HT-M Diss. Nr. /\ 5274 ENDPRODUKT-HEMMUNG IN A R GININ DER PSEUDOMONAS - S YN THE SE AERUGINOSA CHARAKTERISIERUNG DER N-ACETYLGLUTAMAT-SYNTHETASE UND DER N-ACETYLGLUTAMAT-5-PHOSPHOTRANSFERASE ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften der EIDGENOESSISCHEN HOCHSCHULE dipl. geboren von Natw. 18. am TECHNISCHEN ZUERICH ETH September Rohrbach (Kt. Bern) Angenommen auf Antrag Prof. Prof. Dr. Dr. Th. R. Hütter, Leisinger, 1945 von Referent Korreferent 1973 Auszugsweise veröffentlicht EUROPEAN Springer-Verlag JOURNAL Berlin OF in: BIOCHEMISTRY Heidelberg , Band New York 31 102 - - ZUSAMMENFASSUNG Die ersten zwei Enzyme der Arginin-Synthese Pseudomonas von aeruginosa, N-Acetylglutamat-Synthetase und N-Acetylglutamat- 5-Phosphotransferase, Für den Nachweis der wurden charakterisiert. N-Acetylglutamat-Synthetase (Acetyl-CoA: L-Glutamat-N-Acetyltransferase, spezifischer und empfindlicher Chromatographie L-Glutamat und phosphat Das und N 2 Unter Test Hydroxylapatit ausgearbeitet. etwa achtfach Acetyl-CoA. L-Aspartat war -Acetyl-L-Ornithin fungierten pH-Optimum zweifachen an EC 2. 3. 1. 1) in vitro wurde ein des Enzyms lag um Endprodukt-Hemmung Standard-Testbedingungen 0, 2 mM L-Arginin, 9. durch Die Das Enzym, gereinigt, brauchte kein Substrat; Acetyl- nicht als Acyldonoren. Synthetase unterlag L-Arginin wurde eine 50 mit und %ige einer Polyamine. Inhibition durch 1, 5 mM Spermidin oder 15 mM Putrescin erreicht. Während ein Ueberschuss von L-Arginin zu einer vollständigen Hemmung führte, blieb auch bei hohen Polyaminkonzentrationen eine Restaktivität erhalten. das N Enzym 2 -Acetyl-L-ornithin, L-Ornithin und L-Citrullin inhibierten nicht. N-Acetylglutamat-5-Phosphotransferase (ATP: N-Acetyl-L-glutamat5-Phosphotransferase, Das EC 2. 7. 2. Reinigungsverfahren sulfat-Fällung G-150 und und bestand 8) aus Chromatographie Hydroxylapatit. Das wurde über 2000fach Hitzebehandlung, an Ammonium¬ DEAE -Cellulose, gereinigte Enzym war gereinigt. Sephadex nahezu homogen gemäss analytischer Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Das Moleku¬ largewicht 230 000 ergab des Enzyms wurde mit der Gelfiltrationsmethode auf geschätzt; Elektrophorese eine Bande mit einem tographie an Sephadex in Natriumdodecylsulfat-Gelen Molekulargewicht G-150 und von Zentrifugation 29 000. Chroma¬ in Saccharose- - Gradienten dass das zeigten, in verschiedenen 103 Enzym, je Aggregationsformen von N-Acetyl-L-glutamat betrug mit MgATP L-Arginin oder gewichten (minimal Die scheinbare Reaktion o_l_ Zn , Co Das . In Liganden, Gegenwart etwa 230 Molekulargewicht 000) gefunden. der Phosphotransferase2+ Enzym brauchte Mg Die Substratspezifität und geringerem in dieser , für Aktivität; Mn Enzyms Das wurden war Enzym sie teilweise Mg N-Carbamoyl- eng. phosphoryliert, jedoch dATP, nicht aber GTP und ITP, konnte hatte ein breites 6, 5 und 9. Die Inhibition durch L-Arginin oberhalb pH 9 war , N-Acetyl-L-glutamat; N-Propionyl-L-glutamat fast inaktiv als Substrat. ATP ersetzen. des 2+ 9+ konnten Reihenfolge, N-Formyl-L-glutamat Mass als 000; wurden Formen mit kleineren Molekular¬ 94- und Ca L-glutamat war -3 o«f ersetzen. in etwa 60 das nach Puffer und auftreten kann. Gleichgewichtskonstante 10 war - aufgehoben. Funktion der Substratkonzentration Die pH-Optimum war zwischen ausgeprägt pH-abhängig; Reaktionsgeschwindigkeit folgte in einer Michaelis-Menten- Kinetik, selbst bei niedriger Konzentration des zweiten Substrats. für Das scheinbare K etwa 3 mM. bare K Arginin für N-Acetyl-L-glutamat betrug Nach Präinkubation des N-Acetyl-L-glutamat wurden die für Kooperativität ein dreimal schwächerer Inhibitor als Argininosuccinat L-Arginin noch die Die stieg entdeckt wurde. L-Arginin; L-Ornithin, und dessen Vorläufer reprimierten weder die von 14 etwa dreimal stärker als war L- nicht. Synthetase in einem Minimalmedium. Arginin-Analogen wurde studiert. L- L-Citrullin Enzym Phosphotransferase von N-Acetyl-L-glutamat sigmoid, hemmten das und das schein¬ In Anwesenheit Polyamine Wirkung Enzyme mit ATP auf 7 mM. Sättigungs kurven während für ATP keine Enzyms mM, für ATP 2 und -Derivaten auf die zwei Als Inhibitor beider Enzyme war 0-(L-Norvalyl-5)-isoharnstoff L-Arginin und etwa 104 - zehnmal stärker als L-Argininhydroxamat übrigen geprüften Analogen einige waren Folglich indes schwache Inhibitoren scheinen sich die zwei Enzyme Eine Methode wurde entwickelt, im Nanomol-Bereich mit Hilfe werden kann. und hemmte keines die stellen für den Feedback-Inhibitor gewiesen - zu der in L-Indospicin. Von den Synthetase signifikant; Phosphotransferase. bezug auf ihre Bindungs- unterscheiden. nach welcher N-Acetyl-L-glutamat gereinigter Phosphotransferase nach¬ 105 - - SUMMARY The first two enzymes of arginine synthesis N-acetylglutamate synthetase and in Pseudomonas aeruginosa, N-acetylglutamate 5-phosphotransferase, characterized. were N-Acetylglutamate synthetase (acetyl-CoA: L-glutamate N-acetyltransferase, EC 2. 