紫 外 線 の 生 体影 響 と そ in vit110 の 評 価 法 に 関す る 研 究 2002 内野 年 正 目次 略号 - 緒言 - ウ サ ギ 赤血 球 に 対 す るU 第Ⅰ章 第 第 V 光増 感 の 影 響 一 節 U V A 増 感 に よ る 溶血 反 応 節 U V A 増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生成 一 二 第四節 U V B 増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生成 次 元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル に 対 す る U 策 節 U V A 増 感 に よ る 細胞毒 性 節 UV A 第 一 二 J \マ トポ ル フィ リ ン増 感 の影 響 2 40 - 「 第 第 56 - 過 酸化 脂 質 そ 節 一 二節 の 単層培養細胞 もの へ 3 次 元 培 養 紳胞 の へ の 培 養細 胞 の へ 影響 の 影響 64 - 65 - 影響 1 総合考察 - 81 82 - 結語 謝辞 1 参考 文献 - 主論 文目 録 - - 1 - - 一 一 一 - - - 70 - 小括 - 63 - 第Ⅲ章 - 48 - 小括 一 4 ト 1 放出 - 39 増感 に よ る 過 酸 化 脂 質 生 成 U V A 増 感 に よ るP G E 第 三節 V A 9 33 - - 3 - 25 - 小括 第Ⅱ 章 4 18 - U V B 増感 に よる溶血反応 - ベト - 策 三節 2 83 84 85 92 - - - - - - - 略号 本論文 で 使 用 し た主 要 な 略 号 に つ 1 . . : ultr a vi ol e t 2) U V B : 3) U V C : A (3 2 0 u ltr a vi o l e トB (2 8 0 utt r a vi o] e t C (-1 9 0 過 酸化 脂 質 . l) P C ph : 3) P E ph : 5) S Q q : s ph : RS : 8) トB s u a] e n e q t b : - n m ) 2 80 - n m ) e la a n o m o n o a r bit u ri c u ty ) h y - , U VB 3) S t D : Sta a - thy 川 dih y d ' 2 2 : : in m hyd e ro e r o x id e p e h yd a n ol a m in hy d r o p e r o xid e e ro d p e r o x id e r e a c ti v e s u b st a n c es e r o x id e p ro a cid n - 4 4 s u n s cre e n d a rd y] 3 % e x ro xy s a m 4 I b - , - di pl e D of - - 4 ' - et m h o xy u ct s a m prod u ty I - ' , p e n z o 2) C A T C : ( +) c at e c - 3) H i s : hi s tidi n 4) M A : m 5) S O D : 6) S o t: 7) V C . d h yd u ty l a t e b : hi ro x y t ol u dib f a cto e n z o e n e n e a n nit o】 s u p e r o xid e s o rbit o di s m ut a s e I : a s c o r bi c a cid 試薬 1) D M S O : di m eth y[ ph e n o n e 1 5 - s ulf o ni c a cid p 一e A r o t e cti o n eth o xy m b 抗酸 化 剤 . l) B H T 5 320 p h a ti d y [ e t h - A 2) S 4 ) 紫外 線 吸収 剤 . 1) D D S e n m p h a tid yl c h o li n 2 th i o b O O H u o s 400 - u al e n e : - o s - 過酸化物 、 h a ti d y l e t h o sp 6) S Q O O H 7) T B A - 脂質 、 ph : 4) P E O O H - p h a tid y[ c h oli n o s 2) P C O O H 3 。 紫外 線 l) U V A 2 記載 し た いて s ulf o xid e - 2 - r of y[ m UV A eth a n e (p 5% - m eth o x ) y ci n n a m ic a cid 2 - 2) F A D : 3) F M N : vin : 5) lL i n t e rl e 6) L D H 7) 8 : e M O P: 8 - - NPP 1 0) P 巨s l l) P G E 1 2) RF 6 . p : P : s o ps e n a s e o ra e n o lp ph p h a t e b uff e o s r O St a [e n ト2 yf) 2 5 di p h 9 1a - - , o s ph ate d s a= n e re di n E n h - (p H e n ylt e t r a Z oli u bro m m id e 7 4) . 2 bi n d iu d od m e c yl s u [f a d e r e c o n stit u t e : 2) N H E K ( B ) : 3) S ki n 2T ” そ の e - te - g di h u m p id e a n e n si o n a [ m u n z e e r m pid e r m is k c u[t u r e th re e in e s c e n c e - is di m d h e r a ti n o c y t e s u m a n s ki n c ult u r e e n si o n a l d h m o d el u m a n s ki n m o d el 他 - : re e s ki n : 1) C L H P L C 2) H E al n o r m th : 4) Vit r o =f . g 細胞 1) E P t S K[ N 7 n it r o - ro e t h y lt hi a z o - , ph 2 h yd e ( 4 5 di m : h y ri n eth o xy m - : rib o f[ a 1 3) S D S o rp ki n - : u c( e o tid e o n o n u c l e o tid e [ a cta t e d 8) M T T : 3 9) p u di n e nJ n e m top m a ' d a f[ a vi n 4) H P : h fJ a h 3) S P F : : a e m a s u n ch e m to x iJ u yli n p r o t e cti o m a n n d hi g h p - げo e e o si n fa ct o r - 3 - r m a n c e li q uid c h ro m at o g ra phy 一 描 太 陽 か ら 放 射 さ れ る 紫外 線 は 波 長 (U V A) u lt r a vi ol e t 、 - B (2 8 0 に 分 類 さ れ る( Fi 9 1 ) つ 320 - n m _ ゝ ー _ . . . . . . . . .一 ■. 一 _ F 了 も の か ら順 に u lt r a の長 い ) ( U V B) ult r a vi o l e t 、 - C viole (1 9 0 - トA (3 2 0 280 n m ′ ヽ ′ ∫ ヽ ヽ ヽ ′ ヽ ′ I ヽ ヽ ヽ ′ ノ ヽ ′ ヽ ■■ ヽ ∫ ヽ l ■ ヽ ヽ ヽ 奄甑 e s u m ′ ′ ヽ ヽ ′ ノー ヽ ヽ ′ ′ ′ ′ ∫ ′ ′ ヽ / . I ヽ 0 菅盈 y 3 電甑 e 2 9 0 b a ra γ o r s y d b y 喜X ra b e 0 3 la y 電意g 醜電 m n 4 0 0 T  ̄  ̄  ̄ l ' . - _/ 2 9 0 - 5 1 6 1 % r a ti o g y: 7 6 0 m v i s ibl e li g h t 醐… W e n e r  ̄ n e r y  ̄ e 『 s u 閃 . 8 % n m ]R 4 2 . 1 O/o .  ̄ ' r s 。 r 9 ' ・ ・ ・ ・ ー ; f P g 占 'a y 2 8 0 n m ・ b a n m e r 3 2 0 m 4 0 0 m ・ ・ . . U e n e r Fi g l T u V V gy C ”V B r a ti o in th 0 e s u n . 5 % 監題 V 5 】 rL g h t - 4 - 6 % A m 4 00 ) (U V C) 。 . - m n m ) の3 この うち つ い る い る 影 響は 小 さ メラ 1 2) 。 8) る通 り ラ 、 より 方 リ ン 、 プテ リ ン 等 フィ ヘ の の 1 3) 紅 斑( s - 、 はU V B に 比 1 7 1 8) 皮膚 癌 の 誘 発 、 動物 や の い る 、 て べ u rn の影 響 リ ン( H P ) 等 の ポ ル の低下 1 4) 、 た 。 っ しわ 、 生体 しかし 、 1 5) 形成 の の ヘ 、 こ る こ とが 報 告 さ れ 評価 は 上 記 の 、 こ す こ と も報 の で 少 なか べ 7) 誘発 の の 動物愛護 、 、 報告 に も あ の観点か ら 、 o リ ン類 フ ィ 等 を起 が低 い ー 等 が起 ・ 白 内障 、  ̄ ネルギ エ ゼ活 性 ー てい る っ  ̄ 単 独 に よ る 活 性 酸素 生成 V A 吸収 極 大 を に n m 4 6) ) 形成 ヒ トを用 い て 主 に 行 わ れ て き た が 、 フィ 関与が注 目されて b 免疫抑制 , れ ま でU V A こ 。 60 1 0 1 3) 1 9) 免疫 抑制 、 ズ ム に 関 し て はU プテ リ ン類 u n 1 9 2 0) ・ 評 価 法 の 確 立 が急 務 と な ニ は2 いU V B を 形 成 し て D N A 損傷 を 引 き 起 こ す こ と が - U V A 照 射 に よ り 細 胞 内カ タ ラ トポ ル へ マ が高 U V A が地 表 に 到 達 す る 紫 外 線 、 生 体 影 響 に 関す る 報 告 はU V B に 比 、 が示 唆 さ れ て そ の メカ 、 られ 沈着 2 1) VA れ ま でU こ 1 6) Vitr o そ の 影 響 のI n マ 他 に 皮膚 癌 の 誘発 、 、 ト等 ッ r 一 方 . 光 老 化 と の 関連 ネル ギ エ ー 植物 プ ラ ン ク ト ン の 成 長 抑 制 、 一 ン 色素 の ニ U V A より 0 ビ リ ミ ジ ン ダイ 、 い と考 え の研究 に ') い る この - 強度 低 下 の 告されて 最近 は オ ゾ ン 層 に 吸収 さ れ 地 表 に は 届 か ず D N A に 吸収 さ れ 知 られ て 毛髪 ■U V C 以 上 を占めて の9 0 % も 、 リボ 、 外に の プ コ 、 ビ ン( R F ) フ ラ ロ ポル 葉酸 、 、 N A D H 等 の 生 体 内光 増 感 物 質 を 介 し た 間接 作 用 の 生 体 影 響 、 いる 2 2 2 3) も , の の 3 詳 細 は不 明 で あ る 、 1 0 0 2 。 2 l一 h T y p lS C レ 1 ら S ■■ ■■■■■ 3 - Ⅱ e S 盟 R H m ] n O r T y p R R ・ , + M { R I e 。 S S M  ̄ ・ , し _ 0 。 S h レ , a P h ot o s e n siti z e r pa of n li g h t; I S C i n t e , e x cit e d ); S r all e l of si n gl e t st at e ph o 丸 o H g; S c r o s si n s pi n u n d ・ , s t at e h y d r o x yl ra s e n siti z e r , p ai r e d); s s e n siti z e r s e m i re d u c e d fo r m (f r e e ra - gro k ・ ・ ・ n s iti z a ti o n to se ct r o n - A ・ ・ 3 s ・ - m ol e c ul a r o x di c a l yg e n 2 ' ' ・ r sy ste m ( el e 2 ・ - y 0 2 。 ・ ・ a s s w a H J ● ・ ・ p 2 し ・ e a c ti o n S M プ 2  ̄ 2< Y ', S ・ ・ R 2 . ー ・  ̄ 0 S M ・ ら Fi g 2 盈B ⑳ 『 m (t ri pl e t) ; 0 I 2 , . - 5 - S u P , e r O Xi d e ro u n d ti z e r t ri pJ e t 亨 2 , Si n a ni o n gl e t ra o xy 1 ); s s t at e s e n s 1 d L C al) ; o (g g st at e S e n; di c al; O H o ・ , ・ ( s pi n 空, 光増 感 と は光が 基 質 に 直 接吸 収 さ れ る の で は なく れ そ の 後 吸 収 さ れ た光 、 主 として2 ネ ルギ エ 経路 に 分類され つ の 基質以外 、 2 2 2 4) T yp ・ 、 に 励 起 さ れ た 光 増 感 分子( S ) が 電 子 移 動や 水 素原 子 移 動 を 伴 ジカ ル( O H パ ー ・ ー オキ シ ドア 良く な い が ス この 、 に より る 2 5) オキ シ ドア ー よう に して発 生した o ポル フ ・ こ とが報告 ィ リ 、 生体影 響 に 関 して は の 2 l T yp r が生 成 す る 方 一 でo い 発 生 を確 認 し の こ と を示唆 紫 外 線等 、 2 し た笠 ら の 報 告 2 7 29 )  ̄ 注 目さ れ て い る 嘗滞 ら 。 るホス フ ァ チ ジル 量 を 化学 発 光 - H P LC 患者で は増 加 す る ホス 、 を報 告 し て た め酸化 さ れ や す く 高い S Q は ヒ ト表 皮 の こ とか ら 、 3 1) 更 に河野 ら イ ドロ する 報告 ペ 3 0) 河野 ら 、 い る が あ る が 過 酸化 脂 質 そ の も の は他 - ゲ 、 の ー の の 細胞 毒 性 に つ い て ペル オ キ シ ド( トB は い 。 いて 生体影 響 のi n v It r o の 生体 影 響 及 び そ 評 価法 に ド( P C O O H ) ド( P E O O H ) に 着 目 した 単純 で メ カ 照射し 3 5 3 6) ・ 、 、 ニ ズム フォ ス フ ァ 、 生体膜 。 の 解 析が 行 い 溶血 率や P C O O H 基 礎 的検 討 を 行 っ , . あ 含 1 べ o と の 反応 性 が 2 い る o モノハ は加齢 に より 増 加 い こ れ ま で 水 溶性 で 膜脂 質 の の メカ ニ の へ モ 過 酸化 物 の チ ジル エ ズ ム を 明 らか に し の フ ォス フ ァ 夕ノ - ル アミ ン デ ル と し て 良く 用 い られ や す い ウサ ギ赤 血 球 を 用 PEO O H い 含 量 等 を 指標 と し て U た ( 第 Ⅰ 章) 0 - 6 - ・ 、 、 VB 叫 が 大部 分 過酸 化 脂 質 の 影 響 に 関 し つ い て 検 討 す る こ と を 目的 と し た 生体膜 の 主 要 な 構 成 成 分 で あ る リ ン 脂 質 ロ ペルオキ シ で 老 人 性痴 呆 症 、 O O H ) を用 い た報 告 も ほ と ん ど報 告 が な ' 影 響 も最 近 主 要構 成 成分 の 33 u 指 標 と な る サイ トカ イ ン 放 出量 本研 究 で は U V A 及 び U V B の へ 約1 0 % を 占 め るS Q は 患者 あ る の 。 の ー 。 過酸化 物 の ス タ ワ レ ン ま た 免 疫反 応 である い トで あ る と報 告 し て ッ ア トピ フ ィ ル ア ミ ン( P E) の 過 酸 化 物 の ー 表 皮脂質 に 比 の プロ ポル ク ワ レ ン過 酸 化 物 ス 膜脂質 症 を発 症 す ン 皮膚 に U V A を照 射 す る と過 酸 化 脂 質 が 生成 す る と の ヒトの 。 - い タノ エ 夕 の 一 ル オ キ シ ド( S Q O O H ) 含 量 を測 定 し して リ 2 ウ ム ホ トダイ オ マ ニ 癌 患 者 や 高脂 血 症 患 者 、 て 発生した o 不 明な点 も多 , ま た ヒ ト の 表皮脂 質 。 酸化 の 第 過酸 化 剤 で あ るt プチ ル ハ イ ド ロ て の は C し H P L C 法 に よ り ヒ ト 皮膚 中 の S Q こ と を 報告 3 2) チ ジル フ ァ い る 二 重 結 合が 多 い ゲル しか o 1 っ て 生 成 し た過 酸 化 脂 質 の 生 体 っ しH P L C ) 法 で 測 定 し (C こ と 等 がある もの は健 常 人 の 血 紫及 び赤 血 球 リ ン( P C ) コ . フィ 1 2 6) ( F ig 2) の ア ク ネ 菌が 産 生 す る コ 、 は効率 は い 2 2) Ⅱ) e 更 に o 2発生量 に比例 して 、 酸 化 ス ト レス に よ の Typ o r 光励起 によ 、 リシ と 表皮脂 質 の ス ク ワ レ ン( S Q ) の 混 合 物 に U V A を照 射 し ド ア レイ を用 、 ヒ ドロ キシ ラ 、 Ⅱ) あ る e 遺 伝 的障害 を も つ 患者 が ポ ル また 表 皮 常 在 性 菌 、 、 Ⅱ 反応 は励 起 さ れ た 光増感分 子 が ま e オ ン( 0 2 ) が 生 成 す る( m i n ニ ン体生成の され て おり T yp 、 重 項 酸素( o 2)( m aj o 一  ̄ 1 ム ヘ パ - 方 一 o , 2 て 基 質 と 直 接 反応 し っ 過 酸化水素( H 2 0 2) I 1 結果 こ の 、 - オ ン ラ ジ カ ル( 0 ) を生 成 す る も の で あ る ず0 2 と反 応 す る も の で し ニ 光 増 感 反応 は . I 反 応 は U V に より 基 底 状態 か ら 三 重項 状 態 e 3 最終 的 に ス 光 増 感物 質 に 吸収 さ の が基 質 に 伝 達 さ れ る 過 程 を 言 う ー o そ の た め に まず チジ ル ハイ そ れ に 基づ 、 コ 扱 い や すく リ ンハ イ ド ペ ドロ 、 、 ルオキシ 系 が比 較 的 ■ 光 増 感 物質 存 在下U V A を 照 射時 と の 比 較を行 次に 皮 脂腺 より分泌され , 酸化 物 の S Q O O H に 着 目 し た 用い 光 増 感物 質 で あ る へ 、 含量 SQ O O H ヒ ト表 皮 の 、 タ の 一 ー ゲ ト と さ れ るS Q ッ よ り 生 体 に 近 い 3 次 元 培 養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル( S k i n 。 マ 酸化 の 第 トポ ル フィ リ ン( H P ) 存 在 下 U V A を照 射 し プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン E 2 ( P G E 2 ) 放 出量 等 を 指標 と し 、 、 、 過 )を 細 胞毒性 や 生 体影 響 ・ の 2T ” の 評価を 3 7 3 8) 行っ た , 0 38 ) 更 に 各 種 抗酸化剤 や 紫 外 線 防 御 剤 の 影 響 を 検 討 し た そ して そ 、 - 及び そ の[ n の ' v ]tr o 結 果 細胞 毒 性 評価 法 に つ い ン ゼ3 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ カイ した 放出 量 ン 39 ) 。 、 細 胞膜 中 へ の 関与 が 明 ら か に な て 検 討 を行 デ ル( V it r o lif e S の ま た 各 種 抗 酸 化剤 - た っ たS Q O O H そ っ 7 の も の の 生体影 響 を添 加 し , 、 グ 細 胞 毒 性 や サイ ト 細 胞 の 形 態 学 的 変 化 等 を指 標 と し て 検 討 、 響 を 検 討 し た ( 第 Ⅲ 章) - a 正 常 ヒ ト表 皮 角 化 細 胞( N H E K ( B)) ki n) に S Q O O H 過 酸 化 脂質 含 量 の影 o ( 第 Ⅱ 章) - 0 第Ⅰ章 ウ サ ギ赤 血 球 に 対 す る u V - 8 - 一 光 増感 の 影 響 第 Ⅰ章 U V A u v A は単独 で はエ ネルギ た 。 しか し 近年 、 、 8 - っ 。 こ 、 佐々 木 ら い るが 、 , 、 そ の 影響 につ いて はU V B 程 注 目 さ れ て ロ れ ら を介 し た 間接作 用 の 生体影 響 へ ビン の は ウサ ギ保 存 血 に 光 増 感 物質 で あ る リ ボ U V A 照 射後 に 溶 血 率 が 増 加 し , 増感 に よ る 溶血 反応 が 低く ラ ビ ン モ ノ ヌ ク レ オ チ ド( F M N ) か らR F F M N 節 - 4 0) た 一 メ トキ シ ソ ラ レ ン( 8 M O P ) や グリ セ オ フ 質 が 知 られ る よ う に な り よう に な ー 第 ま た窒 素 置 換 下 で は 溶 血 率 の FA D のU V A 照射 に よ 、 っ 等 の 光 増 感物 関与が注目 され る フ ラ ピ ン( R F) や フ ド( F A D ) を添 加 し 増 加 が 抑 制 さ れ た こ と等 , 1 っ て 生成 す る o 2 が 溶 血 に 関 与 す る こ と を示 唆 し て 。 本章 で は 生 体 膜 モ デ ル と し て 良 く用 い られ 感物 質 存在 下U V A を照 射 し なか い フ ラ ビ ン ア デ ニ ン ジ ヌ ク レ オチ 、 、 詳 細 は 不 明な 点 が 多 い 40 ) 、 扱 い やす い ウサ ギ 赤 血 球 を用 い 溶 血 率 を指 標 と し て 基礎 的 検 討 を行 っ た - 9 - 。 、 光増 実験材料 と 方 法 1 1 1 - - ( 1) 動 物 ウ サ ギ ( 日 本 白 色 雄 性 ウサ ギ L f= : 体 重 約2 ふ 3 k g) は 日 本 生 物 材料 セ ン タ ー より購入 o ( 2) 試 薬 マ ン ニ ト ル( M A ) 及 びN ー N a 3 は 関 東化学 よ り 購 入 し た o R F は和 光 純 薬 より 購 入 した . 3 5) ( 3) 溶 血試 験 ウ サ ギ 耳 静 脈 よ り 採 血 し た血 液 か ら 赤 血 球 を 常 法 に より 分 離 し て 0 8 5 % 塩 化 ナ トリ . ウ ム 含 有1 0 釈 した 。 m M リ ン 酸緩衝 液( p H 7 4) で 4 回 洗 浄 した 後 . こ の0 2 % . 試料 ピ ン に 入 れ グル 商 事 ( 秩) c m 、 赤 血 球 懸 濁 液2 室温下 の 倍 に希 l を外 径 3 c m の ー - , 一 。 っ た 。 2 ) は7 0 m W / c m ( u v チ ェ ッ カ : イ グル 照 射前 後 に7 4 0 n m に お け る 吸光度 を測 定 し そ n m ー 、 ー . 、 照 射終 了 後 の 経 過 時 間 射終 了 直 後 に 溶 血 率 を測 定 し た 後 と に 溶血 率 を測 定 し た m で50 0 . であ を求 め た 等 張 緩衝 液 は H P あ る い はR F リ ン 酸緩衝 液4 平 均 照 射強度( 3 6 5 商事 ( 株) 製 に て 測 定) の 減少 か ら 溶 血 率 一 この ( 3 5 0 3 8 0 n m m a x 3 6 5 n m ) を 紫 外 線 照 射装 置 ( イ 照 射 光 源 装 置) を用 い て 定 時 間 照 射 した なお 高 さ1 8 でU V A 製紫外線均 か ら照 射 し た 時 m 、 試 料 を室 温 あ る 。 - 10 - の 溶血 い は0 ℃ で 暗 所 に放 置 し て1 へ の影 響 を み る 際 はU 0 V A 照 分ご 結果 1 1 3 - - ( 1) U V A 照射 時 間 及 び 増 感剤 の 濃 度 の 影 響 R F 6 0 いM を用 n た 時 の 照 射終 了直 後 の 溶 血 率 は 照 射時 間 が 4 0 分 間 ま で は0 % だ っ た が 45 、 分 間 で は6 8 % ほ ぼ同様 の 分 間 で は8 6 5 % と 60 、 結果 を 得 た そ こ で 照 射 時 間 を4 5 . 1 0 LJ M を用 分間 とし R F 濃 度 を変化 さ せ た と こ ろ 、 リM ま で 変化 さ せ た と こ ろ ラト に 達 して 9 7 % の - そ o 6 0 LJ M で 6 8 % に 達 し た ころ 照 射時 間 を1 こで 2 いM 、 、 を照 射 し た と い てU V A 0 0 % に達した 血率 が ほ ぼ1 佐 、 4 0) 木らの 報告 々 ま 5 は ほ ぼo % で 溶 血 率 を示 し た( Fi g 1 5 、 ま で は0 % で 以 3 0 りM 、 。 分 間照 射 時 で 照 射終 了直 後 分間 とし . ト1 1) 、 ぼプ 5 いM で ほ - . o - ・ - - cト ・ ・ ・ - U VA 15 ・ m in 1 ¢0 A ヽ■ $ 0 ■′ 切 ■■ 一 書 幼 > ヽ ■ 山■■ 6 0 0 ≡ 4 0 ) 匂 = 2 0 0 0 2 4 ・ h e m E ry th ・ ト1 H e m o ly s i s r p h yr ro cy t e s w e re a to p o H e m oly s I S W a s E a ch re p oi n t p oず e ry 伽 o c 1 2 (p M) y 紬 by S s e n siti z a ti o m UV A w it h ■ m i r r a di a t e d d et e rm re s e nts U V A 増感 に よ る 1 0 8 io m c o n c e mt r a昔 M P Fi g I 6 in d th e e w di m 溶血 力 は H P it h U V A m m e e a n > > of (3 5 0 di a t e ly th r e RF であ e っ - 380 n m a ft e r t h e d at a た - ll - d of m in ・ i rr a d i a ti o n ・ ・ これ 。 )for1 5 e n より 、 溶 H P 濃 度 を0 5 LJ M か ら1 0 、 以 降 は 急 激 に 増加 し で の 1 2 0 3e と 。 降 は急激 に 値 が 上 昇 し4 0 LJ M で 2 0 % 次 にH P 著 しく値 が 上 昇 し 、 以 降増 感剤 は H P を用 い た 。 ( 2) 放置 時 間及 び 放 置 温 度 の 影響 H P 0 5 いM 存 在 下 U V A を1 5 分 間 照 射 し た 時 の 溶 血 率 は 照 射 終 了 直後 は0 % だ っ た が . 室温 放置 す る と 溶 血 が 起 ト 分 ま で は 急激 に 上 昇 し 溶血 率 を示 した に達 し て9 5 % の ー こり ∴3 0 これ に対 。 し 置度 を0 ℃ に し て 同 様 に 実 験 を行 っ た場 合 は 放 置 5 血率 の 増 加 の 著 し い 抑 制 が 見 られ た( F ig I i 2) - 放 置5 0 分 後 に は ほ ぼプ ラ 、 自 動 酸 化 反応 を 抑制す る た め に 放 、 分 後 で も 溶 血率 は2 0 以下と 0 % 、 溶 - . . 1 0 0 < ト - - R T ー . # 8 0 o O . C A ㌔ } 6 0 ゆ J - u) > - I 呂 4 0 0 ≡ 2 0 0 0 Ti F ig . E ry th 15 H ト1 ・ m H 2 r o c yt e s mi n 1 0 e ( 2 0 i n) m a 3 0 ず! e e m o ly si s o i r r a di a t e d w e re 帥e r 菅 4 0 e r w 5 0 d e n y 紬r o c it h U V A 6 0 o 甘i r r a y 甘e 7 0 di a 朋o a ず随 r s (3 5 0 3 8 0 - m U V A i r r a di a r r o n m ) i n th e p n re s e n c e of O 5 リM ・ H P for . e m o ly s I S W a s E a ch p oint そ こ でH P p re の d ete r m re s e nt s in d th m r t . . e a n o r o O ℃ aft e f th re e th r d a ta e e n d of i r r a d i a ti o n ・ ・ 濃度 を 変化 さ せ 室温 放 置 5 0 分後 の 溶 血 率 を測 定 し た と こ ろ 比例 し て 溶 血 率 が 上 昇 し 見られた( Fig e t a ト 1 3) , H P 無 添 加 で は5 % で あ - . 