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J Dermatol Sci. 2014 ;75(1):16-23.
Resveratrol inhibition of humn keratinocyte proliferation
via SIRT1/ARNT/ERK dependent downregulation of AQP3
レスベラトロールによるヒトケラチノサイトの増殖阻害は
SIRT1/ARNT/ERK依存的なアクアポリン3の発現低下を介している
Zhouwei Wua,b,*, Hiroshi Uchi b,c,*, Saori Morino-Koga b, Weimin Shi a, Masutaka Furue b,c
a Department of Dermatology, Shanghai First People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, China
b Department of Dermatology, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Fukuoka, Japan
c Research and Clinical Center for Yusho and Dioxin, Kyushu University, Fukuoka, Japan
2015/10/05 M1 小松俊之
[ 背景と目的 ]
AQP3は、表皮ケラチノサイトに高発現な水とグリセロールのトランスポーターであり、過剰発現によってケラチノサイトの増殖と表皮肥厚化を誘導する。
さらに、AQP3ノックアウトマウスは、グリセロール含量とATP合成の減少のため、皮膚腫瘍形成に抵抗性を持つことが報告されている。このためAQP3の
阻害は、乾癬やアトピー性皮膚炎、皮膚癌形成などの過増殖を伴う皮膚病において有効と考えられる。また、ケラチノサイトの増殖において、ERK1/2が
主要な役割を担っており、クルクミンといったポリフェノールなどによってERK経路が阻害されると、AQP3の発現が低下することが知られている。
レスベラトロールはブドウやブルーベリー、クワを含むさまざまな植物種において見つかっているポリフェノールであり、さまざまな細胞種において、抗
増殖、抗酸化、抗炎症、抗転移、抗血管新生作用を示すことが知られている。そして、aryl hydrocarbon receptor (AhR)に結合し、結果として核に移行し
て、そこでAhR nucler translocator (ARNT)に結合し、ヘテロ二量体形成する。このヘテロ二量体はハロゲン化芳香族炭化水素や低酸素症において活性
化され、AhR/ARNTとERK経路との関係も報告されている。さらにレスベラトロールは、SIRT1シグナルを介して様々な生理活性を示し、ケラチノサイトの増
殖を抑制することも報告されている。しかし、その詳細なメカニズムは分かっていない。
そこで本研究では、レスベラトロールのケラチノサイトにおける抗増殖作用のメカニズムを、上記の経路に注目し調べた。
レスベラトロールは、40μMまでは
細胞毒性を示さず、50μM以上で
は、濃度依存的に毒性を示した。
Fig. 1. Cytotoxicity of resveratrol in NHEKs. NHEKs were treated with resveratrol at
concentrations ranging from 0 to 100 mMfor 24 h. The cell viability was determined
with the 7-AAD Cell Viability assay. Values are presented as mean SEM (n = 3).
*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 compared to the untreated group (0 mM).
Fig. 2. The proliferation of NHEKs was inhibited in both resveratrol-treated and
AQP3-knocked down conditions. (A) NHEKs were seeded onto 96-well plates at a
density of 1.5 104 cells/well. The cells were treated with resveratrol (20 and
40 mM) for 24 h and BrdU (final concentration, 10 mM) was added for the final 16 h
of the treatment. (B) Western blotting analysis of si-AQP3 transfection by using
AQP3 siRNA. (C) Si-control and si-AQP3-transfected NHEKs were seeded onto 96well plates at a density of 2.0 104 cells/well. Cells were cultured for 24 h and BrdU
(final concentration, 10 mM) was added for the final 16 h of the treatment. BrdU
incorporation was determined by measuring the absorbance at 450 nm.
Representative results, n = 3. ***P < 0.001 compared to the untreated group. (Aand C)
レスベラトロールは、濃度依存的に細胞の増殖を抑制した。
また、AQP3のノックダウンで、細胞の増殖が抑制された。
Fig. 3. The downregulation of AQP3 expression by resveratrol in NHEKs. NHEKs
were treated with resveratrol (20 and 40 mM) for 24 h. (A) qRT-PCR analysis. AQP3
mRNA levels were normalized to b-actin mRNA levels. (B) Western blotting and (C)
quantitative analysis. AQP3 protein levels were normalized to GAPDH protein levels
using ImageJ software. Representative results, n = 3. ***P < 0.001 compared to the
untreated group (A and C).
