紫 外 線 の 生 体影 響 と そ
in
vit110
の
評 価 法 に 関す る 研 究
2002
内野
年
正
目次
略号
-
緒言
-
ウ サ ギ 赤血 球 に 対 す るU
第Ⅰ章
第
第
V
光増 感 の 影 響
一
節
U V A 増 感 に よ る 溶血 反 応
節
U V A 増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生成
一
二
第四節
U V B 増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生成
次 元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル に 対 す る U
策
節
U V A 増 感 に よ る 細胞毒 性
節
UV A
第
一
二
J
＼マ
トポ ル
フィ
リ ン増 感
の影
響
2
40
-
｢
第
第
56
-
過 酸化 脂 質 そ
節
一
二節
の
単層培養細胞
もの
へ
3 次 元 培 養 紳胞
の
へ
の
培 養細 胞
の
へ
影響
の
影響
64
-
65
-
影響
1
総合考察
-
81
82
-
結語
謝辞
1
参考 文献
-
主論 文目 録
-
-
1
-
-
一
一
一
-
-
-
70
-
小括
-
63
-
第Ⅲ章
-
48
-
小括
一
4 ト
1
放出
-
39
増感 に よ る 過 酸 化 脂 質 生 成
U V A 増 感 に よ るP G E
第 三節
V A
9
33
-
-
3
-
25
-
小括
第Ⅱ 章
4
18
-
U V B 増感 に よる溶血反応
-
ベト
-
策 三節
2
83
84
85
92
-
-
-
-
-
-
-
略号
本論文 で 使 用 し た主 要 な 略 号 に つ
1
.
.
:
ultr a vi ol e t
2) U V B
:
3) U V C
:
A
(3 2 0
u ltr a vi o l e
トB
(2 8 0
utt r a vi o] e
t C
(-1 9 0
過 酸化 脂 質
.
l) P C
ph
:
3) P E
ph
:
5) S Q
q
: s
ph
:
RS
:
8) トB
s
u a] e n e
q
t b
:
-
n m
)
2 80
-
n m
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-
,
U VB
3) S t D
:
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-
thy 川
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2 2
:
:
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-
4 4
s u n s cre e n
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'
,
p
e n z o
2) C A T C
:
( ＋)
c at e c
-
3) H i s : hi s tidi n
4) M A
:
m
5) S O D :
6) S
o t:
7) V C
.
d h yd
u ty l a t e
b
:
hi
ro x
y t ol u
dib
f a cto
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n
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a n nit o】
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I
: a s c o r bi c
a cid
試薬
1) D M S O
:
di
m
eth
y[
ph
e n o n e
1
5
-
s ulf o ni c
a cid
p 一e A
r o t e cti o n
eth o xy
m
b
抗酸 化 剤
.
l) B H T
5
320
p h a ti d y [ e t h
-
A
2) S
4
)
紫外 線 吸収 剤
.
1) D D S
e
n m
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2 th i o b
O O H
u
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400
-
u al e n e
:
-
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-
過酸化物
､
h a ti d y l e t h
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6) S Q O O H
7) T B A
-
脂質
､
ph
:
4) P E O O H
-
p h a tid y[ c h oli n
o s
2) P C O O H
3
｡
紫外 線
l) U V A
2
記載 し た
いて
s ulf o xid e
-
2
-
r of
y[ m
UV A
eth a n e
(p
5%
-
m eth o x
)
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n n a m
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a cid
2
-
2) F A D
:
3) F M N
:
vin
:
5) lL
i n t e rl e
6) L D H
7) 8
:
e
M O P: 8
-
-
NPP
1 0) P 巨s
l l) P G E
1 2)
RF
6
.
p
:
P
:
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-
,
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-
(p
H
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7 4)
.
2
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r e c o n stit u t e
:
2) N H E K ( B ) :
3) S ki n
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そ の
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m
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他
-
:
re e
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1) C L H P L C
2) H E
al
n o r m
th
:
4) Vit r o =f
.
g
細胞
1) E P t S K[ N
7
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-
ro
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-
,
ph
2
h yd
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( 4 5 di m
:
h y ri n
eth o xy
m
-
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1 3) S D S
o rp
ki n
-
:
u c( e o tid e
o n o n u c l e o tid e
[ a cta t e d
8) M T T : 3
9) p
u
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4) H P
:
h
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3) S P F :
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3
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一
描
太 陽 か ら 放 射 さ れ る 紫外 線 は 波 長
(U
V A)
u lt r a vi ol e t
､
-
B
(2 8 0
に 分 類 さ れ る( Fi 9 1 )
つ
320
-
n m
_
ゝ
ー
_
. . . . . . . . .一
■.
一
_
F 了
も の か ら順 に u lt r a
の長 い
) ( U V B)
ult r a vi o l e t
､
-
C
viole
(1 9 0
-
トA
(3 2 0
280
n m
′
ヽ
′
∫
ヽ
ヽ
ヽ
′
ヽ
′
I
ヽ
ヽ
ヽ
′
ノ
ヽ
′
ヽ
■■
ヽ
∫
ヽ
l ■
ヽ
ヽ
ヽ
奄甑 e
s u
m
′
′
ヽ
ヽ
′
ノー
ヽ
ヽ
′
′
′
′
∫
′
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ヽ
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3
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2 9 0
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U
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V
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C
”V B
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0
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.
5 %
監題 V
5
】
rL g h t
-
4
-
6 %
A
m
4 00
) (U V C)
｡
.
-
m
n m
)
の3
この
うち
つ
い る
い る
影 響は 小 さ
メラ
1 2)
｡
8)
る通 り
ラ
､
より
方
リ
ン
､
プテ リ
ン
等
フィ
ヘ
の
の
1 3)
紅 斑( s
-
､
はU V B に 比
1 7 1 8)
皮膚 癌 の 誘 発
､
動物 や
の
い る
､
て
べ
u rn
の影
響
リ ン( H P ) 等 の ポ ル
の低下
1 4)
､
た
｡
っ
しわ
､
生体
しかし
､
1 5)
形成
の
の
ヘ
､
こ る こ とが 報 告 さ れ
評価 は 上 記
の
､
こ す こ と も報
の で
少 なか
べ
7)
誘発
の
の
動物愛護
､
､
報告 に も あ
の観点か ら
､
o
リ ン類
フ ィ
等 を起
が低 い
ー
等 が起
･
白 内障
､
￣
ネルギ
エ
ゼ活 性
ー
てい る
っ
￣
単 独 に よ る 活 性 酸素 生成
V A
吸収 極 大 を
に
n m
4 6)
) 形成
ヒ トを用 い て 主 に 行 わ れ て き た が
､
フィ
関与が注 目されて
b
免疫抑制
,
れ ま でU V A
こ
｡
60
1 0 1 3)
1 9)
免疫 抑制
､
ズ ム に 関 し て はU
プテ リ ン類
u n
1 9 2 0)
･
評 価 法 の 確 立 が急 務 と な
ニ
は2
いU V B
を 形 成 し て D N A 損傷 を 引 き 起 こ す こ と が
-
U V A 照 射 に よ り 細 胞 内カ タ ラ
トポ ル
へ マ
が高
U V A が地 表 に 到 達 す る 紫 外 線
､
生 体 影 響 に 関す る 報 告 はU V B に 比
､
が示 唆 さ れ て
そ の メカ
､
られ
沈着
2 1)
VA
れ ま でU
こ
1 6)
Vitr o
そ の 影 響 のI n
マ
他 に 皮膚 癌 の 誘発
､
､
ト等
ッ
r
一
方
.
光 老 化 と の 関連
ネル ギ
エ
ー
植物 プ ラ ン ク ト ン の 成 長 抑 制
､
一
ン 色素 の
ニ
U V A より
0
ビ リ ミ ジ ン ダイ
､
い と考 え
の研究 に
')
い る
この
-
強度 低 下
の
告されて
最近
は オ ゾ ン 層 に 吸収 さ れ 地 表 に は 届 か ず
D N A に 吸収 さ れ
知 られ て
毛髪
■U V C
以 上 を占めて
の9 0 %
も
､
リボ
､
外に
の
プ
コ
､
ビ ン( R F )
フ ラ
ロ
ポル
葉酸
､
､
N A D H 等 の 生 体 内光 増 感 物 質 を 介 し た 間接 作 用 の 生 体 影 響
､
いる
2 2 2 3)
も
,
の の
3
詳 細 は不 明 で あ る
､
1
0
0
2
｡
2
l一
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T y p
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レ
1
ら
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3
-
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k
･
･
･
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-
A
･
･
3
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･
-
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2
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2
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2
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.
-
5
-
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2
,
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1
d L C al) ; o
(g
g
st at e
S
e n;
di c al; O H
o
･
,
･
( s pi n
空,
光増 感 と は光が 基 質 に 直 接吸 収 さ れ る の で は なく
れ
そ の 後 吸 収 さ れ た光
､
主 として2
ネ ルギ
エ
経路 に 分類され
つ の
基質以外
､
2 2 2 4)
T yp
･
､
に 励 起 さ れ た 光 増 感 分子( S ) が 電 子 移 動や 水 素原 子 移 動 を 伴
ジカ ル( O H
パ
ー
･
ー
オキ シ ドア
良く な い が ス
この
､
に より
る
2 5)
オキ シ ドア
ー
よう に して発 生した o
ポル フ
･
こ とが報告
ィ
リ
､
生体影 響 に 関 して は
の
2
l T
yp
r
が生 成 す る
方
一
でo
い
発 生 を確 認 し
の
こ と を示唆
紫 外 線等
､
2
し た笠 ら の 報 告
2 7 29 )
￣
注 目さ れ て
い る
嘗滞 ら
｡
るホス フ ァ チ ジル
量 を 化学 発 光
-
H P LC
患者で は増 加 す る
ホス
､
を報 告 し て
た め酸化 さ れ や す く
高い
S Q は ヒ ト表 皮 の
こ とか
ら
､
3 1)
更 に河野 ら
イ ドロ
する
報告
ペ
3 0)
河野 ら
､
い る
が あ る が 過 酸化 脂 質 そ
の
も
の
は他
-
ゲ
､
の
ー
の の 細胞 毒 性 に つ い て
ペル
オ キ シ ド( トB
は
い
｡
いて
生体影 響
のi n
v It r o
の
生体 影 響 及 び そ
評 価法 に
ド( P C O O H )
ド( P E O O H ) に 着 目 した
単純 で メ カ
照射し
3 5 3 6)
･
､
､
ニ
ズム
フォ ス フ ァ
､
生体膜
｡
の 解 析が 行 い
溶血 率や P C O O H
基 礎 的検 討 を 行
っ
,
.
あ
含
1
べ
o
と の 反応 性 が
2
い る
o
モノハ
は加齢 に より 増 加
い
こ
れ ま で 水 溶性 で 膜脂 質 の
の メカ ニ
の
へ
モ
過 酸化 物
の
チ ジル
エ
ズ ム を 明 らか に し
の フ ォス フ ァ
夕ノ
-
ル アミ ン
デ ル と し て 良く 用 い られ
や す い ウサ ギ赤 血 球 を 用
PEO O H
い
含 量 等 を 指標 と し て U
た ( 第 Ⅰ 章)
0
-
6
-
･
､
､
VB
叫
が 大部 分
過酸 化 脂 質 の 影 響 に 関 し
つ い て 検 討 す る こ と を 目的 と し た
生体膜 の 主 要 な 構 成 成 分 で あ る リ ン 脂 質
ロ ペルオキ シ
で
老 人 性痴 呆 症
､
O O H ) を用 い た報 告
も ほ と ん ど報 告 が な
'
影 響 も最 近
主 要構 成 成分
の
33
u
指 標 と な る サイ トカ イ ン 放 出量
本研 究 で は U V A 及 び U V B
の
へ
約1 0 % を 占 め るS Q は
患者 あ る
の
｡
の
ー
｡
過酸化 物 の ス タ ワ レ ン
ま た 免 疫反 応
である
い
トで あ る と報 告 し て
ッ
ア トピ
フ ィ
ル ア ミ ン( P E) の 過 酸 化 物 の
ー
表 皮脂質 に 比
の
プロ ポル
ク ワ レ ン過 酸 化 物
ス
膜脂質
症 を発 症 す
ン
皮膚 に U V A を照 射 す る と過 酸 化 脂 質 が 生成 す る と の
ヒトの
｡
-
い
タノ
エ
夕
の
一
ル オ キ シ ド( S Q O O H ) 含 量 を測 定 し
して
リ
2
ウ ム ホ トダイ オ
マ ニ
癌 患 者 や 高脂 血 症 患 者
､
て 発生した o
不 明な点 も多
,
ま た ヒ ト の 表皮脂 質
｡
酸化 の 第
過酸 化 剤 で あ るt プチ ル ハ イ ド ロ
て
の
は C し H P L C 法 に よ り ヒ ト 皮膚 中 の S Q
こ と を 報告
3 2)
チ ジル
フ ァ
い る
二 重 結 合が 多 い
ゲル
しか
o
1
っ
て 生 成 し た過 酸 化 脂 質 の 生 体
っ
しH P L C ) 法 で 測 定 し
(C
こ と
等 がある もの
は健 常 人 の 血 紫及 び赤 血 球
リ ン( P C )
コ
.
フィ
1
2 6)
( F ig 2)
の ア ク ネ 菌が 産 生 す る コ
､
は効率 は
い
2 2)
Ⅱ)
e
更 に o 2発生量 に比例 して
､
酸 化 ス ト レス に よ
の
Typ
o r
光励起 によ
､
リシ と 表皮脂 質 の ス ク ワ レ ン( S Q ) の 混 合 物 に U V A を照 射 し
ド ア レイ を用
､
ヒ ドロ キシ ラ
､
Ⅱ) あ る
e
遺 伝 的障害 を も つ 患者 が ポ ル
また 表 皮 常 在 性 菌
､
､
Ⅱ 反応 は励 起 さ れ た 光増感分 子 が ま
e
オ ン( 0 2 ) が 生 成 す る( m i n
ニ
ン体生成の
され て おり
T yp
､
重 項 酸素( o 2)( m aj o
一
￣
1
ム
ヘ
パ
-
方
一
o
,
2
て 基 質 と 直 接 反応 し
っ
過 酸化水素( H 2 0 2)
I
1
結果
こ の
､
-
オ ン ラ ジ カ ル( 0
) を生 成 す る も の で あ る
ず0 2 と反 応 す る も の で
し
ニ
光 増 感 反応 は
.
I 反 応 は U V に より 基 底 状態 か ら 三 重項 状 態
e
3
最終 的 に ス
光 増 感物 質 に 吸収 さ
の
が基 質 に 伝 達 さ れ る 過 程 を 言 う
ー
o
そ の た め に まず
チジ ル
ハイ
そ れ に 基づ
､
コ
扱 い や すく
リ ンハ イ ド
ペ
ドロ
､
､
ルオキシ
系 が比 較 的
■
光 増 感 物質 存 在下U V A を
照 射時 と の 比 較を行
次に
皮 脂腺 より分泌され
,
酸化 物 の S Q O O H に 着 目 し た
用い
光 増 感物 質 で あ る へ
､
含量
SQ O O H
ヒ ト表 皮 の
､
タ
の
一
ー
ゲ
ト と さ れ るS Q
ッ
よ り 生 体 に 近 い 3 次 元 培 養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル( S k i n
｡
マ
酸化 の 第
トポ ル
フィ
リ ン( H P ) 存 在 下 U V A を照 射 し
プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン E 2 ( P G E 2 ) 放 出量 等 を 指標 と し
､
､
､
過
)を
細 胞毒性 や
生 体影 響
･
の
2T ”
の
評価を
3 7 3 8)
行っ た
,
0
38 )
更 に 各 種 抗酸化剤 や 紫 外 線 防 御 剤 の 影 響 を 検 討 し た
そ して
そ
､
-
及び そ
の[ n
の
'
v ]tr o
結 果 細胞 毒 性
評価 法 に
つ い
ン ゼ3 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ
カイ
した
放出 量
ン
39 )
｡
､
細 胞膜 中
へ
の
関与 が 明 ら か に な
て 検 討 を行
デ ル( V it r o lif e S
の
ま た 各 種 抗 酸 化剤
-
た
っ
たS Q O O H そ
っ
7
の
も
の の
生体影 響
を添 加 し
,
､
グ
細 胞 毒 性 や サイ ト
細 胞 の 形 態 学 的 変 化 等 を指 標 と し て 検 討
､
響 を 検 討 し た ( 第 Ⅲ 章)
-
a
正 常 ヒ ト表 皮 角 化 細 胞( N H E K ( B))
ki n) に S Q O O H
過 酸 化 脂質 含 量
の影
o
( 第 Ⅱ 章)
-
0
第Ⅰ章
ウ サ ギ赤 血 球 に 対 す る u V
-
8
-
一
光 増感 の 影 響
第 Ⅰ章
U V A
u v A は単独 で はエ ネルギ
た
｡
しか し
近年
､
､
8
-
っ
｡
こ
､
佐々 木 ら
い るが
､
,
､
そ
の
影響 につ
いて
はU V B 程 注 目 さ れ て
ロ
れ ら を介 し た 間接作 用 の 生体影 響
へ
ビン
の
は ウサ ギ保 存 血 に 光 増 感 物質 で あ る リ ボ
U V A 照 射後 に 溶 血 率 が 増 加 し
,
増感 に よ る 溶血 反応
が 低く
ラ ビ ン モ ノ ヌ ク レ オ チ ド( F M N )
か らR F F M N
節
-
4 0)
た
一
メ トキ シ ソ ラ レ ン( 8 M O P ) や グリ セ オ フ
質 が 知 られ る よ う に な り
よう に な
ー
第
ま た窒 素 置 換 下 で は 溶 血 率 の
FA D のU V A 照射 に よ
､
っ
等 の 光 増 感物
関与が注目 され る
フ ラ
ピ ン( R F) や
フ
ド( F A D ) を添 加 し
増 加 が 抑 制 さ れ た こ と等
,
1
っ
て 生成 す る o 2 が 溶 血 に 関 与 す る こ と を示 唆 し て
｡
本章 で は 生 体 膜 モ デ ル と し て 良 く用 い られ
感物 質 存在 下U V A を照 射 し
なか
い
フ ラ ビ ン ア デ ニ ン ジ ヌ ク レ オチ
､
､
詳 細 は 不 明な 点 が 多 い
40 )
､
扱 い やす い ウサ ギ 赤 血 球 を用 い
溶 血 率 を指 標 と し て 基礎 的 検 討 を行 っ た
-
9
-
｡
､
光増
実験材料 と 方 法
1 1 1
-
-
( 1) 動 物
ウ サ ギ ( 日 本 白 色 雄 性 ウサ ギ
L f=
:
体 重 約2
ふ 3 k g)
は 日 本 生 物 材料 セ ン タ
ー
より購入
o
( 2) 試 薬
マ ン ニ
ト
ル( M A ) 及 びN
ー
N
a
3
は 関 東化学 よ り 購 入 し た
o
R F は和 光 純 薬 より 購 入 した
.
3 5)
( 3) 溶 血試 験
ウ サ ギ 耳 静 脈 よ り 採 血 し た血 液 か ら 赤 血 球 を 常 法 に より 分 離 し て 0 8 5 % 塩 化 ナ トリ
.
ウ ム 含 有1 0
釈 した
｡
m
M リ ン 酸緩衝 液( p H 7 4) で 4 回 洗 浄 した 後
.
こ の0 2 %
.
試料 ピ ン に 入 れ
グル 商 事 ( 秩)
c m
､
赤 血 球 懸 濁 液2
室温下
の
倍 に希
l を外 径 3
c m
の
ー
-
,
一
｡
っ
た
｡
2
) は7 0 m W / c m ( u v チ ェ ッ カ : イ グル
照 射前 後 に7 4 0 n m に お け る 吸光度 を測 定 し そ
n m
ー
､
ー
.
､
照 射終 了 後 の 経 過 時 間
射終 了 直 後 に 溶 血 率 を測 定 し た 後
と に 溶血 率 を測 定 し た
m
で50 0
.