。 - 12 - っ たが 、 、 H P の 濃度 に 0 5 LJ M で は1 0 0 % の . 溶血 が 12 0 UV A 15 十 m in 柑0 叫 ′ S ′ ■■ ■- ヽ 望 8 0 . め 昔6 0 喜4 0 ≡ 2 0 0 0 1 凱0 凱2 . E ry th r o cy te s w e re H e m oly s I S W a s E a ch re p oi nt 今度 は H pre h ind r m s e nts P 0 5 H M . e m a i r r a di a t e d d et e 血率 を測 定 した と 20 of E ff e c t ト1 3 - . 0 4 0 5 . . th e ころ 、 w o m o r p m e a n V A in of th c o n c e n (3 5 0 3 8 0 n m - th e e a ft e r re e . (u M ) p h y ri n it h U V A t 50 a 存 在 下U t 0 6 , c o m c e m ! r a ti o m ‖P F ig 0 3 d at a 照 射 時 間 を3 n d t r a ti o ) fo of r 15 n - . - n ・ . 1 4) 13 - - oly s I S ・ i rr a di a ti o 照 射 時 間 に 比例 し て 溶 血 率 が 上 昇 し 分間 以 上 の 照 射 で 1 0 0 % に 達 し た( Fi g I e m in I m 分 間 ま で 変化 さ せ 0 h o n . 、 、 1 5 室温 放 置5 0 分 後 の 溶 分 間 照射 で9 8 % 、 12 0 - o ・ - - H P O 5 = M - . 10 0 恥 ′ l. 3e ・ 8 0 d め 1 P P 監 d 6 0 d 0 喜 = 4 0 ・ 2 0 ¢ 1 0 0 Fi g 監ff e ト1 4 - . E ry th r o c yt e s w e re H e m oJy s I S W a s E a ch re p oi n t c p t o 2 0 ずi r r d i a 朗o a i r r a di a t e d d et e r m re s e nts in d a th m e e a n ti m w it h t 50 3 0 UV A m in of th m e 埠0 苛r 柑 d i a 伽 (3 5 0 af t e r re e h o m - 380 th e e n d a ta - e 14 - . m n m d 引 S )in th of ti m ( m a n) 0 5 iJ M HP e J gy o m e pre i r r a di a ti o n s e n c e . of . . ( 3) 抗酸化 剤 の 影 響 1 o 2のク ンチ ャ エ であ るM A で あるN ー 生 体 内 抗酸 化 剤 、 N a と ヒ ス チ ジ ン( H i s) 3 O H ラジカ ル の ス カ ベ ン ジャ ビ ン 酸( V C ) の H P の アス コ ル 響を 検討 し た まずH P 5 ‖M 存 在 下 U V A を1 、 のU V A 増感 によ る溶血 ー 影 の へ 。 N N 31 a 5 分 間 照 射時 の 照 射終 了直 後 の 溶血 率 を測 定 し た と M で は9 6 % の 溶 血 率 を 示 し 全 く 阻 害 が 見 ら れ な か m 同様 に 実験 を 行 っ た そ の 結 果 N a N 3 5 0 m M で9 2 % と 非 常 に 強 い 抑 制 が 見 ら れ た m 。 溶 血が抑 制 さ れ た ト1) - T o は5 M A で 、 0 。 た の で 濃 度 を増 加 さ せ て M で は約5 0 % の 阻 害 が 見 られ ま たV C で は1 m 0 M で9 6 % と M で も 全 く 阻害 は 見 られ な か m 、 H i s で は1 0 、 ほ 、 た っ . ぼ完 全 に ( T a bl e I 0 b ‡e I a 方 一 っ ころ = - . E ず紬 c t s o a m t衰 o x i d a m f - S e m Si ti z e d h 竜S a n o甘 y s 椅 e m W d d i c a[ ra i帥 5 p M h s ca v a m e m at o p g o r e 柑 O n p h y ri u V A ・ m 虹 ⊆垣 97 N a N 3 hi stidi n 10 87 10 50 48 51 1 97 0 8 92 e 10 m a n njt oI aj cd a s c o rb i c E w th 15 H m r o c yt e s in a re 次 に0 ろ m N 、 1 24 75 10 4 96 w e re i r r a di a t e d w ith U V A (3 5 0 - 3 80 n m)i n th e p of re s e n c e 5 いM H P fo r . e m oly s ] s D at a 94 50 a m . N 50 m M で1 7 % 5 いM H P H P 10 M で9 7 % と . of e a n s 5 りM 3 d et e w a s m 、 r m th ind re e e di m e dia te一 y e a s u re m m 存在下 U V A を1 M で は5 5 % m 、 50 e nt s a ft e r th e e n d of i r r a di a ti o 、 ・ . 5 分 照 射 時 の 室 温 放 置 5 0 分後 の 溶 血 率 を 測定 した と こ m M で は8 1 % と 強 い 阻 害 が 見 られ 、 ま たV C で は1 0 方 His で は 存 在下 と 同様 に ほ ぼ完 全 に 溶 血 が 抑制 さ れ た 弱 い 阻 害 しか 見 られ ず M A 5 0 m M で は8 1 % と 強 い 阻害 が見 られ 5 H M H P と n 一 o 、 、 存在 下 と 異 な る 結 果 が 得 られ た( T a bl e ・Ⅰ - 1 5 - - 1 2) - . 、 、 T a bl e I l - ・ E 鵬 2 c ts o 守 a s e n s i昔 iz e M m H モトo m id x a mt s d h o )y s 椅 e m e m ol si s d a n ■ c aⅠ s c a v a m it h 0 5 p M W . I n hibiti o % di r a n r at e h e m a モo g p e r s o r o n p h y ri n % 95 N a N 3 hi stidi n 10 43 55 50 18 81 94 1 50 79 17 10 77 19 50 1 8 81 1 24 7 5 3 97 10 e m a n n it o1 a s c o rbi c ai c d 10 E ry th r o c y t e リM H P f o H r e m oJy s I S D at a a re s 15 i r r a di a t e d w e re m W a s in U VA (3 5 0 - 38 0 n m ) i n th e pre s e n c e ・ d e te m e a n s w it h of rm th in d re e at 50 m in m e a s u re m aft e r e nt s th e e n . - 16 - d of i r r a di a ti o n ・ of O 5 ・ u V A ・ 考察 1 1 3 ・ - ■ 40 ) は ウサ ギ 保 存 血 を 用 佐々木 ら い R F 濃 度 を5 6 0 いM と 変 化 さ せ た 時 の U V A (3 5 0 - 、 - ) 照 射 終 了直 後 の 溶 血 率 は 3 0 分 間以 内 の 照 射 で は 0 % だ っ た が 6 0 分 間 照射 時 約9 5 % は3 0 p M 1 2 0 分 間照 射時 で は2 0 いM で ほ ぼ プ ラ ト に 達 し そ れ ぞ れ 約8 0 % これ に対 し H P は5 = M H P 存 在 下 わ ず か1 5 分 間 照 射時 で であ っ た と 報告 し て い る 38 0 n m 、 ー 。 H P の3 6 5 . 40 ) 存在 下 U V A を 照 射 し I O いM 対 照 で は差 が 見 られ な か 、 照射終 了 直後 よ り 高 く な 係を 検討 した o ℃ 放置 時 で . の 損傷が 必 要 で ト1 1 s パ 結論して い る が起 こ ら ず いるが いる 方 一 そ 。 、 o - の 4 0) 1 m N 3 こでN a N 3 ら 方 His , ー 、 の へ , 2 0 いM ィ 1 1 . 2 っ や ジ メ チル 3 い こ たの の何 らか 、 はない か と思われる で フ ラ ン で 抑 制さ れ とから 1 、 o い ー いる と M A で は 阻害 、 2 。 M A やス 、 が 関与し て 2 を 用 い て 同 様 の 実験 を 行 関 与 を認 め て の 害 が 認 め られ な い ど こ ろ か 溶 血 を 促 進 す る と 報 告 し て O H ラ ジカ ル 及 び o 影響 を 検 討 した 2 のス カ ベ ンジ ャ で あるV C のH P - - 。 H i s で 阻 害 が 見 られ , 3 M A で は 阻 害 は見 ら れ 、 j o r T y p e Ⅱ の 光 増感 反 応 に よ m a っ たも の と 思 わ れ る( T リ ン 類 存 在 下 皮 脂 に ∪V A を照 射 し . a っ わ れ る( T N 3 た a 実 験 で はN 2 の ら こ とか bl e ト 1 2) 、 - . a N 3 の い る . 1 o , 2 b le a て 生 成し っ ト 1 1) - . 発生 を ゲ ル の こ の こ とも上 隻 マ ニ ウ こ と を支 持 記の し 関 与が 明 ち か と な っ しかし い る必 た 。 他 に M A で も 阻害が見 ら れ H i s で は あま 、 自 動 酸 化 反 応 に よ る 損傷 の 増 大 も 溶 血 に 関 与 し て この で は 阻 害 が 見 られ こ と か ら 最初 に あ る 程 度 の 損傷 が 生 じ て にo N a 1 M A , H P 存在下の o 5 H M また N する o 定量以上 一 。 い るもの と思 、 ら溶 血 に は あ る 溶 血 に至 、 ド ア レイ に よ り 直 接確 認 して り 阻害が 見 られ な か らず 、 H P 増 感時 に は 照 射終 了 直後 に ほ いM で あ る H i s で は抑 制 さ れ た こ と か ら o M で は阻 ポル フ ム フ ォ ト ダイ オ 一 ま た5 て 生 じ た 損傷 に よ り 溶 血 が 起 こ はH P な ど の て いる そ こ で 照射終 了後 の 時 間 経 過 と 溶 血 の 関 1 ー 、 42 ) 。 溶血 率 を の 添 加 群 で は 照射 終 了 か ら5 時 間 後 の 方 が こ の こ とか 。 、 っ る 、 まず5 L J M H P 存 在 下 の 実験 で は N a N こ の 場 合 は 主 と して なか っ た こ とか ら た o2 によ RF 量 に達し もR F 木ら 々 エ ンチ ャ a 1 、 照 射終 了 直 後 及 び5 時 間後 、 ゼ( S O D ) で 阻 害 さ れ な ク 増感 に よ る 溶 血 UVA らず - , の 2 N 、 な原 因 で . ま た佐 . 1 こ の こ とが 主 、 っ 0 5 LJ M H P 存 在 下 で は 照 射 終 了直 後 に はそ の 量 に 達 し て い な い が 、 オキ シ ド デ イ ス ム タ ー こ は R F 光 増感 に よ る 溶 血 はN ki ら u z u べ て い ト 1 2) - . そ の 後時 間 と 共 に 増 幅 さ れ て そ 41 ) たが っ たと述 っ は ほ と ん ど溶 血 が 起 溶 血 し た( F ig 0 % ぼ1 0 約8 倍 で あり ・ ことが明らか とな H P 増 感 時 に は 室温 放置 時 は3 0 分 後 に9 0 % 以 上 溶 血 し た が 0 5 LI M . 倍 以 上 増感 力が 強 い 。 はRF 佐々 木 ら H P は R F よ り1 0 、 に 掛 ナる モ ル 吸 光 係数 は R F の n m ある と思 わ れ る 測定 し 、 溶血 率 を示 し ほぼ1 0 0 % の た 、 , , V C 場 合 で もU U V A 照射 に よ 、 要が あ る と思 わ れ る は ラ ジカ ル ス カ 非照 射時 で は溶血 が 起 こ V A 。 1 っ て 生 成し た o い ベ ンジャ ずれ にせ よ ー と して の 消去 作 用 等 も 持 つ た め い ず れ の 場合 も 強 い 抑 制 を 示 し た と 思 わ れ る - 1 7 - 。 、 2 によ っ て 溶血 に 対 働 き の ほ か・ 第 Ⅰ章 第二節 U V 如曽感 に よ る 過 酸化 脂 質 生 成 u v A は 単独 で は エ ネ ル ギ た 。 しか し 、 近年 ー が低く そ 、 の 影響 に つ い て はU V B 程 注 目 さ れ て 8 メ トキ シ ソ ラ レ ン( 8 M O P) や グリ セ オ フ - 、 - ロ ビン 40 ) い なか っ 等 の 光 増 感物 質 が知 られ る よ う に な り こ れ ら を 介 し た 間 接 作用 の 生 体 影 響 へ の 関 与 が 注 目 さ れ る 2 7 2 9) は 健 常 人 の 血 祭 及 び 赤 血 球 の 膜 脂 質 の 主 要 構 成成 分 で あ る よう に な っ た 宵 滞 ら 、 - 。 フォ ス フ ァ チジル リ ン( P C ) コ フ ォス フ ァ 、 チジル エ タノ ー ル ア ミ ン( P E) の 過 酸化 物 の 含 量 を 化 学発 光 H P L C ( C し H P L C ) 法 で 測 定 し 癌 患 者 や 高 脂 血 症 患 者 老 人 性痴 呆 40 ま た佐 々 木 ら ) は ウサ ギ 保 存 血 に リ ボ フ ラ 症患 者 で は 増 加 す る こ と を 報 告 し て い る - 、 、 。 ビ ン( R F) を 添 加 し U V A 照 射後 に 2 thi o b a rbit u ri c - 、 値 が上昇 す る 傾 向 が見 ら れ る カ ニ ズム に 関 し て は よ る 過 酸化脂 質 の 、 こ と を 報告 過 酸化 脂質 測 定 は行 っ の して い る a cid 。 r e a c ti v e これ 関与 が 示 唆さ れ る が て お らず 、 らの s u b sta こ とか ら n c e s 々 木 らは C し H 詳細 は 不 明 な 点 が多 い 。 1 著者 ら は 前節 で ∪V A 増感 に よ る 溶 血 に o 2 及 び 自動酸化 反 応 が 関与 し 以上 の 損傷 が必 要 で あ る め に前節 と 同 じ ウサ の 過酸化物 で ファ チジ ル エ との 相 関 に つ ある タノ こ と を示 し た ギ 赤 血 球 を用 フ ォ ス フ ァチ - い ジル 、 コ ル アミ ンハ イ ドロ い て検討 を行 っ た 。 本節で は こ の 損 傷 に つ いて ペ ハイ ドロ ペ 、 P LC ある 一 の メ 法に 定量 詳 細 に検 討 す る た 光 増 感 物質 存 在 下 ∪V A を照 射 し リン - 間 接作 用 、 佐 、 ( T B A R S) 、 赤 血 球膜 脂 質 ル オ キ シ ド( P C O O H ) 、 フ ォス ル オ キ シ ド( P E O O H) 含 量 等 を指 標 と し て 溶 血 。 - 1 8 - 実験材 料 と 方法 1 2 1 _ - (1) 動物 ウ サギ は 前 節 と 同 じ も の を 用 い た 。 (2) 試薬 pc o o H (3) P C O O H pc o o H pco o H フ P E O O H 及びP C 分析条件 を Fi g P LC の 4 3) P E は宵滞 らのC しH P L C 法 , 。 PE の定量 , ル を 内標 と し て 定 量 を行 ー 図及 びH P E O O H 及 びP C , , 標 品 は 東北大 学農学部宵 滞 教授 よ り 譲 り 受 け た P E O O H は 化学発光 検 出器 で , ノ ェ PEO OH の , た っ また 、 PC 、 に準 じ て 定 量 を行 P E は2 1 0 , 吸 収で/てラ の n m た っ ニ 今 回使 用 したH P L C 装置 の シ ス テ ム ブ . ト2 1 に 示 す 。 トロ ロ ッ ク - . 。 S Pl ” C P2 C L W a A Fi g ph ト . o s hyd S 2 1 - r o p e m a ti c 伽 o 朋o w di a g ro p hy d e p (Pl , D et e c t o r ( U c o n diti o m n P 2) : P I S hi m a C L) : U S hi a , ( C ) : H ib M o bil e p h L u min e r o xi d e C L H P LC s - a n d ph y st e ずo m p h a tid y 臥朗 h o s a s s a r a m o は m y o甘 im e n s m d z u d z u LC 6A a s e ar Li C h ( A) : h r o s o rb e x a n e :2 - p P 2 S hi m - , S PD 6A (2 1 ・ El e c t r o ni c I n d C ol u oず ra m e r o xi d e - m h p h a tid y l c h CL H PLC Pu c u s tri e s N H ro p 2 n m zu LC 8A ) CL S g ・ 6 m m 川 20 =M e e nt I , - S 340O a o r - T oh o k u - O H i d) ・ . ( 9 : 2 7 ‥4 : 5 ( B) : 1 0 u g/ m l c yt o c h r o m e c a n d 50 m M b o r a t e b u ff e r ( H 8 B O K C し N a C O 3 .P H 1 0) (fl o S a m pl e s o l u ti o n ( S ) : 1 0 LJl R e c o r d e r ( R ) W a t e r ci r c ul a t o r ( W : S C I M C S C H 2 0 1 ) e s c e nt r e a o m , LC 10A o r - C LD 11 0 (2 5 0 X 4 a n o 0 d a 2 , - 19 - 2 ug/ w , m r at e v/ v = , fl o u m 1 1 . w r at e i n ol i n m l/ m i n) 1 0 1 m ]/ m i h) P E O O H の 定量 (4) ウ サギ 赤 血 球中 前節 と 同 様 の 方 法 で 調 製 し た2 0 % ウ サ ギ 赤血 球 懸 濁 液 2 m は 0 8 5 % 塩 化 ナ トリ ウ ム 含有1 0 m M リ ン 酸緩 衝液( p H 7 4) に へ マ ト ポ ル フ ィ リ ン( H P ) 5 0 H M を加 え た 溶液4 m I を外径3 c m の 試 料 ビ ン に 入 れ 室 温 下 で U V A ( 3 5 0 J 8 0 n m ) を1 5 分 間 照 射 し 照 射終 のP C O O H ・ ・ 1 、 、 了後室 温 あ る い は0 ℃ で 最高3 0 分 間 放 置 した 放 置 後6 m l の 冷 ク ロ ロ ホ ル ム / 2 プ ロ パノ ル( 1 :1 v/ v ; 抗 酸化 剤 と し て 1 0 p p m の プ チ ル ヒ ド ロ キ シ ト ル エ ン( B H T) を 含 む) - 。 - , を加 え こ れ を遠心 し て 、 度操作 し ロ - タリ ロ ロ ホ ル ム 層 ( 総 脂 質 画 分) を集 め た 集 め た 総脂 質 画 分 を 無 水硫酸 ナ トリ ウ ム で 脱水 し た 後 , エバ - ボレ ー タ 内標 と し て1 v/ v ; ル(1 :1 , をC L H P L C で 定量 . - 得 たク した - で 濃縮 乾 固 し た 0 0 u g/ m lのパ ラ こ o トロ ニ 。 - 20 - れ に1 0 0 L J[ の ク フ ェ ノ ー 、 ロ ロ ル を 含 む) ク o 同様 に も う ロロ ホ ル ム層 を ホル ム/ メタ ノ を加 え 、 一 ー こ の1 0 い l 結果 1 2 2 ・ . E O O H 及 びP C P E の 定 量 (1) P C O O H P ま ずP C O O H P E O O H 及 び P C P 巨 の 標 品 の ク ロ , , ト グ ラ ム をFi 9 マ , , ト2 2 に 示 す - ・ o A P C A ≡ ⊂ 0 PE - T N ヽ - ■′ (= 0 a ー (⊃ ∽ 亡) . < ち 嘗 S 1 P > J C O O H ヽ 一 ∽ t= q) ∼ C くD O ( = 也) 室喜 P E O O H . - 童i 0 Fi g ト2 2 Ch ・ . ro m a 紬gra m h y d r op e r o xi d e (P C O O M , h y d r op e r o xi d e (P E O O ‖ , ず o a m 200 p 20 0 p 5 10 i xt u re m m [) , o o 15 ず ph o ph o s ph I) , M in ph o s ph a ti d M yl c h aL a n oBa m y 蜘h in p h a tid y l c h o 】 o s 伽 o e e in (P e C ,1 3 4 m o 8) n , ' ph o sp m o† ) h a tid y B e t h w it h UV n m ) d e t e c ti o c o n diti o n s ト2 e (P E - 2A n are がU V 検 出津 . (B) C h gi v 、 , あっ た o 1 6 0 叫 n m . 方 ム はそれ ぞ れ 、 、 = e m i n Fi g e n Fi g I - . 検出 掛 こ は P C P E が 険 出 さ れ 一 , a n d p n iモr o ph e n o 川S 1 , p - Th e H PL C . 盲n C L H PL C ( A) U V ( 2 1 0 Fig a n ola m ・ 、 2 - u m . 2B in ト2 e s c e n c e - . 分 、 9 6 . n ・ 1 が 化 学発 光 検 出器 の ク リテ ンシ 化学発 光検 出器 に はP C O O H 14 0 d e t e c ti o P E O O H が 検 出さ れ , れた 。 21 ン タイ ム は そ れ ぞ れ ョ 分 と 嘗 滞 ら の 報告 - ロ マ - 43 ) と は逆 に 、 、 トグラ ム で あ る が 、 12 6 . 分 リテ ンシ PE O O H の 8 7 、 ・ ョ 分で ン タイ 方が 先 に検 出 さ のPC O O H P EO O H の 定量 ( 2) ウ サ ギ 赤 血 球中 次 に0 2 % ウサ ギ赤 血 球 懸 濁 液 を用 い て P C O O H P E O O H 含 量 を測 定 し よう と 試 み た が い ずれ も 検 出 限界 以 下 で あ っ た の で 2 0 % ウサ ギ赤 血 球 懸 濁 液 を用 い て 測 定 を行 っ , l , . 、 た U V A を 照射 し な い も の ( o pc o o H , P E O O H 及 びP C , ン トロ コ ル) ー の ク トグ ラ ム をFi g I ロ マ - . P E は そ れぞ れ 標 品 と の 比 較 に よ 2 3 に示す - て 同 定 及 び定 量 を行 っ っ 。 た 。 ∼ . ≡ (= ⊂) q - r N ヽ ヽ - ′ 【= ⊃ ( a ー S ⊃ ( ∽ エ) く く ー J 0 普 ↓ P E P c丘 > ヽ 〃) t = q) (= Q) U 【= q) Q ∽ q) ∼ P C O O H O ⊂ 普 ' g と↓ コ E q) 。 E 。 。 H J = (J 5 0 F ig I ・ ・ h yd r o p 2 3 Ch ・ e r o xi d e ( P E O O H) a nd p - UV , n jt r o t o t a ) ‖p j d (A) r o m s (2 1 0 Th e H P L C ph ph n m t (P C e m ol )d diti o o gr a m ず o O O ‖) , (司S e , d ずr o e t e cti o n n s 1 a re . p m o m e n ixt m )) 15 u re M in o ず ph o sp h p h a ti d y l e t h o s ‖n o r a ( B) gi v a ph p h a ti d y l c h o s b t aj n o c o n a 10 ( P C) e re c o r ph , d e a n o 書a m o s d in a ti d y l c h in hyd e p h a ti d y l e t h th e ・ e m iJ u i n Fi g ・ mi n e s c e n c e ト2 - - 1 22 ・ - d e t e cti o n . ‖n r o e e r o xi d e p a n og a m C L ‖P L C b b it Ch o o f i n e ( P E) e ry t h r o c yt e s 1 5 し 照 射終 了 後 の 放 置 時 間 と 放 置 温 度 の 更 に2 o % 赤血 球 に U V A を 分 間 照 射 へ の 影 響 を検 討 し た P E O O H の 方 が P C O O H よ り 約3 5 倍含 量 pc o o H P E O O H 含量 、 o ・ , ル に 比 べ て 有 意 な 増加 P E O O H 照 射 終 了 直後 に は P C O O H は コ ン ト ロ は増加 傾向 が 見 られ た 室 温 放 置 し た 場 合 は P C O O H は 経 時 的 に 減 少 す る 傾 向 が 見 ら が高か た っ ー 、 . 。 分後 に は コ ン ト ロ ル レ ベ ル に 回 復 し た ま た P E O O H は2 コ ン トロ ル レ ベ ル ま で 減少 し た 加 が見 ら れ た が 3 0 分後 に は 20 れ - o 分 後 まで 有意 な 増 0 ー pc o o H なお 分後 に コ ン ト ロ P E O O H と も1 0 , 照射後 の P C 、 有意 に 減少 し て 一 o 、 た (デ い 含 量 は 放 置 時 間 や 放 置 温 度 に よ らず PE の , タ は示 し て ー い 方 い) な コ 、 放置 時 0 ℃ 、 ル レ ベ ル に ま で 減少 し た( F ig ー ・ ント ト2 ロ - 4) o ル より - o ∼ uj h 4 0 R o ・ a + PC O OH (R T ) ∼ PEO O H (R T ) PC O OH ( 0 ℃) PE O O H ( 0 ℃) . . . ロI 長3 0 - - 個ト 一 ー ー - 0 . . ≡ ∈ ∼ ) 2 0 ∼ ⊂ 0 叫 C 0 O ## 1 0 = 0 ★ ★ ★ ★ ★ 0 Lil 氏 . J ヽ 0 = 0 0 O a 2 0 ・ _ 1 0 0 1 0 2 0 Ti n e n u V A Fig I ・ . hyd of r o p e r yt D at a 2 4 ir r E ff e c t ・ e r o x id e hr are o cyt e s m a e a n s d j a ti o o ph d a n ず d m i n) 紬e a n m f U V A i r r a d i a ti o o 触r o 官 i r r a d i a ti o ?e ( 4 0 3 0 a ti d ph o s n ph o m yl e t h a n o 中a m o s p h a ti d y b c h in e h yd ro p P < o 伽 e e r o xi d e c o n 始 nt $ bb 舶 r a ± s D . . of fi v e e a s u r e m e nt s m Sig nifi c a n tly diff e re n t fro m c o n t rol Sig nifi c a n tly diff e r e nt fr o m R T ・ ・ g ' , ro u p P 0 05 < , ・ ## P - 23 . ' ' , P < 0 01 ・ - < O 01 1 ' * ' , O ・ 0 01 , 1 ・ 考察 1 2 3 - . 