大腸菌の生死判定 - Thermo Fisher Scientific

アプリケーションノート
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer
大腸菌の生死判定
はじめに
フローサイトメトリーとは、細胞や粒子などを 1 つ 1 つ流路へ流し、それぞれの細胞の特徴を解析する手法です。
一般的に血液や動物細胞などで広く利用されていますが、フローサイトメーターで解析するためのサンプル条件は非常
にシンプルです。
散乱光では微生物（細胞）と
ノイズの区別が難しい
核酸を検出する
蛍光色素でラベルする
1. 細胞が凝集せず、単細胞（single cell）の
状態で分散していること
2. 水溶液に溶解・懸濁していること
3. 大きさが 1 ∼ 40 µm 程度
= 微生物（細胞）
蛍光を発しない
= 夾雑物（非細胞）
今回は、Invitrogen™ LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability and
Counting Kit と Invitrogen™ Attune™ Acoustic Focusing Cytometer を用いて、
大腸菌の生死の判定測定を行いました。
蛍光を発する = 核酸を持つ生物
（微生物、細胞）として、
ノイズと区別し検出可能
サンプルの準備
サンプルに含まれる大腸菌は 106 cells/mL 以下になるように適切なバッファーで希釈します。
希釈済み大腸菌液 997 µL
※ 培養液で希釈するとバックグラウンドが高くなる可能性があります。
※ 濃度が分からない場合は、段階希釈して測定してください。
＋SYTO 9（3.34 mM）1.5 µL
＋Propidium iodide（PI：30 mM）1.5 µL
室温 , 15min , 遮光でインキュベーション
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer にて測定
蛍光を発している
ポピュレーションをゲート
（赤）
データ例：E. coli.
（緑）
蛍光を発する
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer では、サンプルの濃度（event/µL）を自動で出すことができます。
(A) サンプルを段階希釈したデータ
100 倍
SYTO 9+
Live
Dead
164.79
104.38
39.29
1000 倍
10000 倍
19.18
13.63
2.59
4.7
1.87
0.97
(event / µL)
(B) 同じサンプルを 3 回測定したデータ
1 回目
SYTO 9+
Live
Dead
2 回目
3 回目（1 時間後に測定）
19.34
12.83
2.93
19.18
13.63
2.59
19.95
11.54
5.17
(event / µL)
測定のコツ
検体を希釈するバッファー（生理食塩水）などは予め 0.22 µm のフィルターでろ過します。
微生物は、前方散乱光によるサイズ解析ではノイズと区別するのが難しいため、まずバッファーのみでノイズ
（バックグラウンド）の位置を確認します。
次に BL1 に Threshold（閾値）を設定して、蛍光を発しているポピュレーションのみを解析します。
Ordering information
製品名
LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability and Counting Kit
サイズ
製品番号
価格 *
100 test
L34856
¥95,600
* 記載の価格は 2015 年 10 月現在の価格です。消費税は含まれておりません。価格は予告なしに変更する場合がありますので、予めご了承ください。
キットについて
核酸に結合することで蛍光を発する試薬の SYTO 9 とＰ
Ｉが含まれているキットです。Invitrogen™ SYTO™ 9 は、細胞膜透過性のため全菌の判定に使
用します。
Ｐ
Ｉは細胞膜への透過性が無いため、生細胞は染色されず、細胞膜の傷ついた細胞や死細胞を染色します。したがって SYTO 9 とＰ
Ｉを組み
合わせることで、サンプル中に含まれる菌の生死の判定を簡便に行うことができます。
研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。
記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。
標準販売条件はこちらをご覧ください。www.thermofisher.com/TC
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