmender Mediumkonzentration steigt T2 an. Aufgrund des komplexen multifunktionalen Systems wurde eine
mathematische Beschreibung des Zusammenhanges nicht versucht und die Daten fur
¨
die Bestimmung der Auswirkung des N¨ahrstoffverzehrs direkt aus dem Diagramm in
Abbildung 4.64b abgelesen. Unter der Annahme, dass die Abnahme der Aminos¨aureund Kohlenhydrat-Konzentration durch den N¨ahrstoffverzehr w¨ahrend der Zellproli-
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
153
feration einer Verdunnung
¨
des Mediums um 18 % entspricht, verursacht die Konzentrationsabnahme somit einen T2 -Anstieg von 15 ms.
135
130
125
120
T2 [ms]
115
110
105
100
95
90
85
0.11
0.12
0.13
0.14
0.15
0.16
0.17
0.18
0.19
Concentration [g/5ml]
(a)
(b)
Abbildung 4.64: Auswirkung des N¨ahrstoffverbrauches auf T2 w¨ahrend der Zellproliferation. (a) Ausschnitt der Spektren aus Abbildung 4.63 zur anschaulichen Darstellung des N¨ahrstoffverbrauches im
ppm-Bereich 4 bis 2.5. (b) T2 -Relaxation in Abh¨angigkeit der BHI-Konzentration, gemessen bei 17.6 T
und 30 ◦ C.
4.4.4.4.2 pH-Einfluss durch Bakterienmetabolismus
Der pH-Wert einer Losung
¨
hat vor allem bei Molekulen
¨
mit ionisierbarer und austauschbarer funktioneller Gruppe, und damit auch bei zahlreichen Aminos¨auren, eine große Wirkung auf die transversale Relaxation. Ver¨andert sich der pH, so a¨ ndert
sich das Verh¨altnis zwischen protoniertem und deprotoniertem Zustand und damit
die chemische Austauschrate. Theoretisch beschreibt die Luz-Meiboom-Gleichung fur
¨
ein Zwei-Spin-System mit schnellem chemischen Austausch die Relaxationsrate in
Abh¨angigkeit der 180◦ -Puls-Rate in der CPMG-Sequenz [163] (Abschnitt 3.5.2.2):
X
2
kb τ
1
1−
tanh
Pi δωi2
(4.3)
R2 (τ ) = R2 (0) +
kb
kb τ
2
mit τ , der zeitlichen Verzogerung
¨
zwischen dem 90◦ und dem 180◦ Puls, R2 (0) der
transversalen Relaxationsrate in Abwesenheit von Austausch, kb der chemischen Austauschrate, Pi der Protonenfraktion in der chemischen Umgebung i und δωi , der Differenz der chemischen Verschiebung zwischen den austauschenden Spin-Spezies in
Einheit der Frequenz. Pi kann hier direkt aus der Henderson-Hasselbalch-Gleichung
¨
berechnet und damit der pH miteinbezogen werden. In Ubereinstimmung
mit theoretischen Berechnungen konnte die starke pH-Abh¨angigkeit der Austauschrate kb fur
¨
Abbildung 4.65: pH-Abh¨angigkeit der T2 Relaxation des BHI
Mediums bei einer Konzentration von 0.185 g/5ml, gemessen bei 30 ◦ C und 17.6 T.
Die T2 -Kurve beschreibt die chemische Austauschrate eines NSpin-Systems. Die gemessenen
Daten wurden zu Anschauungszwecken an ein Polynom vierter
Ordnung angepasst. Die Kurve
repr¨asentiert kein physikalisches
Modell.
4. Ergebnisse und Diskussion
T2 [ms]
154
110
100
90
80
70
5
5.5
6
6.5
7
7.5
pH
die Aminos¨auren L-Glycin, L-Arginin und L-Tryptophan experimentell gezeigt werden [146]. Die Luz-Meiboom-Gleichung gilt fur
¨ einen weiten Bereich und ist auch
¨
fur
¨ die Beschreibung der T2 -Anderungen
w¨ahrend der Bakterienproliferation geeignet. Das BHI-Medium besteht jedoch, wie in Abschnitt 4.4.4.2 identifiziert, aus einem
Gemisch vieler freier und zu Peptiden verknupfter
¨
Aminos¨auren und seine Komple¨
xit¨at verhindert eine Vorhersage der pH-abh¨angigen Anderung
der chemischen Austauschrate nach der Luz-Meiboom-Gleichung.
In einem Referenz-Modell (Abbildung 4.65) wurde die transversale Relaxation der
Protein-Wasser-Mischung (0.185 g BHI/5 ml) bei 30 ◦ C und 17.6 T fur
¨ unterschiedliche
pH-Werte gemessen. Die pH-Werte wurden mit 1 molarer NaOH und HCl eingestellt,
so dass durch die Einstellung an sich kein Verdunnungseffekt
¨
auftrat. Der T2 -Verlauf
zeigt ein breites Minimum bei einem pH von 6.25. Bei diesem pH-Wert ist die chemische Austauschrate kb maximal. Korrekterweise musste
¨
der chemische Austausch
solch einer komplexen Mischung durch ein N-Spin-Modell beschrieben werden. Dies
ist praktisch jedoch nicht durchfuhrbar.
¨
Aufgrund des gut definierten Minimums in
Abbildung 4.65 wurde angenommen, dass der chemische Austausch dieses Systems
n¨aherungsweise mit einer durchschnittlichen Austauschrate k¯b fur
¨ einen zweiseitigen
Austausch zweier repr¨asentativer Spin-Spezies beschrieben werden kann. Insgesamt
wurde im pH-Bereich zwischen 5.0 und 7.5 ein T2 -Unterschied von 40 ms bewirkt.
4.4.4.4.3 Effekt der Zellzunahme
Der von einer Bakterienkultur experimentell ermittelte T2 -Wert setzt sich aus intraund extrazellul¨aren Beitr¨agen zusammen. Maßgeblich ist dabei das relative Volumen,
welches von beiden Komponenten besetzt wird. Berechnet man die Volumenfraktion
fur
¨ Bakterien, die in einer Zellsuspension mit einem OD600 -Wert < 1 eingenommen
wird, kommt man unter Annahme eines Bakterienradius von 0.5 µm auf einen Wert
von unter 10−5 . Ein OD-Wert von 1 ist in diesem Beispiel repr¨asentativ fur
¨ verschie-
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
155
dene Bakterienkulturen und wird h¨aufig in der station¨aren Phase erreicht. Das Ergebnis rechtfertigt somit in erster N¨aherung die Vernachl¨assigung des Einflusses zellbe¨
dingter Anderungen
der Bakterienkultur auf den beobachteten T2 -Verlauf w¨ahrend
der Zellproliferation.
4.4.4.4.4 Metabolitenkonzentrationen
In Abschnitt 4.4.4.3 konnte bereits gezeigt werden, dass w¨ahrend der Zellproliferation
von S. vestibularis haupts¨achlich die Metaboliten Acetat, Formiat, Succinat und Laktat
in das extrazellul¨are Medium freigesetzt werden und damit seine Zusammensetzung
a¨ ndern. Zur Bestimmung der Zunahme der Metabolitenkonzentration wurden nun die
entsprechenden Protonensignale der Kultur-Spektren in Abbildung 4.63 zu den Zeitpunkten t=0 und t=12 h integriert. Die Ergebnisse wurden relativ zur Maleins¨aureresonanz berechnet und sind in Tabelle 4.8 zusammengefasst. Innerhalb von 12 h zeigte
sich fur
¨ Formiat eine Zunahme um den Faktor 4.3, fur
¨ Acetat um 3.2 und fur
¨ Laktat
um den Faktor 7. Laktat ist somit im Stoffwechsel der dominante Metabolit. Ethanol
lag zur quantitativen Auswertung in zu geringer Konzentration vor.
Pro Molekul
¨ Maleat werden zwei Protonen erfasst (Struktur − OOC-CH=CH-COO− ).
Bei einem Molekulargewicht von 116.1 g/mol und einer Konzentration von 1 mg/ml
ist eine Stoffmenge von 8.61 mmol in einem Liter Medium enthalten. Unter Einbeziehung der Avogadro-Konstante (NA =6.022 x 1023 Teilchen pro mol) beinhaltet die
Signalfl¨ache 1.04 x 1022 Wasserstoffkerne/l. Fur
¨ die Metabolite errechnen sich daraus
die folgenden Endkonzentrationen:
• Formiat (Mr=46.03 g/mol, 1 H pro Molekul):
¨ 0.41 mg/ml
• Acetat (Mr=60.05 g/mol, 3 H pro Molekul):
¨ 0.83 mg/ml
• Succinat (Mr=118.1 g/mol, 4 H pro Molekul):
¨ 0.47 mg/ml
• Laktat (Mr=90.08 g/mol, 3 H pro Molekul):
¨ 0.93 mg/ml
Alle quantifizierbaren Metabolite liegen in einer Konzentration von weniger als 1 mg
pro ml vor. Berucksichtigt
¨
man, dass das Medium zu Beginn des Bakterienwachstums
in einer Konzentration von 0.037 g/ml eingesetzt wird, liegen die Metabolitenkonzentrationen um einen Faktor 50 bis 100 niedriger vor. Der Beitrag der Metaboliten zur
¨
Anderung
von T2 kann somit in guter N¨aherung vernachl¨assigt werden. Die mogliche
¨
Untersch¨atzung der Metabolitenkonzentrationen aufgrund unvollst¨andiger longitudinaler Relaxation bei der Messung wurde mittels Ernst-Gleichung abgesch¨atzt:
− TR
M0 1 − e T1 sinα
(4.4)
s(0) ∝
− TTR
1
1−e
cosα
156
4. Ergebnisse und Diskussion
Unter der Annahme einer maximalen Relaxationszeit von 3 s und Einbeziehung des
bei der Messung verwendeten Relaxationsdelays von 2 s berechnet sich der Fehler im
Metabolitengehalt zu 22 %, womit die N¨ahrstoffkonzentration immer noch mindestens
um einen Faktor 39 hoher
¨
liegt.
Metabolit
Gehalt*
(t = 0h)
Gehalt*
(t = 12h)
Formiat
Acetat
Succinat
0.12
0.74
1.37
Dublett
0.25
0.24
Quartett
nicht detektierbar
0.52
2.40
0.92
Dublett
1.78
1.70
Quartett
0.24
0.37
0.34
0.18
Laktat
Tabelle 4.8: Quantifizierung der Metaboliten zu den Zeitpunkten t=0 h und t=12 h der Wachstumskurve
von S. vestibularis. *Der Gehalt wurde durch Integration der Spektren in Abbildung 4.63 bestimmt und
ist als Fl¨ache unter der Kurve relativ zum Maleins¨auresignal (interner Standard, 1 mg/ml) angegeben.
