Déficits du complexe de la pyruvate déshydrogénase (PDHc) ENCEPHALOPATHIES PROGRESSIVES Avec HYPERLACTATEMIE Audrey Boutron meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Laboratoire de biochimie Hôpital de Bicêtre PDHc : Enzyme clé de l’état nourri (+) Insuline, PDH-phosphatase (-) ATP, PDH kinase - ( ) DCA meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Décarboxylation oxydative du pyruvate TPP ↓ E3BP=X Xp22.1-22.2 → 1 x 106 Da inn mt membrane meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian x20-30 x60 x6 Dosage du complexe PDHc Pre-traitement : Dichloro acetate (inhibiteur PDH-kinase) Mg++ (activateur PDH phosphatase) activité (1-14C) Pyruvate + NAD + CoA → AcétylCoA +14CCO2 +NADH ↓ + L-Carnitine Ratio PDHc/citrate synthase meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian PDHc maximale Difficultés du dosage Majorité des anomalies sur la sous unité E1alpha (PDHA1 gène : Xp21.2) Variabilité Tissulaire de l’ activité de la PDHc: Normale dans un tissu (lymphocytes) Anormale dans un autre (fibroblastes, cerveau) Biais d’inactivation du X fréquent chez les filles Mosaicisme somatique possible chez les garçons expression tissulaire différentes de certaines mutations Mutations Cryptiques Mutations de splice Silencieuse Intronique lointaine Délétions hétérozygotes de grande taille meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian PAULINE grossesse, accouchement normaux Microcéphalie Difficultés alimentaires ± hypotonie J14 hospitalisation pour hypothermie, apnées ; Transfert en réanimation : Intubation/ventilation ; décès à J21 ETF agénésie du CC, dilatation ventriculaire D mmol/l Lactate N <1.9 sang sang LCR 7 5 7 Pyruvate N <0.17 L/P 0.700 7-15 10 pmol/min/ mg prot %N m range PDHC Lymphocytes 2.31 N 2.7 1.8-3.7 PDHC fibroblastes 0.52 24 2.2 1.4-3.1 Biais d’inactivation de l’X Ce biais est différent dans les fibroblastes et les lymphocytes meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian PDHA1 : dupAAGAGT (exon 10) hétérozygote ANTHONY, 1er enfant de parents non consanguins A 21 mois, bilan pour microcéphalie, légère dysmorphie et syndrome pyramidal IRM : atrophie corticale et dilatation ventriculaire sang PP LCR mmol/l sang AJ Lactate N<1.9 2.00 3.7 4.99 Pyruvate N <0.17 0.211 0.314 0.434 10 12 11.5 L/P 7-15 pmol/min/ mg prot %N m range PDHC Lymphocytes 1.75 65 2.7 1.8-3.7 PDHC fibroblastes 1.2 55 2.2 1.4-3.1 PDHC MUSCLE 1.0 18 2.7-8.2 Pas d’anomalies des complexes de la chaine respiratoire sur muscle meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Séquençage PDHA1 (Patient Garçon) 1- ADNg : taux de mutation variable selon les tissus ADNg : c.787C>T R263X exon 8 lymphocytes fibroblastes 2- ADNc : discordance entre ADNg et ADNc ADNc : pas de mutation dans les Fibroblastes meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian muscle 1- pourquoi cette discordance entre les tissus ? activité PDHc variable, taux de mutation variable de PDHA1 mosaicisme somatique ? Immuno-cytochimie Anti PDHA1 rouge Anti PDHE2 vert cellules N : orange meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Analyse cheveu par cheveu Digestion ENZYMATIQUE DdeI 2 – pourquoi cette discordance :ADNg et ADNc ? Mutation c.787C>T soit p.Arg263* Risque de dégradation des ARNm non sens (Nonsense mRNA Mediated Decay: NMD) Ce NMD peut être prévenu grâce à l’utilisation d’inhibiteur de la traduction Séquençage de l’ADNc G C G T C C GA C T + fibroblastes pré-incubés avec émétine - émétine meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian DdeI digestion - émétine +émétine LYA Début en anténatal •Présence de kystes para ventriculaires bilatéraux avec une hypoplasie