Cellules souches et protéinopathies neurodégénératives : Carole Crozet IRMB Notion de Protéiniopathies - « Protein conformational disorders » - « Protein misfolding diseases » - Perte de fonction normale - Gain d’une fonction anormale => toxicité Notion de Protéiniopathies - Protein conformational disorders - Protein misfolding diseases Cellules souches et maladies neurodégératives Modèle Cellules souches et médecine régénérative Greffe de cellules souches neurales (pouvant délivrer des molécules qui vont interférer avec la pathologie) - inhibition - réparation Maladies à prions Cellules souches et physiopathologie Rôle / statut des cellules souches endogènes adultes - compréhension - orientation Thérapie génique et cellulaire des maladies à prions Cellules souches Embryonnaires Lentivirus Cellules souches neurales Impact des maladies à prions sur les cellules souches neurales adultes Cellules souches neurales fœtales Amplification Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles (ESST) Maladies dégénératives du système nerveux central, lente (1.5 à 40 ans), fatale Humaines Maladie de Creutzfeldt-Jakob (sporadique 1-2 cas /millions/ans, iatrogène) Insomnie Fatale Familiale (génétique) Syndrome de Gertsmann Straüssler Scheinker (génétique) Kuru (infectieuse) vMCJ (infectieuse) Animales Tremblante du mouton (Scrapie), de la chèvre, Encéphalopathie Spongiforme Bovine, Feline Maladie du dépérissement chronique des cervidés Maladies rares chez l’homme et santé publique Augmentation MCJ sporadique en Europe 3800 personnes porteuses au Royaume –Uni Présence de l’agent infectieux dans le sang, le muscle Transmission (actes chirurgicaux, sanguines, administration de dérivés sanguins) Aucun traitement disponible Clinique : -1er signes neurologiques (apathie, perte de la mémoire), et psychiatriques (dépression) -Syndrome cérebelleux (myoclonies, ataxie, perte d’équilibre) -Evolution rapide vers une démence -Pas de signes inflammatoires, bilans sanguins classiques Anatomopathologie Vacuolisation cérébrale, anormales (PrPSc) H&E Vacuolisation gliose réactionnelle, GFAP Gliose réactionnelle dépôts de protéines PrPSc PrPSc / PrPC PrPC/PrPSc PrPSc PrPC hélice feuillet 42 % Hélices 3 % Feuillets plissés - soluble - sensible à la PK Protéinase K - + conversion 2 1 % Hélices 54 % Feuillets plissés - insolubilité - agrégabilité - résistance à la protéinase K Protéinase K - + Clinique : -1er signes neurologiques (apathie, perte de la mémoire), et psychiatriques (dépression) -Syndrome cérebelleux (myoclonies, ataxie, perte d’équilibre) -Evolution rapide vers une démence -Pas de signes inflammatoires, bilans sanguins classiques Anatomopathologie Vacuolisation cérébrale, anormales (PrPSc) H&E Vacuolisation gliose réactionnelle, GFAP Gliose réactionnelle dépôts de protéines PrPSc PrPSc / PrPC Diagnostic : basé sur l’apparition des signes cliniques => Tardif => Courte fenêtre d’intervention thérapeutique => Cerveau très endommagé Maladies transmissibles caractérisée intraspécifique interspécifique expérimentale « barrière d’espèce » Approches thérapeutiques Molécule testée ScN2a >3 jours Lysat cellulaire Proteinase K WB PrPSc Rouge Congo (Caughey and Race, J Neurochem, 1992) Amphotéricine B (antifongique) (Mangé et al. J Virol. 