好塩性アーキアの DMSO 還元酵素に関する生化学的および分子生物学

SURE: Shizuoka University REpository
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好塩性アーキアのDMSO還元酵素に関する生化学的およ
び分子生物学的研究
斉, 秋子
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2015-12
http://doi.org/10.14945/00009583
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静岡大学
博士論文
好塩性アーキアの DMSO 還元酵素に関する
生化学的および分子生物学的研究
2015 年 12 月
大学院自然科学系教育部
環境・エネルギーシステム専攻
斉
秋子
博士学位論文目次
斉
秋子
審査申請論文名好塩性アーキアの DMSO 還元酵素に関する生化学的
および分子生物学的研究
目
次
省略用語の説明 ···················································································· 1 頁
第1章
序論 ···················································································· 2 頁
図表 ··································································································· 5 頁
引用文献 ····························································································· 6 頁
第 2 章好塩性アーキアの DMSO 還元酵素に関する生化学的解析 ················ 8 頁
第 1 節背景 ····················································································· 9 頁
第 2 節材料と方法 ··········································································· 11 頁
2－1．菌の培養 ·············································································· 11 頁
2－2．DMSO 還元酵素活性の測定 ······················································ 11 頁
2－3．DMSO 還元酵素、および硝酸塩還元活性の活性染色 ····················· 12 頁
2－4．DMSO 還元酵素の精製 ···························································· 12 頁
2－5．その他 ················································································· 13 頁
第 3 節結果 ···················································································· 14 頁
3－1．DMSO 還元酵素の発現と安定性 ················································ 14 頁
3－2．DMSO 還元酵素の精製 ···························································· 14 頁
3－3．精製酵素の分子的性質 ···························································· 16 頁
3－4．精製標品の酵素の性質 ···························································· 16 頁
第 4 節考察 ···················································································· 18 頁
図表 ·································································································· 20 頁
引用文献 ···························································································· 31 頁
第3章
DMSO 還元酵素の誘導発現の制御機構 ····································· 35 頁
第 1 節背景 ···················································································· 36 頁
第 2 節材料と方法 ··········································································· 38 頁
2－1．dmsR 遺伝子破壊株の作製 ························································ 38 頁
2－2．dmsR 遺伝子破壊株の培養実験 ·················································· 38 頁
2－3．レポーターアッセイ用プラスミドの作製 ···································· 39 頁
2－4．プロモーターアッセイ ···························································· 40 頁
2－5．dmsEABCD プロモーターの deletion 実験 ····································· 41 頁
2－6．他の測定 ·············································································· 41 頁
第 3 節結果 ···················································································· 42 頁
3－1．増殖に及ぼす dmsR 遺伝子の影響 ·············································· 42 頁
3－2．dmsEABCD 遺伝子プロモーターの転写活性 ································· 42 頁
3－3．dmsR と mgd 遺伝子プロモーターの転写活性 ······························· 43 頁
3－4．dmsEABCD 遺伝子プロモーターの deletion 実験 ···························· 44 頁
第 4 節考察 ···················································································· 45 頁
図表 ·································································································· 48 頁
引用文献 ···························································································· 59 頁
謝辞 ·································································································· 61 頁
省略用語の説明
ANOVA
analysis of variance
BCA
bicinchoninic acid
BgaH
halophilic β-galactosidase
CoQ
ubiquinone
CPT
citrate-phosphate-Tris
CBB
coomassie brilliant blue
DMS
dimethyl sulfide
DMSP
dimethylsulfoniopropionate
DMSO
dimethyl sulfoxide
DEAE
diethylaminoethyl
FNR
fumarate-nitrate reduction
HTH
helix-turn-helix
bisMGD
bis-molybdopterin guanine dinucleotide
MV
methyl viologen
MPT
molybdopterin
ORF
open reading frame
ONPG
2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside
PAGE
polyacrylamide gel electrophoresis
PCR
polymerase chain reaction
PVDF
polyvinylidene difluoride
PyrE2
orotate:phosphoribosyl transferase.
SDS
sodium dodecyl sulfate
TAT
twin-arginine translocation
1
第一章
序論
2
環境中に豊富に存在する硫黄は炭素や酸素、窒素、リンなどと並んで生物にとって必須の
元素である。硫黄は、炭素をはじめとする様々な原子と安定な結合を作ることができ、また様々
な価数をとることから、極めて多様な無機あるいは有機化合物を構成することができる。現在の
酸化的な地球環境においては、硫黄は硫酸塩として安定化されているが、微生物や植物による同
化反応によって還元され有機生体分子中に取り込まれる。硫黄を含む有機生体分子は、微生物に
よる分解を受けて硫化水素（H2S）やメルカプタンなどの低分子の揮発性硫黄化合物に変換される。
また H2S は、硫酸還元菌による硫酸塩の異化的な還元によっても生成する。
大気中に存在する揮発性硫黄化合物は、H2S、および化石燃料の燃焼に伴って放出される
人為起源の二酸化硫黄（NO2）によって代表されていた（Azad et al. 2005）
。ところが、1970 年代
にいたって、主要な揮発性硫黄化合物としてジメチル硫黄（DMS）の、環境中での存在が新たに
注目されるようになった（Saltaman and Cooper 1988）
。DMS は特有の悪臭を持つ「磯くささ」の
原因物質である。特に海洋表層に多く含まれ大気中に揮発放散していくが、海洋から放出される
揮発性硫黄化合物のほぼ 50%（松本 1995）を占めるとされている。海生の微生物は、浸透圧調節
物質を細胞中に高濃度に蓄積することで海水の高い浸透圧を相殺する必要があるが、昆布やワカ
メなどの褐藻・紅藻類、あるいは植物プランクトン（緑藻類）などの多くは、ジメチルスルフォ
ニオプロピオン酸塩（DMSP）を用いることが知られている（Yoch 2002）
。DMSP はメチオニンか
ら生合成され、細胞中で浸透圧調節物質、あるいは有機物の貯蔵物質としても用いられる。死細
胞から放出された DMSP は細菌類によってプロピオン酸とジメチル硫黄（DMS）に分解され、前
者は細菌によって利用されるが、DMS は海水中に残留する。海水中では DMS が全揮発性硫黄化
合物濃度の 95%以上を占めている。海水表層は常に DMS に関して過飽和の状態にあるため、DMS
は大気へと揮発していく（Kloster et al. 2006）。大気中の DMS は、光酸化によってジメチルスルホ
キシド（DMSO）
、ジメチルスルホン（DMSO2）
、や硫化カルボニル（COS）
、さらに硫酸塩などへ
酸化される（Yin et al. 1990）
。これらの硫黄酸化物は氷晶核として雲の形成を促進することで、結
果として地球全体の太陽光線の反射率を上げる（図 1-1）
。このことは、DMS が気候の寒冷化に寄
与する環境因子でもあることを意味する（Kloster et al. 2006, Andreae et al. 2003）
。
DMS を中核とする硫黄サイクルには、微生物による異化作用が関与することも知られてい
3
る。多くの通性嫌気性微生物が、DMSO を最終電子受容体として用いる DMSO 呼吸を行うことに
よって増殖が可能である（Müller and DasSarma 2005, Bilous and Weiner 1985, Knäblein et al. 1996,
Hilton et al. 1999, Zafra et al. 2005）
。嫌気条件の下におかれた大腸菌は、DMSO 呼吸を行うことで
増殖できるが、その際、呼吸に伴って DMS を発生する。DMSO 呼吸における呼吸鎖電子伝達系
の末端酵素は、DMSO 還元酵素と呼ばれる。大腸菌の DMSO 還元酵素は、すでに分子構造が解明
され、その誘導制御に関する分子生物学的機構についても詳細な議論が行われている（Bilous and
Weiner 1985, Tang et al. 2011, Simala-Grant and Weiner 1996）
。バクテリアだけではなく、アーキアに
も DMSO 呼吸を行う種が知られている（Müller and DasSarma 2005, DasSarma et al. 2012）
。しかし
アーキアの DMSO 還元酵素の分子的・酵素的性質に関する情報はほとんど無く、精製も報告され
ていない。一方、アーキアにおける DMSO 呼吸の誘導制御に関しては、DMSO 呼吸能を持つ高度
好塩性のアーキアである Halobacterium sp. NRC-1 を用いて解析され、高度好塩性アーキアに特有
の転写因子 DmsR の関与が報告されている（Müller and DasSarma 2005, DasSarma et al. 2012）。
そこで私は、高度好塩性アーキアの DMSO 呼吸に関する生化学的および分子生物学的な
性質の解明を目的として研究を行った。Haloferax volcanii は死海の堆積物から分離された、
Halobacterium sp. NRC-1 とは別種の高度好塩性アーキアである（Mullakhanbhai and Larsen 1975,
Hartman et al. 2010）
。H. volcanii もまた通性嫌気性であり、無酸素条件の下でも DMSO や硝酸塩な
どを呼吸基質とする嫌気的な呼吸を行うことで増殖可能である。また本菌は、遺伝子破壊法や発
現用プラスミドなどのツールがよく整備されていることから、生化学・分子生物学的研究がもっ
とも盛んに行われている高度好塩性アーキアである。第二章では、H. volcanii からの DMSO 還元
酵素の精製と、その分子的および酵素的性質の分析を行った。また第三章では、本菌における
DMSO 呼吸の誘導制御の分子生物学的機構について分析を行い、転写因子 DmsR の機能に関する
新たな提案を行った。本研究は、硫黄サイクルの重要な生物学的過程のひとつである DMSO 呼吸
において、アーキアがはたす役割やその分子機構に関する、初めての総合的な分析となる。
4
図 1-1．自然環境中のイオウ循環における DMSO の位置付け
5
引用文献
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7
第二章
好塩性アーキアの DMSO 還元酵素
に関する生化学的解析
8
第1節
背景
序論で述べたように、Haloferax volcanii は塩湖や塩田のような高塩濃度環境で生育でき
るユリアーキオータ門に属する高度好塩性アーキアである（Mullakhanbhai and Larsen 1975,
Hartman et al. 2010, Cohen et al. 1991）。Haloferax volcanii はゲノムの全塩基配列が既知であること、
また形質転換や遺伝子破壊等の遺伝子操作が比較的容易であるため、高度好塩性アーキアのモデ
ル生物として最もよく用いられている。H.volcanii は通性嫌気性であり、嫌気条件においても、
DMSO 呼吸、脱窒（硝酸塩呼吸）
、フマル酸呼吸などの、様々な嫌気的呼吸を行うことが可能とさ
れている（Wanner and Soppa 1999, Oren 1991, Oren and Trüper 1990, Yoshimatsu et al. 2000）
。
5 個の ORF からなる H. volcanii の DMSO 還元酵素遺伝子、およびその 5’側、3’側の遺伝
子構造を【図 2-1A】に示す。このうち、dmsA、dmsB、dmsC の各 ORF は、大腸菌の DMSO 還元
酵素 DmsABC の対応するサブユニットとそれぞれ相同なタンパク質をコードしている。またその
前後の dmsE、dmsD とともに、単一の転写単位としてふるまうと考えられる。dmsD 遺伝子産物は
シャペロンと推定されるが、dmsE 遺伝子産物の生理的機能は不明である。さらに、この dmsEABCD
遺伝子クラスターの 5’側に helix-tern-helix（HTH）型 DNA 結合モチーフを持つ転写因子 DmsR が
コードされている（Müller and DasSarma 2005, Sharmin 2012）。以上の遺伝子構造は Halobacterium sp.
