23. Arbeitstagung Mikromethoden in der Proteinchemie

23. Arbeitstagung
Mikromethoden
in der Proteinchemie
28. Juni - 30. Juni 2016
Zeche Zollern
Dortmund
www.arbeitstagung.de
Liebe Kolleginnen, liebe Kollegen,
Die Fortschritte in der Proteinanalytik werden seit einigen Jahren geprägt von der
Massenspektrometrie. In beeindruckender Weise haben technische Verbesserungen
den wissenschaftlichen Fortschritt mitbestimmt. Eine maximale Leistungsfähigkeit
in Proteomics wurde mit den beiden Rohfassungen des humanen Proteoms gezeigt.
Den 20.300 gen-codierten Proteinen wurden ca. 18.000 MS-Zuordnungen
gegenübergestellt. Die nachfolgende Diskussion der Resultate war ernüchternd, da
aufgrund verschiedener Aspekte eine signifikante Zahl an falsch-positiven
Proteinen enthalten ist. Hinter der aufmerksamkeitsheischenden Benennung des
humanen Proteoms steckt sehr wohl eine tolle Leistung. Die äußerst schwierige
Bestimmung von Proteinen im großen Maßstab stößt mehrfach auf Grenzen: seien
es die biologischen Rahmenbedingungen - wie groß ist das humane Proteom?, oder
die bioinformatische Auswertung – in welchen Grenzen ist die Interpretation
immenser Datenmengen korrekt? Abundanz, Proteoformen, posttranslationale
Modifikationen – es gibt viele Gründe, welche die Arbeit mit Proteinen spannend
und schwierig machen. Betrachtet man demgegenüber eine Einzelanalyse wie z.B.
bei den Biotherapeutika, sieht man, dass mit den gleichen analytischen und
biochemischen Werkzeugen gänzlich andere Ziele bearbeitet werden müssen. Die
Analyse eines Antikörpers oder ADCs ist höchst aufwendig trotz definierter
Herstellung und hocheffizienter Reinigung. Bereits dieses einzelne Molekül wird
aufgrund von Oxidation und anderen Einflüssen in vielen Varianten vorliegen.
Protein- und Proteom-Analysen haben die Gemeinsamkeit, dass nur über Qualität
aussagekräftige Resultate erzielt werden können.
Die Arbeitstagung möchte auch dieses Jahr wieder einen Beitrag zum qualitativen
Standard der Protein-Analytik leisten. Das Programm bietet den Teilnehmern
vielerlei Hintergründe zu den Methoden und Techniken; Sie bekommen
instrumentelle Details von den Herstellern und auch Erfahrungsberichte von
Anwendern angeboten. Interessante Sprecher werden für weiterführende
Diskussionen bereit stehen. Und für ein angenehmes Ambiente auf der Zeche
Zollern während der Tagung ist vom Organisationsteam gesorgt.
Wir freuen uns darauf, Sie in Dortmund zur 23. Arbeitstagung begrüßen zu
dürfen,
Roland Kellner, Merck, Darmstadt
Friedrich Lottspeich, Stockdorf
Helmut E. Meyer, ISAS Dortmund
Albert Sickmann, ISAS Dortmund
Dienstag, 28. Juni 2016
ab 10.00 h
Registrierung
10.30 h
Begrüßung
F. Lottspeich
Eröffnungsvortrag
10.45-11.45 h
Das Mikrobiom des Menschen
J. Bandow
11.45-12.15 h
BioInfra.Prot – „Service-Center Bioinformatics for
Proteomics”
M. Eisenacher
12.15-12.30 h
Pause
12.30-14.00 h
Vendor Seminar
I&L Biosystem, AU Sponsor, Seminarraum 1
14.00-14.15 h
Pause
Methodische Grundlagen
14.15-15.00 h
Probenvorbereitung
S. Lehr
15.00-15.45 h
Chromatographie
15.45-16.15 h
Kaffeepause
16.15-16.45 h
Elektrophorese
16.45-17.15 h
Massenspektrometrie
B. Warscheid
17.15-17.45 h
Elektrochemische Detektion
J.-P. Chervet
Ab 18.00 h
Doktors Office
R. Bischoff
R. Westermeier
R. Westermeier
ab 19.30 h Speakers Dinner im Pferdestall
Mittwoch, 29. Juni 2016
Imaging
09.00-09.45 h
Massenspektrometrisches Imaging
B. Spengler
09.45-10.30 h
Massenspektrometrisches Imaging in der Klinik
10.30-11.00 h
Pause
11.00-11.45 h
Moderne lichtmikroskopische Methoden
11.45-12.15 h
Kryo-Elektronen-Mikroskopie/ Tomographie
12.15-12.30 h
Pause
12.30-14.00 h
Parallele Vendor Seminare
Waters, AU Sponsor, Seminarraum 1
Bruker, AU Sponsor, großer Saal
14.00-14.15 h
Pause
A. Walch
M. Spitaler
J. Plitzko
Contest I
14.15-15.00 h
MS-Imaging
P. Khamehgir-Silz/
B. Beine
Nachwuchspreis zur Proteinanalytik
15.00 h
Eröffnung
F. Lottspeich/
K. Stühler
15.10-15.20 h
Ein radikal anderer Cross-linker - im positiv
negativen Sinne – für die strukturelle Proteomik
15.20-15.30 h
„Charakterisierung Makromolekularer Komplexe
mit Größenausschlusschromatographie und
SWATH-basierter Massenspektrometrie
C. Hage
M. Heusel
15.30-15.40 h
qPerS-SID: Eine massenspektrometrische
Methode zum quantitativen Nachweis von
Cystein-Persulfiden
15.40-15.50 h
Interaktionsstudien von FNT-Kanälen mittels
massenspektrometrischer Methoden
15.50-16.00 h
Charakterisierung der Expression von klinisch
J. Mueller
bedeutsamen Transportern in humanem Darmgewebe
mittels targeted und shotgun proteomics
16.00-16.10 h
Massenspektrometrie-basierte
quantitative Phosphoproteomik in der
pharmakologischen Arzneimittelforschung
16.10-16.20 h
Proteomanalyse der symbiotischen
Stickstofffixierung in Pflanzenwurzeln
16.20-16.30 h
Molekulare Effekte moderner Strahlentherapie
auf Proteom und Phosphoproteom
16.30-16.40 h
Determination of Gas Phase Free Energies of Y. Yefremova