2000) Dendrimères (polyanions cationiques) (Crozet C., et al. J Gen. Virol 2004) Quinacrine (Doh-Ura et al., J Virol, 2000) Anticorps anti-PrPC (Perrier V., Solassol J., Crozet C. et al. J Neurochem, 2004) Dérivés porphyriques (Caughey et al., PNAS, 1998) Polysulfates (Caughey et al., PNAS, 1998) ...... IN VIVO ????? Quinacrine Pentosane polysulfate Doxycycline Approches thérapeutiques Identification de molécules qui peuvent interférer (PrPC, PrPSc, PrPC/PrPSc ou avec des co-facteurs de la réplication - Inhibition de l’expression de la PrP : interférence ARN - Anticorps anti-PrP (PrPC, PrPSc, PrPC/PrPSc) ScFv Anti-PrP (Parties variables des chaines H et L obtenues après clonage d’anticorps anti-PrP) - Dimère soluble de PrP - Mutants dominants négatifs de la PrP - Laminin receptor precursor / laminin receptor (LRP/LR) Vecteurs viraux Thérapie Génique 2 3 4 LRP mutant ScFv DN PrP mutants 5 PrPSc PrPle cycle de replication et ou interfere Mettre diapo de la revue avec PrP C ScFv HSPG 1 LRP/LR 7 Anti PrP - si RNA PrP mRNA Anti LRP - si RNA LRP mRNA A - Relano-Gines A., Gabelle A., Lehmann S., Milhavet O. & Crozet C Infectious Disorders - Drug Targets 2009, 9, 58-68 6 rAAV2-PrPScFv Injection pré-infection => >40 j 2 lentiHIV-PrPFc2 *Injection pré-infection +72 jours *Injection à 30j => +25 jours 3 4 FIV- PrP-DN à 35j 5 => Augmentation de 20% DN PrP PrP mutants PrPle cycle de replication et ou interfere Mettre diapoFIV-PrP-DN de la revue avec à 95j PrP => augmentation de 6% FIV- PrP-DN à 80 et 95j *rAAV2-ScFv LRP/LR => Augmentation de 20% Injection pré-infection Pas de délai LRP mutant Sc C 1 lentiHIV-PrPshRNA Injection à Anti 56jPrP - si RNA Délai 19 à 24% PrP mRNA HSPG LRP/LR 7 Anti LRP - si RNA LRP mRNA A - Relano-Gines A., Gabelle A., Lehmann S., Milhavet O. & Crozet C Infectious Disorders - Drug Targets 2009, 9, 58-68 - Toupet K, Compan V, Crozet C, Mourton-Gilles C, Mestre-Francés N, Ibos F, Corbeau P, Verdier JM, Perrier V. PLoS One. 2008 Jul 23;3(7). 6 Approches thérapeutiques Identification de molécules qui peuvent interférer (PrPC, PrPSc, PrPC/PrPSc ou avec des co-facteurs de la réplication - Inhibition de l’expression de la PrP : interférence ARN - Anticorps anti-PrP (PrPC, PrPSc, PrPC/PrPSc) ScFv Anti-PrP(Parties variables des chaines H et L obtenues après clonage d’anticorps anti-PrP) - Mutants dominants négatifs de la PrP - Laminin receptor precursor / laminin receptor (LRP/LR) Diagnostic des maladies à prions basé sur l’apparition des signes cliniques =>Tardif =>Courte fenêtre d’intervention thérapeutique =>Cerveau très endommagé Stratégie thérapeutique idéale => délivrer des molécules anti-prion et réparer le tissu lésé. Thérapie cellulaire couplée à la thérapie génique Cellules souches neurales « vecteurs » Médecine régénérative Challenges de la médecine régénératives CONSTRUIRE RENOUVELLER REPARER REGENERER REMPLACER Permet d’envisager le traitement de maladies ou d’affections réputées incurables ou mal contrôlées par les thérapies actuelles. ANATOMY ART ( GUNTER von HAGEN ) Sources de cellules souches CS embryonnaires • Pluripotentes, « source de potentialités » CS fœtales • Obtention encadrée • Multipotentes, plasticité limitée • Tératogène • Obtention difficile, Quantités limitée • Immunogénicité • Pas de tératogénicité • Questions éthiques • Immunogénicité CS adultes • Multipotentes, plasticité limitée • Obtention difficile • Pas de tératogénicité • Question éthique • Stratégie autologue possible • Pas d’obstacle éthique IPS Synthèse des avantages des différentes approches? Cellules mal connues, Technique jeune Les stratégies possibles • L’action directe : remplacement directe des cellules lésées, greffe de NSC • L’action indirecte : => production de molécules agissant sur le site de la lésions (ex : les CSM à effet immunosuppresseur) => activation de la niche (Cellules souches endogènes) => association thérapie génique et cellulaire (NSC) Cellules souches neurales Amplification ~ differenciation Lentivirus Cellules souches nreurales « cellules médicaments » Evaluation préclinique Préparations des cellules NSC (CSEH, CSF, CSA) - Optimisation des conditions de culture - Optimisation de la différenciation (CSEH) - Optimisation du transfert de gènes Devenir et intégration des cellules transplantées -Migration, intégration Innocuité et compatibilité -Rejet, contrôle de la prolifération Effet fonctionnel -comportement -effet thérapeutique NSC Fœtales - Collaboration – thèse Européenne Aroa Relaño-Gines - Greffes de NSC dérivées d’embryons E14 (WT, PrP-/-, PoPrP) - Greffes réalisées avant ou après l’apparition des signes cliniques stem cells Hippo , LV RML J0 (150J) stéréotaxie Moment of the graft N0 of inoculated mice Initial Final 6 5 7 4 4 4 2 2 8 6 11 10 9 6 11 5 8 3 Grafted cells BEFORE SIGNS Final N0 of grafted mice Incubation Time (days) Mean Survival Time (days) PrP-/- NSC 5 145 ±1 170 ±0 wtPrP NSC 3 133 ±1 PoPrP NSC 4 145 ±2 PBS 2 121 ±0 23% 141±1 15% 23% 121 ±0 PrP-/- NSC 4 110 ±4 wtPrP NSC 5 109 ±2 PoPrP NSC 4 117 ±3 PBS 4 113 ±5 113 ±5 144 ±4 144 ±4 4 No Graft X 118 ±0 118 ±0 152 ±2 152 ±2 3 100dpi AFTER SIGNS 120dpi Reference Point (RP) Incubation Time Mean 5 175 ±2 172±1 170 ±0 149 ±0 148 ±6 151 ±5 150±4 150 ±1 C° RP 20 C° PBS AS 20 C° PBS BS C° PBS BS 15 PrP-/- NF-AS 15 Po NF-AS Po NF-AS 10 wt NF-AS 10 NF-BS PrP-/- PrP-/- NF-BS C° PBS AS PrP-/- NF-AS wt NF-AS Po NF-BS 5 wt NF-BS 5 wt NF-BS 0 0 90 100 110 120 130 Days 140 150 160 120 130 140 150 Days 160 170 180 5 4 25 C° RP Po NF-BS 2 4 Survival Time 25 3 4 149 ±0 112±3 N0 of mice for analysing RM L RM L A B A B No of astrocytes PrP-/- NSC (PD) 500 PrP-/ -.Bef ore.LVH 450 PBS 400 PrP-/ -.Af t er.LVH 350 PBS 300 250 200 150 100 50 0 8 Cortex 6 Hippocampus 5 Thalamus 4 Hypothalamus 9 Cortex 7 Paraterminal body Hippocampus injection site Lateral ventricle injection site Brain region s Développement de stratégies de thérapie géniques et cellulaires stem cells Molécules anti-prion Lentivirus Amplification ~ differenciation - Projet GIS: Véronique Perrier, Sylvain Lehmann - Prix Victor et Erminia Mescle, FRM Mutants dominants négatifs de la PrP Polymorphismes naturels de la PrP protégeant contre le développement d’une ESST Population japonaise E/K au codon 219 K/K: pas de MCJ Cellules infectées Kaneko et al., 1997 Ovins Q/R au 171 R/R : pas de tremblante Souris transgeniques Perrier et al., 2002 Pas de conversion des protéines PrP mutées Effet dominant négatif des mutants sur la conversion de la PrP endogène Réalisation des mutations dominantes négatives => MoPrP Q167R, MoPrP Q218K // 171 & 219 Production des lentivirus - dérivés du Virus de l’Immunodéficience Féline (FIV), - pseudotypés VSV-G, Equipe P. Corbeau, - non réplicatifs, IGH, Montpellier - expriment la GFP Réalisation des mutations dominantes négatives => MoPrP Q167R, MoPrP Q218K // 171 & 219 Production des lentivirus - dérivés du Virus de l’Immunodéficience Féline (FIV), - pseudotypés VSV-G, Equipe P. Corbeau, - non réplicatifs, IGH, Montpellier - expriment la GFP Validation du système lentiviral Transduction des cellules Prnp-/- [Hpl212 cell line , Onodera T.] SAF32 NT GFP Q167R Q218K NT Effet inhibiteur ex vivo Transduction de cellules infectées par le prion GFP NT Q167R GFP Q167R Q218K Q218K 8j 12j 15j 8j 12j 15j 8j 12j 15j 8j 12j 15j D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 PrPSc Crozet , Lin, Mettling, Gilles, Corbeau, Lehmann and Perrier. (2004) J. Cell. Science, 117, p5591-5597 Gene therapy for prion diseases? (2004) Research Highlights, Nature, 432, p33 Cellules souches embryonnaires Audrey Gabelle