NRC-1 と同一であるが、一方、4 個の ORF、HVO_B0367、HVO_B0368 (mobA2)、HVO_B0369 (modA)、
HVO_B0370 (cysT) が 3’側に見出される。mgd 遺伝子クラスターと命名したこれら 4 個の ORF、
および dmsR 遺伝子の機能については、第三章で議論する。
様々なバクテリアが DMSO 呼吸能を持つが、大腸菌 Escherichia coli、光合成細菌
Rhodobacter sphaeroides から DMSO 呼吸の電子伝達系末端酵素である DMSO 還元酵素が精製され、
その分子的、酵素的性質が詳細に分析されている（Mouncey et al. 1997, Sambasivarao and Weiner
1991, Müller and DasSarma 2005）
。大腸菌の DMSO 還元酵素の分子構造を【図 2-1B】に示した。こ
の酵素は膜結合性タンパク質でありヘテロ三量体構造 DmsABC を持つ（Bilous and Weiner 1985,
Simala-Grant and Weiner1996）
。DmsC は補欠分子族としてプロトヘムを含むシトクロム・サブユニ
ットであり、生理的電子供与体である還元型メナキノン（MKH2）と反応し、電子を受け取る機能
9
を持つ。また DmsB は複数の鉄イオウクラスターを含み、DmsC から供給される電子を DmsA に
伝達する。DmsA は活性中心であるモリブデン補酵素（bis-molybdopterin guanine dinucleotide：
bisMGD）および鉄イオウクラスターを含む活性サブユニットであり、DmsB から供給された電子
を用いて、DMSO を 2 電子還元し DMS に変換する（式 1）
。
DMSO + MKH2 → DMS + H2O + MK
------------ (1)
DmsC は高度に疎水性のタンパク質であり、細胞膜を貫通しているが、DmsA、DmsB は
ぺリプラズムに局在する膜表在性と考えられる（Simala-Grant and Weiner1996, Zafra et al. 2005）。
一方、R. sphaeroides から精製された DMSO 還元酵素 Dor は、補欠分子族として bisMGD のみを持
つ可溶性酵素あるが、生理的な電子供与体は明らかになっていない（Mouncey and Kaplan 1998）。
DMSO 呼吸能を示すアーキアは高度好塩性の種に報告があり、Halobacterium sp. NRC-1
では、その遺伝子構造や発現制御に関する分子生物学的研究が行われている（Müller and Dassarma
2005, DasSarma et al. 2012）
。H. volcanii には、染色体 DNA 以外に 4 種類の巨大な環状プラスミド
（pHV1~4）が存在する（Hartman et al. 2010）
。Halobacterium sp. NRC-1 の DMSO 還元酵素遺伝子
を用いて相同性検索を行ったところ、
pHV3 プラスミド上に高い相同性を示す遺伝子が見出された。
また、H. volcanii を DMSO を添加した培養液中で嫌気的に培養すると、DMS に特徴的な臭気を発
しながら増殖した。このことから、H. volcanii にも、Halobacterium sp. NRC-1 と同様な構造を持つ
DMSO 還元酵素が存在すると考えられる。
このような遺伝子構造から、H. volcanii にも、Halobacterium sp. NRC-1、さらには大腸菌
の酵素と構造的に類似した、膜結合性でヘテロ三量体型の DMSO 還元酵素が存在すると考えられ
る。しかし、これまでアーキアからの DMSO 酵素の精製は報告されていないため、その分子的性
質および酵素学的性質は不明である。そこで私は、H. volcanii からの DMSO 還元酵素の精製と分
子的・酵素的性質の分析を試みた。
10
第2節
材料と方法
2-1. 菌の培養
H. volcanii H26 株（遺伝子型：ΔpyrE2）あるいは ΔnarO 株（ΔpyrE2ΔnarO）を、Hv 培養
液【表 2-1】で好気的に前培養した。H26 株は Torsten Allers 博士（英ノッティンガム大学）から
提供された（Allers et al. 2004）。ΔnarO 株は、志波により作成されたものを用いた（志波 2010）
。
好気培養は、500 mL の培養液を入れた 2 L 容量の三角フラスコを、37 ºC で振とう（143 rpm）し
ながら 2 日間行った。得られた培養液を 50 mM DMSO を添加した 4.5 L の Hv 培養液と混合し、
37ºC で 1 日間静置培養した。その後、さらに 50 mM DMSO を含む 20 L の Hv 培養液と混合し、
37ºC で 10～13 日間静置培養した。培養菌体は遠心機を用いて回収し（7,000 rpm、15 min、4ºC、
Rotor number : R9AF）
、実験に用いるまで-80ºC で凍結保存した。また DMSO の代わりに 50 mM
KNO3 を含む Hv 培養液での H26 株の嫌気培養は、37ºC で 7 日間程度静置培養することで行った。
2-2. DMSO 還元酵素活性の測定
分光光度計用セルに、1 mM methyl viologen（MV）
と 1 M NaCl を含む 3.0 mL の 0.5M Na-Pi
buffer（pH7.0）を入れ、空気中の酸素による還元型 MV の再酸化を抑えるため、流動パラフィン
を重層した。ついで還元剤として 0.1 M Na2S2O4 と 0.2 M NaHCO3 を加え MV を還元した。ここで
NaHCO3 は、Na2S2O4 によって低下する反応液の pH を補正するために加えている。また撹拌は、
あらかじめセル中に入れておいた小型撹拌子を用いて行った。セル中の反応液に酵素標品を 50 μL
加えた後、基質として 10 mM の DMSO を加えた。DMSO に依存した還元型 MV の酸化に伴う 600
nm の吸収の低下速度を可視紫外分光光度計（MPS-2000, Shimadzu Co, Kyoto）を用いて測定し、
DMSO 還元活性とした。ここで還元型 MV の 600 nm におけるミリモル吸光係数（εmM）は 7.72
mM-1cm-1 である（Yu and Wolin 1969）
。
酵素活性の pH 依存性を分析する場合、pH 緩衝剤として、終濃度 50 mM の CPT 緩衝液
（pH5.0~9.0）を、上記のリン酸緩衝液に換えて反応液に加えた。ここで 50 mM CPT 緩衝液とは、
それぞれ 17 mM のクエン酸、リン酸ナトリウム、Tris-base を含み、塩酸あるいは水酸化ナトリウ
11
ムを用いて pH を所定の値に調整したものである。塩濃度依存性は、最適 pH 条件の下、0、0.2、
0.5、1、2、3、4 M の食塩を含む反応液を用いて活性測定を行うことによって分析した。DMSO
に対する親和性は、最適 pH、塩濃度条件の下で、0、0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM の DMSO を含む
反応液中で酵素活性を測定し、
Hanes-Woolf 法を用いて DMSO に対する親和定数 Km を決定した。
オキソ化合物およびオキソ酸塩との反応性は、各 1 mM の濃度の DMSO、DL-methionine sulfoxide、
pyridine N-oxide、trimethylamine oxide（TMAO）をそれぞれ含む反応液を用いて測定した。また
DMSO の代わりに、1mM のオキソ酸塩を添加した培養液中で H.volcanii を嫌気培養し、その増殖
能を比較した。
2-3．DMSO 還元酵素、および硝酸塩還元活性の活性染色
酵素標品の Native-PAGE は、0.1%（w/v）の Triton X-100 を含む 10%アクリルアミドゲル
中で行った。泳導後のゲルを、2 枚のガラス板で厚さ 5 mm のブチルゴム製スペーサーを挟んだ反
応容器中に移し、クリップでガラス板を固定した。反応容器を上述の活性測定用反応液で満たし、
Na2S2O4 と NaHCO3 溶液をシリンジで加え、青色の還元型 MV がゲル中に十分浸透するまで室温
で約 10 分インキュベートした。その後、DMSO あるいは 50 mM KNO3 を加え混合し、還元型 MV
の酸化によってゲル中に現れる無色のスポットを撮影した。
2-4.
