CELLULES SOUCHES DU LIMBE CORNEEN Thérapie cellulaire des déficits chroniques de l’épithélium cornéen PHYSIOLOGIE La cornée (1) Rôle mécanique: Continuité anatomique du globe oculaire Un tissu est un groupement de cellules et matrice extracellulaire spécialisé dans une même fonction. Protection des structures internes Resistance aux forces de cisaillement et compression Maintiens de la PIO (élasticité, évacuation de l’humeur aqueuse) Rôle optique: Lentille convergente (2/3 du dioptre oculaire) Filtre UV (280-300 nm) Rôle de défense: Lysozyme et IgA du film lacrymal N Builles BDT 2012 3 La cornée (2) Epithélium •Avasculaire Membrane de Bowman •Innervation importante Stroma antérieur (120 µm) •Immunité régulée Dermatan sulfate peu hydrophile (décorine) Stroma postérieur Keratans sulfates très hydrophiles (lumican, keratoncan, mimecan) Lamelles cornéennes, SEM. (Meek KM, 2005). Fibre de collagène hétérotypique I/V Membrane de Descemet 100 µm Endothélium N Builles BDT 2012 4 Ultrastructure du stroma cornéen Fibre hétérotypique I/V Coll I-V D (nm) en TEM Sp (nm) 25-35 59 Interactions des principaux éléments de la matrice extracellulaire de la cornée : Le collagène I assure les fonctions mécaniques et physiologiques. Sa croissance en longueur n’est pas régulée. Sa croissance en épaisseur est limitée par la partie NH2-terminale du collagène V. Son espacement est régulé par le collagène VI, les protéoglycannes, les collagènes XII et XIV et le taux d’hydratation. N Builles BDT 2012 5 L’épithélium cornéen (I) • • Epithélium pavimenteux stratifié en 5 à 7 couches cellulaires Fonctions: - Protection du stroma (partie optique) - Etalement du film de larmes - Barrière aux germes et particules • Renouvellement: à partir des CSL: différentiation centripète et lors de la stratification, renouvellement 9 à 12 mois Cellules superficielles Cellules intermédiaires Cellules basales 40 µm N Builles BDT 2012 6 L’épithélium cornéen (II) • Membrane basale: Coll-IV, système laminine (5-332)/intégrines α3β1, α6β4, héparans sulfates Rôle dans la prolifération, différentiation, migration des cellules épithéliales • Cellules basales: cellules adhérentes polarisées (18 x10 µm) Subit des forces abrasives importantes: fixation des cellules basales par des hémidesmosomes fixés à des plaques d’ancrage et à la membrane de Bowmann. Desmosomes et gap jonctions nombreuses avec les cellules basales adjacentes Expression: p63, 14-3-3σ • Cellules intermédiaires: cellules adhérentes polarisées Riches en kératine avec de nombreux desmosomes Expression: K3/K12, 14-3-3σ • Cellules superficielles: cellules adhérentes modifiées (4 x 40 µm) Couche la plus externe sans noyau, membrane cellulaire jouent un rôle barrière: desmosomes ceinturant (résistance), tight junctions (imperméabilité) obligeant les molécules à un passage intra cytoplasmique Membrane cellulaire modifiée avec microplis et microvillosités riches en glycocalix pour l’ancrage du film de larmes (mucines etc..) N Builles BDT 2012 7 Le limbe cornéen (1) ad s s i Pal N Builles BDT 2012 ogt V e es d 8 Le limbe cornéen (2) •Défini par une structure anatomique, les palissades de Vogt •Les palissades constituent le microenvironnement (nutrition, protection, maintiens de la non différentiation) des CSL M. Notara,A. J. Shortt, A. R. O’Callaghan, J. T. Daniels, The impact of age on the physical and cellular properties of the human limbal stem cell niche, Age, 2012 (15). •La profondeur et la richesse des palissades sont très variables d’un individu à l’autre et sont fonction de l’âge L’anatomie des palissades évolue avec l’âge N Builles BDT 2012 9 Microenvironnement des CSL •Vascularisé •Immunogène •Complexe: 4 interfaces: - cornée / sclère - cornée / res. trabéculaire - cornée / iris - larmes / humeur aqueuse / mucus conjonctivoscléral N Builles BDT 2012 10 Les cellules souches limbiques (CSL) CELLULES SOUCHES ADULTES 1- Cellules à cycle lent in vivo 2- Peu différentiées avec cytoplasme