照射前後 の P C O O H に増加 し P C O O H で は照射終了直後 、 分後 p c o o H で は2 0 I 2 4) P E O O H で は3 0 , . した こ と か ら は 照 射 終 了2 分後 に は コ ン ト ロ 分後 に ピ 0 また o 、 ル レ ベ ル ま で 減少 し た( Fi g ー 方がP C O O H より 多く PE O O H の 、 ク に達 し ー ・ 9 0 % 以 上 が 溶血 、 U V A 照 射 に よ る 脂 質 ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド量 の 増 大 に よ 、 た も の と思 わ れ る こっ P E O O H で 、 室 温 放 置 時 で は 照 射後 に 有意 、 室 温放置 時 に は放置3 0 分後 ま で に 溶血 率が急 激 に 上 昇 し - - 含 量 を測 定 し た と こ ろ PEO O H ・ 溶血 が 起 て っ P C O O H の 量が ピ 、 ー ク に達 す る 照 射 終 了 直後 に は 溶 血 が 起 こ らな い こ と か ら P E O O H が 主 と し て 溶 血 に こ の よ う に P E O O H と P C O O H は 異 な る 挙 動 を示 し たが そ 関 与し て い る と 思 わ れ る 、 、 。 1 の 原因 と し て P E と P C の o が考え ら れ る が 不 明 で あ る 分後にP C O O H 1 照射 に よ っ て 生 じた o され ン に よ っ て 還元 て 増加 し で はこ の 、 膜に 2 によ ハイ の 溶血 の 機序 に つ ど溶血 しな か く 、 っ ペ ル オ キ シ ド ラ ジカ ル を生 じ 4 0) す ぐ に飽 和 状態 に 達 し とから 、 HP 5 は R F 膿度 を 高 く し て も3 0 分 以下 い る o しかし い R F はH P に 比 、 べ りM H P 0 5 . りM る い ずれ に せ 。 TBA R S - H P UV A , 増感 に よ 値の 変動 と溶血 と の 関係 H P 及 び R F の ∪V A 一 っ しか し 。 っ 、 、 タ ン パ ク変 とな どか ら こ こ 定量 以 上 の 損傷 が ま た 今 回 は 溶 血 率 は0 . い 、 . 2 % 膜タ ン 、 赤血 球 を 用 uM HP 50 存 1 発 生 し た o 2 に よ っ て 生 成 した P E O O H 及 び て また N a N 24 っ て同 一 条件下 で の , や , マ 、 ン ニ - ト - ル な どの P E O O H あ る と思 わ れ る , PC O O H 0 あ ら ゆ る 生 体 組 織 を 酸化 的 に 傷害 す る 生 体 影 響 を評 価 す る 際 の - よ . 漉度 によ るP E O O H P C O O H 生 成量 及 び H P 、 つ い て 今後 更 に 検討 す る 必 要 が の 畳 が 増 えな か 変動 が 単純 に は 溶 血 と 相 関 し な い 可 能 性 も あ 増感 は 赤 血 球 の み な ら ず 可能性 が あ る の で U V A 4 4) こ る と言 わ れ て い る の P C O O H 生 成量 と 溶 血 と の 関 係 生成 に 与 える 影響等 に の 過 酸化 脂質含 量 は2 0 % 赤 血 球 を用 、 過 酸化 脂 質含 魔 - 、 2 時間 は 膜 に あ る と 溶 血 に は 密接 な 関 係 が あ る こ と が示 唆 さ れ た PC O O H PE O O H よ 、 こ と な く 速や か 存 在 下 で は1 5 分間 照 射終了直後 に ほ ぼ1 0 0 % 溶 血 す る 存在下 で 測 定 し 在下 で 測 定 し て お り O ℃放置時 る と 増感 力 が 非常 に 弱 濃度 を そ れ 以 上 に し て も 生 成す る o ク質変性 も 溶 血 に 寄 与 し で い る 可 能 性 が あ る 、 o っ 照 射 で は ほ とん の 1 、 性 は脂 質 過 酸化 よ り 低 線 量 の 紫 外 線 で 起 o A 赤 血 球膜 が U V A 照 射 の 影 響 を 受け て か ら 溶 血 を 起 こ す ま 蓄積さ れ る の に か か る 時 間 と 考 え た方 が よ り 正 確 な よ う で あ る /l と よ りU V 生 体内抗酸化物質 等 に よ る 過 酸化月 旨質 を 、 U V A を 照 射し て か ら溶 血 が 起 こ る まで の 、 0 、 そ れが 自 動 酸 化 反応 に よ 、 溶血 を起 こ す の に十 分な量 に 達 す る 、 木ら い て佐々 。 など 放置1 この こ o 、 。 た ことか ら たため と 思 われ る た 損傷 を 与 え て 溶 血 に 至 ら せ た と考 え ら れ る 定 の 時間 が 必 要 だ と し て 一 い い て 生 成 し た 脂 質 ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ドが遷 移 金 属 イ オ 消去 す る 反応 の 方 が 優 勢 に な り では ル レ ベ ル に 減少 し て ー 自動酸化 反 応 が 阻 害 さ れ た た め に に 減少し た と 思 わ れ る 違 い る 部位 の 0 ℃ 放 置 時で は ほ と ん ど溶血 が 起 こ らず 、 ントロ コ っ ドロ 定量以上 一 方 一 . PEO O H 畳が , 違 い や 膜 に 局 在化 して との 反応性の 2 一 つ の 注 目点 と思 わ れ る o 第 Ⅰ章 U V B 第三節 増感 に よる溶血反応 4 6 ) 太 陽か ら放 射 さ れ る 紫 外 線 の う ち 地 表 に 到達す る U V A と ∪V B は紅 斑 形 成 15 ) 1 3) 1 6) しわ の 形 成 皮膚癌 の 誘 発 等 を 起 こ す こ とが 報告 さ れ て ニ ン色 素 の 沈 着 - 、 ・ 、 しかし こ メカ の ニ 、 ズム に つ と が示 唆さ れ て い る も の の 著者 ら は前節 で つ い との 相関 に へ マ いて 、 トポル て 検討 し , 照射時 と の 1 2 0 , 詳細 は 不 明 で あ る フ ィ U VA た 過酸化脂 質 が 溶 血 に 関 与 し て ニズム へ の は主 と し で o リ ン( H P 増感( m 卜U aj o r 等 の 活 性酸 素が 関 与 して っ た e Ⅱ) に よ した が 。 - 25 ・ ・ . 。 こ 。 o 2 の 関 与 を明 ら か に す る た め に U V B 照 比較を行 い る い る 2 5 4 5) V A 増 感 に よ る 溶血 と 過 酸化 脂 質 の 生 成 Typ い る こ と を示 2 メラ 、 、 1 っ て 生じた o 本節 で は ∪V B 射時 に つ いて の 2 に よ り 生 成し 生 体影響 の メ カ 同様 に検討 し 、 U V A 実験材 料 と 方 法 1 3 1 _ - (1) 動 物 ウサ ギ は 前 節 と 同 じも の を用 い た 。 ( 2) 試薬 ソル ビ ト ル( S ol) は 和 光純 薬 よ り 購 入 し た - (3) 溶血 試 験 ト1 4 m o 36 ) 節 に 示 し た の と 同様 催 外径3 c m 方法 で 調 製 し た0 の 試料 ビン に入れ の . 2 % 赤 血 球 懸 濁 液2 室 温 下 で U V A (3 5 、 0 380 - n m は H P リ ン 酸緩 衝液 m , m 3 65 a x n m )または ( 3 0 0 3 3 0 n m m a x 3 1 7 n m ) を 紫外 線 照 射 装 置 ( イ グ ル 商事 ( 樵) 製紫外 線 均 定 時 間 照 射 し た な お 高 さ 1 8 c m か ら照 射 し た 時 の 平 均 照射光 源 装 置) を用 い て UVB ー - , 一 一 o 照射強度( 3 6 5 n m ま た は3 1 3 製) に て 測 定) で あ っ た 照 射前後 に7 4 0 n m n m ) は7 . O m W /c 2 m (u v チ ェ ッ カ ー (イ - グル 商 事 ( 樵) 。 に お け る 吸 光 度を 測 定 し 終了後 の 経過 時 間 の 溶 血 へ 、 の 影 響 を み る 際 はU V A そ の 減 少か ら溶血 率を 求め た 26 - 照射 照 射終 了直 後 に 溶血 率 を 測定 し た 後 試料 を室温 あ る い は0 ℃ で 暗 所 に 放 置 し て 1 0 分 ごと に 溶 血 率 を 測定 し た - 。 。 、 結果 1 3 2 . - ( 1) 照 射時 間及 び増 感剤 の 濃度 の 影 響 ト3 1 に 示 す よ う に ウサ ギ赤 血 球 に U V B を1 い 溶血 率は2 6 % と ∪V A 照 射時 よ り 高 値 を 示 し た Fig - . 20 分 間(5 0 ・ 4 J/ c 2 ) 照射 し た と こ m o 3 0 + w ith o u t A 邑 2 0 a) ■■■ ■ a) > l I 0 宕l o = 0 0 3 0 葺r F ig I 8 1 E 鵬 . E w th r o cy t e s H oly s IS e m E a c h p oi n t w ere W a s re ct s e n 9 0 柑 d i a ti o m 骨i ず 如 a d i a ti o i r r a di a t e d d et e pre o 6 0 rm in d ts th e e w m e a n m e of ( e ti m it h U V B d im m n 1 2 0 e e e h o m di a t e ly th r i m) m (3 0 0 1 5 0 - 330 e m n m af t e r th e d at a - 27 - ・ o 日y s i s ) I e n d of i r r a di a ti o n . H P ろ 、 H P 濃度 を 変化 さ せ 的 に 溶血率 達 し た( Fi g の 増加 が 見 ら れ ト3 , U V B 1 5 分 間 照 射終 了直 後 の 、 - 2) 50 、 いM H P 存 在 下 溶血 率 を測 定 した と こ ろ , ( U V A 照 射 時 よ り 高 い 濃 度) o 巧2 0 U VB + 領0 0 ・ 一 喝卜 - ・ ・ UV A ・ A S 〆 、 8 0 切 ■ 1 - Q) > 6 0 ” O 喜 櫓0 = 2 0 ¢ 0 瑠0 M P Fi g ト3 , E ryth - fo r 1 5 r o c yt e s m in w e re 3 0 c o m c e m E 鵬 cせ 2 2 0 o ず h 柑aLti m ato e i rr a d i a t e d 4 0 p w it h 6 0 ( 印M ) o m o r 5 0 p h y ri m UVB c o m c e (3 0 0 - 330 柵 a n m ) e e nd o r 朗o m UVA o m h e m ol y si s (3 5 0 3 - 80 n . H e m oly s l S W a s E a ch re p oi n t d et e pre s e n r m ind t s th e e d im m e a n m e of di a t el y th re e a ft e r d - a ta 28 ・ . th of i r r a di a ti o n . m ) 濃度依 存 で1 0 0 % に ころ H P の 吸収 ス ペ ク ト ル を 測定 し た と 吸 収 極大 は3 8 0 、 n m で あ 0 5 , 也) 0 【= / a 空 . . 0 ∽ ⊂l o 25 . - I - ㌔ / - il / i , . ー ノ ′ ′ / - - ノ l ll ー I. ㌔ \ 、 - 0 25 0 W Fi g HP ト3 3 A b ・ . w as s o rpt di s s ol v e d i n ㌔ 45 0 35 0 ぬn a ph s p o s 払V e 亀e e ¢肘 u m m g 納 oず h p h a t e b u ff e r e d - (m e m - ) 朗o p s a li n e 29 m or p h y ri m ( p H 7 4) ・ っ た( Fi g ト3 3) - ・ 。 の ( 2) 放置温 度 及 び放 置 時 間 影響 1 0 ‖M H P 存 在 下 ( 照 射 終 了 直 後 に は 溶 血 が 起 こ らな い 濃 度) し 照 射終 了 後 、 の 放 置温 度 の 影響 に つ い て 検討 し た に お い て U V B を照 射 そ れ ぞ れ 照 射 終 了直 後 に は 溶 血 。 率 の 増 加 は 見 られ な か っ た が 時 間 の 経 過 と共 に 溶 血 率 の 増加 が 見 ら れ 室 温 放 置 時 は3 0 分後 0 ℃ 放 置 時 は4 0 分 後 に ほ ぼプ ラ ト に 達 し て 9 0 % 以 上 の 溶 血 率 を示 し た 、 、 - 、 (Fi g I 3 4) - - . o 1 0 0 U V B R T + 8 0 - . 針 一 - U V B O I . ℃ ■■l ヽ ′ i ヽ 中 ′ + U V A R T 望 ♯ ∪V A O . の > ヽ け1 . . 6 0 ℃ 一 書 4 0 ¢ = 2 0 0 2 0 0 Fig ト3 4 E f 紬 - . E ryth r o c y t e U VA (3 5 0 s w e re 38 0 - E a c h p oi n t re ct n m pre o ず te 4 0 m p i r r a di a t e d ) in s e nt s th e th e p e 6 0 柑t u r e w it h m e a n of of th (3 0 0 e m - 330 . d at a - e e m 舌n ) a 骨旭 r u o 甘責r r a d岳a 朗o m m oB y s は )in n m 0 5 LJ M H P f o re e ( m e + h O m U V B re s e n c e Ti 紬 30 - . r 15 th m e in p ・ re s e n c e of 1 0 LJ M H P o r (3) 抗酸化剤 の 影響 1 著者 ら は前 節 で o 2 に よ り 生 成 し た 膜 脂 質 の U V A 照 射 時 の 溶 血 へ の 関 与 を 明 らか に 1 した U V B の 生 体影響 の メ カ ニ ズ ム へ の o 2 の 関 与 を 明 ら か に す る た め に O H ラ ジカ ル 。 スカ ベ ン ジ ャ ル ビト のM A ソ - 1 そ し て O H ラ ジカ ル 及 び o 影響を 検 討 し を強く 抑制 し 2 の スカ ベ ン U V A 照 射時 と の 比 、 1 ル( S o d) ー 及び o 、 ジャ 2 の ス カ ベ ン ジ ャ a N 3 His , で あ るV C の H P U V B 増 感 に よ る 溶 血 ー - 較 を行 っ た N 。 N a 。 っ たが M A は ∪V A 照 、 ま たS o l も ほ と ん ど 抑 制 を示 さ ず 射 時 と 異 なり 全 く 抑 制 を示 さ な か っ た オキ シ ドデ イ ス ム 夕 ゼ( S O D ) は 全 く 抑 制 を示 さ な か っ た( T a b l e ト 3 1) . 、 ス ー パ - - 0 T a bB e I 3 1 ・ E 鵬 c 骨S - o甘 a m 批 S e m S Che i c al s m M m H e 朋 d h e m ol o xi d a m - 官S a m l l e m si s o 農y s 帽 % d 柑 dic a E 如拙 1 0 四W m W n hibiti o n r at e s c a v 哉m g e r $ m a 紬 o 岬 h y ri m e p O m u V B % 91 N a N3 h istidi n e m a n nito1 a s c o rbi c 0 50 20 78 10 93 0 50 69 24 88 50 79 13 1 76 16 10 11 a cid SO D 3 8 2 5 U/ m 暮 E ryt h r o cy t e s H P fo r 1 5 in m w e re a re 88 92 i rr a d i a t e d 0 w ith U VB (3 0 0 - 330 n m ) in th e p re s e n c e . 1 m oly sI S D a ta 92 50 s o rbit o1 He 10 W a s d et e m e a n s of rm ind th r e e at 30 m in a ft e r th e m e a s u r e m e n ts e n . - 31 - d of の ヘ とV C はU V A 照 射 時 と 同 様 に 溶 血 H i s も U V A 照 射 時 と 同 様 に 弱 い 阻 害 しか 示 さ な か 、 で あ るN ー i r r a di a ti o n . of 1 0 LA M - ー 考察 1 3 3 - - G od er 46 ) は ヒ ツ ジ 赤 血 球 に U V B (3 ら い る た と 報告 し て F 即 0 V 。 ら a rg a s で ウサ ギ赤 血 球 に U V A ∪V B 、 (6 . 3 J/ c 溶血 す る H P 存 在下 で は1 0 0 % ) を単 独 で 照 射 し 溶 血 は 起 こ らな か っ は ヒ ト赤 血 球 は ∪V B 単 独 で は 溶 血 を 起 こ さ な い が ) を 照射 し m こ と を示 し た 単 独 の 溶血 その も の ネルギ に よ り溶血 が 起 こ い て 検討 し た らか と な っ た o と H P の こ ろ た 吸収 ス ペ ク トル の 著者 ら は1 節 未満 だが 、 。 したとこ ろ い て 検討 ネルギ エ 照 射量 が 多 い 場 、 た も の と思 わ れ る っ e が 31 3 e 365 約 の が大きい - ので 倍程 度 弱 い U VB 、 次 に H P 存在 下 で o H P に 対 す る 増 感 力 はU V B の 方 が 1 0 、 。 H P 非 存 在 下 で は 溶 血 率 は5 % 、 U V B はU V A よ り 。 い る 少 な け れ ば∪V A 照 射 時 と 同 様 に 単独 で は 溶 血 、 らか と な っ 溶 血 す る と報 告 し て 影響 に つ の へ こ とが明 響に つ 00 % 2 を起 こ さ な い ー 、 、 合はU V B 単独 で も あ る程 度溶 血 す る が の エ 2 c m 光増感 剤存 在 下 で は ほ ぼ1 仙 r at e 等 の 本節 で は ま ず 4 7) 6 J/ の 影 こ とが明 / 8 で あるた めと思われる 1 o 放 置温度 及 び 放 置 時 間 の 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 0 ℃ 放 置 時 は 室 温 放 置 時 と ほ ぼ 同 様 の 溶血 率 を 示 し U V A 照 射 時 の よ うな 抑 制 は 示 さ ず ま た プ ラ ト に達 す る 時 間 も 、 ー 、 、 〕v A 照 射時 よ り 早 か っ た 1 同様 に 強 い 抑制 を 示 し た が 抑制 しなか っ た T y p e I 反応 に よ もの と思わ れ 、 制が 見ら れ な か いもの 以上 。 また o 。 の こ の スカ ベ ン 2 とか ら っ た 。 こ とか ら 0 2 一 、 , V C はU V A 照 射時 と S o I は ほと ん ど 溶血 を 定 盈 の o 2 が 赤 血 球 膜 を 傷害 し の 生 成す る 。 ' m ]n o r Ty p e m M と 膿度 を用 い た 1 た 原 因 は 州 s の o 2 消去 能 が N 今後 更 に 検 討 が 必 要 と 思 わ れ る a N 3 。 - 32 - より弱 い 。 溶血 を起 こ し た 、 Ⅱ 反 応 の 関 与 はほ と ん どな H i s がN と を明 ら か に す い こ か な り 高 い ( 溶解 度 や U 、 jor m a また S O D 添 加 時 で は 全 く 抑 な お 本 研 究 で は O H ラ ジ カ ル や 0 2 が 関与 しな を起 こ さな い 事 を 考 慮 し て 用 い う る 最高) 不明 で , 3 1 る ため に M A や S O D な ど の 漉 度 を5 0 っ N U V B 照 射 時 で は主 と し て U V 照 射 に よ り 、 ' , a のM A - 自 動 酸化 反 応 の 寄 与 は 少 な い と 思 わ れ る と思 わ れ る か示さなか で あ るN ー O H ラ ジカ ル ス カ ベ ン ジ ャ 、 て 生 成 した あ る っ ジャ a N V 非 照 射時 で 溶 血 , より 弱 い抑制 し た め で はな い か と 思 わ れ るが 第 Ⅰ章 増 感 に よ る 過酸 化 脂 質 生 成 u V B 著者 らは 第 二 節 で 5 0 LJ M し 、 フ ォス フ ァチ ジル エ チジル コ リ ン ハ イ ド ロ マ へ タノ ペ 第四 節 ト ポル リ ン( H P) 存 在 下 2 フィ 0 % 赤 血 球 に U V A を照 射 ル ア ミ ン ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド( P E O O H ) 及 び フ ォ ス フ - ル オ キ シ ド( P C O O H) 生 成 量 が 有 意 に 増 加 す る また 前節 で ∪V B 照 射 時 で は 主 と し で o 2 が 溶 血 に 関与 し て い る こと こ と を示 し た ァ を示 し た 。 そ こで 。 本節 で はU V B 照 射 時 に お け る 過 酸 化 脂 質 の 関与 を 明 らか に す る た め に P E O O H 及 び また 溶 血 率 測 定 時 と 同 条 件 下 で の 過 酸 p c o o H 生成 量 を 指 標 と し て 検 討 を行 っ た 一 o 化脂質含量 thi o b へ a r bit u ri c の 影響 を 検 討 す る た め に 0 a cid r e a c ti v e 更 にU V 吸 収 剤 の 影響 に つ s u b st a い て n c e s . 赤 血 球 に U V A ま た はU 2 % (T B も検 討 を行 - A っ 33 - R S) 生 成 量 を 指 標 と し て た - を 照射 し V B 。 、 検 討 を行 2 っ - た . 実験 材料 と 方 法 1 ヰ1 (1) 動物 ウ サギ は 前 節 と 同 じ も の を用 い た 。 (2) 試薬 2 thi o b ・ be nz oP h a r bit u ri c e n o n e り購入 した 4 . . - はシグ s u Jf o n i c D D S とS A の a マ社よ a cid w at e r p r o o f ( S a A) p[e A s a m 5 - a cid り購 入 した J 2 2 o - , - n p r o t e cti o s u n , 吸収 ス ク ト ル をFi g I ペ UVB 、 f a ct o n - , ( D D S) は 松 本 工 商 よ り J o ti o ■ dih y d r o x y 4 4 ト1 に J . eth o x m s u n s cr e e n ( S P F) r di はH & R C 8 示す p ro d o m p y u ct a n y よ o O r / ' ' / 賀i e ・ 2 . 0 7< ; , S 1 L I ・ i , 、 J A a ヽ . I ′ J . ㌧ \ l ・ ヽ ⊃ J i D gコI S 〆 . ・ I , 、 ● 〟 - ヽ ヽ ヽ ヽ ヽ ヽ 、 ∼  ̄ → 、 . \ 、 ー \ J 、 、 l・ ヽ 、 ・ 、 - A ・ . 、 ・ _ ・ . ・ 、 ・ ・ , ← - q・ ・ y _ , ー - . - - ・ ●● ● - - ・- - . 0 . ト4 叶 A b S u n S C re e n D DS w as . s o r p ti o m Pro d u ct di s s ol v e d i n c o n c e n t r a ti o n of 0 02 % . (S a e ct r u m s p a A) ph o sp - 一 ・ . ・ 一 - ー a v e oず B g 骨h ¢ n UV Å . 〟 34 b - m m a n I 4 0 0 ) s o rb e r s a一 in e h a t e b u ff e r e d - a ( - - 3 5 0 3 0 0 w Fi g I 0 2 5 ・ - I 0 ' - - d S (D a O S) A in n a n - h d U V B ex an e ・ b ot h at a (3) P C O O H P E O O H 及 び フ ア ミ ン( P E ) の 定 量 , pc o o H (4) T B A - , ォス フ ァ PE O O H 及び P C RS の , チ ジル リ ン( P C ) コ P E は 第2 節 と 同 じ方法 で , フ ォ スフ ァ チ ジル 定量 を行 っ た エ タノ ー ル 。 定量 T B A R S は大石 ら の - たりの 含量 を求め た 。 4 8) 方法 に準 じて 行い タ ン パ ク 膿 度 はL 、 532 o w ry - 35 法 - n m の の 吸光度 か ら 定 量 し 改良法 49 ) で 求め た 。 、 タ ン/ てク 当 結果 1 4 2 ・ - ヘ (1) T B A R S 含 量 の 影響 o 叫 M H P 存 在 下0 2 % 赤 血 球 に U V A を 照 射 し た と こ ろ - 室 温 放置 時 で は放置1 、 ・ . 分 0 後か ら生 成量 が 有 意 に 増 加 し た が o ℃ 放 置 時 は 有 意 な 増 加 は見 られ な か っ た 室 温 放置 時 に お い て 溶 血 を 約8 0 % 抑 制 す る 量( 0 4 m M ) の D D S ( U V A 吸 収 剤) 存 在 下 で も 、 。 ・ 、 方 1 0 りM H P 存 在 下 U V B を照 射 した と こ ろ U V A 有意な 増加 は 見 ら れ な か っ た 照 射終 了 直後 に 有 意 な 増 加 を 示 し 1 0 分後 に は コ ン ト ロ ル レベ ル 照射時よ り早 い 一 o 、 、 - 、 、 に減少 した UV B 。 吸収剤 の S ・ 増加 が ほ ぼ完 全 に 抑制 さ れ た( Fi g Ⅰ - ・ ■■■ ′ 存在 下 ( 溶 血 を 約8 A O 08 % a 4 2) 0 % - o 9 l 抑制 す る 濃度) で は こ の U VA R J + ∈ . ■ q P ¢ 中 II - O 氏 U) UVA O℃ - + ∪V A DDS O 4 + UVB R T + UV B O C + m . ★ ≡ ★ ★ ★ ★★ 7 ヽ ■ ⑳ - 8 h ★ ★ ★ . . - 0 o ∈ # ∈ # 6 〉 ## Jl ∪V B 十 ( M 盲M) a ♯ ∼ S a A O 08 % . ∈ ¢ } 5 こ 0 O く乃 鑑 4 耳 <: 也 ド 3 N 2 0 . 1 0 u V Fig Ⅰ 4 2 ・ r e a c ti v e s u D at a m are ir r Eず fe ct 1 . b st di a ti o a s o ±S D . Sig nifi c a n tl y diff e re n Sig nifi c a n tl y diff e r e nt a n c o nt e n . of t fr o m fr o m 2 0 3 0 4 0 耶 m e e n d 触 = h di a 骨岳o m o 菅岳r r a e n ず u V A a n c e s e a n s 1 0 0 fi v e c o n rt ・ ・ U V B i r r a d i a ti o d o o r te ず0 2% t t r o一 gro ★ p y th r o c m e a s u r m e nt s n P , u e r . , < ★ 0 05 # P , ・ 0 05 < ・ - ★ 36 - , P n < yt o n 2 t hi o b e s of ・ ra a r bi t u ri c b bit . 0 01 ## P ・ < ' ' ' P <O 001 1 ・ O 01 1 ・ L s a c id M P H ヘ (2) P E O O H 及 び C O O 含 量 の 影 響 1 m M H P 存 在 下 2 0 % 赤 血 球 に ∪V B を 照 射 し た と こ ろ 含量より 多 く 、 そ れ ぞ れ 照 射終 了 直後 に 最大値 を 示 し PEO OH 、 含 量 の 場合 は U V A 照 PEO O H 、 含量 の 方がP C O O H 方 P C O O H 含 量 の 場 合 は 照 射 終 了1 0 分後 射時よ り早 く 有 意 な 増 加 が 見 ら れ た ル レ ベ ル まで 減 少 し た( F ig Ⅰ 4 3 ) p E O O H 含 量 の 場合 は 照 射終 了2 0 分後 に コ ン ト ロ 一 。 