DMSO 還元酵素の精製
培養菌体を 2M NaCl を含む 10 mM Tris-HCl（pH8.0）緩衝液に懸濁した。懸濁液を超音
波破砕（VP-30S）した後、遠心し（10,000 rpm、10 min、4ºC）
、上精を無細胞抽出液とした。さら
に超遠心操作（35,000 rpm、65 min、4ºC）によって細胞膜画分を調製した。細胞膜画分を界面活
性剤 1% Triton X-100、10 mM Tris-HCl 緩衝液（以下 buffer A）で処理することによって DMSO 還
元酵素を可溶化した。半透膜を用いて 2 L の 10 mM Tris-HCl 緩衝液に対して一晩透析し、塩を除
いた。得られた試料を 100 mL buffer A で平衡化した DEAE -Toyopearl カラム（1.5×11 cm, Wako Pure
Chemical Industries, Ltd, Tokyo, Japan）に吸着させ、200 mL の buffer A と等量の 0.5 M NaCl を含む
buffer A による直線濃度勾配によって、0.2 mL/min の溶出速度で陰イオン交換クロマトグラフィー
12
を行った。DMSO 還元活性を含む画分を回収し、スピンカラム（Ultracel-10K, Millipore Co., Bedford,
MA.）を用いた限外濾過で濃縮した。これを、0.25 M NaCl と 0.1% Tween-20 を含む 10 mM Tris-HCl
buffer（pH8.0）で平衡化した Sephacryl S-300 カラム（3.0 ×100 cm, Pharmacia, Uppsala, Sweden）を
用いてゲル濾過を行った。DMSO 還元酵素活性を示す画分を回収し、精製標品とした。
2-5．その他
精製酵素標品の可視紫外吸収スペクトルの測定は、MPS-2000 分光光度計（Shimadzu）を
用いて行った。精製酵素の SDS-PAGE 分析は Schägger and Jagow（1987）に従って行った。泳導後、
ゲル中のタンパク質バンドをウェスタンブロッティング用転写装置（Atto Co., Tokyo, Japan）を用
いて PVDF 膜（Millipore Co.）に転写し CBB 染色した。目的のタンパク質バンドを切り出し、プ
ロテインシークエンサー（Shimadzu, model PPSQ-21）を用いて、N 末端アミノ酸配列を分析した。
タンパク質濃度の測定は、牛血清アルブミンを標準物質として用い、市販のタンパク質定量キッ
ト（Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific Co., Rockford, IL.）を用いて行った。実験に使用
した試薬類は、培養液の作成に用いた NaCl と MgCl 以外はすべて特級のものを用いた。
13
第3節
結果
3-1．DMSO 還元酵素の発現と安定性
DMSO を添加した Hv 培養液を用いて嫌気的に培養した H. volcanii H26 菌体から無細胞
抽出液を調製し、さらに超遠心分離を行うことで可溶性画分と細胞膜画分を得た。DMSO 還元活
性は細胞膜画分に回収されたので、Triton X-100 を界面活性剤として用いることで酵素活性を可溶
化抽出した。得られた酵素抽出液は、NaCl を含まない反応液中においても十分な酵素活性を示し
た。このことは、好塩性アーキアの酵素にしばしば観察される halophilic な性質、すなわち分子の
安定化や酵素活性に対する塩要求性を DMSO 還元酵素は持たないことを示す。しかし可溶化抽出
された DMSO 還元活性は不安定であった。可溶化後、氷温下でそれぞれ 0、1、2、3 日間静置し
た試料を Native-PAGE し、ゲル中の DMSO 還元酵素を活性染色した結果、酵素活性の速やかな低
下が観察された【図 2-2A】
。DMSO 還元酵素は、細胞膜に結合した状態では、その酵素活性の急
速な低下は観察されないことから、この不安定化は酵素の可溶化によるものであろう。一方、硝
酸塩を添加した培養液で嫌気的に培養した H. volcanii H26 菌体から細胞膜成分を調製し、可溶化
抽出した硝酸塩還元酵素を同様にゲル上で活性染色した結果が図 2-2B である。硝酸塩呼吸（脱窒）
の末端酸化酵素である硝酸塩還元酵素も膜結合性であること、また高濃度の塩が共存しなくても
活性を示すことがすでに報告されている（Yoshimatsu et al. 2000, 2002, Cabello et al. 2004,
Yoshimatsu and Fujiwara 2009）
。また、DMSO 還元酵素とは異なり、硝酸塩還元酵素は安定であり、
可溶化 3 日後においても活性の低下は観察されなかった。さらにこの実験の結果、硝酸塩還元酵
素は、H. volcanii を脱窒条件で培養した場合だけではなく、DMSO 呼吸条件で培養した場合にも
発現することが明らかとなった【図 2-2AB】
。
3-2. DMSO 還元酵素の精製
DMSO 呼吸条件で培養した H. volcanii H26 菌体から調製した細胞膜を Triton X-100 で処
理し、DMSO 還元酵素を可溶化抽出した。透析後、DEAE-トヨパールによる陰イオン交換クロマ
トグラフィーを行った。その結果、DMSO 還元活性と硝酸塩還元活性はほぼ同じ位置に溶出され
14
た。この結果から、DMSO 還元酵素と硝酸塩還元酵素はいずれもヘテロ三量体構造を示し、特に
両者の活性サブユニットと考えられる DmsA と NarG は、分子量や構造の点で類似した性質を持
つものと予想される。また硝酸塩還元酵素が安定であるのに対して、可溶化した DMSO 還元酵素
は不安定であり、3 日間でほぼ失活することから、H26 株からの DMSO 還元酵素の精製は困難で
あることが予想される。
当研究室で NarO と命名された転写因子は高度好塩性アーキアに特有の DNA 結合タンパ
ク質であり、脱窒の制御因子である。バクテリアの場合、脱窒に関わる酵素タンパク質の発現は
厳密に制御されており、嫌気条件の下、基質である硝酸塩の添加によって遺伝子の転写が活性化
される。ところが、アーキアである H. volcanii の脱窒は、おそらく酸素センサーと考えられる NarO
によって制御されており、嫌気条件のみに応答して脱窒遺伝子の転写が活性化されることがすで
に明らかとなっている（志波 2010, 服部 2014, Hattori et al. 2016）
。図 2-3 に、当研究室で作成さ
れた narO 遺伝子破壊株（ΔnarO）と、その親株である H26 株とにおける DMSO 還元酵素と硝酸
塩還元酵素の発現の違いを示した。その結果、H26 株では、DMSO 呼吸条件の下で両酵素活性が
発現するが【図 2-3AB】
、予想通り、ΔnarO 株では DMSO 還元酵素のみが発現することが確かめ
られた【図 2-3AB】
。そこで改めて H. volcanii ΔnarO 株を、DMSO 還元酵素の精製に用いることと
した。H26 での DMSO 還元活性（1.75 ± 0.16 μmol/min/μg protein、average ± standard deviation, n=3）
に対して ΔnarO 株での活性（0.98 ± 0.31 μmol/min/μg protein）はやや低く、脱窒の制御因子である
NarO が、DMSO 呼吸の誘導に対しても何らかの影響を及ぼしている可能性はある。ΔnarO 株を
DMSO 呼吸条件で嫌気培養し、上記の方法に従って DMSO 還元酵素の精製を試みた。図 2-4A に
陰イオン交換クロマトグラフィーによる DMSO 還元酵素の精製プロファイルを示した。DEAEトヨパール樹脂に吸着させた試料を、NaCl の直線濃度勾配によって溶出したところ、0.3 M の
NaCl で溶出される画分に DMSO 還元活性が検出された。活性は、410 nm での吸収を伴って 58～
60 番画分を中心に溶出され、赤褐色を呈することから、ヘムや鉄イオウクラスターなどの補欠分
子族の存在が予想された。
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分のうち、DMSO 還元活性が強い画分を含む
52～66 番のフラクション中に含まれるタンパク質を SDS-PAGE によって分析したところ、酵素活
15
性とパラレルに 90,000 の分子量を示すタンパク質バンドが現れた【図 2-4B】。この分子量 90,000
のタンパク質の N 末端アミノ酸配列は Ser-Arg-Glu-Asp-Pro と決定され、
DmsA 前駆体
（HVO_B0363
遺伝子産物）の推定アミノ酸配列の 56 番目から 60 番目の配列と一致した【図 2-4C】。またプロ
セシング後の DmsA 分子の推定分子量は 87,272 と計算され、SDS-PAGE から推定される 90,000 と
いう分子量と近い値を示した。DmsA 前駆体の 55 番までのアミノ酸配列は TAT（Twin-Arginine
Translocation）膜間輸送シグナル配列と考えられ、DmsA サブユニットがぺリプラズム局在である
ことを示めす（Sharmin 2012）
。
さらに Sepharcyl S-300 を用いたゲル濾過を行うことで、純度 403 倍にまで精製した【表
2-2】
。しかし可溶化後の酵素は不安定であり、精製操作の間に失活していくため収率は 0.9%と低
かった。精製酵素標品の SDS-PAGE 分析の結果、推定分子量 90,000 の DmsA サブユニット、およ
び推定分子量 30,000 の DmsB サブユニットと一致する位置にそれぞれバンドが確認された。しか
し、分子量 30,000 のタンパク質の N 末端アミノ酸配列を分析したが、おそらく N 末端の修飾のた
め、アミノ酸のシグナルは検出されなかった。DmsC サブユニットに対応するバンド（47.3 kDa）
は現れなかった【図 2-5】
。
3-3．精製酵素の分子的性質
ゲルろ過後の精製標品を用いて、可視紫外スペクトルを 400～700 nm の範囲で測定した
【図 2-6】
。[還元型－酸化型]差スペクトルでは、400 nm を中心にブロードな谷が現れ、これは鉄
イオウクラスターの存在を示すと考えられる。しかしシトクロムに特有の 420 nm 付近の吸収極大
は観察されなかった。大腸菌の DMSO 還元酵素の DmsC サブユニットは補欠分子族としてプロト
ヘムを持つ b 型シトクロムである。H. volcanii の DMSO 還元酵素の DmsC サブユニットは、精製
操作中に脱離してしまったと考えられる。
3-4．精製標品の酵素的性質
精製標品を用いて、還元型 MV を電子供与体とした場合の DMSO 還元活性の最適反応条
件を分析したところ、
pH は 7.0、
NaCl 濃度は 0.2 M で、それぞれ最も高い活性を示した【図 2-7AB】
。
16
精製酵素の DMSO に対する親和定数 Km は 45 μM と算出された【図 2-8】。大腸菌の DMSO 還元酵
素では、180 μM と報告されているので、H. volcanii の酵素は、基質に対する親和性が 4 倍ほど高
かった（Bilous and Weiner 1985）
。様々なオキソ化合物に対する反応性を分析したところ、DMSO
との反応性に対して DL-methionine sulfoxide が 6.0 倍、pyridine N-oxide が 26.0 倍、TMAO が 8.5
倍，という高い反応性を示した【図 2-9】
。また他のオキソ酸塩を添加した培養液で H.volcanii を
嫌気培養した結果、pyridine N-oxide を添加した培養液中では活発に増殖したが、DL-methionine
sulfoxide あるいは TMAO を添加した場合には増殖は観察されなかった。一方、硝酸塩、あるいは
大腸菌や H. volcanii のヘテロ三量体型硝酸塩還元酵素との高い反応性が報告されている塩素酸塩
（NaClO3）とは全く反応性を示さなかった。
17
第4節
考察
私は、これまで全く報告のなかったアーキアからの異化型 DMSO 還元酵素の精製に成功
し、その分子的および酵素的性質の分析に成功した。しかし、得られた精製標品は不安定であり、
最終的な回収率も 0.9%と極めて低かった。またその遺伝子構造から、この酵素は DmsABC ヘテ
ロ三量体構造をとると考えられる。しかし、今回の研究では、DmsC サブユニットは精製操作中
に離脱したと考えられ、最終的に DmsAB 複合体として精製された。酵素の安定化と電気泳動的