4.4.4.4.5 Maßgebende Einflussfaktoren
In den letzten Abschnitten konnte der N¨ahrstoffverzehr und die Beeinflussung der
chemischen Austauschrate durch den pH-Wert als Hauptursachen fur
¨ die beobach¨
teten Anderungen
der transversalen Relaxation w¨ahrend der Zellproliferation identifiziert werden. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden zu den gemessenen pHWerten in Abbildung 4.60 die entsprechenden T2 -Werte aus Abbildung 4.65 abgelesen und zusammen mit der gemessenen T2 -Kurve aus Abbildung 4.59 in einem Diagramm aufgetragen (Abbildung 4.66). In den ersten 5 h bis zum Erreichen des globalen
T2 -Minimums von 70 ms sind die aus der pH-Kalibrierung des Mediums errechnete
und gemessene T2 -Kurve nahezu deckungsgleich. In dieser Zeitspanne erhohte
¨
sich
die Metabolitenkonzentrationen von Formiat, Acetat, Succinat und Laktat nur schleichend und bewirkten lediglich eine pH-Absenkung um ca. 0.5 Einheiten (Abbildung
4.62). Betrachtet man die Wachstumskurve in Abbildung 4.60, so ist in diesem Stadium
mit einem OD600 von 0.416 die H¨alfte des maximalen Zellwachstums erreicht und die
Bakterienpopulation befindet sich mitten in der exponentiellen Phase. Durch die exponentielle Zellproliferation setzt ab einer Inkubationszeit von 5 h beschleunigte Me-
T2 [ms]
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
157
130
gemessene T -Kurve
2
120
berechnet aus pH-T -BHI-Kurve
2
110
100
90
80
70
60
100
200
300
400
500
600
700
t [min]
Abbildung 4.66: Gegenuber¨
stellung der gemessenen und
den aus der pH-Kalibrierung
(Abbildung 4.65) berechneten
T2 -Werten. Zu Anschauungszwecken sind die einzelnen
Datenpunkte mit einer SplineKurve interpoliert. Die Kurven
stellen
kein
physikalisches
Modell dar.
tabolitenproduktion von Formiat, Acetat und Laktat ein. Der pH-Wert f¨allt rapide auf
5.16 ab und die T2 -Kurven in Abbildung 4.66 driften zunehmend auseinander. Der maximale T2 -Unterschied wird in der station¨aren Phase bei 11.6 h erreicht und betr¨agt 20
ms. Dieses Ergebnis entspricht etwa der zu 15 ms berechneten Wirkung des N¨ahrstoffverbrauchs durch die mikrobielle Stoffwechselaktivit¨at. Zusammengefasst l¨asst sich
sagen, dass die erste H¨alfte der T2 -Wachstumskurve nahezu ausschließlich durch den
¨
pH-Wert bestimmt wird, w¨ahrend sich in der zweiten H¨alfte die Effekte aus pH-Anderung und N¨ahrstoffverbrauch uberlagern.
¨
4.4.5 T2 als Maß fur
¨ die antibiotische Wirksamkeit
4.4.5.1 Auswahl des Testsystems
In “whole-cell-bioassays” (Abschnitt 1.2.2) erfolgt die Toxizit¨atsbestimmung einer
Testsubstanz ublicherweise
¨
uber
¨
ihre Auswirkung auf die Zellproliferation und mittels optischer Detektion. In der Regel wird die hemmende Wirkung der Testsubstanz
als minimale Hemmkonzentration (MIC, Abschnitt 1.2.3) angegeben. In den vorhergehenden Abschnitten zeigte sich, dass mit der transversalen Relaxation ein geeigneter
¨
NMR-Parameter gefunden war, wachstumsbedingte Anderungen
einer Bakterienkultur zu erfassen. Der Parameter liefert somit Informationen uber
¨
das Stadium der Zellkultur und kann zur Unterscheidung einer wachsenden und statischen Kultur herangezogen werden. Der Zytotoxizit¨atstest wurde am Teststamm S. vestibularis entwickelt.
Sein Metabolismus war grundlich
¨
untersucht und seine Vancomycin-Empfindlichkeit
sowohl fluorimetrisch als auch mittels Mikrodilutionsverfahren (Abschnitt 4.3) uber¨
pruft.
¨ Als Losungsmittel
¨
konnte H2 O verwendet werden, so dass auf eine Untersuchung der T2 -Beeinflussung durch Losungsmittel
¨
verzichtet werden konnte.
158
4. Ergebnisse und Diskussion
4.4.5.2 T2 -Beeinflussung durch Vancomycin
T2/T 2
0
Bevor die Wirkung des Vancomycin auf S. vestibularis uber
¨
T2 -Wachstumskurven untersucht werden konnte, musste sicher gestellt werden, dass die gemessenen T2 -Werte
von den eingesetzten Vancomycin-Konzentrationen an sich nicht beeinflusst werden.
Bei Vancomycin handelt es sich, wie bereits in Abschnitt 4.3.3 beschrieben, um ein Glykopeptid mit zahlreichen ionisierbaren funktionellen Gruppen, wodurch eine Beein¨
flussung der transversalen Relaxation mit abnehmendem pH-Wert und damit Ande¨
rung der chemischen Austauschrate nicht auszuschließen war. Zur Uberpr
ufung
¨
wurden T2 -Werte von BHI-Medium mit Vancomycin-Konzentrationen im Bereich von 0.01
µM bis 100 µM bei unterschiedlichen pH-Werten und bei 30 ◦ C und 17.6 T bestimmt.
Die Verh¨altnisse zwischen diesen Relaxationszeiten und ihren entsprechenden Blindwerten (T02 ) aus reinem Medium bei den verschiedenen pH-Werten sind in Abbildung 4.67 dargestellt. Sie zeigen abgesehen von kleinen Fehlern, die innerhalb der experimentellen Schwankungen durch Mittlung der T2 -Werte uber
¨
ca. 140 Pixeln lagen (siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.5.1.3), konstante Linien. Hierdurch ist
die Vancomycin-Unabh¨angigkeit der T2 -Relaxation im betrachteten Konzentrationsbereich bewiesen.
1.30
1.25
pH=4.98
pH=5.49
pH=5.98
pH=6.45
pH=7.13
1.20
Abbildung 4.67: pH-Abh¨angigkeit der T2 -Werte des BHIMediums mit unterschiedlichen
Vancomycin-Konzentrationen,
normiert auf die pH-abh¨angigen T2 -Werte von reinem
BHI-Medium. Gemessen wurden die T2 -Werte bei 30 ◦ C und
17.6 T.
1.15
1.10
1.05
1.00
0.95
0.90
0.85
0.80 -2
10
-1
10
1
2
10
10
Concentration [µM]
4.4.5.3 Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit
Zur Bestimmung der antibiotischen Wirkung des Vancomycins auf S.vestibularis wurde
¨
ein Probensatz von sieben 5 mm-NMR-Rohrchen
¨
pr¨apariert. Ahnlich
der Makrodilutionsmethode (DIN 58940-5) wurden funf
¨ dieser Rohrchen
¨
mit 2 ml Bakteriensuspension in einer Konzentration von 0.015 OD600 befullt.
¨
Jedes dieser Inokula enthielt eine
1:10 Verdunnung
¨
von Vancomycin in einem Konzentrationsbereich von 0.01 µM bis
100 µM. Die sechste und siebte Probe bestand aus reinem Medium und einer unbehandelten Bakteriensuspension und diente als Negativ- bzw. Positivkontrolle. Von diesem
4.4 Transversale Relaxation als Indikator fur
¨ Zellwachstum
159
Probensatz wurde die transversale Relaxation uber
¨
einen Zeitraum von 12 h bei 30 ◦ C
und 17.6 T simultan gemessen.
125
120
control
medium
115
110
2
T [ms]
105
100
0.01 µM
0.1 µM
1 µM
10 µM
100 µM
95
90
85
80
75
70
100
200
300
400
500
600
t [min]
700
Abbildung 4.68: T2 -Wachstumskurven von S. vestibularis unter
dem Einfluss unterschiedlicher
Vancomycin-Konzentrationen,
gemessen bei 30 ◦ C und 17.6 T.
Das Diagramm in Abbildung 4.68 zeigt die T2 -Kurven der jeweiligen Proben. Bei den
Bakterienproben in Gegenwart von Vancomycin-Konzentrationen ≥ 1 µM wurde keine zeitliche Ver¨anderung der transversalen Relaxation festgestellt und damit kein Zellwachstum beobachtet. Hingegen zeigten die Bakteriensuspensionen bei einem Vancomycin-Gehalt unter ≤ 0.1 µM gegenuber
¨
der Positivkontrolle keinen Unterschied in
ihrer Wachstumscharakteristik. Zur genaueren Untersuchung des Konzentrationsbereiches 0.1 µM bis 1 µM wurde das Experiment mit intermedi¨aren Zwischenstufen (1:8,
2:8 etc. Verdunnungsstufen)
¨
wiederholt. Auch hier zeigte die inhibitorische Wirkung
des Vancomycin ein typisches Schwellenverhalten ohne Zwischenzust¨ande. Diese sollten sich in einer unterschiedlichen Steigung und einer zeitlichen Verzogerung
¨
der T2 Kurven bemerkbar machen. Gemittelt uber
¨
drei Messwerte wurde der MIC-Wert zu
0.33 ± 0.08 µM bestimmt. Dies entspricht einer Standardabweichung von 24.2 %. Verglichen mit den Ergebnissen aus der FMR- (ED50 =2.4 ± 0.7 µM) LIF-CE- (ED50 =0.24
± 0.07 µM) und der Mikrodilutionsmethode nach DIN 58940-8 [2] (MIC=0.7 µM) liegt
dieses Ergebnis im gleichen Großenbereich.
¨
Die Eignung von T2 als Marker fur
¨ Zellwachstum im Rahmen eines “in-vitro-whole-cell-bioassays” und die Richtigkeit der
Methode sind damit zun¨achst best¨atigt.
4.4.5.4 Potenzial-Praktikabilit¨at-Ausblick
MRI als Methode zur Detektion mikrobiellen Wachstums eroffnet
¨
in HighThroughput-Screening-Verfahren eine neue Perspektive. Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung, die Schlusselfaktoren
¨
fur
¨ Methoden mit hohem Testdurchsatz konnen
¨
in der MRI in hohem Maße erfullt
¨ werden. In der Bildgebung ist
160
4. Ergebnisse und Diskussion
das Pixel die kleinste Informationseinheit. Berucksichtigt
¨
man, dass eine Mittelung
uber
¨
100 Pixel bereits einen aussagekr¨aftigen Wert liefert, und MRI-Experimente mit
einer Matrixgroße
¨
von 1024 x 1024 oder 2048 x 512 in Ganzkorpertomographen
¨
keine Seltenheit sind, werden Messprotokolle mit 10.000 Proben moglich.
¨
Die Detektion
kann somit fur
¨ viele Proben parallel erfolgen, ohne dass fur
¨ jede Probe eine separate Anregung und Detektion notwendig ist, wie es bei den optischen Methoden der
Fall ist. Verwendet man fur
¨ den Testansatz die Mikrodilution in Mikrotiterplatten (Abschnitt 1.2.3), so w¨are der gesamte Ablauf des Testverfahrens voll automatisierbar und
ein Durchsatz von 40.000 Testsubstanzen pro Stunde w¨are moglich.