primitif (granulosité faible) 3- Grande stabilité du génome durant la réplication 4- Capacité de prolifération sans maturation (division asymétrique) 5- Génération de types cellulaires différentiés spécialisés 6- Grande capacité de multiplication IDENTIFICATION • Pas de marqueurs spécifiques • Une combinaison de caractéristiques: • petites cellules ( <10 µm), rapport N/C élevé • cycle lent: retiennent les marquages 3H-thymidine et BrdU (5-bromo, 2’-deoxyuridine) • potentiel clonogénique: holoclones • absence de marqueurs de différentiation: kératine 3/12, Cx43, 14-3-3σ • présence de marqueurs dits « de cellules souches » : •p63∆Nα •ABCG2 / SP •Autres ? (kératine 19, α-enolase,….) N Builles BDT 2012 11 Différentiation des CSL CELLULES SOUCHES ADULTES DIVISION SYMETRIQUE Cellules à cycle lent Rôle: Renouvellement du pool de CSL CSL CSL CSL CSL LA DIFFERENTIATION DES CAT EST UN PROCESSUS UNIDIRECTIONNEL CAT Première CAT (eCAT) sort de la niche des CSL (17-25µm/24h) 1 à 4 divisions CAT CSL Cellules à cycle lent Rôle: produire une CAT DIVISION ASYMETRIQUE Cellules à cycle rapide Rôle: proliférer CAT CELLULE EPITHELIALE CORNEENNE (Basale) VOIE DE DIFFERENTIATION N Builles BDT 2012 12 Différentiation de l’épithélium cornéen Cornée Sclère Cellules souches limbiques: holoclones, p63∆Nα, Κ19, ABCG2 Cellules amplificatrices transitoires: mero/paraclones, p63∆Nβ/γ, Κ19 Cellules différenciées: paraclones, K3, 14−3−3σ Hématoxiline phloxine safran N Builles BDT 2012 100 µm 13 INGENIERIE EXTRACTION N Builles BDT 2012 15 Méthodes d’extraction non enzymatiques • Méthodes non enzymatiques: méthode des explants – Pas d’extraction. – Découpe chirurgicale de la zone limbique et mise en culture. Les cellules sortent et se divisent sur le support de culture. M Iwata , N Fushimi , Y Suzuki , M Suzuki , T Sakimoto , M Sawa Intercellular adhesion molecule-1 expression on human corneal epithelial outgrowth from limbal explant in culture Br J Ophthalmol 2003;87:203-207 doi:10.1136/bjo.87.2.203 N Builles BDT 2012 16 Méthodes d’extractions enzymatiques DISPASE Mécanisme d’action: protéase neutre qui romps les liaisons : - laminine 5 / fibronectine - collagène IV - collagène I Avantages: conserve intact les desmosomes, donc l’intégrité du feuillet épithélial Inconvénients: détruit la lame basale de l’épithélium TRYPSINE –EDTA Mécanisme d’action: enzyme protéolytique qui romps les liaisons Arg- et Lys- . Associée à l’EDTA qui complexe le Calcium et romps les liaisons Ca – dépendantes Avantages: • Mise en suspension des cellules • Rendement d’extraction et viabilité > dispase si bien utilisée • Meilleure accroche à un support de culture Inconvénients: • non spécifique, peut altérer des marqueurs de surface cellulaire • Viabilité des cellules inversement proportionnelle à la durée de contact • Contamination par cellules fibroblastiques N Builles BDT 2012 17 Méthode d’extraction à la Trypsine La surface réduite de la cornée par rapport à d’autres tissus (peau, œsophage…) conduit à un faible nombre de cellules extraites • • • Dissection du limbe au scalpel Elimination du maximum de stroma cornéen Elimination du maximum de partie sclérale Contamination fibroblastique Contamination épithélium scléral • Trypsine EDTA: extraction fractionnée 4 x 20 minutes Peu de cellules extraites: 20.000 à 100.000 – Déterminer le % de cellules ABCG2+ – Démontrer la présence d’une SP – Démontrer la présence en culture des clones Rabotage enzymatique, protection des cellules Méthode Nombre moyen de cellules extraites (n=18) CFE% moyen (n=15) TC moyen (n=15) TRYPSINE EDTA 20564 10,8 1,1 DISPASE 7600 5,3 1,2 Rose S, Sélection d'une méthode d'extraction de CSL, 2008 N Builles BDT 2012 18 CONTROLE N Builles BDT 2012 19 Caractérisation des CSL • • Méthode des cultures en dilution limite (potentiel clonogénique) Holoclone: capable de générer un feuillet cellulaire différencié complet, capacité proliférative important (jusqu’à 160 divisions) - grande colonie - contour régulier, circulaire, lisse - très petites cellules concentrées en périphérie de la colonie - colonie stratifiée avec grosses cellules différentiées en superficie • Meroclone: type intermédiaire, réservoir des paraclones - colonie de taille intermédiaire - contours sinueux • Paraclone: génèrent des colonies avortées (capacité proliférative env. 15 divisions) - petite colonie - irrégulières - couche de cellules larges, aplaties, différentiées N Builles BDT 2012 20 Potentiel clonogénique Conditions de culture standardisée: 14 jours, sur couche nourricière, fixation au 14eme jour à la Rhodamine B Cellule souche limbique adulte 10,1+/-0,8 µm Peu d’organites Rapport N/cyt élevé eCAT et CAT ? 17-25 µm ??? m Holoclone h Méroclone m,p? Paraclone CAT et Cellule différenciée 18-30 µm p 7,5 mm N Builles BDT 2012 21 Facteur de transcription p63 • • • • • Impliqué dans la prolifération et le développement des cellules épithéliales L’ablation du gène p63 chez la souris provoque l’absence d’épithélium Le facteur p63 n’est pas spécifique des cellules souches Le facteur tronqué en position N terminale a 3 isoformes α, β, γ L’isoforme α est nécessaire: – au maintien du potentiel prolifératif des CSL – à leur capacité de migration vers le centre de la cornée p63∆Nα est present: – Dans le limbe mais absent de l’epithelium cornéen – Trés exprimé dans les holoclones – Peu exprimé dans les méroclones – Pas exprimé dans les paraclones • Les isoformes β, γ apparaissent lors de la cicatrisation et sont corrélés avec la migration des cellules limbiques et leur différentiation N Builles BDT 2012 22 Recherche de la présence de cellules exprimant ABCG2 • Anticorps utilisé : déjà conjugué à l’APC Anticorps anti-H, ABCG2-APC Mouse IgG2b,k • Anticorps isotype contrôle Mouse IgG2b,k-APC De Paiva et coll. ,2005 N Builles BDT 2012 23 ABCG2 et side population ABCG2: transporteur intracellulaire du Hoechst 33342. Sa présence est souvent associée aux cellules souches efflux ABCG2 Verapamil (mauvaise spé 30%) Hoechst33342 Lié à l’ADN= 2 pics de fluo Libre= pic de fluo à 465 nm à 465 et 675 nm (Hoechst red) (Hoechst blue) De Paiva et coll. ,2005 N Builles BDT 2012 24 EXPANSION N Builles BDT 2012 25 Méthodes de culture Cultures en 2D sur différents supports: • Couche nourricière cellulaire – cellules 3T3: lignée immortalisée de fibroblastes embryonnaires de souris – cellules fibroblastiques (peau, cornée) – nécessite: une densité d’ensemencement optimisée, bloquer les divisions (irradiation ou mitomycine) • Matrice mimant la lame basale: – Coating, exemples : collagène IV, laminine 5 (332) – Fibrine – Membrane amniotique • Biomatériaux: Upcell° Cultures en 3D : • En matrices artificielles (biomatériaux) exemple: matrice Coll-GaG-Chi • En suspension: mal adaptée aux cellules adhérentes N Builles BDT 2012 26 Culture sur couche nourricière Trois fonctions principales • Synthétiser la MEC pour une bonne adhésion et migration des cellules épithéliales • Apport de facteurs de croissance solubles (FGFa,b, EGF, HGF,…) • Inhiber la croissance des fibroblastes résiduels de la biopsie (inhibition de contact, par facteurs solubles ….) N Builles BDT 2012 27 Culture sur couche nourricière EXEMPLE D’EXTRACTION & AMPLIFICATION DE LA COUCHE NOURRICIERE KERATOCYTES (I) EXTRACTION: Etude de localisation Extrait à la collagénase de la région supérieur périlimbique Meilleur compromis CD34+, Potentiel clonogénique, Taux de croissance CULTURE: Etude d’un milieu optimisé Meilleur compromis CD34+, Taux de croissance CULTURE DIRECTE SUR PLASTIQUE Phénotype fibroblastique, partiellement réversible Détermination du passage maximum: Pas de cellules sénescentes avant P7 N Builles BDT 2012 28 Culture sur couche nourricière EXEMPLE D’EXTRACTION & AMPLIFICATION DE LA COUCHE NOURRICIERE KERATOCYTES (II) L KERATOCYTES PASSAGE 20 Opt.Mic. X200, culture plastique cellules senescentes : cytoplasme géant, lamellipodes (L), noyaux multiples, N Builles BDT 2012 