均一な状態までの精製を目的として、今回用いた Triton X-100 に代わる界面活性剤の選択や精製
法の改良が今後の課題である。
精製した DMSO 還元酵素の活性の最適 NaCl 濃度は 0.2 M であり、2 M 以上の高い NaCl
濃度では活性を示さなかった【図 2-6AB】
。好塩性アーキアは、ほぼ飽和濃度の塩水環境に適応す
るため、細胞内部に高濃度の KCl を蓄積することで、浸透圧調節を行っている（Leuko et al 2008）。
そのため、好塩性アーキアの酵素タンパク質は、その構造安定性や活性に高濃度の塩を必要とす
る halophilic な性質を示すことが多い（Oren 2008）。最適 NaCl 濃度が非常に低いことは、H. volcanii
がほぼ飽和濃度の塩を含む死海に生息すること、また高度好塩性アーキアの細胞内塩濃度（[KCl]
≈ 3 M）では活性が完全に阻害されることとは一見矛盾する（Leuko et al. 2008）。別種の高度好塩
性アーキアである Haloarcula marismortui から精製された硝酸塩還元酵素も DMSO 還元酵素と同様
に halophilic な性質を示さないことが報告されている（Yoshimatsu et al. 2000, 2002）
。H. marismortui
の硝酸塩還元酵素は NarGH ヘテロ二量体として精製されるが、NarG と DmsA はモリブドプテリ
ンと鉄イオウクラスターを、また NarH と DmsB は 4 個の鉄イオウクラスターを含んでいる
（Yoshimatsu et al. 2000, 2002, Baltes et al. 2003, Zafra et al. 2005）
。Ishibashi ら（2012）は、分子内
部に鉄イオウクラスターによる共有結合のネットワークが張り巡らされていると、タンパク質分
子は安定化することを報告している。両者が低濃度の塩環境に曝露されることによっても不安定
化しないのはこのためであろう。また、DMSO 還元酵素の生理的基質は細胞膜中の還元型ユビキ
ノンと考えられるので、キノン化合物を電子供与体とする DMSO 還元活性について最適条件を検
討することもまた今後必要である。
様々な原核生物が DMSO 呼吸能を持ち、E. coli や R. sphaeroides などのバクテリア、さら
18
に今回、高度好塩性アーキア H. volcanii から、その末端酵素である DMSO 還元酵素が精製された
（Sambasivarao and weiner 1991, Kappler et al 2002, Mouncey et al 1997）。ところが、自然環境中での
硫黄サイクルにおける DMSO 呼吸の位置付けは、不明と言わざるを得ないのが現状である。自然
環境中の DMSO 濃度は非常に低く、例えば一般的な海洋表層では数 pM（「化学物質の環境リスク
評価」2009）であり、高い DMSO 濃度が報告されているアメリカの塩湖湖水の表層でも 180 nM
（Simo 1998）である。大腸菌と H. volcanii の DMSO 還元酵素の DMSO に対する親和定数（それ
ぞれ 180 μM と 45 μM）は、この値の 104~105 倍であり、低濃度の DMSO を効率的に DMS に変換
する機能を有するとは到底考えられない。死海湖水中、特に DMSO 呼吸が起こり得る嫌気的な湖
底堆積物中の DMSO 濃度の報告は無いが、それほど高くはないだろう。また、死海の湖水中の硝
酸塩濃度についても、非常に低い値（3～8 µM）が報告されている（Ionescu et al 2012）。これらの
結果から、死海では、高度好塩性アーキアによる DMSO 呼吸や脱窒などの嫌気的代謝が活発に起
こっているとは考えにくい。
今回 H. volcanii 酵素において明らかとなったように、異化型 DMSO 還元酵素はオキソ化
合物に対して広い基質選択性を示す（Simala-Grant and Weiner 1996、Müller and Dassarma 2005）。
大腸菌酵素は、DMSO や TMAO のメチル基が他のアルキル基に置換した誘導体や、ピリジン化合
物の N－オキシド等、広範な有機化合物を基質とすることが示されている。TMAO は魚類等の細
胞中に含まれる浸透圧調節物質であり、生成物である trimethylamine は海産生物の生臭さの原因物
質である（Seibel and Walsh 2002）
。また、タンパク質中のメチオニン残基は、細胞内の酸化ストレ
スレベルが上昇すると、容易にスルフォキシド型の構造（DL-methionine sulfoxide）に変換される
ことが知られている（Magdaleno et al 2011）
。一方、Pyridine N-oxide は、様々な薬剤の化学合成過
程において酸化剤として使用されるが、自然環境中での振る舞いについては全く知られていない
（Xie et al 2010）
。
今後の課題として、DMSO 還元酵素の真の生理的機能は何かが議論されるべきであろう。
H. volcanii の DMSO 還元酵素の基質選択性をさらに詳細に分析するとともに、死海の海水あるい
は底泥中にどのようなオキソ化合物が存在するかを調べることで、DMSO 呼吸の環境生態学的な
意義が明らかになるものと考えている。
19
表 2-1．Hv 培養液の組成
NaCl
MgCl2·6H2O
176 g/l
20 g/l
KCl
00 2.0 g/l
CaCl2·2H2O
00 0.1 g/l
*KNO3（脱窒培養時のみ)
00 5.0 g/l
Yeast Extract
00 5.0 g/l
Pepton oxoid
00 2.0 g/l
Mineral sol.
00 1 ml/l
Fe Sol.
00 1 ml/l
Mineral solution
FeSO4·7H2O
2.46 g/100ml
EDTA-2Na
3.31 g/100ml
Fe Solution
Na2MoO4·2H2O
100 mg/100ml
MnCl2
200 mg/100ml
CoCl2·6H2O
002 mg/100ml
ZnSO4·7H2O
100 mg/100ml
CuSO4·5H2O
100 mg/100ml
Tris-HCl で pH 7.4 に調整後、オートクレーブで
121℃、15min の滅菌処理を行った。滅菌後、フィ
ルター滅菌した DMSO を 50 mM となるように加え
た。
20
表 2-2． H. volcanii ΔnarO 株からの DMSO 還元酵素の精製
Protein
Total
Specific
Total
conc.
protein
activity
activity
Volume
Yield
(ml)
(%)
(μg/ml)
(mg)
(μmol/min/mg)
(μmol/min)
231.0
7,730
1,780.00
0.234 (00
416.
50.0
6,580
0,329.00
0.048 (1)
015.60
3.8
15.50
599
9.29
00.982 (21)
9.11
2.2
1.00
193
0.19
19.1 (403)
3.69
0.9
Membrane
100.
fraction
Solubilization
Anion-exchange
chromatography
Gel-filtration
21
図 2-1. DMSO 還元酵素の遺伝子構造（A）と推定される分子構造（B）。
（A）Haloferax volcanii の
DMSO 還元酵素の遺伝子は、５個の ORF から成り、dmsA がモリブドプテリンを含む活性サブユ
ニット、dmsB が鉄イオウサブユニット、dmsC が生理的電子供与体である補酵素 Q からの電子を
受け取るシトクロム・サブユニットをコードしている。dmsD 産物は分子シャペロンと考えられて
いるが、dmsE 産物の機能は不明である。さらに上流側にある dmsR は、DMSO 還元酵素の発現を
コントロールする制御遺伝子と考えられる。
22
図 2-2．DMSO 還元酵素と硝酸塩還元酵素の活性染色。DMSO 呼吸あるいは脱窒条件の下で培養
した H. volcanii H26 の菌体からそれぞれ調製した膜可溶化抽出物を Native-PAGE し、DMSO 還元
活性（A）
、および硝酸塩還元活性（B）を活性染色によってそれぞれ可視化した。図中の 0, 1, 2, 3
は、可溶化後の日数を表わす。
23
図 2-3．H. volcanii H26 株と ΔnarO 株における DMSO 還元酵素と硝酸塩還元酵素の発現。
（A）.H26
株と ΔnarO 株を、好気（1, 4）
、脱窒（2, 5）
、DMSO 呼吸（3, 6）の各条件でそれぞれ培養し、得
られた菌体から調製した膜画分を可溶化し Native-PAGE を行った。泳動後のゲル中の DMSO 還元
活性（1）と硝酸塩還元活性（2）を活性染色によってそれぞれ可視化した。
（B）.H26、ΔnarO 株
を、好気、脱窒、DMSO 呼吸の条件でぞれぞれ培養し、得られた菌体に含まれる硝酸塩還元酵素
（赤）と DMSO 還元酵素（青）を測定した。実験は独立して 3 回行い、平均値と標準偏差を算出
した。
24
図 2-4．陰イオン交換クロマトグラフィーによる DMSO 還元酵素の精製（A）と SDS-PAGE によ
る分析（B）
、および H. volcanii DmsA 前駆体タンパク質の推定アミノ酸配列（C）
。
（A）. 各フラ
クションの 410 nm
（
）
と 600 nm
（
）での吸光度。
DMSO 還元活性
（オレンジ色、
µM/min）
を測定した。図中の直線は NaCl 濃度を示す。
25
図 2-5．精製酵素の SDS-PAGE 分析。H. volcanii ΔnarO 株から調製した細胞膜画分から、可溶化①、
陰イオンクロマトグラフィー②、およびゲルろ過③によって精製した DMSO 還元酵素標品をそれ
ぞれ泳動した。
26
図 2-6. H.volcanii DMSO 還元酵素精製標品の可視紫外吸収スペクトル。精製 DMSO 還元酵素（0.58
μg/ml）を buffer A で懸濁し、スペクトルを測定した。還元型の可視紫外吸収スペクトルは亜ジチ
オン酸ナトリウム（Na2S2O4）で還元した後測定した。
27
図 2-7. 酵素における最適 pH（A）と酵素における最適塩濃度（B）
。
28
図 2-8. 精製した DMSO 還元酵素の DMSO に対する親和性。1 μM、10 μM、100 μM、および 500 μM
の DMSO を基質として還元活性を測定し、Hanes-Woolf plot*を用いて DMSO に対する親和定数を
算出した。* [S]/v = 1/Vmax×[S] + Km/Vmax
29
図 2-9．H. volcanii DMSO 還元酵素の基質選択性
30
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34
第3章
DMSO 還元酵素の誘導発現の制御機構
35
第1節
背景
第 2 章で述べたように、高度好塩性アーキア Halobacterium sp. NRC-1 において、DMSO
還元酵素遺伝子 dmsEABCD に関する分子生物学的な分析が報告されている（Müller and DasSarma
2005）
【図 3-1】
。dmsA、dmsB、dmsC 遺伝子はそれぞれに Mo-bisMGD を含む触媒サブユニット、
鉄-イオウサブユニット、疎水性アンカーサブユニットをコードし、大腸菌の DMSO 還元酵素
DmsABC の、対応する各サブユニットとそれぞれ相同な構造を持つものと考えられる。また、
dmsD 遺伝子産物は分子シャペロンであり、大腸菌の DMSO 還元酵素遺伝子中にも相同な
ORF が存在する。一方、dmsE 遺伝子は大腸菌の DMSO 還元酵素遺伝子中には存在せず、dmsE
遺伝子産物の役割は不明である。また、この dmsEABCD 遺伝子は単一の転写単位としてふるま
うことが、逆転写 PCR 分析によって示されている（Müller and DasSarma 2005）
。dmsEABCD 遺伝
子の直上流には HTH 型転写因子をコードする遺伝子 dmsR が存在する。
Müller と DasSarma (2005)
は、DMSO 呼吸によって Halobacterium sp. NRC-1 が嫌気的に増殖する際に、DmsR が dmsEABCD
遺伝子を転写活性化していることを、dmsR 遺伝子破壊株を用いたトランスクリプトーム分析によ
って示している。
今回私が用いている H. volcanii も DMSO 呼吸能を持ち、そのゲノム中に Halobacterium sp.
