１．DNAは5’から3’方向への重合でなけれ ば、校正機能がはたらかない 1 5’→3’方向での重合の合目的性;校正機構との関係で 重合中のDNA 5’、3’のいずれの末端にも三リン酸はない モノマーの5’に三リン酸がついている ヌクレオシド三リン酸が3’-OHに付加され、 その際にリン酸２つが切られて、その際に 出る結合エネルギーが反応に使われる。 DNAポリメラーゼがこの反応を触媒する ＊ DNAポリメラーゼは校正機能があり、付加し たヌクレオシドの塩基が正常な塩基対を作ら なければ、ヌクレオシドを削除し、正しいヌク レオシド三リン酸を使って修正（校正）する 新しく正しいヌクレオシドも三リン酸を持って おり、結合エネルギーは供給される もし、3’→5’方向（逆方向）の重合だったら 重合中のDNA、5’末端に三リン酸がついている。 直前に付加されたヌクレオシドが持っているもの ヌクレオシド三リン酸が新たに付加される。仮想 の3’→5’方向への重合であるので、重合中の DNAについている三リン酸が切られて、このエネ ルギーを使って、新しいヌクレオシドが付加され る。 三リン酸がない！ ＊ ＊ もし、正しい塩基対が形成されなければ、直前に 付加されたヌクレオシドを削除し、新しく正しいヌ クレオシドを付加する必要がある。 しかし、直前に付加されたヌクレオシドを削除す ると、重合中のDNAの5’末端には三リン酸がなく なる。このため、結合エネルギーが供給されず、 校正ができず、またDNAの重合反応も止まる ２．DNAからRNAへの転写 二本鎖DNAのどちらを写し取るか そのときどちらが「鋳型」となるか 4 二本鎖のゲノムDNAのどちらが遺伝子の意味を持つか？ 反対側の鎖はどういう機能を持つか 5’－プロモーター－ATG GCC AGA GAC AAC CAA GGA －ターミネーター－3’ 3’ TAC CGG TCT CTG TTC GTT CCA 5’ （塩基は合成のため常に逆平行） ゲノム上の遺伝子は、プロモーター配列とターミネーター配列に挟まれている。 プロモーターにはRNAポリメラーゼが結合し、ターミネーターでRNAポリメラーゼ はゲノムから離れる。プロモーターは必ず遺伝子の上流（5’側）にある。 上記の配列で、遺伝子は 5’－ATG GCC AGA GAC AAC CAA GGA－3’ 転写されてできるRNAの配列は T→Uになるだけなので 5’－AUG GCC AGA GAC AAC CAA GGA－3’ ができる （本当はターミネーターの終わりまで転写されるが省略） ではこのRNAができるための『鋳型鎖』はどれ、どっち？ 5 転写 transcription 5’－プロモーター－ATG GCC AGA GAC AAC CAA GGA －ターミネーター－3’ 3’ TAC CGG TCT CTG TTC GTT CCA 5’ ATG GCC AGA GAC AAC CAA GGAが遺伝子であり、 これと同じ配列のRNA 5’AUG GCC AGA GAC AAC CAA GGA3’ をつくるには AUG GCC AGA GAC AAC CAA GGA 3’TAC CGG TCT CTG TTC GTT CCA5’を鋳型とする RNAとDNAは恒常的な二本鎖を形成せずに、RNAは鋳型DNA鎖から はずれて一本鎖RNAとして存在 6 5’－AUG GCC AGA GAC AAC CAA GGA－3’ 5’ 3’ RNAは上記のものだからこれを合成するための鋳型鎖は 3’ の逆向きでなければならない 5’ プロモーターを5’上流側とするDNA鎖が遺伝子、反対側が鋳型鎖 5’－プロモーター－ATG GCC AGA GAC AAC CAA GGA －ターミネーター－3’ 3’ TAC CGG TCT CTG TTC GTT CCA 5’ 遺伝子をコードしている側を『センス鎖』、 これを合成するための鎖である鋳型鎖を『アンチセンス鎖』 7 5’ ATG GCC AGA GAC AAC CAA GGT 3’ 3’ ターミネーター－ TAC CGG TCT CTG TTC GTT CCA プロモーター－5’ となると転写されるRNAは 5’－ACC UUG CUU GUC UCU GGC CAU－3’ となる 当然鋳型鎖は黒で示す側 5’－ATG GCC AGA GAC AAC CAA GGT－3’ 5’－ACC UUG CUU GUC UCU GGC CAU－3’ 遺伝子をコードしている側を『センス鎖』、プロモーターとターミネーターがある センス鎖の鋳型鎖を『アンチセンス鎖』 8 ３．