であ
を求 め た
等 張 緩衝 液
は H P あ る い はR F リ ン 酸緩衝 液4
平 均 照 射強度( 3 6 5
商事 ( 株) 製 に て 測 定)
の 減少 か ら 溶 血 率
一
この
( 3 5 0 3 8 0 n m m a x 3 6 5 n m ) を 紫 外 線 照 射装 置 ( イ
照 射 光 源 装 置) を用 い て
定 時 間 照 射 した なお 高 さ1 8
でU V A
製紫外線均
か ら照 射 し た 時
m
､
試 料 を室 温 あ る
｡
-
10
-
の
溶血
い
は0 ℃ で 暗 所 に放 置 し て1
へ
の影
響 を み る 際 はU
0
V A
照
分ご
結果
1 1 3
-
-
( 1) U V A 照射 時 間 及 び 増 感剤 の 濃 度 の 影 響
R F 6 0 いM を用 n た 時 の 照 射終 了直 後 の 溶 血 率 は 照 射時 間 が 4 0 分 間 ま で は0 % だ っ た
が
45
､
分 間 で は6 8 %
ほ ぼ同様 の
分 間 で は8 6 5 % と
60
､
結果 を 得 た
そ こ で 照 射 時 間 を4 5
.
1 0 LJ M
を用
分間 とし
R F 濃 度 を変化 さ せ た と こ ろ
､
リM ま で 変化 さ せ た と こ ろ
ラト
に 達 して 9 7 % の
-
そ
o
6 0 LJ M で 6 8 % に 達 し た
ころ
照 射時 間 を1
こで
2 いM
､
､
を照 射 し た と
い てU V A
0 0 % に達した
血率 が ほ ぼ1
佐
､
4 0)
木らの 報告
々
ま
5
は ほ ぼo %
で
溶 血 率 を示 し た( Fi g
1 5
､
ま で は0 % で 以
3 0 りM
､
｡
分 間照 射 時 で 照 射終 了直 後
分間 とし
.
ト1 1)
､
ぼプ
5 いM で ほ
-
.
o
-
･
-
-
cト
･
･
･
-
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U V A 増感 に よ る
1 0
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c o n c e mt r a昔
M P
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溶血 力 は H P
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･
･
これ
｡
)for1 5
e n
より
､
溶
H P 濃 度 を0 5 LJ M か ら1 0
､
以 降 は 急 激 に 増加 し
で
の
1 2 0
3e
と
｡
降 は急激 に 値 が 上 昇 し4 0 LJ M で 2 0 %
次 にH P
著 しく値 が 上 昇 し
､
以 降増 感剤 は H P を用
い
た
｡
( 2) 放置 時 間及 び 放 置 温 度 の 影響
H P 0 5 いM 存 在 下 U V A を1 5 分 間 照 射 し た 時 の
溶 血 率 は 照 射 終 了 直後 は0 % だ っ た が
.
室温 放置 す る と 溶 血 が 起
ト
分 ま で は 急激 に 上 昇 し
溶血 率 を示 した
に達 し て9 5 % の
ー
こり ∴3 0
これ に対
｡
し
置度 を0 ℃ に し て 同 様 に 実 験 を行 っ た場 合 は 放 置 5
血率 の 増 加 の 著 し い 抑 制 が 見 られ た( F ig I i 2)
-
放 置5 0 分 後 に は ほ ぼプ ラ
､
自 動 酸 化 反応 を 抑制す る た め に 放
､
分 後 で も 溶 血率 は2
0
以下と
0 %
､
溶
-
.
.
1 0 0
< ト
-
-
R T
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.
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n
･
･
濃度 を 変化 さ せ 室温 放 置 5 0 分後 の 溶 血 率 を測 定 し た と こ ろ
比例 し て 溶 血 率 が 上 昇 し
見られた( Fig
e
t
a
ト 1 3)
,
H P 無 添 加 で は5 % で あ
-
.
｡
-
12
-
っ
たが
､
､
H P の 濃度 に
0 5 LJ M で は1 0 0 % の
.
溶血 が
12 0
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十
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血率 を測 定 した と
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ト1 3
-
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存 在 下U
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照 射 時 間 を3
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.
-
n
･
.
1 4)
13
-
-
oly s I S
･
i rr a di a ti o
照 射 時 間 に 比例 し て 溶 血 率 が 上 昇 し
分間 以 上 の 照 射 で 1 0 0 % に 達 し た( Fi g I
e m
in I
m
分 間 ま で 変化 さ せ
0
h
o n
.
､
､
1 5
室温 放 置5 0 分 後 の 溶
分 間 照射 で9 8 %
､
12 0
-
o
･
-
-
H P O 5 = M
-
.
10 0
恥
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ト1 4
-
.
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.
.
( 3) 抗酸化 剤 の 影 響
1
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ンチ ャ
エ
であ るM A
で あるN
ー
生 体 内 抗酸 化 剤
､
N
a
と ヒ ス チ ジ ン( H i s)
3
O H ラジカ ル の ス カ ベ ン ジャ
ビ ン 酸( V C ) の H P
の アス コ ル
響を 検討 し た
まずH P 5 ‖M 存 在 下 U V A を1
､
のU V A
増感 によ る溶血
ー
影
の
へ
｡
N
N 31
a
5
分 間 照 射時 の 照 射終 了直 後 の 溶血 率 を測 定 し た と
M で は9 6 % の 溶 血 率 を 示 し 全 く 阻 害 が 見 ら れ な か
m
同様 に 実験 を 行 っ た そ の 結 果 N a N 3 5 0
m M で9 2 % と 非 常 に 強 い 抑 制 が 見 ら れ た
m
｡
溶 血が抑 制 さ れ た
ト1)
-
T
o
は5
M A で
､
0
｡
た の で 濃 度 を増 加 さ せ て
M で は約5 0 % の
阻 害 が 見 られ
ま たV C で は1
m
0
M で9 6 % と
M で も 全 く 阻害 は 見 られ な か
m
､
H i s で は1 0
､
ほ
､
た
っ
.
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一
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H P
10
M で9 7 % と
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M で は5 5 %
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､
･
.
5
分 照 射 時 の 室 温 放 置 5 0 分後 の 溶 血 率 を 測定 した と こ
m
M で は8 1 % と 強 い 阻 害 が 見 られ
､
ま たV C で は1 0
方 His で は
存 在下 と 同様 に ほ ぼ完 全 に 溶 血 が 抑制 さ れ た
弱 い 阻 害 しか 見 られ ず M A 5 0 m M で は8 1 % と 強 い 阻害 が見 られ
5 H M H P
と
n
一
o
､
､
存在 下 と 異 な る 結 果 が 得 られ た( T a bl e ･Ⅰ
-
1 5
-
-
1 2)
-
.
､
､
T
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-
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.
-
16
-
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of
i r r a di a ti o
n
･
of
O 5
･
u V A
･
考察
1 1 3
･
-
■
40 )
は ウサ ギ 保 存 血 を 用
佐々木 ら
い
R F 濃 度 を5 6 0 いM と 変 化 さ せ た 時 の U V A
(3 5 0
-
､
-
) 照 射 終 了直 後 の 溶 血 率 は 3 0 分 間以 内 の 照 射 で は 0 % だ っ た が 6 0 分 間 照射 時
約9 5 %
は3 0 p M 1 2 0 分 間照 射時 で は2 0 いM で ほ ぼ プ ラ ト に 達 し そ れ ぞ れ 約8 0 %
これ に対 し
H P は5 = M H P 存 在 下 わ ず か1 5 分 間 照 射時 で
であ っ た と 報告 し て い る
38 0
n m
､
ー
｡
H P の3 6 5
.
40 )
存在 下 U V A を 照 射 し
I O いM
対 照 で は差 が 見 られ な か
､
照射終 了 直後 よ り 高 く な
係を 検討 した
o ℃ 放置 時 で
.
の 損傷が 必 要 で
ト1 1
s
パ
結論して
い る
が起 こ ら ず
いるが
いる
方
一
そ
｡
､
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の
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1
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､
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1
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2
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い こ
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らか
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はない か と思われる
で
フ ラ ン で 抑 制さ れ
とから
1
､
o
い
ー
いる と
M A で は 阻害
､
2
｡
M A やス
､
が 関与し て
2
を 用 い て 同 様 の 実験 を 行
関 与 を認 め て
の
害 が 認 め られ な い ど こ ろ か 溶 血 を 促 進 す る と 報 告 し て
O H ラ ジカ ル 及 び o
影響 を 検 討 した
2
のス
カ
ベ ンジ ャ
で あるV C のH P
-
-
｡
H i s で 阻 害 が 見 られ
,
3
M A で は 阻 害 は見 ら れ
､
j o r T y p e Ⅱ の 光 増感 反 応 に よ
m a
っ
たも
の と 思 わ れ る( T
リ ン 類 存 在 下 皮 脂 に ∪V A を照 射 し
.
a
っ
わ れ る( T
N
3
た
a
実 験 で はN
2
の
ら
こ とか
bl e ト 1 2)
､
-
.
a
N
3
の
い る
.
1
o
,
2
b le
a
て 生 成し
っ
ト 1 1)
-
.
発生 を ゲ ル
の
こ の こ とも上
隻
マ ニ
ウ
こ と を支 持
記の
し
関 与が 明 ち か と な
っ
しかし
い る必
た
｡
他 に M A で も 阻害が見 ら れ
H i s で は あま
､
自 動 酸 化 反 応 に よ る 損傷 の 増 大 も 溶 血 に 関 与 し て
この
で は 阻 害 が 見 られ こ と か ら
最初 に あ る 程 度 の 損傷 が 生 じ て
にo
N
a
1
M A
,
H P 存在下の
o 5 H M
また N
する o
定量以上
一
｡
い るもの と思
､
ら溶 血 に は あ る
溶 血 に至
､
ド ア レイ に よ り 直 接確 認 して
り 阻害が 見 られ な か
らず
､
H P 増 感時 に は 照 射終 了 直後 に ほ
いM
で あ る H i s で は抑 制 さ れ た こ と か ら o
M で は阻
ポル フ
ム フ ォ ト ダイ オ
一
ま た5
て 生 じ た 損傷 に よ り 溶 血 が 起 こ
はH P な ど の
て いる
そ こ で 照射終 了後 の 時 間 経 過 と 溶 血 の 関
1
ー
､
42 )
｡
溶血 率 を
の
添 加 群 で は 照射 終 了 か ら5 時 間 後 の 方 が
こ の こ とか
｡
､
っ
る
､
まず5 L J M H P 存 在 下 の 実験 で は N a N
こ の 場 合 は 主 と して
なか っ た こ とか ら
た o2 によ
RF
量 に達し
もR F
木ら
々
エ ンチ ャ
a
1
､
照 射終 了 直 後 及 び5 時 間後
､
ゼ( S O D ) で 阻 害 さ れ な
ク
増感 に よ る 溶 血
UVA
らず
-
,
の
2
N
､
な原 因 で
.
ま た佐
.
1
こ の こ とが 主
､
っ
0 5 LJ M H P 存 在 下 で は 照 射 終 了直 後 に はそ の 量 に 達 し て い な い が
､
オキ シ ド デ イ ス ム タ
ー
こ
は R F 光 増感 に よ る 溶 血 はN
ki ら
u z u
べ て い
ト 1 2)
-
.
そ の 後時 間 と 共 に 増 幅 さ れ て そ
41 )
たが
っ
たと述
っ
は ほ と ん ど溶 血 が 起
溶 血 し た( F ig
0 %
ぼ1 0
約8 倍 で あり ･
ことが明らか とな
H P 増 感 時 に は 室温 放置 時 は3 0 分 後 に9 0 % 以 上 溶 血 し た が
0 5 LI M
.
倍 以 上 増感 力が 強 い
｡
はRF
佐々 木 ら
H P は R F よ り1 0
､
に 掛 ナる モ ル 吸 光 係数 は R F の
n m
ある と思 わ れ る
測定 し
､
溶血 率 を示 し
ほぼ1 0 0 % の
た
､
,
,
V C
場 合 で もU
U V A 照射 に よ
､
要が あ る と思 わ れ る
は ラ ジカ ル ス カ
非照 射時 で は溶血 が 起 こ
V A
｡
1
っ
て 生 成し た o
い
ベ ンジャ
ずれ にせ よ
ー
と して
の
消去 作 用 等 も 持 つ た め い ず れ の 場合 も 強 い 抑 制 を 示 し た と 思 わ れ る
-
1 7
-
｡
､
2
によ
っ
て
溶血 に 対
働 き の ほ か･
第 Ⅰ章
第二節
U V 如曽感 に よ る 過 酸化 脂 質 生 成
u v A は 単独 で は エ ネ ル ギ
た
｡
しか し
､
近年
ー
が低く
そ
､
の 影響 に つ い て
はU V B 程 注 目 さ れ て
8 メ トキ シ ソ ラ レ ン( 8 M O P) や グリ セ オ フ
-
､
-
ロ
ビン
40 )
い
なか
っ
等 の 光 増 感物
質 が知 られ る よ う に な り こ れ ら を 介 し た 間 接 作用 の 生 体 影 響 へ の 関 与 が 注 目 さ れ る
2 7 2 9)
は 健 常 人 の 血 祭 及 び 赤 血 球 の 膜 脂 質 の 主 要 構 成成 分 で あ る
よう に な っ た 宵 滞 ら
､
-
｡
フォ ス フ ァ
チジル
リ ン( P C )
コ
フ ォス フ ァ
､
チジル
エ
タノ
ー
ル ア ミ ン( P E) の 過 酸化 物 の
含 量 を 化 学発 光 H P L C ( C し H P L C ) 法 で 測 定 し 癌 患 者 や 高 脂 血 症 患 者 老 人 性痴 呆
40
ま た佐 々 木 ら ) は ウサ ギ 保 存 血 に リ ボ フ ラ
症患 者 で は 増 加 す る こ と を 報 告 し て い る
-
､
､
｡
ビ ン( R F) を 添 加 し
U V A 照 射後 に 2 thi o b a rbit u ri c
-
､
値 が上昇 す る 傾 向 が見 ら れ る
カ ニ ズム に 関 し て は
よ る 過 酸化脂 質
の
､
こ と を 報告
過 酸化 脂質
測 定 は行
っ
の
して
い る
a cid
｡
r e a c ti v e
これ
関与 が 示 唆さ れ る が
て お らず
､
らの
s u
b sta
こ とか
ら
n c e s
々
木 らは C し H
詳細 は 不 明 な 点 が多
い
｡
1
著者 ら は 前節 で ∪V A 増感 に よ る 溶 血 に o 2 及 び 自動酸化 反 応 が 関与 し
以上 の 損傷 が必 要 で あ る
め に前節 と 同 じ ウサ
の 過酸化物 で
ファ
チジ ル
エ
との 相 関 に つ
ある
タノ
こ
と を示 し た
ギ 赤 血 球 を用
フ ォ ス フ ァチ
-
い
ジル
､
コ
ル アミ ンハ イ ドロ
い て検討
を行
っ
た
｡
本節で は こ の 損 傷 に つ
いて
ペ
ハイ
ドロ
ペ
､
P LC
ある
一
の メ
法に
定量
詳 細 に検 討 す る た
光 増 感 物質 存 在 下 ∪V A を照 射 し
リン
-
間 接作 用
､
佐
､
( T B A R S)
､
赤 血 球膜 脂 質
ル オ キ シ ド( P C O O H )
､
フ ォス
ル オ キ シ ド( P E O O H) 含 量 等 を指 標 と し て 溶 血
｡
-
1 8
-
実験材 料 と 方法
1 2 1
_
-
(1) 動物
ウ サギ は 前 節 と 同 じ も の を 用 い た
｡
(2) 試薬
pc o o H
(3) P C O O H
pc o o H
pco o H
フ
P E O O H 及びP C
分析条件 を Fi g
P LC の
4 3)
P E は宵滞 らのC しH P L C 法
,
｡
PE の定量
,
ル を 内標 と し て 定 量 を行
ー
図及 びH
P E O O H 及 びP C
,
,
標 品 は 東北大 学農学部宵 滞 教授 よ り 譲 り 受 け た
P E O O H は 化学発光 検 出器 で
,
ノ
ェ
PEO OH の
,
た
っ
また
､
PC
､
に準 じ て 定 量 を行
P E は2 1 0
,
吸 収で/てラ
の
n m
た
っ
ニ
今 回使 用 したH P L C 装置 の シ ス テ ム ブ
.
ト2 1 に 示 す
｡
トロ
ロ ッ
ク
-
.
｡
S
Pl
”
C
P2
C L
W
a
A
Fi g
ph
ト
.
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2 1
-
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D et e c t o r ( U
c o n
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P 2) : P I S hi m
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C L) : U S hi
a
,
( C ) : H ib
M o bil e p h
L u min
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C L H P LC
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( A) : h
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P 2 S hi m
-
,
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･
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-
m
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2
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LC 8A
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･
6
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-
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a
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-
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-
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･
.
( 9 : 2 7 ‥4 : 5
( B) : 1 0 u g/ m l c yt o c h r o m e c a n d
50 m M b o r a t e b u ff e r ( H 8 B O
K C し N a C O 3 .P H 1 0) (fl o
S a m pl e s o l u ti o n ( S ) : 1 0 LJl R e c o r d e r ( R )
W a t e r ci r c ul a t o r ( W : S C I M C S C H 2 0 1
)
e s c e nt r e a
o m
,
LC 10A
o r
-
C LD 11 0
(2 5 0 X 4
a n o
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2
,
-
19
-
2 ug/
w
,
m
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v/ v
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,
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u m
1 1
.
w
r at e
i n ol i n
m
l/ m i n)
1 0
1
m
]/
m
i h)
P E O O H の 定量
(4) ウ サギ 赤 血 球中
前節 と 同 様 の 方 法 で 調 製 し た2 0 % ウ サ ギ 赤血 球 懸 濁 液 2 m は 0 8 5 % 塩 化 ナ トリ ウ ム
含有1 0 m M リ ン 酸緩 衝液( p H 7 4) に へ マ ト ポ ル フ ィ リ ン( H P ) 5 0 H M を加 え た 溶液4 m I
を外径3 c m の 試 料 ビ ン に 入 れ 室 温 下 で U V A ( 3 5 0 J 8 0 n m ) を1 5 分 間 照 射 し 照 射終
のP C O O H
･
･
1
､
､
了後室 温 あ る い は0 ℃ で 最高3 0 分 間 放 置 した 放 置 後6 m l の 冷 ク ロ ロ ホ ル ム / 2 プ ロ
パノ ル( 1 :1 v/ v ; 抗 酸化 剤 と し て 1 0 p p m の プ チ ル ヒ ド ロ キ シ ト ル エ ン( B H T) を 含 む)
-
｡
-
,
を加 え
こ れ を遠心 し て
､
度操作 し
ロ
-
タリ
ロ ロ
ホ ル ム 層 ( 総 脂 質 画 分)
を集 め た
集 め た 総脂 質 画 分 を 無 水硫酸 ナ トリ ウ ム で 脱水 し た 後
,
エバ
-
ボレ
ー
タ
内標 と し て1
v/ v ;
ル(1 :1
,
をC L
H P L C で 定量
.
-
得 たク
した
-
で 濃縮 乾 固 し た
0 0 u g/
m
lのパ ラ
こ
o
トロ
ニ
｡
-
20
-
れ に1 0 0 L J[ の ク
フ
ェ
ノ
ー
､
ロ ロ
ル を 含 む)
ク
o
同様 に も う
ロロ
ホ ル ム層 を
ホル ム/ メタ ノ
を加 え
､
一
ー
こ の1 0 い
l
結果
1 2 2
･
.
E O O H 及 びP C P E の 定 量
(1) P C O O H P
ま ずP C O O H P E O O H 及 び P C P 巨 の 標 品 の ク ロ
,
,
ト グ ラ ム をFi 9
マ
,
,
ト2 2 に 示 す
-
･
o
A
P C
A
≡
⊂
0
PE
-
T
N
ヽ
-
■′
(=
0
a
ー
(⊃
∽
亡)
.