NRC-1 のものと相同な dmsR/dmsEABCD 遺伝子が存在する【図 3-1】。しかしその直下流に存
在し、これもポリシストロニックに転写されるであろう 4 個の ORF（HVO_B0367～B0370）は、
Halobacterium sp. NRC-1 には見出されない。HVO_B0367 は、モリブドプテリン（MPT）結合ド
メインを持つタンパク質をコードしている。また HVO_B0368（mobA2）遺伝子産物は 2 分子の
MPT から DMSO 還元酵素の補酵素である Mo-bisMGD を生合成する酵素と考えられる（Reschke et
al. 2013, Stevenson et al. 2000）。さらに、HVO_B0369（modA）と HVO_B0370（cysT）はモリブデ
ンの膜間輸送への関与が予想される。そこで私は、4 個の ORF（HVO_B0367～B0370）を、
Mo-bisMGD の生合成（Mo-bisMGD biosynthesis）に関与するものとして mgd 遺伝子クラスターと
命名した。
DMSO 呼吸は嫌気呼吸の一種であるため、その末端酵素である DMSO 還元酵素の発現は、
36
酸素と DMSO の両者に依存した制御系によって制御される必要がある。多くのバクテリアも嫌気
的な呼吸を行うが、その誘導制御には、バクテリア特有の酸素センシング系である 2 成分システ
ム FixLJ や FNR 等の転写因子が関与する（Cotter and Gunsalus 1989, Bearson et al. 2002）。しかし、
アーキアにはこれらの転写制御因子のホモログは存在しない。従って、好塩性アーキアにおける
嫌気呼吸の誘導制御には、これらとは異なるメカニズムが関わっていると考えられる。さらに、
DMSO に依存した転写制御は、バクテリアにおいてもまだ完全には解明されていない（Mouncey
and Kaplan 1998a, 1998b）
。
そこで私は H. volcanii を研究対象として用い、高度好塩性アーキアの DMSO 呼吸の制御
における DmsR の役割を明らかにすることを目的とした研究を行った。H. volcanii の dmsR 遺伝子
破壊が当研究室の伊藤（2010）によって行われ、Halobacterium sp. NRC-1 と同様に DMSO 呼吸に
よる増殖能が失われることがすでに確かめられている（Müller and DasSarma 2005, 伊藤 2010）。
さらに、H. volcanii においては、ΔnarO 株は DMSO 呼吸による増殖が、また ΔdmsR 株は脱窒によ
る増殖がそれぞれ可能であった（伊藤 2010）。この結果は、NarO は脱窒を、また DmsR は DMSO
呼吸をそれぞれ独立に制御していることを示唆している。本研究では、dmsEABCD 遺伝子、mgd
遺伝子、さらに dmsR 遺伝子自身の転写をレポーターアッセイ法によって分析した。その結果、
DmsR は DMSO に依存してこれらの遺伝子の転写を活性化すること、また DMSO 呼吸の誘導制御
には嫌気条件で活性化される未知の転写制御系が関与していることが明らかとなった。Müller and
DasSarma（2005）は、Halobacterium sp. NRC-1 を用いた分析に基づいて、DmsR が、嫌気条件に
依存した dmsEABCD 遺伝子の転写活性化に関与していると述べているが、今回得られた結果とは
矛盾している。今回の研究結果に基づいて、高度好塩性アーキアの DMSO 呼吸の制御機構のモデ
ルを新たに提案する。
37
第2節
材料と方法
2-1．dmsR 遺伝子破壊株の作製
当研究室の伊藤（2010）によって行われた dmsR 遺伝子の破壊実験の方法を以下に示す。
dmsR 遺伝子の破壊は、オロト酸からウラシルを生合成する反応に必須の酵素 PyrE2
（orotate:phosphoribosyl transferase）の遺伝子を欠損した H. volcanii H26 株（∆pyrE2）を用いた
double-integration 法によって行なわれた【図 3-2A】。H. volcanii の遺伝子操作法は、Dyall-Smith（2009）
に従った。まず、dmsR 遺伝子の上流側の領域（dmsR-U）を、オリゴヌクレオチドプライマー
（dmsRUf/dmsRUr）を用いて PCR 増幅した。また dmsR 遺伝子の下流側領域（dmsR-D）について
もオリゴヌクレオチドプライマー（dmsRDf/dmsRDr）を用いて増幅した。PCR 増幅には KOD-plus
DNA polymerase（TOYOBO CO. Ltd.、Osaka）を用いた。両者を pyrE2 遺伝子を含む遺伝子破壊用
プラスミド pTA131（T. Allers 博士から供与）にクローニングした。PCR 増幅に用いたプライマー
の塩基配列は表 3-2 に示した。得られた遺伝子破壊用プラスミド p∆dmsR は、形質転換効率を上げ
るため、E.coli SCS110 株（DNA メチル化酵素欠損株）を用いて脱メチル化した。その後、H. volcanii
H26 を p∆dmsR で形質転換した。相同組み換えによって p∆dmsR プラスミドがゲノム中に挿入
（pop-in）された形質転換株 HDR は、ウラシル合成能が回復するため、ウラシルを含まない H.
volcanii 用カザミノ酸（Hv-Ca）寒天培地でコロニーを形成する（Allers et al. 2004）
。得られた HDR
株を、50 μg/mL の 5’-フルオロオロト酸（5’-FOA）と 10 μg/mL のウラシルを含む Hv-Ca 寒天培地
上で培養すると、pyrE2 遺伝子が相同組み換えによって脱落（pop-out）した株のみ増殖すること
が可能となる。Hv-Ca 寒天培地に現れたコロニーを採取・培養し、抽出したゲノムを鋳型に、
DNAdmsRUf と dmsRDr をプライマーとして PCR 増幅をおこなった。2.0 kbp の DNA 断片が増幅
された DR1 株（遺伝子型：∆pyrE2∆dmsR）を、dmsR 遺伝子破壊株として実験に用いた【図 3-2B】
。
H. volcanii 菌株の遺伝子型は表 3-3 にまとめた。
2-2．dmsR 遺伝子破壊株の培養実験
dmsR 遺伝子破壊株 DR1 の好気的培養は、150 mL 容量の三角フラスコに入れた 40 mL の
38
Hv 培養液を用い、暗所、37˚C で 120 rpm で振とうすることで行った。また嫌気条件での培養は、
Hv 培養液の入った三角フラスコをブチルゴム栓で密閉し、気相を 0.2%酸素と 99.8%窒素からなる
混合ガス（静岡酸素、静岡）で 5 分間置した後、暗所、37˚C で 80 rpm で振とうすることで行った。
この際、脱窒条件での培養には 50 mM KNO3 を、また DMSO 呼吸条件の場合は 50 mM DMSO を
それぞれ加えた Hv 培養液を用いた。嫌気下、呼吸基質を添加しない条件での培養も同時に行っ
た。さらに比較のため、上記の 4 条件での培養を、H26 株を使って行った。サンプリングは、ア
ルコール殺菌した注射針を用いて 24 時間ごとに行い、サンプリングごとに混合ガスによって気相
を再度置換した。菌の増殖は、培養液の濁度を 600 nm で測定することによって追跡した。
2-3．レポーターアッセイ用プラスミドの作製
2-3-1
dmsR プロモーターアッセイ用プラスミドの作製
dmsRPf/dmsRPr をプライマーとして PCR 増幅を行い、dmsR 遺伝子プロモーター全長を
含む 642bp 長の増幅 DNA 断片（以下 HvdmsRP）を得た。増幅 DNA 断片をアガロース電気泳動
した後、切出精製しし、PCR-blunt TOPO II プラスミド（Invitrogen. Carlsbad, CA. U.S.A.）にクロー
ニングした。得られたプラスミド pCRdmsRP 中の HvdmsRP の下流側に、別種の好塩性アーキア
Haloferax lucentense 由来の β－ガラクトシダーゼ遺伝子 bgaH（2.0 kb）をクローニングした（Gregor
and Pfeifer 2001）
。得られたプラスミド pCRdmsRPbgaH を BamHI と XbaI で処理し、2.3 kbp のイン
サート全長を切出し精製した。これを H. volcanii と大腸菌とのシャトルベクターである
pMLH32EV にクローニングすることで、レポータープラスミド pdmsRP を作成した（Holms et al.
