１３２— １３９ 草 业 学 报 ２Ｏ１ ０年 １２月 ＡＣ１、 Ａ ＰＲＡ ＴＡ ＣＵ Ｉ ＴＵ ＲＡ Ｅ ＳＩＮＩＣＡ 第 ｌ９卷 第 ６期 Ｖ ０１．１９，Ｎｏ．６ 瑞 香狼 毒细胞 悬浮 培 养及 黄酮 积 累的研 究 王 文 星 ，安 琪 ，汪 莹 ，王 猛 ，曹 成有 （东北 大 学 理 学 院 生物 技 术 研究 所 ， 辽 宁 沈 阳 １１ ０００４） 摘 要 ：以瑞 香 狼 毒 顶 芽 、叶片 和 茎 段 为 外植 体 ，考 察不 同植 物 生 长 凋节 剂对 愈伤 组 织 诱 导 率 及 生 长 状 态 的影 响 。 由 疏 松 型 的 愈 伤组 织 建 立 稳 定 的瑞 香狼 毒细 胞 悬 浮 培 养 体 系 ，采 用 正交 试验 法初 步 研 究 碳 源种 类 和 植 物 生 长 调 节 剂 对 细 胞 生 长 和黄 酮 积 累 的 影 响 。结 果 表 明 ， 在 附加 了 ２， ４一 Ｄ １．０ ｍｇ／ｌ ＋ ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ的 ＭＳ培 养 基 上诱 导茎 段 可 获 得适 于悬 浮 培 养 的 疏 松 型愈 伤 组 织 ， 诱 导率 达 到 ９Ｏ 。正交 试 验 中各 因素 对 细 胞 生 长 和 黄酮 含 量 的影 响 效 应 均 为 ２， ４ Ｄ＞ 碳 源＞ ＮＡＡ＞ ６ －ＢＡ； 较 高 浓 度 的 ２，４ Ｄ、ＮＡＡ 和 ６ ＢＡ 均 有 利 于细 胞 生 长 和 黄 酮 积 累 ；蔗 糖 最 有 利 于 细胞 生 长 和黄 酮 积 累 ， 其 次 是 葡 萄 糖 和 果糖 ；适 于 细胞 生 长和 黄 酮 积 累 的培 养 摹 为 ： Ｍｓ＋２， ４一 Ｉ ）２．０ ｍｇ／Ｉ ＋ ＮＡＡ １．０ ｍｇ／Ｉ ＋６ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｉ ＋蔗 糖 ３０ ｇ／Ｉ 。细 胞 生 长 与 黄酮 积 累呈 极 显著 正 相 关 （Ｒ 一０．９６７），Ｐ％ ０．０１，这 属 于 生长 偶 联 型 的 次 生 代谢 模 型 。 关键 词 ： 瑞 香 狼 毒 ；细胞 悬 浮 培 养 ； 黄 酮 ；碳源 ；植 物生 长 调 节 剂 中 图分 类 号 ： Ｑ９４９．７６１．１； Ｑ９４２ 文 献标 识 码 ：Ａ 文章编号 ： １００４ ５７５９（２０１０）０６ ０１３２一 Ｏ８ 瑞香 狼毒 （ Ｓｔ ｅ ｌ ｌ ｅｒ ａ ｃ ｋａｍａｅ ｊａｓ ｍｅ）为瑞香 科狼毒 属多 年生草本 植物 ， 又名 断肠草 ， 分布 于东北 、华北 、 西南 、 西 北 等地 的干 草原 、 沙质草原 和典 型草原 上 ， 是我 国重要 的传统 中药［ ＝ １ ］。 自 ２０世 纪 ６０年代 起 ，我 国学者 已从 瑞 香 狼毒 中分离 并鉴定 出 ３ ０多种化合 物 ，主要包括 甾醇 、酚类成 分 、氨基 酸 、 三萜类、 蒽 甙 、狼毒 甙及 有 毒 高分 子有 机 酸等 。其 中酚类成 分 中的黄酮类化 合物 一因有抗肿 瘤 、 抗 ＨＩ Ｖ【 、 抑 菌』１、杀虫 。 等 药用 价值 而被 广泛 研 究。 由于瑞香 狼毒这 些药用 成分 主要通 过定期 到生长地 取材再 分离 纯化来 获取 ， 难 免会受 到植 物收获 期 、 地理 环 境、 土壤 结构 、季节气 候 、 植物 病虫 害等 因素影响 ， 因而 ，在产业 化过 程 的研 究 中还可 以考 虑用 细 胞悬 浮 培养 方式 来获取 。这一 途径具 有生产周 期相对 较短 ， 不受地 区和季 节限制 ， 避免病 虫危 害 ， 所 得产物 品质稳 定 ， 利 于大规模 培养 ， 且 可人为 调控细胞 生长 及其药用 成分 的代谢 途 径获 得 “高 产细 胞 株”等优 点一 一，已成 为开 发药 用植 物 资源 的重要 途径 。利 用植 物细胞悬 浮培养 生产 黄酮类化 合物 的研究报 道 已有 不少 。其 中 ， 袁宗 泉等口 报道 了细胞生 长期 、 苯 丙氨酸 和放线 菌 一Ｄ对银 杏 （ Ｇｉ ｎｋｇｏｂｉ ｌ ｏｂａ）黄酮产 量的影 响 ； 赵 德修等 口 ｊ报道 了不 同理 化因子对 水母 雪莲 （ Ｓａｕｓ ｓ ｕｒｅ ａ ｍｅ ｄｕｓ ａ）培养 细胞 中黄酮形成 的影 响 以及 高产黄酮 雪莲 细胞 系的筛选 等 。Ｓｍｉ ｔ ｈ和 Ｒｅ ｉ ｄｕ 对植 物 细 胞 悬 浮 培 养 与 黄 酮 类 化 合 物 的 积 累 关 系及 李 燕 等 对 植 物 组 织 和 细 胞 培 养 中 黄 酮 类 物 质 积 累 的 影 响 因 素 进行 了阐述 ； 罗建平 等 。 报道 了茉莉 酸 甲酯 、 水 杨酸 和一 氧 化氮 诱 导及 稀 土元 素对 怀 槐 （ Ｍａａｃ ｋｉ ａ ａｌ ￣ ｌ ｕｒ ｅ ｎｓ ｉ ｓ） 悬 浮培养 细胞异黄 酮合成 的影 响及细胞 结构变 化 ； 崔兴 华等口。 报道 了黑暗培 养条 件下 甘薯 （Ｉ ｐｏｍｏｅ ａ ｂａｔ ａｔ ａｓ）悬 浮细 胞黄酮类 物质 的积 累情 况 。尽 管上述 这些 报道为 其他植 物 细胞 培养 及 黄酮积 累 的研 究提 供参 考 ， 但 是每 种 植物 基 因型 及生长条 件等存 在差 异 ，因而没有标 准 的培 养 条件来 适 合昕有 植 物 的细胞 培 养及 产 物积 累 。 由于 目 前 尚未见到 有建立瑞 香狼 毒细胞悬 浮培 养体系 以及用来 积 累黄 酮 的研究 报道 ， 所 以本 研究 通 过不 同植 物 生长 调 节剂 组合诱 导瑞香狼 毒顶 芽 、叶片和茎段 ， 得到 松散型 愈伤组织 ， 然后 建立稳 定 的细胞悬 浮培养 体系 ， 用 正交试 验 方法 初步研 究碳源种 类 、 ２， ４－ 二 氯 苯 氧 乙 酸 （２， ４一 ｄｉ ｃ ｈｌ ｏｒ 。ｐｈｅ ｎｏｘｙａｃｅ ｔ ｉ ｃ ａｃ ｉ ｄ，２， ４一 Ｄ）、 萘 乙酸 （ ｎａｐｈｔ ｈａｌ ｅ ｎｅ ａｃ ｅ— ｔ ｉ ｃ ａｃ ｉ ｄ，ＮＡＡ）和 ６苄 氨基腺 嘌呤 （ ６－ ｂｅ ｎｚ ｙｌ ａｍｉ ｎｏｐｕｒ ｉ ｎｅ，６ ＢＡ）对瑞 香 狼 毒细 胞 生长 和黄 酮 积 累的影 响 ， 为进 一 步研 究和开 发利用瑞 香狼 毒细胞 生产黄 酮类物 质提供 参考 。 收 稿 日期 ： ２Ｏ１ｏ一 ０３ — ２９； 政 同 日期 ： ２Ｏ１Ｏ Ｏ５— ２５ 基 金 项 目：国家 “十 一 五”科 技 支 撑计 划项 目（２（ 】 （ ） ６Ｉ ３ ＡＤ２６ＢＯ４） 和 国家 大学 生创 新 性 实 验计 划 项 日（０８０１０５）资助 。 作 者 简介 ： 王文星 ｆ １９７３）， 女． 