、 、 ー - - . ■■l・ ■ ′ 監 4 0 ■ ヽ uJ `L ロ〉 長 3 0 * - * 0 ∼ PE O O H ( ∪V B ) ∼ PC O O H ( U V B) ∼ P E O O H ( U V A) ♯ PC O O H ( U V A) ≡ ∈ ★ J ヽ 2 0 叫 * * ∈ ¢ ∼ E 0 O 1 0 = * ★ 0 0 O * ★ ★★ ★ 臥 0 R = 0 0 LLJ a 1■ll 2 0 ー 1 0 0 u V Fig I ・ . hyd r o of 2 0 D at a p 4 3 - e r o xid e % are Sig nifi c E ff e c t s d e r y th r o c yt e m e a n s j= S D a n tJ y diff e . r e nt ph s . f ro 2 0 i r r a d i a ti o ず u V A o a n 巧0 o s a n m fi v e c o n 4 0 Ti m e e m u (m i m) a 触 r 帥 e o 骨意r r a d昏a t豆o m n u V B 毒r r a d i a ti o p h a ti d y ヨe 帥 a oず ra of d 3 0 はm in m o m ph o m h yd e o s p h 朗 はy 月e h e r o x 盲d e r o p P 0 00 l bb 舶 m e a s u r m e nt s trol * , P < . ' 0 05 , ・ - 37 - ' P < 0 01 ・ ' , ' ' < ・ ・ c o m o 伽 紬 m e t$ o % * 1 4 3 - ・ u v B 照射 時 に お い て マ ン ト ニ ルや ソ ル ビト ー ル が 溶 血 を ほ と ん ど抑 - 制せ ず o℃ 、 放置 時 は溶 血 率 の 抑 制 が ほ と ん ど 見 られ な か っ た また U V B 照 射 時 の 方 が∪V A 照射 時 より早く P E O O H 含量 の 増 加 が 見 ら れ た 上 記 の こ と か ら U V B 照 射 時 と∪V A 照 射 時 。 。 の溶血 の 1 りo 2 違い は 1 0 りM H P 、 の 生 成速度 が 早 く た こ と に よ る の で はな 生成速度 に つ い て 、 い 存 在 下 U V B 照 射時 の 方カ7S 0 5 H M H P 存 在 下 U V A 照 射 時 よ U V B 照 射時 の 方 が 自 動 酸化 反 応 の 寄与 が 相 対 的 に 小 さ か っ . か と思 わ れ る は不 明で u v 照射時 の T B A R S 生 成 量 の 射時 に お い て も P E O O H 含 量 血 に 関与 し て DD S い る の の たこ とか ら こ とか も の と思 わ れ る はD D S 及 びS ら 、 5 0) 著者ら . した o 2 が 膜 脂質 を過 酸化 し 、 の 、 。 いて もP E O O H 及 そして ∪V B 照 、 溶血 に 先 立 っ て P E O O H 含 含 量 が主 と し て 溶 存 在 下U V B 照 射 時 に お い てT B A R S 含量 の 増 加 が有 a A a A によ - て ∪V A 及 っ 。 ま た D D S 及 びS も試みて い る 血を引 き 起 こ し た こ と が 示 唆 さ れ た 。 の 溶血率 を 指標 と す る 方 法 が U V 防 御 剤 の ' v Itr o /n - 38 o 2 に よる A に よ り溶血 率及 び過 ' /n ' v Jtr o 評 機 序と して U V 照 射 に よ り 生 成 ま た ウ サ ギ赤 血 球 を用 い ' 1 、 。 びP C O O H 含 量 が あ る PE O O H 及 a クされ ッ れ ら を 指標 と した U V 防御剤 の こ 、 び∪v B が ブ ロ 以上 の 結果 か ら ∪V B 照 射時 及 び U V A 照 射 時 の 溶 血 1 赤血 球 へ 2 % の 。 酸化脂質 含 量 増 加 が 抑制 さ れ た こ と か ら 、 赤 血球 に お 0 2 % U V A 照 射 時 と 同様 に P E O O H 過酸化脂質 生 成 が 抑制 さ れ た た め と 思 わ れ る 価法にも 応 用 可 能 で 、 . 2 照 射時 の P E O O H 及 び 方 がP C O O H 含 量 よ り 多く 存 在 下 U V A 照 射時 及 び S 意に抑制 さ れ た っ のU V ま た0 。 赤血 球 の 場合 と ほ ぼ同様 だ と思 わ れ る 0 % 量 の 有意 な 増 加 が 見 ら れ た 1 U V B 照 射 時 及 び ∪V A 照 射 時 の o 、 変化 が 2 0 % 赤 血 球 ヘ 含 量 の 変化 と ほ ぼ 同様 で あ びP C O O H 含量 の 変化 は2 しか し o 今後 更 に 検 討 が 必 要 と 思 わ れ る 、 - pco o H 、 - 一 定 レ ベ ル に 達 して 溶 U VA H P - 、 評価 法 に 成り 得る こ 増感 に よ る と が 示 唆さ れ た o 小括 ウ サ ギ赤 血 球 を 用 光 増感物 質 存 在下U V A ま た はU V B を照 射 し 溶 血 率 や 過 酸化 の 影 響 を検 討 し 更 に 溶 血 に 関 与 す る 活 性酸素 種 を 明 らか に す る た め に い 、 、 脂質 含量 へ 種抗酸 化剤 の 影 響 を検 討 し た 結 果 各 、 、 以下 の こ とが明 らか と な っ た 。 〕V B 照 射 時 及 び U V A 照 射 時 の 溶 血 の 機序 と し て U V 照 射 に よ る m aj o r T y p e Ⅱ 反 応 に より 生成 した o 2 が 膜 脂 質 を 過 酸化 し そ れ が 自 動 酸 化 反 応 に よ っ て 増 大 し p E O O H 及 びP C O O H 含 量 が あ る 定 レ ベ ル に 達 し て 溶 血 を 引 き 起 こ し た こ とが 示 唆 さ れ た 1 、 一 一 。 方 U V B 照 射 時 と U V A 照 射 時 で は エ ネ ル ギ の 差 増感 力 の 差 等 に よ っ て 溶 血 へ の 自 動酸化 反 応 の 寄与 が 異 な り U V B 照 射 時 の 方 が 自動酸化 反 応 の 寄与 が 小 さ い こ と が - 、 、 明 、 らか と な この こ っ た 。 とか ら 、 U V A の 生体 可能性が 示 唆 さ れ た へ の 影 響 はU VB と は少 な く と も 一 部 は 異 な る 機序 に よ る 。 またU V 防御 剤 の 溶 血 や 過 酸 化脂 質含 患 へ の 影響 を 検 討 し た 結 果 、 ウサ ギ 赤 血 球 を 増感 に よ る 溶 血 率 や 過 酸化 脂質 合 壁 を 指標 と す る 方 法 が U V 防御剤 の v/tr o 評価法 に 成 り 得 る こ と が示 唆 さ れ た 用い U VA H P I 、 ' o - 39 - ・ In 第Ⅱ章 3 OV A 次 元 培養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル に 対 す る - へ マ トポル フ ィ リ ン 増 感 の 影 響 - 40 - 第Ⅱ 章 第 一 節 増 感 に よ る細 胞毒性 u V A 著者ら は 前章 で 生 体 膜 モ デ ル と し て ウ サ ギ赤 血 球 を用 い (H P) 存在 下 U V A また は ∪V B を 照 射 し こ と を 報告 した それが 自 動 酸化 反 応 に よ U V A の 生体 た o の へ 影響は U しか し な が ら こ れた知見 をそ の の モ こ 。 っ V B ま た 溶血 に 先 立 、 っ へ リン フィ 影 響を検討 し の 、 て 過 酸化 脂 質含 量 が 1 れ よ り ∪∨ 照 射 に よ り 生 成 し た o 2 が 膜脂 質 を過 酸 化 し て増 大し て 溶血 を引 き起 とは少な く とも 一 こ と とした の こ した こ と を示 唆し た そし 。 、 て 部 は 異 な る 機序 に よ る 可能 性 を 示 唆 し デ ル は 比 較的単 純 で メ カ まま生 体に当て はめ る を用 い て 検 討 をす る トポ ル 溶血 率や 過 酸化脂質含 量 、 照射時間 及 び H P 濃 度 に 比 例 し て 溶 血 が 起 き 増加す る へ マ 、 ニ ズ ム の 解 析 は し やす は 困難 で あ る 。 そ い 反面 よ り 生体 に 近 こで 得ら 、 い モ デル 。 本章で は 従 来 の 単層 培養細胞 よ り も 長 期 間培養 が 可 能 で あり 、 真 皮 線 維 芽細 胞 が 細 胞間物質 を 分 泌 す る の で 細胞 の 存 在 環 境 及 び 細胞 間 相 互 作 用 が よ り 生 体 に 近 い 3 次 元 2' M 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( S ki n ) を 用 い H P 存在 下 U V A 照 射後 に 生 じ る 細胞毒性 へ の 、 影響 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 ま た U V A 防御剤 の 影 響 に つ - 41 - いて も検 討 を行 っ た 。 実験 材 料 と 方 法 2 1 1 ・ . (1) 細胞 2 'M 3 次元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( S ki n z K1 301 殖さ せ 角 層 を形 成 さ せ た も , 株式会社 よ り 購 入 し た 層 ( ラ ンゲル れて い る ハ S kj n の 2 T ” o 線維 芽 細胞 の 上 に ケ ラ チ ノ サ イ ト を増 , メ ラ ノ サ イ ト は 存在 し な い ) はオ リ 。 z K1 301 の 分化状態 を Fi g Ⅱ 1 1 に示 す 上 層 の 表皮 ン ス 細 胞 お よ び メ ラ ノ サイ ト は な い) 下 層 の 真皮 層 の 2 つ に 大 別 さ o - ・ hu m an a nd X2 5 0 ・ . , 。 = s - ・ ` Fi g Ⅰ エ ンタル酵母 ‖i s t o 且o g i c a J ki n m o cr o s s 増 e C d e 書( S k 青n 2' ” 軸 oず n z K 1 3 0 1) 触 a e o sin . - 42 - 納e r 伽 e e s 旭i n i n g - 叫 di w 巧 ・ ▲ ・ , . r . m e m si o m aE 肋 h u nt 柑 at e a e m at o x y 伽 d (2) 試薬 3 ( 4 5 di - - ・ トはオリ エ eth m ylthi a e n z o yl m ト2 y l) 2 5 di p h 1 - e n y lt e t r a z oli u m - , ン タ ル 酵 母 株 式 会社 よ り 購 入 した 標準 サ ン プ ル D ( p dib z o e th - eth o xy m 5 % a n e : ci n n a m ic a c id 2 - P o r o t e c ti o n th y [ h e S トD ) は 日 本化粧 品 工 bro e x yf m id UVA (3 5 0 380 n m 定時間照 射 し た 20 時間イ ン キ 80 「 M TT p ・ ・ m ・ o エ , 極大 波 長 照 射強 度 は ペ シ - ' n m V J a bi(it y A s s .0 A , r ( % ) (A s s.. - A b ・ ・ p ・ /A 54. 3% 2 4 t e ll - , m ・ - 業会 よ り 譲 り 受 けた で あっ た m M ¶ 、 UVA ベ s ol u ti o n ュ べ - シ b u ty ト4 の 入 た新し っ - ン した い M ¶ o c 5.. 下記 - Ab の 式 よ り 生存率 を求 め た ) X 5.. 、 ッ e th o x y o シ ン し た後 に ョ プレ を用 いて ュ ベ 37 一 ℃で ト に移 し ー 山ti o s o で 振 と う し な が ら室 温 で 1 時 間 イ ン キ 、 ㌧m 照 射終 了 後 H P を 除 い て o ョ セイ キ ッ ( P F A ) 測定 用 を 紫 外 線 照 射 装 置 ( 山下 電 装 製) W /c m お よ び A b 5 . . はサ ン プ ル の吸光度 を示 す ) 時 間イ ン キ 吸光度 を 測定 し の = c 5.. 60 7 O n m ン した 後 ョ で 振 と うしなが ら 2 抽 出液 を加 え て て 5 40 365 r of f a ct o (3) 細胞 の 生 存 率 の 測 定 2 無 血 清培 地 中 に H P を添 加 し た S ki n を 1 時 間 プ レ イ ン キ ュ - ( M T T) ア e を洗 n ー シ っ ョ 、 た後 ンし o 100 未照 射 コ ン ト ロ 。 - 43 - ー ルおよび ブラ ンク の 540 n m 結果 2 1 2 - - (1) U V A H P 増感 の 細胞 の 生 存 率 に 与 え る 影 響 ま ず U V A の 照 射時 間及 び H P 濃 度 の 細 胞 毒 性 - 分間照 射 し た と 60 かっ た 減少 し しか し o 2 、 H P 非 存 在下 で は 6 0 , 5 0 LJ M - 存在 下 で は 照 射 時 間 の 増 加 に 伴 っ て 生 存 率 が 有 意 に の H P を示 し た ( Fig Ⅱ 1 2 ) 時で 1 2 % - U V A を0 か ら 0 分 間 照 射後 で も生 存 率 に 影 響 を与 え な 存在 下 で は 1 5 分 照 射時 で 8 3 % 5 いM H P 、 ころ 響 を検 討 した の影 へ 3 0 分 照 射時 で 3 0 % 、 60 、 分 照射 - 0 . 1 4 0 - ・ ぺ) H P O LJ M - 1 2 0 > 1 0 0 p . llI d J hl■■ H P I LI M + H P 2 LI M ♯ H P 5 LJ M + H P I O LJ M # H P 5 0 L) M ★ ★ l J P a . + ★ ★ ★ 望 ★ ★ ★ 8 0 . > 辞 6 0 ★ ★ ★ ト ト 4 0 冨 ★ ★ ★ 2 0 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ 0 0 Fi g Ⅱ 1 ト2 E 触 ・ o n vj a S ki n 2T M D at a b = ty s a m ct s oず S pl e s n o kj n . t[ y d 肘 e r e D nt 3 0 ず ir 4 5 di a ti o ra . of f o u r fr o m c o n w ith tro[ 、 7 5 d a n e られ な か っ UVA P ' , たが < . ' ' , . P 5 した と こ ろ 6 6 % 存率 を 示 し た の 0 01 p o から 、 5 ' 5 0 LJ M o r p h y ri m ( m i m ) c o n c e 舶 r a ti o m P < 0 001 . . ま で 変化 さ せ 生存 率 に 、 濃度 が 2 LJ M 以 上 よ り 渡度依 叫 M で 3 % を 示 した ( Fi g Ⅱ - . の 両 方 に 存在 し て の H P 今 度 は 真皮 側 に 1 0 LJ M 生 存率 を示 し た * ' , . U V A 照 射時 で は H P 、 は H P は 表皮側 及 び 真皮 側 ( 培 地 中) 11 % の生 < at o m e 非 照 射 時 で は H P 濃度 が 5 0 H M で も生 存 率 在位置 め影 響 を 検 討 す る た め に 表 皮 側 に 5 0 0 p M 、 e 骨岳m m . . 0 05 UVA . 存的 に 生 存 率 の 有 意 な 減少 が 見 られ ころ h 適r F a d i a 朋o . 濃度 を 0 H P 与える H P 濃 度 の 影 響 を検討 し た で の 実験 で ti m m e a s u r m e nt s m そ こ で 照 射時 間 を 3 0 分 と し の 有意 な 減少 は 見 6 0 2T ” i r r a di a t e d w e re m e a n ±S are Si g nifj c a 1 5 。 - 44 - を添 加 し の H P 、 い ト 3) たが . ‥ こ れま H P の局 U V A を照 射 し た と を添 加 し 、 U V A を照 射 1 2 0 + C o n t r o) + U V A 30 1 0 0 ” 盟 I P 還 8 0 ★ ★★ ★ ・ in m f6 1 沖 } ■ 芸 6 0 巨40 ★ ★ ★ ★ ★ = ★ ★ 2 0 ★ ★★ ★ 0 0 Fi g I 1 3 ・ - . s ki n D at a 2' ” sa a re Sig nifi c m 川 E 触 ct p[ e s 3 0 o ずh e m a t o i r r a di a t e d w e re m e a n ±S a n tl y 2 0 . D . of si x p 4 0 o r w re nt fr o m p h y r旨n it h U V A m e a s u r m e nt s ' d Jff e 5 0 c o nt ro( , … P (3 5 0 - . . - M P c o n c e nt r a 0 001 < 6 0 45 - . 380 n m ti o c o m c e m 骨 柑骨 雇o m n ) fo r vi a o n 30 m jn . b ㈹y o ( P WF) f S ki m 2 TM (2) 紫 外 線 防 御 剤 の 影 響 〕V A 防御剤 で あ る S トD を表 面 に 添 加 し 度依存 的 に 生 存 率 回復 した ( Fi g 刀 . - 減 少 が 有意 に 抑 制さ れ の 1 4) 細胞毒性 、 o 5 、 g/ c m . の影響 ヘ m 2 を検討 し た と 以上 で トロ コ ン ころ 、 濃 ル レベル に ー - o 瑠2 0 ### ### 0 5 1 O □ ∪V A 3 0 m 1 0 0 ★ ★ , 者 ### 8 0 ■■d II a 絹 - ■ > 6 0 S 巨 4 0 ≡ 2 0 ★ ★ ★ 0 c o n せr o E 0 S W Fi g - Ⅰ ・ 1 E ff e 4 ・ c c o n c e n t r a ti o n ' S kJ n 2T” H P fo r 3 0 D at a a re Sig nifj c ★★★ m m in . a n s 帥 w e re . c o m c e ずa o o n O V A e v q 柵 朗i ( m g/ e o m i r r a di a t e d o 甘S k i ith U V A w 空 ) m (Sta m d s u m s c r e e m i a b 獅t y 、 d sa m pj e n m ) j n th e p a r D ; S t D) 2' ” m (3 5 0 3 8 0 - re s e n c e of 10 u M . e a n s a n tl y P 〈O 0 0 1 Sig nifi c pJ e s a m t 0 2 ±S diff e . D r e nt . of fro m fr o m fo u r to si x c o n t r oJ m e a s u r m e nt s (n o n i r r a di a t e d , ith w - o ut H P) g r o u . tl y diff e r e nt th e SID 0 m 2 g/ c - gro m 46 - u p , # ## p < o o o1 . . p ' , ' P < 0 01 . , in 考察 2 1 3 - - 皮膚 は常 に 外 界 と 接 し 様 、 紫外 線 が 大 きな 影 響 を 与 え て 3 5 51 ) 赤血 球 や ヒ ト 線 維芽 細 胞 ・ な 酸化 的 ダ メ 々 い る 52 そ o ) ジ を受 け て お り ー こ で 紫外 線の 生体 ケ ラチ ノサイ ト 5 3) の へ な どが 、 そ の 一 因 と して太 陽 影 響 を検 討す る た め に 、 ・ デル と し て 用 い 最 近 ( 1) 従来 の 単相培養 細胞 に 比 べ て 長 期 間 の 培養 が 可 能 で あり ( 2) 真 皮 に あ る 線椎 芽 細 胞 が コ ラ ゲ ン な ど の 細 胞 間 物 質 を 分 泌 す る の で 細 胞 られ て きた しか し o 、 、 vitr o /n モ 、 ー 、 び 細胞 間 相 互 作 用 が よ n の存在環境 及 不要で あ る てき た o な ど の 理 由 か ら S kj n 、 Ed w a rd s ら 5 4) は S ki n 2T ” 2T ” ' ' n に近 く vI v o か 、 つ ( 3) 試 験 時 に 無 菌操 作 が 、 ・ が ・ In 表皮モ デ ル と し て 用 い られ る よう に な っ v /tr o に U VA (3 2 0 - 4 00 n m ) を照 射 し 、 U V A 単 独 や 紫外 線吸収 剤存 在 下 で は 細胞 毒 性 を 示 さ な い が 8 メ ト キ シ ソ ラ レ ン ( 8 M O P) や ク ロ ル プ ロ マ ジ ン な ど の 光 増 感剤存 在 下 で は 濃 度 依 存 的 に 細胞 毒 性 が 見 られ た と 報 告 し て い る - - 。 方 C oh 一 e n 、 ら 5 5) は ヒ ト 表 皮再 構築 モ デ ル ( E PJ S K r N ) に ク 〕V A を 照 射 し た 時 及 び 大 量 の ∪V A こ と を報告 れる 特に フ リ して い る ロ マ ジ ン 存在下 ) を 単独 で 照 射 し た 時 に 細胞毒 性 が 見 ら m こ の ∪V A 、 ルプ 照 射 に よ る 細胞毒性 発 現 のメ カ ズム ニ ラ ジカ ル や 過 酸 化 脂 質 の 生 成 と の 関 連 を 考 察 した 報 告 は ほ と ん どな い ー れらを 明 らか に す る る しか し 。 ( 3 0 +/ c ロ 2 こ と は 生体 の へ 、 こ o 紫 外 線 の 影 響 を予 測 す る う え で 重 要 だ と 考 え ら れ 。 本節 の 結果 で は E d から , w a rd s 理 由として C その h o どが考 え られ る o は見 られな か た こ とか ら っ o 6 %) 、 が見 ら れ た が っ た 。 著者 ら 加し 50) こ の こ とか ら は ウ サ ギ赤血 球 に p 、 と な い で も生 存 率 の 有 意 な 減 少 1 培 地 中 に生 じ た o 、 ∪V A 、 生存 率 の - HP 2 によ っ て線維 1 増感 に よ っ て 生 成 した o 2 真皮 ま で 達 し た こ とが 細胞 毒 性 に 主 と し 、 。 r o t e c ti o n f a ct o r of UVA 存在 下 U V A を照 射 し て 溶 血 率 を 測 定 し H P 、 とが 示 唆 さ れ た 違 こ 真皮 側 に 添 加 し た 場 合 は や や 減少 ( 生存 、 に より 表皮 に生 じ た 傷害 が 経 時的 に 増 大 し て 関与 し て い る こ 50 u M た 響 は ほ と ん どな い こ とが 明 ら か と な っ ジ を 受 け た可 能性 は 少な く - っ い て い る 細胞 が 異 な る こ とや 照 射光源 の H P そ の もの の影 が見 ら れ た程 度 で あ 芽細胞 が 直接 ダメ ら と用 影響 を 検 討 す る た め に 表 皮側 に H P を添 加 した 結果 有意 な減 少 ( 生存 率 1 1 % ) 率6 e n ま た U V A 非 照 射 時 で は H P 濃度 が H P の 局在位 置 の た ら と 同 様 に ∪V A 単独 で は 細胞毒 性 が 見 ら れな か ( P F A) 既 知 の U V A 防 御剤 を 添 P F A と 溶血 を 5 0 % 抑 制す る 防御 、 剤の 濃度 の 逆数( 1 /J C 5 .) が 有意 に 相 関 す る こ と を 報 告 し l /[ C 5 . が U V A 防 御剤 の 評価 の指標 に 成 り 得 る こ と を 示 唆 し て い る し か し 分散 し に く い 物質 や 賦形 剤等 が 溶 血 、 。 、 に影 響を 与 え る サ ン プ ル は 適 用 困 難 で あ る こ と か ら の評価 法 を 開 発 す る た め に U V A 防 御剤 の 評価 法 ヘ , の 本 節 で はよ り 生 体 に 近 い 条件 で 応 用 も 検 討 し た 結果 剤 の 濃度依存 的 に 生 存率 の 減 少 が 有意 に 抑 制 さ れ た こ と か ら デルを用 い vitr o 、 UV A 、 3 、 U VA 防御 次 元 培養 ヒ ト 皮膚モ 防御 剤 の 細 胞毒 性 防御効果 を 指標 と す る 方法 も 防 御 剤 の 有 用 な I n ・ 評価 法 と な る 可 能性 が 示 唆 さ れ た 要があ る と 思 わ れ る 。 今後他 の 防 御 剤 に つ い て も 同 様 に 検 討す る 必 。 - 47 - 第 Ⅱ章 第二節 増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生 成 U V A 著者 ら は 前 節 で よ り 生 体 に 近 い 3 次 元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い リ ン( H P ) 存 在 下 U V A を 照 射 し 及び H P 濃度 に 比 例 し て 生 存 率 1 o 2 によ り表 の 影 響 を検 討 し た の 有意 な 減 少 が 起 き 1 、 培地 中 に 生 じ た o と を示 唆 した こ 抑制 され た こ と か ら っ の 結果 - っ 、 フィ 照 射時 間 て 生成した こ と が 細胞 毒 性 に 主 に て 線 維 芽 細 胞 が直 接 ダ メ ー ジ を受 け る 可 能 ま た U V A 防御剤 の 膿 度 依 存的 に 生 存 率 の 減少 が 有意 に 。 次 元 培 養 ヒ ト皮 膚 3 、 によ 2 そ 。 トポ ル へ マ ∪V A H P 増 感 に よ 、 皮 に 生 じ た 傷害 が 経 時 的 に 増 大 し 真 皮 ま で 達 し た 関与し て お り 性は少 な い 細胞毒性 へ 、 、 デ ル を用 い モ 、 U VA 防御 剤 の 細 胞 毒 性 防 御 効果を 指標 と す る 方法 が 防御剤 の 有 用 な I n vitr o 評価 法 に な る 可 能性 を示 唆 した ' 方 , すく 表皮 の 脂 質 、 の 10 % 約 表皮 の 酸化 の 第 一 を 占め る の タ ー ス ゲ ッ ト とされ 過酸化物 の ス ク ワ レ ン モ ノ ハ イ ド ロ ている 3 0 3 1) ・ 。 こ れが 直接 、 ペ ル 3 O) 二 重 結合 が多 い た め 酸化 さ れ や 1 試験管内 で は S Q は o 2 と 反 応 し て 、 オ キ シ ド( S Q O O H ) を生 成 す る 1 こ と が知 られ によ り 表皮 に S Q O O H が 生 成 し 著者らは この S また は 次 的 に 生 成 した 他 の 過 酸化脂質 と 共 に 細胞毒 性 に 主 に 関 与 し て 二 Q O O H に着目し い る と い う 仮説 を 検討 す る た め SQO O H ク ワ レ ン( S Q ) は 一 o 含 量 及 び 2 thi o b - 更にそ れ ら の 細胞 毒性 と 、 a r bit u ri c の 、 本節 で は S ki n a cid 相関に つ r e a c ti v e いて o 2 2 TM s u に H P 存在下 U V A を 照 射 し b st a 検討 を行 っ た - 48 - n c e s 。 (T B A - R S) 含 量 につ 、 、 いて 、 実 験材料 と 方法 2 2 1 ・ ・ ・ (1) 細胞 3 次元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル は 前節 と 同 じ も の を用 い た 。 (2) 試薬 防御剤( S 〕V A 翼博 士 松 は前 節 と 同 じ も トD ) を用 の 河 野 善行 博 士 よ り 譲 り 受 け た 、 (3) 細胞 の 生 存率 の 測定 細 胞生 存率 は 前 節 と 同 じ 方 法 で 行 た っ た い S Q O O H 。 標 品 は 資 生堂 ( 秩) 高 の 。 。 ) (4) T B A R S 量 の 測 定 u v A を 3 0 分 間 照 射 し 上 述 の よ う に 3 ( 4 ふ di m 48 ・ - dip h e ny lt e t r a ‖u z o b m ro m id ドデ シ ル 硫酸 ナ トリ ウ ム 0 (T B A) 1 5 . ノ ー ル : m . e 2 ( M T T) ア m I 2 0 % , I を加 え て 9 5 ℃ で l ビリ ジ ン 混液( 1 5 : 1) を取 り 出 し た 20 。 