Giulia Cafueri

La preservazione della fertilità femminile:
aspetti tecnici
G. Cafueri, L. Gianaroli, A.P. Ferraretti, M.C. Magli
S.I.S.Me.R. - Unità di Medicina della Riproduzione - Bologna
www.iiarg.com
www.sismer.it
La preservazione della fertilità femminile:
• Recente sviluppo di tecniche atte a preservare la fertilità
femminile in pazienti oncologiche con lo scopo di preservare i
propri gameti per futuri tentativi di concepimento.
•  Valida e recente alternativa per il trattamento dell’infertilità
“età-dipendente” o associata a fattori quali ridotta riserva
ovarica e menopausa precoce.
Crioconservazione di embrioni
Crioconservazione di ovociti
Crioconservazione di tessuto ovarico
Jeruss JS, Woodruff TK, Preservation of fertility in patients with cancer, N Engl J Med, 2009; 360: 902-11
Crioconservazione di embrioni
•  metodo di comprovata
efficacia
•  richiede stimolazione
ovarica per il prelievo di
ovociti maturi e la
successiva fertilizzazione
•  necessità di un partner/
donatore
•  problemi etici
Crioconservazione di ovociti
•  tecnica in continuo
sviluppo
• ovociti più sensibili al
congelamento
• più di 200 bimbi nati da
ovociti criconservati
• non necessario partner
• richiesta iperstimolazione
ovarica
Crioconservazione di ovociti
Il principale fattore che può inficiare la riuscita della
crioconservazione degli ovociti è la formazione di cristalli di
ghiaccio intracellulare
Incremento del processo di disidratazione cellulare influenzato
da:
•  presenza di crioprotettori all’interno delle soluzioni di
congelamento
•  velocità di congelamento e scongelamento
Tipologie di Crioprotettori
Penetranti (pm< 400)
Non penetranti (pm> 1000)
• 
• 
• 
• 
•  zuccheri : saccarosio,fruttosio,
glucosio, destrosio
•  amido
•  lipoproteine
•  PVP (polivinilpirrolidone)
DMSO (dimetilsolfossido)
glicerolo
PROH (1,2 propanediolo)
glicole etilenico
Crioprotettori penetranti
•  Abbassano il punto di congelamento della soluzione
•  Prevengono l’esposizione dell’ovocita alle alte
concentrazioni di elettroliti intra ed extra-cellulari(si
legano agli elettroliti e sostituiscono parzialmente
l’acqua)
•  Interagiscono con le modificazioni di membrana
•  Il loro ingresso all’interno della cellula per osmosi
causa una più veloce fuoriuscita dell’acqua.
Crioprotettori non penetranti
•  Molecole di grandi dimensioni che non penetrano la
membrana
•  Esplicano la loro azione aumentando la
concentrazione di soluti extracellulare, creando un
gradiente osmotico che spinge l’acqua a fuoriuscire
dalla cellula
Favoriscono la disidratazione cellulare precedente al
congelamento
Crioprotettori non penetranti
La concentrazione del crioprotettore non permeante è
fondamentale in quanto determina la velocità di
disidratazione della cellula:
più alta è la concentrazione più velocemente l’acqua lascia il
citoplasma per ristabilire l’equilibrio osmotico del mezzo
extracellulare
L’azione protettiva del crioprotettore dipende da
•  il tempo ottimale di esposizione dell’ovocita al
crioprotettore (abbastanza lungo da permettere
una sufficiente disidratazione della cellula ma
non troppo dal momento che si può alterare il
pH intracellulare)
§  d a l l a t e m p e r a t u r a a l l a q u a l e a v v i e n e
l’esposizione
