Amilasi Pancreatica Per uso diagnostico in vitro REF : SPE8 –10 test Kit per la determinazione enzimatica dell’attività dell’alfa-amilasi pancreatica Metodo colorimetrico - IFCC PRINCIPIO Il metodo di dosaggio colorimetrico enzimatico dell’alfa-amilasi pancreatica avviene in due step in sequenza che prevedono dapprima una inibizione specifica dell’alfa-amilasi salivare on doppio anticorpo monoclonale e successivamente il dosaggio dell’attività alfa-amilasica residua (alfa-amilasi pancreatica). L’alfa-amilasi catalizza l’idrolisi del substrato EPS (Ethyliden Protected Substrate) p-nitrofenil-maltoepatoside 4,6-etilidene-bloccato (ethilidene-G7PNP) con formazione di 2 etilidene-G5 + 2 G2PNP. L’Þ-glucosidasi idrolizza completamente i frammenti ottenuti di G2PNP, G3PNP e G4PNP a p-nitrofenolo (PNP) e glucosio (G). Misurando l’aumento di assorbanza dovuto alla formazione di PNP nell’unità di tempo si calcola l’attività dell’alfaamilasi pancreatica nel campione esaminato. FINALITA’ D’USO Le Alfa-amilasi sono enzimi idrolitici che degradano l’amido in maltosio. Nell’uomo, le alfa-amilasi vengono prodotti in svariati organi e prendono il nome dell’organo di provenienza. La alfa-amilasi pancreatica è prodotta quasi esclusivamente dal pancreas e viene rilasciata nell’intestino; la alfa-amilasi salivare, proviene principalmente dalle ghiandole salivari, viene secreta nella saliva ed è presente anche in altri liquidi biologici quali il sudore, le lacrime ed il liquido amniotico, il dosaggio dell’alfa-amilasi è un utile mezzo per il monitoraggio della pancreatite acuta e degli attacchi acuti durante le pancreatite croniche. REATTIVI - Concentrazione iniziale REAGENTE 1 tampone HEPES* 52.5 mmol/L pH 7.15, cloruro di sodio 87 mmol/L, cloruro di magnesio 12.6 mmol/L, α-glucosidasi ≥ 4 kU/L, anticorpi monoclonali anti-alfaamilasi salivare ≥ 30 mg/L, sodio azide < 0.1% REAGENTE 2 tampone HEPES* 52.5 mmol/L pH 7.15, 4,6-etilidene-G7PNP ≥ 4 mmol/L, sodio azide < 0.1% * HEPES: acido 2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil]-etanosolfonico CAMPIONI Siero, PLASMA (eparina, EDTA). Raccolta de campione in accordo con procedura NCCLS riferita in bibliografia (1) PROCEDIMENTO PER SPECTRA 8P Lunghezza d’onda: Temperatura di lavoro: Cammino ottico: Tipo di reazione: Portare i reattivi a 15-25°C prima del loro utilizzo. 405 nm 37°C 1 cm Fixed time (in incremento) PROCEDIMENTO SPECTRA 8P 1) 2) 3) 4) 5) 6) Dispensare 400 µl del Reagente 1 in una delle cuvette in dotazione. Preriscaldare per 150 sec la cuvetta contenente reagente. Aggiungere 16 µl di campione e agitare delicatamente per qualche secondo. Incubare per 300 secondi nella camera di incubazione del fotometro (SPECTRA 8P) e digitare il tasto Enter. Aggiungere 100 µl di Reagente 2 e agitare delicatamente per qualche secondo. Inserire la cuvetta nella cella di lettura e attendere la fine del periodo di incubazione (5 minuti) per il risultato CALCOLO DEI RISULTATI Il fotometro SPECTRA 8P esegue automaticamente il calcolo dei risultati che verranno visualizzati sul display al termine della procedura automatica e dopo il suono del beep. Tali risultati possono essere stampati tramite stampante termica integrata allo strumento. CALIBRAZIONE - I reattivi presenti nel kit sono già stati calibrati. I valori di calibrazione sono contenuti nella Smart Card presente nel kit e sono validi solo per il lotto presente sull’etichetta della Smart Card. Ogni Kit deve essere utilizzato con la propria Smart Card in dotazione. INTERFERENZE Nessuna influenza da emoglobina fino a 200 mg/dL, bilirubina fino a 60 mg/dL nonché da lipidi (intralipidi) fino a 1500 mg/dL. LINEARITA’ La reazione è lineare sino alla concentrazione di 2000 U/l. Campioni superiori a 2000 U/l devono essere diluiti con soluzione fisiologica. Moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione. VALORI