¨
Bisher wurde die
Eignung der MRI-Detektion nur an einem kleinen Probensatz von 20 Stuck
¨ bei hoher
Feldst¨arke (17.6 T) und anaeroben Mikroorganismen gezeigt. Zur Realisierung der Detektionsmethode in High-Throughput-Verfahren unter Verwendung von Ganzkorper¨
tomographen mit Feldst¨arken von 1.5 und 3 T mussen
¨
somit die Parameter T2 , OD600
und pH neu korreliert werden. Auch w¨are noch zu kl¨aren, ob unter Sauerstoffbegasung eine Detektion der Zellproliferation auch fur
¨ Aerobier moglich
¨
ist. Letztendlich
wird erst durch die Testung vieler Substanzen im Routinelabor die Eignung der Methode beurteilt werden konnen.
¨
4.4.6 Fazit: T2 als Marker fur
¨ Zellwachstum
¨
• Hauptursachen der wachstumsbedingten T2 -Anderung
sind der N¨ahrstoffver¨
zehr und die stoffwechselbedingte pH-Anderung
im extrazellul¨aren Medium.
• Der T2 -Verlauf zur Beschreibung von Wachstumskurven erwies sich als bakterienspezifisch. Charakteristische T2 -Kurven ergaben sich in 5 mm-NMR-Rohrchen
¨
nur fur
¨ Anaerobier.
• Die MIC-Werte des Vancomycin fur
¨ S. vestibularis zeigten im Dilutionsverfahren
sowohl bei MRI- als auch bei spektralphotometrischer Detektion vergleichbare
Ergebnisse.
161
Kapitel 5
Experimenteller Teil
5.1 Bakteriologische Untersuchungen
5.1.1 Kapillarelektrophorese (CE)
5.1.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter
Die elektrophoretische Charakterisierung der Bakterien-Spezies wurde an einem Beckman-Ger¨at P/ACE System MDQ (Fullerton, CA, USA) unter Verwendung eines UVDetektors bei 214 nm vorgenommen. Fur
¨ die Aktivit¨atsbestimmungen verschiedener
Antibiotika diente ein Argon-Laser-induzierter-Fluoreszenz-(LIF)-Detektor (488 nm)
(Beckman, Krefeld, Deutschland), welcher im Zwei-Kanal-System mit einem 520 nm
Bandpass- und einem 655 nm Longpass-Filter (Beckman) betrieben wurde. Die elektrophoretische Trennung erfolgte unter Verwendung einer Quarzglaskapillare (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) mit einer Gesamtl¨ange von 31.5 cm, einer Detektionsl¨ange von 21.0 cm und einem Innendurchmesser von 100 µm bei einer konstant
angelegten Spannung von 10 kV bei 23 ◦ C. Die Proben wurden an der Anode der Kapillare durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur
¨ eine Dauer von 10 s injiziert.
5.1.1.2 Spulschritte
¨
Konditionierung einer neuen Kapillare
0.1 M HCl : 10 min, 20 psi
0.1 M NaOH : 20 min, 20 psi
H2 O : 10 min, 20 psi
Tageskonditionierung
0.1 M NaOH : 20 min, 20 psi
H2 O : 10 min, 20 psi
162
5. Experimenteller Teil
Spulschritte
¨
zwischen jeder Trennung
0.33 M H3 PO4 : 16 min, 20 psi
H2 O : 1 min, 20 psi
0.1 M NaOH : 3 min, 20 psi
H2 O : 1 min, 20 psi
CE-Trennpuffer : 2.5 min, 20 psi
Durch 0.33 molaren Phosphatpuffer wird die polymere Polyethylenoxid-Losung,
¨
die
im Puffer zum mobilen Beschichten der Kapillare verwendet wird, vollst¨andig von
der Kapillarwand gelost.
¨ Das Einspulen
¨
von CE-Puffer vor jeder Trennung beschichtet
die Kapillare neu.
Spulschritte
¨
zur Lagerung der Kapillare
0.1 M NaOH : 2 min, 20 psi
H2 O : 10 min, 20 psi
H2 O : 1 min, 5 psi
5.1.1.3 Wasser
Wenn nicht anders beschrieben, wurde das mittels Millipore-Reinigungssystem (MilliQ, Eschborn, Deutschland) gereinigte Wasser benutzt.
5.1.1.4 CE-Trennpuffer (pH = 8.7)
Tris-Borat-Na2 EDTA (TBE)-Puffer (pH = 8.3)
Es wurde eine Stammlosung
¨
von 0.445 M Tris-Borat und 10 mM Na2 EDTA bei
einem pH von 8.3 hergestellt. Dazu wurde das Produkt No T7527 (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen, Deutschland) in 1 l Wasser gelost.
¨ Der hochkonzentrierte TBE-Puffer war,
◦
aufbewahrt bei 4 C, uber
¨
mehrere Monate haltbar.
Polyethylenoxid (PEO)-Losung
¨
0.5 %
0.2 g Polyethylenoxid (Mr=600.000; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
werden in 40 ml Wasser dispergiert, woraus sich ein 0.5 %iger Polymergehalt ergibt.
Das heterogene Gel wurde zur kompletten Losung
¨
uber
¨
Nacht bei 30 ◦ C gelagert.
Diese Losung
¨
wurde uber
¨
einen Zeitraum von einer Woche verwendet.
Fur
¨ die Herstellung von 10 ml Trennpuffer wurden 17.5 µl TBE-Puffer und 250
5.1 Bakteriologische Untersuchungen
163
µl 0.5 %ige PEO-Losung
¨
auf 10 ml mit Wasser verdunnt.
¨
Es ergibt sich daraus eine
Konzentration von 0.78 mM Tris-Borat, 0.018 mM Na2 EDTA und 0.0125 % PEO bei
einem pH von 8.7. Der Trennpuffer wurde unmittelbar vor jeder Trennung hergestellt
und mittels Ultraschallbad 2 Minuten entgast.
5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie
Ger¨at: Cary Eclipse Fluorimeter mit Mikrotiterplatten-Leseger¨at (Varian, Darmstadt,
Deutschland).
Messwellenl¨angen: Anregungswellenl¨ange bei 488 nm und duale Emission bei 520 nm
und 655 nm.
Verwendetes Messprogramm: “Scan” (Varian).
5.1.3 Mikroskopie
Ger¨ate: Olympus CH-2, CK2 mit 10-, 20-, 40- und 100-facher Vergroßerung
¨
(Hamburg,
Deutschland).
5.1.4 Ultraschallbad
Ger¨at: SONOREX RK 156 (Bandelin, Morfelden-Walldorf,
¨
Deutschland).
Leistung: 120 W.
Frequenz: 35 KHz.
5.1.5 Magnetische Kernresonanz (NMR)
5.1.5.1 Bildgebung
5.1.5.1.1 Messapparatur und Ger¨ateparameter
Die kernspintomographischen Messungen zur Bestimmung der transversalen Relaxation (T2 ) wurden am Bruker Avance 17.6 Tesla Spektrometer (Bruker Biospin GmbH,
Rheinstetten, Deutschland) durchgefuhrt.
¨
Zur Schaltung der Bildgebungsgradienten
wurde in die vertikale Bohrung des Magneten mit einem Durchmesser von 89 mm
ein Micro-2.5-Gradientenrohr (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten) mit einem Innendurchmesser von 40 mm und einer maximalen St¨arke von G=1000 mT/m pro Raumrichtung eingebracht. In das Gradientenrohr wurde der Probenkopf montiert, auf dem
sich als Sende-/Empfangsspule ein 20 mm 1 H-Birdcage-Resonator (Bruker Biospin
GmbH, Rheinstetten) befand, in welchem der jeweilige Probensatz in 5 mm-NMRRohrchen
¨
fixiert wurde. Das Gradientensystem wurde auf 30 ◦ C temperiert. Die An-
164
5. Experimenteller Teil
steuerung des Spektrometers erfolgte durch einen angeschlossenen Rechner mit den
Softwarepaketen Paravision 3.0.2 und xwin 3.5 (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten).
5.1.5.1.2 Sequenz und Parameter
Abbildung 5.1: Multi-Spinecho
Sequenz zur Messung von T2 .
Die Transversalmagnetisierung
wurde mit einem schichtselektiven 90◦ sinc3-Puls erzeugt
und nach der H¨alfte der Echozeit τ mit einem schichtselektiven 180◦ sinc3-Puls zur Rephasierung invertiert. Nach jeder Pulsanregung wurden 64
Echos ausgelesen. Die Schichtdicke betrug 2 mm, die Matrixgroße
¨
64 x 64, das Gesichtsfeld
20 x 20 mm2 , die Echozeit 10 ms
und die Repetitionszeit 5 s.
5.1.5.1.3 Auswertung
Die aufgenommenen Echos wurden mittels MATLAB (The MathWorks, Natick, MA,
USA) ausgewertet. Es wurden entsprechende T2 -Karten berechnet indem die Intensit¨at
jedes Pixels nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate an eine Monoexponential− n2τ
funktion (I(n) = I0 e T2 ) angepasst wurde.
Abbildung 5.2: T2 -Karte eines Probensatzes von sieben
5
mm-NMR-Rohrchen
¨
mit
Zellsuspension.
Die Annahme einer Monoexponentialfunktion fur
¨ Zweiphasensysteme (Zellsuspensionen) ist eine Vereinfachung, die jedoch aufgrund des geringen Volumenanteils der
Zellen gerechtfertigt ist. Bei einer Zellsuspension von einem OD600 -Wert< 1 ergibt
sich bei einem durchschnittlichen Bakterienradius von 0.5 µm eine Volumenfraktion
< 10−5 . Aus diesem Grund konnen
¨
intrazellul¨are Beitr¨age und eine direkte Beeinflus-
5.1 Bakteriologische Untersuchungen
165
sung durch die Zellen vernachl¨assigt werden. In der T2 -Karte wurde fur
¨ jedes 5 mmNMR-Rohrchen
¨
ein ROI (region of interest) mit durchschnittlich 140 Pixeln definiert
und T2 als Mittelwert in den ROIs bestimmt. In die gemessenen T2 -Werte gehen unter
anderem Diffusionseffekte mit ein. Aufgrund konstanter experimenteller Parameter
w¨ahrend einer Messserie, wurde der Einfluss der Diffusion als konstant angenommen
und T2 als gemessenes T2 definiert.
5.1.5.2 Spektroskopie
Die NMR-Spektren der Bakteriensuspensionen wurden am 9.4 T Bruker-Avance-NMRSpektrometer (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Deutschland) gemessen. Verwendet wurde dabei ein BBO(Broadband Observe)-Probenkopf mit Z-Gradientensystem.
Jede Bakterienprobe enthielt 10 % D2 O zur Setzung des Locksignals.
5.1.5.2.1 1D-Spektroskopie
Die Messungen erfolgten unter Verwendung von Watergate-W5-Wasserunterdruck¨
ungspulsen und wurden bei 300 K mit den folgenden Parametern durchgefuhrt:
¨
Punkte, 64 K; Anzahl der Mittlungen, 64; Spektrale Breite, 16 ppm; Akquisitionszeit, 5.1 s
und Relaxationsdelay, 2 s. Die Quantifizierung erfolgte durch Integration der Fl¨achen
unter den Protonensignalen. Maleins¨aure in einer Konzentration von 1 mg/ml diente
als interner Standard (δ=6.2 ppm), dessen Fl¨ache unter der Kurve auf eins normiert
wurde.