レスベラトロールは、濃度依存的にAQP3のmRNAとタンパク質の発現を低下させた
レスベラトロールは、 ERKのリン酸化を阻害しAQP3の発現を低下させた。(EGFRのリン酸化は抑制しなかった)
U0126は、ERKのリン酸化を阻害しAQP3の発現を低下させた。(EGFRのリン酸化は抑制しなかった)
レスベラトロールによ
るERKのリン酸化抑制
と、AQP3の発現低下
は、ARNTのノックダウ
ンによって抑制された
が、AhRのノックダウン
では抑制されなかった
→レスベラトロールの
作用は、ARNTに依存
するが、AhRまたは
AhR/ARNT複合体には
依存しない
Fig. 5. The inhibitory effect of resveratrol on ERK activation and AQP3 expression was ARNT- but not AhR-dependent in NHEKs. (A) Western blotting analysis of si-ARNT
transfection by using ARNT siRNA. (B) Western blotting analysis and (C) quantitative analysis. Si-control and si-ARNT-transfected NHEKs were treated with resveratrol
(40 mM) for 24 h, and the expression of ERK phosphorylation and the expression of AQP3 were analyzed. (D) Western blotting analysis of si-AhR transfection. (E) Western
blotting analysis and (F) quantitative analysis. Si-control and si-AhR-transfected NHEKs were treated with resveratrol (40 mM) for 24 h and the expression of ERK
phosphorylation and the expression of AQP3 were analyzed. Protein levels were normalized to GAPDH protein levels using ImageJ software. Representative results, n = 3.
**P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001 compared to the untreated group (C and F).
レスベラトロールは、ARNT
とSIRT1の遺伝子発現を濃
度依存的に増加した。
SIRT1のノックダウンで、
レスベラトロールによって
誘導されるARNTの発現上
昇が抑制された。
SIRT1のノックダウンによっ
て、レスベラトロール誘導
性のリン酸化ERKとAQP3
の発現減少が抑制された。
Fig. 6. Resveratrol induced upregulation of ARNT expression in a SIRT1-dependent manner in NHEKs. (A) qRT-PCR analysis. NHEKs were treated with resveratrol (20 and
40 mM) for 12 h. ARNT mRNA levels were normalized to b-actin mRNA levels. (B) qRT-PCR analysis. NHEKs were treated with resveratrol (20 and 40 mM) for 3 h. SIRT1 mRNA
levels were normalized to b-actin mRNA levels. (C) qRT-PCR analysis of si-SIRT1 transfection. (D) qRT-PCR analysis. NHEKs were treated with resveratrol (40 mM) for 12 h.
ARNT mRNA levels in si-control and si-SIRT1 condition were normalized to b-actin mRNA levels. (E) Si-control and si-SIRT1-transfected NHEKs were treated with resveratrol
(40 mM) for 24 h and the expression of ERK phosphorylation and the expression of AQP3 were analyzed. (F) Protein levels were normalized to GAPDH protein levels using
ImageJ software. Representative results, n = 3. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001 compared to the untreated group (A–F).
Fig. 7. A working model of the molecular mechanism of resveratrol inhibition of
human keratinocyte proliferation. Resveratrol inhibits NHEKs proliferation through
SIRT1/ARNT/ERK/AQP3 pathway. First, resveratrol induces the expression of SIRT1,
leading to the upregulated expression of ARNT. Then, ARNT dephosphorylates ERK,
but not EGFR, resulting in the downregulation of AQP3. AQP3 suppression then has
a negative effect on the NHEKs proliferation. However, resveratrol-mediated AQP3
inhibition merely depends on ARNT, but not on AhR or an AhR/ARNT complex. Red
arrows show effects of experimental manipulation; black T-bar, suppression; black
arrow, stimulatory activity
レスベラトロールは、SIRT1/ARNT/ERK/AQP3経路を介してNHEKsの増殖を抑制する。
1. レスベラトロールはSIRT1の発現を誘導する。
2. SIRT1は、ARNTの発現を増加させる。
3. ARNTはERKを脱リン酸化する。(EGFRは脱リン酸化しない)
4. ERKの脱リン酸化により、AQP3の発現が低下する。
5. AQP3の発現低下によって、NHEKsの増殖は低下する。
（レスベラトロールのこの作用は、ARNTを介するが、AhRまたはAhR/ARNT複合体は解さない。)

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