生体分子固定化のための流動性ある自己組織化膜製造法

生体分子固定化のための
流動性ある自己組織化膜製造法
岐阜薬科大学薬物送達学大講座
薬品物理化学研究室
教授近藤伸一
1
高分子を基材とするバイオチップ開発の問題点
• 高分子基材の利点：焼却処分が可能
（ガラス基材では廃棄と取り扱いが問題）
• 高分子基材の問題点：
生体分子を固定化するための官能基がない
表面処理による官能基の導入
→ 経時的に脱離する
2
プラズマを利用した持続性ある親水性表面構築法
疎水性プラズマ架橋性高分子
VEMAの収着
O
O
O
CH2 CH CH CH
O CH3
アルゴンプラズマ照射
によるVEMAの固定化
n
VEMA
Maleic anhydride-methylvinylether
copolymer
加水分解
架橋反応
加水分解によるカルボ
キシル基の生成
HOOC
COOH
CH2 CH CH CH
持続性ある親水性の導入
O CH3
n
VEMAC
Maleic acide-methylvinylether
copolymer
3
プラズマ表面処理による生体分子の固定化法
O= O =O
CH2CH CH CH
OCH3
n
プラズマ
表面処理
プラズマ架橋反応に
よる高密度固定化
-特徴・持続性ある高分子の固定化が可能
→繰り返し利用可能
VEMAの収着
・様々な官能基を有する高分子の
固定化が可能
プラズマ架橋性
高分子基板
加水分解
→幅広い応用
抗体の固定化
酵素の固定化
高密度のカルボキシル基
による高活性表面の構築
アミド結合
H N
O =C
スペーサー
分子の導入
抗原結合部位
プロテインA
H N
O =C
抗体
プロテイン H N
Aの導入
O =C
抗体のFc
部位との
特異的結合
スペーサー
スペーサー
分子の固定化
N H
C=O
H N
O =C
抗体
H N
O =C
基板
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プラズマを利用したリン脂質自己組織化膜の構築
生体分子
タンパク質
リン脂質
バイオミメティックアプローチ
生体膜
リン脂質
LDPE シート
本研究のリン脂質自己組織化膜構築法の概要
PC
HMDA
カルボキシル基
( -COOH )
Hexamethylene
diamine
（ＨＭＤＡ）
ホスファチジ
ルコリン
（PC）懸濁液
縮合反応
LDPE-VEMAC
LDPE-HE
LDPE-PC-SA
5
リン脂質自己組織化膜の表面構造の特徴
LDPE-HE
CH2OCOR
CHOCOR
＋
N (CH3)3
CH2 O
O P O CH2 CH2
O
(PC)
1700cm-1
1077cm-1
Absorbance
LDPE-HE
（自己組織化前）
LDPE-PC-SA
LDPE-PC-SA
（自己組織化後）
1800 1600 1400
1200
1000
cm-1
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リン脂質自己組織化膜への脂肪酸の導入
１．リン脂質自己組織化膜へのス
テアリン酸（StA）の導入とそ
の膜安定性
LDPE-HE
CH3-(CH2)16-COOH
ステアリン酸 (StA)
２．StA含有リン脂質自己組織化膜
へのアルブミンの固定化
リン脂質自己組織化膜
へのステアリン酸の導入
LDPE-StA-PC-SA
CH2OCOR
CHOCOR
＋
N (CH3)3
CH2 O
O P O CH2 CH2
O
Phosphatidyl Choline (PC)
生体分子の固定化
LDPE-StA-PC-SA-Biomolecules
7
0.4
0.3
0.2
0.1
0
StA / PC
Ratio of eluted PC / %
Surface density of StA
/nmol/cm2
リン脂質自己組織化膜への脂肪酸の導入と膜安定性
100
80
60
40
20
0
0
10
2
4
6
8
Ratio of StA against PC.
Fig. Effect of the ratio of StA against PC
on the surface density of StA on
LDPE-StA-PC-SA.
PC concentration ; 1mM.
LDPE
LDPE-VEMAC
LDPE-HE
LDPE-StA-PC-SA
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Temperature / ℃
Fig. Plots of the elution ratio of PC adsorbed
on LDPE,LDPE-VEMAC and LDPE-HMDA
against temperature.
8
Surface density of immobilized Albumin
/nmol/cm2
StA含有リン脂質自己組織化膜表面へのAlbuminの固定化
0.008
FITC
FITC
0.007
0.006
0.005
LDPE-StA-PC-SAAlbumin
0.004
LDPE-StA-PC-SA-Albumin
LDPE-StA-PC-SAAlbumin-FITC
LDPE-StA-PC-SA
0
0
0.1
0.2
0.3
Surface density of StA
/nmol/cm2
Fig. Effect of surface density of StA on surface
density of immobilized Albumin.
Method ; Bradford method
Dye ; Coomassie Brilliant Blue G-250
Standard ; Albumin,Bovine
100 µm
100 µm
Fig. Confocal fluorescence microscopy of surface modified
LDPE conjugated with FITC-I.
FITC-I ; Fluorescein-4-isothiocyanate
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リン脂質自己組織化膜の膜流動性
FITC-I treated
Untreated
LDPE-StA-PC-SA-Albumin
0 min
After 10 min
After 1h
10
新技術の特徴
• 処理した高分子基材をリン脂質の懸濁溶液
に浸漬することにより、容易に自己組織化膜
が形成される。
• リン脂質自己組織化膜は熱安定性に優れて
いる。
• リン脂質自己組織化膜内に脂肪酸を導入す
ることにより酵素などの生体分子の固定化が
可能である。
• 流動性ある自己組織化膜が得られる。
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想定される用途
• リン脂質膜をインターフェイスに用いることによ
り酵素や抗体などのタンパクの固定化にとっ
て有効である。
• 本方法は流動性ある表面への固定化である
ため固定化された生体分子間の相互作用を
利用した新しいデバイスの開発が期待される。
・バイオチップ
・バイオセンサー
・バイオリアクター
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想定される業界
１）バイオチップ、ヘルスケアチップ産業
・疾病の早期発見のためのバイオチップ
・在宅医療のためのヘルスケアチップ
２）製薬企業
・創薬のためのバイオリアクター
・経皮吸収型DDS
３）環境関連業界
・有害物質等検出のためのバイオセンサー
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実用化に向けた課題
• 大量生産可能なプラズマ表面処理装置はす
でに市場にあるので、リン脂質自己組織化膜
を構築するうえでは問題はない。
• 高い活性を保った生体分子を固定化法に関
しては、さらに検討していく必要がある。
• 流動性ある膜上に固定化した生体分子間で
の相互作用の確認が必要である。
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企業への期待
• リン脂質自己組織化膜への生体分子の固定
化およびその評価の各段階での開発協力
• バイオチップ、バイオセンサーあるいはバイ
オリアクターを開発中の企業、または開発を
予定している企業には、本技術の導入が有
効と思われる。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称：リン脂質膜を有する高分子
基材及びその製造方法
• 出願番号：特願2008-192125
• 出願人
：岐阜市
• 発明者
：近藤伸一、笹井泰志、
葛谷昌之
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お問い合わせ先
岐阜薬科大学薬物送達学大講座
薬品物理化学研究室
教授近藤伸一
ＴＥＬ 058－237 － 3931（内線
ＦＡＸ 058－237 － 5979
e-mail skondo＠ gifu-pu.ac.jp
238）
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