ッ セ イ を行 酢酸 1 5 . m 時間 反 応 さ せ た 5 分 室 温 放 置後 5 3 2 ン の 吸光度 と 比 較 し て T B A R S 量 を 求 め た た後 - - n に8 1 % の . - . 。 - , 2 T” の S ki a rbit u ri c 急冷後 イ オ ン 交換 水 1 r . p . m . で 15 吸光 度 と 測定 し の n m っ l+ 2 y I) 2 5 I 及 び o 8 % 2 thi o b ほ 加 えて 3000 m e t h y Jthi a z o 、 a cid l 及 び ブタ m 分 間遠 心 分離 し テトラ エ 、 - 上清 トキ シ プ ロ パ - ( 5) S Q O O H 定量 の標品 の 膿 度既 知 ( 7 H P を添加 し 、 . 75 n m U o m 5 6) ]) の S Q の エ タ ノ ∪V A を 1 0 分 間 照 射し 較 し新 た な 標 品 ( S t) を作 成 し た 供し S Q は 2 1 0 n m した H P L C 装置 の シス テム の 。 吸収 で 、 、 ル 溶 液 に 終 濃度 が ー 生 じた S Q O O H ■ S t の 1 0 LJ の 1 0 LJ M になる よ うに 含 量 を譲 り 受 け た標 品 と 比 ほ 化学 発 光 H ( C L H P L C) に S Q O O H は化 学発光検出 器 で 定 量 を 行 っ た 今 回 使 用 ブロ 測定 は o - PLC - 。 ッ ク図及び H P L C - 49 - の 分析 条 件 を Fi g Ⅱ . - 2 1 - に示す 。 S Pl ” a P2 R C L W a A Fi g Ir 2 1 - s q u aBe n e c o n ・ u m h e diti o a ti c m hyd , m n m , ( C ) : S hi s e id M o bil e p h a s e ( A) : M L u mi n e s c e nt r e a b o rat e S a m b u ff e r (H , s ol u ti o n p一e g dia g w oず C ra m L ‖P L C y st s - fo e m r a s s ay of l ro ( U C L) : U S hi m r 恥 e r o x id e p n s ( P l P 2) : P I S hi p D et e c t o C o) u c o m o m CL H P L C P S - . z u d a z u LC 6 A ( B) : I 10 - いJ R , a 2 てo rat e w 1 0 p g/ KC L N a d z u (2 1 0 n m ) C 1 8 (2 5 0 X 4 - (fl o ( S) : , S P D 6A e t h a n o一 B P 2 S hi m - C A P C E LLPA K o e nt B O d a l m C O c 3 )/ m l yt o c h ro m m e c o rd e r - CL S , ・ o m S 3400 a - i d) 6 m a n d 2 LJ g / m 暮) u m . ・ i n) e P H 1 0) (fl o LC 8 A c w r at e に1 m l 1 m ・ V m m i n ol i n 5 0 m M i n) ( R) ■ W at e r ci r c ul a t o ( 6) S ki n 2 ' M r ( W ): S C I N [ C S C H 201 中 の S Q 及 び S Q O O H 含 量 の 定量 T B A R S 量 測 定法 と 同様 に処 理 し た S ki n 2' ” - 10 pp ( 2 :1) 2 プ チ ル ヒ ド ロ キ シ トル の m m l で 2 回 抽 出 した ル 混液(1 ) :1 。 に 再 溶解 さ せ た . そ を含む ク エ ン ( B ‥T ) 脱水後 、 [ の リ ン 酸 b uff e r( p H 7 A ) を 加 え 減圧 乾固 し , ロ ロ ホルム 1 0 0 =l の 冷ク : メタノ ロ ロ ホルム : メタ ノ を上 述 の C L H P L C に 供 し て 測 定 を 行 の 1 0 りI - s Q 及び s Q O O H は S t と 比 較 して 同定及 び定量 を行 - 50 - っ た . 、 ル混液 ー っ た ー o 結 果. 2 2 2 - 「 2T ” 中の T B A R S 量 へ の影 響 ( 1) U V A H P 増 感 の S ki n 2T ” に U V A を 30 分間照射し H P を l 5 0 いM 含 む S kj n - - S ki n - 生量 影響 を 検 討 し た の ヘ で ほぼプ ラ ト に達 し た ー な か っ た ( Fi g Ⅱ - . 2 2) 濃度 が H P o なお U V o 以 上よ り 5 p M 、 の - RS - の 産 10 u M 、 有 意 な増 加 は見 られ - . 用 5 ご 中の T B A 有 意 な増 加 が 見 ら れ , 非照 射 時 で は T B A R S 量 A 2T ” c o n t r o[ + - ∼ 4) > - - ∼ * ” * - ㊨ UVA 30 - in m * 0 ∈巧 0 . 巳 ヽ■■■′ d J E Q) ヰ山l O 呂 O 5 . ∽ a: ! 孟o 0 。 ド 0 F ig Ⅰ 2 2 - E ずf e c t - . a c id S ki n D at a 1 0 帽 a C書 iv e 2T ” are Sig nifi c (2 ) S ki n p- e s a m m e a n a n tly 2 T M s ずh b st 3 0 e m at o 士S D . th r e fr o r e nt m c o m c e n U V A fo ith 30 r m e a s u r m e nts c o n t r ol へ の P ★ , 検 出器 の Fi9 Ⅱ 2 3 B - . , 測定 し た と こ ろ コ ントロ - てSQ O O H 、 、 ∪V A o m o n 12 o m 紙i o b a r 一 (p M ) b it u ri c < 0 05 ' ' ★ , . SQ l m m in P < . 0 00 1 . . ロマ ト グラ ム を F ig . Ⅱ - 2 3 に示す - Fi g Ⅰ 2 3 A - o - . , D が 化学発光検出器 の ク ロ マ ト グ ラ ム で あ る が S t 及 分 に 検出 さ れ た そこ で U V A を 照 射 し ti a 帥 a 息i . びサ ン プ ル と も U V 検 出 器 で は S Q が 保持時 間 1 . tr c o m c e m 影響 未照 射 の サ ン プル の ク では S Q O O H が 6 4 M P 6 0 p h y ri m o r w e 中 の S Q O O H 含量 - 5 0 c o nt e n t a n c e s of . 堵0 p i r r ai a t e d w e re diff e St 及 び u v A C がUV s u o 2 0 ol . 6 0 - 分 に検 出さ れ 化学発光検 出器 、 S / N 比 2 で の 検 出限界 は約 0 1 p . 当 たり Q O O H の S の m o] であ 含 量 ( ス ク ワ レ ン 転換率) っ た 。 を 非照 射 時 で は ス ク ワ レ ン 転換率 の 有意 な 増 加 は 見 ら れ ず ほ ぼ ル レベ ル で あ っ た 一 o 方 、 U V A 照 射時 で は 照 射時 間 及 び H P 濃度 に 比例 し 含 量 の 有意 な 増加 が 見 ら れ 3 0 分 間照 射 時 で は 細胞毒性 や T B A R S 量 の 有意 な 増 加 が 見 ら れ な い - 、 H P 濃度 1 いM 以 上 よ り 濃度依 存 的 に 有意 な 嘩加 が 見 られ - 5l - 、 叫M で 1 コ ン トロ ー 含量 の 有意 な 増 加 ル の 約2 倍 に 達 した 7 ・ が 見 ら れ た ( Fi g Ⅱ o - . なお 6 o 2 4) 0 分照 射 時 で はH 非 存在 下 で も P - Sl o S a a m p すe 育 ⊂ (⊃ r Cu ヽ ′ ′ - ⊂ 0 P a - L ●- ∫ くJ I 也) ● ■ ■■一 ∼ ■ ■ 【= 0 _ 也) 0 ▼  ̄ (= ↓ a , ● ヽ ∽ < S Q ↓ S Q B D a∽ SQ O O H . ⊂ ¢ ヰ J ー ⊂ ¢ U ⊂ 宕喜 ∼ (J 普 〔: 毒↓ S Q O O ‖ ↓i 山 U 10 Fi g Ⅰ 2 3 C h ・ - ・ m o n o hy d n m or ) an S ki n 2' ” ro d p s a r o m at o , u ni rr a di a t e d 20 g e r o xjd e m pl e z K1 3 01 (A C) U V ( 2 1 15 0 n m w o f ra m (S m ) d o 甘a d st a n a rd Q O O ‖, 5 6 1 p m o ・ ix t it h C L 10 醐i m ・ e t e c ti o n u re o f S Q O O ‖ of m l) a s a s ix t 15 u r e w e w e H H 20 o f a s a s S Q M 盲n s q u ale n e s q u al e n e o bt aj n e (S Q 7 7 5 . d 柑o , m , ‖P L C ・ ( B D) C h , e m ‖u . - 52 - m in esc e n c e d e t e c ti o n . S a m pl e s w er e 1 2 6 p く} - - - U VA O - - UVA 15 m in U VA 30 m in U VA 60 m in m 舌n a) - I 塘 - 苛巧0 E . サ ヽ■l■ Id - 呂O 8 , 虹 r - - ≡ o ニ ∈ 6 . C) ★ ☆ ∼ o § O ★ 4 . ★ ★ ★ = 0 0 2 0 0 . ∽ o o . 0 Fi g Ⅰ 2 4 - E 鵬 ct ・ . m o n oh yd 2T ” s ki n D at a 2 ro s a m pl e s S ig nifi c a n tl y diff e P 〈O 0 0 1 . f h o e r o xi d e p . D r e nt 6 c o n t fr o w h y ri m ‖P 1 2 c o m c e n ith U V A t r a ti 肘a 紬 c o n c e n o m o n s q ( p M) m u a[ e m e ・ m e a s u r m e nts c o nt rol m 1 0 e nt of t h r e e . 8 m a 紬 p o rp e i rr a di a t e d w e re m e a n s ±S are 4 (no n . i rr a di a t e d - w it h o u t H P) g ro u p . P A , < 0 05 ・ ' ' * , . (3) 紫外 線 防御 剤 の 影 響 uvA 防御剤 で あ る S を表 面 に 添加 し トD 、 濃度依存的 に S Q O O H 含 魔 の 増加 が 有 意 に 抑制 さ れ レベ ルに 回 復 し た( Fi g Ⅰ 2 5) - . - . - 53 含量 へ SQ O O H - , 1 m の g/ c 影響 を 検 討 した と こ ろ 2 m 以上 で コ ント ロ - 、 l t, 0 6 . ∪V A 3 0 □ ★★★ ★ ★★ m 0 5 6 ・ ∽ ■一 0 暑o 4 . ■ 一 0 ≡ ≡ o ニ ⊂ 3 . V ∼ C 0 o 1 0 2 . ## ≡ 0 0 a ∽ 0 1 . 0 0 - c o m 鰍o ) 0 0 2 St D Fi g Ⅰ 2 5 - E 鵬 ct - ・ 帥 aL朋 o m c o n c e n 2T ” S ki n H P f o r 30 D at a a re Sig nifi c Sig nifi c m m in o m s s w er e s u m s c re e m ( hy d ro u a 耳e m e m i r r a di a t e d w q ( m g/ c c o n c e n t r a ti o n O V A o m o 1 0 . ith U V A . 2 ) m 朗 aL n d a r d p s a m e r o x id ¢ (3 5 0 - 380 n m c o m ) in th 旭 m e pre . D . of diff e r e nt fr o m diff e r e nt fr o m th re e m e a s u r m e n ts ) せ s e n ce of l O りM c o ntro一 (no n . i r r a di a t e d - w ith o u t H P) g . a n tJ y D; S W p 日e . e a n s ±S a n tly P 〈O 0 01 . pl e sa m oず a 0 5 . th e SI D 0 m 2 g/ c - gro m 54 - u p ## p , < o o1 ・ , ro u p ★ , P <0 05 . ' , ' ' in 考察 2 2 3 ・ - 5 7) 小山 ら は ヒ ト の 額 に S Q を 塗 布後 太 陽 光 線 を照 射 し びT B A R S 含 量 を測 定 し た と ころ ・ 、 照 射後 の S Q O O H 含 量 及 、 照 射時 間 に 比 例 し て S Q O O H 含 量 及 び TB A - RS 含量 の 増加 が 見 られ ビタ ミ ン E や カ テ キ ン な ど の 抗酸化 剤 の 添 加 に よ り こ の 増 加 が 58) は ヘ ア レ ス マ ウ ス の 器 官培 養皮膚 顕著 に 抑制 さ れ た と 報告 し て い る ま た 中 山 ら 、 。 に 〕V B を 照 射 し 組織中 の T B A R S 含 量 が 有意 に 増 加 し アス - 、 ス テル の 添加 に よ り 、 コ ン トロ ー 、 ル ビン 酸 リ ン 酸 エ コ ル レ ベ ル ま で 減 少 した と 報告 し て い る o 2T M 中の 本節 で 著者 は 細胞 毒 性 及 び T B A R S 含 量 の 有意 な 増加 に 先 立 っ て S ki n また 前 節 の 結 果 を 考 慮 す s Q O O H 含 量 が 有意 に 増 加 す る こ と を 初 め て 明 らか に し た - 。 ると UV A H P - 、 応 に よ りあ る 1 た o によ 2 しか し 、 っ 一 1 増感 に よ っ て 生 じ た o 定 レ ベ ル以上 に増 て 線維 芽 細 胞が 直 接 ダ メ ∪∨ 照 射 に よ り コ ラ ク変性 も細 胞 毒 性 に 関与 し て SQ O O H UVA 大す る - 皮表 に 生 成 した S Q O O H が 自 動 酸化 反 に より 2 こ とが 細 胞毒性 に 主 に 関 与 し ジ を受 け る 可 能性 は 少 な ゲ ン の 変性 が 起 こ る ー い る もの と思われ る 含 量 増 加 を 有 意 に 抑制 し た ことか ら 、 3 。 5 9) い こ 、 培地 中に 生じ とが 示 唆 さ れ た こ と が 報告 さ れ て おり 、 タ ンパ 更 に ∪V A 防御 剤 の 漉度 依 存 的 に 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い 防御剤 の S Q O O H 含量増加 抑制効果 を 指標 と す る 方法 も 防御 剤 の 有 用 な i n 評価法 にな る 可 能性 も 示 唆 さ れ た 。 - 55 - 。 、 ' v Itr o 第 Ⅱ章 第三節 増感 に よ る P G E 2 放出 u V A 著者 は前 節 で 3 次 元 培養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル を 用 い 下 U V A を 照 射 し 2 t hi o b a rbit u ri c a cid r e a c ti v e s u b 、 へ マ 、 H P 増感 に よ っ て 生 じ た る 一 一 、 方 R h ei n s ら 6 0) により 2 こと る ため に 、 を示 唆 し て H P 含量 へ 2 , l し1 こ と が 細胞 毒 性 に い る 。 α の の - 影 響 を検討 し た 主 に関与す る 、 の S ki n 放 出 量 の 増加 を報 告 し 本 節 で は ∪V A に つ 細 胞 毒性 と の 相 関 に つ て検 討す る た め に U V A そして U V A い て いて - 防御 剤 及 び 抗酸化 剤 を 添加 し - 56 - , 細胞毒性 に 炎 症 反 応 が 関 、 エ 2 寄 与 を明 らか に す の ー 更 にそ 。 PG E o z K 1 3 0 0 に U V B を照 射 も 炎症 反 応 検討 した を示唆した こと 2 T” 存在 下 U V A を 照 射 し て 炎症 の ケ ミ カ ル メ デ ィ の 影 響 を検 討 し o 皮表 に 生 成 し た S Q O O H が 自 動 酸化 反 応 に よ り あ は 3 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル 細胞毒 性 及 び P G E 与す る へ o 定 レ ベ ル 以 上 に 増大 す る 、 し 1 リ ン ( H P) 存 在 フ ィ (T B A R S) 含 量 及 び ス ク st a n c e s - 、 ワ レ ン モ ノ ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド( S Q O O H ) トポル 放出 へ タ の - の P G E メカ ニ 2 放出量 ズム に つ の 影響 を 検討 し た い 。 実 験材 料 と 方 法 2 3 1 - . (1) 細胞 と 同 じ も の を用 い た 3 次元培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル は 前節 。 (2) 試薬 い た P G E 2 e n Z y m e i m m u n o a s s a y ( EI A) u v A 防御剤( S t D ) は 前 節 と 同 じも の を 用 よ a n nit oI ( M A ) は 関 東 化 学 ( 樵) kit はオリ エ ン タ ル 酵 母 社 よ り 購 入 し た N a N , と m - o 。 また そ り , の の試 他 薬 は 和光純 薬 ( 株) よ り 購入 し た o (3) P G E 2 ア ツセ イ 2 ' M シ ョ ン後 に U V A を 0 を 1 時 間 プ レイ ン キ ュ ベ 培地中 に H P を添 加 した S ki n 2 照 射終 了 後 H P を 除 い て 3 7 ℃ 5 % C O 2 湿 度 6 0 分間( 強度 0 2 5 2 +/ c m ) 照 射 し た シ ョ ン し 0 4 2 0 時 間 後 に 培地 を取 り 出 した 5 0 9 0 % 以上 で 2 0 時 間 イ ン キ ュ ベ - - ′ o ・ , - 、 u] の 培地 と 5 0 u l の ア がコ - ッ セイ メ デ ィ ウ ム を 取 り テ ィ ングさ れ た 9 6 穴 ナル) を 加 え て 2 - , 8℃で1 プレ - ウ サ ギ の I g G 抗体 ( ポ リク ト に 添加 し 時間 イ ン キ ュ ベ 1 00 、 シ ー o , 、 - ョ =I の P G E ン した o 2 次に 1 の 抗体 ( 00 ロ ー ナ ル) モ ノク ロ - =1 の P G E 2 W a s h b u ff e r で 洗 っ た ベ シ ョ ンした j u g a t e を加 え て 2 8 ℃ で 3 時 間 イ ン キ ュ て 37 ℃ 5 % C O 2 濁 後 3 0 0 u l の p nit r o p h e n o】p h o s p h a t e ( P N P P) s u b s t r a t e を加 え - c o n o - ′ - - 、 度9 0 % 以 上 で 1 時 間イ ン キ の 吸光度 を測 定 し 、 ュ ベ ー シ ョ ンし 5 0 いl の S t o p 、 s ol u ti o n 標 品 の 検 量 線 と 比較 し て 放 出量 を求 め た - 57 - o を加 えて 4 05 n m 結果 2 3 2 ・ ・ (1) ∪V A s ki n pG E2 増感 の P G E 2 放 出 量 岬 一 2 'M 存在下 U V A を 照 射 し に H P 放出量 へ 影響 の へ 照 射時 間 及 び H P 濃度 の 照 射 終 了 直後 の 、 影響 を 検 討 し た と こ ろ の 照 射時 間 及 び H P 濃度 に 比 例 し て P G E 、 2 放 出量 の 有意 な 増加 が 見 ら れ ∪V A 照 射時 で は H P 非添 加 時 で も 有意 な 増 加 が 見 ら れ た (Fig Ⅰ 3 1 ) また P G E 2 放 出 量 の 経 時 変 化 を測 定 し た と こ ろ 経時的 な放 出量 の 増 加 、 - - 、 o , が見られた( Fig Ⅱ 3 2) - - ・ 0 6 ¢ ∼ H P O LJ M ∼ H P l =M ∼ H P 2 LJ M ∼ H P 5 LJ M # H P 1 0 LJ M ′ヽ - ★★ ★ ∼ ★ ★ ★ ¢ a 4 0 ∼ u) E ′ - ¢ め 付 ¢ d 2 0 o I ★ ★★ _ ★ ★ ★ 刑 ★★★ O ★★ ★ ★ ★ 臥 ★ ★★ ★★★ ★ * 0 1 5 0 3 0 u V A i rr Fi g o n ★★ ★ uj Ⅱ 3 ・ I - p G E2 2T” S kj n pl e d im are m s m e e a n s oず ct s r e 白色 a S e s a m m e a s u re D at a E ff e 1 h w e (e . a t o p . せ岳m m o r ( m i 7 5 ) m tr a n m ) c o n c e n ti o n a m d 如 a d i a ti o ti m e m n w ith U V A d i a ti o of m m e p h y ri n a ft e r i rr a th 6 0 2T M i r r a di a t e d di a t el y ±S D di a 号音o e m b y S ki Sig nifi c a n tl y diff e r e n t f r o P 〈O 0 0 1 a 4 5 * re e c o n t r o[ n (3 5 0 o n 380 a n d P G E2 r e一e a s e w a s ・ e a s u r m e nt s (n - . i rr a di a t e d ・ . . - 58 - w ith o u t H P) g ro u p ★★ , P < 0 01 ・ ' , ' ' 1 60 n O U V A H P OH M + n o U V A H P 5 LJ M + n o 1 ン - ★ ★★ メ- ー - UVA H P 1 0 L) M 1ヽ 山 一 1 20 p 4) 夢 砂 ー ・ I ★ - - - U V A 30 m i n H P O いM U V A 30 m in H P I H M ・ ★ ∼ 研 ∈ - - 金 「 一 } ¢ め 侍 a> - - - 甲+ - ・ - U V A 3 0 m in H P 2 H M ・ 8 0 - ∼ 針 叫 - ¢ - U V A 30 m in H P 5 u M U V A 30 m i n H P I O LJ M - i ★★ くq ★ # uJ a) 4 0 良 ★ ★ ★ ★★ ★★★ 0 4 0 F ig Ⅰ 3 2 E ff e - ・ ・ p G E o n s ki n D a re si g nifi c P <0 pl e s a m . 01 e a n s + m _ a n tl y diff e ★ ' ' , ( 2) P G E 2 P < of . . fr o ti m e d a n re e ith U V A w m e a s u r m c o ntr o) (n (35 0 e nt s M の へ ント ロ - と 同程 度 の - 380 i rr a di a t e d o n - こ ろ N 、 。 N a とア ス 。 しス ー ル と 同 程 度 の 値 を示 し 、 2 0 パ 、 ー ) fo r n m 30 t w ith o u t in m H P) g r o 夕は示 して い な ベ - シ ョ c o m c e m tra 紬 m ・ u p P ★ , ン後 の P G E ー < 0 05 ・ - ' ' , 。 ) の 放 出量 M A も 照 射終 了 直後 に は ポ ジ テ ィ 0 - 59 - の放 出量に っ 有意 べ ィ ブコ ン トロ た( Fi g II 3 3) - ・ の 時 間後 20 に比 へ ゼ( S O D ) は ポジ テ 時 間後 もや や 低 い 値 を示 し た 程度 で あ い 2 ル ( 抗酸化剤 非添 加 時) オ キ シ ドデ イ ス ム タ 、 - h y ri m ル ビ ン 酸( V C ) は 照 射終 了 直後 及 び ポジテ ィ ブコ ント ロ これ に対 値を示 し コ ュ 方 ∪v A 非照 射 時 で は 抗酸化 剤そ の も の は P G E 2 た(デ o rp p (h r) e 抗 酸化 剤 の 影 響 を 除 い て) な抑制 を示 し た コ at o 朗m m . 影響 を測定 し た と m e m b a ti o cu . 抗酸化剤 の 照 射 終 了 直後 及 び 2 0 時 間イ ン キ に( V C I O h 2 4 且n n th m n 2 0 1 6 0 001 放 出量 の S D re nt b a ti o irr a d iat e d w e re s 増2 2T M b y S ki r el e a s e 2 2T ” ata o 書i n c u ts c 8 - ブ ル 一 - . ほとん ど 影響 を 与 え な か っ 80 0 lヽ p / ★★★ Fd Fd . ロ O h $ 20 h r r # ## d 買6 0 0 ヽ 研 ∈ ヽ■ ′ … ¢ , 詔4 00 】 ¢ ■ ## ★ ★ ## 一 ★★ a) ゝ . ” 呂2 0 0 ★★ ★ ★★ 氏 #& T ★ ★★ 榊 ★ … ★ * * * " ★★ I # * ★★ ★ … ## ## # ## * * * * J ‖ I # ## 榊 I ## ## # ## 0 - 亡 o O = = = ≡ = = ∈ ≡ 〔 E ≡ ≡ r N LL) く⊃ U > O > 0 > 宅 B B ⊂ O O LL) ▼  ̄ ” ” 蔓 Z - E 恥 cts I 一 2T M s ki n pl e s a m H Pf or D at a 30 in m a re . ★★ P , 〈O . D . , < 0 > l⊃ LL) a a LL ) < = 【〕 Z - a n t首 o xi d a - of . … 01 o o5 . , P , sig nifi c a n t)y d 附 e gr o u p # p 0 N 0 sig nifi c a n t一 y diff e r e n t f r o P 〈O 0 5 コ w o m P G E2 (3 5 0 it h U V A - r e3 e a s e 380 n m b y S k 盲n ) i n th e pre 2T M s e n c e Of l O いM . e a n s ±S m ≡ 、 (q Z i r r a di a t e d w e re s ” = 盲 ”) f o T = a 音量 Fi g Ⅱ S S く⊃ LL) ★★ ★ * ) 1 ★ ★ ★★ ★ * * re nt P ## 〈O . 