Protein-Protein Interactions by Ion Mobility Mass
Spectrometry
17.15-18.15 h
S. Longen
B. L. R. Ruprecht
Zeche Zollern LIVE
Parallelveranstaltung
17.15-18.15 h
18.30 h
ab 18.45 h
Mitgliederversammlung der DGPF
Verleihung der Nachwuchspreise
FEST
J. Lorenz
B.Thal
M. Winter
Donnerstag, 30. Juni 2016
Biotherapeutika
09.00-09.45 h
Therapeutische Proteine
S. Jaekel
09.45-10.30 h
Charakterisierung von Biosimilars
10.30-11.00 h
Pause
11.00-11.45 h
Therapeutische Antikörper - Methoden zur Ermittlung von
Qualitätsattributen (CQA)
D. Reusch
11.45-12.15 h
Massenspektrometrische Methoden für die Analyse von
Glykanen und Glykopeptiden
M. Wuhrer
12.15-12.30 h
Pause
12.30-14.00 h
Vendor Seminar
Thermo, AU Sponsor, großer Saal
14.00-14.15 h
Pause
U. Lewandrowski
Contest II
14.15-15.00 h
De-Novo Sequenzierung
unbekannter Peptide
B. Blank-Landeshammer/
I. Feldmann
Abschlussvortrag
15.00-16.00 h
Top-Down Proteomics
Ende
N. Kelleher
Conteste 2016
1. Maldi Imaging von Lipiden und Peptiden
Die
bildgebende
MALDI-Massenspektrometrie
(MALDI
Imaging)
liefert
Informationen über die räumliche Verteilung von Molekülen in einem biologischen
Gewebe. Mithilfe der Phospholipid- und Proteinzusammensetzung lassen sich
unterschiedliche Gewebetypen und Gewebebereiche detailliert charakterisieren,
ohne dass zuvor einzelne Zielmoleküle chemisch markiert oder Gewebestrukturen
histologisch angefärbt werden müssen. Änderungen in der Phospholipid- und
Proteinzusammensetzung reflektieren dabei häufig Änderungen des metabolischen
Zustandes des Gewebes und beschreiben damit zum Beispiel die Eigenschaften und
räumlichen Verteilungen von Tumoren und Metastasen. Auf der Proteinebene
lassen sich räumliche Informationen und eine valide Identifizierung insbesondere
über einen lokalisierten enzymatischen Verdau und anschließende bildgebende
MALDI-Massenspektrometrie erreichen. Die Aussagekraft der bildgebenden
Massenspektrometrie hängt insbesondere von der räumlichen, aber auch der
massenspektrometrischen Auflösung und Genauigkeit des verwendeten Systems
ab.
Der Contest hat zum Ziel, die räumlichen Verteilungen von Phospholipiden und
Proteinen in Maushirn-Gewebeschnitten zu charakterisieren. Nähere Informationen
werden mit den Proben zur Verfügung gestellt. Die Resultate sind bis Ende Mai
2016 einzureichen.
2. De-Novo Sequenzierung unbekannter Peptide
Die Massenspektrometrie stellt ein leistungsstarkes Instrument zur Untersuchung
von Proteinen dar. In der „bottom-up“ Proteomik werden in einem ersten Schritt
durch einen enzymatischen Verdau aus Proteinen Peptide generiert. Durch die
Fragmentierung der Analyten im Massenspektrometer ergibt sich daraus ein
spezifisches Ionenchromatogramm. Diese Technik macht sich die Proteomik zu
Eigen, um Informationen aus komplexen Proteinproben zu gewinnen. Aus der
Kombination von Vorläufer- und Fragmentionenmassen lassen sich – in der Regel
durch eine Datenbanksuche – Peptide identifizieren und den entsprechenden
Proteinen zuordnen. Stammt die Probe jedoch von einem unbekannten oder nicht
annotierten
Organismus,
stehen
häufig
unzureichende
oder
keinerlei
Datenbankinformationen zur Verfügung. An diesem Punkt können die Peptide
nicht auf dem konventionellen Weg identifiziert werden. Eine der wenigen
Möglichkeiten dennoch die Sequenz zu ermitteln, stellt die manuelle oder
algorithmenbasierte De-Novo Peptid-Sequenzierung dar.
Der Contest hat zum Ziel, aus einer unbekannten Probe für 30 synthetische
Peptide die exakten Sequenzen zu bestimmen. Nähere Informationen werden mit
den Proben zur Verfügung gestellt.
Die Resultate sind bis Ende Mai 2016 einzureichen.
Dienstag, 28. Juni 2016
Seminarraum 1
12:30 – 14:00 h
Reproducible protein sample preparation from small amount of clinical specimens for
proteomic studies
Tiannan Guo 1, Ruedi Aebersold 1,2
1. Department of Biology, Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich,
Switzerland
2. Faculty of Science, University of Zurich, Zurich, Switzerland
Reproducible and efficient extraction of proteins from small amount of clinical specimens is
the first step for protein-based measurements in clinical studies. In this talk, we will discuss
recent progresses in developing various versions of pressure cycling technologies (PCT) for
reproducible protein extraction prior to their mass spectrometric analyses. Protein extraction
is followed by proteolytic digestion and the analysis of the resulting peptide samples by the
highly reproducible technique SWATH-MS. The PCT-SWATH technology is broadly
applicable to different types of clinical samples. The tissue types we have processed
included cancer cells, biopsy-level fresh frozen tissues, formalin-fixed, paraffin-embedded
(PPFE) tissues, and various types of blood samples. We will also demonstrate the
quantitative performance of the method on the thousands of proteins measured from each
sample.
Molekulare Einblicke in den Multikomponentenkomplex der Nisin Biosynthese.
