平成２７年度ベンチャー・ビジネス研究活動報告書 研究開発課題代表者 （所属・職名・氏名） 研究開発課題名 （研究開発期間） マテリアルサイエンス研究科・教授・藤本健造 酵素を用いない高感度遺伝子検出ツールの開発 （平成２７年度～２９年度） １． 研究開発課題の概要 藤本研究室で開発された光反応性核酸技術とDNAチップ技術の融合により、酵素を用いること なく、極微量しか存在しない疾患マーカーを検出可能な遺伝子検出ツールを開発する。酵素試薬 を用いない技術であることから検査コストの低減、また、煩雑な前処理操作を必要としないこと からプロトコル簡略化による迅速な検出・システム化、さらに、人的エラーの低減による信頼性 の向上が期待できる。通常酵素を用いて行われる標的遺伝子の蛍光標識を、光反応性核酸を用い て行う技術の改良、および、標的遺伝子のDNAチップへの結合の光反応による高効率化技術を確 立することで、目的の遺伝子検出ツールを開発し、基礎技術の確立後、医療現場のニーズにあわ せた、高感度乳がんマーカー検出ツールやマイクロRNA検出ツールの開発を目指す。低コスト化 、迅速化、信頼性向上により、遺伝子診断システムの臨床応用を促進し、増大する医療費の低減 、高齢者のQOLの向上に貢献する。平成27年度は「検体遺伝子の光反応による蛍光標識化技術 のブラッシュアップ」を、平成28年度は「DNAチップ検出の光反応による高効率化」を主に実 施する。平成28年度の後半以降、 「製品化を意識した有効性の評価」および「標的疾患マーカー の絞り込み」を行い、事業化に繋げる。 ２． 研究成果（途中年度の場合は進捗状況） ２-１ 光反応性核酸の光反応性の基礎検討 本プロジェクトでは超高速核酸光架橋反応を巧みに用いることで、酵素を用いない、高感度・ 高効率な核酸検出ツールを開発することを目的としている。再現性が高く、安定的な核酸検出技 術を確立するため、基礎反応となる超高速核酸光架橋反応の詳細、つまり「光架橋反応の反応速 度を左右するファクターは何 であるか？」を科学的に理解 しておくことは極めて重要で ある。そこで平成２７年度は 、超高速核酸光クロスリンカ ーである３-シアノビニルカル バゾールヌクレオシド（ CNV K ）の標的塩基であるウラシル 図１ (A) 評価に用いたDNAの塩基配列と光反応スキーム（B）CNVKと5置換2' デオキシシウリジンの化学構造（C）評価したウラシル５位の官能基 誘導体の５位の置換基が、光反 応性に及ぼす効果について検 討した。 図１aの「X」の位置に各５置 換ウラシルを含むオリゴDNA に対して、相補的なCNVKを含む 光反応性核酸を添加し、光架橋 反応性を評価した。結果（図２ ）、ウラシル５位の置換基によ って最大で２倍の反応性の差 が見られ、光反応性が５位の置 換基に大きく依存することが 明らかとなった。密度汎関数法 （DFT、B3LYP/6-311++G(d,p) ）により求めた各５置換ウラシ 図２ 各５置換ウラシルとCNVKのDNA２本鎖中での光架橋反応 ルの最低非占有分子軌道（LU MO）のエネルギー準位と、光 反応速度を比較した結果、これ ら２つの値に良い相関が見ら れた（図３b）ことから、光架 橋反応の標的ピリミジン塩基 のLUMOが、光反応速度に大き く影響することが明らかとな った。一方で、各２重鎖DNA の２重鎖融解温度（Tm）と光 架橋反応速度には有意な相関 が見られなかったことから、光 架橋反応に２重鎖DNAの熱力 学的安定性は寄与しないこと が明らかとなった。 図３ ５置換ウラシルの光反応性とLUMOとの相関 ここで得られた基礎的な知 見は標的核酸の光照射による蛍光ラベリングおよび、標的のDNAチップへの固定時における光反 応性人工核酸の設計における基礎的な情報として有用である。 ２-２ 研究成果の発表・知財および共同研究 上記の研究成果を含め、平成２７年度の成果として３報の学術論文を報告した。また、１８件 の国内学会発表、４件の国際学会発表、PEGS Europe 2015や BioTech 2015 （2015.5.13-15 「光を用いた核酸類操作法の開発」）における展示ならびに発表を行い、学術会ならびに事業化 を視野に入れた産業界へのアピールに務めた。また、平成２７年１１月より「日華化学株式会社 」との共同研究を開始し、事業化・製品化に向けた技術の具体化に取組んでいる。 （作成に当たっての注意） ・ 研究開発課題の概要及び研究成果については、産学官連携総合推進センターのホームページに掲載予定のため公 表可能な範囲で記入すること。 ・ ２ページ以上４ページ以下（図表、写真等を含む）にまとめること。 ・ 特許の出願番号、発明の名称等、実用化・製品化されたものがある場合は、その名称を挙げること。 ・ 起業化まで進んだ場合は、その旨記載すること。
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