0 01 n e e , e e nt S e a s ur m m 0 01 th m ・ re e th m f ro < th g a ti v e . c o n t r ol (n o n i r r a di a t e d - ith w o ut H P) g r o u ★ p , ・ p o siti v e ### P c o n t r ol 0 0 01 < ・ (U V A i r r a di a t e d w ith l O いM H P) 1 紫外 線 防御剤 の 影 響 ベ シ ョ ン後の P G E 2 放 s トD を 表 面 に 添 加 し 照 射終 了 直後 及 び 2 0 時間 イ ン キ ュ され 0 2 出量 へ の 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 極 め て 顕 著 に P G E 2 の 放出 量 の 増 加 が 抑制 の 放出量 2 m c コ ロ ル レベ ル に 回復した なお St D そ の もの は P G E2 (3) P G E 2 の 放 出量 へ の ー 、 、 、 g/ m 以上 で ント に影 響を 与 え な か っ - - o た ( Fi g Ⅱ 3 4) - . - . - 60 - ・ 1 6 0 ★ ★ ★ □ O h % 20 h r ■ lヽ ′ J P ” ⑳ r 1 2 0 暑 ロ〉 ∈ ヽ 中 ′ a) め 伯 ⑳ p $ 0 l■■1 4) ★ ★ ★ h N uj 4 0 ぴ 臥 * , ### c o nt r o拝 0 stD Fi g Ⅰ 3 4 ・ ・ . c o n e n t r a tj 2T” s ki n s a m H P fo r 3 0 D at a m are m E 即e c 骨 o m o n pl e . P G E w e re e a n s j= S D U V A 2 柵 n c e . a 0 5 2 ( o n s u n s cr e e n r e- e aL S e i r r a di a t e d w 1 . ti g/ c m (st a n m b y S k 盲n ith U V A ## # ## # 2 ) d a rd D ; S I D) p 】e s a m 2T M (3 5 0 - 380 n m ) i n th e p of re s e n c e l O りM . Sig nifi c a n tl y diff e P 〈O 0 0 1 oず a s in c o 0 ## # ### ## # , . of th r e e r e n t f ro m c o n m e nt s e a s u r m t r o 一( n o n . i r r a di a t e d it h w - o ut H P) g ro u . Sig nifi c a n t[ y diff e r e n t f r o m th e S I D 0 m 2 g/ c gro m - 61 - u p ' ### p < o oo1 ・ A p ★ , P < 0 05 ・ * * , ' 考察 2 3 3 ・ ・ c oh e n ら 5 5) は ヒ ト表 皮 再 構 築 を照射 し ジン 存 在 下 U V A 加を報告 し て い る いこと が 明ら か と な oH の ・ 。 っ た っ 。 S O D 及び M A 関 与 は 少な 増感 剤 の濃 P IS K! N) に 光 増 感 物 質 で 度 依存 的 に 細 胞 毒 性 及 び I L - あるク ロ 1 放 出量 α の 本節 で は U V A 非 照 射 時 で は 抗酸 化 剤 添 加 時 に P G E 2 。 有意な 増 加 が 見 ら れ な か が示さ れ た 、 デル ( E モ い た こ とか ら また N a N 、 。 S トD 増 の 放 出量 の の の 方 が 炎症 反 応 を 強 く 抑制す る 添 加 時 に 炎症 反 応 が 抑制 さ れ な. か っ た こ と か ら と思 わ れ る ロ マ 抗酸化剤 そ の も の は 炎症 反 応 に 影 響 を 与 え な よりも V C 3 ルプ を添 加 し た と ころ 0 2 濃 度依存 的 に P G E 2 、 と こ  ̄ , ■ 及び 放 の 出量の 増 加 が 有 意 に 抑 制 さ れ た S t D に より U V A が カ ッ トさ れ た た め と 思 われ る 2 また S Q O O H 含 量 抑 制 が 見 られ な い 0 2 m g / c m で P G E 2 放 出量 の 有 意 な抑 制 が 見 - o 。 、 、 られ た こ と か ら 先立 っ て P G E 2 , の こ ち ら の 方 が感 度が 高 い と思 わ れ る 放 出 量 の 有 意 な 増 加 が 見 られ 応が有 意 に 抑制 さ れ た 1 . こ とか ら 、 こ の 。 St D 及び N - 、 細 胞毒 性 の 発 現 に U V A o 2 に よ る 炎症 反 応 も 関 与 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た p GE 2 の u vA 放 出 量 増 加 を 有意 に 抑制 し た こ と か ら 3 、 - o よう に 細胞 毒 性 a N 3 , の V C 添 加 時 に 炎症 反 H P 増 感 に よ っ て 生 成 した 更 に ∪V A 防 御剤 が 顕 著 に 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い 防御剤 の P G E 2 放 出 量 増 加 抑制効 果 を 指標 と す る 方 法 も 防御剤 の 有 用 な i n 評価法 に な る 可 能 性 も示 唆 さ れ た が 0 ると思わ れ る . 2 2 g/ c m m 。 - 62 - 増加 に 以下 の 、 ' vIt r o 濃 度 で 更 に検 討 す る 必 要が あ 小活 次元 培 養 ヒ ト 皮 膚 モ デ ル を 用 3 過酸 化月旨質 含 量 た 、 放 出量 P G 巨2 い の へ 光 増 感 物 質存 在 下 U V A を照 射 し 、 影 響 を検討 し た結果 以下 の こ とが 明 らか と な っ 。 照 射時 間 及 び H P 濃 度 に 比例 し て 細 胞毒性 pG E2 放出 量 が有 意 に 増 加 し sQO OH vc 、 細胞 毒 性 や 、 , N a N 含量及び P G E 3 は 細 胞 毒性 放出 量 等 ヘ の ま た 細胞 毒 性 及 び T B A R S 含 量 SQ O O H 含量及 び P G E た っ P G E 、 2 - 自動 酸化 反 応 に よ り あ る ころ 、 て っ また o 2 に よ る 炎症 反 応 も 関与 し て 増加 に 先 立 っ て 放 出 量 の 増 加 を 抑制 し たが uvA 防御剤 の 評 価 法 の 良 い 加 v It r o 1 生じた o 2 。 これ - ら の 結 果 か ら細 が し こ と が細 胞毒性 発 現 に 主 に 関 与 評 価 法 に 成 り得 る 63 , に よ り 皮表 に 生成 し た S Q O O H い る こ とが 示 唆 さ れ た - M A 細胞 毒 性 及 び 、 o S KI N 2' M 増感 に よ る 過 酸 化 脂 質 生 成 や 細胞 毒 性 等 を 指標 と す る 試 験 法 が U V ' 、 、 濃 度依存 的 に 細 胞 毒 性 及 び S Q O O H 含 定 レ ベ ル 以 上 に 増 大す る 1 、 抗酸化 剤 の 影 響 を 検 討 し た と こ ろ 。 放 出 量 の 増 加 が 顕著 に 抑 制 さ れ た 胞毒 性 の 発 現 に U V A H P 増 感 に よ 一 2 の 防御剤 を 表 面 に 添 加 し U VA 。 影 響 を検討 し た と 量が有意 に 抑 制 さ れ 含 量及 び S Q O O H 含 量 - , s o D は顕著 な 抑 制 を 示 さ な か p GE2 - 放 出 量 が有意 に 増 加 し た 2 , TBA R S 、 こ A を用 の い U V A - H P 光 毒 性及 び と が 示 唆さ れ た 。 、 第Ⅲ章 過酸 化 脂 質 そ の も の の 培 養 細 胞 影響 1 64 - へ の 第Ⅲ章 第 単層 培養細胞 過 酸化脂 質 は 老 化 が示 唆さ れ て い る が ペ チル ハ イ ド ロ ワ レ ンモ ノ ハ 明な点 が 多 い , や ア トピ 細 胞 毒性 、 ル オ キ シ ド(I B - イ ド ロ ペ ー の へ 性 皮 膚炎 影 響は 6 1) これ 影響 細胞毒 性 、 まで膜脂質 O O H ) を用 い て u の へ 6 2 6 3) な ど に 関与 す る 1 過 酸 化 剤 で 水 溶性 の の 3 3 3 4) 行わ れた も の ・ が 大部 分 で ル オ キ シ ド( S Q O O H ) に 関 し て は 報 告 が少 なく 次元 培養 ヒ ト皮 膚 モ デル を用 い 3 、 下 U V A を照 射 し 2 thi o b - 、 a rbit u ri c 含 量や P G E 2 放 出 量 へ の a cid r e a c ti v e s u 影 響 を 検 討 した 、 へ マ b st a 。 トポル n c e s フ ィ ・ プ ス ク 作 用 機序 も不 大 す る こ と が 細 胞 毒 性 に 主 に 関与 す る そして U V 本節 で は S Q O O H そ の も の 皮膚 の バ リ ア ー の 機能 を 担 こ と を示 唆 し た 細 胞毒性 ヘ っ 細胞 毒性 及 びサ イ トカ イ ン 放 出 量 A - H P の - 65 - っ て 生じ 定 レ ベ ル 以 上 に増 響 及 びそ の 作 用 機 序 を 明 らか に す る た の影 影 響 につ 一 増感 に よ Q て い る ケ ラ チ ノ サ イ ト を用 い へ リ ン ( H P) 存 在 - た o 2 に よ り 皮表 に 生成 し た S Q O O H が 自 動 酸 化 反 応 に よ り あ る 、 1 (T B A R S) 含 量 及 び 1 めに 、 、 と こ 。 著者 は 前章 で SQ OO H 2 6 3 1) 節 一 い て 検 討 を行 っ 、 た S Q O O H を 添 加 して o 実験 材料 及 び 方 法 3 1 1 - . ( 1) 細 胞 正 常 ヒ ト表 皮 角 化 細 胞( N H E K ( B )) は ク ラ ボ ウ ( 樵) よ り購 入 し た 。 ( 2) 試薬 は 資 生 堂 ( 樵) SQ O O H イ キ ン(J L) (H 測定 用キ 2 - u m e dj a 高松 トは ッ 翼博士 ナ フ ( 樵) シ コ K G 2) は ク ラ ボ ウ ( 株) - 河 野 善 行博 士 より 譲 り受 け た 、 より より 購 入 し た そ 、 の 他 の イ ンタ 。 ロ ー N H E K( B) の メ デ ィ ウ ム o 試 薬 は 和 光 純 薬 ( 株) より 購 入 し た 。 ( 3) 細 胞毒性試験 N H E K( B) 5 上で ×1 3 0 釧 s/ c 時間イ ンキ 48 を加 え て 2 5 dip h 時間 イ ン キ 2 4 e n - , ベ ュ z o[i u m yJt e t r a ℃ 37 5% C O , 2 ( P B S) s a一 in e , id e イム ノ ア g/ m m ( の M TT ョ C O , 湿度 90 % 以 芝, 過 酸化脂 質 ( 1 % E t O H で 可 溶 化 し た S Q O O H ) ン した 細胞 毒 性 を 3 ( 4 5 di m e t h ylthi a z o ト2 y f) - - - o ( M T T) ア - , セイ ッ セ イ ( EI A ッ 37 ℃ 5 % 、 , s o l u ti o n 湿 度9 0 % 以上で 2 で 2 回 洗浄 し た 後 a n oJ /i s o p r o p m ン後 シ ー ト に 播種 し ー 6 4) で 、 免 疫反 応 の 指標 で あ る )L - 2 6 5) ) で 測 定し た o 6 4) ( 4) M ¶ ア ッ セ イ 2 ョ ベ ュ bro の 放出量 を エ ン ザ イ ム 各ウ エ ル に シ ー プレ ‖ を9 6 穴 w e 、 ( M ¶ を培地 に 溶解 した も の) を 時 間イ ン キ ュ べ 2 0 0 ‖[ の M T T - シ ョ ンした e x t r a c ti o n ph . s ol u ti o n o sp . h a t e b uff e re 、 d (0 0 5 M H C 暮 . ) を加 え 6 0 r p m で 振 と う し な が ら室 温 で 1 時 間イ ン キ て マ イク ロ プ レ トリ ダ ( M o d e 一4 5 0 BJ O R A D 社 製) で 5 4 0 n m し 下記 の 式 よ り 生 存 率 を 求 め た . 添加 し 1 0 0 いl ベ ュ . ー シ ョ ンし ' - ー ー の - , 、 吸光度 を測 定 。 ' V i a bjh t y( % ) A ss .. , A c5 .. お よび A 吸光度 を示 す エ - ルをT - w e e n 2 0 0 5 ・ m I/J P B S ベ 時間 イ ン キ ュ 求めた re a g n m の ・ で 18 m a n s 54 0 6 5 6 6) 1 0 0 いI の A EH c 、 b5. . メ ディ ウム を 入 れ ) - s 。 ( 5)J し2 ア ッ セ イ 各ウ ( A s . . A b 5 . . / A 5 . . A b5 . . ) X 1 0 0 は サ ン プル 末照 射 コ ン ト ロ ル お よ び ブ ラ ン ク の = e nt ー シ を添加 し ョ 、 (w c e ty J c h o ン した 4 05 o n m そ a s hi n =n の g b uff e r) で 1 回 洗 浄 し e st e r a s e : 後 w a s にお ける 。 - 66 - [L 2 F b hi n g b uff e a r ・ ju g c o n 、 5 0 uJ の at e 上浦 と を加 え て で 5 回 洗浄 し 、 4 ℃ 2 0 0 りl の 吸光度 を 測定 し 標 晶 と 比 較 し て 濃度 を 結果 3 1 2 - - (1) 過 酸 化 脂 質 の 細 胞 毒 性 へ の 影響 N H E K ( B ) に S Q O O H を添 加 し た と こ ろ は 6 3 0 LJ M 50 とな た ( Fi g Ⅲ っ 1 1) - 濃 度 依存 的 に 生存 率 の 減 少が 見 られ 、 、 IC . - o 瑠2 5 - - o S Q O OH - 1 0 0 ∼ J 邑 7 5 ★ ★ ” ご巴 I ★ P ■l ー J ★ ★ ★ 上白 望 5 0 . > ★★ ★ 2 5 ★★ ★ 0 0 Fig vi a ー - bi H ty o N H E K( B ) D at a E ff e 1 1 ロ ・ a re S jg nifi c ct 1 0 c o m c e mt r a モ io m ずS q e o S Q O O 門 旭n u a o m in e a n s a n t[y c u b a t e d fo ±S D d iff e . r e nt . of f ro m th r 24 h [L 2 の hyd n o re e r a ft e r a d si x to c o n t r o[ ' , m P ( 2) 過 酸 化 脂 質 の サ イ トカ イ ン 放 出 量 - 1 0 0 (p e r o x p r o 1 00 0 M) id e c o n c e n t r a ti o n o n f N H E K ( a) w e re m 1 < へ e a s u rm 0 05 . 4 ' ' , e nts P . 0 01 < . . ★ ★★ , P < 0 0 01 . . 影響 の 放 出 量 の 経 時 変化 を 検 討 し た と こ ろ 有意 な 増 加 が 見 ら れ di n 9 S Q O O H 過 酸化 脂質 、 時 間以 降 は ほ ぼ プ ラ ト - 67 - - の 濃 度依 存 的 に LL に 達 し た( Fi g Ⅲ 1 2) - . - . - 2 放 出量 1 50 ★★ ★ - ○ - c o n t ro I - ★★★ ★ ★★ - - ◎ 1 % E tO H - ヽ ′ ★★★ ” 長 1 00 ★ ★★ U) a - . 一 ′ 1 ■ ■■ S Q O O H I O O LJ M + ★★★ 也 ・ - 「 - 也 切 S Q O O H 4 0 0 LJ M + ★★★ 付 0 t ■■■1 - 4) 噸ト S Q O O H 200 H M ー ー S Q O O H 1 0 0 0 LJ M h 5 0 o1 ★★★ I J ■■■ l o Fig Ⅲ 1 2 - E ff e - ・ r el e a s e fr o D at a m a re Si g nifi c f o q s 1 2 u aB e n e m 1 6 2 0 h yd o n o r o 2 4 p 2 8 e r o xi d e N H E K( a) m e a n s a n tl y ct 8 4 ±S D diff e . r e nt . of fr o m th r e e t o fi v c o n t r ol , * e P m < e a s u rm 0 05 ・ - ★★ ★ , 68 - e nt s P < . 0 0 01 ・ ・ n C u b a ti o n ti c o n c e n t r a ti o n m e ( h r) o n lL - 2 3 1 3 - - 考察 3 1) 河野 ら はチャ イ ニ - ズ ハムス タ ー 肺 由 来線 維 芽 細胞 に ジ メ チ ル ス ル フ ォ キシド ( D M S O ) に 溶 解 し た S Q O O H を添 加 し て 4 8 時 間イ ン キ ュ ベ シ ョ ン し L D 5 0 は 約 2 3 0 リM で あ っ た と 報 告 し て い る 本 研 究 で は N H E K ( B ) で は や や 高 い 値 が 得 られ た ー 、 。 が 、 細 胞 の 違 い 等 に よ る も の と思 わ れ る サイ トカイ ン で あ り こ とから た 。 、 、 rL 2 は 細胞 性 免 疫 に 関 与 す る - o 細 胞毒性 が 見 られ な い 濃度 で も I L S Q O O H 添 加 に より 細 胞性 免 疫 反 応 ま た N H E K( B) を 用 い 、 SQ O OH の ルパ ー Tl 放 出 量 の 増 加 が 見 られ た 何 ら か の 影 響 の 可 能性 も 示 唆 され に よ る 細胞 毒 性 や サ イ ト カ イ ン 放 出量 を指 標 と す る 方 法 が ヒ ト 表皮細 胞 に 対す る 過 酸化 脂 質 示 唆さ れ た へ 2 の ヘ 。 ー 69 - の 影 響 を評 価 す る 上 で 有 用 で あ る こ とも 第 Ⅲ章 3 した 。 、 節 二 次元 培 養 細 胞 へ 前節 で 著者 ら は ス ク ワ レ ン モ ノ 発現す る こ と 第 ハ イ ドロ の 影響 ル オ キ シ ド( S Q O O H ) に よ り 細胞 毒 性 が ペ 及 び 細胞 毒 性 を 示 さ な い 濃度 で も I L また 正 常 ヒ ト表皮角 化 細胞( N H E K ( B )) を用 い 2 、 放 出量 を増 加 さ せ る を示 唆 こと S Q O O H に よ る 細 胞 毒 性 やサ イ ト カ イ ン 放 出 量 を 指 標 と す る 方法 が ヒ ト 表 皮細 胞 に 対 す る 過 酸 化 脂 質 の 影 響 を 評 価 す る 上 で 有 用 で あ る こ と を示 唆 し た 本 節 で は S Q O O = そ の も の の 細胞 毒 性 へ の 影 響 。 及 びそ 作 用 機 序 を 明 らか に す る た め に の 次元 培養細胞 よ り サ イ ズ が 小 さ く ( vit r olif e 響に つ - s ki n) を 用 い いて 、 S Q O O H 検討 を行 っ た 経 時 変化 を 観察 し た 。 o 、 よ り 生体 に 近 い と さ れ 、 、 S ki n 2' ” や他 の 3 安価 な グ ン ゼ 3 次 元 培養 ヒ ト皮膚 モ デ ル を 添加 し て 細 胞 毒性 及 び サイ トカイ ン 放 出 量 また 細 胞断面 を へ 更 に 抗酸化 剤 を 添 加 し - 70 マ 、 - トキ シ リ ン そ の 影響に - エ へ 影 の オ シ ン( H E ) 染 色 し つ いて も検討 を行 っ た o 、 実験 材料 及 び 方 法 3 2 1 - - 試薬 vit r olif e s ki n - の メ デ ィ ウ ム ( D ulb ) は グ ン ゼ ( 樵) よ り seru m ン マ 、 ● e c c o s ニ ト m difi e d o e a gl e m d hi u e より ル ( M A) は 関 東 化 学 ( 株) ー F e t a暮b % 十5 m o vi n e 購入 し た 、 。 細胞 グ ン ゼ 3 次 元 培 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( Vit r o[if e ケ ラチ ノ サ イ ト を 増 殖 さ せ サイ ト は 存 在 し な より 小 さ 参照 い い m S ki n : と 同様 直径 , V it r o [if e o 2 T” 線 維 芽細胞 の 上 に , ラ ン ゲル ハ ン ス 細 胞及 び メ ラ ノ 。 円形 で の m より 購 入 し た ) は グ ン ゼ ( 樵) . ki n 角 層 を形 成 さ せ た も の 、 デル は 直径 8 モ 。 s - - 10 s ki n m 正 方形 の m 分 化 状態 は Fi g Ⅲ の 2 'M の S ki n 2 3 - ・ - 。 細 胞毒 性 試 験 vit r olif e プ レイ ン キ ki n を 1 時 間 s - ベ ュ シ - ン後 ョ 過 酸化 脂 質 ( 1 % E t O H で 可 溶 、 化 し た S Q O O H ) を表 面 に 加 え て 2 4 時 間イ ン キ ュ ベ シ ョ ン し た ま た は 1 時 間 プ シ ョ ン後 抗酸 化 剤 を 培 地 中 に 添 加 し 2 時 間イ ン キ ュ ベ シ ョ ン 後 レイ ン キ ュ ベ ー o ー - 、 、 、 ス ク ワ レ ン ( S Q ) で 希 釈 し た S Q O O H を 表 面 に 加 え て 2 4 時 間イ ン キ ペ エ シ - ンし ョ 細胞 毒 性 を 3 ( 4 5 d i m e th ylt hi a z o ト2 yl) 2 5 d i p h e n ylt e t r a z o li u m b r o m id e ( M T T) 69 ) 6 7 68 ) で IL 2 放出量を エ ン ァ ッ セイ 及 びI a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( L D H ) ア ッ セイ た - ・ - - 1 . , , ・ 、 ザイ ム イ ム ノ ア セイ ( E IA ) で ツ 細 胞 膜脂質 、 ン ハ イ ド ロ ペ ル オ キ シ ド( P C O O H ) フ ォスフ ァ , オキ シ ド( P E O O H ) 含 量 を C し H P L C 法 M Tr ア 5% C O , 35 3 7) フ ォス フ ァ チ ジル ルア ミ ンハイ ドロ タノ エ で 測 定 した , チ ジル 過 酸化 物で あ る ー コ リ ペ ル o セイ ッ 各 ウエ ル に2 37 ℃ の 2 m 湿度 90 % 以上 で , ( M ¶ を 培 地 に 溶解 し た も の) を 1 s ol u ti o n g/ m l の M ¶ 3 時 間イ ン キ ュ ベ シ ー ン した ョ 憾 加し m 、 リ ン 酸 b uff e r ( p H o 定 面 積 の 細胞 を ポ ン チ で く り 抜 い た 後 2 m l の M T T 1 の 1 % S o di u m d o d e c yl s ulf a t e e xt r a c ti o n s o l u ti o n ( 0 0 5 M H C I /i s o p r o p a n o I) と 4 0 い ( S D S ) を加 え 以 降 は 前 節 と 同 じ 方 法 で 測 定 し た (P B S) で 7 4) , 回洗浄 し 2 一 、 . o 、 LD H ア 各ウ ホラ べ ー ルに エ ゼ シ - セイ ッ 5 0 いl の 上 浦 と発色試薬 ( N A D / D L 乳 酸 リ チ ウ ム 緩衝液 5 0 - 、 ョ ン した o 吸光 度 を測 定 し た 1 し2 ア トロ ブル ニ m g/ . b u ff e _ jug c o n r 室温で 1 0 0 リI 添加 し 20 0 5 m 45 57 0 、 n g/ m I ジ ア , 分 間イ ン キ m にお ける ュ セイ ツ 、 . 、 m 。 前 節 と 同 様 の 方法 で 行 っ た 各 ウ エ ル を T w 回 洗 浄 し 5 0 H l の 上清 と メ デ ィ ウ ム を入 れ fab ・ を添 加 し m ]) そ の 後 反 応 停 止 液 ( 0 5 N H C l) を e e n 。 1 テ ト ラ ゾリ ウ ム 0 7 4 ー a te を加 え て 4 ℃ で で 5 回洗 浄 し 1 8 2 0 0 p I の Ell , 、 時間イ ンキ ュ ' m 、 ベ 。 - 7l - ー シ ョ c e tyJ c ン した を添 加 し w a s hi n g b uff e r h oli n e s t e r a s e :[ L 2 V P B S( 1 0 0 ul の A a n s r e a g e n t・ を測 定・ し 標 品 と 比 較 し て 濃 度 を求 め た ・ 、 o 405 そ の後 n m w a s hi n に お ける ) で g 吸光度 PC O O H Vit r o =f e , pp の b m めた o - u s P E O O H 含量 の 定 量 ki n に 1 m 叫h y d 同様 に もう 濃縮乾 固 した /mI の^ o ラ r o x ニ o ト 一 f の P BS と 2 yt o l u 含有) e n e 度 操作 し 、 ノ ー l の 冷ク を加 え 集 め たク こ れ に 1 0 0 りl の ロ フ ェ m ク ロ ロ ル を 含 む) 、 ロ ロ ロ ロ ホ ル ム:2 プ - 72 、 - ロ ^ o / こ れ を遠心 し て 得 たク ホル ム層 を ロ ホ ル ム: メ タ ノ を加 え - ー こ の 10 = ー タリ ル ( 1 :1 ほ C v/ v , ー , - ロ ロ エ , v /v 10 , ホ ル ム 層 を集 ボレ バ ー 内標 と し て L H PL C - ル ( 1 :1 で 夕 - で 100 ug 定量 し た . 3 2 2 - 結果 - S O O O H の 細胞 毒 性 や サ イ トカイ ン 放 出量 の へ N H E K ( B ) よ り 生 体 に 近 い と 思 わ れ る Vit r o [if e した と ころ 、 s - 影響 ki n に 0 1 0 0 濃度依存的 に 生 存 率 の 減少 が 見 られ た( Fi g Ⅲ . - M の S Q O OH m - 2 1) を添 加 - . 1 5 0 - 貫l ヽ - o Vi a biFity ( % ) - o e ′ 一 > l ご巳 h d I ■■■l a 相 S 5 0 ★ ★ ★ 0 0 5 0 S Q O O H Fig Ⅲ 2 1 - E ff e c t ・ . vi a b H it y D at a a re S i g n ifi c 2 4 o m f V it r e a n s a n tl y o of Hfe ±S D . diff e r e nt - . に 達 した ( Fi g Ⅲ 2 2) - . 4 、 u a ki S of f ro 時 間 後 に 細胞 毒 性 が 化 を検 討 した と こ ろ q s m 1 0 0 c o m c e n t r a ti o m Je n e m hy d o n o ( ro p m MI e r o x id c o n c e n e tr a ti o rl O m n th re e m c o ntro l, 50 % e nt s e a s u r m ' P < 0 05 . ' ' . ' , 未満とな る S Q O O H P < 0 0 01 100 ・ m M I 添加時 時 間 後 よ り 細胞毒 性 の 増 加 が 見 られ - o - 73 - 、 の 細 胞毒 性 の 8 時 間後 に ほ 経時 変 ぼプ ラ ト ー 1 0 . - 0 S - - - ◎ S Q O O H 1 00 - m M /1 % E t O H ★ ★ ★ . 0 6 a ド LL) , - a O A o 4 . ★ ★★ ★ ★★ 0 2 - 0 0 . 4 8 ct oず s 0 Fjg ・ Ⅲ 】a c t a t D at a ・ 2 ・ d e a re Si g nifi c E ff e 2 e m hy d r o e a n s a n tl y g q u aJ e n e ・ . of diff e r e n t f r o th m re e - . m さく なり 、 of u r (i n c こ ろ 2 4 h yd o n o t o fp c o nt r ol 更 に 細胞 断面 を H E 染 色 し た と 皮 の 細 胞が 丸 く 小 1 ( Fi g Ⅲ 2 3) 2 0 r el e a s e e n a s e ±S D 1 6 1 2 、 u 2 2 8 r o p V i t r o Jif b a ti o n ti e r o x e ・ s m e c u id ki e nt s e a s ur m m すn e b a tj o ti n m o - 74 - o n n . 0 h r) ★ ★ ★ , P < 0 00 1 . 8 2 4 時 間 後 には 真 皮 細 胞 に も 同 様 の , ( h r) c o n c e n t r a ti o n 時 間 後 に 角 層 に 変化 が 見 ら れ - e . 、 4 時 間後 に 表 変化 が見 ら れ た a (0 h ) b( 1 h r ■l ■ ..__ - _ . . . . - J ” ) r ∫ . 