<
ち
嘗
S
1
P
>
J
C O O H
ヽ
一
∽
t=
q)
∼
C
くD
O
( =
也)
室喜
P E O O H
.
-
童i
0
Fi g
ト2 2
Ch
･
.
ro m a 紬gra m
h y d r op
e r o xi d e
(P C O O M
,
h y d r op
e r o xi d e
(P E O O ‖
,
ず
o
a
m
200
p
20 0
p
5
10
i xt
u re
m
m
[) ,
o
o
15
ず ph
o
ph
o s
ph
I) ,
M in
ph
o s
ph
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M yl c h
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o
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C ,1 3 4
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,
'
ph
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h a tid y B e t h
w it h
UV
n m
)
d e t e c ti o
c o n diti o n s
ト2
e
(P E
-
2A
n
are
がU V 検 出津
.
(B) C h
gi v
､
,
あっ た
o
1 6 0
叫
n m
.
方
ム はそれ ぞ れ
､
､
=
e m
i n Fi g
e n
Fi g I
-
.
検出 掛 こ は P C P E が 険 出 さ れ
一
,
a n
d
p
n
iモr
o
ph
e n o
川S
1
,
p
-
Th e H PL C
.
盲n
C L H PL C
( A) U V ( 2 1 0
Fig
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･
､
2
-
u m
.
2B
in
ト2
e s c e n c e
-
.
分
､
9 6
.
n
･
1
が 化 学発 光 検 出器 の ク
リテ ンシ
化学発 光検 出器 に はP C O O H
14 0
d e t e c ti o
P E O O H が 検 出さ れ
,
れた
｡
21
ン タイ ム は そ れ ぞ れ
ョ
分 と 嘗 滞 ら の 報告
-
ロ マ
-
43 )
と は逆 に
､
､
トグラ ム で あ る が
､
12 6
.
分
リテ ンシ
PE O O H の
8 7
､
･
ョ
分で
ン タイ
方が 先 に検 出 さ
のPC O O H
P EO O H の
定量
( 2) ウ サ ギ 赤 血 球中
次 に0 2 % ウサ ギ赤 血 球 懸 濁 液 を用 い て P C O O H P E O O H 含 量 を測 定 し よう と 試 み た
が い ずれ も 検 出 限界 以 下 で あ っ た の で 2 0 % ウサ ギ赤 血 球 懸 濁 液 を用 い て 測 定 を行 っ
,
l
,
.
､
た
U V A を 照射 し な い も の (
o
pc o o H
,
P E O O H 及 びP C
,
ン トロ
コ
ル)
ー
の
ク
トグ ラ ム をFi g I
ロ マ
-
.
P E は そ れぞ れ 標 品 と の 比 較 に よ
2 3 に示す
-
て 同 定 及 び定 量 を行
っ
っ
｡
た
｡
∼
.
≡
(=
⊂)
q
-
r
N
ヽ
ヽ
-
′
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(
a
ー
S
⊃
(
∽
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く
く
ー
J
0
普
↓
P E
P c丘
>
ヽ
〃)
t =
q)
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Q)
U
【=
q)
Q
∽
q)
∼
P C O O H
O
⊂
普
'
g
と↓
コ
E
q)
｡ E ｡ ｡ H
J =
(J
5
0
F ig I
･
･
h yd r o p
2 3
Ch
･
e r o xi d e
( P E O O H)
a nd
p
-
UV
,
n jt r o
t o t a ) ‖p j d
(A)
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(2 1 0
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ph
ph
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1
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.
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ph
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10
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ph
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d
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ti d y l c h
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p h a ti d y l e t h
th
e
･
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i n Fi g
･
mi n e s c e n c e
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-
-
1
22
･
-
d e t e cti o
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.
‖n
r o
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C L ‖P L C
b b it
Ch
o
o
f
i
n e
( P E)
e ry t h r o c
yt e
s
1 5
し 照 射終 了 後 の 放 置 時 間 と 放 置 温 度 の
更 に2 o % 赤血 球 に U V A を 分 間 照 射
へ の 影 響 を検 討 し た
P E O O H の 方 が P C O O H よ り 約3 5 倍含 量
pc o o H P E O O H 含量
､
o
･
,
ル に 比 べ て 有 意 な 増加 P E O O H
照 射 終 了 直後 に は P C O O H は コ ン ト ロ
は増加 傾向 が 見 られ た 室 温 放 置 し た 場 合 は P C O O H は 経 時 的 に 減 少 す る 傾 向 が 見 ら
が高か
た
っ
ー
､
.
｡
分後 に は コ ン ト ロ ル レ ベ ル に 回 復 し た ま た P E O O H は2
コ ン トロ
ル レ ベ ル ま で 減少 し た
加 が見 ら れ た が 3 0 分後 に は
20
れ
-
o
分 後 まで 有意 な 増
0
ー
pc o o H
なお
分後 に コ ン ト ロ
P E O O H と も1 0
,
照射後 の P C
､
有意 に 減少 し て
一
o
､
た (デ
い
含 量 は 放 置 時 間 や 放 置 温 度 に よ らず
PE の
,
タ は示 し て
ー
い
方
い)
な
コ
､
放置 時
0 ℃
､
ル レ ベ ル に ま で 減少 し た( F ig
ー
･
ント
ト2
ロ
-
4)
o
ル より
-
o
∼
uj
h
4 0
R
o
･
a
＋
PC O OH
(R T )
∼
PEO O H
(R T )
PC O OH
( 0 ℃)
PE O O H
( 0 ℃)
.
.
.
ロI
長3 0
-
-
個ト
一
ー
ー
-
0
.
.
≡
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･
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ph
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ず
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3 0
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m
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･
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1
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,
O
･
0 01
,
1
･
考察
1 2 3
-
.
照射前後 の P C O O H
に増加 し
P C O O H で は照射終了直後
､
分後
p c o o H で は2 0
I
2 4)
P E O O H で は3 0
,
.
した こ と か ら
は 照 射 終 了2
分後 に は コ ン ト ロ
分後 に ピ
0
また
o
､
ル レ ベ ル ま で 減少 し た( Fi g
ー
方がP C O O H より 多く
PE O O H の
､
ク に達 し
ー
･
9 0 % 以 上 が 溶血
､
U V A 照 射 に よ る 脂 質 ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド量 の 増 大 に よ
､
た も の と思 わ れ る
こっ
P E O O H で
､
室 温 放 置 時 で は 照 射後 に 有意
､
室 温放置 時 に は放置3 0 分後 ま で に 溶血 率が急 激 に 上 昇 し
-
-
含 量 を測 定 し た と こ ろ
PEO O H
･
溶血 が 起
て
っ
P C O O H の 量が ピ
､
ー
ク に達 す る 照 射 終 了 直後 に は 溶 血 が 起 こ らな い こ と か ら P E O O H が 主 と し て 溶 血 に
こ の よ う に P E O O H と P C O O H は 異 な る 挙 動 を示 し たが
そ
関 与し て い る と 思 わ れ る
､
､
｡
1
の 原因 と し て P E と P C の o
が考え ら れ る が 不 明 で あ る
分後にP C O O
H
1
照射 に よ
っ
て 生 じた o
され
ン に よ っ て 還元
て 増加 し
で はこ の
､
膜に
2
によ
ハイ
の
溶血 の 機序 に つ
ど溶血 しな か
く
､
っ
ペ
ル オ キ シ ド ラ ジカ ル を生 じ
4 0)
す ぐ に飽 和 状態 に 達 し
とから
､
HP 5
は R F 膿度 を 高 く し て も3
0
分 以下
い る
o
しかし
い
R F はH P に 比
､
べ
りM H P
0 5
.
りM
る
い ずれ に せ
｡
TBA R S
-
H P UV A
,
増感 に よ
値の 変動 と溶血 と の 関係
H P 及 び R F の ∪V A
一
っ
しか し
｡
っ
､
､
タ ン パ ク変
とな どか ら
こ
こ
定量 以 上 の 損傷 が
ま た 今 回 は 溶 血 率 は0
.
い
､
.
2 %
膜タ ン
､
赤血 球 を 用
uM HP
50
存
1
発 生 し た o 2 に よ っ て 生 成 した P E O O H 及 び
て
また N
a
N
24
っ
て同
一
条件下 で
の
,
や
,
マ
､
ン
ニ
-
ト
-
ル な どの P E O O H
あ る と思 わ れ る
,
PC O O H
0
あ ら ゆ る 生 体 組 織 を 酸化 的 に 傷害 す る
生 体 影 響 を評 価 す る 際 の
-
よ
.
漉度 によ るP E O O H P C O O H 生 成量 及 び
H P
､
つ い て 今後 更 に 検討 す る 必 要 が
の
畳 が 増 えな か
変動 が 単純 に は 溶 血 と 相 関 し な い 可 能 性 も あ
増感 は 赤 血 球 の み な ら ず
可能性 が あ る の で U V A
4 4)
こ る と言 わ れ て い る
の
P C O O H 生 成量 と 溶 血 と の 関 係
生成 に 与 える 影響等 に
の
過 酸化 脂質含 量 は2 0 % 赤 血 球 を用
､
過 酸化 脂 質含 魔
-
､
2
時間 は 膜 に あ る
と 溶 血 に は 密接 な 関 係 が あ る こ と が示 唆 さ れ た
PC O O H
PE O O H
よ
､
こ と な く 速や か
存 在 下 で は1 5 分間 照 射終了直後 に ほ ぼ1 0 0 % 溶 血 す る
存在下 で 測 定 し
在下 で 測 定 し て お り
O ℃放置時
る と 増感 力 が 非常 に 弱
濃度 を そ れ 以 上 に し て も 生 成す る o
ク質変性 も 溶 血 に 寄 与 し で い る 可 能 性 が あ る
､
o
っ
照 射 で は ほ とん
の
1
､
性 は脂 質 過 酸化 よ り 低 線 量 の 紫 外 線 で 起
o
A
赤 血 球膜 が U V A 照 射 の 影 響 を 受け て か ら 溶 血 を 起 こ す ま
蓄積さ れ る の に か か る 時 間 と 考 え た方 が よ り 正 確 な よ う で あ る
/l
と よ りU V
生 体内抗酸化物質 等 に よ る 過 酸化月
旨質 を
､
U V A を 照 射し て か ら溶 血 が 起 こ る まで の
､
0
､
そ れが 自 動 酸 化 反応 に よ
､
溶血 を起 こ す の に十 分な量 に 達 す る
､
木ら
い て佐々
｡
など
放置1
この こ
o
､
｡
た ことか ら
たため と 思 われ る
た
損傷 を 与 え て 溶 血 に 至 ら せ た と考 え ら れ る
定 の 時間 が 必 要 だ と し て
一
い
い
て 生 成 し た 脂 質 ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ドが遷 移 金 属 イ オ
消去 す る 反応 の 方 が 優 勢 に な り
では
ル レ ベ ル に 減少 し て
ー
自動酸化 反 応 が 阻 害 さ れ た た め に
に 減少し た と 思 わ れ る
違
い る 部位 の
0 ℃ 放 置 時で は ほ と ん ど溶血 が 起 こ らず
､
ントロ
コ
っ
ドロ
定量以上
一
方
一
.
PEO O H 畳が
,
違 い や 膜 に 局 在化 して
との 反応性の
2
一
つ の
注 目点 と思 わ れ る
o
第 Ⅰ章
U V B
第三節
増感 に よる溶血反応
4 6
)
太 陽か ら放 射 さ れ る 紫 外 線 の う ち 地 表 に 到達す る U V A と ∪V B は紅 斑 形 成
15 )
1 3)
1 6)
しわ の 形 成
皮膚癌 の 誘 発 等 を 起 こ す こ とが 報告 さ れ て
ニ ン色 素 の 沈 着
-
､
･
､
しかし こ
メカ
の
ニ
､
ズム に つ
と が示 唆さ れ て い る も の の
著者 ら は前節 で
つ い
との 相関 に
へ マ
いて
､
トポル
て 検討 し
,
照射時 と
の
1
2
0
,
詳細 は 不 明 で あ る
フ ィ
U VA
た 過酸化脂 質 が 溶 血 に 関 与 し て
ニズム へ の
は主 と し で o
リ ン( H P
増感(
m
卜U
aj o r
等 の 活 性酸 素が 関 与 して
っ
た
e
Ⅱ) に よ
した が
｡
-
25
･ ･
.
｡
こ
｡
o 2 の 関 与 を明 ら か に す る た め に U V B 照
比較を行
い る
い る
2 5 4 5)
V A 増 感 に よ る 溶血 と 過 酸化 脂 質 の 生 成
Typ
い る こ と を示
2
メラ
､
､
1
っ
て 生じた o
本節 で は ∪V B
射時 に つ
いて
の
2
に よ り 生 成し
生 体影響 の メ カ
同様 に検討 し
､
U V A
実験材 料 と 方 法
1 3 1
_
-
(1) 動 物
ウサ ギ は 前 節 と 同 じも の を用 い た
｡
( 2) 試薬
ソル ビ ト
ル( S ol) は 和 光純 薬 よ り 購 入 し た
-
(3) 溶血 試 験
ト1
4
m
o
36 )
節 に 示 し た の と 同様
催 外径3
c m
方法 で 調 製 し た0
の
試料 ビン に入れ
の
.
2 %
赤 血 球 懸 濁 液2
室 温 下 で U V A (3 5
､
0 380
-
n m
は H P リ ン 酸緩 衝液
m
,
m
3 65
a x
n m
)または
( 3 0 0 3 3 0 n m m a x 3 1 7 n m ) を 紫外 線 照 射 装 置 ( イ グ ル 商事 ( 樵) 製紫外 線 均
定 時 間 照 射 し た な お 高 さ 1 8 c m か ら照 射 し た 時 の 平 均
照射光 源 装 置) を用 い て
UVB
ー
-
,
一
一
o
照射強度( 3 6 5
n m
ま た は3 1 3
製) に て 測 定) で あ っ た
照 射前後 に7 4 0
n m
n m
) は7
.
O
m
W /c
2
m
(u v チ
ェ ッ
カ
ー
(イ
-
グル 商 事 ( 樵)
｡
に お け る 吸 光 度を 測 定 し
終了後 の 経過 時 間 の 溶 血
へ
､
の 影 響 を み る 際 はU V A
そ
の
減 少か ら溶血 率を 求め た
26
-
照射
照 射終 了直 後 に 溶血 率 を 測定 し た 後
試料 を室温 あ る い は0 ℃ で 暗 所 に 放 置 し て 1 0 分 ごと に 溶 血 率 を 測定 し た
-
｡
｡
､
結果
1 3 2
.
-
( 1) 照 射時 間及 び増 感剤
の
濃度 の 影 響
ト3 1 に 示 す よ う に ウサ ギ赤 血 球 に U V B を1
い
溶血 率は2 6 % と ∪V A 照 射時 よ り 高 値 を 示 し た
Fig
-
.
20
分 間(5 0
･
4 J/ c
2
) 照射 し た と こ
m
o
3 0
＋
w ith o u t
A
邑
2 0
a)
■■■ ■
a)
>
l
I
0
宕l o
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0
0
3 0
葺r
F ig I 8 1
E 鵬
.
E w th
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E a c h p oi n t
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9 0
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6 0
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m
n
1 2 0
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m
(3 0 0
1 5 0
-
330
e m
n m
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-
27
-
･
o
日y s i s
)
I
e n
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of
i r r a di a ti o
n
.
H P
ろ
､
H P 濃度 を 変化 さ せ
的 に 溶血率
達 し た( Fi g
の
増加 が 見 ら れ
ト3
,
U V B 1 5 分 間 照 射終 了直 後 の
､
-
2)
50
､
いM H P 存 在 下
溶血 率 を測 定 した と こ ろ
,
( U V A 照 射 時 よ り 高 い 濃 度)
o
巧2 0
U VB
＋
領0 0
･
一
喝卜
-
･
･
UV A
･
A
S
〆
､
8 0
切
■ 1 -
Q)
>
6 0
”
O
喜
櫓0
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2 0
￠
0
瑠0
M P
Fi g
ト3
,
E ryth
-
fo r 1 5
r o c yt e s
m
in
w e re
3 0
c o m c e m
E 鵬 cせ
2
2 0
o
ず h
柑aLti
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i rr a d i a t e d
4 0
p
w it h
6 0
( 印M )
o m
o r
5 0
p h y ri m
UVB
c o m c e
(3 0 0
-
330
柵
a
n m
)
e
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朗o
m
UVA
o m
h
e m ol y si s
(3 5 0 3
-
80 n
.
H
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W a s
E
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-
a
ta
28
･
.
th
of
i r r a di a ti o
n
.
m
)
濃度依 存
で1 0 0 % に
ころ
H P の 吸収 ス ペ ク ト ル を 測定 し た と
吸 収 極大 は3 8 0
､
n m
で あ
0 5
,
也)
0
【=
/
a
空
.
.
0
∽
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.
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I
-
㌔
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25 0
W
Fi g
HP
ト3 3 A b
･
.
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㌔
45 0
35 0
ぬn
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-
(m
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-
)
朗o p
s a li n e
29
m
or
p h y ri m
( p H 7 4)
･
っ
た( Fi g
ト3 3)
-
･
｡
の
( 2) 放置温 度 及 び放 置 時 間 影響
1 0 ‖M H P 存 在 下 ( 照 射 終 了 直 後 に は 溶 血 が 起 こ らな い 濃 度)
し
照 射終 了 後
､
の 放 置温 度 の
影響 に
つ い
て 検討 し た
に お い て U V B を照 射
そ れ ぞ れ 照 射 終 了直 後 に は 溶 血
｡
率 の 増 加 は 見 られ な か っ た が 時 間 の 経 過 と共 に 溶 血 率 の 増加 が 見 ら れ 室 温 放 置 時
は3 0 分後 0 ℃ 放 置 時 は4 0 分 後 に ほ ぼプ ラ ト に 達 し て 9 0 % 以 上 の 溶 血 率 を示 し た
､
､
-
､
(Fi g I 3 4)
-
-
.
o
1 0 0
U V B R T
＋
8 0
-
.
針
一
-
U V B O
I
.
℃
■■l ヽ
′
i
ヽ
中
′
＋
U V A R T
望
♯
∪V A O
.
の
> ヽ
け1
.
.
6 0
℃
一
書
4 0
￠
=
2 0
0
2 0
0
Fig
ト3 4 E f 紬
-
.
E ryth r o c y t e
U VA
(3 5 0
s
w e re
38 0
-
E a c h p oi n t
re
ct
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pre
o
ず te
4 0
m
p
i r r a di a t e d
) in
s e nt s
th
e
th e
p
e
6 0
柑t u r e
w it h
m e a n
of
of
th
(3 0 0
e m
-
330
.
d at a
-
e
e m
舌n ) a 骨旭 r
u o 甘責r r a d岳a 朗o
m
m
oB y s は
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n m
0 5 LJ M H P f o
re e
(
m e
＋
h
O m
U V B
re s e n c e
Ti
紬
30
-
.
r
15
th
m
e
in
p
･
re s e n c e
of
1 0 LJ M
H P
o r
(3) 抗酸化剤 の 影響
1
著者 ら は前 節 で o 2 に よ り 生 成 し た 膜 脂 質 の U V A 照 射 時 の 溶 血 へ の 関 与 を 明 らか に
1
した U V B の 生 体影響 の メ カ ニ ズ ム へ の o 2 の 関 与 を 明 ら か に す る た め に O H ラ ジカ ル
｡
スカ ベ ン ジ ャ
ル ビト
のM A ソ
-
1
そ し て O H ラ ジカ ル 及 び o
影響を 検 討 し
を強く 抑制 し
2
の スカ ベ ン
U V A 照 射時 と の 比
､
1
ル( S o d)
ー
及び o
､
ジャ
2
の ス
カ
ベ ン
ジ
ャ
a
N
3
His
,
で あ るV C の H P U V B 増 感 に よ る 溶 血
ー
-
較 を行 っ た
N
｡
N
a
｡
っ
たが
M A は ∪V A 照
､
ま たS o l も ほ と ん ど 抑 制 を示 さ ず
射 時 と 異 なり 全 く 抑 制 を示 さ な か っ た
オキ シ ドデ イ ス ム 夕 ゼ( S O D ) は 全 く 抑 制 を示 さ な か っ た( T a b l e ト 3 1)
.