転写後の修飾 原核生物 転写されたRNAがそのままリボソームに 結合して翻訳に用いられる 真核生物の転写 前駆体RNAが転写されたのちに三段階で 加工される ・RNAが核から細胞質に輸送される必要 ・mRNAであるというシグナル ・1つの遺伝子から複数のタンパクを作る 9 真核生物における転写とスプライシング DNA プロモーター 前駆体RNA Exon1 ターミネーター exon2 exon3 exon4 exon5 exon6 Intron ゲノムDNAの遺伝子がRNAとして写し取られる（転写；translation） Promoterからterminatorの間がRNAとなる 真核生物では遺伝子部分はexonとintronから構成されている エキソン：mRNAになりうるゲノム配列、いくつかはスプライシングで削除される。 遺伝子領域の10%程度（全ゲノムの2%）。 イントロン：アミノ酸配列をコードしておらずスプライシング必ず削除される配列 mRNAの転写量を決めたりする（けっこう重要である） 10 前駆体RNA RNA Exon1 exon2 Cap RNA Exon1 exon5 exon6 AAAAAAAAAAAAA 1 前駆体RNA exon3 exon4 2 4 exon2 6 exon3 exon4 Cap5’ exon5 exon6 3’AAAAAAAAAAAAA 1 3 5 6 転写されたRNAからイントロンと一部のエキソンが切り取られる（スプライシング） RNAの5’にメチルグアニンが付加される（5’キャッピング） 3’末端にアデニンが数十から数百結合する（3’ポリアデニレーション） これで真核生物のmRNAが完成して、核外へ輸送される スプライシングは1つの遺伝子から複数の蛋白を作る仕組みとして重要 11 真核生物の転写様式 (1)ゲノムDNAのプロモーターからターミネーターまでがRNA として写し取られる→前駆体RNA (2) 写し取られてできた前駆体RNAのうち、イントロンと場合 によっては一部のエキソンが切り取られ再結合する（選択的スプ ライシング） (3) 同時に5’にメチルグアニンが付加され（5’キャッピング）、 3’にはポリAが付加される（3’polyA tailing）。これをプロセシング という (4)これでメッセンジャーRNA（mRNA）が完成し核外へ運ばれ、 翻訳に用いられる 12 転写のまとめ (1)ゲノムの中で遺伝子はどのように存在しているか、 (2)遺伝子は二本鎖DNAのいずれの側にあるか、どのように 決まっているか (3)DNAのセンス鎖とアンチセンス鎖とは、どのような組み合わせ を言うのか (4)ゲノムのなかでプロモーターとターミネーターとはどういう意味 があるか (5)真核生物では転写された（前駆体）RNAはどのように「加工」 されるか、どのような意味があるか (6)スプライシングとはどういう反応過程か、どのような意味があるか (7)レトロウイルスはどのように自己複製するか (8)レトロウイルスは、なぜ免疫系により排除されにくいのか (9)レトロウイルスは、 なぜ「レトロ」ウイルスとよばれるのか 13 小テスト 5’ 3’ ターミ ネー ター GCAACCTAGATTATGATA CGTTGGATCTAATACTAT プロ モー ター 3’ 5’ （１）上記の配列から転写されるRNAを答えなさい （２）スプライシングにはどのような意味があるか述べな さい。 14 真核生物の転写と翻訳の様式 １．ゲノムDNAではプロモーターからターミネーターまでがRNAとして写し取られる (1) 写し取られてできたRNAのうちイントロンと場合によっては一部のエキ ソンが切り取られ再結合する（選択的スプライシング） (2) 同時に5’にメチルグアニンが付加され（5’キャッピング）、3’にはポリA が付加される（3’polyA tailing） (3)これでメッセンジャーRNA（mRNA）が完成し核外へ運ばれ、リボソームで 翻訳に用いられる ２．mRNAのうちfirst AUGからストップCodonの間が蛋白に翻訳される (1) first AUGより上流（5’側）とstop codonより下流（3’側）は翻訳されない (2) 翻訳される部分をreading frame（読み枠）、それ以外の部分を untranslated region（UTR、それぞれ5’UTR, 3’UTR）という 15 ここからの２ページは実験のおはなし；cDNAとは何か 発現している遺伝子のDNAを人工的につくる→イントロンがない→大腸菌も使える RNA 5’Cap AAAAAAAAAAAAA3’ 細胞内にはこのようなmRNAがあります。これを鋳型として、発現している遺伝子の DNAを人工的につくります。 