5.1.5.2.2 2D-Spektroskopie
2D-Doppelquanten-gefilterte-COSY-Experimente wurden bei 300 K unter Verwendung von 3-9-19 Wasserunterdruckungspulsen
¨
(Watergate) und mit den folgenden Parametern durchgefuhrt:
¨
Punkte, 2048 K; Anzahl der Mittlungen, 80; Spektrale Breite,
12.32 ppm; Akquisitionszeit, 0.208 s; Relaxationsdelay, 2 s; Inkremente von t1, 256.
5.1.6 Fluoreszenzmarker: SYTO9 und Propidiumiodid
Der “Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit” (L-7012) zur Markierung lebender
und toter Bakterienzellen wurde uber
¨
Molecular Probes (MobiTec, Gottingen,
¨
Deutschland) bezogen. Er besteht aus den beiden Fluoreszenzfarbstoffen SYTO9 und Propidiumiodid. SYTO9 liegt in 3.34 mM, Propidiumiodid in 20 mM Konzentration, gelost
¨ in
DMSO, vor. Fur
¨ die Verwendung in den Zytotoxizit¨atsbestimmungen wurden diese
Stammlosungen
¨
mit DMSO 1:10 bzw. 1:100 verdunnt.
¨
Die Anregungs-/Emissionsmaxima fur
¨ diese Farbstoffe liegen fur
¨ SYTO9 bei 480/500 nm und bei 490/635 nm fur
¨
Propidiumiodid. Die zwei Nucleins¨aure-bindenden Farbstoffe unterscheiden sich in
166
5. Experimenteller Teil
ihrer F¨ahigkeit in lebende Zellen einzudringen. SYTO9 f¨arbt lebende Zellen mit intakter Membran grun,
¨ w¨ahrend Propidiumiodid tote Zellen mit gesch¨adigter Membran
rot f¨arbt.
5.1.7 Proben
5.1.7.1 Antibiotika-Losungen
¨
Stammlosungen:
¨
10 mM Stammlosungen
¨
verschiedener Referenz-Antibiotika wurden
in geeigneten, moglichst
¨
nicht-toxischen Losungsmitteln
¨
und damit bevorzugt in Wasser hergestellt. W¨assrige Losungen
¨
wurden mit Membranfiltern der Porengroße
¨ von
0.2 µm steril filtriert. Zur Verminderung von Aktivit¨atsverlust durch Zersetzung der
Proben empfiehlt sich eine Lagerung bei -30 ◦ C.
Ciprofloxacin (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland)
Vancomycin-HCl (Ratiopharm, Ulm, Deutschland)
Ampicillin-Na (Pfizer Pharma GmbH, Karlsruhe, Deutschland)
Ofloxacin (Hoechst, Frankfurt, Deutschland)
:
:
:
:
H2 O
H2 O
H2 O
0.1 M NaOH
Arbeitslosungen:
¨
Die Arbeitslosungen
¨
im Konzentrationsbereich 1 mM bis 1 µM ergaben sich aus den Stammlosungen
¨
durch serielle 1:10-Verdunnung
¨
mit den entsprechenden Losungsmitteln.
¨
200 µl jeder Verdunnung
¨
wurden unmittelbar vor der Testung zubereitet.
5.1.7.2 Bakterien
5.1.7.2.1 Bakterien-St¨amme
Die bakteriologischen Messungen mittels Kapillarelektrophorese, NMR und Fluoreszenzspektroskopie wurden an den folgenden funf
¨ Bakterien-St¨ammen durchgefuhrt:
¨
• Aerobier
Pseudomonas fluorescens (DSM-No 50090; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
Micrococcus luteus (DSM-No 20030; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
Neisseria cinerea (DSM-No 4630; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
• Anaerobier
Escherichia coli (Top 10, Institut fur
¨ Biotechnologie, Universit¨at Wurzburg,
¨
Deutschland)
• Fakultativer Anaerobier
Streptococcus vestibularis (DSM-No 5636; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
*DSMZ=Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
5.1 Bakteriologische Untersuchungen
167
5.1.7.2.2 Kultur-Medien
Muller-Hinton-Agarplatten
¨
Muller-Hinton-Agarplatten
¨
wurden von Oxoid (Wesel, Deutschland) mit der folgenden Zusammensetzung bezogen:
Getrockneter Rinderextrakt : 2 g/l
Caseinhydrolysat : 17.5 g/l
St¨arke : 1.5 g/l
Brain-Hart-Infusion(BHI)-Bouillon
Das pulverisierte BHI-Medium wurde von Oxoid (Wesel, Deutschland) mit folgender
Zusammensetzung bezogen:
Getrockneter Rinder-Herz-Extrakt : 12.5 g/l
Getrockneter Kalbs-Hirn-Extrakt : 5.0 g/l
Pepton : 10 g/l
Glukose : 2 g/l
Chloride : 5 g/l
Dinatrium-Phosphat : 2.5 g/l
5.1.7.2.3 Kultivierung
Die Bakterien-Spezies wurden in gefriergetrocknetem Zustand von der DSMZ bezogen. Suspendiert in BHI-Bouillon wurden sie zun¨achst auf Muller-Hinton-Agarplatten
¨
◦
ausgestrichen und bei 30 C angezuchtet.
¨
Die Agarkultur diente fur
¨ den Zeitraum von
einer Woche als Bakterienreservoir. Vor der Analyse wurden Bakterien in 5 ml der
BHI-Bouillon uberimpft
¨
und bei 30 ◦ C fur
¨ 12 h inkubiert. Diese Bakteriensuspension
diente zur Vorbereitung der verschiedenen CE-, NMR- und fluoreszenzspektroskopischen Proben.
5.1.7.2.4 Zellkonzentration
Die Zellkonzentration wurde UV/VIS-spektroskopisch durch Messung der optischen
Dichte (OD) bei 600 nm und anschließendem Z¨ahlen der koloniebildenden Einheiten
(CFU) bestimmt. Zur letzteren Bestimmung wurden Bakterienproben in der exponentiellen Phase mit einem bestimmten OD-Wert serienm¨aßig 1:10 verdunnt
¨
und ein definiertes Volumen (1 ml) wurde auf BHI-Agar ausplattiert. Die Zellkonzentration ergab
sich durch visuelles Ausz¨ahlen der gebildeten Kolonien nach einer Inkubation von 24
h bei 37 ◦ C.
168
5. Experimenteller Teil
5.1.7.2.5 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen zur kapillarelektrophoretischen und fluoreszenzspektroskopischen Analyse
20 µl einer 12h-Bakterienkultur wurden in 2 ml BHI-Bouillon suspendiert und in 15 mlRohrchen
¨
bei 30 ◦ C fur
¨ 24 h bis zum Erreichen der fruhen
¨
station¨aren Phase inkubiert.
Die Bakteriensuspension wurde in einer Zentrifuge (EBA 12; Hettich, Kirchlengern,
¨
Deutschland) bei 3400 rpm fur
¨ 5 min pelletiert. Der Uberstand
wurde abdekantiert,
die Zellen mit 500 µl Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach zweimaligem
Waschen wurden die Zellen entweder in Wasser (fluorimetrische Bestimmungen) oder
in Trennpuffer (CE-Bestimmungen) resuspendiert. Aufgrund der Bakterienernte in der
fruhen
¨
station¨aren Phase, stellen die Bakterien in diesem Zustand nahezu 100 % lebende Zellen dar. Fur
¨ die Kalibrierung des zur Zellmarkierung erforderlichen Konzentrationsverh¨altnisses von SYTO9 und Propidiumiodid waren Bakterienproben mit
unterschiedlichem Gehalt an lebenden und toten Zellen erforderlich. Zur Herstellung
einer Bakteriensuspension mit 100 %igem Tot-Anteil wurden gewaschene Zellen fur
¨
eine Stunde in 50 %igem Isopropanol suspendiert und nach einem Waschschritt entweder in Wasser (fluorimetrische Bestimmung) oder Trennpuffer (CE-Bestimmung)
uberf
¨
uhrt.
¨
Die Stammbakteriensuspensionen lebender und toter Zellen wurden auf
eine OD600 -Wert von 0.5 eingestellt und unmittelbar vor jeder Messung pr¨apariert.
Diese Zellkonzentration wurde fur
¨ CE-Messungen mit UV-Detektion bei 214 nm verwendet. Fluoreszenz-Messungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Leseger¨at oder an der
Kapillarelektrophorese wurden mit 1:10 (Fluorimeter) bzw. 1:100 (LIF-CE) verdunnten
¨
Bakterienproben durchgefuhrt.
¨
Die Entwicklung eines Zytotoxizit¨atstests mittels LIFCE und Fluorimeter erforderte Arzneistoff-behandelte Bakterienproben. Dazu wurden
1980 µl einer sich in der exponentiellen Phase befindlichen Bakterienkultur in BHIMedium (OD600 =0.3) in funf
¨ 15 ml Zentrifugenrohrchen
¨
aliquotiert. Die Zugabe von 20
µl verschiedener Konzentrationen einer 10fachen Verdunnungsreihe
¨
der AntibiotikaStammlosungen
¨
mit den entsprechenden Losungsmitteln
¨
fuhrte
¨
zu einem Testbereich
von 0.01 µM bis 100 µM an Antibiotika-Konzentration unter Verwendung von 1 %
Losungsmittel
¨
(vgl. Abschnitt 5.2.5). Zusammen mit einer Positivkontrolle (Inokulum
mit 1 % Losungsmittel)
¨
wurden die Ans¨atze bei 30 ◦ C fur
¨ 18 h inkubiert, d. h. so lange, bis unbeeinflusste Bakterienproben den station¨aren Zustand erreichten. Anschließend wurden die Bakterienzellen geerntet, wie zuvor beschrieben, gewaschen, in Wasser bzw. in Trennpuffer in den entsprechenden Konzentrationen suspendiert, und fur
¨
Fluoreszenz-Messungen verwendet.
5.1.7.2.6 Zellpr¨aparation und Stammsuspensionen fur
¨ die NMR-Messungen
20 µl einer 12h-Kultur wurden in 2.0 ml BHI-Medium suspendiert und in 5 mm-NMRRohrchen
¨
uberf
¨
uhrt.
¨
Das Inokulum zeigte einen OD600 -Wert von 0.015. Zur Bestim-
5.1 Bakteriologische Untersuchungen
169
mung der T2 -Wachstumskurven wurden diese Proben uber
¨
einen Zeitraum von 24 h
gemessen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) erfolgte durch
Messung von T2 -Wachstumskurven in Abh¨angigkeit unterschiedlicher AntibiotikaKonzentrationen. Dazu wurden 1.980 µl Bakteriensuspension mit einem OD600 -Wert
von ca. 0.015 in funf
¨ 5 mm-NMR-Rohrchen
¨
aliquotiert und mit 20 µl einer AntibiotikaStammlosung
¨
bzw. -Arbeitslosung
¨
versetzt, so dass sich eine Testkonzentration zwischen 100 µM und 0.01 µM unter Verwendung von 1 % Losungsmittel
¨
ergab.