辽 宁 沈 阳人 ， 讲 师 ，博士 。Ｅ ｍａｉ ｌ ： ｗａｎｇｗｅ ｎｘＪ ｎｇ＠ １ ２６．ｇ ＯＩ Ｔ ［ ］ ＊通 讯 作者 。Ｅ ｍａ ｉ ｌ： ｃａ ｏｃ ｈｅ ｎｇｙｏｕ＠ １ ６３ ．Ｃ Ｏ Ｉ ｎ 第 １９卷第 ６期 草 业 学 报 ２０１０年 １ ３３ １ 材 料 与 方 法 １．１ 供 试 材 料 本试 验 所采用 的材料 是 瑞 香 狼 毒 幼 苗 ，于 ２００８年 ５月 上 旬 采 自内蒙 古 翁 牛 特 旗 乌 兰 敖 都 地 区 碱 化 草 场 （ ４３。０２ Ｎ，１１ ９。３９ Ｅ）， 幼 苗连 根取 回后栽在 花盆 中复壮 ， 备用 。 １．２ 方 法 １．２．１ 愈伤 组织 的诱导 与继代 在离 体培养 中 ， 外 植体 是决 定 培养 是否 成 功 的关 键 因素 之一 ， 大 多数 植 物在 其 生长 刚开始 的季节 采样较好 ， 往往 较易 培养成 功 。在天气 晴 朗的 中午 １ ２： 。（ ］ 一１４： Ｏ（ ）时 ， 从 瑞 香狼 毒幼 苗上 剪 取生长 旺盛 的新 枝置 于烧杯 中， 用纱 布封 口后 流水 冲洗 ４～５ ｈ， 在 超 净工 作 台上 取 其顶 芽 （约 １．０ ｃ ｍ 长 ）、叶片 （沿 叶脉剪几个 裂 口）或无腋 芽 的茎段 （约 １．０ ｃ ｍ 长 ），先用 ７５ 乙醇 浸泡 ３０ Ｓ， 再用 ５ 次 氯 酸 钠溶 液 消毒 １Ｏ ｍｉ ｎ和无 菌水漂诜 ５遍后 ， 无 菌滤 纸 吸干 表 面 水分 ，接种 于 附加 不 同植 物 生长 调 节 剂 的 ＭＳ固体 培 养 基 （含 ３０ ｇ／Ｉ 蔗糖 和 ７ ｇ／Ｌ琼脂 ， ｐＨ ５．８～６．０） 上 。每 组 １５瓶 ，每瓶 接 种 ３个外 植 体 。在培 养 温度 为 （２５±２） Ｃ，光照 强 度 为 ４０“ｔ ｏｏｌ ／（ ｒ ｎ ・ｓ）， 光 照 １２ ｈ／ｄ下 ， 诱 导愈 伤组织 。愈 伤组织 诱导率 一（每组诱 导 愈伤组 织 数 ÷每组 接种 外 植体 总数）×１００ 。 以附加 １．０ ｍｇ／Ｌ ２， ４一 Ｄ 和 ０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ 的 ＭＳ固体培养 基为继 代培 养基 ，每 ２５ ｄ愈伤 组 织 继 代 １次 。 １．２．２ 细胞悬 浮培养 体系 的建立 取继 代培 养 ２或 ３次 的松散 型愈伤 组织 ， 转 入与 继代 培养 基相 同 配方 的 １ ００ ｍＩ 液体 培养基 中， 接 种量 为鲜 重 ４０ ｇ／Ｌ，１２０ ｒ／ｍｉ ｎ振荡 悬浮 培养 。每 ７ ｄ将 细胞经 ４Ｏ目筛 网过滤 后接 种人 新 鲜 培养基 中， 经 过 ４或 ５代 的培养 ， 逐渐形 成稳 定 的悬 浮细 胞 系 。 自细 胞悬 浮 培养 开 始 ，每 ３ ｄ用 已灭 菌 的 吸管 吸取 １滴 约黄 豆粒大 小 的培 养液 置于载玻 片上 ， 放在 相差显 微镜 （德 国徕 卡 ）下 观察 悬 浮细胞 的形态 、 分 散程 度 ， 用成像 系统拍 照 。 １．２．３ 细胞生 长测 定 参 照文献 ［２０］，自接 种 日起 ， 每 ３ ｄ取 １Ｏ ｍＬ细胞 悬浮 液测 定 １次 ，５ ０００ ｒ ／ｒ ａｉ ｎ离 心 １０ ｍｉ ｎ， 去上 清液 ， 蒸 馏 水 洗 涤 ３次 ， 过 滤 后 称 得 细 胞 鲜 重 （ＦＷ ， ｇ／Ｌ）， ６０℃烘 干 至 恒 重 即 得 细 胞 干 重 （ＤＷ ， ｇ／ｉ ），试 验 重 复 ３次 。 １．２．４ 黄酮 的提取 和含量测 定 参 照文 献［２１］方法 提取 和测定 细胞黄 酮 。收获瑞香 狼毒 悬浮细 胞 ， 蒸馏 水漂洗 ３次 ， ６０℃干燥 至恒 重 ， 称 取 ０．５ ｇ研 磨 并过 １ ００目筛 网后 ， 加 ７５ 乙醇 １５ ｍＬ， 超声 提取 ６０ ｍｉ ｎ。取 出，放冷 至 室温， 用 ０．２２ Ｍｍ 一次 性滤膜 过滤 ， 补足损 失溶 液 。取 ２．５ ｍＬ于 １Ｏ ｍＬ容 量瓶 中 ， 用 甲醇稀 释 至刻 度 ， 摇 匀 ，即 得 供试 品溶液 ， 试 验重 复 ３次 。以芦 丁为标 准 品（购 自中 国药 品生 物制 品检定 所 ）， 用 ＵＶ一 ２１ ００分光 光 度计 测定 ５１０ ｎｍ 下 的吸光 度值并 绘 制标准 曲线 ， 得 芦 丁质量 浓度 Ｃ（ｇ／Ｉ ）与 吸光 度 Ａ 的线性 回归方 程为 Ａ一０．０１２ ７ Ｃ＋ ０．０００ ５， 相关 系数 ｒ一０．９９９ ９。然后测 定供 试 品溶 液 的吸光度 值 ， 从 标准 曲线上计 算 出该溶液 的黄酮 含量 。 １．２． ５ 试 验设计 与统计 分析 在前 面基础 上 ， 利 用正 交试验 考察 培养基 中碳源 种类 、２， ４～ Ｄ、 ＮＡＡ 和 ６ ＢＡ 四种 因素对瑞香 狼毒 细胞生 长和黄 酮积 累 的影 响 。选 用 Ｌ。（３ ） 正 交表进 行 ４因素 ３水平 （表 １）， 共 ９种组合 试 验 ， 所 用碳 源浓度 均为 ３０ ｇ／ｉ ， ｐＨ 均为 ５．８－ ６．０。各组 合均 采用 ２５０ ｍＬ三角 瓶 ， 装 液量 为 １００ ｍＬ， 接种 量为鲜 重 ４０ ｇ／Ｌ，ＭＳ培养 基 为基本培 养基 ， 每组接 种 ５瓶 ， 试验 重 复 ３次 ，结果 取 平 均值 。培 养 温度 均为 （ ２５±１） Ｃ， 振摇 速 度 为 １２０ ｒ ／ｒ ａｉ ｎ，暗培养 。细胞 培养 １ ８ ｄ时收获 每 Ｉ 细胞干 重 ， 用 细胞增 长量 （ｇ／Ｉ ）一细胞 收获量 一接种量 ， 细胞 增长 率 （ ）一细 胞增 长 量 ×１００／接 种量 ， 表 示 各组 合 的细胞生 长变化 。同时根 据 １．２．４中方法测 定各组 合 表 １ Ｌ，（ ３ ） 正 交 设 计 的 因 素 与 水 平 的细胞 黄酮含 量 。用 ＳＰＳＳ １１．５软 件分 析 数 据 ，以 方 Ｔａｂｌ ｅ １ Ｌ９（ ３ ）ｏｒｔ ｈｏｇｏｎａｌ ｄｅ ｓ ｉ ｇｎ ｆ ａｃ ｔ ｏｒ ｓ ａｎｄ ｌ ｅｖｅ ｌ ｓ 差分析 、极 差 分 析 、相 关 性 分 析 和 最 小 显 著 差 数 法 （Ｉ ＳＤ）多 重 比较 。 ２ 结 果 与 分 析 ２．１ 愈 伤 组 织 的 诱 导 与 继 代 外 植 体 和植 物 生 长 调 节 剂 是 获 得 所 要 愈 伤 组 织 的 关键 因素 】， 即使 相 同 品种 的不 同外植 体 之 间也 会 １３４ ＡＣＴＡ ＰＲＡ ＴＡ ＣＵ ＬＴＵ Ｒ ＡＥ Ｓ１ ＮＩ ＣＡ （２０１ Ｏ） 口 顶 芽 Ｂｕｄ 口 叶 片 Ｌｅａｆ 存在差异ｌ ２ 。 结 果表 明 ， 瑞 香狼 毒顶 芽 、叶 片和茎 段 的 脱分 化能力存 在 明显 的差 别 （图 １）。