TTTTTTTTTTT5’をプライマーとして使い、またレトロウイルス の逆転写酵素を使います mRNAを鋳型として1本鎖のDNAを作ります mRNA 5’Cap 3’ こっちはDNA AAAAAAAAAAAAA3’ TTTTTTTTTTT5’ レトロウイルスの逆転写酵素にはRNAを分解する活性もあるので TTTTTTTTTTT5’ 3’ という1本鎖のDNAができます。RNAを鋳型として作るDNAを相補的DNA （complementary DNA, cDNAといいます）。 16 一本鎖DNA TTTTTTTTTTT5’ 3’ cDNAができるとこれを鋳型としてPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により 二本鎖DNAをふやすことができます。PCRは後期の12月頃に学習します 二本鎖DNA こうやって増やしたcDNAは、イントロンを持っていないので、大腸菌で も働くプロモーター（後述するLacZのプロモーターなど）をつないでやる と、大腸菌の中でタンパクが作られるようになります。こうやって、ヒト やマウスや植物など真核生物で発現している蛋白を大腸菌で大量に 造らせることができます。 一方で、大腸菌には小胞体とゴルジ装置がないので、糖タンパクは できません。ホルモンなども大腸菌でできますが、糖鎖は付いていま せん。 17 ４．mRNAからタンパクを合成する仕組み リボソームの機能 18 役者 （１）mRNA （２）運搬RNA（tRNA）－アミノアシルtRNA mRNAの情報に従ってアミノ酸を運んでくる アンチコドン領域を持つ⇔mRNA上のコドンと結合 ヒトでは49のアンチコドンが対応 （３）リボソーム、大サブユニットと小サブユニット (a)小サブユニットはmRNAとtRNAの結合をつかさどる (b)大サブユニットはペプチド結合を触媒 Aサイト、Pサイト、 （Eサイト原核生物ではA,PにEサイトがある） （４）終結因子 19 （１）翻訳の開始 （a）小サブユニットとメチオニンを持つtRNAが結合 （b）これにmRNAと結合し、最初のAUGとtRNAが強く結合 （c） 大サブユニットが結合する （d）これに続いての塩基配列のトリプレットコドンの情報 をもとにtRNAがアミノ酸を持ってくる 20 （２）ペプチド鎖の伸長 （e）リボソームがペプチド結合を触媒してポリペプチド鎖の形 成が始まる （f）PサイトとAサイトのアミノ酸がペプチド結合 （g）大サブユニットと小サブユニットがmRNAの3’側に、コドンに 沿ってスライドする （h）アミノ酸の外れたtRNAがEサイトに来て、tRNAばmRNAから はずれる （i）空いたAサイトにコドンに結合するアンチコドンを持った アミノアシルtRNAが入る これを繰り返すことで、ポリペプチド鎖が伸長する 21 （３）終結 （j）終結コドンに集結因子が結合して、リボソームが かい離し、ポリペプチド鎖の形成が終わる 22 Coding region (reading frame)とUTR RNA Cap5’ AAAAAAAAAAAAA 3’ 1 3 AUG 5 6 Stop codon 5’ 3’ 5’UTR この間の塩基配列情報が アミノ酸配列の情報となる 3’UTR Coding region, reading frame UTR：untranslated region 非翻訳領域 タンパクに翻訳されない領域 mRNAの寿命や細胞内での輸送に関わる 23 ５．突然変異の話 DNAは、複製時の校正機構と、修復機構とにより、非常 に正確に次世代に引き継がれる。 １０のマイナス９乗のエラーの確率 体細胞では１回の分裂で数個～10個のエラー エラーが生じたらどうなるか 遺伝子の塩基の異常による『突然変異』 遺伝子に突然変異が起こると → できるタンパクが変わる 転写でエラーが起きても同じことが起こる 24 突然変異の話 GCA AGA GAC AAC TGT ACA TAC TTA ATA という塩基配列があったとする Ala Arg Asp Asn Cys Thr Tyr Leu Ile こっちはアミノ酸配列 GCA AGA GAC AAC TGT ATA TAC TTA ATA 点突然変異、 point mutation Ala Arg Asp Asn Cys Ile Tyr Leu Ile C→Tでトレオニンがイソロイシンに変わる（非同義置換） 塩基が変異してもタンパクは変わらないこともある（同義置換；複数のコドン） GCA AGA GAC AAC TGT ACA TAC TTA ATA Ala Arg Asp Asn Cys Thr Tyr Leu Ile GCA AGA GAC AAC GTA CAT ACT TAA TA・ frame shift mutation Ala Arg Asp Asn Val His Thr stop コドンがずれるので、下流のコドンがすべて変わりアミノ酸も換わる frame shift mutationではしばしば途中で転写が止まる 25 ６．