5.1.8 Zytotoxizit¨at
5.1.8.1 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR)
200 µl Arzneistoff-behandelter Bakterienproben (Abschnitt 5.1.7.2.5), die zuvor auf
einen OD600 -Wert von 0.5 eingestellt und anschließend 1:10 verdunnt
¨
wurden (ca. 107
Zellen/ml), wurden in die Vertiefungen einer weißen Mikrotiterplatte gegeben. Die
Zellmarkierung erfolgte durch hinzufugen
¨
von je 1 µl 0.33 mM SYTO9 und 2 mM Propidiumiodid und anschließender Inkubation von 15 Minuten unter Lichtausschluss.
Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Leseger¨at bei einer Anregungswellenl¨ange von 488 nm und Zwei-Kanal-Emission bei 520 nm (grun,
¨ lebend)
und 655 nm (rot, tot) ausgelesen. Durch Vergleich mit einer Standard-LebendigkeitsKurve (beschreibt die Beziehung zwischen den Verh¨altnissen grun/roter
¨
Fluoreszenzintensit¨aten und unterschiedlichen Verh¨altnissen lebender zu toter Zellen) konnte
das Verh¨altnis grun/rot
¨
fur
¨ jede Konzentration einer getesteten Substanz mit dem prozentualen Anteil lebender Zellen korreliert werden. Die Testung einer Substanz wurde
zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Aktivit¨at der getesteten Substanzen erfolgte durch Berechnung von ED50 -Werten (Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolation.
5.1.8.2 LIF-CE
200 µl einer Arzneistoff-behandelten Bakteriensuspension (Abschnitt 5.1.7.2.5) wurde
auf einen OD600 -Wert von 0.5 eingestellt, anschließend 1:100 verdunnt
¨
(ca. 106 Zellen/ml) und mit jeweils 1 µl von 0.033 mM SYTO9- und 20 mM PropidiumiodidLosung
¨
versetzt. Die Fluoreszenzmarkierung erfolgte fur
¨ 15 Minuten unter Lichtausschluss. Die markierten Bakterienproben wurden an der Anode der Kapillare injiziert
durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi fur
¨ eine Dauer von 10 s. Um die Peaks
der niedrig konzentrierten Bakterienproben fokussieren zu konnen,
¨
folgte der Probeninjektion eine zweite Injektion aus einer unmarkierten Bakteriensuspension hoher¨
8
er Konzentration (OD600 =0.5; d. h. ca. 10 Zellen/ml), ebenfalls durch Anlegen eines
Druckes von 0.5 psi fur
¨ 10 s. Die Elektropherogramme wurden mit einer Anregungs-
170
5. Experimenteller Teil
wellenl¨ange von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und 655 nm ausgelesen (siehe
Abschnitt 5.1.1.1). Die Auswertung der Elektropherogramme erfolgte durch Integration aller Signale im aufgezeichneten Zeitfenster und die Bestimmung der Zytotoxizit¨at
in Anlehnung an Abschnitt 5.1.8.1.
5.1.8.3 Mikrodilutionsverfahren
Die Bestimmungen der minimalen Hemmkonzentration mittels Mikrodilutionsverfahren fanden am Institut fur
¨ Molekulare Infektionsbiologie der Universit¨at Wurzburg
¨
statt. Es konnte auf ein etabliertes Testsystem, welches gem¨aß den DIN 58940-8 Richtlinien [2] unter leicht modifizierten Bedingungen durchgefuhrt
¨
wurde, zuruckgegrif¨
fen werden. Dazu wurden Kulturen aus der exponentiellen Phase mit Medium auf
eine Zelldichte von 2 x 107 Zellen/ml eingestellt. In Mikrotiterplatten erfolgte die Inkubation von 100 µl dieser Zellsuspension unter Zusatz von 100 µl einer serienm¨aßigen 2fach-Verdunnung
¨
einer antimikrobiellen Substanz in Kulturmedium, bei 37 ◦ C
fur
¨ 24 h. Die Verdunnungsreihe
¨
lag im Bereich 1 µg bis 32 µg. S. vestibularis wurde
in Todd-Hewitt-Bouillon (Oxoid, Basingstoke, England) mit 0.5 % Hefeextrakt und P.
fluorescens in konventioneller Muller-Hinton-Bouillon
¨
kultiviert. Der Test wurde mit
einem Mikrotiterplatten-Leseger¨at bei 550 nm ausgewertet und das Ergebnis als MICWert angegeben, d. h. der niedrigsten Konzentration, bei welcher nach einer Inkubationszeit von 24 h das Zellwachstum immer noch inhibiert war.
5.2 Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei
Die Etablierung des Testsystems auf Trypanosoma brucei brucei (T. b. b.) erfolgte im
Armauer-Hansen-Institut der Missions¨arztlichen Klinik. Alle Arbeitsschritte wurden
unter der Sterilbank (Hera soft, Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland) durchgefuhrt.
¨
5.2.1 Medium
5.2.1.1 Baltz-Medium-Basis-Losung
¨
Die zur Zellkultivierung eingesetzte MEM-Basis-Losung
¨
(+ Earle‘s-Reagenz, -L-Glutamin, 500 ml Flasche, Gibco, Karlsruhe, Deutschland) enthielt zur besseren visuel¨
len Uberpr
ufung
¨
einer intakten Zellkultur und Zelldichte Phenolrot als pH-Indikator¨
Zusatz. Bei zu hoher Zelldichte kommt es durch Ubers¨
auerung des Mediums, hervorgerufen durch eine zu hohe Konzentration verschiedener Stoffwechselprodukte
5.2 Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei
171
zum Absterben der Zellen. Der Zytotoxizit¨atstest wurde hingegen in Abwesenheit von
Phenolrot durchgefuhrt
¨
aufgrund der spektralphotometrischen Auswertung des Toxizit¨atseffektes. Zur Herstellung der Baltz-Medium-Basis-Losungen
¨
wurden die nachfolgenden Substanzen in 50 ml MEM-Medium (ohne Phenolrot bzw. mit Phenolrot)
gelost,
¨ der pH auf 7.5 eingestellt, anschließend der Ansatz steril filtriert und mit MEMMedium unter Zusatz von 5 ml nicht-essenzieller Aminos¨auren (NEAA, 100x, Gibco,
Karlsruhe, Deutschland) auf 500 ml erg¨anzt.
HEPES
Glukose-Monohydrat
Na-Pyruvat
Hypoxanthin
:
:
:
:
3g
500 mg
110 mg
7 mg
Thymidin
Adenosin
Bathocuproninsulfonat
L-Gluthamin
:
:
:
:
2 mg
10.7 mg
14.1 mg
146 mg
Alle Substanzen wurden von Roth, Karlsruhe, Deutschland bezogen. Die BaltzMedium-Basis-Losungen
¨
waren gelagert bei 5 ◦ C uber
¨
mehrere Wochen stabil.
5.2.1.2 Baltz-Medium zur Kultivierung
Das Baltz-Medium zur Kultivierung wurde nach folgender Vorschrift hergestellt:
Baltz-Medium-Basis-Losung
¨
β-Mercapto-Stammlosung
¨
Penicillin/Streptomycin*
Inaktiviertes fotales
¨
Rinderserum
:
:
:
:
40 ml
0.4 ml
0.4 ml
8 ml
Es sollte bei 5 ◦ C aufbewahrt nicht l¨anger als zwei Wochen verwendet werden.
Inaktiviertes fotales
¨
Rinderserum:
Das Rinderserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) war in 500 ml Flaschen erh¨altlich.
Es wurde steril filtriert in zehn 50 ml Plastikrohrchen
¨
aliquotiert und bei -30 ◦ C
aufbewahrt. Vor Gebrauch erfolgte nach Auftauen eines 50 ml Aliquotes bei 37 ◦ C
Inaktivierung des Rinderserums im Wasserbad bei 56 ◦ C fur
¨ 30 Minuten.
β-Mercaptoethanol-Stammlosung:
¨
β-Mercaptoethanol 50 mM* :
H2 O, bidestilliert, Ampuwa :
4 ml
6 ml
*Substanzen wurden von Biochrom, Berlin, Deutschland bezogen.
172
5. Experimenteller Teil
5.2.2 Parasitenkultur
5.2.2.1 Kultivierung
Trypomastigote Formen von Trypanosoma brucei brucei des Laborstammes TC 221 wurden in 5 ml Baltz-Medium in 25 cm3 Kulturflaschen mit luftdurchl¨assigem Schraubverschluss (Biochrom, Berlin, Deutschland) bei 37 ◦ C und 5 % CO2 kultiviert. Die w¨ahrend
des Wachstums der Parasitenkultur vermehrte Stoffwechselproduktion fuhrt
¨
zum Absterben der Zellen, so dass die Kultur im Abstand von 2 Tagen mit ca. 0.1 ml Zellkultur
in neues Medium uberimpft
¨
werden musste. Eine Erneuerung der Kultur erfolgte im
Abstand von 6 Monaten durch Auftauen und Anzuchten
¨
neuer Stabilate (Abschnitt
5.2.2.2). Dabei sollte darauf geachtet werden, dass die Zellkultur grundlich
¨
mit Medium (d. h. mindestens dreimal) gewaschen und restliches Glycerin aufgrund seiner toxischen Wirkung entfernt wird. Das Abdekantieren erfolgte durch Zentrifugation bei
3000 rpm fur
¨ 10 Minuten (Potanta TRC, Hettich, Kirchlengern, Deutschland).
5.2.2.2 Stabilate
Zur Herstellung der Stabilate wurde eine in der exponentiellen Phase befindliche Trypanosomenkultur durch Zentrifugation (Potanta TRC, Hettich, Kirchlengern, Deutschland) bei 3000 rpm fur
¨ 10 min pelletiert. Auf Eis gekuhlt
¨
wurde das Pellet in 90 %
Baltz-Medium und 10 % Glycerol aufgenommen, so dass sich eine Zellkonzentration
von 106 Trypanosomen/ml ergab. Diese Zellsuspension, Stabilat genannt, ist bei -80 ◦ C
uber
¨
mehrere Monate stabil. Ein Zellansatz wurde in 10 Eppendorf-Caps aliqotiert.
5.2.2.3 Zellkonzentration
Die Bestimmung der Zytotoxizit¨at an Trypanosomen erforderte eine Zellsuspension
von 105 Zellen/ml. Die Zelldichte und die notwendige Verdunnung
¨
der aktuellen Trypanosomenkultur wurde durch Ausz¨ahlung mittels Z¨ahlkammer nach Neubauer [23]
bestimmt. Dazu wurde die Z¨ahlkammer mit einem geschliffenen Deckglas pr¨apariert
und mit einer 100 µl Eppendorfpipette vorsichtig mit Zellkultur gefullt.
¨
Ausgez¨ahlt
wurde das rote Quadrat in der Mitte der Abbildung 5.3. Eine Zellzahl von zehn entsprach einer Trypanosomenkonzentration von 105 Zellen/ml.
