M Gay-bellile- ERTICa 24 janv 2014

Etude de l’instabilité génomique et du statut des
télomères dans le cancer du sein triple négatif
M. GAY-BELLILE
24 janvier 2014
Pr A. TCHIRKOV
Cytogénétique médicale
Statut des télomères
•
Télomères :
–
–
Séquences répétées TTAGGG
Rôles :
•
•
•
Télomérase :
–
–
Complexe ribonucléoprotéique (Reverse transcriptase :
hTERT + Matrice ARN : hTERC)
Rôles : ↑ longueur télomères
•
•
•
Régulation de la réplication cellulaire
Maintien intégrité du génome
Absente dans les ¢ somatiques
Activée dans les ¢ tumorales
Immortalisation ¢R
Complexe Shelterin :
–
–
TRF1, TRF2, POT1, TPP1, RAP1 et TIN2
Rôles :
•
•
Formation t-loop
Régulation de l’élongation par la télomérase
Instabilité génomique évaluée par CGH array
dans le cancer du sein
(Kwei et al, 2010)
•
« simplex » ou 1q/16q :
– seulement qq réarrangements, perte/gain de bras chromosomiques entiers,
– tumeurs ER-positive, avec un profil d’expression génique de type luminal-A
•
« complex firestorm » :
– phénomène d’amplification génique,
– nbx CNV, de gde amplitude, mais limités à de petites régions génomiques
– Caractéristique de luminal-B ou ERBB2
Instabilité génomique évaluée par CGH array
dans le cancer du sein
(Kwei et al, 2010)
•
« complex sawtooth » :
– Nbx CNV, de faible amplitude, touchant de petits segments chromosomiques
– Profil très segmenté avec nombreuses alternances de gain et de perte
– Associé à basal-like et mutation TP53
•
•
Pas toujours facile de classer les patients
3 mécanismes +/- associés au sein d’une même tumeur
Objectifs
• Etude Télomère / Télomérase dans les TNBC
– Longueur des télomères
– Expression de la télomérase (hTERT)
– Expression des protéines du complexe Shelterin (TRF1 et 2, POT1, RAP1,
TPP1 et TIN2)
• Instabilité génomique
– Profils génomiques
– Nombre, taille et type (gain ou perte) des aberrations génomiques
– Clustering non supervisé
• Paramètres clinico-biologiques
– Classifications pronostiques : TNM et SBR
– Evaluation réponse thérapeutique : Classifications histopathologiques
(Chevallier et Sataloff)
Matériels et Méthodes
• Population :
– 65 patientes
– Carcinome canalaire infiltrant triple négatif
– Protocole TVA ou TENEO : Chimiothérapie néoadjuvante (anti-EGFR)
Valeur
pronostique
Réponse
thérapeutique
Matériels et Méthodes
•
Etude longueur des télomères :
–
–
–
–
•
65 ADN
PCR quantitative en temps réel (Cawthon, 2009)
Gène de référence : GAPDH
Quantification : ratio Télomères/GAPDH (2-∆∆ Cp)
Etude d’expression génique :
–
–
–
–
–
hTERT, TRF1, TRF2, POT1, TPP1, RAP1 et TIN2
29 ARN
RT-PCR quantitative en temps réel (Véronèse et al., 2012)
Gène de référence : B2M
Quantification : ratio (Gène Cible / B2M) x 100
• CGH-array :
–
–
–
–
27 ADN (biopsies TVA)
Puce Agilent 8x60K
Reference : ADN Promega féminin
Interprétation : Agilent Genomic Workbench
CGH array : Hybridation génomique comparative
Hybridation compétitive
Marquage :
Random priming
Nick translation
Puce :
BAC/PAC
Oligonucléotides
Analyse d’images
Traitement données brutes
Interprétation
Ratio des intensités de
fluorescence patient/ref
pour chaque spot
Normalisation statistique
Détection des anomalies
Seuil logiciel sup ou inf à
0,25
CGH array : Hybridation génomique comparative
•
Log2 (patient/réf)
•
Interprétation :
–
–
–
–
•
Seuils choisis :
–
–
•
Normal : log2(2/2) = 0
Délétion : log2(1/2) = -1
Amplification : log2(3/2) = 0,58
> 5 Mb
amplification > 0,15
délétion < - 0,20
Identification CNV
–
–
–
Variation du nombre de copie
Gains/Pertes
Anomalies équilibrées non vues
Résultats : Longueur télomère
Association entre longueur des télomères et agressivité de la tumeur
(Stades UICC), particulièrement liée à l’existence d’un envahissement
ganglionnaire
Résultats : Longueur télomère
Association significative entre longueur des télomères et réponse
thérapeutique
Résultats : Reliquat tumoral
•
Longueur des télomères et réponse thérapeutique
Au sein du reliquat tumoral,
des télomères courts
restent associés de façon
significative à une mauvaise
réponse thérapeutique
•
Couple biopsie / reliquat tumoral (n=15)
aucune différence significative observée sur la longueur des télomères
Résultats : hTERT - Shelterin
•
Association significative entre hTERT et agressivité tumorale (Stades UICC),
particulièrement liée a la taille tumorale
•
Association significative entre hTERT et réponse thérapeutique
(Classification de Chevallier et de Sataloff)
•
Surexpression significative de certains gènes du complexe Shelterin (TRF1,
TRF2 et TPP1) dans les tumeurs les plus agressives (Stade UICC et Grade
SBR)
Résultats : CGH array
Aberrations, Gains et Pertes :
- nombre
- taille moyenne
- taille totale
TVA 4
TVA 16
TVA 24
Population : 27 biopsies
