遺伝子解析システム CEQ / GeXP Application Information No.6 フラグメント解析における シグナル強度のバランス フラグメント解析において、シグナル強度のバランスは重要です。サンプルピークが強すぎるとサイズスタンダード が検出されなかったり、過剰なプライマーが存在するサンプルではプライマーが優先的にキャピラリーに取り込ま れ肝心のサンプルがインジェクトされなくなったりします。過剰プライマーとシグナル強度についての影響について 検討しました。 過剰なプライマーの泳動への影響 過剰量のプライマーはサンプルのキャピラリーへの取り込みを抑制し、結果としてシグナルの強さを抑制します。 Fig.1 過剰な残存プライマーの影響 （左）0.5µM／10µL PCR 反応の PCR 産物の泳動 Raw data （右）左と同条件の PCR 産物に 10pmole の過剰なプライマーを PCR サンプルに加えて泳動したときの Raw data ・サンプルは 0.25µL 400base size standard／30µL SLS に 1µL の 10 倍希釈した PCR 産物を使用 ・泳動メソッド Frag-3 で泳動 PCR 後に過剰なプライマーを取り除くことは非効率的です。PCR 条件を決定する際、サンプル中に多量のプライ マーが残らないようにプライマーのタイトレーションを行い使用する濃度を決定することをお勧めします。プライマー のピークが 1 本の細いピーク（可能ならばテストピークのシグナルより低く）となり、テストピークのシグナル強度が 十分得られるプライマー濃度を選択します。 過剰なプライマーのサイズスタンダードへの影響 過剰なプライマーは、サイズスタンダードのシグナル強度の不均衡を引き起こす可能性があります。 過剰プライマー存在下 適正プライマー存在下 A：Raw data B：Raw data C：Analyzed data D：Analyzed data Fig.2 過剰プライマーのシグナル強度への影響 A, B: Raw data, C,D: 解析データ、A, C: 過剰プライマー存在下、B,D: 適正プライマー量 過剰なプライマーはサイズスタンダードのシグナル強度に不均衡を引き起こす可能性があります。 サイズのコールは正確ではありますが、ピークレシオや LOH 解析といったシグナル強度を元に解析を行う結果は、 不正確なデータとなってしまいます。 過剰なプライマー解析データへの影響 サンプル中の過剰プライマーは、解析データにアーティファクトとして現れ、データの解析を困難にします。 適正プライマー存在下 過剰プライマー存在下 Fig.3 過剰プライマーの解析への影響 （左）過剰プライマーなし；（右）過剰プライマーが存在 過剰プライマーが存在する場合、Fig.1（右）に見られるように（左）に比べ太く大きなピークが検出されます。この幅 のあるピークは何らかのピークとして解析され Fig.3 の解析データ上に不可解なアーティファクトとして観察されます。 このようなアーティファクトは解析を困難にし、サイズによっては解析に必要なピークの検出を妨げることがありま す。 シグナルの強さの解析への影響 シグナルは弱いより強い方がよいのですが、検出限界を超えてしまうと正確なデータが得られません。検出限界を 超えてしまったピークは、たとえ 1 本のピークであっても解析結果で複数のピークとして現れることがあります。 Fig.4 シグナル強度の飽和 （左）Raw データ;（右）解析データ Raw データにおいてシグナルの強さが検出限界を超えてしまうと、ピークの頂上がフラットになってしまいます。解 析結果を見るとシグナルとして検出されていますが、１本のピークではなく 2 本のピークとして解析されてしまい正 確なデータを得ることができません。このような時は、サンプルを希釈してインジェクション量を減らし、ピークが振 り切らないように調整してください。 AI-C-006_0802a
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