Cellules souches embryonnaires ectoderm mesoderm totipotent cells blastocyste inner cell mass Pluripotent ES cells endoderm - Cellules souches embryonnaires (ES) CGR8, Dr Austin Smith (Edimbourg), Pierre Savatier, PRIMASTEM, Lyon - Auto- renouvellement - Pluripotentes Différenciation neurale ES Induction neurale (Benninger et al., Brain pathology, 2000) Formation des Neurosphères - Boites de pétri - Milieu neurobasal +B27 +G5 - 8 jours Induction neurale Cellules ES Nestin - Formation de «Neurosphères» GFAP - III tubulin Caractérisation des cellules (IF, RT-Q-PCR): Nestin +, Sox1+ Sox2+, Oct4 - Différenciation terminale - Différenciation « terminale » en Neurones et astrocytes Tuj1 - GFAP Greffes des corps embryoïdes - Injections stereotaxiques EB Analyses histologique et immunohistochimique Cortex Hp Cortex Hp hematoxyline Contrôle hematoxyline Greffé Transduction ES vs EB (Y.Benninger, 1999) Formation «Neurosphères» Cellules ES Lentivirus Transduction ES vs EB (Y.Benninger, 1999) Cellules ES Formation «Neurosphères» Lentivirus FIV- LacZ Transduction ES vs EB (Y.Benninger, 1999) Cellules ES Formation «Neurosphères» Lentivirus FIV- LacZ Transduction ES vs EB -Corps Embryoïdes (20µl medium (6-10 NFs) + 10 µl virions (107TU)) Lenti gal Day 8 Non transduit Day 6 Non transduit - Lentivirus Q167R PrP / Q218K PrP Transduction des neurosphères avec les mutants portant les PrP/DN GFP PrP Greffes FIV-GFP ES/NFs GFP Tumor / GFP ES résiduelles? 3 protocoles de différenciation neurale en monocouche Mc Kay et al., 2000 Smith et al., 2003 Benninger et al. 1999 • Protocole de « sélection » • Protocole de « spécification » •Protocole de « spécification » ES/NSC (R. Mc Kay) ES/NSC (A. Smith) Nestin betaIII tubulin ES/EBs/NSC (modified from Y.Benninger) GFAP Greffes ES : CGR8 ES/NSC transduits avec lentivirus GFP ES/NSC (R. Mc Kay) ES/NSC (A. Smith) ES/EBs/NSC (modified from Y.Benninger) 90 souris Survie Intégration Différenciation Tératomes Transduction des ES/NSC ES/NSC (A. Smith) - ES/NSC-GFP - ES/NSC-PrPQ167R - ES/NSC-PrPQ218K - Différenciation in vitro - Greffe sur souris saines (40) - Vérification de l’innocuité et intégration des cellules greffées Essais Pré-cliniques ES/NSC (A. Smith) Prion ME7 J0 Incubation : 165j Greffe J90 Dans le Gyrus Denté - C° ES/NSC-GFP ES/NSC-PrPQ167R ES/NSC-PrPQ218K Incubation 8% : augmentation de 15 à 19% chez certains animaux In c u b a t io n *** * C° G FP 190 Q 167R Q 218K 180 170 K R 8 7 Q 2 1 6 1 Q G F P ° 160 C t e m p s d 'in c u b a t io n 200 Vacuolisation PrPSc * ES/NSC-Q167R ES/NSC-Q218K Astrogliose Peu d’effet Thérapie génique et cellulaire des maladies à prions Cellules souches Embryonnaires Lentivirus Cellules souches neurales Impact des maladies à prions sur les cellules souches neurales adultes Amplification Rôle de la neurogenèse adulte dans les maladies à prions Aroa Relaño-Gines Neurogenèse adulte En situation physiologique Le gyrus denté dans l’hippocampe La zone sous ventriculaire des ventricules latéraux D’après Alvarez-Buylla, Neuron, 2004 Neurogenèse adulte En situation physiologique Le gyrus denté dans l’hippocampe La zone sous ventriculaire des ventricules latéraux D’après Alvarez-Buylla, Neuron, 2004 Neurogenèse adulte En situation physiologique Le gyrus denté dans l’hippocampe La zone sous ventriculaire des ventricules latéraux D’après Alvarez-Buylla, Neuron, 2004 En situation pathologique :Ischémie, Huntington, Alzheimer - Stimulation de la neurogenèse adulte - Production et migration de nouveaux neurones dans les zones lésées Mécanismes neuro-développementaux / Mécanismes Neurodégénératifs - Protéines impliquées