〟 7 : 「 -)  ̄ ・ : 51 . ヽ ㍗  ̄ 室 P 控義絶 ' ・ ユー.・ r .. c (2 h ご / ) d( 4 h r . , . ) ノ 野 l - ; A I - : - - 蒜 、 i T) i I( 2 4 h 盲碑 h r) of V it r o lif in w - e - ki n s it h l o o s w e lli n V : e pid ( F ig 24 is e r m . 6 1 e M m c u S Q O O H g th ( Fig a n 時間後 w a s S Q O OH d f) b at e d f o a n st r a t u m e d 1 , r O h st ai n e c o rn e u m 6 d ) ▼ s h ri . V it r olif e o n n ki n g ( a) r d w ith , l h h r ( b) . , 2 h at o x a e m ( Fi g 6 C) i g ) r ki n : s 1 c u rli n , s - , a nd r ( c) y[i n , a n h ri n ki n g 4 h r ( d) 8 h , d e o si n a nd v a c u a li z a ti o n of . e ( e) X 200 c u rli n th r g of c e lL s o r 24 h r (f) . th e in d c ell s e r m in is . の IL 2 - 放 出量 を 検 討 し た と こ ろ 有意 な 増 加 が 見 られ た( F ig Ⅲ . - 2 4) 過酸化 脂質 , - 。 - 75 - の i  ̄ 濁声 - , r . L Fig / Ⅲ 2 3 E ff e ct 掛 濃 度 依 存 的 に ル 2 放 出量 ー の 監 2 0 lL 2 2 4 h ∼ - r 1 5 貫 ロI a ヽ . 一 1ノ ■ 4) ∽ (q 1 0 ★★ ★ ¢ L - 4) A _ ★★ ★ (叫 l + 5 - 0 0 5 0 S Q O O H Fig ・ Ⅲ 2 4 - E ff e ・ r e 一e a s e fr D at a m e a n s ±S a re S ig n ifi c V jt r o lif o a n tl y e - s ki n) SQ O O H o f o Hfe t c V jt r m . D s diff e r e n t f r o ' , P < 0 05 . - of . hy d m o n o ro ( p m M) e r o x id e c o n c e n t r a tj ¢ n ル 2 o n ー 令k i n th re e m c o ntr ol m ' c o n c e n t r a ti o n u al e n e q 1 0 0 ' ' , の 細 胞毒性 や サ イ P < e nts e a s u r m ' ( o nly 0 001 . m e di u . m c o n t ai ni n g l % Et O H w a s p pli e d t o a . トカ イ ン 放出量 及 び P C O O H , PE O OH 含 量 に対 す る 抗 酸化 剤の 影響 S Q O O H の 細 胞毒性 用 い て 各種抗 酸 化 剤 ( +) カ テ キ ン ( C - A T C) へ の影 、 の 自動酸化 反 応 の 関与 を 明 らか に す る た め に V it r oJ Jf e ・ 響 を検 討 し た と こ ろ 還 元 剤で も あ る ア ス 胞毒性 の 有 意 な 抑制 が 見 られ た ( Fi 9 Ⅲ . - コ 2 5) - - 、 76 0 - ラ ジカ ル ス カ ベ ンジャ - の M A - s ki n を 及び ル ピ ン 酸 ( V C) 添 加 時 は 2 4 時 間 後 の 細 □ v i a biJity ( %) 1 5 0 ★ ★★ ★★ ★ ★★ ★ 1 0 0 ー ′ 邑 > 一 ご巳 ■ - a t可 . ' S ## # 5 0 0 g ativ e c o n t ro [ n e Fig ind Ⅲ 2 5 ・ . u c e Vit r o =f e 24 h D d ・ yt ot c s ki n 什e r a E ff e c t - a t a a re e a n s S i g nifi c a n tJ y Si g nific a n e n e g a ti v C AT C JL 2 = in a b at e d f o c u ±S D . of r e nt fr o m tl y diff e r e nt fr o m c o n t r o] = ( +) 放出 量 - diff e . Tis c hi n s u e s c a te へ の影響 , M A o n r 2 h o lif e b ef o r re ・ u al e n e s q S ki n ad m o n o di n g S Q O O H a n h yd S Q O O H +M A I O p r p d th e in n m M e r o x id e c u b at e d f o r . th re e t o fi v e m e a s u r m th e S Q O O H 1 0 0 n e w = V it r aJ n St g S Q O O H +V C l m M . - ● o x J c it y w a s S Q O O H +C A T C 3 4 LJ M M m o ず a n ti o x i d a n t s s ' d di n g S Q O O H r a m SQO O H IOO m g a ti v hi c h e c o n t r ol , w e re a n n it o l , a VC を検 討 した と こ ろ M g - 77 - < , . VC p ' ' 0 0 01 . a cid , ' , S Q o n ly a s c o rbi c CATC ts ro u ### P ie d p p一 = 、 m e n P < 0 00 l . . . . . M A 添加 時 に I L - 2 放出 量 の 有意 な 抑制 が見 られ た ( Fi g / Ⅲ ろ C AT C 、 V C , - 2 6) なお - 。 抗酸 化 剤そ の も の 、 影響 に の M A そ の も の は今 回 用 い た 濃 度 ( そ れ ぞ れ 3 4 u M , m 存 率 及 び ル 2 放 出 量 に 有意 な 影 響 を 与 え な か っ た ( デ タ は 示 して い M 10 1 . ー 検 討 した と こ つ い て , な い o M) で 生 m , ) o 口 fL 2 2 4 h r M S Q O O H +M A 1 0 - 1 2 1 0 音 ## 8 ー Cn a ヽ ′ - 0 諾 6 4) - ¢ 1 一 ヨ t - 4 ■l ★ ★★ 2 ★★ ★ ∩ . d . 0 n e g a ti v e c o n tr o l Fig ind ・ Ⅲ u c e V it r olif e 24 h D 2 ・ - 6 E ff e c t d JL 2 - ・ s ki n r a ft e r a at a are m r e w a of s c u ±S D . fr of Si g n ifi c a n tl y diff e r e n t f r o m S jg n ifi c a n tl y diff e r e n t f r o m C AT C = ( +) SQ O O H の c a te c hi n , m o b at e d f o . M A = xi d a n - d di n g S Q O O H e a n s - ti o a n Je as e d in SQ OO H S Q O O H 1 00 m M r t s o n V it r o 2 h b ef o r Hf e S - re s +C A T C 3 4 リM q u al e n e SQ O O H . +V o n o m C 1 m hyd p r o e r o xi d e M - ki n a d di n g S Q O O H a n d th e n in b a te d f o c u r . th re e th e S n e m Q O O H g a ti v e a n n it o l , m e nt s e a s u r m l oo m c o n t r ol , V C = . M g ## P a s c o rbi c ro u < p 0 Ol < 0 05 = n ot . ' , ' ' P < 0 001 - s ki n に 1 0d m M - の S Q O O H 78 - . . , . a cid P ' , , n . d . d ete ct e d 自動 酸化 反 応 に よ っ て 生 成 す る 細胞膜脂 質 の 酸化 の 細胞毒性 へ らか に す る た め に V it r olif e m . の 関与 を 明 存在 下 C A T C を添加 し 、 24 時 間後 の P C O O H P E O O H 含量 ル と 同程 度 に な ー 影 響 を検 討 し た と の へ 含 量 が 有意 に 増 加 し た が PC O O H ントロ , S Q O O H 添加 時に 、 C A T C 添 加 時 で は こ の 増 加 が 顕 著 に 抑制 さ れ 、 た ( F ig Ⅲ っ ころ ・ - 2 7) PEO O H - 0 含 量 は 検 出限 界 以 下 だ っ た □ pc o oH 、 o c o nt e nt 7 0 0 訂 `L T6 6 0 0 ★ ★ ≡ ㌔ d 5 0 0 o ≡ ≡ ニ 4 0 0 ⊂ 4) 盲 3 0 0 2 2 0 0 # # O ∼ ≡ 8 1 0 0 U 亡L O c o nt r ol Fi g ph Ⅲ 2 ・ . o s E ff e p h a ti d y J c h Vit r o ‖ fe D a ta 7 - - a re s ki n w a s of s ct (i n o in m e a n s ±S q u a- e n e hy d e c u b at ed . D . S Q O O H IOO of th r o p m Si g nifi c a n tly diff e r e n t f r o m Si g nifi c a n tly diff e r e n t f r o m th e hy d e r o x id e fo r 2 4 h r re e o n o m c o n t r ol a ro p m M e r o x jd c o nt e n t 允e r a (ti s s u e s i n V it 79 m - +C ATC 3 4 p M . o n r o lif e ・ S ki n < 0 01 . . w ith o u t S Q O O H 100 - e d di n g S Q O O H e nt s e a s u r m S Q O O H S Q O Oり ) M g ro u p , ## P ' ★ , < P 0 01 . ・ . ・ コ 考察 3 2 3 - - V it r o (if e ki n の J C 5 0 は N H E K ( B ) の 約 1 0 0 s - L 角層 が あ る た め 濃度で もJ L 放出 の 活 性化 が 関 与 し て 61 ) 河野 らは 添加 し 見 られ た 機能に よるも の と思われ る い る こ o S Q O O H に よ る )L 2 と も 考 え られ る ヒ ト皮 膚 再 構築 モ デ ル とか ら こ - s い ki n の 時 間 後 よ り 真 皮 細胞 に も 細胞 毒性 が 発 現 し た や M A 及 び V C 添 加 時 に 細胞毒性 e 、 q ui v a[ e h t - s kj n の 今 回用 が小 さ く い 、 こ 安価で ある - か と思 わ れ る 一 o 方 、 s ki n は S k i n とか ら 2 T ” や他 ー ゼ A2 TM . の 3 S Q O O H , き 皮膚細胞 に 障害 を 与 えた と 推定 し 表皮細胞 に 細胞 毒性 が 現 れ 始 め の 有 意 な 抑制 が 見 とが 示 唆 さ れ た ' た V it r o JJf e パ (L S E ) に S Q O O H を また ラ ジ カ ル ス カ 。 細 胞 膜脂質 を過 酸 化 し 間後 よ り 細胞 毒 性 を 発 現 す る には ki n 時 間後 で は 顕 著 な細 胞 毒 性 が 2 4 られ 増 加 した P C O O H 含 量 が C A T C 添 加 に よ り 抑制 さ れ た S Q O O H が V it r olif e s S Q O O H 添 加 に より サ イ トカ イ ン 、 S Q O O H の 透 過 に よ り 細胞 毒 性 が 発 現 し た の で は なく 、 - 。 の L J vi n g s ki n 本研 究 で も 4 時 間後 よ り V it r o =f e o V it r o ‖ fe 細 胞 毒 性 が見 られ な い 。 ・ 由 来 の ラ ジ カ ル が 自 動酸化 反 応 に よ り 伝播 し て てい る . 放 出量 の 増 加 に ホ ス ホ リ - 時 間 後 で は 細 胞 毒 性 が 見 られ な か っ た が 4 、 ヤ ー 放出量 の 増 加 が 見 ら れ た こ と か ら の 響 も 示 唆さ れ た の影 へ 2 の バリ 角層 、 倍 と 抵 抗性 を示 し た 、 。 , ベ ン ジャ ー 、 8 の C A T C S Q O O H 添 加 に より 有 意 に 以上 の 知 見 か ら添 加 さ れ た 自動 酸 化 反 応 に より 伝播 し て 4 時 。 次 元 培 養 ヒ ト皮 膚 モ デ ル よ り もサ イ ズ 過 酸化脂 質 の 影 響 を 評 価 す る 上 で よ り 有 用 で は な い N H E K( B) は 更 に 安 価 で 使 い や す い 反 面 角 層 が な い た め に 過 こ 、 、 酸化脂 質 の 影 響 を 評 価す る 上 で 生 体 に 比 べ て 感 度 が 高く な っ て し まう と い う 欠 点 が あ る ことが示唆されたた め こ れ ら を 考 慮 し た 上 で 評 価 法 と し て 用 い る こ と が 必 要 と思 、 われ る と か ら ヒ ト表 皮角 化細胞 や グ ン ゼ 3 次 元 培養 ヒ ト皮 膚 モ デル を 用 い S Q O O H 添 加 に よ る 細 胞毒 性 や サイ トカ イ ン 放出 量 を 指標 と す る 評価 法 が こ れ ら の 細 o 以上 の こ 、 胞 に 対 す る 過 酸化脂 質 の 影響 を評価 す る 上 で 有 用 で あ る こ とが示 唆 さ れ た - 80 - 。 小括 細胞毒 性 へ 評価法 に つ 関与が 明らか にな の い て検討する 存 率 の 減少 や J L 細胞 毒性 見 られ た これ の 2 、 、 の もの の 放出 増加 に 先立 っ 、 - 細 胞 膜 中 の 過 酸化 脂 質 含量 細胞膜脂 質 の 過 酸 化 て IL 2 の ・ 放出 生 体 影 響 及 びそ の Vit r o lif e S ki n に S Q O O H ま た 各 種 抗 酸化 剤 の 影 響 を 検 討 した o 、 。 v]tr o 細胞 、 細胞 の 形態 学 的変化等 を 指 そ の 結果 細胞膜 脂 質 の 過 酸 化 、 を添 加 し 、 濃度依 存 的に 生 細胞 の 形 態 学 的 変化 が 見 ら れ 、 ・ の in 、 、 また 細 胞 の 形 態 学的変 化 が 。 より U V 照射 に よ PC O O H た SQ O OH そ た め に N H E K ( B) 毒 性 や サ イ トカ イ ン 放 出 量 標 と し て 検 討 した っ っ て 表 皮 に 生 じた S Q O O H が 自動 酸化 反 応 に よ な ど め 細胞膜 脂質 を過 酸 化 し 、 細胞 の 形 態 学的変化 を 引 き 起 こ し 傷害 が 真皮 の 線維 芽 細 胞 に 達 し て 細胞 毒性 を引 き 起 こ した て増 大し て っ 、 こ と が 示 唆さ れ た それらの ま た細 毒 を き こ さ い 胞 性 引 起 な 濃度 で も S Q O O H に よ り サイ トカ イ ン 放 出量 の 増大 が 起 こ る こ と が 示 唆さ れ た 。 ま た ヒ ト表 皮角 化細胞 や グ ン ゼ 3 。 次元 培 養 ヒ ト皮膚 モ デル を 用 い 、 S Q O O H 添 加 に よ る 細胞毒性 や サ イ ト カイ ン 放 出 量 を 指標 と す る 評 価 法 が こ れ ら の 細 胞 に 対 す る 過 酸化脂 質 の 影 響 を 評価 す る 上 で 有 用 で あ る - 8l - こ と も示 唆さ れ た 。 総合考察 ■ 紫 外 線 の 生 体影 響 に 関 し て は こ れ ま で 様 々 な 報 告 が な さ れ 影 響に か た っ て注目され て い る が つ い 、 特 に ∪V A に 関 し て は 報告 が 少 な く いて 生 体影 響 ス フ ァ ' の in チ ジル コ リ ンハ イ ドロ ペ ウサ ギ赤 血 球 を 用 い 生 体影 響及 び そ の 評価法 v /t r o ル アミ ン ハ イ ドロ につ い の メ て 検 討 した ペ ルオキ シ ル に達 し て 溶 血 を 引 き 起 い る こと してお り した m o 方 っ タノ 生 体 膜 モ デル と し て 用 い られ る そ 、 の 溶血 率 や P C O O H 結果 PEO O H , U V A 照 射時 の 、 、 溶血 の 一 こ と を 示 唆 した 捌旨質 の 過 酸化 の 機 序 に つ ヒ ト 表皮 の 酸 化 の 第 ンモ ノ ハ イ ドロ ペ の 一 。 これ より ∪ V A 生体影 響 に の へ マ に より 生 じ た 膜脂 質 の 過 酸化 が 関与 し て 2 ネル ギ エ も関与 ー U V A と は 異 な る 機序 によ る 可 能性 を示 、 P G E 、 タ ー いて 更 に 明 ら か にす る た め ゲ ッ ト とさ れ る ス ク ワ レ ン ( S Q ) ル オ キ シ ド( S Q O O H ) に 着 目 し た 養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル ( S K I N 2' M ) を用 い 。 唆 酸化脂質 含 量 、 も の 皮脂 腺 よ り 分 泌 さ れ , の H P 存 在 下 ∪V A を照 射 し 、 過 酸化 物 、 発現 に ∪V A H P 増感 に よ っ て 生 じ た o 次元培 3 。 そ の 細 胞膜中 の 過 、 結果 、 細胞毒性 の に よ り 皮表 に 生 成 した S Q O O H が 自動酸化 - 2 反応 に より P C O O H な どの 細月割莫脂質 を過 酸化 し て 細胞 の 形 態学 的 変化 を 引 き 起 そ れ ら の 傷 害 が 真皮 の 線維芽 細胞 に 達 し て 細胞 毒 性 を 引 き 起 こ し た ま た 細胞毒 性 を引 き 起 2T ” が UV A 唆 した を用 の 。 い U V A - こさ な い レ 。 細胞 の 形 態 学 的変 化 等 を 指標 と し て 検 討 し た 1 、 細 胞毒 性 や S Q O O H 生 体 影 響 を 細胞毒 性 や サイ トカイ ン 放 出 量 の の の スク ワ そ し て よ り 生 体 に近 い 放 出 量 等 を 指 標 と し て 生 体影響 の 評 価 を行 っ た 2 更に S Q O O H そ S K]N - 、 自動酸化 反 応 の 関 与 は 少 なく 、 エ U V B の 生 体影 響 に は U V そ の も の の 、 の フ ォ ジル 、 。 フ ォスフ ァ チ e 増 感 に よ り 生 じた o 一 た 生体膜 脂質 、 Ⅱ 反 応 に よ り生 成 し た o 2 が 膜 脂 質 を過 酸 化 て 増大し P E O O H 及び P C O O H 含量が ある 定 レベ jo r T yp a した こ っ そ れ に 基づ 、 。 次に 含量 点が多 の 1 1 リ ン ( H P) を示 唆 した た め に まず の 光 増感物 質存 在下 ∪V A を照 射 し 、 そ れ が 自動 酸化 反 応 に よ フ ィ そ ル オ キ シ ド( P E O O H ) に 着 目 し 機 序 と し て ∪∨ 照 射 に よ る トポル o カ ニ ズ ム を 明 らか に し ド( P C O O H ) 及 び 含 量 等 を 指 標 と し て ∪V B 照 射 時 と の 比 較 を行 、 不明 、 の へ 。 著者 ら は ∪ V A 及 び U V B し 最近 で は 免疫 反 応 、 こ こ し と を 示 唆 した 濃度 で も サ イ ト カ イ ン 放 出量 を増 大 さ せ る こ と 、 、 。 及び H P 増 感 に よ る 過 酸化 脂 質 生 成 や 細胞 毒 性 等 を 指 標 と す る 試 験 法 光毒性 及 び U V A 防 御 剤 の 評価 法 の 良 い 加 vitr o モ デ ル に 成 り 得 る 更 に ヒ ト 表皮角 化細胞 や グ ン ゼ 3 次元 培養 ヒ ト 皮膚 モ デ ル を 用 い 、 こ と を示 SQ O O H 添 加 に よ る 細胞毒 性 や サ イ トカ イ ン 放出 量 を 指 榛 と す る 評価法 が ヒ ト 表皮角 化 細 胞 や グ ン ゼ 3 次元 培 養 ヒ ト皮 膚 モ デル に 対 す る 過酸化脂 質 の 影 響 を 評 価 す る 上 で 有 用 で あ る こ と も示 唆した 。 , - 82 - 土 誌 蘇ロ 1) U V A の い る こ ロlコ 生 体影 響 に H P 増 感 に よ り 生 じ た 1 o とを示唆した 的 変化 を 引 き 起 こ o そ して この S 2 に よ り 生 成 し た S Q O O H が 関与 し て Q O O H が 細 胞膜脂 質 を 過 酸 化 し し て 細 胞 毒 性 を発 現 す る こ と及 び 細 胞 毒 性 を 引 き起 もサ イ ト カ イ ン 放 出量 を 増大 さ せ る こ と を 示 唆 した 2) ∪V B の 生 体 影 響 に は ∪∨ そ 関与 は 少 な く 3) S K f N 2' ” 、 も の の エネル ギ ー や ウ サ ギ 赤血 球 を用 の い U V A H P - 形態学 の こ さな い 濃度 で 。 も 関 与 して お り ∪V A と は 異 な る 機 序 に よ る 可 能性 を示 指標 と す る 試 験 法 が U V を示 唆 した の 細 胞膜 、 唆 した 、 自動 酸 化 反 応 の 。 増感 に よ る 過 酸 化 脂 質 生 成 や 細胞 毒 性等 を 光毒 性 及 び U V 防御 剤 の 良 い i n ・ v /t r o 評 価 法 に 成 り得 る こ と 。 4) ヒ ト表皮 角化 細胞 や グ ン ゼ 3 次 元 培養 ヒ ト皮膚 モ デル を用 い S Q O O H 添 加 に よ る 細胞毒性 や サ イ トカ イ ン 放 出 量 を 指 標 と す る 評 価法 が こ れ ら の 細胞 に 対 す る 過 酸化脂 質 の 影 響 を 評価 す る 上 で 有 用 で あ る 、 こ とも示唆した - 83 - 。 謝辞 終わ りに 鑑み 本 研 究 の 機会 を 与 え て 頂 き 、 国立 医 薬 品 食 品衛 生 研 究所 医薬 品 添 加 剤 協会 第 二 室 長) また 環 境衛 生化 学 部 の 作製 に あ た り P C O OH 、 PEO OH ・ 助言 を 頂 き ま し た 、 同徳永 裕司 第 、 の 東 北 大 学 農 学 部教授 社 基 盤 研 究 本部 素材 開 発 セ ン タ 室長 、 環 境衛 生 化 学 部 本 論文 の 御校 閲 を 頂 き ま し 、 鈴 木 和 夫 博士 に 深謝 致 します 標 晶 を 御提 供 頂 き 御提供頂 き ま し た 前 資 生 堂株 式会 社 二 。 御 指 導 と 御助 言 を 頂 き 、 た 千 葉 大学 大学 院薬学 研 究 院教 授 また 安藤 正 典 部 長 木 嶋敬 二 博 士 ( 前 国立 医薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 に 心 か ら 感 謝 の 意 を表 し ま す 本論文 、 多大 な る 御 指導 と 御 助 言 を賜 り ま し た 、 、 C し= P L C 法 に よ る 測 定 に 関 し て 御 宵滞 陽夫 博士 安全 性 ・ o な らび に S Q O O H 、 分 析セ ン タ ー 所長 高松 標品を の 翼博 士 、 同 素剤 開 発 研 究 所 所 長 河 野 善行 博 士 及 び S t D を き ま し 御提 供頂 た 日 本化粧 品 工 業 連 合 会 技術 課 長 高 野 勝 弘 氏 に深 謝致 し ま す ー 、 。 ' Vit r o[ Jf e 究所 朗 - s ki n の 細胞 断 面 の 標本 を 作製 し 病 理 部 主 任研 究 官 博士 、 小 野 寺 博志博士 を始 め 同 生 薬 部第 二 室 長 た 各位 に 感 謝 い た し ます 写 真 を 撮影 頂 、 河 原 信 夫 博士 。 - 84 - , 、 い た 国立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 同 機能性 化学部第 二 室 長 . 斎藤嘉 本 研 究 に 御協 力及 び 御助 言 を頂 き ま し 参考文献 津敬 1) 野 Ch e Jp 肌 太 陽 紫外 線 (U V A : 一 n 31 ・ 槍枝光 太 郎 2) 14 30 山 口 由起子 、 D : e o x y th 害 太 陽 紫 外 線 の 絶 対 線量 計 市橋 正 光 つ い て J S . . m y id yl yl 5 ・ - ・ 3 - - d e o x yt h m i di n 、 。 c . C ti . s m e c . ( T p T ) を用 い た 有 e 太 陽 紫 外 線防御 研 究委員 会 学 術報 告 紫 外 線細胞 生 物学 太 陽 紫 外 線 と メ ラ ニ ン 太 陽 紫 外 線 防 御 研 究委 員 会 学 術 報 告 6 7 7 9 4 ( 1 9 9 6) 3) 船 坂 陽子 B ) の 生 物学 的諸 作 用 に ( 1 9 9 7) - , - , : 5 19 27 メ ラノ 一 ・ (1 9 9 5 ) - , マ ー . - , 山村恵 彦 4) 5) C A R a m ・ ・ n 芋川 玄爾 90 2 9 0 4 佐々 木 B ・ r J ・ マ A V J C h a暮 1o D ・ a t oJ e r m 亨 : 94 ・ 新実 之 一 温 ジャ 9) 田 口 , ・ 哲 22 、 , hy p p h ot o c h S t r e il ei n ・ u m a n s ki n a ft e r ult r a vi ol e t (1 9 7 6) 6 95 111 ー ン 製薬 工 場 . 