29 vacuoles etc… KERATOCYTES PASSAGE 5 Opt.Mic. X200, culture plastique phenotype fibroblastique Culture sur couche nourricière EXEMPLE D’EXTRACTION & AMPLIFICATION DES CSL Extraction des cellules limbiques Extraction fractionnée trypsine EDTA Feuillet épithélial Culture sur couche nourricière Milieu de Green (adapté) N Builles BDT 2012 30 Culture en 2D de CSL sur kératocytes epithelium clone Repiquage CN Clone :épithélium cornéen en P0 sur couche nourricière de kératocytes irradiés,x200. Épithélium cornéen en P1 sur couche nourricière de kératocytes irradiés,x100. N Builles BDT 2012 31 Culture sur membrane amniotique Martin Grueterich, Edgar M. Espana, and Scheffer C.G. Tseng, Ex Vivo Expansion of Limbal Epithelial Stem Cells: Amniotic Membrane Serving as a Stem Cell Niche Surv Ophthalmol 48 (6) November–December 2003 N Builles BDT 2012 32 Préparation des Membranes amniotiques Séparation amnios-chorion Découpage Patch unitaire Stockage -80°C, 2 ans Conservation Conditionnement N Builles BDT 2012 33 Culture sur gel de Fibrine • Préparé sur un support de culture plastique en mélangeant des quantités équimolaires de fibrinogène et de thrombine (grade pharmaceutique) • Nécessite un savoir faire pour obtenir un gel homogène • Les cellules cultivées sur gel de fibrine ont la même capacité de croissance que sur plastique • Elles sont greffées sur leur support, évitant un traitement enzymatique • Apres greffe le feuillet de fibrine est rapidement dégradé, laissant l ’épithélium en contact avec le tissu sous jacent N Builles BDT 2012 34 Culture sur biomatériaux Exemple : système Upcell° Polymère de N-isopropylacrylamide • À +37°C polymère hydrophobe, les cellules sont adh érentes, la culture se fait comme sur plastique • A une T°<32°C, le polymère devient hydrophile, les cellules se détachent • Avantage: permet de conserver intactes toutes les protéines de la membrane basale des cellules: meilleur attachement au site de greffe • Conserve la cohésion du feuillet épithélial sans atteinte des jonctions intercellulaires N Builles BDT 2012 35 Conditions environnementales • Milieu de culture pour cellules eucaryotes optimisé. • • • • • a.a. essentiels sels minéraux sucres (pyruvate de sodium "extemporanément") vitamines. Sérum animal: albumine, transferrine, hormones… • Température de culture: +37°C pour optimiser les r éactions enzymatiques • Humidité 100%: à 37°C évaporation importante du mili eu • Système tampon carbonate – bicarbonate et CO2 5%. permet d’acidifier le milieu suivant la réaction: CO2 + H2O HCO3- + H+ prévient l’alcalinisation spontanée du milieu, toxique pour les cellules. • Renouvellement du milieu fréquent: acidification du milieu par le CO2 provenant du cycle de Krebs • Environnement contrôlé • Stérilité N Builles BDT 2012 36 Caractérisation de l’épithélium obtenu à partir des CSL • qualité histologique de la culture adhérente sur membrane amniotique en interface air/liquide pour forcer la différenciation épithéliale • Coupes histologiques sont réalisées pour comparer les caractéristiques (stratification, types cellulaires) de l'épithélium obtenu versus épithélium cornéen normal. • Ce contrôle est complété par les marqueurs de cellules "non différenciées" p63, • de différenciation épithéliale Kératine 3, • de stratification 14-3-3σ. • les critères d'acceptabilité sont : 5-7 couches épithéliales avec une couche de cellules basales cuboïdales, 3-5 couches de cellules intermédiaires/winged cells, une couche dense; absence de cellules caliciformes (sclérales). Cellules basales: p63 +; K3 -; 14-3-3σ -. Cellules intermédiaires/winged cells p63 -; K3 +; 14-3-3σ +. N Builles BDT 2012 37 THERAPEUTIQUE Stratégies thérapeutiques substitutives dans les pathologies cornéennes Greffes de cornées allogéniques Greffes AMN allogénique Les thérapeutiques substitutives cellulaires et tissulaires possibles selon la localisation pathologique dans la cornée N Builles BDT 2012 39 Les Insuffisances en cellules