在相 同生 长调 节 剂组 合下 ， 茎 段 的愈伤 诱 导率 都 是 最高 ， 其 次 是 叶片 ， Ｖ ０１ ．１９， Ｎ ｏ．６ ｌＯＯ ８Ｏ 最低 是顶 芽 。比较 不 同生 长调 节 剂组 合 可 看 出 ．附加 ２．０ ｍｇ／Ｌ ２， ４一 Ｄ的培 养基 对 所 有外 植 体 的 愈 伤诱 导 率 皆最高 ， 其 次是 附加 了 １．０ ｍｇ／Ｌ ２， ４一 Ｄ＋０．１ ｒ ｎｇ／Ｌ ６０ ４Ｏ ＮＡＡ 组合 ， 而所有 附加 了 ６ － ＢＡ 的 培养基 上 的外植 体 愈伤 诱导率 均较低 。从 愈 伤组 织 生 长状 态 来看 ， 顶 芽 仅能诱 导 出绿色致 密的小 团愈伤组 织 ， 且 生长缓慢 ， 少 ２Ｏ Ｏ Ａ 数能 由芽生 芽 途 径 出苗 （图 ２Ａ）；叶 片和 茎 段 在 附 加 ６－ ＢＡ的培养 基上都诱 导 出绿色 致 密 的愈伤 组织 ， 且 生 长较 慢 （图 ２Ｂ， Ｃ）；叶片在 附加 ２， ４ Ｄ 的培养 基上 能诱 Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ 生 长 调 节 剂 组 合 Ｇｒ ｏｗｔ ｈ ｒｅ ｇｕｌ ａ ｔ ｏｒ ｃｏｍｂｉ ｎａ ｔ ｉ ｏｎ 图１ 不 同外 植 体 和 植 物 生 长 调节 剂 组 合 对 愈伤 组 织诱 导 率 的 影 响 导 出 黄 绿 色 较 致 密 的 愈 伤 组 织 ；茎 段 在 附 加 了 １．０ Ｆｉ ｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉ ｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｐｌ ａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌ ａｔｏｒ ｍｇ／Ｌ ２， ４一 Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ 的培 养基 上 才 能诱 导 ｃｏｍ ｂｉ ｎａｔｉ ｏｎｓ ｏｎ ｃａｌｌ ｕｓ ｉ ｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ 出黄 绿色 、 质 料 （ ＿ ｏ ／ ０ 地松散 易 ０ ０ 颗粒 ｌｓ； Ｉｌ 对Ｕ 碎 、 小 、 生 长 旺盛 的愈伤 组 Ａ ：６ ＢＡ １．０ ｍ ｇ／ｌ ＮＡＡ ０．０１ ｍｇ／Ｌ；Ｂ：６－ＢＡ ０．１ ｒ ａｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ 织 （图 ２Ｄ）， 它们 常作 为 悬 浮培 养 的起 始 材料 ， 在 此 培 １． ０ ｎ ａ ｇ／Ｌ；Ｃ：６ － ＢＡ １．０ ｒ ａｇ／ Ｉ ＋ ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｉ ；Ｄ：２， ４－ Ｄ １ ．０ ａｇ／１ ｒ ； 养基 上继代这 种生长 旺盛 、 松 散易碎 的愈伤 组织 。 Ｅ：２． ４ Ｄ ２． ０ ｍｇ／Ｌ；Ｆ：２， ４ Ｄ １．０ ｍｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ 图 ２ 瑞 香 狼 毒细 胞 悬 浮 培 养体 系 的 建 立 Ｆｉ ｇ．２ Ｅｓ ｔ ａｂｌ ｉ ｓ ｈｍｅｎｔ ｏｆ ｃ ｅｌ ｌ ｓ ｕｓ ｐｅｎｓ ｉ ｏｎ ｃｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｓ ｙｓ ｔ ｅｍ ｏｆ Ｓ．ｃ ｈａｍａｅｊａｓ ｍｅ Ａ：一 个 顶 芽形 成 一 株 苗 Ａ ｐｌ ａｎｔ ｌ ｅ ｔ ｇｅｎｅ ｒ ａｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏｍ ａ ｂｕ ｄ； Ｂ：诱 导 叶 片 获得 愈 伤 组 织 Ｃａ ｌ ｌ ｕｓ ｉ ｎｄｕｃ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏｍ ｌ ｅａ ｆ； Ｃ：ＭＳ＋６一 ＢＡ ０ ・１ ａｇ／ ｒ Ｌ￣ＮＡＡ １・０ ｍｇ／Ｌ诱 导茎 段 获 得 愈 伤组 织 （ ： ａ ｌ ｌ ｕｓ ｉ ｎｄｕ（ ， ｅｄ ｆ ｒ ｏ ｎ１ ｓ ｔ ｅ ｍ ｓｅ ｇｎ１ ｅ ｎＴ ｏｎ ｔ ｈｅ ｍｅｄｉ ｕｍ ｏｆ ＭＳ＋ ６ ＢＡ ０．１ ｎ ａ ｇ Ｉ ＋ ＮＡＡ １．０ ｍｇ／Ｌ； Ｄ：ＭＳ＋２， ４－ Ｄ １・０ ｎ ａ ｇ／Ｌ ＋ ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ诱 导茎 段 获 得 愈 伤组 织 Ｃａｌ ｌ ｕｓ ｉ ｎｄｕｃ ｅｄ ｆ ｒ ｏｍ ｓ ｔ ｅｍ ｓ ｅ ｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔ ｈｅ ｍｅ ｄｉ ｕｍ ｏｆ ＭＳ＋ ２・ ４ Ｄ １．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．１ ｒ ａｇ／Ｌ； Ｅ：悬 浮 细 胞 启 动 Ｔｈｅ ｓ ｔ ａｒ ｔｕ ｐ。ｆ ｓ ｕｓｐｅ ｎｓ １ 。ｎ ｃｅ ｌ １ ；Ｆ：悬 浮 培 养 细 胞 系 Ｓｕｓ ｐｅｎｓ ｉ ｏｎ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎｅｓ； Ｇ：初 期 悬 浮 细 胞 （× ２ ００ ３ Ｓｕｓ ｐｅｎｓ ｉ ｏｎ ｃｅ ｌ ｌ ｓ ａ ｔ ｅａ ｒ ｌ ｙ ｓ ｔ ａ ｇｅ （×２０ ０）；Ｈ：继 代 ３次悬 浮 细 胞 （× １ ００）Ｓｕｓ ｐｅｎｓ ｉ ｏｎ ｃ ｅ ｉ ｌ ｓ ｐ ｒｏ ｌ ｉ ｆ ｅｒ ａ ｔ ｅ ｄ ３ ｔ ｉ ｍｅｓ（×４００）； １：继 代 ４次 悬 浮 细 胞 （×４０ ０）Ｓｕｓ ｐｅｎｓ ｉ ｏｎ ｃ ｅｌ ｌ ｓ ｐｒ ｏｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａｔ ｅ ｄ ４ ｔｔ ｍ ｅｓ（× ４００） 第 １ ９卷 第 ６期 草 业 学 报 ２０１０年 ２．２ 细 胞 悬 浮 培 养 体 系 的 建 立 及 形 态 观 察 挑选继代 ２或 ３次后 的松散 易碎 的愈伤组 织转入 与继 代培养 基相 同配方 的液 体培养基 中振 荡培养 。