担当課題名 γ-アミノ酪酸 (GABA) 生合成制御遺伝子解析と 高含有トマト栽培技術開発 担当機関：筑波大学 大学院生命環境科学研究科 研究代表者：江面 浩（教授・遺伝子実験センター） 研究分担者：福田 直也（講師・農林技術センター） 松倉 千昭（講師） 研究終了時の達成目標 1. コンソーシアムが保有する既存の遺伝資源からアミ ノ酸、GABA高含有系統を選抜し、日本デルモンテ （株）及び千葉県農業総合研究センターに母本提供 を行う. 2. 栽培法、収穫後の果実貯蔵法を検討し、GABAを 高生産するトマトの栽培・貯蔵技術を開発する. 3. GABA高含有系統ならびに新規栽培・貯蔵技術を 適用して育成した果実を用いて、 アミノ酸、GABA 生合成の制御機構を解明する. 研究期間前半の達成目標 1. 既存遺伝資源からアミノ酸、GABA高含有系統を 選抜し日本デルモンテ（株）へ提供する. 2. GABA高生産栽培・貯蔵技術の予備試験を行い、 有効性を検証する. 3. TILLING法による変異体選抜の手法を最適化する と共に、GABA代謝関連遺伝子アミノ基転移酵素 遺伝子のクローニングと機能欠損変異体の選抜に 着手する. 年度別研究計画 研究内容（担当者氏名） ①アミノ酸・GABA高含有系 統の選抜 江面 浩 松倉千昭 福田直也 17年度 18年度 19年度 20年度 21年度 アミノ酸, GABA高含 アミノ酸,G A B A 高含 有 系 統 の 選 抜 (20品 有系統の選抜(40品 種) 種） ②アミノ酸、GABAを高蓄積 させる栽培・貯蔵技術開発 福田直也 松倉千昭 ・ 果 実 発 達 ス テ ー ・GABA高含有系統 ・（特許性有と判 ・特許出願 ジ に よ る 蓄 積 量 変 を用いて嫌気処理 断した場合）GABA 動の測定（栽培） の効果を検証（貯 高含有系統を用い ・ 嫌 気 処 理 の 有 効 蔵） て塩ストレス処 性を検証（貯蔵） ・特許性の有無を 理、嫌気処理を組 判断（貯蔵） み合わせた新しい 高蓄積技術の開発 ③アミノ酸、GABA生合成制 御機構の解明 江面 浩 松倉千昭 ②の栽培・貯蔵条 アレイ解析による ア ミ ノ 酸 , GABA 生 件で生産した果実 アミノ酸, GABA生 合 成 関 連 未 同 定 因 のアミノ酸, GABA 合成関連未同定因 子の機能解析 生合成関連遺伝子 子の単離 発現解析 ④ TILLING法によるGABA代 謝関連遺伝子変異系統の探 索 TILLING 法 に よ る 変 ESTクローンの取得 TILLING 法 に よ る TILLING 法 に よ る 江面浩 異体選抜の最適化と と 遺 伝 子 の ク ロ ー スクリーニング 共同研究機関への情 ニング 報提供 スクリーニング 今年度の研究実施計画 1. アミノ酸・GABA高含有系統の選抜 ・当該コンソーシアムが保有する遺伝資源（栽培品種、 野生種計60系統）より20品種を供試し高アミノ酸・ GABA含有系統を選抜する． 2.アミノ酸・GABAを高蓄積させる果実貯蔵技術の開発 ・貯蔵条件の検討： 嫌気貯蔵、温度の検討（予備試験）． 3. TILLING法によるGABA代謝関連遺伝子変異系統の 探索 ・ TILLING法による変異体選抜の条件最適化を行う. 1. アミノ酸・GABA高含有系統の選抜 日本デルモンテ㈱、千葉県農総研へ提供 コンソーシアムが保有する 遺伝資源からのアミノ酸・ GABA高含有系統の選抜. GABA高蓄積品種の育成 DNAマーカー開発 野生種 11系統 栽培種への戻し交配系統 6 系統 栽培種（加工用） 32品種 栽培種（生食用） 10品種 合計59系統 各系統10個体を圃場へ展開し、緑熟期、赤熟期果実をサンプリング． GABA, アミノ酸含量を測定． 