Jens Reiners,
Institut für Biochemie, Heinrich Heine Universität, Universitätsstraße1, 40225 Düsseldorf
Stöchiometrie und in-vitro Assemblierung von Multikomponentenkomplexen stellt eine
Herausforderung für die Analytik dar. Mithilfe einer Kombination von multi-angle light
scattering und Gelfiltration (MALS-SEC) können diskrete Molekülkomplexe analysiert
werden. Hierbei wird der hydrodynamische Radius bestimmt, wodurch das
Molekulargewicht und somit der oligomere Zustand der Proteine ermittelt werden kann. Für
ein besseres Verständnis der Interaktion ist die Strukturaufklärung des Komplexes aber sehr
wichtig. Jedoch sind Multikomponentenkomplexe meist sehr labil und kristallisieren nur
schlecht. In vielen Fällen konnten jedoch die Strukturen der Einzelkomponenten gelöst
werden. Mithilfe von zusätzlichen Strukturinformationen aus small-angle X-Ray scattering
(SAXS) Experimenten können diese zu einem in-silico Komplex zusammen gesetzt
werden.In diesem Vortrag werden diese Techniken am Beispiel der Biosynthese des
Lantibiotikums Nisin verdeutlicht. Nisin ist ein von Lactococcus lactis sekretiertes Peptid,
welches insbesondere gegen Gram-positive Bakterien wirkt. Besonderheiten von Nisin sind
spezielle dehydratisierte Aminosäuren sowie (Methyl)-Lanthioninringe die namensgebend
für diese Art von Peptiden sind. Ebenso sind die (Methyl)-Lanthioninringe verantwortlich
für die antimikrobielle Aktivität von Nisin. Diese Modifikationen werden von speziellen
Enzymen in einem Multikomponentenkomplex katalysiert
Mittwoch, 29. Juni 2016
Seminarraum 1
12.30 - 14.00 h
Ion Mobility Supported Acquisition Techniques
Dr. Marc Kipping
Waters GmbH Eschborn
Advances in Targeted Omics Quantitation Using a Novel Scanning Quadrupole DIA Method
Dr. Hans Vissers
Waters Manchester UK
Mittwoch 29. Juni 2016
grosser Saal
12:30 – 14:00 h
Are you interested in innovation?
Annette Michalski, Arndt Asperger
Join us for a lunch session to discuss the novel workflows and the latest advances in mass
spectrometry instrumentation. We will share insights into Bruker’s MALDI imaging
applications and QTOF technology for quantitative proteomics.
Welcome!
Donnerstag, 30. Juni 2016
grosser Saal
12.00 - 13.30 h
Second Generation Parallel Reaction Monitoring For Targeted Proteomics
Dr. Sebastien Gallien
Thermo Fisher Scientific
Targeted analyses using parallel reaction monitoring (PRM), performed on high resolution
and accurate-mass (HRAM) quadrupole-orbitrap mass spectrometers, present the selectivity
and sensitivity to confidently quantify peptides in complex samples. The internal standards
(IS) used for isotope dilution quantification were recently leveraged to actually drive the
acquisition (“internal standard triggered-PRM”, IS-PRM), thus increasing the scale of
screening experiments while ensuring high data quality. The use of the IS-PRM technique
has been further investigated in additional contexts, including post-translational
modifications, accurate quantification experiments, and fast liquid chromatographic
separations.
OMICS Applikationen und neues von der ASMS 2016
Dr. Patrick Pankert
Thermo Fisher Scientific
Reagenzien für die Massenspektrometrie
Dr. Geraldine Kolter
Thermo Fisher Scientific
Nachwuchspreis
Ausschreibung
Die 23. Arbeitstagung „Mikromethoden in der Proteinchemie“ lädt alle
Diplomanden, Doktoranden und Post-Docs (max. Alter: 33 Jahre) ein,
sich für den Nachwuchspreis zu bewerben. Unter den eingesendeten
Beiträgen werden acht Arbeiten ausgewählt, welche zur Präsentation im
Rahmen der Arbeitstagung nach Dortmund eingeladen werden.
Die beste Arbeit wird mit einem Iphone 6S prämiert.
Beiträge einreichen
Eine deutsch-sprachige Beschreibung der methodischen Protein-Arbeit
soll auf maximal einer DIN A4 Seite zusammengefasst werden (sowie
der CV auf einer Seite) und bei den Organisatoren unter folgender
Adresse eingereicht werden:
Dr. Friedrich Lottspeich
Peter-Dörfler-Str. 4
82131 Stockdorf
Tel: + 49 (0) 1727285698
Email: [email protected]
Einsendeschluss ist der 1. Juni 2016
Christoph Hage1, Mathias Schäfer2, and Andrea Sinz1, 1 Institut für Pharmazie, Universität Halle-Wittenberg,
2
Institut für organische Chemie, Abteilung Massenspektrometrie, Universität zu Köln
Ein radikal anderer Cross-linker - im positiv negativen Sinne – für die strukturelle Proteomik
Die Kombination von „Cross-linking”- und “Labeling”- Experimenten mit Massenspektrometrie (MS) hat
sich in den letzten Jahren zu einer bedeutenden Methode der strukturellen Proteomik entwickelt. So
können Einblicke in die Topologie von Proteinen und Proteinkomplexen sowie deren Interaktionen erhalten
werden. Unter Cross-linking versteht man in diesem Zusammenhang die kovalente Quervernetzung von
Aminosäuren, kombiniert mit anschließender Proteolyse und einer massenspektrometrischen Analyse.
Meist werden Lysingruppen quervernetzt, aber auch Thiol- oder Carboxylgruppen können zur Reaktion
gebracht werden. Photoreaktive Diazirine und Benzophenone können zudem unspezifische
Vernetzungsreaktionen eingehen und liefern einen Zugang zu hydrophoben Aminosäuren und Liganden.
Durch Einführung weiterer Attribute in den Cross-linker, wie z.B. Affinitätstags, oder
Isotopenmarkierungen können den Reaktionsprodukten zusätzliche Eigenschaften aufgeprägt werden. Ist
das Reagenz zudem noch MS-spaltbar wird die Identifizierung vernetzter Peptide aus den komplexen
Reaktionsmischungen maßgeblich erleichtert. Der von uns synthetisierte, bifunktionelle, aminreaktive
Cross-linker TEMPO-Bz, enthält sowohl eine TEMPO (2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-oxy), als auch eine
Benzylgruppe (Bz). Dieses neuartige Reagenz weist eine spaltbare NOC-Bindung auf, so dass Dubletts in
MS/MS- Spektren für die zuvor vernetzten Peptide erhalten werden. Somit wird die automatisierte
Zuordnung vor Cross-linking- Produkten enorm erleichtert. Bei der Spaltung können jedoch zwei
unterschiede Verläufe in (+)-ESI- Experimenten auftreten, die in (-)-ESI- Experimenten nicht zu erwarten
sind. Wir konnten zeigen, dass in (-)-ESI-MS- Experimenten nur die radikalische Spaltung des
Cross-linkers beobachtet wird und so eine Kombination von nicht-radikalischer und radikalischer
Fragmentierung der Peptidketten erhalten wird.1 Dies ermöglicht daher auch die Diskriminierung der
Isomere Leucin und Isoleucin. Somit können wir einen neuen, spaltbaren Crosslinker vorstellen, dessen
außergewöhnliche Eigenschaften sowohl eine automatisierte Auswertung ermöglichen, als auch zwei
komplementäre Fragmentierungen (CID- und ETD- artige) kombiniert in einem einzigen Experiment
liefert.