､
ス
ー
パ
-
-
0
T
a bB e
I 3 1
･
E 鵬 c 骨S
-
o甘 a m
批
S e m S
Che
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M
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H
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朋
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-
官S
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l
l
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%
d
柑 dic a E
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W
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n
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g
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o
岬 h y ri m
e
p
O m
u V B
%
91
N
a
N3
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e
m a n nito1
a s c o rbi c
0
50
20
78
10
93
0
50
69
24
88
50
79
13
1
76
16
10
11
a cid
SO D
3 8 2 5 U/ m 暮
E ryt h r o cy t e
s
H P fo r 1 5
in
m
w e re
a re
88
92
i rr a d i a t e d
0
w ith
U VB
(3 0 0
-
330
n m
) in
th
e
p re
s e n c e
.
1
m oly sI S
D a ta
92
50
s o rbit o1
He
10
W a s
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m e a n s
of
rm
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at
30
m
in
a ft e r th e
m e a s u r e m e n ts
e n
.
-
31
-
d
of
の
ヘ
とV C はU V A 照 射 時 と 同 様 に 溶 血
H i s も U V A 照 射 時 と 同 様 に 弱 い 阻 害 しか 示 さ な か
､
で あ るN
ー
i r r a di a ti o
n
.
of
1 0 LA M
-
ー
考察
1 3 3
-
-
G od
er
46 )
は ヒ ツ ジ 赤 血 球 に U V B (3
ら
い る
た と 報告 し て
F
即 0
V
｡
ら
a rg a s
で ウサ ギ赤 血 球 に U V A
∪V B
､
(6
.
3 J/ c
溶血 す る
H P 存 在下 で は1 0 0 %
) を単 独 で 照 射 し 溶 血 は 起 こ らな か っ
は ヒ ト赤 血 球 は ∪V B 単 独 で は 溶 血 を 起 こ さ な い が
) を 照射 し
m
こ
と を示 し た
単 独 の 溶血
その も の
ネルギ
に よ り溶血 が 起 こ
い て 検討 し た
らか と な
っ
た
o
と
H P の
こ ろ
た
吸収 ス
ペ
ク トル
の
著者 ら は1 節
未満 だが
､
｡
したとこ ろ
い て 検討
ネルギ
エ
照 射量 が 多 い 場
､
た も の と思 わ れ る
っ
e
が
31 3
e
365
約
の
が大きい
-
ので
倍程 度 弱 い
U VB
､
次 に H P 存在 下 で
o
H P に 対 す る 増 感 力 はU V B の 方 が 1 0
､
｡
H P 非 存 在 下 で は 溶 血 率 は5 %
､
U V B はU V A よ り
｡
い る
少 な け れ ば∪V A 照 射 時 と 同 様 に 単独 で は 溶 血
､
らか と な
っ
溶 血 す る と報 告 し て
影響 に つ
の
へ
こ とが明
響に つ
00 %
2
を起 こ さ な い
ー
､
､
合はU V B 単独 で も あ る程 度溶 血 す る が
の エ
2
c m
光増感 剤存 在 下 で は ほ ぼ1
仙 r at e 等 の
本節 で は ま ず
4 7)
6 J/
の
影
こ とが明
/ 8 で あるた めと思われる
1
o
放 置温度 及 び 放 置 時 間 の 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 0 ℃ 放 置 時 は 室 温 放 置 時 と ほ ぼ 同
様 の 溶血 率 を 示 し U V A 照 射 時 の よ うな 抑 制 は 示 さ ず ま た プ ラ ト に達 す る 時 間 も
､
ー
､
､
〕v A 照 射時 よ り 早 か
っ
た
1
同様 に 強 い 抑制 を 示 し た が
抑制 しなか
っ
た
T y p e I 反応 に よ
もの と思わ れ
､
制が 見ら れ な か
いもの
以上
｡
また o
｡
の こ
の スカ ベ ン
2
とか ら
っ
た
｡
こ
とか ら
0
2
一
､
,
V C はU V A 照 射時 と
S o I は ほと ん ど 溶血 を
定 盈 の o 2 が 赤 血 球 膜 を 傷害 し
の
生 成す る
｡
'
m ]n o r
Ty p
e
m
M と
膿度 を用 い た
1
た 原 因 は 州 s の o 2 消去 能 が N
今後 更 に 検 討 が 必 要 と 思 わ れ る
a
N
3
｡
-
32
-
より弱
い
｡
溶血 を起 こ し た
､
Ⅱ 反 応 の 関 与 はほ と ん どな
H i s がN
と を明 ら か に す
い こ
か な り 高 い ( 溶解 度 や U
､
jor
m a
また S O D 添 加 時 で は 全 く 抑
な お 本 研 究 で は O H ラ ジ カ ル や 0 2 が 関与 しな
を起 こ さな い 事 を 考 慮 し て 用 い う る 最高)
不明 で
,
3
1
る ため に M A や S O D な ど の 漉 度 を5 0
っ
N
U V B 照 射 時 で は主 と し て U V 照 射 に よ り
､
'
,
a
のM A
-
自 動 酸化 反 応 の 寄 与 は 少 な い と 思 わ れ る
と思 わ れ る
か示さなか
で あ るN
ー
O H ラ ジカ ル ス カ ベ ン ジ ャ
､
て 生 成 した あ る
っ
ジャ
a
N
V
非 照 射時 で 溶 血
,
より 弱
い抑制
し
た め で はな い か と 思 わ れ るが
第 Ⅰ章
増 感 に よ る 過酸 化 脂 質 生 成
u V B
著者 らは 第 二 節 で 5 0 LJ M
し
､
フ ォス フ ァチ ジル エ
チジル コ リ ン ハ イ ド ロ
マ
へ
タノ
ペ
第四 節
ト ポル
リ ン( H P) 存 在 下 2
フィ
0 %
赤 血 球 に U V A を照 射
ル ア ミ ン ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド( P E O O H ) 及 び フ ォ ス フ
-
ル オ キ シ ド( P C O O H) 生 成 量 が 有 意 に 増 加 す る
また 前節 で ∪V B 照 射 時 で は 主 と し で o 2 が 溶 血 に 関与 し て
い る こと
こ
と を示 し た
ァ
を示 し た
｡
そ こで
｡
本節 で はU V B 照 射 時 に お け る 過 酸 化 脂 質 の 関与 を 明 らか に す る た め に P E O O H 及 び
また 溶 血 率 測 定 時 と 同 条 件 下 で の 過 酸
p c o o H 生成 量 を 指 標 と し て 検 討 を行 っ た
一
o
化脂質含量
thi o b
へ
a r bit u ri c
の
影響 を 検 討 す る た め に 0
a cid
r e a c ti v e
更 にU V 吸 収 剤 の 影響 に つ
s u
b st a
い て
n c e s
.
赤 血 球 に U V A ま た はU
2 %
(T B
も検 討 を行
-
A
っ
33
-
R S) 生 成 量 を 指 標 と し て
た
-
を 照射 し
V B
｡
､
検 討 を行
2
っ
-
た
.
実験 材料 と 方 法
1 ヰ1
(1) 動物
ウ サギ は 前 節 と 同 じ も の を用 い た
｡
(2) 試薬
2 thi o b
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(3) P C O O H P E O O H 及 び フ
ア ミ ン( P E ) の 定 量
,
pc o o H
(4) T B A
-
,
ォス フ ァ
PE O O H 及び P C
RS の
,
チ ジル
リ ン( P C )
コ
P E は 第2 節 と 同 じ方法 で
,
フ ォ スフ ァ
チ ジル
定量 を行 っ た
エ
タノ
ー
ル
｡
定量
T B A R S は大石 ら の
-
たりの 含量 を求め た
｡
4 8)
方法
に準 じて
行い
タ ン パ ク 膿 度 はL
､
532
o w ry
-
35
法
-
n m
の
の
吸光度 か ら 定 量 し
改良法
49 )
で
求め た
｡
､
タ ン/ てク 当
結果
1 4 2
･
-
ヘ
(1) T B A R S 含 量 の 影響
o 叫 M H P 存 在 下0 2 % 赤 血 球 に U V A を 照 射 し た と こ ろ
-
室 温 放置 時 で は放置1
､
･
.
分
0
後か ら生 成量 が 有 意 に 増 加 し た が o ℃ 放 置 時 は 有 意 な 増 加 は見 られ な か っ た 室 温
放置 時 に お い て 溶 血 を 約8 0 % 抑 制 す る 量( 0 4 m M ) の D D S ( U V A 吸 収 剤) 存 在 下 で も
､
｡
･
､
方 1 0 りM H P 存 在 下 U V B を照 射 した と こ ろ U V A
有意な 増加 は 見 ら れ な か っ た
照 射終 了 直後 に 有 意 な 増 加 を 示 し 1 0 分後 に は コ ン ト ロ
ル レベ ル
照射時よ り早 い
一
o
､
､
-
､
､
に減少 した
UV B
｡
吸収剤 の S
･
増加 が ほ ぼ完 全 に 抑制 さ れ た( Fi g Ⅰ
-
･
■■■
′
存在 下 ( 溶 血 を 約8
A O 08 %
a
4 2)
0 %
-
o
9
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抑制 す る 濃度) で は こ の
U VA R J
＋
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.
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￠
中 II
-
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UVA O℃
-
＋
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DDS O 4
＋
UVB R T
＋
UV B O C
＋
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.
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★★
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(2) P E O O H 及 び C O O 含 量 の 影 響
1 m M H P 存 在 下 2 0 % 赤 血 球 に ∪V B を 照 射 し た と こ ろ
含量より 多 く
､
そ れ ぞ れ 照 射終 了 直後 に 最大値 を 示 し
PEO OH
､
含 量 の 場合 は U V A 照
PEO O H
､
含量 の 方がP C O O H
方 P C O O H 含 量 の 場 合 は 照 射 終 了1 0 分後
射時よ り早 く 有 意 な 増 加 が 見 ら れ た
ル レ ベ ル まで 減 少 し た( F ig Ⅰ 4 3 )
p E O O H 含 量 の 場合 は 照 射終 了2 0 分後 に コ ン ト ロ
一
｡
､
､
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-
-
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( U V B)
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( U V A)
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( U V A)
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1 4 3
-
･
u v B 照射 時 に お い て
マ
ン
ト
ニ
ルや ソ ル ビト
ー
ル が 溶 血 を ほ と ん ど抑
-
制せ ず
o℃
､
放置 時 は溶 血 率 の 抑 制 が ほ と ん ど 見 られ な か っ た また U V B 照 射 時 の 方 が∪V A 照射 時
より早く P E O O H 含量 の 増 加 が 見 ら れ た 上 記 の こ と か ら U V B 照 射 時 と∪V A 照 射 時
｡
｡
の溶血 の
1
りo
2
違い は
1 0 りM H P
､
の 生 成速度 が 早 く
た こ と に よ る の で はな
生成速度 に つ
い て
､
い
存 在 下 U V B 照 射時 の 方カ7S 0 5 H M H P 存 在 下 U V A 照 射 時 よ
U V B 照 射時 の 方 が 自 動 酸化 反 応 の 寄与 が 相 対 的 に 小 さ か っ
.
か と思 わ れ る
は不 明で
u v 照射時 の T B A R S 生 成 量 の
射時 に お い て も P E O O H 含 量
血 に 関与 し て
DD S
い る
の
の
たこ とか ら
こ とか
も の と思 わ れ る
はD D S 及 びS
ら
､
5 0)
著者ら
.
した o 2 が 膜 脂質 を過 酸化 し
､
の
､
｡
いて
もP E O O H 及
そして
∪V B 照
､
溶血 に 先 立 っ て P E O O H 含
含 量 が主 と し て 溶
存 在 下U V B 照 射 時 に お い てT B A R S 含量 の 増 加 が有
a
A
a
A によ
-
て ∪V A 及
っ
｡
ま た D D S 及 びS
も試みて い る
血を引 き 起 こ し た こ と が 示 唆 さ れ た
｡
の
溶血率 を 指標 と す る 方 法 が U V 防 御 剤 の
'
v Itr o
/n
-
38
o
2
に よる
A に よ り溶血 率及 び過
'
/n
'
v Jtr o
評
機 序と して U V 照 射 に よ り 生 成
ま た ウ サ ギ赤 血 球 を用 い
'
1
､
｡
びP C O O H 含 量 が あ る
PE O O H 及
a
クされ
ッ
れ ら を 指標 と した U V 防御剤 の
こ
､
び∪v B が ブ ロ
以上 の 結果 か ら ∪V B 照 射時 及 び U V A 照 射 時 の 溶 血
1
赤血 球 へ
2 %
の
｡
酸化脂質 含 量 増 加 が 抑制 さ れ た こ と か ら
､
赤 血球 に お
0 2 %
U V A 照 射 時 と 同様 に P E O O H
過酸化脂質 生 成 が 抑制 さ れ た た め と 思 わ れ る
価法にも 応 用 可 能 で
､
.
2
照 射時 の P E O O H 及 び
方 がP C O O H 含 量 よ り 多く
存 在 下 U V A 照 射時 及 び S
意に抑制 さ れ た
っ
のU V
ま た0
｡
赤血 球 の 場合 と ほ ぼ同様 だ と思 わ れ る
0 %
量 の 有意 な 増 加 が 見 ら れ た
1
U V B 照 射 時 及 び ∪V A 照 射 時 の o
､
変化 が 2 0 % 赤 血 球 ヘ
含 量 の 変化 と ほ ぼ 同様 で あ
びP C O O H 含量 の 変化 は2
しか し
o
今後 更 に 検 討 が 必 要 と 思 わ れ る
､
-
pco o H
､
-
一
定 レ ベ ル に 達 して 溶
U VA H P
-
､
評価 法 に 成り 得る
こ
増感 に よ る
と が 示 唆さ れ た
o
小括
ウ サ ギ赤 血 球 を 用
光 増感物 質 存 在下U V A ま た はU V B を照 射 し 溶 血 率 や 過
酸化
の 影 響 を検 討 し
更 に 溶 血 に 関 与 す る 活 性酸素 種 を 明 らか に す る た め に
い
､
､
脂質 含量 へ
種抗酸 化剤 の 影 響 を検 討 し た 結 果
各
､
､
以下
の こ とが明
らか と な
っ
た
｡
〕V B 照 射 時 及 び U V A 照 射 時 の 溶 血 の
機序 と し て U V 照 射 に よ る m aj o r T y p e Ⅱ 反 応 に
より 生成 した o 2 が 膜 脂 質 を 過 酸化 し そ れ が 自 動 酸 化 反 応 に よ っ て 増 大 し p E O O H
及
びP C O O H 含 量 が あ る 定 レ ベ ル に 達 し て 溶 血 を 引 き 起 こ し た こ とが 示 唆 さ れ た
1
､
一
一
｡
方 U V B 照 射 時 と U V A 照 射 時 で は エ ネ ル ギ の 差 増感 力 の 差 等 に よ っ て 溶 血 へ の 自
動酸化 反 応 の 寄与 が 異 な り U V B 照 射 時 の 方 が 自動酸化 反 応 の 寄与 が 小 さ い こ と が
-
､
､
明
､
らか と な
この こ
っ
た
｡
とか ら
､
U V A の 生体
可能性が 示 唆 さ れ た
へ
の
影 響 はU
VB
と は少 な く と も
一
部 は 異 な る 機序 に よ る
｡
またU V 防御 剤 の 溶 血 や 過 酸 化脂 質含 患
へ
の
影響 を 検 討 し た 結 果
､
ウサ ギ 赤 血 球 を
増感 に よ る 溶 血 率 や 過 酸化 脂質 合 壁 を 指標 と す る 方 法 が U V 防御剤 の
v/tr o 評価法 に 成 り 得 る こ と が示 唆 さ れ た
用い
U VA H P
I
､
'
o
-
39
-
･
In
第Ⅱ章
3
OV A
次 元 培養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル に 対 す る
-
へ マ
トポル フ ィ リ ン 増 感 の 影 響
-
40
-
第Ⅱ 章
第
一
節
増 感 に よ る細 胞毒性
u V A
著者ら は 前章 で 生 体 膜 モ デ ル と し て ウ サ ギ赤 血 球 を用 い
(H P)
存在 下 U V A また は ∪V B を 照 射 し
こ と を 報告
した
それが 自 動 酸化 反 応 に よ
U V A の 生体
た
o
の
へ
影響は U
しか し な が ら こ
れた知見 をそ
の
の モ
こ
｡
っ
V B
ま た 溶血 に 先 立
､
っ
へ
リン
フィ
影 響を検討 し
の
､
て 過 酸化 脂 質含 量 が
1
れ よ り ∪∨ 照 射 に よ り 生 成 し た o 2 が 膜脂 質 を過 酸 化 し
て増
大し て 溶血 を引 き起
とは少な く とも
一
こ と とした
の
こ
した
こ と を示
唆し た
そし
｡
､
て
部 は 異 な る 機序 に よ る 可能 性 を 示 唆 し
デ ル は 比 較的単 純 で メ カ
まま生 体に当て はめ る
を用 い て 検 討 をす る
トポ ル
溶血 率や 過 酸化脂質含 量
､
照射時間 及 び H P 濃 度 に 比 例 し て 溶 血 が 起 き
増加す る
へ マ
､
ニ
ズ ム の 解 析 は し やす
は 困難 で あ る
｡
そ
い
反面
よ り 生体 に 近
こで
得ら
､
い モ
デル
｡
本章で は 従 来 の 単層 培養細胞 よ り も 長 期 間培養 が 可 能 で あり
､
真 皮 線 維 芽細 胞 が 細
胞間物質 を 分 泌 す る の で 細胞 の 存 在 環 境 及 び 細胞 間 相 互 作 用 が よ り 生 体 に 近 い 3 次 元
2' M
培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( S ki n ) を 用 い H P 存在 下 U V A 照 射後 に 生 じ る 細胞毒性 へ の
､
影響 に つ い て 検 討 を 行 っ た
｡
ま た U V A 防御剤 の 影 響 に つ
-
41
-
いて
も検 討 を行
っ
た
｡
実験 材 料 と 方 法
2 1 1
･
.
(1) 細胞
2 'M
3 次元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( S ki n
z K1 301
殖さ せ
角 層 を形 成 さ せ た も
,
株式会社 よ り 購 入 し た
層 ( ラ ンゲル
れて い る
ハ
S kj n
の
2 T ”
o
線維 芽 細胞 の 上 に ケ ラ チ ノ サ イ ト を増
,
メ ラ ノ サ イ ト は 存在 し な い ) はオ リ
｡
z K1 301 の
分化状態 を Fi g Ⅱ 1 1 に示 す 上 層 の 表皮
ン ス 細 胞 お よ び メ ラ ノ サイ ト は な い)
下 層 の 真皮 層 の 2 つ に 大 別 さ
o
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(2) 試薬
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-
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1
-
e n y lt e t r a z oli u m
-
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ン タ ル 酵 母 株 式 会社 よ り 購 入 した
標準 サ ン プ ル D ( p
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5 %
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定時間照 射 し た
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､
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Ab
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式 よ り 生存率 を求 め た
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ン し た後 に
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を用
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ュ
ベ
37
一
℃で
ト に移 し
ー
山ti o
s o
で 振 と う し な が ら室 温 で 1 時 間 イ ン キ
､
㌧m
照 射終 了 後 H P を 除 い て
o
ョ
セイ キ
ッ
( P F A ) 測定 用
を 紫 外 線 照 射 装 置 ( 山下 電 装 製)
W /c
m
お よ び A b 5 . . はサ ン プ ル
の吸光度 を示 す
)
時 間イ ン キ
吸光度 を 測定 し
の
=
c 5..