3. 1. 1) The enzyme, assay. on hydroxyapatite, was detected in vitro was The substrates. tase dependent 2 with 0.2 mM While excess an N of of the enzyme 5 mM L-arginine measured was trations. L-arginine, 1. even and and sensitive acetyl-CoA. -acetyl-L-ornithine was by arginine Under standard assay conditions 50 amines. activity and N pH optimum L-glutamate on to feedback inhibition subject was specific a purified approximately eightfold by chromatography Aspartate, acetylphosphate, as by a about 9. well as % inhibition spermidine, led to were or 2 -Acetyl-L-ornithine, L-ornithine, not used The synthe¬ as by poly- was obtained 15 mM putrescine. complete inhibition, in the presence of L- residual a high polyamine concen- and L-citrulline were not inhibitory. N-Acetylglutamate 5-phosphotransferase (ATP: N-acetyl-L-glutamate 5-phosphotransferase, near homogeneity phoresis. The as EC 2. 7. 2. 8) was over 2000-fold to judged by analytical Polyacrylamide gel purification procedure ammonium sulfate purified involved a electro¬ heat treatment, fractionation, and chromatography on DEAE- cellulose, Sephadex G-150, and hydroxyapatite. A molecular weight of approximately 230 000 in sodium dodecyl molecular weight sucrose occur sulfate was gels of 29 000. obtained gave single band Chromatography gradient centrifugation in different states of a by gel filtration. Electrophoresis on corresponding Sephadex on a G-150 and demonstrated that the enzyme aggregation depending to ligands can and 106 In the presence of buffer. about 230 was cular 000; with MgATP weight (minimum 10 was and Ca -3 2+ in this order, , specificity glutamate narrow: was were or L-arginine forms of were could 2+ dATP, a broad but neither GTP pH optimum dependent on for but at nor ITP, 2+ 9 no replace inhibition L-glutamate with ATP, and about 3 mM for ATP. the apparent In the presence of than became was no a phospho¬ of the enzyme increased to 7 mM. curves potent and L-arginine. L-Ornithine, L-argininosuccinate, markedly N-acetyl- for N- cooperativity three times less substrate. was The preincubation while , at low concentrations N-acetyl-L-glutamate sigmoidal, L-Citrulline After as mM for 2 was 2+ N-acetyl-L- observed. the rate-concentration L-arginine acetyl-L-glutamate tected for ATP. for K K Co The enzyme had ATP. even , N-formyl-L- and by L-arginine was reaction 2+ The substrate almost inactive Inhibition apparent The Zn , partially. transferase showed Michaelis-Menten kinetics, of the second substrate. 2+ lower rate than was could from 6, 5 to 9. pH. Above pH a Mn activity. N-carbamoyl-L-glutamate glutamate; N-propionyl-L-glutamate smaller mole¬ phosphotransferase replace Mg phosphorylated, weight found. constant for the required Mg The enzyme . 000) 60 apparent equilibrium The the molecular N-acetyl-L-glutamate an was de¬ inhibitor polyamines did not inhibit the enzyme. L-Arginine the and its precursors phosphotransferase The effect of 14 enzymes was was a neither the As studied. about three times more more L-indospicine. Of an synthetase nor minimal medium. arginine analogues and derivatives and about ten times or in repressed on the two inhibitor of both enzymes, effective than 0-(N-norvalyl-5-)-isourea effective than either the other L-arginine L-arginine hydroxamate analogues tested, none inhibited the - 107 synthetase significantly; however, the phosphotransferase. respect some were weak inhibitors of Thus the two enzymes to differ with seem to their allosteric sites. A method glutamate ferase. - was developed allowing in the nanomole range the determination of by means of N-acetyl-L- purified phosphotrans¬
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