(la cellula è esposta inizialmente a basse
concentrazioni di crioprotettore a T ambiente
in modo da creare il giusto gradiente di
concentrazione che da inizio alla deidratazione
e ad un ingresso più lento del crioprotettore
stesso)
Criopreservazione di ovociti – possibili danni
Cytoplasmic and
Cytoskeletron damage
Oocyte
ageing
Meiotic spindle
depolymerization
Impact on oocyte
physiology
Zona pellucida
hardening
Membrane
permeability
Polar body
degeneration/fusion
Crioconservazione di ovociti
Le metodiche utilizzate per crioconservare gli ovociti si dividono in:
Congelamento lento
Vitrificazione
Utilizzo del crioprotettore PROH
Utilizzo dei crioprotettori DMSO e Etilen
Glicole ad alta concentrazione
Richiede un congelatore
programmabile
Non richiede uno strumento specifico
Tempo necessario circa 2 ore
Tempo necessario circa 15 minuti a
supporto (in genere 2-3 ovociti)
Tecnica ormai consolidata
Metodica relativamente recente
La prima gravidanza al mondo ottenuta da un ovocita
congelato con protocollo di vitrificazione venne riportata
presso il S.I.S.Me.R. nel 1999 (Kuleshova et al., 1999)
Slow freezing
Vitrification
CPA concentration
1.5 M
3.0-5.0 M
Volume
0.3-1.0 mL
<1 µL
Cooling rate
~0.5°C/min
~25000-50000°C/min
Reduced osmotic
injury
No
Yes
Seeding
Yes
No need
Procedure
Complicated
Simple
Freezing machine
Yes
No need
Costs
High
Less??? (no freezing
machine needed, but
expensive handling
devices)
Liquid nitrogen
amount
High
Low
Slow-freezing/Rapid thawing
1
2
1 = Washing solution
PBS + 30% Plasmanate
2 = Equilibration solution (10 min)
3
1.5 M PROH + 30% Plasmanate
3 = Loading solution
4-well dish
1.5 M PROH + 0.3 M SUC + 30 % Plasmanate
Thawing solutions consist in a gradually decreasing
concentration of PROH and a constant 0.3 M sucrose
concentration:
SOLUTION 1: 1.0 M PROH + 0.3 M SUC + 30% Plasm. (5 min)
SOLUTION 2 : 0.5 M PROH + 0.3 M SUC + 30% Plasm. (5 min)
SOLUTION 3 : 0.3 M SUC + 30 % Plasm. (10 min)
SOLUTION 4 : PBS + 30 % Plasm. (10 min + 10 min at 37°C)
Vitrification (Kuwayama method)
Equilibration Solution (ES):
7,5% DMSO
7,5% ETHYLENE GLYCOL
10% HSA
CM
ES
ES ES
3 min 3 min
9 min
Re-warming
VS 1 min
Vitrification Solution (VS)
15% DMSO
15% ETHYLENE GLYCOL
10% HSA
0.5 M Sucrose
Thawing Solution (TS): 1 M Sucrose + 10 % HSA at 37 C for 1 min
Dilution Solution 1 (DS1): 0.5 M Sucrose + 10 % HSA for 3 min
Dilution Solution 2 (DS2): 0.25 M Sucrose + 10 % HSA for 3 min
Fattori importanti per la crioconservazione di ovociti
Accanto all’ottimizzazione del
protocollo di congelamento degli
ovociti, è stato dimostrato che il
tempo che intercorre tra la
somministrazione dell’ hCG e il
congelamento degli ovociti gioca
un ruolo fondamentale nello
sviluppo embrionale e nel
successo della gravidanza
(S.I.S.Me.R.)
Il tempo ottimale di congelamento è tra 39 e 40 ore dopo
la somministrazione dell hCG.
Ferraretti et al., Factors affecting thawed oocyte viability suggest a customized policy of embryo transfer, Fert Steril 2010, 94: 1308-1313
Ovociti congelati PROH vs freschi
Ovociti scongelati hanno comunque minor probabilità di essere fertilizzati e
svilupparsi in zigoti di buona qualità e, conseguentemente, in embrioni
rispetto ad ovociti freschi, indipendentemente dall’età della paziente.