60
7 O
n m
ン した 後
ョ
で 振 と うしなが ら 2
抽 出液 を加 え て
て 5 40
365
r of
f a ct o
(3) 細胞 の 生 存 率 の 測 定
2
無 血 清培 地 中 に H P を添 加 し た S ki n を 1 時 間 プ レ イ ン キ ュ
-
( M T T) ア
e
を洗
n
ー
シ
っ
ョ
､
た後
ンし
o
100
未照 射 コ ン ト ロ
｡
-
43
-
ー
ルおよび ブラ ンク の 540
n m
結果
2 1 2
-
-
(1) U V A H P 増感 の 細胞 の 生 存 率 に 与 え る 影 響
ま ず U V A の 照 射時 間及 び H P 濃 度 の 細 胞 毒 性
-
分間照 射 し た と
60
かっ た
減少 し
しか し
o
2
､
H P 非 存 在下 で は 6 0
,
5 0 LJ M
-
存在 下 で は 照 射 時 間 の 増 加 に 伴 っ て 生 存 率 が 有 意 に
の H P
を示 し た ( Fig Ⅱ 1 2 )
時で 1 2 %
-
U V A を0 か ら
0
分 間 照 射後 で も生 存 率 に 影 響 を与 え な
存在 下 で は 1 5 分 照 射時 で 8 3 %
5 いM H P
､
ころ
響 を検 討 した
の影
へ
3 0 分 照 射時 で 3 0 %
､
60
､
分 照射
-
0
.
1 4 0
-
･
ぺ)
H P O LJ M
-
1 2 0
>
1 0 0
p
.
llI
d
J hl■■
H P I LI M
＋
H P 2 LI M
♯
H P 5 LJ M
＋
H P I O LJ M
#
H P 5 0 L) M
★ ★
l J P
a
.
＋
★ ★ ★
望
★ ★ ★
8 0
.
>
辞
6 0
★ ★ ★
ト
ト
4 0
冨
★ ★ ★
2 0
★ ★ ★
★ ★ ★
★ ★ ★
★ ★ ★
★ ★ ★
0
0
Fi g Ⅱ 1 ト2
E 触
･
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2T M
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7 5
d
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られ な か
っ
UVA
P
'
,
たが
<
.
'
'
,
.
P
5
した と こ ろ 6
6 %
存率 を 示 し た
の
0 01
p
o
から
､
5
'
5 0 LJ M
o r
p h y ri m
(
m
i
m
)
c o n c e 舶 r a ti o m
P
<
0 001
.
.
ま で 変化 さ せ
生存 率 に
､
濃度 が 2 LJ M 以 上 よ り 渡度依
叫 M で 3 % を 示 した ( Fi g Ⅱ
-
.
の
両 方 に 存在 し て
の H P
今 度 は 真皮 側 に 1 0 LJ M
生 存率 を示 し た
* '
,
.
U V A 照 射時 で は H P
､
は H P は 表皮側 及 び 真皮 側 ( 培 地 中)
11 % の生
<
at o
m
e
非 照 射 時 で は H P 濃度 が 5 0 H M で も生 存 率
在位置 め影 響 を 検 討 す る た め に 表 皮 側 に 5 0 0 p M
､
e
骨岳m
m
.
.
0 05
UVA
.
存的 に 生 存 率 の 有 意 な 減少 が 見 られ
ころ
h
適r F a d i a 朋o
.
濃度 を 0
H P
与える H P 濃 度 の 影 響 を検討 し た
で の 実験 で
ti m
m
e a s u r m e nt s
m
そ こ で 照 射時 間 を 3 0 分 と し
の 有意 な 減少 は 見
6 0
2T ”
i r r a di a t e d
w e re
m e a n ±S
are
Si g nifj c a
1 5
｡
-
44
-
を添 加 し
の H P
､
い
ト 3)
たが
.
‥
こ
れま
H P の局
U V A を照 射 し た と
を添 加 し
､
U V A を照 射
1 2 0
＋
C
o n t r o)
＋
U V A 30
1 0 0
”
盟
I
P
還 8 0
★
★★
★
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6 0
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★ ★
★ ★ ★
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★
★★
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1 3
･
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m e a s u r m e nt s
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5 0
c o nt ro( ,
…
P
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-
.
.
-
M P
c o n c e nt r a
0 001
<
6 0
45
-
.
380
n m
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c o m c e m 骨 柑骨
雇o m
n
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30
m
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.
b ㈹y
o
( P WF)
f S ki
m
2 TM
(2) 紫 外 線 防 御 剤 の 影 響
〕V A 防御剤 で あ る S トD を表 面 に 添 加 し
度依存 的 に 生 存 率
回復 した ( Fi g 刀
.
-
減 少 が 有意 に 抑 制さ れ
の
1 4)
細胞毒性
､
o 5
､
g/ c
m
.
の影響
ヘ
m
2
を検討 し た と
以上 で
トロ
コ ン
ころ
､
濃
ル レベル に
ー
-
o
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0 5
1 O
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∪V A 3 0
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1 0 0
★ ★
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★ ★ ★
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Ⅰ
･
1
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4
･
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46
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,
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<
o o o1
.
.
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'
,
'
P
<
0 01
.
,
in
考察
2 1 3
-
-
皮膚 は常 に 外 界 と 接 し
様
､
紫外 線 が 大 きな 影 響 を 与 え て
3 5 51 )
赤血 球
や ヒ ト 線 維芽 細 胞
･
な 酸化 的 ダ メ
々
い る
52
そ
o
)
ジ を受 け て お り
ー
こ で 紫外
線の 生体
ケ ラチ ノサイ ト
5 3)
の
へ
な どが
､
そ
の
一
因 と して太 陽
影 響 を検 討す る た め に
､
･
デル と し て 用 い
最 近 ( 1) 従来 の 単相培養 細胞 に 比 べ て 長 期 間 の 培養 が 可 能 で
あり ( 2) 真 皮 に あ る 線椎 芽 細 胞 が コ ラ ゲ ン な ど の 細 胞 間 物 質 を 分 泌 す る の で 細 胞
られ て きた
しか し
o
､
､
vitr o
/n
モ
､
ー
､
び 細胞 間 相 互 作 用 が よ n
の存在環境 及
不要で あ る
てき た
o
な ど の 理 由 か ら S kj n
､
Ed
w a rd s
ら
5 4)
は S ki n
2T ”
2T ”
'
'
n
に近 く
vI v o
か
､
つ
( 3) 試 験 時 に 無 菌操 作 が
､
･
が
･
In
表皮モ デ ル と し て 用 い られ る よう に な っ
v /tr o
に U VA
(3 2 0
-
4 00
n m
) を照 射 し
､
U V A 単 独 や 紫外
線吸収 剤存 在 下 で は 細胞 毒 性 を 示 さ な い が 8 メ ト キ シ ソ ラ レ ン ( 8 M O P) や ク ロ ル プ
ロ マ ジ ン な ど の 光 増 感剤存 在 下 で は 濃 度 依 存 的 に 細胞 毒 性 が 見 られ た と 報 告 し て い る
-
-
｡
方 C oh
一
e n
､
ら
5 5)
は ヒ ト 表 皮再 構築 モ デ ル ( E PJ S K r N ) に ク
〕V A を 照 射 し た 時 及 び 大 量 の ∪V A
こ と を報告
れる
特に フ リ
して
い る
ロ マ
ジ ン 存在下
) を 単独 で 照 射 し た 時 に 細胞毒 性 が 見 ら
m
こ の ∪V A
､
ルプ
照 射 に よ る 細胞毒性 発 現
のメ
カ
ズム
ニ
ラ ジカ ル や 過 酸 化 脂 質 の 生 成 と の 関 連 を 考 察 した 報 告 は ほ と ん どな い
ー
れらを 明 らか に す る
る
しか し
｡
( 3 0 +/ c
ロ
2
こ
と は 生体
の
へ
､
こ
o
紫 外 線 の 影 響 を予 測 す る う え で 重 要 だ と 考 え ら れ
｡
本節 の 結果 で は E d
から
,
w a rd s
理 由として C
その
h
o
どが考 え られ る
o
は見 られな か
た こ とか ら
っ
o
6 %)
､
が見 ら れ た が
っ
た
｡
著者 ら
加し
50)
こ の こ
とか ら
は ウ サ ギ赤血 球 に p
､
と
な
い
で も生 存 率 の 有 意 な 減 少
1
培 地 中 に生 じ た o
､
∪V A
､
生存 率
の
-
HP
2
によ
っ
て線維
1
増感 に よ っ て 生 成 した o 2
真皮 ま で 達 し た こ とが 細胞 毒 性 に 主 と し
､
｡
r o t e c ti o n
f a ct o
r of
UVA
存在 下 U V A を照 射 し て 溶 血 率 を 測 定 し
H P
､
とが 示 唆 さ れ た
違
こ
真皮 側 に 添 加 し た 場 合 は や や 減少 ( 生存
､
に より 表皮 に生 じ た 傷害 が 経 時的 に 増 大 し
て 関与 し て い る こ
50 u M
た
響 は ほ と ん どな い こ とが 明 ら か と な っ
ジ を 受 け た可 能性 は 少な く
-
っ
い て い る 細胞 が 異 な る こ とや 照 射光源 の
H P そ の もの の影
が見 ら れ た程 度 で あ
芽細胞 が 直接 ダメ
ら と用
影響 を 検 討 す る た め に 表 皮側 に H P を添 加 した 結果
有意 な減 少 ( 生存 率 1 1 % )
率6
e n
ま た U V A 非 照 射 時 で は H P 濃度 が
H P の 局在位 置 の
た
ら と 同 様 に ∪V A 単独 で は 細胞毒 性 が 見 ら れな か
( P F A) 既 知 の
U V A 防 御剤 を 添
P F A と 溶血 を 5 0 % 抑 制す る 防御
､
剤の 濃度 の 逆数( 1 /J C 5 .) が 有意 に 相 関 す る こ と を 報 告 し l /[ C 5 . が U V A 防 御剤 の 評価
の指標 に 成 り 得 る こ と を 示 唆 し て い る
し か し 分散 し に く い 物質 や 賦形 剤等 が 溶 血
､
｡
､
に影 響を 与 え る サ ン プ ル は 適 用 困 難 で あ る こ と か ら
の評価 法 を 開 発 す る
た め に U V A 防 御剤 の 評価 法 ヘ
,
の
本 節 で はよ り 生 体 に 近 い 条件 で
応 用 も 検 討 し た 結果
剤 の 濃度依存 的 に 生 存率 の 減 少 が 有意 に 抑 制 さ れ た こ と か ら
デルを用 い
vitr o
､
UV A
､
3
､
U VA
防御
次 元 培養 ヒ ト 皮膚モ
防御 剤 の 細 胞毒 性 防御効果 を 指標 と す る 方法 も 防 御 剤 の 有 用 な I n
･
評価 法 と な る 可 能性 が 示 唆 さ れ た
要があ る と 思 わ れ る
｡
今後他 の 防 御 剤 に つ い て も 同 様 に 検 討す る 必
｡
-
47
-
第 Ⅱ章
第二節
増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生 成
U V A
著者 ら は 前 節 で よ り 生 体 に 近 い 3 次 元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い
リ ン( H P ) 存 在 下 U V A を 照 射 し
及び H P 濃度 に 比 例 し て 生 存 率
1
o 2 によ り表
の
影 響 を検 討 し た
の
有意 な 減 少 が 起 き
1
､
培地 中 に 生 じ た o
と を示 唆 した
こ
抑制 され た こ と か ら
っ
の
結果
-
っ
､
フィ
照 射時 間
て 生成した
こ と が 細胞 毒 性 に 主 に
て 線 維 芽 細 胞 が直 接 ダ メ
ー
ジ を受 け る 可 能
ま た U V A 防御剤 の 膿 度 依 存的 に 生 存 率 の 減少 が 有意 に
｡
次 元 培 養 ヒ ト皮 膚
3
､
によ
2
そ
｡
トポ ル
へ マ
∪V A H P 増 感 に よ
､
皮 に 生 じ た 傷害 が 経 時 的 に 増 大 し 真 皮 ま で 達 し た
関与し て お り
性は少 な い
細胞毒性 へ
､
､
デ ル を用 い
モ
､
U VA
防御 剤 の 細 胞 毒 性 防 御
効果を 指標 と す る 方法 が 防御剤 の 有 用 な I n vitr o 評価 法 に な る 可 能性 を示 唆 した
'
方
,
すく
表皮 の 脂 質
､
の
10 %
約
表皮 の 酸化 の 第
一
を 占め る
の
タ
ー
ス
ゲ ッ ト とされ
過酸化物 の ス ク ワ レ ン モ ノ ハ イ ド ロ
ている
3 0 3 1)
･
｡
こ れが 直接
､
ペ ル
3 O)
二
重 結合 が多
い
た め 酸化 さ れ や
1
試験管内 で は S Q は o 2 と 反 応 し て
､
オ キ シ ド( S Q O O H ) を生 成 す る
1
こ と が知
られ
によ り 表皮 に S Q O O H が 生 成 し
著者らは
この S
また は
次 的 に 生 成 した 他 の 過 酸化脂質 と 共 に 細胞毒 性 に 主 に 関 与 し て
二
Q O O H に着目し
い る と い う 仮説 を 検討 す る た め
SQO O H
ク ワ レ ン( S Q ) は
一
o
含 量 及 び 2 thi o b
-
更にそ れ ら の 細胞 毒性 と
､
a r bit u ri c
の
､
本節 で は S ki n
a cid
相関に つ
r e a c ti v e
いて
o
2
2 TM
s u
に H P 存在下 U V A を 照 射 し
b st a
検討 を行 っ た
-
48
-
n c e s
｡
(T B A
-
R S)
含 量 につ
､
､
いて
､
実 験材料 と 方法
2 2 1
･ ･
･
(1) 細胞
3 次元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル は 前節 と 同 じ も の を用 い た
｡
(2) 試薬
防御剤( S
〕V A
翼博 士
松
は前 節 と 同 じ も
トD )
を用
の
河 野 善行 博 士 よ り 譲 り 受 け た
､
(3) 細胞 の 生 存率 の 測定
細 胞生 存率 は 前 節 と 同 じ 方 法 で 行
た
っ
た
い
S Q O O H
｡
標 品 は 資 生堂 ( 秩) 高
の
｡
｡
)
(4) T B A R S 量 の 測 定
u v A を 3 0 分 間 照 射 し 上 述 の よ う に 3 ( 4 ふ di m
48
･
-
dip h e ny lt e t r a
‖u
z o
b
m
ro m
id
ドデ シ ル 硫酸 ナ トリ ウ ム 0
(T B A) 1 5
.
ノ
ー
ル
:
m
.
e
2
( M T T) ア
m
I 2 0 %
,
I を加 え て 9 5 ℃ で l
ビリ ジ ン 混液( 1 5 : 1)
を取 り 出 し た
20
｡
ッ
セ イ を行
酢酸 1 5
.
m
時間 反 応 さ せ た
5
分 室 温 放 置後 5 3 2
ン の 吸光度 と 比 較 し て T B A R S 量 を 求 め た
た後
-
-
n
に8 1 % の
.
-
.
｡
-
,
2 T”
の S ki
a rbit u ri c
急冷後 イ オ ン 交換 水 1
r
.
p
.
m
.
で 15
吸光 度 と 測定 し
の
n m
っ
l+ 2 y I) 2 5
I 及 び o 8 % 2 thi o b
ほ 加 えて 3000
m
e t h y Jthi a z o
､
a cid
l 及 び ブタ
m
分 間遠 心 分離 し
テトラ
エ
､
-
上清
トキ シ プ ロ パ
-
( 5) S Q O O H
定量
の標品 の
膿 度既 知 ( 7
H P を添加 し
､
.
75
n m
U
o
m
5 6)
]) の S Q の エ タ ノ
∪V A を 1 0 分 間 照 射し
較 し新 た な 標 品 ( S t) を作 成 し た
供し S Q は 2 1 0
n m
した H P L C 装置
の シス テム
の
｡
吸収 で
､
､
ル 溶 液 に 終 濃度 が
ー
生 じた S Q O O H
■
S t の 1 0 LJ
の
1 0 LJ M
になる よ うに
含 量 を譲 り 受 け た標 品 と 比
ほ 化学 発 光 H
( C L H P L C) に
S Q O O H は化 学発光検出 器 で 定 量 を 行 っ た 今 回 使 用
ブロ
測定 は
o
-
PLC
-
｡
ッ
ク図及び H P L C
-
49
-
の
分析 条 件 を Fi g Ⅱ
.
-
2 1
-
に示す
｡
S
Pl
”
a
P2
R
C L
W
a
A
Fi g Ir
2 1
-
s
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201
中 の S Q 及 び S Q O O H 含 量 の 定量
T B A R S 量 測 定法 と 同様 に処 理 し た S ki n
2' ”
-
10 pp
( 2 :1) 2
プ チ ル ヒ ド ロ キ シ トル
の
m
m
l で 2 回 抽 出 した
ル 混液(1
)
:1
｡
に 再 溶解 さ せ た
.
そ
を含む ク
エ ン ( B ‥T )
脱水後
､
[ の リ ン 酸 b uff e r( p H 7 A ) を 加 え
減圧 乾固 し
,
ロ ロ
ホルム
1 0 0 =l の
冷ク
:
メタノ
ロ ロ
ホルム
:
メタ ノ
を上 述 の C L H P L C に 供 し て 測 定 を 行
の 1 0 りI
-
s Q 及び s Q O O H は S t と 比 較 して 同定及 び定量 を行
-
50
-
っ
た
.
､
ル混液
ー
っ
た
ー
o
結 果.
2 2 2
-
｢
2T ”
中の T B A R S 量 へ の影 響
( 1) U V A H P 増 感 の S ki n
2T ”
に U V A を 30 分間照射し
H P を l 5 0 いM 含 む S kj n
-
-
S ki n
-
生量
影響 を 検 討 し た
の
ヘ
で ほぼプ ラ ト
に達 し た
ー
な か っ た ( Fi g Ⅱ
-
.
2 2)
濃度 が
H P
o
なお U V
o
以 上よ り
5 p M
､
の
-
RS
-
の
産
10 u M
､
有 意 な増 加 は見 られ
-
.
用 5
ご
中の T B A
有 意 な増 加 が 見 ら れ
,
非照 射 時 で は T B A R S 量
A
2T ”
c o n t r o[
＋
-
∼
4)
>
-
-
∼
*
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*
-
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-
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c o n
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の
P
★
,
検 出器 の Fi9 Ⅱ 2 3 B
-
.
,
測定 し た と こ ろ
コ ントロ
-
てSQ O O H
､
､
∪V A
o m
o n
12
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一
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.
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m
m
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P
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.
0 00 1
.
.
ロマ
ト グラ ム を
F ig
.
Ⅱ
-
2 3 に示す
-
Fi g Ⅰ 2 3 A
-
o
-
.
,
D が 化学発光検出器 の ク ロ マ ト グ ラ ム で あ る が S t 及
分 に 検出 さ れ た
そこ で U V A を 照 射 し
ti
a
帥 a 息i
.
びサ ン プ ル と も U V 検 出 器 で は S Q が 保持時 間 1
.
tr
c o m c e m
影響
未照 射 の サ ン プル の ク
では S Q O O H が 6 4
M P
6 0
p h y ri m
o r
w
e
中 の S Q O O H 含量
-
5 0
c o nt e n t
a n c e s
of
.
堵0
p
i r r ai a t e d
w e re
diff e
St 及 び u v A
C がUV
s u
o
2 0
ol
.
6 0
-
分 に検 出さ れ
化学発光検 出器
､
S / N 比 2 で の 検 出限界 は約 0 1 p
.
当 たり
Q O O H
の S
の
m
o]
であ
含 量 ( ス ク ワ レ ン 転換率)
っ
た
｡
を
非照 射 時 で は ス ク ワ レ ン 転換率 の 有意 な 増 加 は 見 ら れ ず ほ ぼ
ル レベ ル で あ
っ
た
一
o
方
､
U V A 照 射時 で は 照 射時 間 及 び H P
濃度 に 比例 し
含 量 の 有意 な 増加 が 見 ら れ 3 0 分 間照 射 時 で は 細胞毒性 や T B A R S 量 の
有意 な 増 加 が 見 ら れ な い
-
､
H P
濃度 1 いM 以 上 よ り 濃度依 存 的 に 有意 な 嘩加 が 見 られ
-
5l
-
､
叫M で
1
コ ン
トロ
ー
含量 の 有意 な 増 加
ル の 約2
倍 に 達 した
7
･
が 見 ら れ た ( Fi g Ⅱ
o
-
.