5.2 Zytotoxizit¨atstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei
173
Abbildung 5.3: Z¨ahlkammer
nach Neubauer 4, modifiziert
nach [284]. Die Kammertiefe betr¨agt 0.100 mm. Die Netzteilung
dieser Kammer weist 3 mal 3
große Quadrate von je 1 mm2
Fl¨ache auf. Fur
¨ die Trypanosomenz¨ahlung wurde nur das
große, rot markierte Quadrat in
der Mitte verwendet.
5.2.3 Referenz- und Testsubstanzen
5.2.3.1 Stammlosungen
¨
Die Referenz- und Testsubstanzen wurden entweder in Wasser, DMSO oder Ethanol
gelost.
¨ Die Konzentration der Stammlosungen
¨
betrug dabei 10 mM. W¨assrige Losun¨
gen wurden mit Membranfiltern der Porengroße
¨
von 0.2 µm steril filtriert. Zur Verminderung des Aktivit¨atsverlustes durch Zersetzung der Proben empfiehlt sich eine
Lagerung bei -30 ◦ C. Die folgenden Substanzen wurden als Referenz-Substanzen zur
Etablierung des Testsystems eingesetzt.
Suramin-Na (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) : H2 O
Pentamidin-diisethionat (Aventis, Bad Soden, Deutschland) : H2 O
Melarsoprol (Aventis) : DMSO
Eflornithin-HCl (Aventis) : H2 O
Nifurtimox (Bayer AG) : DMSO
5.2.3.2 Arbeitslosungen
¨
Die Arbeitslosungen
¨
im Konzentrationsbereich 1 mM bis 100 pM (Arbeitslosungen
¨
18) ergaben sich aus den Stammlosungen
¨
durch serielle 1:10-Verdunnung
¨
mit BaltzMedium. Aufgrund der nachgewiesenen Toxizit¨at einiger Losungsmittel
¨
war darauf
174
5. Experimenteller Teil
zu achten, dass jede Verdunnung
¨
den gleichen Anteil Losungsmittel
¨
enthielt. Dazu
wurde die erste Verdunnungsstufe
¨
mit reinem Medium, alle weiteren mit Medium
unter Zusatz von 10 % Losungsmittel
¨
hergestellt. Unmittelbar vor der Testung wurden
200 µl jeder Verdunnung
¨
zubereitet.
5.2.4 AlamarBlue
AlamarBlue wurde als Resazurin-Natriumsalz von Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland bezogen. Es handelt sich dabei um die reduzierte Form des REDOXIndikators AlamarBlue. Fur
¨ die Anwendung im Zytotoxizit¨atstest wurden 11 mg
Resazurin-Na in 100 ml 0.9 % NaCl gelost.
¨ Bei 4 ◦ C aufbewahrt, war die Losung
¨
uber
¨
mehrere Wochen stabil.
5.2.5 Durchfuhrung
¨
des Zytotoxizit¨atstests
1
2
Blindneg.
wert
Kontrolle
A M: 180
M: 180
ML: 20
A1: 20
B
M: 180
ML: 20
M: 180
A1: 20
C
M: 180
ML: 20
M: 180
B1: 20
D
M: 180
ML: 20
M: 180
B1: 20
E
.
.
.
.
.
.
3
pos.
Kontrolle
M: 160
ML: 20
T: 20
M: 160
ML: 20
T: 20
M: 160
ML: 20
T: 20
M: 160
ML: 20
T: 20
.
.
.
4-11
Testsubstanz
100 µM - 10 pM
M: 160
A1: 20 - A8: 20
T: 20
M: 160
A1: 20 - A8: 20
T: 20
M: 160
B1: 20 - B8: 20
T: 20
M: 160
B1: 20 - B8: 20
T: 20
Substanz C
Tabelle 5.1: Pipettierschema des Zytotoxizit¨atstests an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei.
M=Medium; ML=Medium mit 10 % Losungsmittelanteil;
¨
T=Trypanosomensuspension (105 Zellen/ml);
A/B1-A/B8=Arbeitslosungen
¨
der Testsubstanzen A-B. Die Zahlen in der Tabelle sind in µl angegeben.
In 96-Mikrotiterplatten wurden 20 µl der Arbeitslosungen
¨
1-8 in 160 µl vorgelegtes Baltz-Medium pipettiert und anschließend 20 µl einer Trypanosomensus-
5.3 Berechnung von ED50 -Werten
175
pension der Konzentration 105 Zellen/ml hinzugefugt
¨
(Tabelle 5.1). Der Testbereich lag damit zwischen 100 µM und 10 pM mit einem Losungsmittelanteil
¨
von
1 %. Positiv(Trypanosomen in Baltz Medium mit 1 % Losungsmittel)¨
und Negativ(Testsubstanz in Medium ohne Trypanosomen zur Erfassung der Eigenabsorption)kontrollen wurden bei jedem Test zus¨atzlich inokuliert. Die Platten wurden anschließend bei 37 ◦ C in einer Atmosph¨are von 5 % CO2 fur
¨ 24 h inkubiert. Nach Zugabe von 20 µl steril filtriertem AlamarBlue in jede Vertiefung erfolgte erneute Inkubation. Nach einer Gesamtinkubationszeit von 48 h wurden die Platten durch Messung
der Lichtabsorption an einem MR 700 Mikrotiterplatten-Leseger¨at (Dynatech, Ruckers¨
dorf, Deutschland) bei einer Wellenl¨ange von 550 nm und einer Referenzwellenl¨ange
von 630 nm ausgelesen. Die Testung einer Substanz erfolgte als Doppelbestimmung
(siehe Pipettierschema) und wurde zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Aktivit¨at der getesteten Substanzen erfolgte durch Berechnung von ED50 -Werten (siehe
Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolation.
5.3 Berechnung von ED50-Werten
Die Auswertung des AlamarBlue-Testes auf Trypanosomen sowie der antibakteriellen Testung auf der Basis der SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung erfolgte uber
¨
die Bestimmung der ED50 -Werte mittels linearer Interpolation. Der ED50 -Wert definiert
diejenige Konzentration, bei der 50 % der maximalen Inhibition bzw. Toxizit¨at eintritt. Zu seiner Bestimmung war es zun¨achst notwendig bei jeder getesteten Konzentration einer bestimmten Substanz die beobachtete Zelldichte bzw. den prozentualen
Anteil lebender Zellen in Bezug auf die eingesetzten Positivkontrollen und StandardLebendigkeits-Kurven zu berechnen. Nach folgender Gleichung konnte daraus der
entsprechende ED50 -Wert ermittelt werden.
log(ED50 ) = log(x1 ) +
y1 − 0.5
(log(x2 ) − log(x1 ))
y1 − y2
(5.1)
mit
y1 :
x1 :
y2 :
x2 :
Bezuglich
¨
der getesteten absteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz,
der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der oberhalb 0.5 liegt.
Die zum Wert y1 gehorige
¨
Konzentration der Substanz.
Bezuglich
¨
der getesteten aufsteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz,
der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der unterhalb 0.5 liegt.
Die zum Wert y2 gehorige
¨
Konzentration der Substanz.
176
6. Zusammenfassung
Kapitel 6
Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden potenzielle Wirksubstanzen zur Behandlung trypanosomaler und bakterieller Infektionen gesucht. W¨ahrend auf dem Gebiet der Trypanosomiasis das Ziel in der Testung großer Substanzbibliotheken auf antitrypanosomale Wirkung und in der Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bestand, lag im
Bereich der bakteriellen Infektion der Schwerpunkt in der Entwicklung neuer Testmethoden.
Zu diesem Zweck wurde im ersten Teil der Arbeit mit dem AlamarBlue-Bioassay ein
In-vitro-High-Throughput-Screening-Verfahren zur antitrypanosomalen Aktivit¨atsbestimmung verschiedener Substanzklassen etabliert (Abschnitt 4.1). In der Gruppe der
Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) mit C,C-verknupfter
¨
Biaryl-Achse (Abschnitt
4.1.4.1.1) zeigten Dioncophyllin A (ED50 =3.4±1.7 µM), B (ED50 =2.6±0.4 µM) und C
(ED50 =4.2±2.3 µM) sowie das dimere Ancistrogriffithin A (ED50 =0.85±0.05 µM) die
st¨arkste Aktivit¨at gegen Trypanosoma brucei brucei und lagen damit im Wirkbereich
des Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM). Wie am Beispiel des unwirksamen dimeren Michellamin B mit sechs freien Hydroxy-Gruppen gezeigt werden konnte, war fur
¨ eine gute antitrypanosomale Wirksamkeit die begrenzte Anzahl phenolischer Gruppen
auf eine oder zwei maßgeblich. Untersuchungen am Isochinolin-Gerust
¨ ergaben, dass
unter diesen Bedingungen auch vereinfachte Analoga ohne Naphthalin-Einheit aktiv
sind. Mit Ancistrocladinium B, ein NIQ mit N,C-verknupfter
¨
Hetero-Biaryl-Achse (Abschnitt 4.1.4.1.2) konnte ein neuer in der antitrypanosomalen Aktivit¨at wirksamerer
Alkaloidtypus gefunden werden (ED50 = 0.35±0.02 µM). In dieser Gruppe zeigte sich
von phenyl- zu anthracensubstituierten Isochinolinen eine großere
¨
Wirksamkeit, die
sich durch zunehmende Lipophilie erkl¨aren ließ. Der Einfluss der Hydroxy-Gruppe
auf die antitrypanosomale Wirkung konnte auch am Beispiel der Fluorchinolone (Abschnitt 4.1.4.2) nachgewiesen werden. Fur
¨ wirksame Substanzen war somit auch das
Lipinski Kriterium [161] fur
¨ “drug-like”-Substanzen erfullt.
¨
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zum konventionell angewandten Mikrodilutionsverfahren nach DIN 58940-8 [2], alternative und erg¨anzende Methoden zur Be-
177
stimmung der antimikrobiellen Aktivit¨at potenzieller Wirksubstanzen entwickelt. Dazu wurde auf dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (CE) (Abschnitt 4.2) und der
magnetischen Kernresonanz (NMR) (Abschnitt 4.4) nach Methoden zur Beschreibung
von Bakterienkulturen gesucht und diese Zytotoxizit¨atsbestimmungen zug¨anglich gemacht.
Nach Entwicklung geeigneter CE-Bedingungen und Optimierung der Bakterienkulturen und deren Probenpr¨aparation konnte fur
¨ Pseudomonas fluorescens und Streptococcus vestibularis eine kapillarelektrophoretische UV-Methode mit guter Pr¨azision, Selektivit¨at, Spezifizit¨at und Linearit¨at etabliert werden. Sie erlaubte die Trennung verschieden großer Agglomerate und Ketten und die Erstellung charakteristischer Fingerabdrucke.