Résultats : CGH array - GAINS
L’ instabilité génomique, dans les tumeurs résistantes, est plutôt de type
gain de matériel
Résultats : CGH array - PERTES
Pas de corrélation significative entre les pertes et la réponse thérapeutique
Résultats : CGH array - clustering
perte
Clusters
gain
1
2
3
Cluster 1
(n=13)
Cluster 2
(n=2)
Cluster 3
(n=8)
P
% bonne réponse
au TTT
69%
0%
25%
0,035
Nombre moyen
de gains
16,4
22,5
36,5
0,00036
Nombre moyen
de pertes
16,5
43,5
5,2
0,0078
Résultats : CGH array et Longueur des télomères
Des télomères courts sont associés à une instabilité génomique plus
importante et plutôt de type gain de matériel
Discussion :
•
Télomères courts et agressivité tumorale :
Martinez-Delgado et al., 2013
Télomères courts et cancer du sein héréditaire
Martinez-Delgado et al., 2013
•
Intensité télomérique moyenne
(Q-FISH) :
Télomères
longs
n = 14
n = 13
n = 48
n = 29
Télomères
courts
n = 75
n = 29
Télomères courts et cancer du sein héréditaire
Martinez-Delgado et al., 2013
Grade histologique de Nottingham :
BRCAX
Association significative entre télomères courts et agressivité tumorale
Récepteurs hormonaux et HER2 :
HEREDITARY
SPORADIC
Association significative entre
télomères courts et ER négatifs
dans les tumeurs sporadiques
Aucune corrélation avec PR ou
HER2
Discussion :
•
Télomères courts et agressivité tumorale :
Martinez-Delgado et al., 2013
•
Télomères courts et instabilité génomique de type gain de matériel
Kwei et al., 2010
Phénomène d’amplification par cycles
cassure-fusion-pont
Kwei et al., 2010
Discussion :
•
Télomères courts et agressivité tumorale :
Martinez-Delgado et al., 2013
•
Télomères courts et instabilité génomique de type gain de matériel
Kwei et al., 2010
•
Instabilité génomique = marqueur pronostique ? :
Bonnet et al., 2012
Genomic instability index (G2I) : marqueur
prédictif de la survie dans le cancer du sein
Bonnet et al., 2012
•
CGH array
–
–
% génome altéré
Nombre de régions génomiques altérées (G/L)
G2I-1 : groupe de faible risque
- fraction d’alt génomique < 48%
- G/L ≤ 42
G2I-3 : groupe de haut risque
- fraction d’alt génomique > 35%
- G/L ≥ 65
3 pop tumorales avec 3 degrés
d’instabilité génomique
Indépendant de l’index
pronostique de Nottingham
(analyse multivariée)
Conclusion et Perspectives
•
Associations significatives :
–
Télomères courts et surexpression hTERT :
Tumeurs agressives et résistantes au ttt
–
Instabilité génomique, de type gain de matériel
Tumeurs résistantes au ttt
–
Télomères courts et instabilité génomique de type gain de matériel
Statut télomérique et Instabilité génomique = biomarqueurs prédictifs de
la réponse aux chimiothérapie néo-adjuvantes
•
Perspectives :
–
Augmenter cohorte de TNBC pour CGH-array (TENEO)
–
Corrélation des paramètres télomériques et de l’instabilité génomique avec le statut
ERCC1 dans les cancers du sein traités par chimiothérapie néoadjuvante (P. Romero)
–
Identification du profil BRCA-like par MLPA
Profil BRCA-like
•
Joosse et al., 2009 :
–
–
Cancers du sein familiaux : Mutations BRCA1 ou BRCA2 ~ 25% seulement
Objectif : Développer un nouvel outil capable de détecter l’implication de BRCA1/2
Profil caractéristique des tumeurs BRCA1 associated : 24 régions (> 10Mb) significatives
Perspectives – Profil BRCA-like
•
•
Joosse et al, 2011 :
–
80-90 % des tumeurs avec mutations BRCA1 sont de type basal-like
voie BRCA1 non fonctionnelle dans les tumeurs basal-like
–
Identification de profils BRCA1-like chez patients non porteurs de mutations ?
Expression mRNA BRCA1
–
–
Luminal
Basal like :
•B1-high
•B1-low
Fct de la méthylation du
promoteur
n = 20
n = 21
51 % des basal—like sporadique sous-expriment BRCA1
Perspectives – Profil BRCA-like
•
Profils génomiques des différents sous groupes (CGH-array) :
Différences significatives entre les profils basal-like et
BRCA1 muté
Profils quasi identiques entre basal-like B1-low et BRCA1 muté
Perspectives – Profil BRCA-like
•
Lips et al, 2011 : Mise au point MLPA capable de détecter profils BRCA-like
Kit BRCA1-like, MRC Holland, 48 sondes :
10 sondes de référence (2p, 7q, 10q, 11p,14q et 21q)
4 sondes BRCA1/2
38 sondes d’intérêt (11 régions ≠)
Perspectives – Profil BRCA-like
•
Lips et al, 2011 : Mise au point MLPA capable de détecter profils BRCA-like
Survie sans rechute, TNBC
Ttt : chimiottt alkylante intensive / chimiottt conventionnelle (FEC)
• Intérêt thérapeutique majeur
Sensibilité aux agents induisant DSB
• Profil BRCA1-like = marqueur de
réponse thérapeutique
Traitements néo-adjuvants
• Identification nouveaux profils chez les
non répondeurs
MLPA BRCA1-like
•
•
22 ADN TVA passés à ce jour
Exemple de profil :

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