当日配布資料（1.4MB）

ヒスタグ配列を認識し、発蛍光する
新規プローブの開発
名古屋市立大学大学院薬学研究科
○准教授梅澤直樹
鴨東美絵
教授樋口恒彦
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研究背景１：蛍光イメージングとは
蛍光イメージング：タンパク質の細胞内局在や機能を研究する
強力な手法
標的タンパク質の特異的な蛍光標識が必要
よく用いられるタンパク質の蛍光標識法
• 蛍光タンパク質の利用
• “タンパク質タグ”と蛍光性分子の利用
• “ペプチドタグ”と蛍光性分子の利用
• 非天然型蛍光性アミノ酸の導入
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研究背景２：蛍光タンパク質
蛍光タンパク質
標的タンパク質
Green Fluorescent Protein: GFP
遺伝子導入
生細胞
長所
短所
•自発的に蛍光団を形成するため、
ラベル化が簡便
•特異性が高い
•標的タンパク質への影響（構造、
機能、局在の変化）
•蛍光団に制限がある
より小さな分子を用いた選択的蛍光標識法が注目を集めている
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従来技術1: 受容体タンパクを用いる方法
タンパク質タグ（受容体タンパク質）
＋
蛍光性有機小分子（蛍光リガンドプローブ）
蛍光色素
リガンド
標的タンパク質
標的タンパク質
受容体タンパク質
高いリガンド認識能を有する受容体タンパク質をタグとして用い、
対応するリガンドに蛍光色素を連結したものを蛍光リガンドプロー
ブとして用いる手法
1) Farinas, J.; Verkman, A. S. J. Biol. Chem. 1999, 274, 7603-7606.
2) Marks, K. M.; Braun, P. D.; Nolan, G. P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 9982-9987.
3) Wu, M. M.; Llopis, J.; Adams, S.; McCaffery, J. M.; Kulomaa, M. S.; Machen, T. E.; Moore, H. P.; Tsien, R. Y. Chem. Biol.
2000, 7, 197-209.
4) Miller, L. W.; Cai, Y.; Sheetz, M. P.; Cornish, V. W. Nat. Methods 2005, 2, 255-257.
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従来技術２: 酵素活性を用いる方法
タンパク質タグ（自己修飾型酵素／被修飾ドメイン）
＋
蛍光性有機小分子（蛍光基質プローブ）
１）タンパク質タグ／蛍光基質プローブ
基質
標的タンパク質
蛍光色素
標的タンパク質
自己修飾型
酵素
Keppler, A.; Gendreizig, S.; Gronemeyer, T.; Pick, H.; Vogel, H.; Johnsson, K. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 86-89.
2）被修飾ドメインタグ／蛍光基質プローブ
標的タンパク質
被修飾
ドメイン
標的タンパク質
修飾酵素
George, N.; Pick, H.; Vogel, H.; Johnsson, N.; Johnsson, K. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 8896-8897.
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従来技術の総括とその問題点
・利点ー「合成蛍光色素を用いることができる」
・多様な励起波長、蛍光波長を持つ分子を選択可能
・機能性蛍光色素（環境応答性、pH感受性、等）の使用が可能
・酵素を用いる方法の場合、共有結合的にラベル化できる
・欠点ー「タグがタンパク質である」
「特異性」を獲得する上で、有効であるが・・・
・ある程度の大きさのタンパク質を融合する必要がある
・タグタンパク質が機能する環境下でのみ使用できる
ペプチドをタグとして用いる
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従来技術３：ペプチドタグを用いた報告例
1) Tetracysteine/biarsenal system
S
Pro Gly Cys
Cys
SH Cys
Cys SH
標的タンパク質
SH
SH
As
S
O
S
As
Pro Gly Cys
Cys
Cys
Cys
S
O
+
S
標的タンパク質
OH
As
S
O
S
As
O
OH
-2EDT
COOH
S
COOH
Griffin, B. A.; Adams, S. R.; Tsien, R. Y. Science 1998, 281, 269-272.
2) His-tag/nickel complex system
O
O
His
His
O Ni
O
N
O
標的タンパク質
O
His
His
標的タンパク質
His His His His
His His His His
O
O
O Ni
O
N
O
O
NH
O
+
N
S
O
O
Cl
N
O
NH
O
Cl
Cl
N
N
R
R
O
O
S
N
O
Cl
N
R = H, SO3H
Kapanidis, A. N.; Ebright, Y. W.; Ebright, R. H. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 12123-12125.
Guignet, E. G.; Hovius, R.; Vogel, H. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 440-444.
R
R
7
ペプチドタグを用いる従来法の問題点
ペプチドタグ＋蛍光性有機小分子
タグ
標的タンパク質
ペプチドタグと特
異的に結合する
蛍光性小分子
遺伝子導入
生細胞
長所
短所
• 標的タンパク質に与える影響が少ない
• 多様な蛍光団を選択できる
• タグとの結合前も蛍光を有する
• 細胞内のラベル化が困難
「ヒスタグと結合し発蛍光する分子」の開発
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新技術の特徴：発蛍光型プローブである
ペプチドタグ＋蛍光性有機小分子
タグ
標的タンパク質
無蛍光
タグ
遺伝子導入
発蛍光
生細胞
信頼性（S/N比）の高い検出法となる。
タンパク質の蛍光標識を、試薬を加えるだけで行える可能性がある。
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新技術のコンセプト
金属配位性の蛍光団を用いれば、発蛍光をコントロールできるのではないか？
“Intramolecular Fluorophore Displacement Strategy”
蛍光プローブ（消光状態）
His-tag
認識部位
配位子
金属イオン
蛍光団
His
His
標的タンパク質
His His His His
His
His
His His His His
標的タンパク質
１段階蛍光標識が可能。
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先行特許１：特願2006-053956
O
O
O
蛍光団
HN
リンカー
（n=1, 2, 3）
O
N
O
O
Co2+ O
O
O
コバルトーNTA錯体
（ヒスタグ認識部位）
クマリンを蛍光団として持つ発蛍光型プローブ
Kamoto, M.; Umezawa, N.; Kato, N.; Higuchi, T. Chem.-Eur. J. 2008, 14, 8004-12.