souches limbiques (ICSL) Symptomatologie fonctionnelle: • épisodes de kératalgies, • baisse de l’acuité visuelle, • larmoiements et des rougeurs oculaires persistantes. • conjonctivalisation de la cornée (avec cellules caliciformes à mucus) • néovascularisation Causes • destruction chimique, physique ou mécanique de la surface oculaire: projections acides /bases, irradiations, traumatisme chirurgical, traumatisme mécanique • origine infectieuse: pyocyanique (chez les porteurs de lentilles), le chlamydia trachomatis (agent de la forme endémique subsaharienne du trachome), mycoses, virus de l’herpès, plus fréquemment responsable d’ICSL sectorielle • origine inflammatoire: syndrome de Lyell et syndrome de Stevens-Johnson, pemphigoïde oculaire cicatricielle • origine constitutionnelle: aniridie, épidermolyse bulleuse, endocrinopathies multiples • dysplasies ou dystrophies de la surface oculaire: ptérygion, dystrophies cornéennes, néoplasies du limbe • destruction d’un des éléments constitutifs de la matrice cornéenne F. Majo, Y. Barrandon, P. Othenin-Girard, M. Toublanc, T. Hoang-XuanCorneal epithelial diseases related to limbal stem cell deficiency, J. Fr. Ophtalmol., 2006; 29, 9: 1060-1069 N Builles BDT 2012 40 Produit fini (1) • Le système doit permettre l’application du feuillet cellulaire au patient • En respectant les contraintes de travail du bloc opératoire: stérilité / double emballage • En maintenant la fonctionnalité des cellules • Etre correctement identifié pour avoir le bon produit au bon patient • Etre conforme à la réglementation (MTI / MTI PP) • Le conditionnement doit être sûr (pas de transmission de matières dangereuses) et ne doit pas induire de modifications du produit N Builles BDT 2012 41 Produit fini (2) Le système obtenu doit : • Etre transplantable • Résoudre le problème du patient: Être fonctionnel, dans la durée • Assurer la sécurité du patient: – Infectieuse: • Bactéries • Virus • Prions – Néoplasique – Toxique • Si utilisation de composants d’origine animale, conformité à la pharmacopée européenne – Substances d’origine animale utilisée dans la préparation des médicaments – Réduction du risque de transmission des agents des ESB – Produits comportant un risque de transmission des ESB – Voir aussi: 9 CFR 113.53 Requierements for ingredients of animal origin used for production of biologics (USA) N Builles BDT 2012 42 Etudes cliniques Etude de suivi sur la plus longue durée: Rama P et coll. (Rama P, 2010) Cohorte de 112 patients. Cette équipe utilise les cultures d’épithélium cornéen obtenues à partir de cellules souches limbiques autologues sur gel de fibrine qui ont permis une cicatrisation cornéenne de bonne qualité à 1 an Cette étude a été réalisée dans les cas les plus difficiles à traiter: les brûlures chimiques ou thermiques avec destruction de l'épithélium, destruction du limbe et d'une partie du stroma antérieur. La cohorte a été évalué en moyenne à 2 ans post greffe (1 à 10 ans, médiane 1,9 ans), avec 76% de succès défini comme la restauration d'une surface cornéenne stable, avasculaire et transparente. N Builles BDT 2012 43 Autogreffe de culture d’épithélium cornéen à partir de CSL sur gel de fibrine (lésion unilatérale) 1,5 year 20 ans Brûlure 43 ans Brûlure chimique 3 years Pellegrini G, Rama P, Mavillio F, De Luca M, Epithelial stemBDT cells2012 in corneal regeneration and epidermal gene N Builles therapy, J Pathol, 2009; 217: 217–228 44 Autogreffe de culture d’épithélium cornéen à partir de CSL sur membrane amniotique (lésion unilatérale) Espana EM, Grueterich M, Ti SE, Tseng SC. Phenotypic study of a case receiving a keratolimbal allograft and amniotic membrane for total limbal stem cell deficiency. Ophthalmology. 2003 Mar;110(3):481-6. Echec de greffe de membrane amniotique Echec d’autogreffe limbique Biopsie limbique œil sain 31 ans Brûlure acide N Builles BDT 2012 45 Kératoplastie transfixiante
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