なお 6
o
2 4)
0
分照 射 時 で はH
非 存在 下 で も
P
-
Sl
o
S
a
a m
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育
⊂
(⊃
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Cu
ヽ
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0
P
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-
L
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S Q
↓
S Q
B
D
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.
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￠
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ー
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￠
U
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宕喜
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普
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S Q O O ‖
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･
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･
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52
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-
-
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-
-
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m
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U VA 30
m
in
U VA 60
m
in
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･
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,
.
(3) 紫外 線 防御 剤 の 影 響
uvA
防御剤 で あ る S
を表 面 に 添加 し
トD
､
濃度依存的 に S Q O O H 含 魔 の 増加 が 有 意 に 抑制 さ れ
レベ ルに 回 復 し た( Fi g Ⅰ 2 5)
-
.
-
.
-
53
含量 へ
SQ O O H
-
,
1
m
の
g/ c
影響 を 検 討 した と こ ろ
2
m
以上 で
コ
ント
ロ
-
､
l t,
0 6
.
∪V A 3 0
□
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★ ★★
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0 5
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.
■
一
0
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Fi g Ⅰ 2 5
-
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･
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.
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.
2
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-
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.
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,
'
'
in
考察
2 2 3
･
-
5 7)
小山 ら
は ヒ ト の 額 に S Q を 塗 布後 太 陽 光 線 を照 射 し
びT B A R S 含 量 を測 定 し た と
ころ
･
､
照 射後 の S Q O O H 含 量 及
､
照 射時 間 に 比 例 し て S Q O O H 含 量 及 び
TB A
-
RS
含量 の 増加 が 見 られ ビタ ミ ン E や カ テ キ ン な ど の 抗酸化 剤 の 添 加 に よ り こ の 増 加 が
58)
は ヘ ア レ ス マ ウ ス の 器 官培 養皮膚
顕著 に 抑制 さ れ た と 報告 し て い る ま た 中 山 ら
､
｡
に 〕V B を 照 射 し
組織中 の T B A R S 含 量 が 有意 に 増 加 し
アス
-
､
ス テル の 添加 に よ り
､
コ ン
トロ
ー
､
ル ビン 酸 リ ン 酸 エ
コ
ル レ ベ ル ま で 減 少 した と 報告 し て
い る
o
2T M
中の
本節 で 著者 は 細胞 毒 性 及 び T B A R S 含 量 の 有意 な 増加 に 先 立 っ て S ki n
また 前 節 の 結 果 を 考 慮 す
s Q O O H 含 量 が 有意 に 増 加 す る こ と を 初 め て 明 らか に し た
-
｡
ると
UV A H P
-
､
応 に よ りあ る
1
た o
によ
2
しか し
､
っ
一
1
増感 に よ っ て 生 じ た o
定 レ
ベ ル以上 に増
て 線維 芽 細 胞が 直 接 ダ メ
∪∨ 照 射 に よ り
コ
ラ
ク変性 も細 胞 毒 性 に 関与 し て
SQ O O H
UVA
大す る
-
皮表 に 生 成 した S Q O O H が 自 動 酸化 反
に より
2
こ
とが 細 胞毒性 に 主 に 関 与 し
ジ を受 け る 可 能性 は 少 な
ゲ ン の 変性 が 起 こ る
ー
い る
もの と思われ る
含 量 増 加 を 有 意 に 抑制 し た
ことか
ら
､
3
｡
5 9)
い こ
､
培地 中に 生じ
とが 示 唆 さ れ た
こ と が 報告 さ れ て
おり
､
タ ンパ
更 に ∪V A 防御 剤 の 漉度 依 存 的 に
次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い
防御剤 の S Q O O H 含量増加 抑制効果 を 指標 と す る 方法 も 防御 剤 の 有 用 な i n
評価法 にな る 可 能性 も 示 唆 さ れ た
｡
-
55
-
｡
､
'
v Itr o
第 Ⅱ章
第三節
増感 に よ る P G E 2 放出
u V A
著者 は前 節 で 3 次 元 培養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル を 用 い
下 U V A を 照 射 し 2 t hi o b a rbit u ri c a cid r e a c ti v e s u b
､
へ マ
､
H P 増感 に よ っ て 生 じ た
る
一
一
､
方 R h ei n
s
ら
6 0)
により
2
こと
る ため に
､
を示 唆 し て
H P
含量
へ
2
,
l し1
こ と が 細胞 毒 性 に
い る
｡
α
の
の
-
影 響 を検討 し た
主 に関与す る
､
の S ki n
放 出 量 の 増加 を報 告 し
本 節 で は ∪V A に つ
細 胞 毒性 と の 相 関 に つ
て検 討す る た め に U V A
そして U V A
い て
いて
-
防御 剤 及 び 抗酸化 剤 を 添加 し
-
56
-
,
細胞毒性 に 炎 症 反 応 が 関
､
エ
2
寄 与 を明 らか に す
の
ー
更 にそ
｡
PG E
o
z K 1 3 0 0 に U V B を照 射
も 炎症 反 応
検討 した
を示唆した
こと
2 T”
存在 下 U V A を 照 射 し て 炎症 の ケ ミ カ ル メ デ ィ
の 影 響 を検 討 し
o
皮表 に 生 成 し た S Q O O H が 自 動 酸化 反 応 に よ り あ
は 3 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル
細胞毒 性 及 び P G E
与す る
へ
o
定 レ ベ ル 以 上 に 増大 す る
､
し
1
リ ン ( H P) 存 在
フ ィ
(T B A R S) 含 量 及 び ス ク
st a n c e s
-
､
ワ レ ン モ ノ ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド( S Q O O H )
トポル
放出 へ
タ
の
-
の P G E
メカ
ニ
2
放出量
ズム に つ
の 影響 を 検討 し た
い
｡
実 験材 料 と 方 法
2 3 1
-
.
(1) 細胞
と 同 じ も の を用 い た
3 次元培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル は 前節
｡
(2) 試薬
い た
P G E 2 e n Z y m e i m m u n o a s s a y ( EI A)
u v A 防御剤( S t D ) は 前 節 と 同 じも の を 用
よ
a n nit oI ( M A ) は 関 東 化 学 ( 樵)
kit はオリ エ ン タ ル 酵 母 社 よ り 購 入 し た N a N , と m
-
o
｡
また そ
り
,
の
の試
他
薬 は 和光純 薬 ( 株)
よ り 購入 し た
o
(3) P G E 2 ア ツセ イ
2 ' M
シ ョ ン後 に U V A を 0
を 1 時 間 プ レイ ン キ ュ ベ
培地中 に H P を添 加 した S ki n
2
照 射終 了 後 H P を 除 い て 3 7 ℃ 5 % C O 2 湿 度
6 0 分間( 強度 0 2 5 2 +/ c m ) 照 射 し た
シ ョ ン し 0 4 2 0 時 間 後 に 培地 を取 り 出 した 5 0
9 0 % 以上 で 2 0 時 間 イ ン キ ュ ベ
-
-
′
o
･
,
-
､
u] の 培地 と 5 0 u l の ア
がコ
-
ッ
セイ メ デ ィ ウ ム を 取 り
テ ィ ングさ れ た 9 6 穴
ナル) を 加 え て
2
-
,
8℃で1
プレ
-
ウ サ ギ の I g G 抗体 ( ポ リク
ト に 添加 し
時間 イ ン キ ュ
ベ
1 00
､
シ
ー
o
,
､
-
ョ
=I の P G E
ン した
o
2
次に 1
の
抗体 (
00
ロ
ー
ナ ル)
モ ノク ロ
-
=1 の P G E 2
W a s h b u ff e r で 洗 っ た
ベ
シ ョ ンした
j u g a t e を加 え て 2 8 ℃ で 3 時 間 イ ン キ ュ
て 37 ℃ 5 % C O 2 濁
後 3 0 0 u l の p nit r o p h e n o】p h o s p h a t e ( P N P P) s u b s t r a t e を加 え
-
c o n
o
-
′
-
-
､
度9 0 % 以 上 で
1
時 間イ ン キ
の 吸光度 を測 定 し
､
ュ
ベ
ー
シ
ョ
ンし
5 0 いl の S t o p
､
s ol u ti o n
標 品 の 検 量 線 と 比較 し て 放 出量 を求 め た
-
57
-
o
を加 えて
4 05 n m
結果
2 3 2
･
･
(1) ∪V A
s ki n
pG E2
増感 の P G E 2 放 出 量
岬
一
2 'M
存在下 U V A を 照 射 し
に H P
放出量 へ
影響
の
へ
照 射時 間 及 び H P 濃度 の 照 射 終 了 直後 の
､
影響 を 検 討 し た と こ ろ
の
照 射時 間 及 び H P 濃度 に 比 例 し て P G E
､
2
放
出量 の 有意 な 増加 が 見 ら れ ∪V A 照 射時 で は H P 非添 加 時 で も 有意 な 増 加 が 見 ら れ た
(Fig Ⅰ 3 1 ) また P G E 2 放 出 量 の 経 時 変 化 を測 定 し た と こ ろ 経時的 な放 出量 の 増 加
､
-
-
､
o
,
が見られた( Fig Ⅱ 3 2)
-
-
･
0
6 ￠
∼
H P O LJ M
∼
H P l =M
∼
H P 2 LJ M
∼
H P 5 LJ M
#
H P 1 0 LJ M
′ヽ
-
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H P OH M
＋
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H P 5 LJ M
＋
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･
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叫
-
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-
U V A 30
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in H P 5 u M
U V A 30
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i n H P I O LJ M
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M
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-
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380
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N
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｡
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ル と 同 程 度 の 値 を示 し
､
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､
ー
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-
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ン後 の P G E
ー
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0 05
･
-
'
'
,
｡
)
の
放 出量
M A も 照 射終 了 直後 に は ポ ジ テ ィ
0
-
59
-
の放 出量に
っ
有意
べ
ィ
ブコ ン トロ
た( Fi g II 3 3)
-
･
の
時 間後
20
に比
へ
ゼ( S O D ) は ポジ テ
時 間後 もや や 低 い 値 を示 し た 程度 で あ
い
2
ル ( 抗酸化剤 非添 加 時)
オ キ シ ドデ イ ス ム タ
､
-
h y ri m
ル ビ ン 酸( V C ) は 照 射終 了 直後 及 び
ポジテ ィ ブコ ント ロ
これ に対
値を示 し
コ
ュ
方 ∪v A 非照 射 時 で は 抗酸化 剤そ の も の は P G E 2
た(デ
o rp
p
(h r)
e
抗 酸化 剤 の 影 響
を 除 い て)
な抑制 を示 し た
コ
at o
朗m
m
.
影響 を測定 し た と
m
e m
b a ti o
cu
.
抗酸化剤 の 照 射 終 了 直後 及 び 2 0 時 間イ ン キ
に( V C I O
h
2 4 且n
n
th
m
n
2 0
1 6
0 001
放 出量
の
S D
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b a ti o
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2
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一
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ほとん ど 影響 を 与 え な か
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380
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b y S k 盲n
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0 0 01
<
･
(U V
A i r r a di a t e d
w
ith l O いM
H P)
1
紫外 線 防御剤 の 影 響
ベ
シ ョ ン後の P G E 2 放
s トD を 表 面 に 添 加 し
照 射終 了 直後 及 び 2 0 時間 イ ン キ ュ
され 0 2
出量 へ の 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 極 め て 顕 著 に P G E 2 の 放出 量 の 増 加 が 抑制
の 放出量
2
m
c
コ
ロ
ル レベ ル に 回復した なお St D そ の もの は P G E2
(3) P G E 2
の
放 出量
へ
の
ー
､
､
､
g/
m
以上 で
ント
に影 響を 与 え な か
っ
-
-
o
た ( Fi g Ⅱ 3 4)
-
.
-
.
-
60
-
･
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★ ★ ★
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U V A
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2
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-
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61
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･
* *
,
'
考察
2 3 3
･
･
c oh
e n
ら
5 5)
は ヒ ト表 皮 再 構 築
を照射 し
ジン 存 在 下 U
V A
加を報告 し て
い る
いこと が 明ら か と な
oH
の
･
｡
っ
た
っ
｡
S O D 及び M A
関 与 は 少な
増感 剤
の濃
P IS K! N) に 光 増 感 物 質 で
度 依存 的 に 細 胞 毒 性 及 び I L
-
あるク
ロ
1
放 出量
α
の
本節 で は U V A 非 照 射 時 で は 抗酸 化 剤 添 加 時 に P G E 2
｡
有意な 増 加 が 見 ら れ な か
が示さ れ た
､
デル ( E
モ
い
た
こ
とか ら
また N
a
N
､
｡
S トD
増
の
放 出量 の
の
の
方 が 炎症 反 応 を 強 く 抑制す る
添 加 時 に 炎症 反 応 が 抑制 さ れ な. か っ た こ と か ら
と思 わ れ る
ロ マ
抗酸化剤 そ の も の は 炎症 反 応 に 影 響 を 与 え な
よりも V C
3
ルプ
を添 加 し た と
ころ
0
2
濃 度依存 的 に P G E
2
､
と
こ
￣
,
■
及び
放
の
出量の 増 加 が 有 意 に 抑 制 さ れ た S t D に より U V A が カ ッ トさ れ た た め と 思 われ る
2
また S Q O O H 含 量 抑 制 が 見 られ な い 0 2 m g / c m で P G E 2 放 出量 の 有 意 な抑 制 が 見
-
o
｡
､
､
られ た こ と か ら
先立 っ て P G E
2
,
の
こ
ち ら の 方 が感 度が 高 い と思 わ れ る
放 出 量 の 有 意 な 増 加 が 見 られ
応が有 意 に 抑制 さ れ た
1
.
こ
とか ら
､
こ の
｡
St D 及び N
-
､
細 胞毒 性 の 発 現 に U V
A
o 2 に よ る 炎症 反 応 も 関 与 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た
p GE 2 の
u vA
放 出 量 増 加 を 有意 に 抑制 し た こ と か ら
3
､
-
o
よう に 細胞 毒 性
a
N
3
,
の
V C 添 加 時 に 炎症 反
H P 増 感 に よ っ て 生 成 した
更 に ∪V
A
防 御剤 が 顕 著 に
次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い
防御剤 の P G E 2 放 出 量 増 加 抑制効 果 を 指標 と す る 方 法 も 防御剤 の 有 用 な i n
評価法 に な る 可 能 性 も示 唆 さ れ た が 0
ると思わ れ る
.
2
2
g/ c
m
m
｡
-
62
-
増加 に
以下
の
､
'
vIt r o
濃 度 で 更 に検 討 す る 必 要が あ
小活
次元 培 養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル を 用
3
過酸 化月旨質 含 量
た
､
放 出量
P G 巨2
い
の
へ
光 増 感 物 質存 在 下 U V A を照 射 し
､
影 響 を検討 し た結果
以下
の こ とが 明
らか と な
っ
｡
照 射時 間 及 び H P 濃 度 に 比例 し て 細 胞毒性
pG E2
放出 量 が有 意 に 増 加 し
sQO OH
vc
､
細胞 毒 性 や
､
,
N
a
N
含量及び P G E
3
は 細 胞 毒性
放出 量 等 ヘ
の
ま た 細胞 毒 性 及 び T B A R S 含 量
SQ O O H
含量及 び P G E
た
っ
P G E
､
2
-
自動 酸化 反 応 に よ り あ る
ころ
､
て
っ
また o 2 に よ る 炎症 反 応 も 関与 し て
増加 に 先 立 っ て
放 出 量 の 増 加 を 抑制 し たが
uvA
防御剤 の 評 価 法
の
良
い 加
v It r o
1
生じた o
2
｡
これ
-
ら の 結 果 か ら細
が
し
こ と が細 胞毒性 発 現 に 主 に 関 与
評 価 法 に 成 り得 る
63
,
に よ り 皮表 に 生成 し た S Q O O H
い る こ とが 示 唆 さ れ た
-
M A
細胞 毒 性 及 び
､
o
S KI N
2' M
増感 に よ る 過 酸 化 脂 質 生 成 や 細胞 毒 性 等 を 指標 と す る 試 験 法 が U V
'
､
､
濃 度依存 的 に 細 胞 毒 性 及 び S Q O O H 含
定 レ ベ ル 以 上 に 増 大す る
1
､
抗酸化 剤 の 影 響 を 検 討 し た と こ ろ
｡
放 出 量 の 増 加 が 顕著 に 抑 制 さ れ た
胞毒 性 の 発 現 に U V A H P 増 感 に よ
一
2
の
防御剤 を 表 面 に 添 加 し
U VA
｡
影 響 を検討 し た と
量が有意 に 抑 制 さ れ
含 量及 び S Q O O H 含 量
-
,
s o D は顕著 な 抑 制 を 示 さ な か
p GE2
-
放 出 量 が有意 に 増 加 し た
2
,
TBA R S
､
こ
A
を用
の
い U V A
-
H P
光 毒 性及 び
と が 示 唆さ れ た
｡
､
第Ⅲ章
過酸 化 脂 質 そ の も の の 培 養 細 胞
影響
1
64
-
へ
の
第Ⅲ章
第
単層 培養細胞
過 酸化脂 質 は 老 化
が示 唆さ れ て い る が
ペ
チル ハ イ ド ロ
ワ レ ンモ ノ ハ
明な点 が 多 い
,
や ア トピ
細 胞 毒性
､
ル オ キ シ ド(I B
-
イ ド
ロ ペ
ー
の
へ
性 皮 膚炎
影 響は
6 1)
これ
影響
細胞毒 性
､
まで膜脂質
O O H ) を用 い て
u
の
へ
6 2 6 3)
な ど に 関与 す る
1
過 酸 化 剤 で 水 溶性 の
の
3 3 3 4)
行わ れた も の
･
が 大部 分 で
ル オ キ シ ド( S Q O O H ) に 関 し て は 報 告 が少 なく
次元 培養 ヒ ト皮 膚 モ デル を用 い
3
､
下 U V A を照 射 し
2 thi o b
-
､
a rbit u ri c
含 量や P G E 2 放 出 量
へ
の
a cid
r e a c ti v e
s u
影 響 を 検 討 した
､
へ マ
b st a
｡
トポル
n c e s
フ ィ
･
プ
ス ク
作 用 機序 も不
大 す る こ と が 細 胞 毒 性 に 主 に 関与 す る
そして U V
本節 で は S Q O O H そ の も の
皮膚 の バ リ ア
ー
の
機能 を 担
こ と を示 唆 し た
細 胞毒性 ヘ
っ
細胞 毒性 及 びサ イ トカ イ ン 放 出 量
A
-
H P
の
-
65
-
っ
て
生じ
定 レ ベ ル 以 上 に増
響 及 びそ の 作 用 機 序 を 明 らか に す る た
の影
影 響 につ
一
増感 に よ
Q
て い る ケ ラ チ ノ サ イ ト を用 い
へ
リ ン ( H P) 存 在
-
た o 2 に よ り 皮表 に 生成 し た S Q O O H が 自 動 酸 化 反 応 に よ り あ る
､
1
(T B A R S) 含 量 及 び
1
めに
､
､
と
こ
｡
著者 は 前章 で
SQ OO H
2 6 3 1)
節
一
い て
検 討 を行
っ
､
た
S Q O O H を 添 加 して
o
実験 材料 及 び 方 法
3 1 1
-
.