初代培 养时细胞 生长缓 慢 ， 细 胞分散 不均 匀 ， 底 部有大 小不一 的细 胞 团（图 ２Ｅ）， 继代 ４代后 生长 加快 ， 悬 浮 系分散 均匀 ， 没有 明显 的大颗 粒细胞 团出现 （图 ２Ｆ）。通 过相 差 显 微镜 观 察 ， 第 １代 细 胞多 数 成 团 ，细胞 内含 物少 ， 形 状 不规 则， 似 钩形 向外 延伸 （图 ２Ｇ）； 第 ２和 ３次继代 后 ， 细胞 团变小 ， 形 状趋 于长 圆形 （图 ２Ｈ）； 第 ４次继 代后 ， 基本 由多 个细胞组 成 ， 形状 接近 球形 ， 细胞核 大 ，内含物较 多 （图 ２Ｉ ）。经过 ４或 ５次继 代 以后 ， 就建 立起 分 散性好 、 生 长周 期较短 的稳定瑞 香狼 毒悬浮 细胞 系 ， 用 于其次生 代谢 产物 的研究 中 。 ２． ３ 悬 浮 细 胞 生 长 及 黄 酮 积 累 的 时 间进 程 图 ３是 在 附 加 １．０ ｍｇ／［ ２，４一 Ｄ＋ ０．１ ｍｇ／Ｉ ｌ・ ４ ＮＡＡ 的 ＭＳ液 体培养 基 上 继代 ５次 后 的瑞 香 狼 毒 ｌ・ ２ 悬 浮细胞 生 长 以 及 黄 酮 积 累 随 培养 时 间 的 变 化 情 １． ０ 况。悬浮细胞的生长 曲线基本符合“ｓ”型， ０～６ ｄ 蚤 为延 迟期 ， ６～１５ ｄ为指 数 生长 期 ，１５ ｄ后进 入 稳 定 喜 ≥ 期 。悬浮细 胞 的干 重 以及 黄酮 的积 累都随培 养时 间 ２ ０ ８ ０． ８Ｋ ￣ ｏ一６ 熹 Ｏ． ４ ６ ４ ２ Ｏ Ｏ ２ 的增加 而增加 ， 培养 １８ ｄ后 细胞 于重 和黄 酮含 量都 基本 保持不 变 （图 ３）， 表 明 瑞香 狼 毒 悬 浮 培 养 细胞 中黄 酮生物 合成 与细 胞生 长属 于生长 偶联型 的次生 代谢模 型 。 ２．４ 不 同因素组合 对 瑞 香狼 毒 细 胞 生 长和 黄 酮含 量 的 影 响 Ｏ Ｏ ３ ６ ９ ｌ ２ ｌ ５ ｌ ８ ２１ ２４ 培 养 时 间 Ｃｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｔ ｉ ｍｅ（ ｄ） 图 ３ 瑞 香 狼 毒 细 胞 生 长 和 黄酮 积 累的 时 间进 程 Ｆｉｇ．３ Ｔｉ ｍ ｅ－ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔ ｈ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉ ｄｓ ａｃ ｃｕｍｕｌ ａｔ ｉ ｏｎ ｉ ｎ Ｓ．ｃｈａｍａｅ ｊａｓｍｅ 在上 面研究 的基础 上 ， 进 一 步采 用 Ｉ 。（３ ）正 交 试验 ， 考 察不 同碳源 种类和植 物生 长调节 剂对瑞 香狼 毒细胞 生长 和黄酮 积 累的影 响 。收获 培养 １ ８ ｄ的悬 浮细胞 进 行细胞增 长率 和黄酮 含量 的测定 ， 其结 果见表 ２。９种组 合之 间 的细胞 生 长有 较大 差 异 ： 分 别 利用 葡 萄糖 和果 糖 作碳源 的 ４和 ７号细 胞生 长最慢 ， 黄酮含 量也 最少 ， 为 ０．４６ ｍｇ／ｇ； 利 用蔗糖 作碳源 的 ３号 细胞 生长最 旺 盛 ， 细 胞增 长率达 到 ４５３ ， 黄酮 含量最 多 ， 达 到 ２．１４ ｍｇ／ｇ ＤＷ 。 ４种 因素对 瑞香狼 毒细胞 生 长和黄酮 含量 的影 响效应 关系均 为 ２， ４ － Ｄ＞碳源 ＞ＮＡＡ＞６一 ＢＡ （ 表 ２， ３）。对细 胞生 长而言 ， ２， ４一 Ｄ和碳 源 的影响 均达到 显著水 平 （ Ｐ＜０．０５），其 中以 ２．０ ｍｇ／Ｌ ２， ４ 一 Ｄ 和蔗糖 影 响最 为显 著 （表 ２，３）； 对细 胞 中 黄酮 含 量 而言 ， ４种 因素 均 有 显 著 影 响 （ Ｐ＜ ０．０５），其 中 以 ２．０ ｍｇ／Ｉ ２，４一 Ｄ、蔗 糖 、１ ．０ ｍｇ／Ｉ ＮＡＡ和 ０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ ＢＡ 影响最 为显 著 。各 因素 的理论最 佳水 平组合 为 ： 适宜 细胞 生 长 的培养 基为 ＭＳ＋２， ４～ Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．５ ｍｇ／Ｉ ＋６ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｉ ＋蔗糖 ３０ ｇ／Ｌ； 利于 细胞 中黄酮积 累的 培养基为 ＭＳ＋２， ４ Ｄ ２．０ ｍｇ Ｌ十ＮＡＡ １．０ ｍｇ／Ｌ＋６－ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋蔗糖 ３０ ｇ／Ｌ （表 ２）。 由于 ＮＡＡ对 细胞生 长影 响不显 著 ， 而对 黄酮 含量影 响显著 ， 所 以 ＮＡＡ 含量 可用 １．０ ｍｇ／Ｌ而 不受影 响 。综 合 上述 结果 ， 可 以得 出既适 于瑞 香狼 毒细胞 生长 又 利 于 细 胞 中黄 酮 积 累 的 适 宜 培 养 基 为 ： ＭＳ＋ ２， ４ 一 Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ １ ．０ ｍｇ／Ｌ＋ ６－ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋ 蔗 糖 ３０ ｇ／ｉ 。 ２． ５ 瑞香 狼毒 细胞增 长率 与黄酮积 累的关 系 瑞 香狼 毒细胞 增长率 与黄 酮含量 的变化 趋势相 一致 （表 ２）， 其 线性相 关 系数 （Ｒ。）为 ０．９６７（ｎ一９）， Ｐ＜０．０１， 呈极显 著正 相关关 系 。这 表 明随着细胞 密度 的增加 ， 细胞 中黄 酮 类物 质 积累也 越 多 ， 这 与 ２．３的结 果 一致 ， 也 与 黑 暗条件 下甘薯 悬 浮细胞 黄酮类物 质积 累 的结果 一 致ｍ ，因 而在 瑞香 狼 毒悬 浮 细胞 培 养 中 ， 黄 酮含 量 受细 胞密 度等 因素 的显 著影 响 ， 可通 过调节 细胞 密度等 手段来 提高黄 酮类 物质 的积 累。 ３ 讨 论 ３．１ 愈 伤 组 织 的 诱 导 与 悬 浮 细胞 系 的 建 立 建立 悬浮 细胞培养 是实 现植物 次生代 谢产 物工业 化生 产 的重要 途 径 ， 愈 伤组 织 的外 观形 态 和生 长状 态 直接 ＡＣＴＡ ＰＲ ＡＴＡ ＣＵ 】 ＴＵ Ｒ ＡＥ ＳＩＮ ＩＣＡ （２０１０） Ｖ ｏ１ ．１９，Ｎｏ．６ 影 响到建立 的悬浮 细胞系 的质量 ， 通常挑选 颗粒 小 、 松散 易脆 、生长 旺盛 的愈 伤组 织作 为悬 浮 培养 的材 料口 。要 获得 理想 的愈伤组织 ， 选择适 宜 的外植体 和植物 生长调节 剂组合 是关键 。