¨
Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid, den beiden Fluoreszenzmarkern im “LIVE/DEAD BacLight viability kit”, ermoglichte
¨
mittels LIF-CE
die Konstitution der Bakterienkulturen zu untersuchen. Die beiden Nucleins¨aurebindenden Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden sich in ihrer Eigenschaft in gesunde Zellen einzudringen, wodurch eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen moglich
¨
wird: SYTO9 f¨arbt alle Zellen grun,
¨ Propidiumiodid f¨arbt alle
Zellen mit besch¨adigter Membran rot. Die Aufzeichnung mikrobieller Elektropherogramme im Zwei-Kanal-Modus mittels LIF-Detektion ermoglichte
¨
das Verh¨altnis lebender zu toter Zellen mit charakteristischen elektrophoretischen Profilen zu korrelieren. Mit dieser neuen LIF-CE Methode, die erst durch Nachinjektion unmarkierter Bakterienzellen als “stacking front” moglich
¨
wurde, konnte die Tendenz der mi¨
krobiellen Kettenbildung und die Anderung
des lebend/tot-Verh¨altnisses der Bakterienkultur in Gegenwart unterschiedlicher Antibiotikakonzentrationen direkt beobachtet werden. Mit Hilfe der Korrelation des grun/rot-Fluoreszenzverh¨
¨
altnisses mit
dem prozentualen Anteil lebender Zellen wurden fur
¨ Arzneistoff-exponierte Bakterienkulturen Dosis-Wirkungs-Diagramme erstellt und die entsprechenden ED50 Werte berechnet. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurden die ED50 -Messung auch am
Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at (FMR) durchgefuhrt
¨
und ebenso die entsprechenden MHK-Werte mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren nach DIN bestimmt. Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und Vancomycin-HCl zeigten fur
¨ die fluorimetrischen Methoden als auch fur
¨ das Mikrodilutionsverfahren vergleichbare Ergebnisse.
Die fluorimetrischen Verfahren ermoglichten
¨
eine schnelle Differenzierung zwischen
zytostatischer und zytotoxischer Wirksamkeit, was mittels Mikrodilutionsverfahren
nicht moglich
¨
ist.
Mittels NMR konnte bei 17.6 Tesla im Bildgebungsexperiment gezeigt werden, dass
sich die transversale Relaxation T2 gut zur Beschreibung der Bakterienproliferation
verschiedener Anaerobier eignet. Der Parameter T2 , welcher durch den chemischen
¨
Austausch beeinflusst wird, erfasst dabei das Mittel aller wachstumsbedingten Anderung in der Zellkultur. Durch N¨ahrstoffverzehr, Metabolitenproduktion und steigen-
178
6. Zusammenfassung
der Zelldichte a¨ ndern sich sowohl Zusammensetzung und Konzentration des Mediums als auch der pH-Wert, die Ionenst¨arke und die Viskosit¨at. Zur Aufkl¨arung der einzelnen Beitr¨age und des Zusammenhangs zwischen Zellproliferation und T2 wurden
am Beispiel der Bakterien-Spezies Streptococcus vestibularis 1 H-NMR-Spektren von Bakterienkulturen unterschiedlicher Wachstumsstadien mit den extrazellul¨aren Parame¨
tern T2 , OD600 und pH korreliert. Dabei konnten N¨ahrstoffverzehr und pH-Wert-Anderung durch Metabolitenproduktion als Hauptursachen fur
¨ die T2 -Parameterisierung
der Zellproliferation identifiziert werden. Die Bildgebung erlaubte die Aufzeichnung des zeitlichen T2 -Verlaufes mehrerer Bakterienproben simultan. Aus den T2 Wachstumskurven der Streptococcus-Spezies ließ sich in Gegenwart unterschiedlicher
Vancomycin-Konzentrationen der MHK-Wert des Antibiotikums zu 0.33±0.08 µM bestimmen. Er stand in gutem Einklang mit dem Ergebnis aus dem konventionellen Mikrodilutionsverfahren nach DIN (MHK=0.7 µM), der LIF-CE- (ED50 = 0.24±=0.07 µM)und der FMR- (ED50 =2.4±0.7 µM) Methode.
179
Kapitel 7
Summary
The purpose of this investigation was the search for new potential drugs for treatment of trypanosomal and bacterial infections. According to trypanosomiasis, this study aimed at screening large compound libraries for their antitrypanosomal activity
and analyzing structure activity relationships. In the field of bacterial infections the
development of new screening methods was of main interest.
In the first part of this thesis (Section 4.1) the AlamarBlue assay was established.
The assay showed great potential for the determination of drug sensitivities of African trypanosomes in vitro and was suitable for high-throughput-screening of different
compound classes. At first the series of naphthylisoquinolin alkaloids (NIQs) having
a C,C-biaryl-axis (Section 4.1.4.1.1) were tested against Trypanosoma brucei brucei. The
most active compounds of this NIQ-class were Dioncophyllin A (ED50 =3.4±1.7 µM),
B (ED50 =2.6±0.4 µM), and C (ED50 =4.2±2.3 µM), and the dimeric Ancistrogriffithin A
(ED50 =0.85±0.05 µM). Their ED50 values were in the same range of inhibition concentration as Nifurtimox (ED50 =3.4±0.4 µM). Michellamin B which consists of two identical naphthylisoquinoline portions including six free hydroxy functions was inactive.
Thus, for good antitrypanosomal potency, the number of phenolic hydroxy functions
has to be limited to one or two. Under these circumstances even some naphthalene-free
tetrahydroisoquinolines were active to some extent. Ancistrocladinium B, a representative of the novel-type N,C coupled NIQ alkaloid with hetero-biaryl-axis exhibited significantly higher antitrypanosomal activities (ED50 = 0.35±0.02 µM) (Section 4.1.4.1.2).
Investigations of this novel-type alkaloid showed an increase in efficiency when going
from phenyl to anthracen substituted isoquinolines which is probably evoked by the
increase in the lipophilic character of the compounds. The influence of the hydroxygroup on the potency was also verified for fluoroquinolones by structure-activity relationship (Section 4.1.4.2). Thus, for potent compounds the Lipinski’s criterion [161] for
drug-like compounds was met as well.
Further aim of this thesis was to find alternative and adjunct methods to the broth
microdilution test according to DIN 58940-8 [2], which is conventionally used for the
180
7. Summary
determination of the antibacterial activity of potential drugs. Therefore novel methods
were developed based on capillary electrophoresis (CE) (Section 4.2) and nuclear magnetic resonance (NMR) (Section 4.4), which were suitable for the description of cell
cultures and could be employed for activity screening.
Having developed suitable CE-conditions, and optimized bacterial cultures and sample preparation a reliable CE-method was established for the bacterial strains Streptococcus vestibularis and Pseudomonas fluorescens. The method was performed by UV
detection and showed good precision, selectivity, specificity, and linearity. It allowed
for separation of microbial agglomerates and chains of different size, and was used to
create characteristic fingerprints.
Staining bacteria by using the LIVE/DEAD BacLight viability kit the constitution of a
bacterial population could be examined by means of LIF-CE. The kit consists of the two
fluorescent nucleic acid stains SYTO9 and propidium iodide, which differ in their ability to penetrate healthy cells making a distinction between live and dead cells possible:
SYTO9 stains all cells green, propidium iodide stains cells with damaged membrane
red. Monitoring electropherograms of bacterial samples by dual LIF detection, the ratio
of live to dead cells was correlated with the electrophoretic profile. Therefore, the new
LIF-CE method, based on the use of a second unlabeled bacteria injection as a stacking
front, allowed for the direct observation of the tendency of chain formation and alterations in the live/dead ratio of the bacterial composition in presence of different
antibiotics. By correlation of the ratio of green and red fluorescence with the percentage of live cells dose response curves of drug-treated bacterial samples were calculated,
which allowed for the assessment of ED50 values. To verify the results the determination of the antibacterial activity was repeated by fluorescence microplate reader (FMR)
measurements and broth microdilution method. For ciprofloxacin, ampicillin-Na, and
vancomycin-HCl similar results were obtained for each of the three methods. The fluorometric methods allowed for a rapid differentiation between cytostatic and cytotoxic
efficiency, which was previously not possible with broth microdilution.
Using NMR experiments, it was shown by magnetic resonance imaging (MRI) at 17.6 T
that the transverse relaxation T2 is suitable for the description of anaerobical, bacterial
proliferation. The parameter T2 , which is influenced by chemical exchange, is sensitive
to all variations of the bacterial culture. Consumption of the medium, metabolism, and
varying cell density change the composition and the concentration of medium as well
as pH, ionic strength and viscosity. To establish the dependence of T2 on cell proliferation 1 H NMR spectra of Streptococcus vestibularis samples of different growth stages
were correlated with the extracellular parameters T2 , OD600 , and pH. The consumption of medium and the pH-variation evoked by the production of metabolites during
cell growth were identified to be the basis for the successful parametrization of cell
growth by T2 . MRI allowed for measuring growth curves on the basis of T2 of several
181
bacterial cultures simultaneously. From T2 -growth curves of Streptococcus vestibularis in
the presence of varying concentrations of vancomycin, MIC of the antibiotic could be
determined to be 0.33±0.08 µM. This value was in good agreement with the results obtained by conventional broth microdilution (MIC=0.7 µM), LIF-CE- (ED50 = 0.24±0.07
µM), and FMR- (ED50 =2.4±0.7 µM) method.
182
A. Abkurzungsverzeichnis
¨
Anhang A
Abkurzungsverzeichnis
¨
AATF
ADME
BHI
CA
CE
CEC
CFU
CGE
CIEF
CITP
COMP
COSY
CPMG
CZE
D
DNDi
DMFO
DSMZ
EC50
ED50
EMEA
EOF
FDA
FID
FMR
FQRP
FRET
HAT
Antimicrobial Availability Task Force
Adsorption, Distribution, Metabolismus und Elimination
Brain-Heart-Infusion
Community-acquired, ubiquit¨ar auftretend
Kapillarelektrophorese
Kapillarelektrochromatographie
Colony forming units, koloniebildende Einheiten
Kapillargelelektrophorese
Kapillar-Isoelektrische Fokussierung
Kapillarisotachophorese
Committee for Orphan Medicinal Products
COrrelation SpectroscopY
Carr-Purcell-Meiboom-Gill
Kapillarzonenelektrophorese
Diffusionskoeffizient
Drugs for Neglected Diseases Initiative
Eflornithin, Difluormethylornithin
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
Effective concentration, 50 %
Effective dose, 50 %
European Medicines Agency
Elektoosmotischer Fluss
Food and Drug Administration
Free induction decay
Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Leseger¨at
Fluorchinolon-resistenter Pseudomonas aeruginosa
Fluorescence resonance energy transfer
Human African Trypanosomiasis
183
HA
HTS
IC50
IC
ICH
IDSA
IOWH
ISC
IUPAC
LDL
LIF
LIF-CE
LPS
MEKC
MIC
MMV
MRI
MRS
MRT
MRSA
MTC
NIQ
NMR
OD
ODC
OM
PEO
PGSE
ppm
PPP
PRSP
PD-PPP
REDOX
RFU
ROI
SAR
SOD
SW
T
Hospital-acquired, nosokomial
High-throughput-screening
Inhibitory concentration, 50 %
Internal conversion
International Conference of Harmonization
Infectious Diseases Society of America
Institute for One World Health
Intersystem crossing
International Union of Pure and Applied Chemistry
Low density lipoprotein
Laser-induzierte Fluoreszenz
Kapillarelektrophorese mit Laser-induziertem-Fluoreszenz-Detektor
Lipopolysaccharide
Mizellare elektrokinetische Chromatographie
Minimum inhibitory concentration
Medicines for Malaria Venture
Magnetic resonance imaging
Magnetic resonance spectroscopy
Magnetic resonance tomography
Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
Magnetisierungstransferkontrast
Naphthylisochinolin-Alkaloide
Nuclear magnetic resonance
Optische Dichte
Ornithin-Decarboxylase
Outer membrane
Poly(ethylen)oxid
Pulsed-field-gradient-spin-echo
Parts per million
Public-private-partnership
Penicillin-resistenter Streptococcus pneumoniae
Public-private-partnerships for product development
Reduktion-Oxidation
relative fluorescence unit
Region of interest
Structure activity relationship, Struktur-Wirkungs-Beziehungen
Superoxid-Dismutase
Bandbreite
Tesla
184
T1
T2
T. b. b.
TBE
TD
TMS
VRE
WHO
A. Abkurzungsverzeichnis
¨
longitudinale Relaxation
transversale Relaxation
Trypanosoma brucei brucei
Tris-Borat-EDTA
Time domain
Tetramethylsilan
Vancomycin-resistenter Enterococcus
World Health Organization
185
Anhang B
Prozessierung der Rohdaten
Mit nachfolgendem MATLAB-Code wurde aus den Multispin-Images T2 von jedem Pixel durch Anfitten des Intensit¨atsverlaufs an eine Monoexponentialfunktion berechnet
und T2 -Karten erstellt.