1994）
。ここで pMLH32EV は、シャトルベクターpMLH32 を EcoRV で処理することで、内在する
bgaH 遺伝子を不活性化したものである。
H26 株および DR1 株を pdmsRPbgaH で形質転換し、1 μg/mL のノボビオシン（DNA gyrase
B 阻害剤）を含む Hv 寒天培地上で培養した。37°C で 1~2 週間培養後、現れたコロニーを、それ
ぞれ DMP1 （H26/pdmsRp）
、DMP2（DR1/pdmsRp）としてプロモーターアッセイ実験に用いた。
2-3-2．dmsEABCD プロモーターアッセイ用プラスミドの作製
39
dmsPf/dmsPr をプライマーとして PCR 増幅を行い、dmsEABCD 遺伝子プロモーター全長
を含む 300 bp 長の増幅 DNA 断片を得た。以下、dmsR プロモーターアッセイ用プラスミドと同じ
手順で dmsEABCD プロモーターアッセイ用プラスミド pdmsP を作製し、H26 株と DR1 株を形質
転換した。得られた形質転換株、DMP1（H26/pdmsp）と DMP2（DR1/pdmsp）を実験に用いた。
2-3-3．mgd プロモーターアッセイ用プラスミドの作製
mgdPf/mgdPr をプライマーとして PCR 増幅を行い、mgd 遺伝子プロモーター全長を含む
474 bp 長の増幅 DNA 断片を得た。以下、dmsR プロモーターアッセイ用プラスミドと同じ手順で
mgd プロモーターアッセイ用プラスミド pmgdP を作製し、H26 株と DR1 株を形質転換した。得ら
れた形質転換株、MGP1（H26/pmgdp）と MGP2（DR1/pmgdp）を実験に用いた。
2-4．プロモーターアッセイ
形質転換株を、2-2 に記した 4 条件で培養し、誘導された BgaH 活性を測定することで、
各遺伝子プロモーターの転写活性とした。培養開始後 24 時間ごとに、滅菌済注射器を用いて 2.0
mL の培養液を採取した。嫌気培養の場合は、試料採取後、改めて気相を混合ガスで置換した。採
取した 2.0 mL のうち 1.0 mL は、MPS-2000 分光光度計による OD600 の測定に用いた。また残りの
1.0 mL の培養液を遠心（6,000 rpm x 5 min、4 ºC）し、得られた菌体ペレットを 800 μL の BgaH 活
性測定用反応溶液
（以下 B 溶液）
に懸濁した。
B 溶液の組成は、50 mM Tris-HCl (pH7.2)、2.5 M NaCl、
10 μM MnCl、0.1% β-mercaptoethanol である。次に 100 μL の 2% (w/v) Triton X-100 を加えボルテ
ックスミキサーで 10 秒間混合することで溶菌させた。これを分光光度計用セルに移し、405 nm
での吸光度を測定した。この状態での吸光度を 0 とした後、100 μL の 8mg/ml 2-nitrophenyl
β-D-galactopyranoside（ONPG）溶液（B 溶液に溶解）を加え、ONPG の加水分解による o-nitrophenol
の生成に伴う 405 nm の吸光度の増加を 10 分間測定した。得られた OD600 と 405 nm の吸光度の時
間変化量（ΔA405/min）から、式１に従って BgaH 活性（Miller unit）を計算した。
BgaH (m.u.) = (ΔA405/min/OD600) ×1,000 -----（式 1）
40
2-5. dmsEABCD プロモーターの deletion 実験
dmsEABCD プロモーターの発現領域の機能部位を探るために、翻訳開始点から 120 bp、
90 bp、
58 bp まで削った配列を用いて、2-3 に記した手順で 3 種のレポータープラスミド、pdmsP120、
pdmsP90、
pdmsP58 を作成した。
これらのプラスミドで H26 株と DR1 株をそれぞれ形質転換した。
得られた形質転換株、DMP3（H26/pdmsP120）
、DMP4（DR1/pdmsP120）
、DMP5（H26/pdmsP90）、
DMP6（DR1/pdmsP90）
、DMP7（H26/pdmsP58）
、DMP8（DR1/pdmsP58）を用いて 2-4 に記したレ
ポーター実験を行った。
2-6．他の測定
PCR 産物の塩基配列は、DNA シークエンサーSequeCEQ 8000 Genetic Analysis System
（Beckman Coulter, Inc., Brea, CA ）を用いて確認した。塩基配列の相同性検索は、 BLAST
（http://blast.genome.jp/）を用いて行った. 高度好塩性アーキアの全ゲノム情報は KEGG GENOME
Database （http://www.genome.jp/kegg/）に登録されているものを用いた。
41
第 3 節結果
3-1．増殖に及ぼす dmsR 遺伝子の影響
H. volcanii H26 株（遺伝子型：ΔpyrE2）を用いて作成された dmsR 遺伝子破壊株 DR1（遺
伝子型：ΔpyrE2∆dmsR）を、好気、嫌気（呼吸・基質無添加）、DMSO 呼吸（嫌気・DMSO 添加）、
脱窒（嫌気・硝酸塩添加）の 4 条件で培養し、その増殖を親株である H26 株と比較した。H26 株
は、好気、DMSO 呼吸、脱窒条件で活発的に増殖するのに対し、DR1 は、好気、脱窒条件では
H26 株と同様に増殖したが、DMSO 呼吸条件では増殖しなかった【図 3-3AB】
。
4 条件で培養した両菌株の DMSO 還元酵素活性を表 3-2 にまとめた。いずれも培養開始
96 時間後（DMSO 呼吸条件と脱窒条件では対数期後期、好気条件では定常期初期）に回収した菌
体を実験に用いた。DMSO 呼吸条件で培養した H26 株では最も高い活性（569 ± 47 nmol/min/mg）
を検出した。好気条件、嫌気（基質無添加）条件で培養した H26 株菌体からは、それぞれ最大活
性の 2.6 %（15 ± 6 nmol/min/mg）、6.2 %（35 ± 13 nmol/min/mg）と低くはあるが、DMSO 還元酵
素活性が検出された。興味深いことに、脱窒条件で培養した H26 株は、最大活性の 57%（327 ± 20
nmol/min/mg）という高い DMSO 還元活性を示した。一方で、DR1 株菌体からは、すべての培養
条件で DMSO 還元活性は検出されなかった。以上の結果は、dmsR 遺伝子が DMSO 呼吸能の誘導
に必須であること、また、DMSO 還元酵素の発現には嫌気条件のみが必須であることを示してい
る。
3-2．dmsEABCD 遺伝子プロモーターの転写活性
レポータープラスミド pdmsP で H26 と DR1 を形質転換した DMP1（H26/pdmsP）
と DMP2
（DR1/pdmsP）を用いて、dmsEABCD 遺伝子プロモーターの転写活性を測定した。上記と同じ 4
条件で 96 時間培養し、
得られた菌体中の BgaH 活性を測定したところ、
DMSO 呼吸条件では、
DMP1
では高い BgaH 活性（1,477 ± 229 m.u.）が検出されたのに対して、DMP2 での活性は 4 分の 1
程度（335 ± 142 m.u.）と低かった【図 3-4A】
。脱窒条件では、両菌株いずれも高い活性（DMP1:
949 ± 451 m.u., DMP2: 1,405 ±366 m.u.）を示し、DMSO 呼吸条件での DMP1 における活性と有
42
意差は認められなかった。嫌気・呼吸基質無添加条件で培養した DMP1 と DMP2 からは、低
いながらもそれぞれ 165 ± 41 m.u.、138 ± 30 m.u.と、同程度の BgaH 活性が検出されたが、そ
の活性は DMSO 呼吸条件での DMP2 の活性とは有意差を示さなかった。好気的に培養した
DMP1、DMP2 からは、極めて低い活性（16 ± 6 m.u.、13 ± 3 m.u.）しか検出されなかった。
以上の結果は、dmsEABCD 遺伝子プロモーターの転写活性化には、嫌気条件のみが
重要であり、呼吸基質の有無には関係ないこと、また dmsR 遺伝子は DMSO に依存した転写
活性の亢進に寄与することを示す。
DMP1 と DMP2 の両者とも、脱窒条件においても dmsEABCD
遺伝子が強く転写されるが、DMSO 還元酵素活性は DMP1 のみに誘導された。Müller と
DasSarma（ 2005）は、Halobacterium sp. NRC-1 の ΔdmsR 株を用いた転写制御の分析から、DmsR
が嫌気条件に依存して dmsEABCD 遺伝子の転写を活性化する制御因子であることを示唆した。
しかし、今回得られた研究結果は、彼らの主張とは明らかに矛盾する。今回の結果は、DmsR
の機能が DMSO に依存した転写活性化であり、嫌気条件に依存した未知の転写制御系ととも
に、dmsEABCD 遺伝子の転写を二重に制御しているというモデルによって説明できると考え
られる。
3-3．dmsR と mgd 遺伝子プロモーターの転写活性
dmsR 遺伝子プロモーターの転写活性を DRP1 (H26/pdmsRP) と DRP2 (DR1/pdmsRP)
を用いて分析した。上記の 4 条件で 96 時間培養し、誘導された BgaH 活性を測定した【図 3-4B】
。
好気条件では両菌株ともに活性は非常に弱かった。DMSO 呼吸条件では DRP1 で最も高い活
性（955 ± 21 m.u.）が検出されたが、DRP2 での活性はその約 40%（365 ± 37 m.u.）だった。
嫌気・基質無添加条件では、両株とも同程度の活性（DRP1：396 ± 39 m.u.、DRP2：447 ± 46 m.u.）
を示し、DMSO 呼吸条件での DRP2 の活性と有意差はなかった。脱窒条件では両株とも同程
度の高い活性（DRP1：902 ± 82 m.u.、DRP2：871 ± 87 m.u.）を示し、DMSO 呼吸条件での DRP1
の活性とも有意差はみられなかった。以上の dmsR 遺伝子プロモーターの転写活性の性質は、
図 3-4B に示した dmsEABCD 遺伝子プロモーターの転写活性のものとよく一致することから、
両者は同一の制御系によってコントロールされていることが示された。
43
mgd 遺伝子プロモーターの転写活性も、MGP1 (H26/pmgdP) と MGP2 (DR1/pmgdP)を
用いて、同様に分析した【図 3-4C】
。mgd 遺伝子プロモーターの場合にも、DMSO 呼吸条件で
MGP1 が最も高い活性（476 ± 75 m.u.）を示し、MGP2 ではその 35%（165 ± 78 m.u.）である
こと、また脱窒条件での転写活性は両菌株で同程度（MGP1：204 ±85 m.u.、MGP2：194 ±80 m.u.）
であるなど、dmsEABCD 遺伝子と dmsR 遺伝子での観察と類似した性質を示した。以上の結果か
ら、mgd 遺伝子の転写もまた、dmsEABCD、 dmsR 両遺伝子と同一の制御機構によってコントロ
ールされていることが示唆された。
3-4．dmsEABCD 遺伝子プロモーターの deletion 実験
dmsR、 dmsEABCD と mgd 遺伝子の転写は、同一の制御機構によってコントロールされ
ていると考えられることから、これらの遺伝子プロモーターは制御因子との相互作用に関わる共
通した機能部位を持つと考えられる。ところが、TATA-box と推定される配列以外、コンセンサス
配列は見つからなかった。そこで dmsEABCD 遺伝子プロモーター配列上の機能部位を探るため
deletion 実験を行った。このプロモーター上には、高度好塩性アーキアの TATA-box（consensus：
TTTWWW, W = A or T）に相当すると考えられる「TATATA」が、dmsE 遺伝子翻訳開始点（ATG）
の上流 -67~-62 bp の位置に存在する。そこで、プロモーター配列を翻訳開始点上流それぞれ 120bp、
90bp と 58bp まで短縮した配列を bgaH 遺伝子と連結することでレポータープラスミド（pdmsP129,
pdmsP90, pdmsP58）を作成した。これら 3 種のレポータープラスミドで H26 と DR1 をそれぞれ形
