Microscopie confocale Responsable : Anne Cantereau Formation des utilisateurs – 17 novembre 2014 Faisceau lumineux Réflexion Photons réfléchis Echantillon Photons émis Photons transmis Transmission Fluorescence Lampe halogene Cellules végétales transmission 70µm •Fond clair •Contraste de phase •Contraste interférentiel Levures réflexion Lampe ARC ou LASER Feuille de magnolia (dessus) Lampe ARC ou LASER fluorescence Transmission Fluorescence Contraste +++ Résolution spatiale 1) Excitation laser (lumière focalisée) 2) Objectif à grande ouverture numérique (grand angle) 3) Iris confocal (= pinhole) Image confocale ~ coupe optique Limite de résolution XY ~ 0.2µm Limite de résolution XZ ~ 0.4µm Déplacement vertical de l’objectif Olympus - FV1000 4 lasers excitation : -Argon : 488nm (GFP) 458 et 515 (CFP/YFP) -HeNe 543nm -HeNe 633 -Diode 405nm : Imagerie ou FRAP 3 détecteurs de fluorescence + 1 détecteur de transmission Chambre thermostatée et régulée en CO2 Relativement facile en 4 couleurs x200 Cellules neurales Coupe de feuille x1000 Levures Bactéries Mosaïque avec l’objectif x40 Fibres de cellulose en solution Cheveu Microscopie confocale en réflexion Imagerie des cellules vivantes Andor – revolution system 4 lasers excitation : -405nm -488nm -560nm -640 nm Spinning disk Module FRAP Caméra NB haute sensibilité 512x512 Tourelle objectif piezzo électrique Platine motorisée : mémorisation positions XY Chambre thermostatée et régulée en CO2 Racine – STP7 Imagerie des cellules vivantes Migration cellulaire Imagerie des cellules vivantes Migration cellulaire FRAP : fluorescence recovery after photobleaching Acquisition des images à 488nm photoblanchiement Bleach (diode 405nm) Intensité de fluorescence 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 10 12 14 8 Temps (sec) 16 18 20 Imaris v7.3 (Bitplane) -visualisation 3D -mesures en 3D -tracking -colocalisation Huygens (SVI) -déconvolution ImageJ Imaris - Module tracking Billes fluorescentes de 0,1µm Objectif x60 oil NA 1.4 Avant déconvolution Après déconvolution Huygens (SVI) -déconvolution Huygens (SVI) -déconvolution Image J Calcul du nombre de cellules Identification des plages de cellules vertes Comptage des vésicules rouges /pop cellules +- vertes/nombre de cellules Image J Kymographe time StackReg + Stackdifference MIP Image J Stackreg MIP MIP
© Copyright 2024 ExpyDoc
