engineering of an amino acid racemase for - ETH E

DISS. ETH NO. 23677
ENGINEERING OF AN AMINO ACID
RACEMASE FOR APPLICATION
IN SEPARATION-INTEGRATED DYNAMIC
RESOLUTIONS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Christian Femmer
Diplom-Ingenieur Biotechnology, TU Berlin
born on 16.04.1979
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Sven Panke (ETH Zurich, Switzerland), examiner
Prof. Dr. Martin Fussenegger (ETH Zurich, Switzerland), co-examiner
2016
SUMMARY
Chiral carbon atoms play a crucial role in the activity of organic compounds that interact
with biological systems, including drugs, flavors and fragrances, and agricultural
compounds such as pesticides. One of the main synthetic routes to optically pure
preparations of such chiral compounds is the preparation of the racemate and
subsequent resolution. Such resolutions are limited to a theoretical yield of 50 %. This
yield can be doubled by integration of a step-wise or continuous racemization of the
non-desired enantiomer. However, many of the different routes toward racemization of
a compound require harsh treatments and are therefore often incompatible with the
highly functionalized state of the compound to be resolved. Employing enzymatic
catalysis for racemization can therefore be highly beneficial, yet their application in
biocatalysis is rarely explored.
Coupling mild enzymatic racemization and a potent physical enantioseparation
technology such as continuous chiral chromatography, realized in the form of a
simulated moving bed (SMB), enables the production of single enantiomers from
racemates in theoretically 100% yield and hence constitutes a highly desirable process
route for fine chemicals. This requires the availability of a cost effective enzyme, which
depends on factors such as catalytic proficiency of the enzyme with the substrate of
interest, its efficient production, and its stability under process conditions. While the
first two aspects are generic problems in biocatalysis, the latter aspect is specific to
the strategy of reaction-integrated processing: The direct coupling of SMB and
bioreactor requires the same phase in both units, the separation and the racemization
unit. As the productivity of the overall process is highly sensitive to the composition of
the mobile phase that is applied in the continuous chromatography, the enzyme needs
to operate efficiently under suitable separation conditions, such as high content of
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water-miscible organic solvents. In this thesis, a suitable amino acid racemase is
engineered for such a process, which constitutes an important model enzyme for such
an approach due to the importance of amino acids as building blocks in the fine
chemical industry. We improved the racemization of ornithine, a possible starting block
for the large-scale synthesis of sulphostin, by a broad-spectrum amino acid racemase
from Pseudomonas putida (PpAAR).
In order to improve the catalytic performance of the racemase, we constructed a strain
whose growth is dependent on the conversion of D- to L-ornithine so that changes in
enzyme performance could be scored by their effect on growth behavior which is one
of the most widely applied strategies for identifying improved biocatalysts. While this
strategy is powerful in removing non-functional catalysts, measuring subtle differences
in growth behavior remains difficult at high throughput due to the lack of suitable
methods. Here, we demonstrate successful miniaturization of a growth-based directed
enzyme evolution process in optically clear gel-like microcarriers of nanoliter volume
(“nanoliter reactors” or NLRs), which allow reading out subtle differences in growth by
measuring the fluorescence of cells constitutively expressing a fluorescent protein in a
fluorescence-assisted particle sorter. The discriminatory power of the assay was
increased by including lysine as a competitive inhibitor, or antimetabolite. We isolated
a PpAAR mutant with a total of twelve mutations, none of which close to the active site
of PpAAR, with a catalytic efficiency improvement of 2.1-fold (conversion of D- to Lornithine) and 2.7-fold (L to D), respectively.
In order to improve the PpAAR stability in MeOH/water mixtures, we developed a
simple method that allowed considerable stability improvements with low experimental
effort. It is based on the assumption that the introduction of additional arginine residues
on the surface of an enzyme improves the behavior in water/organic solvent mixtures
because of its increased capacity to form hydrogen bonds which either increases the
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energy that is required for unfolding or hinders the removal of critical water molecules
from the structure. By sequence comparison with thermophilic homologous enzymes,
we identified suitable residues for exchange, constructed a master variant with all
previously identified mutations, and performed gene shuffling with the gene for the
parent enzyme. This way, we identified PpAAR variants that had a significantly
extended half-life time in 40 % MeOH [up to 8-fold] and 30 % acetonitrile [up to 8-fold]
while retaining their catalytic activity under aqueous conditions.
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ZUSAMMENFASSUNG
Chirale Kohlenstoffatome spielen eine entscheidende Rolle in der Aktivität von
organischen Molekülen, die mit biologischen Systemen interagieren, wie zum Beispiel
Arzneistoffe, Geschmacks- und Duftstoffe, oder Pestizide in der Landwirtschaft. Eine
der Hauptrouten zur Herstellung von Verbindungen, die nur eine von zwei möglichen
chiralen Formen enthalten (enantiomerenreine Stoffe) ist die Kopplung der Herstellung
eines Racemats (Gemisch beider chiraler Formen in gleicher Menge) der gewünschten
Verbindung und dessen Spaltung. In einer solchen Route ist die Ausbeute auf maximal
50 % limitiert, da immer mindestens 50% des Ausgangsmaterials zurückbleiben,
nämlich das Material mit der falschen Konfiguration. Eine Verdopplung der Ausbeute
kann erreicht werden, wenn die Racematspaltung mit einer schrittweisen oder
kontinuierlichen Racemisierung des ungewünschten Enantiomers gekoppelt wird.
Jedoch finden viele Racemisierungsreaktionen unter extremen Bedingungen statt und
sind daher oft unvereinbar mit den hochfunktionalisierten Molekülen, die für die LifeScience
Branchen
relevant
sind.