dans les maladies neurodégénératives protéines impliquées dans le dévéloppement neural (-Synucléine, Huntingtin, Presenilin…) Cas de la PrP - Fonction PrP mal connue mais rôle dans le processus de neurogenèse Neurogenèse adulte En situation physiologique Le gyrus denté dans l’hippocampe La zone sous ventriculaire des ventricules latéraux D’après Alvarez-Buylla, Neuron, 2004 En situation pathologique :Ischémie, Huntington, Alzheimer - Stimulation de la neurogenèse adulte, altération - Production et migration de nouveaux neurones dans les zones lésées Mécanismes neuro-développementaux / Mécanismes Neurodégénératifs - Protéines impliquées dans les maladies neurodégénératives protéines impliquées dans le dévéloppement neural (-Synucléine, Huntingtin, Presenilin…) Cas de la PrP - Fonction PrP mal connue mais rôle dans le processus de neurogenèse Hypothèses de travail Maintien des fonctions cérébrales Signes cliniques ? PrPS Inoculation c Mort Temps PrPC Précurseurs neuraux PrPC Différenciation neuronale Survie cellulaire PrPSc Précurseurs neuraux => propagation? Fonctions altérées lors de l’infection => Inhibition neurogenèse? Objectifs Statut des cellules souches adultes Rôle de ces cellules souches adultes Stratégies thérapeutiques Statut de la neurogenèse adulte au cours de l’infection Modèles animaux 180 souris inoculés par le prion ou homogénat sain comme contrôle Cinétique de prélèvements des cerveaux (173dpi) Analyse Prions Propriétés des précurseurs neuraux In situ Immunofluorescence Immunohistochimie Prolifération Différenciation, migration Mort cellulaire Présence de PrPSc Mise en culture des Cellules souches neurales (CSN) Prolifération Différenciation Survie cellulaire Présence de PrPSc Modèles animaux Souris infectées par le prion Prions - Inoculation of 180 souris - 2 injections BrdU Cinétique de prélèvements des cerveaux Prions J0 J62 J125 J92 J155 J173 BrdU J62+30j - 8 souris pour les études de prolifération - 8 souris pour les études de survie - 8 souris pour mise en culture (Hippo + VL) J92+30j J125+30j J155+18-19j PrPSc accumulation in NSC and neuroblasts area in prion infected mice • PrPSc Accumulation NSC isolated from prion infected mice accumulate PrPSc • differentiation PrPSc accumulation in adult NSC impaired neurons production • differentiation PrPSc accumulation in adult NSC impaired neurons production Increase of apoptosis in infected cells ** ** • Prolifération L’infection modifie les propriétés prolifératives des NSC • Étude basée sur l’incorporation de l’EdU par les cellules en prolifération ** Hippo ME7 hippo sain LV ME7 LV sain ** • apoptosis Le prion altère la viabilité des cellules en prolifération • Évaluation de l’activation des caspases 3 et 7 impliquée dans l’apoptose ** ** Thérapie génique et cellulaire des maladies à prions Cellules souches Embryonnaires Lentivirus Cellules souches neurales Impact des maladies à prions sur les cellules souches neurales adultes Amplification IGH CNRS UPR 1142 Aroa Relaño-Ginès Claire Hamela Audrey Gabelle Stella Cosenza Véronique Perrier Maxime Bélondrade IRB- U1040 INSERM Sylvain Lehmann Cécile Monzo Félicie Radreau Laura Auboyer Cosette Le Souder Constance Delaby Christophe Hirtz Laurent Tiers Monique Provansal Jérôme Vialaret Pauline Bros Baptiste Gor Amandine Moulinier Bernard Klein U710- Mécanismes moléculaires dans les démences neurodégénératives. Université Montpellier II Véronique Perrier Montpellier II Laboratoire Lentivirus et Transfert de Gènes, IGH, Montpellier Yea-Lih Lin, Isabelle de Vidi, Clément Mettling, Pierre Corbeau
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