clear all;
patient_name = ’T2_va060305’;
scan_number = [3:134];
verz=’va060305.Ar1’;
%vez=’mo04-10-11’;
path=strcat(’/mamba/q_home/vahoerr/Daten/’,verz,’/’);
directory=’/mamba/q_home/vahoerr/Ergebnisse/’;
processed_data_directory = strcat(directory,’/’);
l=size(scan_number)
%clear all;
for u=1:l(2);
s=scan_number(u);
ordner=num2str(scan_number(u));
full_path=strcat(path,ordner)
cd(full_path);
% read TE values
pvm = read_acqp(’method’);
TE = read_acqp_value(pvm, ’$PVM_EchoTime=’);
TE_value = str2num(TE);
186
B. Prozessierung der Rohdaten
% read number of echo images
number_of_echo_images_str =
read_acqp_value(pvm, ’$PVM_NEchoImages=’);
number_of_echo_images = str2num(number_of_echo_images_str);
echo_times = TE_value*(1:number_of_echo_images)’;
% read NA
acqp = read_acqp(’acqp’);
n_avg = read_acqp_value(acqp, ’$NA’);
% read number of slices
number_of_slices = read_acqp_array(pvm,’$PVM_SPackArrNSlices’);
process_number=’1’;
% read matrix size
filename_reco = strcat(full_path,’/pdata/’,process_number,...
’/reco’);
reco = read_acqp(filename_reco);
matrix_size = read_acqp_array(reco,’$RECO_ft_size=’);
%t=echo_times
t=echo_times(2:64);
clear bild;
clear t2;
tic
for slice = 1:number_of_slices;
dateiname = strcat(full_path, ’/pdata/’,process_number,...
’/2dseq’);
bild = read_2dseq(matrix_size(1),matrix_size(2), ...
number_of_echo_images*number_of_slices, ...
(slice-1)*number_of_echo_images+1:slice*....
number_of_echo_images, dateiname, ’l’);
max_signal_int = max(max(max(bild)));
for kx=1:matrix_size(1);
[slice kx];
187
for ky=1:matrix_size(2);
signalint = reshape(bild(:,kx,ky),...
number_of_echo_images,1);
end
end
end
for k=1:64;
for kk=1:64;
[k kk];
data = bild([2:1:64],k,kk);
if data(1) > 3000;
[k kk];
options = optimset(’Display’,’off’,’MaxIter’,
1000, ’MaxFunEvals’, 1000);
[y err] =fminsearch(’t2fit_2’,[data(1) 100],options,...
t , data );
t2(k,kk)=y(2);
Mo(k,kk)=y(1);
err;
error(k,kk)=err;
end
end
end
toc
write_verzeichnis = strcat(processed_data_directory,...
patient_name, ’/’);
cd(processed_data_directory);
if (exist(patient_name) ˜= 7)
mkdir(patient_name);
end
datei1 = strcat(write_verzeichnis,’t2_’,ordner);
datei2 = strcat(write_verzeichnis,’bild_’,ordner);
save(datei1,’t2’);
save(datei2,’bild’);
end
188
C. Region of Interest (ROI)
Anhang C
Region of Interest (ROI)
Zur Definition der ROIs wurde der nachfolgende MATLAB-Code verwendet.
clear all;
patient_name = ’T2_va060320.AG1’;
scan_number = [126:243];
proben=17;
teil=’1’;
t=[0:12:1404];
directory=’/mamba/q_home/vahoerr/Ergebnisse’;
directory1 = strcat(directory,’/’);
directory2 = strcat(directory1,patient_name,’/’);
cd(directory2);
l=size(scan_number)
m=zeros(proben,l(2));
st=zeros(proben,l(2));
w=1;
s=scan_number(w);
ord=num2str(scan_number(w))
datei1 = strcat(’t2_’,ord,’.mat’)
load(datei1);
imagesc(t2)
189
for k=1:proben,
w=1;
s=scan_number(w);
ord=num2str(scan_number(w));
datei1 = strcat(’t2_’,ord,’.mat’)
load(datei1);
datei1
size(t2)
maske=roipoly;
size(maske)
for z=1:l(2),
ord2=num2str(scan_number(z));
datei2 = strcat(’t2_’,ord2,’.mat’);
load(datei2);
myS = size(maske)
t3 = t2(1:myS(1),1:myS(2));
clear t2
t2 = t3;
if size(t2,1)>116
t2=t2(1:116,:);
end
roi=maske.*t2;
m(k,z)=mean(roi(roi>0));
st(k,z)=std(roi(roi>0));
end
end
m
st
directory4=strcat(’t2_std’,teil);
cd(directory2)
if (exist(directory4)˜=7)
mkdir(directory4)
end
directory3=strcat(directory2,’t2_std’,teil,’/’);
datei6=strcat(directory3,’m’);
190
datei7=strcat(directory3,’st’);
datei8=strcat(directory3,’t’);
save(datei6,’m’)
save(datei7,’st’)
save(datei8,’t’)
C. Region of Interest (ROI)
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214
215
Danke
Zum Schluss mochte
¨
ich mich bei all den Pharmazeuten, Chemikern, Physikern,
Medizinern und Biologen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben. Mein besonderer Dank gilt:
Professor Dr. Ulrike Holzgrabe fur
¨ die Betrauung mit diesem interdisziplin¨aren Thema,
die wissenschaftlichen Freiheiten, die Bereitschaft zur freien Zeiteinteilung, wodurch mein
Zweitstudium der Physik m¨oglich wurde und fur
¨ ihre Unterstutzung
¨
meiner Zukunftspl¨ane.
Professor Dr. Peter Jakob fur
¨ seinen Pragmatismus, der das Leben um so vieles leichter
macht und fur
¨ die Erstellung des Zweitgutachtens.
Professor Dr. Tanja Schirmeister fur
¨ die gute Zusammenarbeit bei der Betreuung des
zweiten Semesters und bei unserem gemeinsamen Projekt zur Auffindung neuer Leitstrukturen gegen die Afrikanische Trypanosomiasis, ihre stets aufmunternden Worte
zur richtigen Zeit und fur
¨ ihre Hilfe bei der Realisierung meiner zukunftigen
¨
Projekte.
PD Dr. Wilma Ziebuhr, Dr. Svetlana Kozitskaya und Elena Katzowitsch fur
¨ die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen verschiedener Antibiotika mittels Mikrodilutionsverfahren und fur
¨ die Diskussionen zum Thema mikrobieller Testverfahren.
PD Dr. Michael Steinert und Dr. Markus Wehrl fur
¨ hilfreiche Diskussionen rund um
die Mikrobiologie.
Dr. Cornelius Faber, Dr. Martin Horstmann und Kerstin Hoffmann fur
¨ die Ermogli¨
chung des Bakterien-Projektes mittels magnetischer Kernresonanz.
Dr. Curd Schollmayer fur
¨ die Hilfe bei der Messung der NMR-Spektren.
Dem Missions¨arztlichen Institut insbesondere Professor Dr. Klaus Fleischer, PD Dr.
August Stich, Andreas Fabrizius, Silvia Miksch und Hanne Fleischmann fur
¨ die zahlreichen Gespr¨ache und Vortr¨age, die mir einen Einblick in die Tropenmedizin gaben;
Melanie Glaser fur
¨ ihre Hilfe bei der Testung an Trypanosoma brucei brucei; und Andrea
Roggers und Daniela Heuer fur
¨ ihre logistische Unterstutzung.
¨
PD Dr. Dietmar Steverding fur
¨ seine elektronische Pr¨asenz im fernen Norfolk und die
vielen Tipps und Tricks im Umgang mit Trypanosomen.
Professor Dr. Simon Croft, Dr. Vanessa Yardley, Howard Kendrick and Lauren
Rattrey fur
¨ die freundliche Aufnahme in ihren Arbeitskreis w¨ahrend meines For-
216
schungsaufenthaltes in London und das Lehren des Umgangs mit humanpathogenen
Trypanosomen-St¨ammen.
Den Professoren Dr. Chris Curtis und Dr. Jill Curtis fur
¨ ihre Gastfreundschaft in London.
Dr. Peer Lobmann
¨
und Holger Friedrich fur
¨ die Ermoglichung
¨
der rheologischen Untersuchungen polymerer PEO-Losungen.
¨
Den Arbeitskreisen Professor Dr. Dr. h.c. Gerhard Bringmann und Professor Dr. Reinhold Tacke fur
¨ die Zusammenarbeit bei der Suche nach neuen Leitstrukturen gegen
die Afrikanische Trypanosomiasis in der Gruppe der Naphthylisochinolin-Alkaloide
und der Siliziumverbindungen.
Dem AK Ho und der EP5 fur
¨ die abwechslungsreichen und lustigen letzten Jahre, insbesondere dem CE-Team: Susanne Kopec, Alexandra Deubel, Stefanie Laug und Christine Weber und meinen Buro-Kollegen
¨
in EP5: Volker Sturm, Florian Schmid, Jochen
Lorenscheid, Gert Schneider und Dr. Gerd Klug.
Und das Beste kommt immer zum Schluss, dem harten Kern: Cat, Schnurff, Igel, Boppi
¨
und M¨auserich.

Salzburger Woche / Flachgauer Nachrichten

LITERATUR UND WISSEN Was veranlasst jemanden, sich - TUHH

Programm - Mathematikzentrum

Zur zwelten Auflage Buttellitedle "Flugprinolp". VOIl Carl Buttenstedt`s

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Blatt 10

Die Rallye Le Jog gilt nach wie vor als ulti- mativer Hartetest - an

Bibliographie

Seminar - Mathematisches Institut der Universität Heidelberg

Dänischer Spring Cup 2015 für Tandemteams