今年度進捗状況 (1) ２０系統を春夏作で栽培 加工用トマト ‥‥ 6系統 NDM051TH, 958, 1185, 2260, AB2, シャスタ 生食用トマト ‥‥ 14系統 播種：5月7, 17日 移植：6月29日移植 開花：7月中旬～8月中旬 サンプリング：9月上旬～ 10月下旬 NDM79, L03-291, -103, L04-498, 362, B03-9, フルーツイエロー, トインクル, ビタミンエース, リトルサマーキッス, 耐病豊金, 福寿トマト (トーホク), おおみや163 (ダイヤ交配), ハウス桃太 (タキイ), 愛知ファースト サンプリング ： 各品種３個体×２反復 各個体の第２花房から赤熟果を１果 計120サンプル採取． 310 3 フ ル B0 ー ツ 3-9 イ エ ロ トイ ー ビ ン リ タミ クル トル ン サ エー マ ス 豊 ーキ 金 福 ッス 寿 ト お お マト み 愛 や 知 1 フ 63 ァ ー ス ト グルタミン酸含量[m g/g-FW ] N加工用品種 D M 051TM 36 2 G A B A 含量[m g/g-FW ] ハウス桃太郎 L0 シ 2 ャ ス ND タ M1 1 N D 85 M2 26 0 ND M7 9 L0 329 L0 1 449 8 AB ウ ス 桃 ND 太 M0 郎 51 T ND M M9 58 ハ GABA・グルタミン酸含有量の品種間比較 生食用品種 L03-291 7 6 5 4 3 2 1 0 2.5 2 1.5 1 0.5 0 (2) 56系統を夏秋作で栽培 野生トマト ： 14系統 (内6系統は発芽/着果せず） 加工用トマト ： 32系統 生食用トマト : 10系統 現在測定中 播種：7月27日 移植：8月30日移植 開花：9月下旬～10月上旬 サンプリング：11月中旬～下旬 サンプリング （1）各品種３個体×２反復 各個体の第1もしくは２花房から緑熟果を1果ずつ 計300サンプルを採取． （2）赤熟まで至ったものについても適宜サンプリング． 2. アミノ酸・GABAを高蓄積させる栽培・果実 貯蔵技術の開発 アミノ酸・GABA 高蓄積栽培・貯蔵技術 の開発 栽培条件の検討 貯蔵条件の検討 養液土耕を利用 嫌気貯蔵、温度 した根圏環境の 制御（塩類ストレス、 水ストレス、施肥） アミノ酸・GABA生合成制御の解明 ・マクロアレイによる網羅的発現解析 ・グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）, GABAアミノ基転移酵素 (GABA-T)， グルタミン合成酵素（ＧＳ）， グルタミン酸合成酵素（ＧＯＧＡＴ）， の発現制御解析 特許申請を視野に入れた技術開発 GABA含量 在来品種 40～60mg/100gFW アミノ酸・GABA高含有系統の選抜 100～120 mg/100gFW 塩類ストレス栽培技術の開発 新規貯蔵技術の開発 200～250 mg/100gFW GABA高含有トマトの生産 遺伝資源と技術開発を組み合わせて特許申請を目指す 次年度の研究計画 1. アミノ酸・GABA高含有系統の選抜（継続） ・当該コンソーシアムが保有する遺伝資源（栽培品種、 野生種計59系統）より高アミノ酸・ GABA含有系統を選抜する． 2. アミノ酸・GABAを高蓄積させる栽培・果実貯蔵技術の 開発 ・養液土耕システムによるＧＡＢＡ蓄積への効果を検証する． ・ ＧＡＢＡを高蓄積させる収穫後処理条件を検討する． → 処理法、温度、時間、収穫ステージ等． 3. TILLING法によるGABA代謝関連遺伝子変異系統の 探索 ・標的遺伝子の単離と塩基配列の決定を行う． ・ GABA代謝関連遺伝子突然変異体の選抜に着手する． サンプリング 1.赤道面を約1ｃｍ厚で 輪切りにする 2.ゼリーおよび種子を除く 3. 隔壁を含むようにして ２～３ｇ採取 4. 細片にして液体窒素で 凍結後-80℃保存 抽出方法 MeOH CHCl3 250μl 250μl ５０mg 内部標準溶液 25μl ミリＱ水 175μl Vortex Vortex 上 清 ミリＱ水 30μl スピードバック LC-MSによる分析 遠心 遠心
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