11
先行特許２：特願2006-053956
6000
蛍
光
強
度
4000
色素濃度： 5.0 µM
励起波長: 365 nm
蛍光波長: 455 nm
2000
0
0
5.0
10
15
20
His-His-His-His-His-His-Tyr-NH2 / µM
発蛍光型プローブの開発に成功したが、紫外光
励起が必要：細胞障害や自家蛍光が懸念される
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新技術の特徴
可視光励起可能：
励起光による細胞毒性が低く、自家蛍光の影響が少ない
蛍光団
COO
O
O
O
HN
リンカー
O
O
O
N
O Co2+
O
O
コバルトーNTA錯体
（ヒスタグ認識部位）
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新技術の特徴
蛍 4000
光
強
度 2000
0
色素濃度: 1.0 µM
励起波長: 490 nm
蛍光波長: 510 nm
0
1.0 2.0 3.0 4.0
モデルペプチド / µM
モデルペプチド: His-His-His-His-His-His-Tyr-NH2
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Fluorescence intensity (a. u.)
新技術の特徴
His6-Angiotensin I
Angiotensin I
条件:
[Co2+-NTAnF] = 1.0 µM,
50 mM Tris-Buffer (pH=7.4),
Ex. 490 (NTA1F), 500 nm (NTA2F),
Em. 510 nm
[Peptide] (µM)
His6-Angiotensin I: H-(His)6-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-NH2
Angiotensin I:
H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-OH
本プローブはHis tag選択的である。
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新技術の特徴：RNase Sの標識
Fluorescence intensity (a. u.)
+ His6-RNase S 2.0 µM
1.0 µM
0.5 µM
0.1 µM
0 µM
Wavelength (nm)
+ RNase S
1.5 µM
0.5 µM
0 µM
Wavelength (nm)
条件: [Co2+-NTA1F complex] = 0.5 µM, 50 mM Tris-Buffer (pH = 7.4), Ex. 490 nm
His tag導入タンパク質の添加により蛍光強度が増大
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従来技術とその問題点
既に実用化されているものには、Invitrogen
(Molecular Probe)社によるTC-FlAsH, TCReAsH等があるが、
プローブがヒ素を含むため、毒性が懸念さ
れる。
内在性チオールに起因するバックグラウン
ド蛍光が発生。
等の問題があり、広く利用されるまでには至っ
ていない。
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新技術の特徴・従来技術との比較
• 従来技術の問題点であった、ペプチドタグと
の結合に際し、「蛍光強度が変化しない」とい
う欠点を改良することに成功した。
• 従来の蛍光小分子を用いる蛍光標識法で
は、余剰の蛍光色素に由来するバックグラウ
ンド蛍光が問題であったが、新技術を用いる
ことで信頼性の高い（S/N比の高い）蛍光標
識が可能となる。
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想定される用途
• 本技術は、タンパク質の蛍光標識に適用する
ことで「発蛍光型」試薬が持つ高いS/N比とい
うメリットを生かすことが出来ると考えられる。
タンパク質の蛍光標識は、細胞内タンパク質
の挙動解析やタンパク質間相互作用の研究
において極めて重要である。
• 上記以外に、目的タンパク質の蛍光検出にも
幅広く効果が期待される。
19
想定される業界
• 想定されるユーザー
試薬会社
バイオベンチャー
製薬会社
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実用化に向けた課題
• 現在、His tag導入Rnase Sが蛍光標識可能な
ところまで検証済み。しかし、他のHis tag 導入
タンパク質を標識できるのかが未解決である。
• 今後、他のHis tag 導入タンパク質について実
験データを取得し、その一般性を検証する。一
般性に問題があるようであれば、（同様の原理
に基づいた）新規分子を開発する。
• 実用化に向けて、His tagとの結合強度を更に
向上できるよう技術を確立する必要もあり。
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企業への期待
• モデルタンパク質を用いた基礎検討及びイ
メージングは、大学所有設備で検討可能。
• 様々なHis tag導入タンパク質を有する企業と
の共同研究を希望。本技術の一般性の検討
を進めたい。
• また、蛍光試薬分野への展開を考えている
企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称：ペプチド又はタンパク質標識
用の蛍光色素
• 出願番号
：特願2008-208933
• 出願人
：名古屋市立大学
• 発明者
：梅澤直樹、鴨東美絵、
樋口恒彦
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お問い合わせ先
名古屋市立大学
産学官・地域連携推進センター
ＴＥＬ 052-853-8041
ＦＡＸ 052-841-0261
e-mail [email protected].ａｃ.ｊｐ
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