本试 验发 现 ，只有 茎段 在 附加 了 ２， ４ Ｄ 与 ＮＡＡ 的培 养基上 能诱导 出结构 松散 ，颗粒状 ， 生长 旺盛 的愈伤 组织 ， 且愈 伤诱 导 率也 较 高 ， 为 ９Ｏ％ ，而顶 芽 和 叶片不论 在附加 了何种植 物生 长调节 剂组合 的培养 基上都 只能诱 导 出结 构致 密 、 生长 慢 的愈 伤组织类 型 。此 外 ， ６ － ＢＡ、 ＮＡＡ 和 ２， ４一 Ｄ的不 同激 素组合 对诱 导的愈 伤组 织 类 型也有 很 大 的影 响 ：在 附加 了 ６ 一 ＢＡ 和 ＮＡＡ 组合 的 培养基上 不论哪 种外植体 都 只能诱导 出绿色 致密 ， 生 长缓慢 的愈伤 组织类 型 ； 仅 附加 了 ２， ４ 一 Ｄ 的培 养基上 只能诱 导 出黄绿 色较致 密 ， 生 长较慢 的愈伤 组织类 型 ， 但是 当 ２， ４ Ｄ 与少 量 ＮＡＡ组 合后 愈伤组织 状 态转变 为 黄绿 色松 散， 表面 润湿 ， 生 长旺盛 的愈伤组 织类 型 ， 表 明 ２， ４ Ｄ 对 瑞 香 狼 毒 愈 伤 组 织 的 诱 导 能 力 最 强 ，ＮＡＡ 能 够 有 效 地 调 节 愈伤组 织的生 长状态 ， ６ － ＢＡ不 太适于瑞 香狼毒 用于悬 浮培养 的愈 伤组织诱 导 。 表 ２ （ ３ ）正 交 试 验 设 计与 试 验 结 果 Ｔａｂｌ ｅ ２ Ｌ９（ ３ ）ｏｒ ｔ ｈｏｇｏｎａｌ ｔ ｅｓ ｔ ｄｅｓ ｉ ｇ ｎ ａｎｄ ｔ ｒｉ ａｌ ｒｅｓ ｕｌ ｔ ｓ 注 ：同列 数 字后 不 同字 母 分 别代 表 ０．０５水平 差 异 显 著 。 Ｋ 、 Ｋ。、 Ｋ。、 Ｒ 为细 胞 增 长 率数 据 ； Ｍ１、 Ｍｚ、 Ｍ。、 Ｒｚ为 黄 酮 含量 数 据 。 Ｎｏｔｅ：Ｍ ｅａｎｓ ｐｒｅｃｅｄｉ ｎｇ ｔｈｅ ｄｉ ｆ ｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔ ｅｒｓ ｆ ｏｒ ｅａｃｈ ｌｉ ｎｅ ｗｅｒｅ ｓｉ ｇｎｉ ｆｉ ｃａｎｔ ｄｉ ｆ ｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ５ ｐｒｏｂａｂｉ ｌ ｉ ｔｙ ａｓ ｄｅｔ ｅｒｍｉ ｎｅｄ ｂｙ ＬＳＤ ｍｕｌ ｔ ｉｐｌｅ ｃｏｍ ｐａｒｉ ｓｏｎｓ Ｋ １．Ｋ２，Ｋ３，Ｒ１ ａｒｅ ｔ ｈｅ ｄａｔａ ｏｆ ｔｈｅ ｉ ｎｃｒ ｅａｓｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｅｌ ｌ ｄｒｙ ｗｅｉ ｇｈｔ；Ｍ １，Ｍ ２，Ｍ ．Ｒｚ ａｒｅ ｔｈｅ ｄａｔａ ｏｆ ｆｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ｃｏｎｔ ｅｎｔ ． 表 ３ 瑞 香 狼 毒 细胞 增 长 率 和 黄 酮 含 量 的 方差 分 析 Ｔａｂｌ ｅ ３ Ｖａｒｉ ａｎｃ ｅ ａｎａｌ ｙｓ ｉ ｓ ｏｆ ｔ ｈｅ ｉ ｎｃｒ ｅａ ｓｅ ｒａｔ ｅ ｏｆ ｃｅｌ ｌ ｄｒ ｙ ｗｅｉ ｇｈｔ ａｎｄ ｆ ｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ｃ ｏｎｔ ｅｎｔ ｏｆ Ｓ．ｃｈａｍａｅ ｊａｓ ｍｅ 注 ：＊ 表 示 差异 达 到 显著 水 平 （ Ｐ％ ｏ． ０５）， Ｆｕ ｏ Ｊ（２， １ ８）一３．５５。 Ｎ ｏｔ ｅ： ＊ ｍ ｅａｎｓ ｓｉ ｇｎｉ ｆ ｉｃａｎｔ ｄｉ ｆ ｆｅｒ ｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０．０５，Ｆ０ ０ ５（２，１８）一 ３．５５ 第 １９卷 第 ６期 草 业 学 报 ２０１０年 １３７ 建立 细胞悬 浮培养体 系 ， 还要 考虑 培养 条件对 悬浮 细胞 的影响 。一般悬 浮 细胞生 活力较 弱 ， 强光 容易 引起 细 胞膜 的光氧化 ， 对细胞 生 活力造成 损伤 ， 所 以本试验 采用 光照条 件下诱 导瑞香 狼 毒 的愈伤 组织 ， 而 细胞 悬浮 培 养 时转 入 暗培 养条件 下 。本 试验 中发现摇 床转 速超 过 １３０ ｒ ／ｍｉ ｎ或低 于 １００ ｒ ／ｍｉ ｎ都 不利 于瑞 香狼 毒 细胞 的生 长 。还 有 ，当细胞接 种量超 过鲜重 ４０ ｇ／Ｌ时 ， 细胞增 长率 下 降 ， 培养 液有粘稠 挂壁 以及 细胞褐 化 的现 象 。 ３．２ 碳 源种 类 对 悬 浮 细 胞 生 长 和 黄 酮 积 累 的 影 响 碳 源是细胞 生长 的能量 来源 和构成 细胞骨 架 的重要成 分 以及 调节 细胞渗 透压作 用 。碳 源对 植物次 生代谢 的 作用 ， 首 先表现 在不 同的碳 源对次 生代谢 产物 的积 累及细胞 的生长 不 一样 上［ １ 。研 究 表 明 ， 蔗 糖对 人参 （ Ｐａｎａｚ ｇｉ ｎｓ ｅｎｇ）色 素细胞 生长及 花苷 的积 累效 果 最好 ， 其 次 是 葡萄 糖ｌ ２ 。在 银杏 细 胞 悬浮 培 养 中 ，蔗糖 最 有利 于 细 胞 中黄酮 合成 ， 葡 萄糖最 有利 于细胞 生长 。还有研 究报 道高浓 度 的蔗糖 可提高 细胞 的生 物量 和 次生 代谢 产物 的 含量 。 。通 常认 为 ， 蔗糖作 为很 好 的碳 源 ， 是 通过植 物细胞 壁 上 的转化 酶 ， 在微 酸性 环境 下 迅速 被分 解成 等分 子量 的果 糖和葡 萄糖 ， 细胞优 先吸 收葡萄 糖后 再利 用 果 糖 。本试 验 中发现 ， 蔗 糖对 瑞 香狼 毒 细胞 生 长和 黄酮 积累都是 最有利 的 ， 其次 是葡 萄糖 和果糖 。葡萄糖 和果 糖之 间对黄 酮积 累的差 异不显 著 ， 而对 细胞 生长有 显著差 异， 葡萄糖 要优 于果糖 。 ３．３ 植 物 生 长 调 节 剂 对 悬 浮 细 胞 生 长 和 黄 酮 积 累 的影 响 植物 生长调节 剂 的种类与浓 度 以及组合 方式 等是植 物细胞 生长 和次生 代谢 产物积 累研究 中要考 虑 的重 要影 响因素 。研 究表 明 ， 在银 杏细胞 悬浮培 养 中 ， ＮＡＡ 与激动素 （ ６－ ｆ ｕｒ ｉ ｆ ｕｒ ｙｌ — ａｍｉ ｎｏｐｕｒｉ ｎｅ，ＫＴ）组合有利 于 细胞生 长 和黄酮 糖苷 的积 累 ，而 ２，４ 一 Ｄ、 赤 霉 素 （ｇｉ ｂｂｅｒ ｅ ｌ ｌ ｉ ｎｓ，ＧＡ。）和玉 米 素 （ ｚｅ ａｔ ｉ ｎ，ＺＴ）对 其 有抑 制作 用 ＿ ３ 。在 喜 树 （ Ｃａｍｐｔ ｏｔ ｈｅ ｃ ａ ａｃ ｕｍｉ ｎａｔ ａ）细胞 培养 中 ， 适 当浓度 的 ２， ４ Ｄ可 以显 著 提 高花青 素 的产 量 ， 但 是 高浓 度会 产 生抑 制 作 用 。 