生物部 大浦 冬樹 吉岡 昌樹 高木 愛 若林 未来 青木 秀梨 長谷川 愛 磯部 たな プロトプラストとは… プロトプラストとはヌード細胞、つまり植物細 胞の細胞壁を酵素で溶かし原形質だけの状態に したものです。細胞壁のないプロトプラストは、 大変操作しやすく、培養・融合しやすいのでよ く使われています。 (動物) (植物) 細胞膜 酵 素 細胞壁 細 胞 壁 植物細胞には細 胞を守る厚い細 胞壁があります。 そこで、細胞壁 を酵素で分解し ます。 このはだか状態 の細胞をプロト プラスト、また は原形質体とい います。 培養 融合 優れた形質 の選択 細胞壁のないプ ロトプラストは、 大変操作しやす く、培養・融合 しやすいので実 験にもってこい ! また、保護され ていない状態に あるので、突然 変異を起こしや すい。 ※ 実際に、突然変異して、日本人好みのねばねば感 のある米ができたりする。 細胞融合の方法に は、ポリエチレン グリコールによる 化学的方法と電気 パルスによる物理 的方法とがある。 (cf) PEG = ポリエチレン・ グリコール プロトプラストを融合していろいろな ものをつくる研究もある。 例えばポマト (= ポテト + トマト) 耐寒性のトマトを作るのが目的だったが、結 果、ポテトの芽の毒入りのまずいトマトがで きてしまった。融合は何があるかわからない。 プロトプラストの説明が 終わったところで、 早速実験に突入します ! プロトプラストの単離 実験内容 1. プロトプラスト作成に適した高張液を作ろう ! ☆使用した実験器具と薬品☆ ・試験管 ・ショ糖 (0.65mol/l と 0.75mol/l と 0.85mol/l の 3 種類) ・顕微鏡 0.65mol/l と 0.75mol/l と 0.85mol/l のショ糖溶液それぞれに 植物を薄く切ったものを入れて、 10 分ほどおいてから顕 微鏡で原形質分離をしている濃度を調べた。 ＜実験結果＞ にんじん細胞の高張液は 0.80mol/l で、ピーマン細胞と赤パ プリカ細胞とカボチャ細胞の高張液は 0.75mol/l だった。 原形質分離し ているよ☆ このように原形質分離 をしていれば、質のよ いプロトプラストがで きる。 2. 最適な酵素液を作ろう ! ☆使用した薬品☆ • D-マンニトール にんじん : ピーマン : 赤パプリカ : カボチャ : • セルラーゼ 0.80g • ペクチナーゼ 0.20g 14.574g 13.663g 13.663g 13.663g (0.80mol/l) (0.75mol/l) (0.75mol/l) (0.75mol/l) •0.1mol/l の塩酸と 0.1mol/l の水酸化ナトリウム (pH 調整のため) ☆使用した実験器具☆ • 薬包紙 • 薬さじ • 電子天秤 • ピペット • 遠心分離器 • 沈殿管 •メスフラスコ D-マンニトールとセルラーゼとペクチ ナーゼをそれぞれ電子天秤で量り、メ スフラスコに入れる。そして蒸留水を 入れて全体の体積を 100ml にしてよく かき混ぜて出来上がり ! D-マンニトール ペクチナーゼ とセルラーゼ メスフラスコ ①にんじん・ピーマン・赤パプリカ・カボ チャを細かく切り、 2g ずつに分ける。 ②ツンベルク管に 2g ずつに分けた野菜をいれ、酵 素液を 10ml ずつ入れる。 ③アスピレーターにかけて、酵素液を細胞 間に染み込ませる。 ツンベルク管内の空気がなくなったら栓をして、 24 時間放置する。 ④ツンベルク管の下部にたまった溶液をピペットで取り 出して沈殿管に入れて遠心分離器に5分間かける。 4.プロトプラストを見よう ! ☆使用した実験器具☆ • ピペット • ホールスライドガラス • カバーガラス • 顕微鏡 ①遠心分離機にかけた溶液の下部のほうの溶液 をピペットでホールスライドガラスに取り出し てカバーガラスをかぶせてプレパラートを作る。 ②顕微鏡で観察する。 赤パプリカのプロトプラスト☆ 黄パプリカのプロトプラスト☆ にんじんのプロトプラスト☆ ここで、プロトプラスト であることを実証するた めに蒸留水を流し入れま した。破裂の様子をご覧 ください☆ 試薬 器具 PEG溶液 40% ポリエチレングリコール4000 顕微鏡 一つ目穴スライドガラス 柄つき針 スポイト 実験方法 ①一つ目穴スライドガラスにプロトプラストをスポイトで取りおく。 ②その周辺に PEG 溶液をおき、柄つき針でかき混ぜる。 しばらくすると、細胞融合がはじまる。 同種での細胞融合 人参同士の融合は、 ビデオのほうで！ 異種での細胞融合 こちらもビデオで ご覧ください ☆同種でのプロトプラストのほうが融合しやすかった。 ☆PEG溶液の濃度によって、変化がおきるのか調べて みたい。 薄層クロマトグラフィー 実験内容 1. 実験に使った野菜の色素を調べよう ! ☆使用した実験器具と薬品☆ ・器具 乳鉢、ガラス毛細管、試験管 (大・少) 、管ビン、 コルク栓、駒込ピペット、試験管たて、ものさ し、はさみ ・薬品 抽出溶媒 (メタノール, エチルエーテル) 、展開溶媒 (石油エーテル:アセトン = 6:4) 、 10% 食塩水 ・試料 赤パプリカ、ピーマン、レッドオニオン 実験方法 I. 色素の抽出 ① 試料を細かく切り、すりつぶす →メタノール (2ml) を加え、抽出 した液を試験管に入れる ② 10% 食塩水を少しずつ加えていき、液が二層に 分かれたらやめる ③ 駒込ピペットを用いて上層を別の試験管に入れる ④ 10% 食塩水を加え二層に分ける ⑤ ③と同様に駒込ピペットを用い て管ビンに入れる II. 薄層クロマトグラフィーによる色素の分離 ① プラスチックシートの一端から 2cm のところへ 鉛筆で原線を書く。 ② その線上にガラス毛細管でスポットを作る。 乾いた後、数回繰り返す。 ③ スポットをつけたシートを展開溶媒の入った試験管内 にピンセットを使って、静かに入れる。 ④ コルク栓をはめる。 ⑤ 展開溶媒が 7cm 程度上昇したところで試験管から取り出す。 ⑥ 溶媒の上昇したところと各色素の輪郭を鉛筆で描く。 実験結果 １分後 ２分後 ３分後 ４分後 ５分後 ６分後 ７分後 ８分後 ９分後 ピーマンの実験結果 考察 ピーマンには６つの色素が確認できたが、赤パプリ カでは１色の色素しか確認できなかった。またレッ ドオニオンでは色素を抽出することはできなかった。 →これは抽出溶媒が有機溶媒だったので水性の色素 が溶け出さなかったためと考えられる。（レッドオ ニオンの色素はアントシアンか？） Special Thanks マチャ (山本先生) 酵素液の作製に関して 化学的見地からアドバ イスを頂きました Special Thanks 山藤・佐々木先輩 全実験にわたり協力し ていただきました。 Special Thanks もりもっちゃん & 川腰先生 編集作業のアドバイス Special Thanks パンプキン&ニンジン ・・・
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