D 液

海洋生命・分子工学基礎実験
タンパク質の取扱い
（4）
細胞分子工学研究室担当
5．SDS-ポリアクリルアミド
ゲルの調製
まずは・・・
• ゲル板を組み立てる
o 当日実演します
o メモの用意を！
使う溶液
1． A 液（30% アクリルアミド水溶液）
2． B 液（Lower Gel Buffer）
3． C 液（Upper Gel Buffer）
4． D 液（10% 過硫酸アンモニウム ammonium peroxodisulfate
= APS）
5． E 液（10% テトラメチルエチレンジアミン
tetramethylethylenediamine
= TEMED）
分離ゲル
（separation gel = running gel）
• 以下の溶液を混ぜる（12.5% アクリルアミド）
o A 液： 3.47 mL （3470 mL）
o B 液：
2.08 mL （2080 mL）
o 蒸留水： 2.78 mL （2780 mL）
• ここまで混ぜたら脱気
o D 液：
28.5 mL
o E 液：
85 mL
• D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板に流し込む
分離ゲル
（separation gel = running gel）
• ガラス板に流し込んだら，上に静かに水飽和 1-ブタノー
ルを載せる
• 1-ブタノールはアクリルアミド水溶液とは混ざらない
• ゲルの上の端が平らになるように約 30 分静置してゲル
を固める
• 固まったらブタノールを捨て，水道水→蒸留水で洗う
• 残った水をろ紙で拭き取る
濃縮ゲル
（stacking gel）
•
•
•
以下の溶液を混ぜる
•
A 液： 375 mL
•
C 液： 625 mL
•
蒸留水： 1.5 mL （1500 mL）
ここまで混ぜたところで脱気
•
D 液： 7.5 mL
•
E 液： 50 mL
D 液と E 液を加えたらすばやく混ぜてゲル板に流し込む
濃縮ゲル
（stacking gel）
• 気泡を閉じ込めないように，サンプルコウムを差し込む
• 30 分間ほど静置し，ゲルを固める
• 固まったら，サンプルコウムとシールガスケットを取り外し，
水でぬらしたキムワイプと一緒に，ラップで包んで冷蔵保存
する（数週間は保存可能）
サンプルの調製
• SDS サンプルバッファー
o 10% (w/v) グリセリン
o 5% (v/v) 2-メルカプトエタノール
o 2.3% (w/v) SDS
o 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)
• 当日は上記のサンプルバッファーの 2 倍濃縮ストック溶液を
使用します（次のスライド）
2x SDS サンプルバッファー
のつくり方
• 以下のものを混ぜて 10 mL とする
o 50% グリセリンを 4 mL
o 2-メルカプトエタノールを 1 mL
o SDS の粉を 0.46 g
o 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) を 2.5 mL
o 蒸留水を 2.5 mL
o 少量のブロモフェノールブルーの粉を溶かす

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