在 巨 峰 葡 萄 （ Ｖｉ ｔ ｉ ｓ ｖｉ ｎｉ ｆｅ ｒ ａ）细 胞 悬 浮 培 养 中 ，１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ 和 ０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ ＢＡ 能 够 促 进 细 胞 快 速 生长 ， 而 ２， ４一 Ｄ 的添加会 产生抑 制作用 。由此可 看 出 ，不 同植物 生 长 调节 剂对 不 同植 物 细胞 生 长 和产物 的积 累有 明显 的差 异 。在 本试验 中发 现 ， ２， ４－ Ｄ是最 主要 的影 响因素 ， 较高浓 度 的 ２， ４一 Ｄ对瑞 香 狼毒 细胞 生长 和黄 酮 积累都 是有利 的 ； ＮＡＡ 和 ６一 ＢＡ对瑞 香狼毒 细胞 生长 影响不 显著 ， 但 是对 细胞 中黄 酮含量 的影响 显著 ， 其 中较 高 浓度 的 ＮＡＡ 和 ６ － ＢＡ 有利 于黄 酮的积 累 。由较高浓 度组 成 的 ３号组合 即 ２， ４一 Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ １．０ ｍｇ／Ｌ＋ ６ － ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋蔗糖 ３０ ｇ／Ｌ， 所 获得 的细胞增 长率 还是黄 酮含量 都是 最高 的 ， 分别 为 ４５３ 和 ２．１４ ｍｇ／ｇ。 本研 究成 功地建立 了稳定 的瑞 香狼 毒细胞悬 浮培 养体 系 ， 并 在 此基 础上 初 步研究 了碳 源种类 和植 物生 长调 节剂对瑞 香狼毒 细胞生 长和 黄酮积 累的影 响 。要 获得更 高产 黄酮 的瑞香狼 毒悬 浮细胞 系 ， 碳 源浓度 、 培养基 成分 以及 诱导前 体等将 是进 一步试 验要考 虑 的重要 因素 。 参 考文献 ： ［１］ 刘 英 ，龙 瑞 军 ，姚 拓 ．草地 狼 毒 研 究 进 展 ［Ｊ］．草 业科 学 ，２００４，２１（６）：５５—５８． ［２］ 裴 月 湖 ，冯 宝 民 ，华 会 明 ，等 ．瑞香 狼 毒 化 学 及 药 理 研 究 进 展 ［Ｊ］．中草 药 ，２００１，３２（８）：７６４— ７６６． ［３］ 宋 晓平 ，曹 光 荣 ，李 绍 君 ．瑞 香 狼 毒 中 总 黄 酮 的 提取 分 离 及 其 毒 性 研 究 ［Ｊ］．西 北 农业 大学 学 报 ，１９９６，２４（４）：３５—３８． ［４］ 冯 宝 民 ，裴 月 湖 ，韩 冰 ．瑞 香 狼 毒 中的 黄 酮类 化 合 物 ［ Ｊ］．中草 药 ，２００１，３２（１）：１４ １５． ［５］ 王 敏 ，贾 正 平 ，马 骏 ，等 ．瑞 香 狼 毒 总 黄 酮 提 取 物 的 抗 肿瘤 作用 ［ Ｊ］．中 国 中药 杂 志 ，２００５，３０（８）：６０３～ ６０６． ［６］ Ｉ ｋｅｇａｗａ Ｔ，Ｉ ｋｅｇａｗａ Ａ．Ｃｈａｍａｅ ｊ ａｓｍｉ ｎ ａｎｄ ｅ ｕｃｈａｍａｅｊ ａｓ ｍｉ ｎ ｅｘｔ ｒａｃ ｔ ｉ ｏｎ ｆ ｒ ｏｍ Ｓｔ ｅｌ ｌ ｅｒ ａ ｃ ｈａｍａｅ Ｊａｓ ｍｅ ａｎｄ ｔ ｈｅｉ ｒ ａｎｔ ｉ ｖｉ ｒａｌ ａｃｔ ｉ ｖｉ ｔ ｉ ｅｓ Ｊａｎｐａｎ，０８３１１０５６［Ｐ］．１９９５— ０５—１９． ［ ７］ 秦 宝 福 ，周 乐 ，苗芳 ，等 ．瑞 香 狼 毒 根 的 抑 菌 活性 研 究 （Ｉ）ＥＪ］．西 北 植 物 学 报 ，２００３，２３（１１）：１９７７—１９８０． Ｅ ｓ］ 王 亚 维 ，张 国洲 ，徐 汉虹 ，等 ．瑞 香 狼 毒 杀 虫 活性 成 分 的提 取 与 分 离 ［Ｊ］．安 徽 农业 科 学 ，２００４，３２（４）：６７１－６７２． ［９］ 段 晓 明．狼 毒 根 提 取 物 的 杀 虫 活性 测 定 』Ｊ］．中 国农 学 通 报 ，２００６，２２（１２）：３４５— ３４７． ［１ ０ ］ 胡凯 ，谈锋 ．药 用植 物 细胞 的大 规 模 培 养 技 术 ［ Ｊ ］ ．植 物生 理 学 通 讯 ，２ ０ ０４，４０（ ２ ）：２５ １ — ２５ ９． ［１１ ］ 袁宗 泉 ，刘 淑 兰 ，吴 改道 ，等 ．细 胞 生 长 期 、苯 丙 氨 酸 和 放 线 菌一Ｄ对 银 杏 黄 酮 产 量 的 影 响 ＥＪ］．农 业 生 物 技 术 学 报 ，１９９７ ５（２）：１１８—１２４． ［１２］ 赵德 修 ，汪 沂 ，赵 敬 芳．不 同 理 化 因 子对 雪 莲 培 养 细 胞 中黄 酮 类 形成 的影 响［Ｊ］．生 物 工 程 学 报 ，１９９８，１４（３）：２５９— ２６４． １ ３８ Ａ ＣＴ Ａ ＰＲＡＴ ＡＣＵ ＬＴＵ ＲＡ Ｅ ＳＩ ＮＩ ＣＡ （２Ｏ１Ｏ） Ｖｏ１ １９，Ｎｏ．６ ． －１３］ ［ 赵德 修 ，乔传 令 ，汪 沂 ．水 母雪 莲 的细 胞 培 养 和 高 产 黄酮 细胞 系 的筛 选 ［Ｊ］．植 物学 报 ，１９９８，４０（６）：５１５— ５２０． ｄ Ｊ Ｆ． Ａｐｐｌ ｉ ｃａｔ ｉ ｏｎ ｏｆ ｉ ｍａｇｉ ｎｇ ｔ ｏｏｌ ｓ ｔ ｏ ｐｌ ａｎｔ ｃｅｌ ｌ ｃｕｌ ｔ ｕｒｅ：Ｒｅ ｌ ａｔ ｉ ｏｎｓｈｉ ｐ ｂｅｔ ｗｅｅ ｎ ｐｌ ａｎｔ ｃｅｌ ｌ ａｇｇｒ ｅｇａｔ ｉ ｏｎ ａｎｄ ［１４３ Ｓｍｉｔｈ Ｍ Ａ Ｌ，Ｒｅｉ ｌａ ｆ ｖｏｎｏｉ ｄ ｐｒ ｏｄｕｃｔ ｉ ｏｎ［Ｊ］．Ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ Ｃｅｌ ｌ ｕｌ ａｒ＆ Ｄｅｖｅｌ ｏｐｍｅｎｔ ａｌ Ｂｉ ｏｌ ｏｇｙ－ Ｐｌ ａｎｔ，１９９９，３５（ ４）：２９０— ２９５． ［１ ５］ 李 燕 ，王春 兰 ，郭 顺 星 ，等 ．植 物 组 织 和 细 胞 培 养 物 中 黄 酮 类 物 质 积 累 影 响 因 素 的 研 究 进 展 ［Ｊ］．中 国 药 学 杂 志 ，２００６， ４１（９）： ６５卜 ６５５， ［１６］ 罗 建 平 ，夏 宁 ，沈 国栋 ．茉 莉 酸 甲酯 、 水 杨 酸 和 一 氧 化 氮诱 导 怀 槐 悬 浮 细 胞合 成 异 黄 酮 及 细 胞 结 构 变 化 Ｉ － Ｊ］．分 子 细胞 生 物 学 报 ，２００６，３９（５）：４３８ ４４４． －１７］ ［ 罗 建 平 ，曹 磊 ，潘 利 华 ，等 ．稀 土 元 素 对 怀 槐 悬 浮 培 养 细 胞 异 黄 酮 合 成 及 氧 化 还 原 态 的 影 响 ［Ｊ］．