博士論文 (要約)

博士論文 (要約)
論文題目
新生糖タンパク質の品質管理を担うマレクチンの生化学的解析
(Functional analysis of malectin in the quality control of nascent glycoprotein)
氏名
武田晃
【序論】
膜タンパク質・分泌タンパク質の合成の場で
★
マレクチン
ある小胞体では、膨大な数の新生タンパク
質のフォールディング、正しくフォールドさ
'Ⅱ4
れたタンパク質を選別・輸送、ミスフォール
'Ⅰ4
0.(#,12#34
0.(5,6*)(2#4
?@'A0<=7BCAD7>BCADE&
':-8
-;<-8
正しくフォールディングされた4
タンパク質
'9-8
ドとなったタンパク質を分解することで
フォールディングサイクル
$%<84
F&D<7G
リボソーム
$%&
品質管理している。この機構は各々の
新生タンパク質に付加される N 型糖鎖
と、その糖鎖構造を認識する 10 種類程
'7-8
?H?-4
!"#
分解へ&
&&'()*+,
-=<->
()&
'()*+",
度の細胞内レクチンによって的確に行われて
!"#$%体へ輸送
ミスフォールドタンパク質
-.##+",
'(*/.*
レクチン
'ⅠIJ()*+"2K.",4Ⅰ4
'ⅡI4J()*+"2K.",4Ⅱ4
図:4タンパク質の小胞体品質管理機構とレクチン4
いる（図 1）。Oligosaccharyltransferase (OST)によって新生ポリペプチド鎖の Asn に付加された 14 糖
からなる Glc3Man9GlcNAc2（G3M9）糖鎖は、糖タンパク質のフォールディング状態に応じて糖が刈り取ら
れ、各々の糖鎖構造が品質管理における「タグ」の役割を果たす（図１）。近年、G2M9 糖鎖を認識する「マ
レクチン」が発見された。マレクチンのアミノ酸配列は生物種間で高度に保存されていることから、細胞内
で重要な役割を果たしていると考えられた。
これまで、マレクチンの機能に関して以下のことが明らかになっている。モデル糖タンパク質であるα1-ア
ンチトリプシン（AT）およびそのミスフォールド体 AT NullHong Kong (ATNHK) を用いた共免疫沈降の解析
から、ヒトのマレクチンは正常な構造の AT よりもミスフォールドな構造をもつ ATNHK と多く共沈し、細胞外
への分泌を抑制することが分かった。また、マレクチンに認識された ATNHK は分解機構へと誘導されること
が示唆されている(Chen.et.al.,2011)。本研究では、細胞内におけるマレクチンの機能をより深く理解する
ため、異なる 2 つの方法でマレクチン相互作用分子の網羅的な探索を行った。
【結果と考察】
1. マレクチンは oligosaccharyltransferase (OST) 複合体の構成分子である
分子として同定されている (Qin et.al., 2012)。マレクチンの新たな相互作
非還元!
)(*+,ゲル
---)
子の 1 つである ribophorin1 (Rpn1)がマレクチンと恒常的に相互作用する
*+
'"
,
)*
+
.マ '"
レ ,ク
チ
ン
これまで、Qin らによる質量分析を用いた解析から、OST 複合体の構成分
-./
用分子を明らかにするため、いくつかの改良を施した上で、改めて質量分
析による解析を行った。作製した HEK293-マレクチン発現細胞由来の免疫
'(#
沈降物を SDS-PAGE し、前処理をした上で質量分析したところ、Rpn1 の
(&#
他に OST 複合体の構成分子である ribophorin2 (Rpn2)、OST48 がマレク
$#
チンの相互作用分子として同定された。また、免疫沈降物を Nano-LC で分
&#
!①
"#
%%
◀!"#$%&'(マレクチン
離した後、質量分析したところ、Rpn1 に加え、OST 複合体の活性中心であ
'#
る STT3A が同定された。以上の結果から、マレクチンは OST 複合体と相互
作用することが示唆された。
②
!
!③
!④
!⑤
①②!"#$%&'%"#()!
③!"#$%&'%"#(*!
④+⑤!,-./0
図*!マレクチン1免疫沈降後の!
-2-13456!
2. OST 複合体と結合不能なマレクチン変異体を使った解析
マレクチンが OST 複合体と相互作用しミスフォールド糖タン
!"#$%&'
パク質の分泌抑制の機能に関わるか否かを調べるため、OST
図/012*0%345#$6と結合不能な変異体0
図!"#$%複合体と結合不能なマレクチン変異体
を作製した。C 末端に小胞体滞留シグナルペプチドを融合
した Mal-ΔTM-KDEL は OST 複合体の構成分子である
?8@;AB"AC
が必要であることが示唆された。そこで図 3 のような変異体
?8#D%"AC
!",-./0
べた。その結果、マレクチンと Rpn1 の結合に膜貫通領域
!"'()+
!"#$%&
レクチンの様々な部位欠損変異体を作製し、結合部位を調
7897:;
!"#$%&
#56
<=>?8@;AB"AC
!"'()*
Rpn1 とマレクチンの相互作用する部位を調べるため、マ
!",-./0
2-1) OST 複合体と結合不能なマレクチン変異体の作製
!"#()*!(+,-.