1Hage, Ch. et al., Dissociation Behavior of a TEMPO-Active Ester Cross-linker for Peptide Structure
Analysis by Free Radical Initiated Peptide Sequencing (FRIPS) in Negative ESI-MS, in press
Moritz Heusel, Institut für Molekulare Systembiologie, ETH Zürich, Schweiz
„Charakterisierung Makromolekularer Komplexe mit Größenausschlusschromatographie und
SWATH-basierter Massenspektrometrie“
Hintergrund
Seit der Sequenzierung des humanen Genoms konnten nur wenige Phänotypen direkt anhand der
Genomsequenz erklärt werden. Eine weitere wichtige und initial unterschätzte Dimension der Komplexität
eines Zellsystems sind die vielfältigen Interaktionsmöglichkeiten der Genprodukte (Proteine) untereinander
und mit anderen Teilen der Zelle, mit teils drastischen Auswirkungen auf das Funktionsspektrum der
beteiligten Proteine. Folglich besteht ein Hauptziel der modernen biologischen Forschung darin, das
Ausmaß und die Funktion der Komplexbildung, besonders im Hinblick auf die Funktion der beteiligten
Proteine, zu untersuchen.
Methode
Die im Rahmen meiner Doktorarbeit entwickelte Methode SEC-SWATH-MS ermöglicht es, mit
hoher Genauigkeit makromolekulare Komplexe zu charakterisieren (Siehe Abbildung 1).
Hierbei werden makromolekulare Komplexe unter milden Bedingungen aus dem Zellsystem isoliert, mit
hochauflösender Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatographie, SEC) aufgetrennt
und die in den gesammelten Fraktionen enthaltenen Proteine anhand von SWATH-MS quantifiziert.
SWATH-MS ist eine Implementierung der sogenannten „datenunabhängigen Messung“ (Data-independent
Acquisition, DIA) in der massenspektrometrie-getützten Proteomanalyse. Im Gegensatz zu herkömmlichen
LC-MS-Messmethoden werden bei DIA-MS alle Peptidionen fragmentiert und alle entstehenden
Fragmentionensignale gespeichert. Die Detektion und Quantifizierung einzelner Peptid-ionen erfolgt
jedoch erst nach der eigentlichen Messung anhand empirisch bestimmter „Peptidionen-koordinaten“ und
extraktion der entsprechenden Signale aus den hochkomplexen MS-Daten-„karten“. Anhand der
Fragmentionensignale können Peptide (und damit Proteine) besonders präzise und konsistent und mit hoher
Sensitivität über viele Proben hinweg quantifiziert werden.
Als Resultat können sehr genaue Elutionsprofile der Peptide über die Dimension der SEC-Fraktionen
rekonstruiert und Protein-Elutions-Bereiche anhand ko-eluiernder Peptide detektiert werden. Mit dem
Wissen der Elutionsbereiche von Referenzproteinen bekannter Größe ist es möglich, die Proteinmasse in
monomerem oder komplexgebundenem Zustand zu quantifizieren, analog einer „Protein-Masse-Waage“.
Rekonstruktion der Protein-Elutionsprofile und gezielte Extraktion der Signale von Komplex-untereinheiten
ermöglicht die Detektion und Quantifizierung von Proteinkomplexen. Drei Aspekte sind hierbei besonders
vielversprechend: Erstens, die Detektion von etwaigen Komplex-Varianten abweichender Grösse mit
potentiell abweichender biologischer Funktion. Zweitens, die Ableitung der Stöchiometrie innerhalb des
Komplexes anhand der MS-Signale. Zuletzt, aber nicht minder wichtig: Das Potential diese Verhältnisse
über biologischer Perturbationen des zellulären Systems hinweg zu verfolgen und etwaige Dynamik zu
erfassen.
Sebastian Longen, Institut für allgemeine Pharmakologie und Toxikologie, Uniklinik Frankfurt
qPerS-SID: Eine massenspektrometrische Methode zum quantitativen Nachweis von
Cystein-Persulfiden
Während der letzten Jahre wurden kurzlebige, anorganische Moleküle wie Stickstoffmonoxid oder
Sauerstoffradikale als endogen synthetisierte Signalmoleküle mit entscheidender physiologischer und
pathophysiologischer Rolle identifiziert. Sie reagieren mit Cysteinresten (Thiolen) von Proteinen und
modifizieren diese zu Sulfen-, Sulfin- oder Sulfonsäure bzw. zu Nitrosothiolen. Diese, auch als
thiol-basierte Redoxschalter bezeichneten, Modifikationen führen oft zu veränderter Proteinstabilität oder
-aktivität und ihnen wird mittlerweile eine ähnlich bedeutende Rolle bei zellulären Signalprozessen
zugesprochen wie der Phosphorylierung. Kürzlich wurde Schwefelwasserstoff als ein weiteres
Signalmolekül identifiziert, welches Thiole zu Persulfiden (R-S-SH) modifizieren kann und eine große
Rolle bei Entzündungen, Ischämie/Reperfusion sowie als Vasodilator spielt. Aufgrund ihrer chemischen
Eigenschaften sind Persulfide auf Proteinebene schwierig zu identifizieren. Zum einen besitzen sie eine
ähnliche Reaktivität zu elektrophilen Substanzen wie Thiole, was eine Anreicherung mittels
Iodoacetyl-Biotin nahezu unmöglich macht. Zum anderen ist eine „Biotin-Switch-Strategie“, bei der
zunächst freie Thiole geblockt werden, die gesuchte Cysteinmodifikation durch Ascorbat, DTT oder
andere Substanzen entfernt und anschließend biotinyliert wird, im Falle von Persulfiden nicht möglich.
Aufgrund Ihrer Struktur (R-S-S-H) würden sie in einem solchen Ansatz zusammen mit Disulfidbrücken
(R-S-S-R) angereichert werden.
Wir haben eine massenspektrometrische Methode entwickelt (qPerS-SID, quantitative PerSulfide Site
IDentification), mit der es möglich ist Persulfide auf Peptidebene nachzuweisen. Hierzu haben wir
zunächst sowohl Thiole als auch Persulfide mit Iodoacteyl-Biotin modifiziert und anschließend die Proteine
mit Trypsin verdaut. Hierdurch konnten wir mit Streptavidin-Agarose alle Peptide anreichern, die
entweder lediglich ein modifiziertes Thiol (R-S-Biotin) oder ein modifiziertes Persulfid (R-S-S-Biotin)
aufwiesen. Peptide mit anderen Cysteinmodifikationen wurden nicht biotinyliert und angereichert.