partielle du corps calleux •Convulsions néonatales Hypotonie axiale •Hypoglycémie et RCIU mmol/l Sang AJ Sang PP LCR 5.20 3.40 3.50 Pyruvate N <0.17 0.44 0.27 0.30 L/P 11.8 12.8 11.5 Lactate PDHC N <1.9 7-15 Lymphocytes meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian pmol/min/ mg prot %N m range 3.160 N 2.7 1.8-3.7 Étude moléculaire de PDHA1 ADN g Long range PCR : promoteur(1000kb) → exon 11 Bande Normale : absence de délétion intra génique Séquençage Aucune anomalie ADN c Pas d’anomalie d’épissage Déficit en PDHc ? pmol/min/ mg prot %N m Valeurs usuelles PDHC Lymphocytes 3.160 N 2.7 1.8-3.7 PDHC Fibroblastes 0.317 25% 2.13 1.37-3.10 Délétion hétérozygote qui emporte la totalité du gène PDHA1 ? meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Dosage génique aux 2 extrémités du gène Quantification relative Dosage génique Dosage génique patient Dosage génique témoin LYA Témoin Fille Témoin Garçon 5’UTR 1.04 0.814-1.219 2.02 2.004-2.356 1.11 0.958-1.186 3’UTR 0.98 0.907-1.254 1.84 1.916-2.370 1.04 0.923-1.084 Délétion hétérozygote qui emporte la totalité du gène PDHA1 + ? meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Délétion Xp22.12p22.2 (2.14 Mb ;15 gènes) puce 244K Agilent CXorf15 RBBP7 REPS2 NHS SCML1 RAI2 CXorf20 SCML2 CDKL5 RS1 PPEF1 PHKA2 GPR64 PDHA1 MAP3K15 SH3KBP1 meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Déficits en PDHc sans anomalies de PDHA1 PDHA1 PDHX PDHB (E1β) DLAT (E2) DLD (E3) : 85 cas (>70% De Novo) : 11 cas : 8 cas (1 mutation fréquente ) : 0 cas : 3 cas acidurie organique , anomalies sd de Reye PPM2C (PDH pase) CAA, : 0 cas Absence de spécificité des signes cliniques, biologiques et radiologiques meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Déficits en PDHc sans anomalies moléculaires Faux positifs 1 cas de déficit secondaire à un déficit de la chaîne respiratoire (complexe I) 1 déficit aigu en thiamine Vrais positifs ??? Anomalies mixtes :MMDS PDH + KGDHc +BCKDHc et GCS +chaine respiratoire meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian E1 E2 E3 Liam Hypotonie de l’axe non étiquetée dès 4 mois de vie A 18 mois suite à une GEA : décompensation neurologique avec régression psychomotrice et altération de la conscience Lactates augmentés sang et LCR (rapport L/P bas) CAO dérivés du cycle de krebs : αcetoglutarate +++ CAA: alanine, glutamine et glycine IRM normale Suspicion de déficit en E3 meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian PDHc Lc PDHc fibro KGDH Fibro E3 / DLD fibro 0.98 0.08 1.00 45 1.82-3.68 1.37-3.10 7-8 42-81 •Hypothèse : Anomalie de lipoylation de la sous-unité E2 ? •Etude en WB / anticorps anti acide lipoique : T 1 2 3 1 Liam 4 70 kDa - PDH E2 subunit = DLAT < 55 kDa - BCKDH E2 subunit = DBT ≈ 48 kDa - α-KGDH E2 subunit = DLST 2 N 3 Lya PDHA1 4 Marion NFU1 HSP70 (70 kDa) •Etude moléculaire gènes NFU1/ BolA3/ LIAS puis exome meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian ISCU / NFU1 IBA57 BOLA3 GLRX5 E1 cluster 4Fe-4S LIAS Lipoyl-E2 E3 Octanoyl-E2 Apo-E2 LIPT1 ApoGMP-lipoate mt lipoate meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian Apo-E2 LIPT2 Octanoyl-mtACP mt FAS II MERCI !!!!!!!!!!!!!! À Michèle Brivet À tous les cliniciens B.Chabrol, A.Cano, A.Goldenberg P.De Lonlay, I.Desguerre, V.Desportes B.Heron, D.Lamireau, P. Landrieu, C.Mignot H.Ogier de Baulny, M.Rio, A.Roubertie, F.Rivier, F.Sedel, C.Sevin, G.Touati …… Aux technicien(ne)s, particulièrement à V.TAMI pour les dosages enzymatiques et les cultures de fibroblastes et I. Correia et C. Oliveira pour la biologie moléculaire meetochondrie 0505-07mai 2014 Evian
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