!"'()+
ン変異体を作製した。
!"'()*
複合体に結合不能でかつ小胞体に局在するようなマレクチ
!"#
!"#()*!
䕴"'()*"
䕴"'()+"
䕴"<FB"G鎖"
䕴",-./0"
34
22
/4
䕴"#56""
䕴"#56E.#897:;
12
Rpn1、Rpn2 および OST48 と相互作用せず（図 4）、また
蛍光免疫染色による顕微鏡観察の結果からマレクチン
図/"#568E.#897:;変異体は"
,-.複合体と相互作用しない"
（Mal）と同様に小胞体に局在することが分かった。Mal-ΔTM-KDEL は小胞体に局在し、かつ OST 複
合体に結合不能な変異体であることが示唆されたことから、次の解析に用いた。
2-2) Mal-ΔTM-KDEL は小胞体で AT NHK と結合する
共免疫沈降法による解析から Mal-ΔTM-KDEL もミスフォールド糖タンパク質 ATNHK と相互作用するこ
とが分かった（図 5-B）。さらにその免疫沈降産物を endo-β-N-glycosidase H (Endo-H) 処理したところ、
ATNHK の糖鎖は全て切断された。 Endo-H はハイマンノース型糖鎖を切断することから、Mal-Δ
TM-KDEL は Mal と同様に、小胞体内腔で ATNHK と結合することが示唆された。
2-3) Mal-ΔTM-KDEL 変異体は AT -NHK の分泌を抑制しない
Mal-ΔTM-KDEL が ATNHK の分泌抑制に関わるかを解析するため、 ATNHK と Mal または
Mal-ΔTM-KDEL を共発現させた後、細胞外に分泌された ATNHK 量をウエスタンブロッティングで調べた。
その結果、Mal は ATNHK の分泌を抑制するが、Mal-ΔTM-KDEL は分泌を抑制しないことが示され(図
5-C,D)、マレクチンと OST 複合体の結合は、マレクチンによるミスフォールドタンパク質の分泌抑制に重要
であることが示唆された。
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/,0 +,-.&
12
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12
3 /
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;<=>560
%"
䕴/4.560//
///?@A:B/
図&'()*+,(-.%/0変異体は!,12.の分泌を抑制しない'
!,12.および30!4タグを融合した()*、または()*+,(-.%/0を一過性発現条件で25*)細胞に共発
現させ、6789後に培養液を交換した後再び培養し、7:89後に培養液および細胞を回収した。細胞
は0;<=<した後、>-30!4抗体で免疫沈降し、>-!,抗体でウエスタンブロッティングした（#）。細胞外へ
分泌された!,12.は培養上清を>-!,抗体でウエスタンブロットし解析した?$"。?$"'の!,12.のバンドの
濃度を@5A<=BCD5B9;解析で比較した'?AEF"'?%"。>-!,抗体で解析した結果は非還元、>-30!4抗体お
よび>-G!HIA抗体の結果は還元条件で行った。'
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23
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12
3 /
378*9:
!"
400
400
300
300
# Cells
200
99.9
100
0.13
100
0
10
出されにくい、という欠点を有している。そこで、「細胞
0
10
1
2
10
10
FL1-H: FL1-Height
3
10
%&'()*$+,-"
100
0.027
0
4
100
101
102
103
FL1-H: FL1-Height
104
.$!/0"-12/3#4156-$$
$7ネガティブコントロール8
600
600
250
500
200
400
# Cells
99.8
96.9
0.24
3.11
150
46.1
100
200
200
# Cells
400
400
# Cells
内でのスクリーニング系」を用いてマレクチンと相互作
200
# Cells
溶化が必要、wash 等の操作により弱い相互作用が検
500
# Cells
免疫沈降法による相互作用分子の探索は、細胞の可
!"##$数
3. Protein-fragment complementation assay を利用したマレクチン相互作用分子の解析
53.9
用する分子を明らかにすることで、マレクチンに関する
新たな知見が得られるのではないかと考えた。本研究
0
0
10
0
10
1
FL3-H, SSC-H subset
1st before BW5147
Event Count: 13306
2
10
10
FL1-H: FL1-Height
3
10
4
4"?,:"$(2;$2,:;
10
10
1
FL3-H, SSC-H subset
1st after BW5147
Event Count: 15103
2
10
10
FL1-H: FL1-Height
3
10
4
39":$(2;$2,:;
1.21
98.8
100
0
0
300
200
50
0
10
0
10
1
FL3-H, SSC-H subset
2nd after BW5147
Event Count: 14892
2
10
10
FL1-H: FL1-Height
3
10
4
39":$<-=$2,:;
10
0
10
1
FL3-H, SSC-H subset
3rd after BW5147
Event Count: 17400
2
10
103
FL1-H: FL1-Height
104
39":$>:=$2,:;
.!/0"-12/@"AB</CD+E$#64:3:F$3-=$C"##$2,:G-H
0"-12 強度
では蛍光タンパク質を利用した、protein-fragment
complementation assay（PCA）を用いてマレクチン
図!"#$%を利用したマレクチン相互作用分子の探索"
&'()*+,'マレクチン発現細胞に、$'()*+,'-)./0'12&%ライブラリーを安定発現させ、
セルソーターを用いて蛍光陽性細胞集団を濃縮した。ソーティング前後の細胞群を
フローサイトメトリーで解析した。
の相互作用分子の探索を行った。
3-1) PCA によるマレクチン相互作用分子のスクリーニング
PCA は細胞内で 2 つのタンパク質の相互作用を解析する方法である。蛍光タンパク質の N 末端断片を
タンパク質 A に、C 末端断片をタンパク質 B に融合した形で細胞内に発現させ、A と B の相互作用を蛍
光タンパク質断片の近接による蛍光発光として検出する系である。改変 GFP である Venus の N 末端側の
フラグメントを融合した N-Venus-マレクチンを細胞に発現させた後、同細胞に C-Venus-HepG2 cDNA
library をウイルスべクターを用いて導入し、スクリーニングを行った。蛍光強度が上位の細胞集団をセル
ソーターで 3 回濃縮し（図 6）、得られた蛍光陽性細胞集団を限界希釈でクローン化した。フローサイトメトリ
ー解析で蛍光が陽性であったクローンの中から 20 クローンを選択し、コードされているライブラリー由来の
遺伝子を調べた。
3-2) PCA スクリーニング
表!"#$%スクリーニングによるマレクチン相互作用候補分子
の結果と検討
調べた 20 クローンから 11
種類の遺伝子がマレクチンの
相互作用分子の候補に挙が
った（表 1）。
実際に、蛍光を発することを
glycosilation site
Memo
localization
FK506BP
57
142
None
Chaperon
ER
コードされていた
クローン数
3
2
PDIA6
144
440
None
Chaperon
ER
1
3
ERP29
180
266
None
Chaperon
ER
1
4
calreticulin
375
417
1
Chaperon
ER
2
5
6
cathepsinZ
㼫Transferrin
226
330
303
698
2
3
Glycoprotein
Glycoprotein
Lysosome
Secreted
1
2
7
granulin 593
Secreted
1
Mac2-BP
585
5
7
Glycoprotein
8
273
405
Glycoprotein
Secreted
2
9
apolipoprotein E (APOE)
10 TAP BP variant2 (TAPASIN)
309
293
317
448
7
1
Glycoprotein
Secreted
Golgi or ER
1
11 integral membrane protein C2
160
267
1
Golgi 1
No Name
1
部分配列の長さ AA 全長 AA
1
確認するため、クローニングしたライブラリーの遺伝子を発現ベクターに挿入し、N-Venus-マレクチンと
HeLa 細胞で共発現させ PCA を行った。その結果、どの候補も蛍光が陽性となり、マレクチンと相互作用
することが示唆された。同定された候補分子は分子シャペロンまたは分泌糖タンパク質が割合として多く含
まれていた。なお、スクリーニングされた候補分子はタンパク質部分配列である。そこで、小胞体で機能す
る分子シャペロン PDIA6、 ERp29、 calreticulin、およびリガンドとして結合すると考えられた糖タンパク
質 Mac2BP、Transferrin について、全長配列をコードした C-Venus で PCA 解析した。その結果、いず
れの候補も有意に蛍光を示しマレクチンと相互作用することが示唆された。またこれらの分子は、糖認識ド
メインを欠損したマレクチン変異体を用いた解析から、N 型糖鎖依存的に相互作用することが示唆された。
さらに、糖鎖を有さない分子シャペロン PDIA6、 ERp29、および calreticulin は共免疫沈降法からもマ
レクチンと相互作用することが示された。以上の結果から、分泌糖タンパク質がリガンドとしてマレクチンと
相互作用すること、また分子シャペロンがマレクチンと相互作用し新生タンパク質のフォールディング促進
に関与する可能性が示唆された。
【結論・考察】
マレクチン安定発現細胞を使った免疫沈降および質量分析の解析から、マレクチンが OST 複合体と相
互作用することが見出された。また、マレクチン変異体を用いた解析から、マレクチンは OST 複合体と相
互作用することでミスフォールド糖タンパク質の分泌抑制し、分解経路へと誘導することが考えられた。一
方、PCA を利用した細胞内におけるスクリーニングから、免疫沈降法による探索からは検出されなかった
マレクチンのリガンドとなる分泌糖タンパク質、および新生タンパク質のフォールディングに関わる分子シャ
ペロンが同定された。新生タンパク質に付加された G3M9 糖鎖は、glucosidase I、glucosidase II により
G1M9 糖鎖へとトリミングされる過程で G2M9 糖鎖を経る。マレクチンが分泌糖タンパク質等の新生タンパ
ク質の G2M9 糖鎖をトラップすることで、PDIA6、ERp29 等の分子シャペロンによるフォールディングが促
されると考えられる。しかし、その中でフォールディングに失敗し疎水面を露出してミスフォールドとなった
新生タンパク質は、OST 複合体を入り口として分解経路へと誘導されることが予想される。

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