( 1) 細 胞
正 常 ヒ ト表 皮 角 化 細 胞( N H E K ( B )) は ク ラ ボ ウ ( 樵)
よ り購 入 し た
｡
( 2) 試薬
は 資 生 堂 ( 樵)
SQ O O H
イ キ ン(J L)
(H
測定 用キ
2
-
u m e dj a
高松
トは
ッ
翼博士
ナ
フ
( 樵)
シ
コ
K G 2) は ク ラ ボ ウ ( 株)
-
河 野 善 行博 士 より 譲 り受 け た
､
より
より 購 入 し た
そ
､
の
他
の
イ ンタ
｡
ロ
ー
N H E K( B) の メ デ ィ ウ ム
o
試 薬 は 和 光 純 薬 ( 株)
より 購 入 し
た
｡
( 3) 細 胞毒性試験
N H E K( B) 5
上で
×1
3
0
釧 s/
c
時間イ ンキ
48
を加 え て
2 5 dip h
時間 イ ン キ
2 4
e n
-
,
ベ
ュ
z o[i u m
yJt e t r a
℃
37
5% C O
,
2
( P B S)
s a一
in e
,
id
e
イム ノ ア
g/
m
m
( の M TT
ョ
C O
,
湿度 90 % 以
芝,
過 酸化脂 質 ( 1 % E t O H で 可 溶 化 し た S Q O O H )
ン した
細胞 毒 性 を 3 ( 4 5 di m e t h ylthi a z o ト2 y f)
-
-
-
o
( M T T) ア
-
,
セイ
ッ
セ イ ( EI A
ッ
37 ℃ 5 %
､
,
s o l u ti o n
湿 度9 0 % 以上で
2
で 2 回 洗浄 し た 後
a n oJ
/i s o p r o p
m
ン後
シ
ー
ト に 播種 し
ー
6 4)
で
､
免 疫反 応
の
指標 で あ る )L
-
2
6 5)
) で 測 定し た
o
6 4)
( 4) M ¶ ア ッ セ イ
2
ョ
ベ
ュ
bro
の 放出量 を エ ン ザ イ ム
各ウ エ ル に
シ
ー
プレ
‖ を9 6 穴
w e
､
( M ¶ を培地 に 溶解 した も の) を
時 間イ ン キ ュ
べ
2 0 0 ‖[ の M T T
-
シ
ョ
ンした
e x t r a c ti o n
ph
.
s ol u ti o n
o sp
.
h a t e b uff
e re
､
d
(0 0 5 M H C 暮
.
) を加 え 6 0 r p m で 振 と う し な が ら室 温 で 1 時 間イ ン キ
て マ イク ロ プ レ
トリ
ダ ( M o d e 一4 5 0 BJ O R A D 社 製) で 5 4 0 n m
し 下記 の 式 よ り 生 存 率 を 求 め た
.
添加 し
1 0 0 いl
ベ
ュ
.
ー
シ
ョ
ンし
'
-
ー
ー
の
-
,
､
吸光度 を測 定
｡
'
V i a bjh t y( % )
A
ss
..
,
A
c5
..
お よび A
吸光度 を示 す
エ
-
ルをT
-
w e e n 2 0
0 5
･
m
I/J P B S
ベ
時間 イ ン キ ュ
求めた
re a
g
n m
の
･
で 18
m a n s
54 0
6 5 6 6)
1 0 0 いI の A
EH
c
､
b5. .
メ ディ ウム を 入 れ
)
-
s
｡
( 5)J し2 ア ッ セ イ
各ウ
( A s . . A b 5 . . / A 5 . . A b5 . . ) X 1 0 0
は サ ン プル
末照 射 コ ン ト ロ ル お よ び ブ ラ ン ク の
=
e nt
ー
シ
を添加 し
ョ
､
(w
c e ty J c h o
ン した
4 05
o
n m
そ
a s hi n
=n
の
g b uff e r) で 1 回 洗 浄 し
e st e r a s e :
後
w a s
にお ける
｡
-
66
-
[L 2 F
b
hi n g b uff e
a
r
･
ju g
c o n
､
5 0 uJ の
at e
上浦 と
を加 え て
で 5 回 洗浄 し
､
4
℃
2 0 0 りl の
吸光度 を 測定 し 標 晶 と 比 較 し て 濃度 を
結果
3 1 2
-
-
(1) 過 酸 化 脂 質 の 細 胞 毒 性 へ
の
影響
N H E K ( B ) に S Q O O H を添 加 し た と こ ろ
は 6 3 0 LJ M
50
とな
た ( Fi g Ⅲ
っ
1 1)
-
濃 度 依存 的 に 生存 率 の 減 少が 見 られ
､
､
IC
.
-
o
瑠2 5
-
-
o
S Q O OH
-
1 0 0
∼
J
邑
7 5
★ ★
”
ご巴
I
★
P
■l ー
J
★ ★ ★
上白
望 5 0
.
>
★★ ★
2 5
★★ ★
0
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-
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N H E K( B )
D
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1 1
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1 0
c o m c e mt r a モ
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S Q O O 門
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c o n t r o[
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m
P
( 2) 過 酸 化 脂 質 の サ イ トカ イ ン 放 出 量
-
1 0 0
(p
e r o x
p
r o
1 00 0
M)
id
e
c o n c e n
t r a ti o n
o n
f N H E K ( a)
w e re
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1
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0 05
.
4
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,
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P
.
0 01
<
.
.
★ ★★
,
P
<
0 0 01
.
.
影響
の
放 出 量 の 経 時 変化 を 検 討 し た と こ ろ
有意 な 増 加 が 見 ら れ
di n 9 S Q O O H
過 酸化 脂質
､
時 間以 降 は ほ ぼ プ ラ ト
-
67
-
-
の
濃 度依 存 的 に LL
に 達 し た( Fi g Ⅲ 1 2)
-
.
-
.
-
2
放 出量
1 50
★★ ★
-
○
-
c o n t ro I
-
★★★
★ ★★
-
-
◎
1 % E tO H
-
ヽ
′
★★★
”
長
1 00
★ ★★
U)
a
-
.
一
′
1 ■
■■
S Q O O H I O O LJ M
＋
★★★
也
･
-
｢
-
也
切
S Q O O H 4 0 0 LJ M
＋
★★★
付
0
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-
4)
噸ト
S Q O O H 200 H M
ー
ー
S Q O O H 1 0 0 0 LJ M
h
5 0
o1
★★★
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J
■■■ l
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Fig Ⅲ 1 2
-
E ff e
-
･
r el e a s e
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Si g nifi c
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1 2
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2 0
h yd
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2 4
p
2 8
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N H E K( a)
m
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8
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c o n t r ol ,
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-
★★ ★
,
68
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C u
b
a ti o n
ti
c o n c e n t r a ti o n
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-
2
3 1 3
-
-
考察
3 1)
河野 ら
はチャ イ
ニ
-
ズ
ハムス
タ
ー
肺 由 来線 維 芽 細胞 に ジ メ チ ル
ス
ル
フ ォ
キシド
( D M S O ) に 溶 解 し た S Q O O H を添 加 し て 4 8 時 間イ ン キ ュ ベ シ ョ ン し L D 5 0 は 約
2 3 0 リM で あ っ た と 報 告 し て い る
本 研 究 で は N H E K ( B ) で は や や 高 い 値 が 得 られ た
ー
､
｡
が
､
細 胞 の 違 い 等 に よ る も の と思 わ れ る
サイ トカイ ン で あ り
こ とから
た
｡
､
､
rL 2 は 細胞 性 免 疫 に 関 与 す る
-
o
細 胞毒性 が 見 られ な い 濃度 で も I L
S Q O O H 添 加 に より 細 胞性 免 疫 反 応
ま た N H E K( B) を 用 い
､
SQ O OH
の
ルパ
ー
Tl
放 出 量 の 増 加 が 見 られ た
何 ら か の 影 響 の 可 能性 も 示 唆 され
に よ る 細胞 毒 性 や サ イ ト カ イ ン 放 出量 を指 標 と
す る 方 法 が ヒ ト 表皮細 胞 に 対す る 過 酸化 脂 質
示 唆さ れ た
へ
2 の
ヘ
｡
ー
69
-
の
影 響 を評 価 す る 上 で 有 用 で あ る
こ とも
第 Ⅲ章
3
した
｡
､
節
二
次元 培 養 細 胞 へ
前節 で 著者 ら は ス ク ワ レ ン モ ノ
発現す る こ と
第
ハ
イ ドロ
の
影響
ル オ キ シ ド( S Q O O H ) に よ り 細胞 毒 性 が
ペ
及 び 細胞 毒 性 を 示 さ な い 濃度 で も I L
また 正 常 ヒ ト表皮角 化 細胞( N H E K ( B )) を用
い
2
､
放 出量 を増 加 さ せ る
を示 唆
こと
S Q O O H に よ る 細 胞 毒 性 やサ
イ ト カ イ ン 放 出 量 を 指 標 と す る 方法 が ヒ ト 表 皮細 胞 に 対 す る 過 酸 化 脂 質 の 影 響 を 評 価
す る 上 で 有 用 で あ る こ と を示 唆 し た 本 節 で は S Q O O = そ の も の の 細胞 毒 性 へ の 影 響
｡
及 びそ
作 用 機 序 を 明 らか に す る た め に
の
次元 培養細胞 よ り サ イ ズ が 小 さ く
( vit r olif e
響に つ
-
s
ki n) を 用 い
いて
､
S Q O O H
検討 を行 っ た
経 時 変化 を 観察 し た
｡
o
､
よ り 生体 に 近 い と さ れ
､
､
S ki n
2' ”
や他
の 3
安価 な グ ン ゼ 3 次 元 培養 ヒ ト皮膚 モ デ ル
を 添加 し て 細 胞 毒性 及 び サイ トカイ ン 放 出 量
また 細 胞断面 を へ
更 に 抗酸化 剤 を 添 加 し
-
70
マ
､
-
トキ シ リ ン
そ
の
影響に
-
エ
へ
影
の
オ シ ン( H E ) 染 色 し
つ いて
も検討 を行
っ
た
o
､
実験 材料 及 び 方 法
3 2 1
-
-
試薬
vit r olif e
s ki n
-
の
メ デ ィ ウ ム ( D ulb
) は グ ン ゼ ( 樵) よ り
seru m
ン
マ
､
●
e c c o s
ニ
ト
m
difi e d
o
e a
gl e
m
d hi u
e
より
ル ( M A) は 関 東 化 学 ( 株)
ー
F e t a暮b
%
十5
m
o vi n e
購入 し た
､
｡
細胞
グ ン ゼ 3 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( Vit r o[if e
ケ ラチ ノ サ イ ト を 増 殖 さ せ
サイ ト は 存 在 し な
より 小 さ
参照
い
い
m
S ki n
:
と 同様
直径
,
V it r o [if e
o
2 T”
線 維 芽細胞 の 上 に
,
ラ ン ゲル ハ ン ス 細 胞及 び メ ラ ノ
｡
円形 で
の
m
より 購 入 し た
) は グ ン ゼ ( 樵)
.
ki n
角 層 を形 成 さ せ た も の
､
デル は 直径 8
モ
｡
s
-
-
10
s ki n
m
正 方形
の
m
分 化 状態 は Fi g Ⅲ
の
2 'M
の S ki
n
2 3
-
･
-
｡
細 胞毒 性 試 験
vit r olif e
プ レイ ン キ
ki n を 1 時 間
s
-
ベ
ュ
シ
-
ン後
ョ
過 酸化 脂 質 ( 1 % E t O H で 可 溶
､
化 し た S Q O O H ) を表 面 に 加 え て 2 4 時 間イ ン キ ュ ベ シ ョ ン し た ま た は 1 時 間 プ
シ ョ ン後
抗酸 化 剤 を 培 地 中 に 添 加 し 2 時 間イ ン キ ュ ベ シ ョ ン 後
レイ ン キ ュ ベ
ー
o
ー
-
､
､
､
ス ク ワ レ ン ( S Q ) で 希 釈 し た S Q O O H を 表 面 に 加 え て 2 4 時 間イ ン キ
ペ
エ
シ
-
ンし
ョ
細胞 毒 性 を 3 ( 4 5 d i m e th ylt hi a z o ト2 yl) 2 5 d i p h e n ylt e t r a z o li u m b r o m id e ( M T T)
69 )
6 7 68 )
で IL 2 放出量を エ ン
ァ ッ セイ
及 びI a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( L D H ) ア ッ セイ
た
-
･
-
-
1
.
,
,
･
､
ザイ ム イ ム ノ ア
セイ ( E IA ) で
ツ
細 胞 膜脂質
､
ン ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド( P C O O H )
フ ォスフ ァ
,
オキ シ ド( P E O O H ) 含 量 を C し H P L C 法
M Tr ア
5% C O
,
35 3 7)
フ ォス フ ァ
チ ジル
ルア ミ ンハイ ドロ
タノ
エ
で 測 定 した
,
チ ジル
過 酸化 物で あ る
ー
コ
リ
ペ
ル
o
セイ
ッ
各 ウエ ル に2
37 ℃
の
2
m
湿度 90 % 以上 で
,
( M ¶ を 培 地 に 溶解 し た も の) を 1
s ol u ti o n
g/ m l の M ¶
3
時 間イ ン キ
ュ
ベ
シ
ー
ン した
ョ
憾 加し
m
､
リ ン 酸 b uff e r ( p H
o
定 面 積 の 細胞 を ポ ン チ で く り 抜 い た 後 2 m l の M T T
1 の 1 % S o di u m d o d e c yl s ulf a t e
e xt r a c ti o n s o l u ti o n ( 0 0 5 M H C I /i s o p r o p a n o I) と 4 0 い
( S D S ) を加 え 以 降 は 前 節 と 同 じ 方 法 で 測 定 し た
(P B S) で
7 4)
,
回洗浄 し
2
一
､
.
o
､
LD H
ア
各ウ
ホラ
べ
ー
ルに
エ
ゼ
シ
-
セイ
ッ
5 0 いl の
上 浦 と発色試薬 (
N A D / D L 乳 酸 リ チ ウ ム 緩衝液 5 0
-
､
ョ
ン した
o
吸光 度 を測 定 し た
1 し2 ア
トロ ブル
ニ
m
g/
.
b u ff e
_
jug
c o n
r
室温で
1 0 0 リI
添加 し
20 0 5
m
45
57 0
､
n
g/ m I ジ ア
,
分 間イ ン キ
m
にお ける
ュ
セイ
ツ
､
.
､
m
｡
前 節 と 同 様 の 方法 で 行 っ た 各 ウ エ ル を T w
回 洗 浄 し 5 0 H l の 上清 と メ デ ィ ウ ム を入 れ
fab
･
を添 加 し
m ])
そ の 後 反 応 停 止 液 ( 0 5 N H C l) を
e e n
｡
1
テ ト ラ ゾリ ウ ム 0 7 4
ー
a
te
を加 え て 4 ℃ で
で 5 回洗 浄 し
1 8
2 0 0 p I の Ell
,
､
時間イ ンキ
ュ
'
m
､
ベ
｡
-
7l
-
ー
シ
ョ
c e tyJ c
ン した
を添 加 し
w a s
hi n g b uff e
r
h oli n
e s t e r a s e :[
L 2
V P B S(
1 0 0 ul の A
a n s r e a g e n t･
を測 定･ し 標 品 と 比 較 し て 濃 度 を求 め た
･
､
o
405
そ の後
n m
w a s hi n
に お ける
) で
g
吸光度
PC O O H
Vit r o =f e
,
pp
の b
m
めた
o
-
u
s
P E O O H
含量 の 定 量
ki n に 1
m
叫h y d
同様
に もう
濃縮乾 固 した
/mI の^
o
ラ
r o x
ニ
o
ト
一
f の P BS と 2
yt o l u
含有)
e n e
度 操作 し
､
ノ
ー
l の 冷ク
を加 え
集 め たク
こ れ に 1 0 0 りl の
ロ フ ェ
m
ク
ロ ロ
ル を 含 む)
､
ロ ロ
ロ ロ
ホ ル ム:2 プ
-
72
､
-
ロ ^
o
/
こ れ を遠心
し て 得 たク
ホル ム層 を
ロ
ホ ル ム: メ タ ノ
を加 え
-
ー
こ の 10 =
ー
タリ
ル ( 1 :1
ほ C
v/ v
,
ー
,
-
ロ ロ
エ
,
v /v
10
,
ホ ル ム 層 を集
ボレ
バ
ー
内標 と し て
L H PL C
-
ル ( 1 :1
で
夕
-
で
100 ug
定量 し た
.
3 2 2
-
結果
-
S O O O H の
細胞 毒 性 や サ イ トカイ ン 放 出量
の
へ
N H E K ( B ) よ り 生 体 に 近 い と 思 わ れ る Vit r o [if e
した と
ころ
､
s
-
影響
ki n に 0 1 0 0
濃度依存的 に 生 存 率 の 減少 が 見 られ た( Fi g Ⅲ
.
-
M の S Q O OH
m
-
2 1)
を添 加
-
.
1 5 0
-
貫l
ヽ
-
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S Q O O H
Fig Ⅲ 2 1
-
E ff e c t
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.
diff e
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-
.
に 達 した ( Fi g Ⅲ 2 2)
-
.
4
､
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ki
S
of
f ro
時 間 後 に 細胞 毒 性 が
化 を検 討 した と こ ろ
q
s
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1 0 0
c o m c e n t r a ti o m
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n e
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,
未満とな る S Q O O H
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0 0 01
100
･
m
M
I
添加時
時 間 後 よ り 細胞毒 性 の 増 加 が 見 られ
-
o
-
73
-
､
の 細 胞毒 性 の
8 時 間後 に ほ
経時 変
ぼプ ラ ト
ー
1
0
.
-
0 S
-
-
-
◎
S Q O O H 1 00
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､
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こ ろ
2 4
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o n o
t o fp
c o nt r ol
更 に 細胞 断面 を H E 染 色 し た と
皮 の 細 胞が 丸 く 小
1
( Fi g Ⅲ 2 3)
2 0
r el e a s e
e n a s e
±S D
1 6
1 2
､
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2
2 8
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-
74
-
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★ ★ ★
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0 00 1
.
8 2 4 時 間 後 には 真 皮 細 胞 に も 同 様 の
,
( h r)
c o n c e n t r a ti o n
時 間 後 に 角 層 に 変化 が 見 ら れ
-
e
.
､
4
時 間後 に 表
変化 が見 ら れ た
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時間後
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S Q O OH
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1
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,
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-
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4 h r ( d) 8 h
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in
is
.
の IL 2
-
放 出量 を 検 討 し た と こ ろ
有意 な 増 加 が 見 られ た( F ig Ⅲ
.
-
2 4)
過酸化 脂質
,
-
｡
-
75
-
の
i
￣
濁声
-
,
r
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Fig / Ⅲ 2 3 E ff e ct
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濃 度 依 存 的 に ル 2 放 出量
ー
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w a s
p pli e d t o
a
.
トカ イ ン 放出量 及 び P C O O H
,
PE O OH
含 量 に対 す る 抗 酸化
剤の 影響
S Q O O H
の
細 胞毒性
用 い て 各種抗 酸 化 剤
( ＋) カ テ キ ン ( C
-
A T C)
へ
の影
､
の
自動酸化 反 応 の 関与 を 明 らか に す る た め に V it r oJ Jf e
･
響 を検 討 し た と こ ろ
還 元 剤で も あ る ア ス
胞毒性 の 有 意 な 抑制 が 見 られ た ( Fi 9 Ⅲ
.
-
コ
2 5)
-
-
､
76
0
-
ラ ジカ ル ス カ
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の M A
-
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を
及び
ル ピ ン 酸 ( V C) 添 加 時 は 2 4 時 間 後 の 細
□
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m
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w
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V it r
aJ n St
g
S Q O O H ＋V C l m M
.
-
●
o x J c it y
w a s
S Q O O H ＋C A T C 3 4 LJ M
M
m
o ず a n ti o x i d a n t s
s
'
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r a
m
SQO O H IOO
m
g a ti v
hi c h
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c o n t r ol ,
w e re
a n n it o l ,
a
VC
を検 討 した と こ ろ
M g
-
77
-
<
,
.
VC
p
' '
0 0 01
.
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,
'
,
S Q
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CATC
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=
､
m
e n
P
<
0 00 l
.
.
.
.
.
M A
添加 時 に I L
-
2
放出 量 の 有意 な
抑制 が見 られ た ( Fi g / Ⅲ
ろ
C AT C
､
V C
,
-
2 6)
なお
-
｡
抗酸 化 剤そ の も の
､
影響 に
の
M A そ の も の は今 回 用 い た 濃 度 ( そ れ ぞ れ 3 4 u M
,
m
存 率 及 び ル 2 放 出 量 に 有意 な 影 響 を 与 え な か っ た ( デ
タ は 示 して
い
M 10
1
.