Aufgrund der „internen Disulfidbrücke“ von Persulfiden lassen sich diese Peptide nun selektiv von den
Agarosebeads mit Reduktanzien wie TCEP eluieren und anschließend mittels LC-MS/MS analysieren.
Durch Kopplung dieser Methode mit isotop-basierter Markierung (SILAC) konnten wird zeigen, das sich
verschiedene persulfidinduzierende Substanzen stark in ihrer Wirksamkeit unterscheiden. Bioinformatische
Analysen zeigen weiterhin, dass die Substanzen Persulfide an Proteinen aller subzellulären Kompartimente
induzieren und in viele verschiedene zellulare Prozesse eingreifen. Darüber hinaus treten negativ geladene
Aminosäuren gehäuft in räumlicher Nähe zu Cystein-Persulfiden auf. Abschließend konnten wir in einem
In-vitro-Ansatz mit Pyruvat-Kinase M2 (PKM2) unsere Proteomdaten bestätigen und zeigen, dass
Persulfide an Position C49, C152, C358 und C474 gebildet werden. Hierdurch wird die enzymatische
Aktivität der PKM2 inhibiert. Diese Arbeit befindet sich zurzeit in Revision bei der angesehenen
Zeitschrift Scientific Reports.
Jana Lorenz1, Gary Sawers2, Andrea Sinz1, 1Institut für Pharmazie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg,
2
Institut für Mikrobiolgie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg
Interaktionsstudien von FNT-Kanälen mittels massenspektrometrischer Methoden
FNT-Kanäle (Formiat-Nitrit-Transporter) sind integrale Membranproteine die monovalente Anionen wie
Chlorid, Formiat, Laktat, Hydrosulfid sowie größere, organisch geladene Säuren transportieren [1]. Das in
E.coli während der gemischten Säuregärung entstehende Formiat wird über den Formiatkanal FocA
transportiert. Kürzlich konnte auch die molekulare Identität des Laktattransportes im Malariaerreger
Plasmodium falciparum aufgeklärt werden [2]. Der aquaporinähnliche PfFNT (Plasmodium falciparum
formate-nitrite transporter) transportiert das durch Glykolyse entstandene Laktat aus dem Zytosol in die
parasitäre Vakuole. Durch strukturelle Untersuchungen mittels Röntgenkristallanalyse konnten für FocA
zahlreiche Informationen gewonnen werden. Obwohl Kristallstrukturen vorliegen, sind die Mechanismen
des Formiat- bzw. Laktattransports in FocA bzw. PfFNT unklar.
Zur Identifizierung potentieller Bindungspartner wird das mit einem Histidinaffinitätstag versehene PfFNT
mit einem Plasmodienzelllysat inkubiert. Dabei werden transiente Interaktionen mit chemischer
Quervernetzung erfasst. Als Quervernetzungsreagenz dient Bis-Sulfosuccinimidylglutarat (BS2G), ein
aminreaktiver,
homobifunktioneller
Cross-linker.
Quervernetzungsprodukte
werden
über
massenspektrometrische Analysen identifiziert (ESI-Orbitrap-MS/MS). Potentielle Bindungspartner werden
über Label-Free Quantification (LFQ) mit MaxQuant quantifiziert. Ferner werden FocA-Konstrukte
hergestellt, bei denen FocA mit unterschiedlichen Affinitätstags (His-, GST-, MBP-Tag) markiert ist.
Diese Konstrukte werden mit E.coli-Zelllysaten inkubiert. Die Identifizierung potentieller Bindungspartner
erfolgt ebenfalls mit chemischer Quervernetzung in Verbindung mit Massenspektrometrie. So werden
Einblicke in potentielle Bindungspartner von FocA und PfFNT erhalten, die zum Verständnis des Laktatund Formiattransportes beitragen können.
[1] Wang et al. (2010), Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 31-37
[2] Beitz et al. (2015), Nature communications 6:6284
Janett Müller, D. Busch, E. Hammer, U. Völker, A. Fritz und S. Oswald, Universitätsmedizin Greifswald, Abteilung
klinische Pharmakologie
Charakterisierung der Expression von klinisch bedeutsamen Transportern in humanem Darmgewebe
mittels targeted und shotgun proteomics
Die Wirksamkeit und Sicherheit der Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von den pharmakokinetischen
Prozessen der Absorption, Distribution, Metabolisierung und Exkretion (ADME) bestimmt. Neben den
bereits gut untersuchten Enzymen der Biotransformation wurden in den letzten Jahren Transportproteine
als weitere klinisch bedeutsame Determinanten der genannten Prozesse identifiziert und zum Teil
funktionell charakterisiert. Bisher liegen insbesondere für den humanen Darm aber nur wenige
Informationen über die quantitativen Verhältnisse dieser Transporter vor1. Dieses Wissen ist jedoch
notwendig, um die ablaufenden ADME-Prozesse von Arzneimitteln abschätzen oder gar vorhersagen zu
können. Zur proteomischen Analyse stehen verschiedene methodische Ansätze wie targeted oder shotgun
proteomics zur Verfügung.
Beim Ansatz der targeted proteomics werden gezielt proteospezifische Peptide erfasst, um die
entsprechenden Proteine über Kalibrationskurven absolut quantifizieren zu können. In diesem Rahmen
haben wir eine LC-MS/MS Methode2 entwickelt und nach internationalen Richtlinien validiert, die die
simultane Quantifizierung von 27 Peptiden für 20 humane Transporter ermöglicht. Als interne Standards
für jeden Analyten werden isotopenmarkierte Peptide verwendet. Die Messungen erfolgen dabei im
scheduled multiple reaction monitoring (sMRM), wobei jeweils drei Übergänge je Peptid detektiert
werden.
Im Gegensatz dazu erlaubt der shotgun proteomics-Ansatz3 eine globale Proteomanalyse, sodass sich ein
größerer Teil des Proteoms erfassen lässt. Mittlerweile sind auch Methoden zur absoluten Quantifizierung
mittels shotgun proteomics beschrieben4, aber nur wenige Studien vergleichen die Quantifizierung mittels
targeted und shotgun proteomics. Aus diesem Grund sollen im Projektverlauf humane Darmproben mit
beiden proteomischen Ansätzen vermessen und Transportproteine quantifiziert werden, sodass die
Ergebnisse beider Methoden verglichen werden können.