应 用 与 环 境 生 物 学 报 ， ２００８，１４（３）：３６２— ３６５． ［１８］ 崔 兴华 ，李 兴 林 ，蔡 津 ，等．黑 暗培 养 条 件 下 甘薯 悬 浮 细 胞 黄 酮 类 物 质积 累 的初 步 研 究 ［Ｊ］．浙 江 大 学 学 报 （农 业 与 生命 科 学 版 ），２００８，３４（ ５）：５０２－５０８． 郭 哗红 ，蔺 海 明 ，武 睿．唐 古 特 白刺 组 织 培 养 及 其 培 养基 筛 选 研 究 ［Ｊ］．草 业 学 报 ，２００９，１８（ ６）：６９— ６４． 李 明军 ，李 萍 ，赵 喜亭 ，等 ．怀 牛 膝 细 胞悬 浮培 养 及 多 糖 含 量 变 化 的研 究 ［Ｊ］．西 北 植 物 学 报 ，２００８，２８（３）：４９４— ５００． 王磊 ，杨英 ，周 圆 圆 ，等 ．甘 草 细 胞 培 养 物 黄酮 含 量 测 定 方 法 的 建立 ［ Ｊ ］．时 珍 国医 国 药 ，２ ００ ７，１ ８（１ ２ ）：３ ０４ ６ — ３０ ４８ ． 赵 智 燕 ，潘 俊 松 ，何 亚 丽 ，等 ．两 个 高 羊 茅无 性 系 的营 养 器 官组 织 培 养 及 再 生 体 系 的建 立 ［ Ｊ］．草 业 学 报 ，２００９，１８（５）：１６８— １７５． ［２３］ 赵 洁 ，张 博 ，王玉 祥 ，等．疏 叶骆 驼 刺 茎 段 离 体 快 繁技 术 的研 究 ［Ｊ］．草 业 科 学 ，２００９，２６（５）：７２— ７５． －Ｊ］．草 业学 报 ，２００９，１８（２）：２１２— ２１５． ［２４］ 王 友 生 ，王 瑛 ，李 阳春 ．三 叶草 愈 伤 组 织诱 导及 分 化 的研 究 ｌ ［２５］ 汤 行 春 ，刘 幼 琪 ．连 翘 悬 浮 细胞 系 的建 立 及 不 同 理 化 因 子对 细 胞 生 长 和 次 生 产 物 积 累 的 影 响 ［Ｊ］．湖北 大 学 学 报 （自然 科 学 版 ），２００７，２９（４）：４０９－ ４１２． ［ ２ ６］ 李 树 敏 ，朱 蔚 华 ．人 参 色 素 细胞 培养 的研 究 ［Ｊ］．植 物学 报 （英 文 版 ），１９９０，３２（２）：１０３— １１１． ［２７］ 李 春斌 ，王 关林 ，岳 玉 莲 ，等 ．培 养 条 件 对 银 杏 悬 浮 培 养 细 胞 黄 酮 合 成 影 响 研 究 ［Ｊ］．大 连 理 工 大 学 学 报 ，２００３，４３（３）： ２８７—２９１． ｉ Ｇ ， Ｅｒｖｅｎ Ａ Ｓ， Ｏｕｗｅｒｋｅｒｋ Ｐ Ｂ． Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｉ ｃｔ ｏｓｉ ｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉ ｗｉｎｋｌ ｅ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｌｉ ｃｉ ｔｏｒ—ｉ ｎ— ［ ２８］ Ｐａｓｑｕａｌ ｄｕｃｉ ｂｌ ｅ ｅｘｐｒｅｓ ｓｉ ｏｎ ｉ ｎ ｔ ｒ ａｎｓ ｇｅｎｉ ｃ ｔ ｏｂａｃｃ ｏ ａ ｎｄ ｂｉ ｎｄｓ ｎｕｃｌ ｅａｒ ｆ ａｃｔ ｏｒｓ ＧＴ一１ ａｎｄ ＧＢＦ［ － Ｊ］．Ｐｌ ａｎｔ Ｍｏｌ ｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉ ｏｌ ｏｇｙ，１９９９，３９（６）： １２９９—１３１０． Ｊ，Ｚｈｕ Ｗ ，Ｈｕ Ｑ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃ ａｔｈａｒａ ｎｔ ｈｉ ｎｅ ｐｒ ｏｄｕｃｔ ｉ ｏｎ ｉ ｎ Ｃａｔ ｈａｒ ａｎｔ ｈｕｓ ｒｏｓ ｅｕｓ ｃ ｅｌ ｌ ｃｕｌ ｔ ｕｒｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉ ｎｅｄ ｅ ｌ ｉ ｃｉ ｔ ｏｒ ｔ ｒ ｅａｔ ｍｅ ｎｔ ［２９］ Ｚｈａｏ ｉ ｎ ｓｈａｋｅ ｆ ｌ ａｓ ｋｓ ａｎｄ ｂｉ ｏｒ ｅａｃｔ ｏｒｓ ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉ ｃｒ ｏｂｉ ａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ，２００１，２８（７－ ８）：６７３—６８１． ４６． －３０］ ［ 丁世 萍 ，严 菊 强 ，季 道 藩 ．糖 类 在 植 物 组 织 培 养 中 的效 应 ［Ｊ］．植 物 学 通 报 ，１９９８，１５（６）：４２— － Ｊ］．果 树 科 学 ，２０００，１７（２）：１１０—１１３． ［３１］ 姜 玲 ，章 文才 ．植 物生 长 调 节 剂 对 银 杏 悬 浮 细胞 生 长 和 黄 酮糖 苷含 量 的影 响 Ｉ ｉ Ｉ Ｉ ，Ｍ ｕｌ ｉ ｎａｃｃ ｉ Ｎ ． Ｔｈｅ ｅｆ ｆ ｅｃｔ ｏｆ ｇｒ ｏｗ ｔ ｈ ｒｅ ｇｕｌ ａｔ ｏｒｓ ａｎｄ ｓｕｃｒ ｏｓ ｅ ｏｎ ａｎｔ ｈｏｃｙａｎｉ ｎ ｐｒ ｏｄｕｃｔ ｉ ｏｎ ｉ ｎ Ｃａｍ ｐｔ ｏｔ ｈ— ［３２］ Ｐａｓｑｕａ Ｇ ， Ｍ ｏｎａｃｅｌｌ ｅｃ ａ ａｃｕｍｉ ｎａｔ ａ ｃｅｌ ｌ ｃｕｌ ｔ ｕｒｅｓ［ Ｊ］．Ｐｌ ａｎｔ Ｐｈｙｓｉ ｏｌ ｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉ ｏｃ ｈｅｍｉ ｓｔ ｒｙ，２００５，４３（３）：２９３ —２９８． ２０４． ［ ３ ３］ 杜 晓 映 ，张 振 文 ，夏 惠 ，等．葡 萄悬 浮细 胞 系 的 建 立 ［Ｊ］．西北 农 林 科 技 大 学 学 报 （自然 科 学版 ），２００９，３７（１）：１９９— 第 １９卷第 ６期 草业 学 报 ２Ｏ１Ｏ年 １３９ Ａ ｓ ｔ ｕｄｙ ｏｎ ｃ ｅｌ ｌ ｓ ｕｓ ｐｅｎｓ ｉ ｏｎ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ａ ｎｄ ｆ ｌ ａ ｖｏｎｏｉ ｄｓ ａｃ ｃｕｍｕｌ ａｔ ｉ ｏｎ ｏｆ Ｓｔ ｅｌ ｌ ｅ ｒ ａ ｃ ｈａｍａｅ ｊａｓ ｍｅ Ｗ ＡＮＧ Ｗ ｅ ｎ— ｘｉ ｎｇ，ＡＮ Ｑｉ ，Ｗ ＡＮＧ Ｙｉ ｎｇ，Ｗ ＡＮＧ Ｍｅ ｎｇ，ＣＡＯ Ｃｈｅｎｇ— ｙｏｕ （Ｉｎｓｔｉ ｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉ ｏ—ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ，Ｃｏｌ ｌ ｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉ ｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔ ｈｅａｓｔ ｅｒｎ Ｕ ｎｉ ｖｅｒｓｉ ｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １０００４，Ｃｈｉ ｎａ） Ａｂｓ ｔ ｒ ａｃ ｔ：Ａ ｃ ｅｌ ｌ ｓ ｕｓ ｐｅ ｎｓ ｉ ｏｎ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｓ ｙｓ ｔ ｅ ｍ ｗａｓ ｅｓ ｔ ａｂｌ ｉ ｓｈｅｄ ｕｓ ｉ ｎｇ ｃｕｌ ｔ ｕｒｅ ｓ ｏｆ ｌ ｏｏｓ ｅ ｃ ａｌ ｌ ｉ ｏｆ Ｓｔ ｅ ｌ ｌ ｅｒ ａ ｃ ｈａｒ ｎａｅ ｊ ａｓ ｍｅ ｔ Ｏ ｉ ｎｖｅｓｔｉ ｇａｔ ｅ ｔ ｈｅ ｅｆ ｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉ ｆ ｆｅｒｅｎｔ ｐｌ ａｎｔ ｇｒｏｗ ｔｈ ｒｅｇｕｌ ａｔｏｒｓ ｏｎ ｃａｌ ｌ ｕｓ ｉ ｎｄｕｃｔｉ ｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｇｒｏｗ ｔｈ ｓｔａｔ ｅ ｆｒｏｍ ｅｘｐｌ ａｎｔ ｓ ｓｕｃ ｈ ａｓ ｂｕｄｓ，ｌ ｅａｖｅ ｓ ａｎｄ ｓ ｔ ｅ ｍ ｓ ｅｇｍｅｎｔ ｓ ｏｆ Ｓ．ｃ ｈａｍａｅ ｊａｓ ｍｅ，ａｎｄ ｔ Ｏ ｓ ｔ ｕｄｙ ｔ ｈｅ ｅｆ ｆ ｅｃ ｔ ｓ ｏｆ ｃ ａｒ ｂｏｎ ｓ ｐｅ ｃｉ ｅｓ ａｎｄ ｐｌ ａｎｔ ｇｒ ｏｗｔ ｈ ｒｅｇｕｌ ａｔｏｒｓ ｏｎ ｃｅｌ ｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｆ ｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ａｃｃｕｍ ｕｌ ａｔｉ ｏｎ ｕｓｉ ｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｌ ｏｏｓｅ ｃａｌｌ ｉ ｓｕｉ ｔ ａ ｂｌ ｅ ｆ ｏｒ ｓｕｓｐｅ ｎｓｉ ｏｎ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｃａｎ ｂｅ ｉ ｎｄｕｃｅｄ ｆ ｒ ｏｍ ｓ ｔ ｅｍ ｓｅ ｇｍｅ ｎｔ ｓ ｏｎ ＭＳ ｗｉ ｔ ｈ ２，４ － Ｄ １．０ ｒ ａｇ／Ｉ ＋ ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ，ａｎｄ ｔ ｈｅ ｉ ｎｄｕｃｔ ｉ ｏｎ ｒ ａｔ ｅ ｃ ａｎ ｒ ｅａ ｃｈ ９０ ．Ｔｈｅ ｅｆ ｆ ｅ ｃｔ ｓ ｏｆ ｆ ａ ｃｔ ｏｒ ｓ ｉ ｎ ｔ ｈｅ ｏｒ ｔ ｈｏｇｏｎａｌ ｔ ｅ ｓｔ ｏｎ ｃｅｌ ｌ ｇｒｏｗｔ ｈ ａｎｄ ｆｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ｃｏｎｔ ｅｎｔ ａｒｅ ｃｏｎｓｉ ｓｔｅｎｔ ａｎｄ ｉ ｎ ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ２， ４－Ｄ ＞ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ＞ Ｎ ＡＡ ＞ ６－ ＢＡ ． Ｈ ｉ ｇｈｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ ｉ ｏｎｓ ｏｆ ２．４ Ｄ 。ＮＡ Ａ ｏｒ ６－ＢＡ ａｒｅ ｍ ｏｒｅ ｃｏｎｄｕｃｉ ｖｅ ｔ Ｏ ｃｅｌ ｌ ｇｒｏｗ ｔｈ ａｎｄ ｆｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ａｃｃｕｍ ｕｌ ａｔｉ ｏｎ． Ｓｕｃｒ ｏｓｅ ｉ ｓ ｍ ｏｓｔ ｃｏｎｄｕ— ｃｉ ｖｅ ｔＯ ｃｅｌ ｌ ｇｒｏｗｔ ｈ ａｎｄ ｆ ｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ａｃｃｕｍ ｕｌ ａｔｉ ｏｎ，ｆ ｏｌ ｌ ｏｗｅｄ ｂｙ ｇｌ ｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｆ ｒｕｃｔ ｏｓｅ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉ ｍｕｍ ｍｅｄｉ ｕｍ ｆｏｒ ｃｅ ｌ ｌ ｇｒ ｏｗｔ ｈ ａ ｎｄ ｆ ｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ａｃ ｃｕｍｕｌ ａｔ ｉ ｏｎ ｉ ｓ ＭＳ＋ ２， ４－ Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ ｌ＿０ ｍｇ／Ｌ＋ ６－ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋ ｓｕｒ ｃｒ ｏｓ ｅ ３０ ｇ／Ｌ．Ｔｈｅｒ ｅ ｉ ｓ ａ ｓｉ ｇｎｉ ｆ ｉ ｃ ａｎｔ ｐｏｓ ｉ ｔ ｉ ｖｅ ｃｏｒ ｒ ｅｌ ａｔ ｉ ｏｎ ｂｅｔ ｗｅ ｅｎ ｃ ｅｌ ｌ ｇｒ ｏｗｔ ｈ ａ ｎｄ ｆ ｌ ａｖｏｎｏｉ ｄｓ ｃ ｏｎｔ ｅ ｎｔ（ Ｒ 一０．９６７，Ｐ＜ ０．０ １），ｂｅｌ ｏｎｇｉ ｎｇ ｔ ｏ ｇｒｏｗｔｈ—ｃｏｕｐｌ ｉ ｎｇ—ｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏ ｉ ｓｍ ｍｏｄｅ１ ． ｄｓ；ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ；ｐｌ ａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌ ａｔ ｏｒｓ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓｔ ｅ ｌ ｌ ｅｒ ａ ｃ ｈａｍａｅ ｊａｓ ｍｅ；ｃ ｅｌ ｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉ ｏｎ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ｅ；ｆ ｌ ａｖｏｎｏ
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