ー
検 討 した と こ
つ い て
,
な
い
o
M) で 生
m
,
)
o
口
fL 2 2 4 h r
M
S Q O O H ＋M A 1 0
-
1 2
1 0
音
##
8
ー
Cn
a
ヽ
′
-
0
諾
6
4)
-
￠
1
一
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-
4
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★ ★★
2
★★ ★
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.
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.
0
n e g a ti v e c o n tr o l
Fig
ind
･
Ⅲ
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V it r olif e
24 h
D
2
･
-
6
E ff e c t
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-
･
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M A
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S Q O O H 1 00 m M
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-
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SQ O O H
.
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Q O O H
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V C
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.
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0 05
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.
'
,
'
'
P
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0 001
-
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に 1 0d
m
M
-
の S Q O O H
78
-
.
.
,
.
a cid
P
'
,
,
n
.
d
.
d ete ct e d
自動 酸化 反 応 に よ っ て 生 成 す る 細胞膜脂 質 の 酸化 の 細胞毒性 へ
らか に す る た め に V it r olif e
m
.
の
関与 を 明
存在 下 C A T C を添加 し
､
24
時
間後 の P C O O H
P E O O H 含量
ル と 同程 度 に な
ー
影 響 を検 討 し た と
の
へ
含 量 が 有意 に 増 加 し た が
PC O O H
ントロ
,
S Q O O H 添加 時に
､
C A T C 添 加 時 で は こ の 増 加 が 顕 著 に 抑制 さ れ
､
た ( F ig Ⅲ
っ
ころ
･
-
2 7)
PEO O H
-
0
含 量 は 検 出限 界 以 下 だ っ た
□
pc o oH
､
o
c o nt e nt
7 0 0
訂
`L
T6
6 0 0
★ ★
≡
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5 0 0
o
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3 0 0
2
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Ⅲ 2
･
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E ff e
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Vit r o ‖
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7
-
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Si g nifi c
a n tly
diff e r e n t f r o
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p
m
M
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c o nt e n t
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79
m
-
＋C
ATC 3 4 p M
.
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･
S
ki n
<
0 01
.
.
w ith o u t
S Q O O H 100
-
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S Q O O H
S Q O Oり
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,
##
P
' ★
,
<
P
0 01
.
･
.
･
コ
考察
3 2 3
-
-
V it r o (if e
ki n の J C 5 0 は N H E K ( B ) の 約 1 0 0
s
-
L
角層 が あ る た め
濃度で もJ L
放出
の
活 性化 が 関 与 し て
61 )
河野 らは
添加 し
見 られ た
機能に よるも の と思われ る
い る こ
o
S Q O O H に よ る )L 2
と も 考 え られ る
ヒ ト皮 膚 再 構築 モ デ ル
とか ら
こ
-
s
い
ki n の
時 間 後 よ り 真 皮 細胞 に も 細胞 毒性 が 発 現 し た
や M A 及 び V C 添 加 時 に 細胞毒性
e
､
q ui v a[ e h t
-
s
kj n の
今 回用
が小 さ く
い
､
こ
安価で ある
-
か と思 わ れ る
一
o
方
､
s
ki n は S k i n
とか ら
2 T ”
や他
ー
ゼ A2
TM
.
の 3
S Q O O H
,
き 皮膚細胞 に 障害 を 与 えた と 推定 し
表皮細胞 に 細胞 毒性 が 現 れ 始 め
の 有 意 な 抑制 が 見
とが 示 唆 さ れ た
'
た V it r o JJf e
パ
(L S E ) に S Q O O H を
また ラ ジ カ ル ス カ
｡
細 胞 膜脂質 を過 酸 化 し
間後 よ り 細胞 毒 性 を 発 現 す る
には
ki n
時 間後 で は 顕 著 な細 胞 毒 性 が
2 4
られ
増 加 した P C O O H 含 量 が C A T C 添 加 に よ り 抑制 さ れ た
S Q O O H が V it r olif e
s
S Q O O H 添 加 に より サ イ トカ イ ン
､
S Q O O H の 透 過 に よ り 細胞 毒 性 が 発 現 し た の で は なく
､
-
｡
の L J vi n g s ki n
本研 究 で も 4 時 間後 よ り V it r o =f e
o
V it r o ‖
fe
細 胞 毒 性 が見 られ な い
｡
･
由 来 の ラ ジ カ ル が 自 動酸化 反 応 に よ り 伝播 し て
てい る
.
放 出量 の 増 加 に ホ ス ホ リ
-
時 間 後 で は 細 胞 毒 性 が 見 られ な か っ た が
4
､
ヤ
ー
放出量 の 増 加 が 見 ら れ た こ と か ら
の
響 も 示 唆さ れ た
の影
へ
2
の バリ
角層
､
倍 と 抵 抗性 を示 し た
､
｡
,
ベ ン
ジャ
ー
､
8
の C A T C
S Q O O H 添 加 に より 有 意 に
以上
の
知 見 か ら添 加 さ れ た
自動 酸 化 反 応 に より 伝播 し て
4
時
｡
次 元 培 養 ヒ ト皮 膚 モ デ ル よ り もサ イ ズ
過 酸化脂 質 の 影 響 を 評 価 す る 上 で よ り 有 用 で は な い
N H E K( B) は 更 に 安 価 で 使 い や す い 反 面 角 層 が な い た め に 過
こ
､
､
酸化脂 質 の 影 響 を 評 価す る 上 で 生 体 に 比 べ て 感 度 が 高く な っ て し まう と い う 欠 点 が あ
る ことが示唆されたた め
こ れ ら を 考 慮 し た 上 で 評 価 法 と し て 用 い る こ と が 必 要 と思
､
われ る
と か ら ヒ ト表 皮角 化細胞 や グ ン ゼ 3 次 元 培養 ヒ ト皮 膚 モ デル を 用 い
S Q O O H 添 加 に よ る 細 胞毒 性 や サイ トカ イ ン 放出 量 を 指標 と す る 評価 法 が こ れ ら の 細
o
以上
の こ
､
胞 に 対 す る 過 酸化脂 質 の 影響 を評価 す る 上 で 有 用 で あ る こ とが示 唆 さ れ た
-
80
-
｡
小括
細胞毒 性 へ
評価法 に つ
関与が 明らか にな
の
い て検討する
存 率 の 減少 や J L
細胞 毒性
見 られ た
これ
の
2
､
､
の
もの
の
放出
増加 に 先立
っ
､
-
細 胞 膜 中 の 過 酸化 脂 質 含量
細胞膜脂 質 の 過 酸 化
て IL 2 の
･
放出
生 体 影 響 及 びそ
の
Vit r o lif e S ki n に S Q O O H
ま た 各 種 抗 酸化 剤 の 影 響 を 検 討 した
o
､
｡
v]tr o
細胞
､
細胞 の 形態 学 的変化等 を 指
そ の 結果
細胞膜 脂 質 の 過 酸 化
､
を添 加 し
､
濃度依 存 的に 生
細胞 の 形 態 学 的 変化 が 見 ら れ
､
･
の in
､
､
また
細 胞 の 形 態 学的変 化 が
｡
より U V 照射 に よ
PC O O H
た SQ O OH そ
た め に N H E K ( B)
毒 性 や サ イ トカ イ ン 放 出 量
標 と し て 検 討 した
っ
っ
て 表 皮 に 生 じた S Q O O H が 自動 酸化 反 応 に よ
な ど め 細胞膜 脂質 を過 酸 化 し
､
細胞 の 形 態 学的変化 を 引 き 起 こ し
傷害 が 真皮 の 線維 芽 細 胞 に 達 し て 細胞 毒性 を引 き 起 こ した
て増 大し て
っ
､
こ と が 示 唆さ れ た
それらの
ま た細
毒
を
き
こ
さ
い
胞 性 引 起
な 濃度 で も S Q O O H に よ り サイ トカ イ ン 放 出量 の 増大 が 起 こ る
こ と が 示 唆さ れ
た
｡
ま た ヒ ト表 皮角 化細胞 や グ ン ゼ
3
｡
次元 培 養 ヒ ト皮膚 モ デル を 用 い
､
S Q O O H 添 加 に よ る 細胞毒性 や サ イ ト カイ ン 放 出 量 を 指標 と す る 評 価 法 が こ れ ら の 細
胞 に 対 す る 過 酸化脂 質 の 影 響 を 評価 す る 上 で 有 用 で あ る
-
8l
-
こ
と も示 唆さ れ た
｡
総合考察
■
紫 外 線 の 生 体影 響 に 関 し て は こ れ ま で 様 々 な 報 告 が な さ れ
影 響に
か
た
っ
て注目され て い る が
つ い
､
特 に ∪V A に 関 し て は 報告 が 少 な く
いて
生 体影 響
ス フ
ァ
'
の in
チ ジル
コ
リ ンハ イ ドロ
ペ
ウサ ギ赤 血 球 を 用 い
生 体影 響及 び そ
の
評価法
v /t r o
ル アミ ン ハ イ ドロ
につ い
の メ
て 検 討 した
ペ ルオキ シ
ル に達 し て 溶 血 を 引 き 起
い る こと
してお り
した
m
o
方
っ
タノ
生 体 膜 モ デル と し て 用
い
られ る
そ
､
の
溶血 率 や P C O O H
結果
PEO O H
,
U V A 照 射時 の
､
､
溶血 の
一
こ
と を 示 唆 した
捌旨質 の 過 酸化 の 機 序 に つ
ヒ ト 表皮 の 酸 化 の 第
ンモ ノ ハ イ
ドロ ペ
の
一
｡
これ
より ∪ V A
生体影 響 に
の
へ マ
に より 生 じ た 膜脂 質 の 過 酸化 が 関与 し て
2
ネル ギ
エ
も関与
ー
U V A と は 異 な る 機序 によ る 可 能性 を示
､
P G E
､
タ
ー
いて
更 に 明 ら か にす る た め
ゲ ッ ト とさ れ る ス ク ワ レ ン ( S Q )
ル オ キ シ ド( S Q O O H ) に 着 目 し た
養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( S K I N
2' M
) を用
い
｡
唆
酸化脂質 含 量
､
も
の
皮脂 腺 よ り 分 泌 さ れ
,
の
H P 存 在 下 ∪V A を照 射 し
､
過 酸化 物
､
発現 に ∪V A H P 増感 に よ っ て 生 じ た o
次元培
3
｡
そ
の
細 胞膜中 の 過
､
結果
､
細胞毒性 の
に よ り 皮表 に 生 成 した S Q O O H が 自動酸化
-
2
反応 に より P C O O H な どの 細月割莫脂質 を過 酸化 し て 細胞 の 形 態学 的 変化 を 引 き 起
そ れ ら の 傷 害 が 真皮 の 線維芽 細胞 に 達 し て 細胞 毒 性 を 引 き 起 こ し た
ま た 細胞毒 性 を引 き 起
2T ”
が UV A
唆 した
を用
の
｡
い U V A
-
こさ
な
い
レ
｡
細胞 の 形 態 学 的変 化 等 を 指標 と し て 検 討 し た
1
､
細 胞毒 性 や S Q O O H
生 体 影 響 を 細胞毒 性 や サイ トカイ ン 放 出 量
の の
の スク ワ
そ し て よ り 生 体 に近 い
放 出 量 等 を 指 標 と し て 生 体影響 の 評 価 を行 っ た
2
更に S Q O O H そ
S K]N
-
､
自動酸化 反 応 の 関 与 は 少 なく
､
エ
U V B の 生 体影 響 に は U V そ の も の の
､
の フ ォ
ジル
､
｡
フ ォスフ ァ チ
e
増 感 に よ り 生 じた o
一
た
生体膜 脂質
､
Ⅱ 反 応 に よ り生 成 し た o 2 が 膜 脂 質 を過 酸 化
て 増大し P E O O H 及び P C O O H 含量が ある
定 レベ
jo r T yp
a
した
こ
っ
そ れ に 基づ
､
｡
次に
含量
点が多
の
1
1
リ ン ( H P)
を示 唆 した
た め に まず
の
光 増感物 質存 在下 ∪V A を照 射 し
､
そ れ が 自動 酸化 反 応 に よ
フ ィ
そ
ル オ キ シ ド( P E O O H ) に 着 目 し
機 序 と し て ∪∨ 照 射 に よ る
トポル
o
カ ニ ズ ム を 明 らか に し
ド( P C O O H ) 及 び
含 量 等 を 指 標 と し て ∪V B 照 射 時 と の 比 較 を行
､
不明
､
の
へ
｡
著者 ら は ∪ V A 及 び U V B
し
最近 で は 免疫 反 応
､
こ
こ
し
と を 示 唆 した
濃度 で も サ イ ト カ イ ン 放 出量 を増 大 さ せ る
こ と
､
､
｡
及び
H P 増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生 成 や 細胞 毒 性 等 を 指 標 と す る 試 験 法
光毒性 及 び U V A 防 御 剤 の 評価 法
の
良 い 加 vitr o モ デ ル に 成 り 得 る
更 に ヒ ト 表皮角 化細胞 や グ ン ゼ 3 次元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い
､
こ
と を示
SQ O O H
添 加 に よ る 細胞毒 性 や サ イ トカ イ ン 放出 量 を 指 榛 と す る 評価法 が ヒ ト 表皮角 化 細 胞 や
グ ン ゼ 3 次元 培 養 ヒ ト皮 膚 モ デル に 対 す る 過酸化脂 質 の 影 響 を 評 価 す る 上 で 有 用 で あ
る こ と も示
唆した
｡
,
-
82
-
土 誌
蘇ロ
1) U V A の
い る こ
ロlコ
生 体影 響 に H P 増 感 に よ り 生 じ た 1 o
とを示唆した
的 変化 を 引 き 起
こ
o
そ して
この S
2
に よ り 生 成 し た S Q O O H が 関与 し て
Q O O H が 細 胞膜脂 質 を 過 酸 化 し
し て 細 胞 毒 性 を発 現 す る
こ と及
び 細 胞 毒 性 を 引 き起
もサ イ ト カ イ ン 放 出量 を 増大 さ せ る こ と を 示 唆 した
2) ∪V B の
生 体 影 響 に は ∪∨ そ
関与 は 少 な く
3) S K f N
2' ”
､
も
の の エネル
ギ
ー
や ウ サ ギ 赤血 球 を用
の
い U V A H P
-
形態学
の
こ さな い
濃度
で
｡
も 関 与 して お り
∪V A と は 異 な る 機 序 に よ る 可 能性 を示
指標 と す る 試 験 法 が U V
を示 唆 した
の
細 胞膜
､
唆 した
､
自動 酸 化 反 応
の
｡
増感 に よ る 過 酸 化 脂 質 生 成 や 細胞 毒 性等 を
光毒 性 及 び U V 防御 剤 の 良 い i n
･
v /t r o
評 価 法 に 成 り得 る
こ と
｡
4) ヒ ト表皮 角化 細胞 や
グ ン ゼ 3 次 元 培養 ヒ ト皮膚 モ デル を用 い S Q O O H 添 加 に よ る
細胞毒性 や サ イ トカ イ ン 放 出 量 を 指 標 と す る 評 価法 が こ れ ら の 細胞 に 対 す る 過 酸化脂
質
の
影 響 を 評価 す る 上 で 有 用 で あ る
､
こ
とも示唆した
-
83
-
｡
謝辞
終わ りに 鑑み
本 研 究 の 機会 を 与 え て 頂 き
､
国立 医 薬 品 食 品衛 生 研 究所
医薬 品 添 加 剤 協会
第
二
室 長)
また
環 境衛 生化 学 部
の
作製 に あ た り
P C O OH
､
PEO OH
･
助言 を 頂 き ま し た
､
同徳永 裕司 第
､
の
東 北 大 学 農 学 部教授
社 基 盤 研 究 本部 素材 開 発 セ ン タ
室長
､
環 境衛 生 化 学 部
本 論文 の 御校 閲 を 頂 き ま し
､
鈴 木 和 夫 博士 に 深謝 致 します
標 晶 を 御提 供 頂 き
御提供頂 き ま し た 前 資 生 堂株 式会 社
二
｡
御 指 導 と 御助 言 を 頂 き
､
た 千 葉 大学 大学 院薬学 研 究 院教 授
また
安藤 正 典 部 長
木 嶋敬 二 博 士 ( 前 国立 医薬 品 食 品 衛 生 研 究 所
に 心 か ら 感 謝 の 意 を表 し ま す
本論文
､
多大 な る 御 指導 と 御 助 言 を賜 り ま し た
､
､
C し= P L C 法 に よ る 測 定 に 関 し て 御
宵滞 陽夫 博士
安全 性
･
o
な らび に S Q O O H
､
分 析セ ン タ
ー
所長
高松
標品を
の
翼博 士
､
同
素剤 開 発 研 究 所 所 長 河 野 善行 博 士 及 び S t D を
き
ま
し
御提 供頂
た 日 本化粧 品 工 業 連 合 会 技術 課 長 高 野 勝 弘 氏 に深 謝致 し ま す
ー
､
｡
'
Vit r o[ Jf e
究所
朗
-
s
ki n の
細胞 断 面 の 標本 を 作製 し
病 理 部 主 任研 究 官
博士
､
小 野 寺 博志博士 を始 め
同 生 薬 部第 二 室 長
た 各位 に 感 謝 い た し ます
写 真 を 撮影 頂
､
河 原 信 夫 博士
｡
-
84
-
,
､
い
た 国立 医 薬 品 食 品 衛 生 研
同 機能性 化学部第 二 室 長 . 斎藤嘉
本 研 究 に 御協 力及 び 御助 言 を頂 き ま し
参考文献
津敬
1) 野
Ch
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太 陽 紫外 線 (U V A
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一
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槍枝光 太 郎
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山 口 由起子
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害 太 陽 紫 外 線 の 絶 対 線量 計
市橋 正 光
つ い て
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温
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る ヒ ト 皮 表 脂 質 過 酸化 物 の 定 量 ( 第 2 報)
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5 7) 小 山 和夫
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中 山 情実
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佐 田雅 宏
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小 西宏 明
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紫外 線 B 波 照射 に よ る 皮 膚 障害 に 対
:
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香 粧会
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福 井守 正
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化 学発 光検 出器 を 用 い た H P L C に よ
:
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抗 老 化化 粧 品 の 展 望
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試験 法 ( 日 本 組 織 培 養 学 会 編)
東京 ( 1 9 9 1)
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朝倉 書
主 論 文 目録
本学位 論文 内容 は 下 記
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尭表論文 に よ る
の
安藤 正 典
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脂質 生 成 と赤 血 球 の 溶血 反 応 と の 関 連
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徳永裕司
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安藤 正 典
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本 学 位 論 文 の 審 査 は 千 葉 大学大 学 院薬 学 研 究 科 で 指 名 さ れ た下 記
行われ た
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主査
千 葉 大学教授 ( 薬学 研 究 院)
薬学 博 士
鈴木 和 夫
副査
千 葉 大 学教授 ( 薬 学研 究 院)
薬学 博 士
今成 登 志男
副査
千 葉 大学教 授 ( 薬 学 研 究 院)
薬学 博 士
上 野光
副査
千 葉 大学教 授 ( 薬 学 研 究 院)
薬学 博 士
堀江 利 治
副査
千 葉 大学教 授 ( 薬学 研 究 院)
薬 学博 士
矢野真吾
-
93
-
一
の 審査 委 員 に よ
っ
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温度スイッチ E-MQT

スライド 1

可視光の生体への影響を明らかにすることは、可視光の新たな利用法の

GC DIFF - ジーリンクシステムコンサルティング株式会社

ダウンロード - こども未来へのかけはしin所沢

原案・問題文 : 西村 解答 : 西村・田村

CSC-10G 電流センサー

CRC-00型 電流センサー

クイズの前に・・・ちょっとした知識

外用薬による光アレルギー性接触皮膚炎の症状 光線過敏症を起こし