質転換し、得られた菌株を DMSO 呼吸条件で培養した後、BgaH 活性を測定した【図 3-5】
。
DMP3（H26/pdmsP120）と DEP5（H26/pdmsP90）での活性は、DMP1（H26/pdmsP）より
約 30％低下した。推定 TATA-box を含まない DMP7（H26/pdmsP58）では活性は検出されなかった。
一方、DMP4（DR1/pdmsP120）、DMP6 （DR1/pdmsP90）と DMP8 （DR1/pdmsP58）では転写
活性は全く検出されなかった。以上の結果は、dmsEABCD プロモーター配列の-90~-58 bp 間
には、DmsR による DMSO 依存的な転写活性化に必要な機能部位が、さらに dmsEABCD プロ
モーター配列の-120 bp より上流側には嫌気的制御に関係する部位がそれぞれ存在することを
示唆する。
44
第 4 節考察
DMSO 呼吸の制御は、E. coli と R. sphaeroides において、詳細な研究がなされている。
E. coli DMSO 還元酵素をコードする dmsABC 遺伝子の転写は、独立した 3 種の制御系によっ
てコントロールされていることが明らかとなっている。転写因子 FNR（ fumarate-nitrate
reduction）は、嫌気条件の下で dmsABC 遺伝子の転写を活性化する（Bearson et al. 2002, Cotter and
Gunsalus 1989）。FNR は、その N 末端側に鉄-イオウクラスター、C 末端側に HTH 型 DNA 結合モ
チーフを持ち、酸素センサーとしての機能を持つ（Kiley and Beinert 1998, Dibden and Green 2005）。
また、モリブデンに応答した制御因子 ModE もまた、その転写を活性化する（Bearson et al. 2002,
McNicholas et al. 1998）
。一方、E.coli では、硝酸塩呼吸が DMSO 呼吸に優先することが知られて
いるが、これは細胞外硝酸塩に応答した二成分情報伝達をつかさどる NarXL が、dmsABC 遺伝子
の転写を抑制するためである（Hartig et al. 1999, Goh et al. 2005）
。
R. sphaeroides は光合成バクテリアであるが、暗所では DMSO 呼吸によってエネルギ
ーを得て増殖できる（Moore and Kaplan 1989）。R. sphaeroides の DMSO 還元酵素をコードする
dor 遺伝子の転写は、酸素センサー能を有する制御因子 FnrL、および DMSO に応答した二成
分情報伝達系である DorSR と DorXY によって制御されている（Mouncey and Kaplan 1998a）。
Mouncey と Kaplan（1998b）は、DMSO による dor 遺伝子の活性化は、DMSO 分子と DorS、
DorX との直接的な相互作用が引き金となるのではなく、DMSO 還元酵素から漏出した還元力
が DorS、DorX を活性化するためであるとする興味深い機構を提唱している。
H.volcanii や Halobacterium sp. NRC-1 などの DMSO 呼吸能を持つ好塩性アーキアで
は、dmsR/dmsEABCD という構造を持った遺伝子クラスターが、ゲノム上に共通して見出され
る（Müller and DasSarma 2005, Oren 1991, 2002, Oren and Trüper, 1990）。しかし、H.volcanii ゲノム
上には、バクテリアにおいて DMSO 還元酵素遺伝子の転写を制御する FNR や NarXL に相同
なタンパク質をコードする遺伝子は存在しない。Müller と DasSarma（2005）は、Halobacterium
sp. NRC-1 の ΔdmsR 株を用いて分析した結果、DmsR は嫌気条件に依存して DMSO 還元酵素
遺伝子の転写を活性化する制御因子であることを提唱した。しかし今回の研究で、H.volcani
の DmsR は酸素センサーではなく、dmsEABCD 、mgd、dmsR 遺伝子の転写を DMSO 依存的に
45
活性化する制御因子であることが明らかとなった。さらに、これらの遺伝子の転写制御には、
嫌気条件の下で転写を活性化する未知の制御因子が関与することが示唆された。
今回の研究では、H. volcanii を嫌気培養する場合には、0.2% O2 を含む混合ガスを用いて
いる。純窒素ガス（0.0001%> O2、静岡酸素）を用いて嫌気培養を行うと、誘導期から対数増殖期
への移行が不規則に遅くなることがしばしば観察される。この不安定な増殖の原因はまだ不明だ
が、微量（0.2%）の O2 の存在が DMSO 呼吸や脱窒などの嫌気呼吸の誘導発現に重要と考えられ
る。図 3-3 に示すように、H. volcanii を嫌気・基質無添加条件で培養すると、培養液の濁度はゆっ
くりと上昇している。私は、H.volcanii の HVO_0461 と HVO_0462 にコードされているシトク
ロム bd に注目すべきと考えている。シトクロム bd は、様々な微生物に存在し、酸素に対し
て高い親和性を持つため、微好気呼吸の電子伝達系末端酵素として機能することが知られて
いる（Juty et al. 1997）。H.volcanii は、シトクロム bd を末端酵素とする微好気呼吸によって得
たエネルギーを用いて、DMSO 呼吸や脱窒等の嫌気呼吸に必要な酵素やタンパク質の合成が
可能となるのだろう。
以上の結果から、H. volcanii における DMSO 還元酵素の転写制御モデルを提案する
【図 3-6】
。嫌気条件の下では、未知の嫌気的制御因子が、アポ DMSO 還元酵素をコードする
dmsEABCD 遺伝子、dmsR 遺伝子、Mo-bisMGD 生合成をつかさどる mgd 遺伝子の転写をそれ
ぞれ活性化する。また DmsR は、これら 3 遺伝子の転写活性を、DMSO に応答してさらに亢
進する。また、∆dmsR 株の培養とレポーター実験の結果から、DmsR は DMSO 還元酵素の成
熟化にも必須であることが明らかとなった。その機構はまだ不明であるが、一つの可能性と
して、Mo-bisMGD の前駆体である MPT の生合成系が DmsR によってコントロールされてい
るのかもしれない。
全ゲノム情報が報告されている 32 種の高度好塩性アーキアのうち、11 種（H. volcanii,
Haloferax mediterranei, Haloarcula sp. CBA1115, Haloarcula hispanica N601, Haloarcula hispanica
ATCC33960,
Haloarcula
marismortui,
Halobacterium
salinarum,
Halobacterium
sp.
NRC-1,
Halomicrobium mukohataei, Natronobacterium gregoryi, Natrinema sp. J7-2）に dmsR/dmsEABCD 遺伝子
クラスターが存在する。これら 11 種の高度好塩性アーキアの DmsR の推定アミノ酸配列を図
46
3-7 に示した。 N-末端側領域に 5～ 6 残基の保存されたシステイン（コンセンサス配列:
CXCX19-23CX22-31CXCX7C、H. volcanii からの DmsR: C33, C35, C56, C81, C83, C91）、C-末端側領域に
HTH 型 DNA 結合モチーフを共通して持っている。DmsR の N-末端側領域に存在するシステ
インに富む配列は、高度好塩性アーキアの NarO（第二章）以外の、既知のアミノ酸配列とは
相同性を示さない、Müller と DasSarma（2005）は、これらの保存されたシステイン残基が、
酸素あるいは redox センサーとして機能し得る鉄-イオウクラスターの結合モチーフである可
能性について述べている。一方、今回の研究によって、DmsR が DMSO に応答した転写制御
因子であることが示された。DmsR による DMSO センシングの分子機構は現時点では不明で
あるが、Mouncey と Kaplan (1998b)によって提唱された、R. sphaeroides における、DMSO に依存
した dor 遺伝子の転写制御機構が、
DmsR の機能を理解するための手がかりとなるかもしれない。
すなわち、DMSO 還元反応の際に漏出した還元力による DmsR の活性化が引き金となって、以降
の様々な遺伝子の転写が制御されるというものである。
H. volcanii では、脱窒条件でも高い DMSO 還元活性が誘導された。第二章の図 2-9
に示したように、DMSO 還元酵素は硝酸塩とは反応しないので、脱窒条件での DMSO 還元酵
素の発現には生理的意義は無いように思われる。この結果は、E. coli の DMSO 呼吸における、
嫌気条件と DMSO、硝酸塩による厳密な制御とは対照的であり、H. volcanii では DMSO 呼吸の
制御が‘ゆるい’ことを示している。第二章で示したように、H. volcanii の DMSO 還元酵素は、
様々なオキソ化合物（DMSO、メチオニンスルホキシド（CH3S(O)CH2CH2CH(NH2)COOH）
、TMAO
（(CH3)3N-O）
、ピリジン-N-オキシド（C5H5N-O）
）と反応する。H. volcanii における DMSO 呼吸
のゆるい制御と幅広い基質選択性は、微生物と環境との関係を考察する上で興味深い。微生物、
特に高度好塩性アーキアによる DMSO 呼吸の生態学的な有意性はまだ不明である（Oren 2002）
。
DMSO 呼吸は、たとえば水圏の堆積物中の様々な種類のオキソ化合物を、嫌気呼吸の基質として
用いることで除去する機能であるかもしれない、今回の研究では明らかにすることのできなかっ
た、DmsR による DMSO センシングの分子機構や DMSO 還元酵素の成熟化のメカニズム、高度好
塩性アーキアにおける DMSO 呼吸の生態学的意義などを、今後検討していく必要がある。
47
表 3-1. 実験に用いた H. volcanii 菌株の遺伝子型
Strain
Derivation or reference
Genotype characteristics
H26
Allers et al. (2004)
ΔpyrE2
HDR
H26, p∆dmsR pop-in
ΔpyrE2 dmsR+::[ΔdmsR pyrE2+]
DR1
HDR, pop-out
ΔpyrE2ΔdmsR
DMP1
H26, pdmsP transformed
ΔpyrE2 {dmsp::bgaH+novR}
DMP2
DR1, pdmsP transformed
ΔpyrE2ΔdmsR {dmsp::bgaH+novR}
DRP1
H26, pdmsRP transformed
ΔpyrE2 {dmsRp::bgaH+novR}
DRP2
DR1, pdmsRP transformed
ΔpyrE2ΔdmsR {dmsRp::bgaH+novR}
MGP1
H26, pmgdP transformed
ΔpyrE2 {mgdp::bgaH+novR}
MGP2
DR1, pmgdP transformed
ΔpyrE2ΔdmsR {mgdp::bgaH+novR}
DMP3
H26, pdmsP120 transformed
ΔpyrE2 {dmsp120::bgaH+novR}
DMP4
DR1, pdmsP120 transformed
ΔpyrE2ΔdmsR {dmsp120::bgaH+novR}
DMP5
H26, pdmsP90 transformed
ΔpyrE2 {dmsp90::bgaH+novR}
DMP6
DR1, pdmsP90 transformed
ΔpyrE2ΔdmsR {dmsp90::bgaH+novR}
DMP7
H26, pdmsP58 transformed
ΔpyrE2 {dmsp58::bgaH+novR}
DMP8
DR1, pdmsP58 transformed
ΔpyrE2ΔdmsR {dmsp58::bgaH+novR}
48
表 3-2.