DI RIFERIMENTO SENSIBILITA’ ANALITICA Soglia di sensibilità espressa dal metodo: 4 U/l. Siero/Plasma(U/l) Adulti 37°C 8-53U/L I valori di riferimento sono da considerarsi indicativi in quanto ogni laboratorio dovrebbe ricercare quelli della popolazione su cui opera. I risultati del test dovrebbero essere interpretati unitamente alle informazioni derivanti dalle valutazioni cliniche del paziente. PREPARAZIONE DEI REATTIVI - I Reagenti sono liquidi e pronti pe l’uso. - Conservare il kit a 2-8°C. - I reattivi, se conservati a 2-8°C e protetti dalla luce sono stabili fino alla data di scadenza indicata in etichetta. MATERIALI AUSILIARI Materiali necessari non contenuti nel kit: soluzioni diluenti, vetreria e monouso, sistemi di dosaggio e misurazione, calibratori per la taratura degli strumenti. CONTROLLO DI QUALITÁ É necessario eseguire i controlli ad ogni utilizzo del kit e verificare che i valori ottenuti siano inclusi nell’intervallo di riferimento riportato nelle istruzioni d’uso. PRECAUZIONI ED AVVERTENZE Oltre alle eventuali indicazioni di rischio relative a componenti attivi, il prodotto contiene componenti non attivi quali conservanti (p.e. sodio azide ed altro) e detergenti. La concentrazione totale di tali componenti è inferiore ai limiti riportati nelle Direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e relative modifiche ed integrazioni per la classificazione, etichettatura ed imballaggio dei preparati pericolosi. Si raccomanda comunque di manipolare il prodotto con cautela e di evitare l’ingestione ed il contatto con occhi, pelle e mucose e di seguire le norme di buona pratica di laboratorio nell’utilizzo. PRECISIONE NELLA SERIE: determinata su 1x1x20 saggi (giorni x seduta analitica x replicato) su 2 controlli commerciali (L1/L2). I risultati ottenuti sono stati i seguenti: U/L Media DS CV% L1 31.0 0.22 0.7 L2 240.7 0.66 0.3 PRECISIONE TRA LE SERIE: determinata su 5x2x4 saggi (giorni x seduta analitica x replicati) su due controlli commerciali (L1/L2) e su una miscela di sieri umani (L3). I risultati ottenuti sono stati i seguenti: media U/L Imprecisione totale DS CV% Tra i giorni Ripetibilità DS CV% DS CV% L1 37.3 1.80 4.8 0.00 0.0 1.24 3.3 L2 102.3 3.05 3.0 0.74 0.7 2.54 2.5 L3 27.1 1.56 5.7 0.00 0.0 1.21 4.5 CORRELAZIONE: il confronto tra questo test (y) ed un metodo del commercio (x), ha fornito i seguenti risultati: N = 60, r = 0.999, y = 1.00x – 1.09 SMALTIMENTO RIFIUTI Il prodotto deve essere smaltito secondo le locali normative in materia di gestione dei rifiuti. . Amilasi Pancreatica Per uso diagnostico in vitro REF : SPE8 –10 test BIBLIOGRAFIA 1) NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture; Approved Standard - Fifth Edition (H3-A5). W ayne, PA: The National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003. 2) Pesce, A.J., Kaplan, L.A.: “Methods in Clinical Chemistry”, Mosby Ed. (1987). 3) Burtis C.A., Ashwood E.R.: “Tietz Textbook of Clinical Chemistry”, W.B. Saunders Company Ed. (3rd edition, 1999). 4) Guder W .G.: “The Quality of Diagnostic Sample”. Recommendations of the Working Group on Preanalytical Quality of the German Society for Clinical Chemistry and the German Society for Laboratory Medicine. (1st Edition 2001). 5) Jakobs, D.S., Kasten, Jr., B.L., DeMott, W .R., Wolfson, W.L.: “Laboratory Test Handbook”, Lexi-Comp and W illiams & Wilkins Ed. (2nd Edition - 1990). 6) Junge W , Waldenström J. Bouman A et al. Evaluation of the Assays for Total and Pancreatic α-Amylase based on 100% Cleavage of Et-G7-PNP at 6 European Clinical Centres (Poster Medlab 97). Basel, Switzerland: 12th IFCC European Congress of Clinical Chemistry, August 17-22, 1997. SIMBOLOGIA Consultare istruzioni per l’uso Marchio CE (prodotto conforme ai requisiti della Dir. 98/79/CE) Limiti temperatura di conservazione Dispositivo medico-diagnostico in vitro  Fabbricante .