Eine
enzymatische
Racemisierung,
die
typischerweise unter sehr milden Bedingungen stattfindet, kann daher sehr vorteilhaft
sein. Allerdings ist deren Anwendung in der weissen Biotechnologie noch recht wenig
erforscht.
Die Kopplung einer milden enzymatischen Racemisierung mit einer effizienten
kontinuierlichen
Chromatographieeinheit
zur
Racematspaltung,
realisiert
als
sogenanntes „simuliertes Fliessbettverfahren“ (SMB, für Englisch „simulated moving
bed“), ermöglicht die Produktion des gewünschten Enantiomers mit einer
theoretischen Ausbeute von 100 % und ist daher ein sehr attraktiver Prozessweg zur
Herstellung
von
enantiomerenreinen
Feinchemikalien.
Dieser
erfordert
die
Verfügbarkeit eines kostengünstigen Enzyms, welches sich leicht rekombinant
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herstellen lässt, eine hohe katalytische Aktivität für das Substrat von Interesse besitzt
und stabil unter Prozessbedingungen ist. Während die ersten beiden Aspekte jeden
Bioprozess betreffen, ist letzterer ein spezifisches Problem für die Strategie der
reaktionsintegrierten Prozesse: Das direkte Koppeln von SMB und Bioreaktor erfordert
dasselbe Reaktionsmedium in beiden Prozesseinheiten. Ferner hängt die Produktivität
des Gesamtprozesses sehr stark von der Komposition der mobilen Phase in der
Chromatographieeinheit ab. Da diese für die Trennung von Feinchemikalien wie
Aminosäuren einen hohen Anteil von organischem Lösungsmittel enthalten muss,
sollte das Enzym effizient in diesem Medium arbeiten können. In der vorliegenden
Arbeit wird ein geeignetes Enzym, genauer gesagt eine Aminosäureracemase, für
einen solchen Prozess mittels gerichteter Evolution optimiert. Die Wichtigkeit von
Aminosäuren als Bausteine für die Feinchemikalienindustrie macht dieses Enzym zu
einem hochinteressanten Modellenzym. Wir verbessern die Racemisierung von
Ornithin, einem möglichen Ausgangsstoff für die grossmassstäbliche Synthese von
Sulphostin, durch eine Aminosäureracemase von Pseudomonas putida (PpAAR).
Um die katalytische Effizienz der Racemase zu verbessern, konstruierten wir einen
Stamm, dessen Wachstum von der effizienten Umwandlung von D-zu L-Ornithin
abhängt. Unterschiede in der Leistungsfähigkeit der Racemase konnten so durch ihre
Auswirkung auf das Wachstum leicht nachvollzogen werden. Diese Strategie ist eine
der gebräuchlichsten, um verbesserte Varianten zu identifizieren. Sie ist sehr
aussichtsreich, um nicht-funktionelle Enzymvarianten auszusortieren. Um jedoch
kleinere Unterschiede im Hochdurchsatz zu detektieren, fehlen bisher die nötigen
Methoden.
Hier
demonstrieren
wir
die
erfolgreiche
Miniaturisierung
einer
wachstumsbasierten Methode zur gerichteten Enzymevolution in optisch klaren, aus
einem Hydrogel bestehenden Nanoreaktoren mit Volumina im Nanoliterbereich (NLRs,
für Englisch „nanoliter reactors“). Diese erlauben das Detektieren von kleinsten
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Wachstumsunterschieden durch die Messung der Fluoreszenz von Zellen, die ein
fluoreszierendes Proteins konstitutiv exprimieren. Dazu wird ein Gerät genutzt, das die
Fluoreszenz von Kolonien in diesen Nanoreaktoren im Hochdurchsatz messen kann.
Die Trennschärfe des Assay wurde durch die Zugabe eines Antimetaboliten erhöht.
Schlussendlich konnte eine PpAAR Variante mit 12 Mutationen isoliert werden, von
denen keine in unmittelbarer Nähe zum aktiven Zentrums liegt, deren katalytische
Effizienz jedoch 2.1-fach (D- zu L-Ornithin) bzw. 2.7-fach (L zu D) über der des
Wildtyps lag.
Um als nächstes die PpAAR Stabilität in Methanol/Wassermischungen zu optimieren,
wurde ein einfaches Protokoll entwickelt, um erhebliche Verbesserungen der Stabilität
mit geringem experimentellem Aufwand zu erzielen. Dies basierte auf der Annahme,
dass zusätzliche Argininreste auf der Oberfläche von einem Enzym das Verhalten des
Enzymes in Mischungen von organischen Lösungsmitteln und Wasser dadurch
verbessern,
dass
die
Argininreste
zusätzliche
Wasserstoffbrückenbindungen
eingehen und somit entweder die Energie erhöhen, die es braucht, um das Enzym zu
entfalten, oder das Entfernen von kritischen Wassermolekülen von der Struktur
verhindern. Durch den Vergleich mit Sequenzen von homologen Enzymen aus
thermophilen Organismen wurden passende Aminosäurerestepositionen ausgewählt
und einzeln ersetzt. Nutzbringende Mutationen wurden in einer Hauptvariante vereint
und
mittels
multipler
Hauptvariante
DNS
Rekombinationen
zwischen
Elternenzyme
und
in verschiedenen Kombinationen getestet. Dadurch, wurde
schlussendlich eine PpAAR Variante identifiziert mit einer signifikant verbesserten
Halbwertzeit in 40 % MeOH [bis zu 8-fach besser] und 30 % Acetonitril [ebenfalls bis
zu 8-fach besser], wobei die katalytische Aktivität in wässriger Lösung beibehalten
werden konnte.
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