Zur Anreicherung der Transporter wird sowohl die gesamte Membranfraktion mittels des ProteoExtractTM
Native Membrane Protein Extraction Kits isoliert als auch eine Methode zur Plasmamembranisolation
etabliert. Ferner sollen auch Zelllinien in diese Messungen miteinbezogen werden, um deren
Transporterprofile mit denen in humanem Gewebe zu vergleichen und so ihre Eignung als in-vitro-Modell
zu bestimmen.
[1] Drozdzik M. et al.; Protein abundance of clinically relevant multidrug transporters along the entire
length of the human intestine; Molecular Pharmaceutics 2014; 11; 3547-3555[2] Gröer C. et al.;
LC-MS/MS-based quantification of clinically relevant intestinal uptake and efflux transporter proteins;
Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis 2013; 85; 253-261[3] Wiśniewski R. J. et al.; Absolute
proteome analysis of colorectal mucosa, adenoma, and cancer reveals drastic changes in fatty acid
metabolism and plasma membrane transporters; Journal of Proteome Research 2015; 14; 4005-4018[4]
Maaß S. et al.; Methods and applications of absolute protein quantification in microbial systems; Journal
of Proteomics 2016; 136; 222-233
Benjamin Lorenz Robert Ruprecht, TUM, Lehrstuhl fuer Proteomik und Bioanalytik
Massenspektrometrie-basierte quantitative Phosphoproteomik in der pharmakologischen
Arzneimittelforschung
Die von Kinasen vermittelte Proteinphosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosin-Seitenketten ist
eine essentielle, posttranslationale Modifikation, die einen Großteil der physiologischen und
krankheitsassoziierten, zellulären Signalverarbeitung steuert. In den letzten Jahren hat sich die
Massenspektrometrie-basierte Proteomik zur Kerntechnologie für die großangelegte, explorative und
Proteom-weite Untersuchung von Phosphorylierungsvorgängen entwickelt. Aufgrund der geringen
Stöchiometrie müssen phosphorylierte Peptide vor der eigentlichen Messung angereichert werden.
Zu diesem Zweck wurde eine Methode, die auf einer mit Eisenionen beladenen
Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) Säule basiert, entwickelt. Dadurch ist es möglich, die
Gesamtheit an. Die Methode skaliert linear mit der Menge an geladenem Ausgangsmaterial (50µg-5mg)
und zeichnet sich durch eine effiziente Elution der gebundenen Phosphopeptide aus. Nachfolgend wurde
sie auf zwei verschiedene Fragestellungen im Kontext der pharmakologischen Arzneimittelforschung
angewendet.
Um die Hypothese zu untersuchen das der Aktivierungsstatus einer Zellinie die Vorhersage des
Wirkstoffansprechens ermöglicht, wurde die globalen Phosphoproteome des „NCI-60“ Zelllinienpanels,
einer phramakologisch exzellent karakterisierten Tumorzelliniensammlung, bestimmt. Die ca. 25,000
quantifizierten Phosphopeptide pro Zelllinie gewaehren einen tiefen und funktional relevanten Einblick in
die Tumorzellbiologie. Eine Korrelationsanalyse des Wirkstoffansprechens mit der gemessenenen
Phosphopeptidabundanz deckte bekannte und neue Sensitivitäts- sowie Resistenzmarker auf.
In einer weiteren Anwendung war die Methode Grundlage fuer eine proteomische und
phosphoproteomische Untersuchung der Wirkweise des Kinaseinhibitors Lapatinib und der Entwicklung
von Resistenz gegen Lapatinib in einer Her2 überexprimierenden Brustkrebszelllinie. Mit > 7,800
quantifizierbaren Proteinen und > 15,000 quantifizierbaren Phosphopeptiden ermoeglichte dieser
umfassende, multiproteomische Ansatz eine tiefgehende Analyse der Signalwiederherstellung und gab
einen Einblick in die molekularen Konsequenzen der Lapatinib-Resistenzentstehung. Hieraus resultierte die
Aufklärung deregulierter, therapeutisch relevanter Zielmoleküle und Phänotypen.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die quantitative Phosphoproteomik das Potential hat, einen
wertvollen Beitrag in verschiedenen Bereichen der präklinischen Wirkstoffforschung zu leisten.
Beate Thal, Institut für Pflanzengenetik, Abteilung Pflanzenproteomik, Leibniz Universität Hannover
Proteomanalyse der symbiotischen Stickstofffixierung in Pflanzenwurzeln
Pflanzensamen aus der Familie der Leguminosen, welche Bohnen und weitere Hülsenfrüchte umfasst, sind
sehr proteinreich und wertvoll für die menschliche und tierische Ernährung. Im Gegensatz zu anderen
Nutzpflanzen müssen Leguminosen jedoch nicht mit Stickstoff gedüngt werden. Leguminosen sind in der
Lage, eine Symbiose mit Rhizobien‐Bakterien einzugehen, die Luftstickstoff fixieren können. In neu
gebildeten Pflanzenorganen, den Wurzelknöllchen, werden die Bakterien von der Pflanze mit
energiereichen Verbindungen ausgestattet, wohingegen die Bakterien die Pflanze mit Aminosäuren, den
Endprodukten der bakteriellen Stickstofffixierung, versorgen. Für diese Symbiose wird der pflanzliche
Metabolismus grundlegend umgestaltet. Mitochondrien nehmen dabei eine Schlüsselrolle ein. Zwischen
den Stoffwechselwegen der Bakterien und der Mitochondrien gibt es einige Berührungspunkte (Abb. 1,
rechts, rot umrahmt). So konkurrieren beide Kompartimente um Substrate, wie zum Beispiel Malat oder
Sauerstoff. Die Biochemie dieser Symbiose ist jedoch noch weitgehend unverstanden.
Wir haben ein Projekt initiiert, um die Rolle der Mitochondrien im Zuge der Symbiose von Pflanzen mit
Rhizobien-Bakterien systematisch aufzuklären. Dazu wurde ein Verfahren etabliert, um aus kleinsten
Mengen an Wurzel- oder Knöllchengewebe schonend Mitochondrien zu isolieren. Die gereinigten
Organellen wurden nachfolgend mit „Label-free quantitative shotgun“ Massenspektrometrie
charakterisiert. Eine vergleichende Auswertung der Ergebnisse ermöglicht erstmals umfassende Einblicke
in biochemische Prozesse, durch die die Mitochondrien in die Symbiose eingebunden sind.