6 , a nd , P R B , の ヘ 栗本 巌 a n ・ . の ー 開発 と 課 題 . フ レ グラ ン ス 影響 植物 及 び 動物 プ ラ ン ク ト ン に つ - 6 , 1 2 ト1 4 4 吉川 邦彦 of e pid e r m al c y t o ki n e s g e n e ti c s - P h o t o bi o ] 6 2 3 8 9 4 0 1 . e n e ti c m u n o u lt r a vj ol e t r a d ' G Jm - . , e rg s t r e s s e r: . . e r ot e r e a c ti o n s e m 太 陽紫 - ( 1 9 9 6) - 太 陽 紫 外 線 と 皮膚 免 疫 局所 免 疫 : 一 , di a ti o 85 - - of 6 252 258 i n th e u c e g , 7 ト7 5 ( 1 9 9 6) U ltr a vi ol e トB - , ind n ( 1 9 9 5) - b a si s 27 いて (1 9 9 6) 太 陽 紫 外 線 防御 研 究委 員 会 学術報告 e r s e n siti vity ・ un e . - 1 2) S E U ”ri c h : T h m - ( 1 9 9 4) 8 17 - . . c o nt a ct im in h e s 隆 : 紫 外 線 防御 か らみ た シ ャ ン プ J W W S t r eiJ ei n ・ g 紫 外 線 に よ る 皮膚 障害 と サ ン ス ク リ 太 陽 紫 外 線 の 海 洋 生 態系 : の 低下 と 発癌 . ch a n ( 1 9 9 0) 1 8 , 一 池内 、 吉 川岡佃 1 1) J 48 7 493 太 陽 紫 外 線 防 御 研 究 委員会学術報告 - 1 0) a s c ul a r 18 紫外 線 と 白内障 水 晶 体 混 濁 発現危 険 因子 と し て の 紫 外 線 : ナル ー V 1 外 線 防御 研 究 委員 会 学術報告 8) リ ア ン ナ 医科 大 学雑 誌 n e r: ・ I 手嶋 、 聖 ・ ( 1 9 8 6) - 7) a nd s ay i r r a di a ti o 6) 皮膚 と 紫 外 線 : ( 1 9 8 8) e n e r a ti o n d im e ff e ct s o n m u n e of c u t a n e o u s s u p pr e s si o n ・ 1 3) A J ・ e e v a n y t o ki n c ・ in d n ・ i n th e s di a tj o ra S E U [J ri c h , ・ im m r a ci a ・ e n e r a ti o n g e u c ed - M D G , R Sh of c u t a n e o u s u n e ppre s u s si o n h a I , d a n i m c h Th u n: ・ e m Ph ・ a nd p Jd al e r m ult r a vi o ) e t bi ol 6 4 ot o ・ of e r ole e r e a c ti o n s u n e m P h ot o . Y S . - 2 59 2 6 6 - , ( 1 9 9 6) 貞幹 正 1 4) 滝 31 荒金 久 美 、 396 402 1 5) 宮地 良 樹 1 6) 堀尾 1 7) Z H ind 紫外線 と しわ : 武: U V A u s aj n ・ ・ u c ti o n of a n th r a c e n e (1 ・ ・ a nd 53 FL B 2 1) e nt m u c e d i u m a n G e a n v e st ・ L m B a n 川西正祐 ャ 20 ナル ー 20 1 7 7 1 81 8 17 ( 1 9 9 4) - , (1 9 9 6) - , W i c k : R ol e . a ]rl e s s u Jt r a v i ol e m of ult r a vi o l e t i r r a d i a ti o i n th n e ic m t i r r a di a ti f o一 l o w i n g 7 1 2 di m e e t h yl b e n z - o n , ・ C R a n c e r e s 暮 51 ( a) 4 96 4 497 0 - , ・ a . s ki n , . M o ys an , c e ll s I n o a n . . a 豊 b e ‖e U lt r a v i o [ e t A i n d - e u n: in d c a n c e r u c o . in h vit r o d J K ・ R s: t oJ 1 0 4 Ils L e r I nt e u c ti o n r a c ti o n b et w i n h ai rl e u(t r a vi ol e t e e n s s m ic e . C a n c e r R A e s ys u m a n P M o r= e r e . , s ki n : a n P a n d L D . r o t e c ti v e u b e n ret: . eff e ct of vit a m U VA - in E in ' , ru B ・ t 3 6 r , J : F G . a t ol e r m ] n t e rJ e 134 . ki n 1 0 p - B 7 7 84 - , a nd ro d (1 9 9 6) u c ti o n by uJt r a vi o l e t c ult u r e Al ra d di a ti o n . J . ( 1 9 9 5) 竹ノ 内正紀 、 1 90 2 00 - , U V A によ る D N A a u uJt r a vi oJ e t 粧技 誌 3 1 . D ・ by n 託 摩 由有子 、 ・ m a n n: g uJ a ti o e - 伊 藤貴美 子 、 d v a n . L M j c h e暮 A M , yt e n o c 太田 、 in s u p r e s si o n af e r m e r m . (1 9 9 3) u n e ti d J C j 紫 外 線 防御研 究 委員全 学術報告 2 3) A . in h o rs d r ui i a n 序 とそ の 効果 的 な 防 御 2 2) u m r a di a ti o n s a c r oi x ra 本好捷 宏 G e . K G y ufk , ke D - p id ra w e u m In . 4212 4217 , ind ・ F R d , - ・ 2 0) M e rg uJt r a vi oJ e t 1 9) P C J e h 粧技誌 9 9 1) 1 8) J W h 変軌 ' y ti c t n d M M a n . , p p li c a ti o a ・ k T Fl o tt e a el a n o c m 香 粧会誌 一 ・ グラ ンス ジ フ レ ・ 作用 基 礎 の M A P a th , ∪V A に よ る 皮膚内抗酸化 酵 素 の : ( 1 9 9 7) - , 加治 和彦 、 b 6 d ]i p jd p o ri a u 7 , 3 3 45 ・ , R S e r o xid a tj o n - 86 an - ∪V A に よ る 光 老 化皮膚 の 生 成 機 ( 1 9 9 7) 損傷 生 体 内光増感 分子 の 関 与 - - . ( 1 9 9 7) a nt u s . : d , L D u b e rtr e t a n a n ti o xid a n t d P M d ef e . ns e o rJj e r e : sy st e m s in 太陽 . d h c u Jt u r e 2 4) 薗田 2 5) 花 田勝 美 勝 43 48 笠 a n s k i n fib 坂 岸 良克 、 bla ro st s J Jn ・ ・ D ・ e r m a t ol 光 増 感 反 応 に よ る活 性 酸 素 : 皮膚 疾 患 と 活 性 酸 素 : v e st リ フ ・ ラ ジカル ー 1 00 . 6 92 6 9 8 生化学 . ( 1 9 9 3) - , 60 21 2 6 (1 - , フ レグラ ン ス ジ ャ . 9 8 8) ナル ー 21 , ( 1 9 9 3) - 2 6) u m 明芙 荒 金 久美 、 光 老 化 と 活 性酸 素 : フ レ . グラ ン ス ジ ャ ナル ー 25 24 28 - , (1 9 9 7 ) 2 7) 官滞 陽 夫 化 , z a w a R S e r o x i d a ti o n Bi oL u m in ki a nd H ln ab a: bi ol o g I C a l s y st e m s a e ・ , of e s c e n c e d a n c 2 9) 宵滞 陽夫 : 過 酸化脂 質 3 0) 河野 善 行 ナル 25 3 1) 河 野 善行 山 下 豊信 、 29 35 - , (1 ける 脂 質 過酸化 反 応 3 2) 松 尾 車朗 21 3 3) 3 0 34 (1 - , 別府 正 敏 フ : 40 30 3 31 6 , 74 3 5) ー 仁 : . e m i[ u d it s a n in m D e t e c ti o a 26 e m i) u m in i n Ii p id e s c e n c e to H P LC n . J . ( 1 9 8 9) 475 479 - , ( 1 9 9 4) 53 5 8 - , h p p li c a ti o 4 e s ce n c e 現代 医 療 of c n 皮膚 の 過酸化 と 抗酸化 化 粧 品 の 開発 森 、 真輝 阪 本興彦 、 粧 技誌 . 23 33 40 フ . レグ ラ ン ス ジ ャ ー 、 高橋 元 次 : ヒ ト皮 表 に お (1 9 9 3) - , 中村哲 治 、 ラ ジカ ル に よ る 過酸化脂 質 の 生成 . フ レグラ ンス ジャ ー ナル 9 9 3) 菊 川 清見 、 - 3 4) 正 木 リ : h ・ 9 9 7) 荻原 滋延 、 農 . ( 1 9 8 8) 6 2 1 4 91 1 4 9 8 I ル オ キ シ ド の 定量 分 析 ペ - - 2 8) T M i y a p 化 学発光 H P L C 法 に よ る 生 体脂 質 ヒ ド ロ : : 酸化 的 ス ト レ ス を 受 けた 細 胞 に 対 す る 生 体 防御 . 衛生 化 学 ( 1 9 9 4) 植物抽 出 成分 の 活 性酸素消去作 用 . フ レグランネジ ヤ ー ナル 23 , 65 - ( 1 9 9 5) 内野 正 , 木 嶋敬 二 , 安藤 正 典 : トポル へ マ 脂 質 生 成 と 赤 血 球 の 溶血 反 応 と の 関 連 ー , 87 フ ィ 衛 生化学 - リ ン等の U 40 35 0 3 5 7 - , V A 増感 に よ る 過 酸化 ( 1 9 9 4) 3 6) T U ch j n o I h at o e m Jp n p 正 n a h y ri n o xi c o[ I 3 7) 内野 ku o . o rp J T ・ H T , n vi r o n 徳永 裕 司 、 K K iji m . , = pid h y d o n E ・ a g H ・ e a a ro lt h 4 3 c hi n o m ki n T m o d e l i n th e o x i c oJ 3 9) T U m o n o h u m o h yd a n H J , ki n s (2 605 610 - 4 1) Y S u z u ・ yt e の M iy a sj m ph R P ro e s 4 4) L E . a w a 子 b ra 4 5) G F Vi一e a nd . , T S ・ n e s p r o t ei n u m a n e V A ー 香 粧会 誌 ・ gl a o rp h M A di n E n of t h eir h e m ol y s I S ・ 2 259 2 64 2 T” ( 1 9 9 6) - , r el e a s e d a n 増感 に よ る 3 次 元 培 20 S ki n of y[i n sq u al e n e , z K1 3 01 u)t r a vi oJ e t a = Eff e ct of o: y t o ki n c e r m d n ・ d a n pid . 小 嶋茂雄 、 57 59 - a s h a u m A i r r a di a ti o a n n . r eJ e a s e e くe r a ti n o c y t e s s u al e n e q in th a re e B i oI P h I - di m a r m ・ e n si o n aL B . = 25 u . , 1 u z u of s e r u m u ot o i n a ti o n rm ji m a n ol a m in e of hy d U V in d - u c e s /n e m b d h bj o D y n - 新本浩 、 e m o暮 y si s 5 568 575 , 長 野 哲雄 一 、 of ra - . フィ リンによる d Ch t ( 1 9 8 2) 虞部雅 昭 、 、 重項 酸 素 の 産 生 と 一 ( 1 9 9 5) d K Y ・ a s u p h a tid y[ c h o s p a r m a c o e r o xid e o i n th a= ‖n e a nd alt e r a ti o n s e li v a n P h o t o bi oI 5 2 7 9 5 8 0 0 - . . vitr a n d p r o t ei n in h , . d R M T y rr e ”: U V A . 1 6 - , s e n siti z e il u e m h yd e r ro a n p d b m in e s c e n e r o xid e r ai n of t an th d rat e , J Li p id . (1 9 9 2) P h ot o ch ' ph ro Ph ・ 由 来ポ ル a c n e s ki K F ・ J ・ 増永卓司 , 19 ・ ビ ン 類 の ∪V A 増 感 に よ る 分 離 赤 血 球 の Rib of一a vi n p h o t o o: 林 千 賀子 、 フ ラ : (1 9 9 3) - , 香粧会誌 . d et e e v a r: a n h リン U フィ t o x i c ity p a nd ・ y t o t o xi city n l b a c t e ri u m , h H e ra - 33 1 051 10 59 o c c d re s e n c e p e pi o p h a tid yJ e t h K . o n n o at o o n n ( 1 9 9 9) d T 0 gi s a n - . m e m . ra 過 酸化 uJt a n e o u s o s O 111 荒金久美 表皮脂 質 ・ , u n ag a i n th s 、 : 4 3) T 483 489 木 島敬 二 、 ・ 益子信郎 a e m - 衛生試報 ・ , 明美 4 2) 笠 of c ell a nd s ti o ( 1 9 9 7) 影響 r o st a yt e s e n siti z a - 0 0 2) ki T M i u e ry th r o c a n h P d u c ti o n re s e n c e , nd o : ・ d ro m o d el a n d 4 0) 佐 々 木 久 美 子 溶血反応 k o d M A a n p e r o xid e p ro a g p 暮n V it r o 1 3 . hi n c I u n a e r o xid e p ro k o ・ hy d o n o s H T , の へ U V of e ry t h r o c トポ ル へ マ : 養細胞( S ki n ) 中 の 過 酸化 脂 質 含 量 ・ in 1 0l 1 0 7 , E ff e c t o: - 2 3 8) T U d n . e r o xid e s p 安 藤正典 、 M A d a n r a di a ti o n u m a n s ind - ki n fib - 88 - u c ed ro d = pid o xid a tj o n in e ry t h r o c y t e (1 9 9 0) o xid a ti v e bl a s ts i s d e p d e n a m a g e to d e nt o n li p id s ir o n a n d si n 4 6) E gJ e t o x D G ・ o ・ dj a ti o ra V ・ Ph e r・ n in d a rg a s R o s e b 内野 5 0) 正 ・ 5 2) F G a b n in D 5 3) K P ・ gh F , 22 al m A in d - s C J J , ・ a nd e - y [i pid p L o n g w a v e 一e n - a m ag e a n d h gt h U V A ly e m o s JS ・ ( 1 9 9 3) d ph o t o h a n oly ti c e m d ie s eth o d stu of fib r a t e s . 33 e n oJ 66 0 6 63 p r o t ei n q Bi o c h (1 - , 9 7 8) u a n tit a tj o n A n al : 赤 血 球 を用 い た U V A 防御剤 の ・ e m 1 00 m ・ 2 0l , 22 0 - of L o w ry , ( 1 9 7 9) ' 評価法 vitr o In . a n s e n , in h urt r a vi o - e t l n V it r o c c o a n e r o xid a A P m ・ by 6 . of r e d 34 5 3 4 7 c ti o c ult r e ・ in h In e: b( o o d c e ”s v ol v e m e n t o f si n d h f ro m ( 1 9 9 2) - , d ] Ti r a n B u m a n s ki n fib g 一e t ro o x e n yg bl a s t s . A r ch . ( 1 9 9 5) 33 8 3 4 0 - es m ・ o xi c oJ Gia P U V A tr e at e n z f oli n p h a e m ol y si s T ・ o u[i n s , e: ・ 最新 医 学 ・ a n d a】 1 hj : H uc ed 287 . th e ci e s e m ・ un n o n e n n p s o s W Le (1 9 9 8) - ・ d P h o t ol a b ‖ ity 安藤 正 典 98 1 0 1 , P C J toL R e of 、 ( 1 9 9 5) - ( 1 9 9 3) d R a rr a n N D , a n ti o xid a n t (1 e vi e w 徳永裕 司 , t a ni i r r a dj a ti o 1018 1026 , 7 2 1 73 0 , yt o s k e l e t a l d - 過 酸 化脂質測 定 法 R a n c , 18 ・ r ・ st r e s s e d e S M 川e ・ a s: , u Jt r a vi ol e t e r m a d a n u ・ B io L M ・ A , ti v - o ri a n ・ o xid a d N C u m ar a nd diff e r e a s 48 90 0 904 香粧会誌 5 1) S K o m P h o t o bi or 5 7 s o n: ro u di c a ・ : r R e ・ u c e s ・ a r m a zi e ・ . q a n 4 9) L G P e t e r Fre ・ P D Th e m 大石 誠 子 4 8) e n d P h ot o c h 4 7) F yg u n t a] a a nd e n t of m e m ke u m a n M Ah otup . bra n e r a ti n o c y t e s . Eff e ct s a: f a 廿y a ci J In v e st . d a nd s . of D in vit r o UVA a c ti viti e s of L 96 2 55 259 e r m at o - , 9 9 1) 5 4) S M . a n . Ed w a rd s 1 06 11 5 5 5) C C . o th e e h e n . of e nt a s s e s m - T A D , o n n eJy , R M S . p h o t o t o xj city a . u sl n yre g h a an d LA u m a n s R h ei n . ki n m o s: ' Q u a n tit a d e一 s ki n , ti v e 2T ” A E vit r o In u r M ・ e d ・ R e s ・ , ( 1 9 9 4) , K . G D . v a 一u a ti o n i n Vjtr o 8 , of , A R . o u gi e r p h o t o t o xi city 6 69 6 7 1 ・ , o s s u an d R R . o g a n d s u n s c re e n (1 9 9 4) - 89 - A n in p h o t o p r o t e cti v e p u e t: E P J S KI N : vit r o ro p m e rti e s d el f o o . T r o xi c o l . 5 6) 河 野 善行 阪 本興 彦、 ・ 、 中村 哲治 官揮 陽 夫 , る ヒ ト 皮 表 脂 質 過 酸化 物 の 定 量 ( 第 2 報) 出 油化学 . 5 7) 小 山 和夫 42 酒井 、 剛 5 8) 中 山 情実 するアス 誌 5 9) 23 1 7 佐 田雅 宏 (1 6 0) L ク ワ レン ヒ ドロ ペル オ キ シ ドの 検 小 西宏 明 、 小 方英 、 二 粧技 誌 . 24 2 02 2 0 6 - , (1 9 9 1) 紫外 線 B 波 照射 に よ る 皮 膚 障害 に 対 : ス テ ル の 投 与 効果 培 エ 太 陽 光 線 に より 皮 膚 上 に : 養 皮 膚 を用 い た実験 一 香 粧会 ∴ ( 1 9 9 9) - , 忍 伊東 、 ル ビ ン 酸 リ ン酸 コ 今尾 正 隆 、 酸化 防 止 剤 に よ る抑 制 の 小 林 静子 、 福 井守 正 、 生 成 す る 過 酸化 脂 質 ス 、 ( 1 9 9 3) 44 49 - , 化 学発 光検 出器 を 用 い た H P L C に よ : 抗シ ワ : 抗 老 化化 粧 品 の 展 望 ・ フ レグラ ンス . ジャ ナル ー 24 23 30 - , 9 9 6) A R h ei n . s . to a S M Ed . , w a rd s . im s s e s s c ut a n e o u s 6 1) 河 野 善 行 高橋 元 次 、 : m , 0 . Mia an o u n o t o xi city d T A D - T . o xi c o o n n el[y : . 2T ” S ki n ' a n ' L i n V it r o 8 1 0 0 7 1 0 1 4 ・ , 皮表 に お け る 過 酸化 反 応 とそ の 防 御 v/t r o In d el ( 1 9 9 4) 油化学 . m o 44 2 48 2 5 5 - , (1 9 9 5 ) 6 2) T S u z u . h yd B u ki K N r o c a rb o n s ‖17 55 63 M M . Cli n l . s . L B ki n , T M iy a z a w a . r o xid a ti o n i「 = a n d H -s . s ol a t e d o n o: r at C y t o t o xi cit y of cl o ri n a t e d h e p a t o c yt e s Bj oI P h . . a r m . : 生 体 の 酸化 障害 と 防御機構 フ レ グ ラ ンス ジ ャ , ー ナル 25 e ra ti o a n pid c oJ o ri m e t ri c ass a y fo r c ell ul a r a nd c y t o t o xi c ity a s s a ys J g ro o u r n a l of . [ m w th a n d s u r vi v al : a m u n ol o gi c al p p li c a ti o M eth o d s 65 , ( 1 9 8 3) - 6 6) P a s a ki d一 i pid p e 木鋭 雄 R o s m a n n: t o p r olif . . , ( 1 9 9 7) 9 16 - 6 5) K 二 、 H S , ( 1 9 9 4) - 6 3) 野 口 範 子 . an 82 8 6 , . 6 4) T M e z u . , e a x e m m y , K . R M . u n o a s s ay e r n h of e r, ・ M q ui v b a l e n t m e s e n c hy m al . a d di p a ti 1 5 116 120 - , S ei b e rg sy ste m s int e a nd a n J B i rk . . T I nt e rf e re n c e in i m m un o a s s ay ・ J ・ ( 1 9 9 2) d M R M to t o p I C - r a c ti o n s m ei e r: . a a rti n : ・ ”y o xi c o I . a Th ie d p p一 90 - i n fl u e n c e c o n s u m e r i n V it r o 1 3 - e 21 9 2 2 9 - , p of th e r e s p o n s e ro d u ct s ( 1 9 9 9) by e of p ith e li a ト n 6 7) K M ・ o ro e v aJ u a 1 7 ti o ・ ・ o ro ta si x e n , th e o rik a w a M e ・ s ki n A)t e , d s ・ T 細 胞 トキ シ ki n S M e st n ・ コ ロ ・ , E xp ー ji o m a d eI Ti s s m o t e st ジ H K , o rit a . i r rit a ti o rn o rit a ・ c ult u r e N . S M , 9 8) d p oi n t s : ■ o rik a w a (1 9 d r ai z 6 9) 佐 藤 和 子 、 of n 87 93 n m a ry 店 N M , - , 6 8) K M p ta . H K o u sl n g . e ri m ji m a a n u e 6 o ni s C u)t u r e R d H K . d h 4l 5 1 - , . a n C ult u r e e nt d H K h i: e v el o e s e a rc o ni s hi : u m a n D s ki n Alt e m - 91 - o o m e nt m m r n a ti v e d e一: c o m a n d u ni c a ti o n to p a ri s o n of ( 1 9 9 9) 試験 法 ( 日 本 組 織 培 養 学 会 編) 東京 ( 1 9 9 1) h C p p p 95 9 6 - . , 朝倉 書 主 論 文 目録 本学位 論文 内容 は 下 記 1 . 内野 正 木 嶋敬 二 , 尭表論文 に よ る の 安藤 正 典 , トポル へ マ : 脂質 生 成 と赤 血 球 の 溶血 反 応 と の 関 連 2 . 内野 正 徳永裕司 , 安藤 正 典 , 2 細胞( S ki n ) 中 の 過 酸化 脂 質 含 量 3 T U . . h . n T U ・ hi n at o e m Jp 4 c T 5 . c hi n yd o c o s 605 6 1 0 - , o ku h y rj n E . H T ok y ro n ag a on u n a e , H T ro ki n . p o k o d a , o n a n d h c yt o u m d n . n . d o: h d P r o sta c e= at o ー o rp 20 2 59 2 64 (1 9 g] a (1 9 - , Eff e c t of U V - s e n siti z a a n d ti o 9 6) n o n t h ei r h s u al e n e of e m ol y si s 9 7) di n E n t o xi city p 550 55 7 - , e ry th r o c y t e s in - M A 40 増 感 に よ る 過 酸化 の U V A ( 1 9 9 4) ィ リ ン U V A 増感に よ る 3 次元培養 フ o: , a e m . M A リ ン等 香粧 会 誌 . 4 3 1 01 1 0 7 of H O 響 e r o xid e s a n s e n c e g p u c ti o n - u n a d el a nd ro ro トポル の影 へ m a a nd e a lth 4 8 3 4 89 , e r o xid e m H . a p pre . )i pid h y d g e r o xid e p K K iji , n vi r o n h l V it r o 1 3 hyd u m a n . d e一i n t h hi n o n o H T o rp o o xi c o L . h m , o xi c oJ . ki n T U m p J T . m o n oh s o 衛 生化 学 . へ マ : フ ィ of h y ri n 2 r el e a s e S ki n a n d 2T ” , q z K 1 3 01 ult r a vi ol e t - a s a h u m a n A i r r a d i a ti o n . (1 9 9 9 ) e ra a n d M A t o x i city a n d n o a n d e pjd , e r m c a[ 92 d o: yt o ki n k ( 2 0 0 2) - n - e E ff e c t of s r el e a s e in e r a ti n o c yt e s , q u al e th a re e Bi o I P h . n e - ar m di . m e n si o n a l B u[I 2 5 . , . 本 学 位 論 文 の 審 査 は 千 葉 大学大 学 院薬 学 研 究 科 で 指 名 さ れ た下 記 行われ た 。 主査 千 葉 大学教授 ( 薬学 研 究 院) 薬学 博 士 鈴木 和 夫 副査 千 葉 大 学教授 ( 薬 学研 究 院) 薬学 博 士 今成 登 志男 副査 千 葉 大学教 授 ( 薬 学 研 究 院) 薬学 博 士 上 野光 副査 千 葉 大学教 授 ( 薬 学 研 究 院) 薬学 博 士 堀江 利 治 副査 千 葉 大学教 授 ( 薬学 研 究 院) 薬 学博 士 矢野真吾 - 93 - 一 の 審査 委 員 に よ っ て
© Copyright 2024 ExpyDoc