PCR 増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列
Remarks
Name
Nucleotide sequence (5’-3’)
(inserted restriction
sites, underlined)
dmsRUf
GAG CTC GAA CAC CTG ATA ATG TAG CG
SacI
dmsRUr
GGA TCC CCG CTC GTG GAA TCA GCC AT
BamHI
dmsRDf
GGA TCC CGG TGT TCG ACT CCG AGT AA
BamHI
dmsRDr
CTG CAG CGC CGA ACA GCG ACG ACA GC
PstI
dmsPf
GGA TCC AGC GCG AGG CGG CGC TCA T
BamHI
dmsPr
CAT ATG TAC ACA CGT ACC GAG GGT GG
NdeI
dmsRPf
GGA TCC GTC GTC GGC GGC GAT AGT C
BamHI
dmsRPr
CAT ATG TAG TCA GTC GGT CAA CAC G
NdeI
mgdPf
GGA TCC CGC GGG AGG TGG TC
BamHI
mgdPr
GTG CAT ATG TAC TCA CTA CAC
NdeI
dmsP120f
GCA AAA ACG GCA GAC AGC TGA
-
dmsP90f
ACG GCT CGG TGC GAC GTC
-
dmsP58f
TTC ATT ATC CAG CGG GTG GC
-
49
表3-3．DMSO還元活性の誘導発現に対するdmsR遺伝子破壊の影響。dmsR遺伝子破壊株DR1とそ
の親株H26を、好気、嫌気・基質無添加、DMSO呼吸、脱窒の４条件で96時間培養した後、サンプ
リングした菌体を用いてDMSO還元活性を測定した。菌の培養はそれぞれ独立に３回行い、平均
値と標準偏差を算出した。DR1株では、４培養条件とも活性は全く検出されなかった。
DMSO reductase activity (nmol/min/mg protein)
Cultivation condition
anaerobic
anaerobic
anaerobic
(no substrate)
(+DMSO)
(+nitrate)
15 ± 6
35 ± 13
569 ± 47
327 ± 20
(2.6%)
(6.2%)
(100%)
(57.4%)
0
0
0
0
aerobic
H26
DR1
50
表 3-4. 実験に用いたプラスミドの性質
plasmid
Relevant characteristics
Source or reference
H. volcanii-E. coli shuttle plasmid containing ampR and
pMLH32
Holmes et al. 1991*
novR.
Derived from pMLH32 by EcoRV digestion for inactivation
pMLH32EV
This study
of bgaH gene originally present in plasmid.
pdmsp
pMLH32 containing dmsp300::bgaH.
This study
pdmsRp
pMLH32 containing dmsRp::bgaH.
This study
pmgdp
pMLH32 containing mgdp::bgaH.
This study
pdmsP120
pMLH32 containing dmsp120::bgaH.
This study
pdmsP90
pMLH32 containing dmsp90::bgaH.
This study
pdmsP58
pMLH32 containing dmsp58::bgaH.
This study
pTA131
Integration vector containing pyrE2.
Allers et al. 2004
p∆dmsR
pTA131 containing dmsRU+dmsRD fragment.
This study
51
図3-1.
H. volcaniiゲノム中のDMSO還元酵素遺伝子とその近傍の遺伝子構造。DNA結合タンパク
質をコードする dmsR 遺伝子（ HVO_B0361 ）を赤、 DMSO 還元酵素遺伝子 dmsEABCD
（HVO_B0362-0366）を緑、またMobisMGD の生合成に関与すると考えられる４個のORFからな
るmgd遺伝子クラスター（HVO_B0367-0370）をオレンジでそれぞれ示した。HVO_B0367（星印）
はMPT結合ドメインを持つタンパク質をコードする。dmsEABCDとmgd遺伝子クラスターは、それ
ぞれ単一の転写単位としてふるまうと考えられる。
52
図3-2. dmsR 遺伝子破壊株の作成。（A）図中に矢印で示したオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて、dmsR遺伝子の上流・下流側領域（dmsR-U、dmsR-D）をそれぞれPCR増幅した。用いたプラ
イマー（dmsRUf、 dmsRUr、dmsRDf、dmsRDr）のアミノ酸配列は表3-2に示した。両増幅産物を、
ウラシル合成酵素遺伝子pyrE2を含む遺伝子破壊用プラスミド pTA131にクローニングした。得ら
れたプラスミドp∆dmsRを脱メチル化した後、H. volcanii H26株（∆pyrE2）に導入し、ウラシルを
含まない寒天培地上で培養した。培地上に現れたコロニーを、相同組み換えによってp∆dmsRがゲ
ノム中に挿入されたpop-in株を得た。得られたHDR株を、5’-フルオロオロト酸（5’-FOA）を含む
寒天培地上で培養することで、再度の相同組み換えによってpyrE2遺伝子が脱落したpop-out株を得
た。
（B）Pop-out株を数コロニー採取し、得られたpop-out株のゲノムを抽出し、dmsRUfとdmsRDr
をプライマーとしてPCR増幅を行った。その結果、PCR産物のサイズが2.0 kbpを示すdmsR遺伝子
破壊株（遺伝子型：∆pyrE2∆dmsR）を得、これをDR1とした。Lane 1は標準としてλファージDNA
のEcoT14I 分解産物、またLane 2,3,4は、H26株、HDR株、DR1株からそれぞれ抽出したゲノムDNA
を鋳型としたPCR産物である。
53
図 3-3. H. volcanii の増殖に及ぼす dmsR 遺伝子破壊の影響。 dmsR 遺伝子破壊株 DR1 の増殖
（B）
を、その親株である H26（A）と比較した。菌の増殖は、波長 600 nm で測定した培養液の濁度の
変化を 24 時間毎に測定することで追跡した。培養は、好気（）、DMSO 呼吸（）、脱窒（）、
嫌気・基質無添加（）の４条件で、それぞれ独立に 3 回づつ行った。エラーバーは標準偏差で
ある。
54
図 3-4．dmsEABCD、dmsR、および mgd 遺伝子プロモーターの転写活性。dmsEABCD（A）、dmsR
（B）、および mgd（C）遺伝子プロモーターの転写活性を、好塩性 β-ガラクトシダーゼ遺伝子
bgaH をレポーター遺伝子として用い測定した。（A）は、DMP1（H26/pdmsP、赤）と（DMP2
（DR1/pdmsP、灰）の両株を、図の下に示す４条件でそれぞれ培養し、96 時間後にサンプリング
した菌体を用いて測定した結果である。それぞれ独立に３回の培養実験を行い、エラーバーは標
準偏差である。図中の a,b,c は、Bonferroni 法に基づく２要因分散分析のための多重比較によって、
それぞれの間に有意差（P < 0.05）が検出されたことを示す。
（B）は、DRP1（H26/pdmsRP、赤）
と（DRP2（DR1/pdmsRP、灰）を、（C）は、MGP1（H26/pmgdP、赤）と MGP2（DR1/pmgdP、
灰）をそれぞれ用い、同様の測定と分析を行った結果である。
55
図3-5．dmsEABCD 遺伝子プロモーターのDeletion実験。dmsEABCD 遺伝子プロモーターの塩基
配列を（A）に示した。pdmsP プラスミド中の300bp長のdmsEABCD 遺伝子プロモーター配列に
は、dmsR遺伝子の後半部分（168bp）が含まれている。TATAボックス（consensus：TTTWWW、
W = A or T）と考えられる配列は太字で示した。dmsE遺伝子の翻訳開始点から120 bp、90 bp、58bp
上流までの配列を用いたレポータープラスミド（pdmsP120、pdmsP90、pdmsP58）で、H26および
DR1をそれぞれ形質転換し、プロモーターアッセイを行った（B）。赤で示したのは、H26を形質
転換したDMP1（pdmsP）、DMP3（pdmsP120）、 DMP5（pdmsP90）、DMP7（pdmsP58）を、
DMSO呼吸条件で96時間培養した後サンプリングした菌体を用いた測定の平均値である。それぞ
れ独立に３回の培養実験を行い、エラーバーは標準偏差を示す。また灰色はDR1を用いた場合で
あり、DMP2（pdmsP）以外はBgaH活性は検出されなかった。
56
図3-6．H. volcaniiのDMSO呼吸をコントロールする遺伝子制御機構のモデル。詳細は本文を参照。
57
図 3-7. DmsR のアミノ酸配列の比較。Haloferax volcanii DmsR（HVO_B0361）の推定アミノ酸配列を、
Haloferax mediterranei（HFX_2205）
、Haloarcula sp. CBA1115（SG26_16955）
、Haloarcula hispanica N601
（ 1、HISP_09240 ）、Haloarcula hispanica ATCC 33960（2 、HAH_1811）、Haloarcula marismortui
（ rrnAC1217 ）、 Halobacterium salinarum （ OE2220F ）、 Halobacterium sp. NRC-1 （ VNG0826C ）、
Halomicrobium mukohataei（Hmuk_3266）
、Natronobacterium gregoryi（Natgr_2516）、および and Natrinema
sp. J7-2（NJ7G_4124）の相同タンパク質のものと比較した。保存されたシステイン残基を白抜きで、
その他の保存アミノ酸残基を星印で、HTH 型 DNA 結合モチーフを影で示した。図右側はアミノ酸番
号である。
58
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60
謝辞
本論文の作成にあたり、終始適切な助言を賜り、また丁寧に指導いただいた藤原健智先
生と吉松勝彦博士には深く感謝します。また石原顕紀先生からデータの統計処理についてご指導
をいただきました。大学院生、学部生の皆さんには有意義な議論と、多くのご指摘をいただきま
した。博士課程前期進学以前から現在にわたり温かく励ましてくださいました方々に対して深い
感謝の意を表して謝辞と致します。
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