Das bessere Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen den symbiotischen Partnern kann auf
lange Sicht dazu genutzt werden, den Ertrag von Leguminosen zu erhöhen. Auch ist denkbar, Pflanzen,
die nicht zu den Leguminosen gehören, mit der Befähigung auszustatten, eine Symbiose mit
stickstofffixierenden Bakterien einzugehen.
Abbildung 1: Proteomische Strategie zur Identifizierung mitochondrialer Proteine mit Bedeutung für die
Wurzelknöllchen-Symbiose. Links: Vicia faba Pflanze mit Wurzelknöllchen zur Stickstofffixierung.
Mitochondrien werden aus unterschiedlichen Geweben isoliert: Wurzeln mit stickstofffixierenden
Knöllchen (Fix+ ), Wurzeln mit nicht-stickstofffixierenden Knöllchen (Fix-), gedüngte (N) sowie
unbehandelte Wurzeln (0). Mitte: Experimentelle Strategie (oben: „shotgun“ Massenspektometrie, unten:
Gel-basierte Techniken) zur Identifikation von mitochondrialen Proteinen, die für die Stickstofffixierung
von Bedeutung sind. Rechts: Haupt-Stoffwechselvorgänge und metabolische Berührungspunkte zwischen
Bakteroiden und Mitochondrien während der Stickstofffixierung.
Martin Winter1,2, Ivana Dokic2, Ramona Mayer1, Uwe Warnken1, Amir Abdollahi2 und Martina Schnölzer1,
1
Funktionelle Proteomanalyse, DKFZ, Heidelberg, 2Translationale Radioonkologie DKFZ, Heidelberg
Molekulare Effekte moderner Strahlentherapie auf Proteom und Phosphoproteom
Seit dem Jahr 2009 werden im Heidelberger Ionenstrahl-Therapiezentrum (HIT) Patienten mit
Partikelstrahlung behandelt. Diese weisen gegenüber herkömmlicher Photonenstrahlung große
physikalische Vorteile auf. Photonen zeigen vom Eintritt ins Gewebe ab ein abklingendes Intensitätsprofil,
weshalb bei tief liegenden Tumoren nur noch eine geringe Strahlendosis am Zielort wirken kann. Partikel
hingegen, zeigen ein invertiertes Intensitätsprofil und ermöglichen so die präzise Bestrahlung tief liegender
Tumore, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen.
Ziel dieser Studie ist es aufzuklären, ob auch auf molekularer Ebene Unterschiede zwischen Photonen- und
Partikelstrahlung bestehen. Hierfür wurden Zellen mit Photonen, Protonen und Kohlenstoff-Ionen bestrahlt
und die Expression der Proteine sowie die Proteinphosphorylierung untersucht. Die Analyse erfolgte
mittels nano-Flüssigchromatographie gekoppelt mit einem hochauflösenden Massenspektrometer.
In ersten Experimenten konnte gezeigt werden, dass zwei Stunden nach Bestrahlung keine Änderungen der
Protein-Expression erkennbar sind, während hingegen eine große Zahl an Proteinphosphorylierungsstellen
durch Bestrahlung reguliert wurden. Deren Hauptfunktionen beinhalten die Aktivierung der
DNA-Reparaturmechanismen und die Regulation des Zellzyklus.
Der Großteil dieser
Phosphorylierungsstellen zeigt eine weitestgehend homogene Regulation zwischen den Strahlenarten.
Interessanterweise wurde jedoch für einige Phosphorylierungsstellen eine differentielle Regulation
zwischen den Strahlenarten, Photon versus Partikel, gefunden.
Um diese Phosphorylierungsstellen zu validieren, zogen wir eine Alternative zu dem „Goldstandard“
Western Blot heran. Wir verwendeten synthetische Peptide ausgewählter Phosphorylierungsstellen mit
einer schweren Isotopenmarkierung und konnten damit die erhaltenen Ergebnisse in einem spike-in
Experiment bestätigen. Welche molekularen Effekte für diese differentielle Regulation verantwortlich sind
und welche zellulären Konsequenzen daraus folgen, ist Teil weiterführender Experimente.
Yelena Yefremova ,Proteome Center Rostock, University Medicine Rostock, Rostock, Germany
Determination of Gas Phase Free Energies of Protein-Protein Interactions by Ion Mobility Mass
Spectrometry
In solution, protein-protein interactions are characterized quantitatively by thermodynamic properties like
dissociation constants (KD) and Gibbs free binding energies (ΔGs0) at equilibrium. Given that properties of
biological molecules depend on the balance between intramolecular interactions and solvation, studying
unsolvated protein complexes in the gas phase is important for understanding of intramolecular interactions
[1]. We developed a method to directly determine gas phase thermodynamic parameters of non-covalent
protein-protein complexes by IMS-MS that allows semi-quantitative characterization of these interactions
in the gas phase. First, the interacting partners are mixed in solution in an ESI competitive buffer to form
a complex. Next, the complex is introduced into the gas phase via ESI and transferred to an ion mobility
cell. Upon separation of the complex from non-complexed constituents by ion mobility drift, dissociation
of the complex is directly achieved in the gas phase of the mass spectrometer by raising the transfer
collision energy (TCE) in a stepwise manner (2V - 220V). Areas under the signals (AUS) of surviving
complex and intensities of the dissociated complex constituents are then recorded and normalized.
Dissociation of complexes in the gas phase is unidirectional and irreversible, hence not reaching
equilibrium conditions. Thus, gas phase dissociation thermodynamics studied by ESI-IM-MS/MS gives
information about total free energies (
, where ` #´ indicates that the term includes 1/ T; see (1)).
Taking this into consideration and using normalized AUS values at different TCE voltages relative free
energies (
) of complex dissociations in the gas phase can be calculated:
(1)
where R is the gas constant (R = 8,314 Jmol-1K-1). The calculated relative free energies (
) for
individual complex dissociation events in the gas phase then can be plotted against TCE voltages and a line
can be fitted into the resulting points by linear regression, applying (2), where m is the slope of the fitted
line [2].
(2)
Extrapolating the resulting line to [TCE] = 0, i.e. the intercept with the y axis, gives the gas phase free
energy of the complex dissociation without applied external energy that can be considered as the internal
energy of the complex
at dissociation.
The developed method was applied to calculate
values for three closely related protein-protein
complexes consisting of Fc parts of immunoglobulins (IgG) and protein G´ derivatives (IgG-Fc• G´ e,
IgG-Fc• G´ f, and IgG-Fc• G´ g). Gas phase free energy values derived for these there complexes represent
binding strengths of complexes which correlate well with in-solution thermodynamic data. Hence,
values provide a rapid and reliable method to characterize protein-protein interactions in the gas phase with
very little sample consumption.