I ridotti tassi di fertilizzazione e di
cleavage che si osservano negli
ovociti congelati rispetto ai freschi
suggeriscono che, sebbene gli ovociti
sopravvivano allo scongelamento, il
processo di congelamento lento ha un
impatto negativo sul potenziale di
sviluppo dell’ovocita stesso.
Magli et al., Impact of oocyte cryopreservation on embryo development, Fert Steril 2010, 93: 510-516
Ovociti vitrificati vs freschi
Cobo et al., Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method, Fert Steril 2008, 89: 1657-1664
Ovociti vitrificati vs freschi
Rienzi et al., Embryo development of fresh “versus” vitrified metaphase II oocytes after ICSI: a prospective randomized sibling-oocyte study, Hum Reprod 2010,
25: 66-73
Crioconservazione del tessuto ovarico
La corticale ovarica è una struttura estremamente complessa che
comprende diversi istotipi cellulari e follicoli in vari stadi di sviluppo con
cellule di diverse dimensioni (cellule tecali, cellule della granulosa, ovociti),
strutture extracellulari compatte (cellule dello stroma) e formazioni cavitate
(antro-follicolari, vasi sanguigni).
Campione
fresco
Campione
congelato/scongelato
Tecnica di prelievo di tessuto corticale ovarico
-  Congelamento
lento
-  Vitrificazione
S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Molecular Human Reproduction 2012, 18: 59–67
Vitrificazione del tessuto ovarico
Biopsia del tessuto
corticale ovarico
Tessuto tagliato in
piccoli frammenti
Frammenti per
analisi
I frammenti attraversano
differenti concentrazioni di
soluzione di vitrificazione
Il cryotube chiuso è immerso
in azoto liquido
I frammenti vengono posti in
un cryotube vuoto
Crioconservazione del tessuto ovarico: risultati clinici
Ø  Ad oggi in tutto il mondo
sono nati più di 20 bambini
da trapianto di tessuto
ovarico, fresco o congelato.
S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility
Preservation, Mol Hum Reprod 2012, 18: 59–67
Ø  In alcuni casi il tessuto
ovarico trapiantato ha
permesso una ripresa della
funzionalità ovarica per più
di 7 anni.
Andersen et al., Long-term duration of function of ovarian tissue
transplants: case reports, Reprod Biomed Online 2012 25: 128-32
S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Mol
Hum Reprod 2012, 18: 59–67
..alternative
Ø  Coltura e IVM di follicoli primordiali: 2 step culture system :
coltura di tessuto seguita da isolamento di follicoli e coltura
degli stessi. In alternativa, utilizzo di una matrice di supporto
3D.
Abir et al., In vitro maturation of human primordial ovarian follicles: clinical significance, progress in mammals, and methods for growth evaluation,
Histol. Histopatho 2006, 21: 887-98
Picton et al., The in vitro growth and maturation of follicles, Reproduction 2008, 136: 703-15
Telfer et al., A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin, Hum Rep
2008, 23: 1151-8
Woodruff TK, Preserving fertility during cancer treatment, Nat Med 2009, 15: 1124-5
Ø  Xenotrapianto: tessuto ovarico umano in topi SCID.
Kim et al., Assessment of the integrity of human oocytes retrieved from cryopreserved ovarian tissue after xenotransplantation”, Hum Reprod 2005, 20:
2502-8
Nottola et al., Cryopreservation and xenotransplantation of human ovarian tissue: an ultrastructural study, Fertil Steril 2008, 90: 23-32
Conclusioni
La criopreservazione di ovociti è efficiente abbastanza
da essere utilizzata come metodo di preservazione
della fertilità?
•  Negli ultimi anni il miglioramento delle tecniche di congelamento ha
significativamente migliorato l’efficienza della criocorservazione degli ovociti
• La crioconservazione degli ovociti è un metodo promettente, soprattutto
utilizando la procedura di vitrificazione.
•  Per determinare l’efficacia e la sicurezza di questa metodica è necessario,
però, verificare la performance in pazienti infertili in tutte le classi di età
(pazienti giovani e non)

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