[1] J. Woenckhaus et al. J. Phys. Chem. B 1996, 101, 847-851
[2] M.M. Santoro and D.B. Bolen. Biochemistry 1988, 27, 8063-8068
Sprecherliste 2016
Julia Bandow
Birte Beine
Rainer Bischoff
Bernhard Blank-Landeshammer
Jean-Pierre Chervet
Martin Eisenacher
Universität Bochum
ISAS Dortmund
University of Groningen, Niederlande
ISAS Dortmund
Antec BV, Niederlande
Universität Bochum
Ingo Feldmann
ISAS Dortmund
Christoph Hage
Universität Halle-Wittenberg
Moritz Heusel
ETH Zürich
Stefan Jaekel
Merck, Darmstadt
Pegah Khamehgir-Silz
Universität Gießen
Neil Kelleher
Nothwestern University, USA
Stephan Lehr
Deutsches Diabetes-Zentrum (DDZ)
Urs Lewandrowski
Sebastian Longen
Jana Lorenz
Friedrich Lottspeich
Janett Mueller
Jürgen M. Plitzko
Dietmar Reusch
Sandoz, Kundl Österreich
Uniklinik Frankfurt
Universität Halle-Wittenberg
Stockdorf
Universitätsmedizin Greifswald
MPI Martinsried
Roche Diagnostics, Penzberg
Benjamin Ruprecht
TUM
Bernhard Spengler
Universität Gießen
Martin Spitaler
MPI Martinsried
Kai Stühler
Universität Düsseldorf
Beate Thal
Leibniz Universität Hannover
Axel Walch
Helmholz Zentrum München
Bettina Warscheid
Reiner Westermeier
Martin Winter
Manfred Wuhrer
Universität Freiburg
Serva, Heidelberg
DKFZ, Heidelberg
LUMC, Niederlande
Firmen
Die 23. Arbeitstagung 2016 wird von den folgenden
Firmen finanziell unterstützt:
BIOZOL / Biomedica
Bruker Daltonik GmbH
DECODON GmbH
Elsevier
Gilson international
I&L Biosystems
IonBench
Olink Proteomics
Promega GmbH
Protagen Protein Services GmbH PPS
Shimadzu Deutschland GmbH
SCIEX
SERVA
SunChrom GmbH
Thermo Fisher Scientific
Toplab
Waters
Tagungsort
Die Arbeitstagung wird im LWL-Industriemuseum Zeche Zollern, Grubenweg 5,44388
Dortmund im Stadtteil Bövinghausen stattfinden
Sie erreichen uns:
Mit öffentlichen Verkehrsmitteln
- Haltestelle "Industriemuseum Zollern" der Buslinie 462 (U-Bahnlinie 47 bis DortmundHuckarde Bushof, dann Bus 462 Richtung Dortmund-Marten bis Haltestelle "Industriemuseum
Zollern"), oder
- Haltestelle "Bövinghauser Straße" der Buslinie 378 (S-Bahnlinie 1 bis Bochum-Langendreer
oder S-Bahnlinie 4 bis Dortmund-Lütgendortmund, dann Bus 378 Richtung Castrop-Rauxel bis
Haltestelle "Bövinghauser Straße"; dann noch Fußweg von ca. 1 km oder mit dem Bus 462
Richtung Huckarde bis Haltestelle "Industriemuseum Zollern"), oder
- Bahnlinie RB 43 ("Emschertal-Bahn"), Dortmund-Dorsten, bis Bahnhof "DortmundBövinghausen"; von dort ein zehnminütiger Fußweg (Ausgang Bahnsteig Richtung
Eisenbahnbrücke, rechts 10 m Merklinder Str., dann schräg links durch Siedlung: Plutostr.,
Jupiterstr., Rhader Weg schräg links überqueren, Grubenweg).
Mit dem Auto
A 40 Dortmund - Essen, Abfahrt Dortmund-Lütgendortmund/B235, dann Wegweisern folgen
oder
A 42 Dortmund - Oberhausen, Abfahrt Castrop-Rauxel, dann B 235 und Wegweisern folgen
oder
A 45 Dortmund - Frankfurt, Abfahrt Dortmund-Marten, dann Autobahnzubringer Richtung
Dortmund-Marten und Wegweisern folgen.
Achtung: Bei Fahrten mit einem Auto-Navigations-Leitsystem dieses bitte ggf. auf "Rhader
Weg" einstellen, da nicht alle Systeme den Grubenweg richtig programmiert haben.
Organisatorisches
Für Unterkunft und Verpflegung müssen die Teilnehmer selbst sorgen.
Zimmerreservierungen in verschiedenen Preiskategorien sind z.B. online über
www.dortmund-tourismus.de/suchen-buchen/unterkuenfte/hotelbuchung.html,
oder telefonisch unter Tel.: +49 (0) 231 18999 111 möglich. Die
Zimmerbestellung sollte rechtzeitig vor Tagungsbeginn erfolgen.
Organisatoren
Dr. Roland Kellner
Merck KgaA
Frankfurter Straße 250
64271 Darmstadt
Tel: +49 (6151) 72 72 62
Fax: +49 (6151) 72 90 722
Email: [email protected]
Dr. Friedrich Lottspeich
Peter-Dörfler-Straße 4
82131 Stockdorf
Tel: + 49 (0) 1727285698
Email: [email protected]
Prof. Dr. Helmut E. Meyer
ISAS
Bunsen-Kirchhoff-Straße 11
44139 Dortmund
Tel: + 49 (231) 1392-106
Email: [email protected]
Prof. Dr. Albert Sickmann
ISAS
Otto-Hahn-Str. 6b
44227 Dortmund
Tel: + 49 (231) 1392-100
Email: [email protected]
Hinweise zur Anmeldung
Für die Durchführung der Tagung wird ein geringer Beitrag zur
Deckung der anfallenden Kosten erhoben.
Die Teilnehmerzahl ist aus organisatorischen Gründen limitiert
und somit erfolgt die Registrierung gemäß der Verbuchung der
Tagungsbeiträge.
Der Tagungsbeitrag für Studenten/Doktoranden beträgt 100,- €,
für Wissenschaftler/TAs 250,- €.
Nach dem 31. Mai 2016 ist eine Rückerstattung dieses Betrages
auch bei Nichtteilnahme nicht mehr möglich!
Die Anmeldung zur Tagung sollte möglichst elektronisch über
die Webseite www.arbeitstagung.de erfolgen.
www.arbeitstagung.de

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