遺伝子発現の調節様式 遺伝子は、必要な時にスイッチが入り蛋白合成が始 まる。必要のないときは、遺伝子はoffになっており、 蛋白はできない。 大腸菌のβガラクトシダーゼ（LacZ）遺伝子が、生育環 境によりその遺伝子発現の調節が行われている。こ れを例に、遺伝子発現における調節領域の働きを紹 介する。 第8章のｐｐ．２６７－２６９ 大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子は環境に反応して発現するようになる ターミネーター 調節領域 CAP結合部位 プロモーター オペレーター LacZ LacY LacI Βガラクトシダーゼ（LacZ） パーミアーゼ(LacY） アセチルトランスフェラーゼ(LacI） LacZはラクトースをグルコースとガラストースに分解する酵素 LacYはラクトースを大腸菌の細胞内にとりこむ蛋白 LacIはラクトースにアセチル基を付加する酵素 大腸菌は通常、グルコースを取り込んでエネルギーとしている 環境にグルコースがなく、乳糖のみ存在するときには、乳糖を分解する酵素（LacZ）の 遺伝子がOnになる。 グルコースがある場合には、この遺伝子はOffのままである。どのようにして遺伝子発 現のスイッチが入るのか。 LacZ遺伝子（赤枠）の上流（5’側）にはLacZ遺伝子の発現調節領域がある（青枠）。調節 領域は、CAP蛋白結合部位、プロモーター、オペレーターから構成されている（塩基配 列から3つに分けられる）。LacZ遺伝子、調節領域とも、ゲノムDNAの一部である。 大腸菌の環境にグルコースがあるときにはLacZ遺伝子はoffになっている リプレッサー（蛋白） CAP結合部位 プロモーター オペレーター LacZ LacY LacI LacZ遺伝子（赤枠）の上流（5’側）にはLacZ遺伝子の発現調節領域がある（青枠）。調節領域は、 CAP蛋白結合部位、プロモーター、オペレーターから構成されている（塩基配列から3つに分けら れる）。 環境にグルコースがある条件では、大腸菌のLacZ遺伝子の調節領域 の中のオペレーター配列（ゲノムDNA上の一部）にリプレッサー蛋白が 結合している。リプレッサーがオペレーターに結合している状態では、 RNAポリメラーゼはプロモーターに結合できない。したがって、蛋白は できない（リプレッサーは遺伝子発現を抑制する転写調節因子）。 ラクトースがあるとリプレッサーはオペレーターに結合できない ラクトース（乳糖） CAP結合部位 プロモーター オペレーター LacZ LacY LacI リプレッサーがオペレーターから離れる、結合できない CAP結合部位 プロモーター オペレーター LacZ LacY LacI ラクトースが存在すると、これが大腸菌内に入って（ラクトースの代謝 産物が）リプレッサーに結合し、リプレッサーの立体構造が変わるため オペレーター配列に結合できなくなる（オペレーターから離れる）。 ラクトースのみの環境では、最初は利用できる糖はなく大腸菌は飢餓状態と なりシグナル分子のcAMPの濃度が高くなる。 CAP結合部位 プロモーター オペレーター LacZ LacY LacI cAMP CAP蛋白* 大腸菌内のcAMPの濃度が高くなると、cAMPがCAP蛋白（catabolite activating protein）に結合する。その結果、やはりCAP蛋白の立体構造 が変化し、DNA上のCAP結合部位に結合できるようになる。 cAMPはシグナル分子で、ここでは大腸菌が使えるエネルギーが環 境に少なくなったことを反映しています。 *CAPの中に蛋白という意味は含まれていますが、あえてCAPタンパクという表現 をすることで、CAPがタンパクであるということを強調しています CAP蛋白がCAP結合部位に結合するとRNAポリメラーゼがプロモーターに 結合しやすくなる。 CAP結合部位 プロモーター オペレーター LacZ LacY LacI RNAポリメラーゼ CAP蛋白がRNApolを集める mRNA DNA上のCAP結合部位にCAP蛋白が結合すると、CAP蛋白がRNAポリメ ラーゼをリクルートする（呼び寄せる）ようになり、RNApolがプロモーター 近辺に集まり、プロモーターに結合する。 RNAポリメラーゼがプロモーターに結合するとRNAの転写が始まり、続 いて蛋白合成が始まる。 CAPタンパクは、リプレッサーと逆の機能を持ちっています。RNAポリメ ラーゼがプロモーターに結合するのを促す働きがあります。このような機 能を持つタンパクを、アクチベーターといいます。 まとめ ①DNA→RNAの合成における二本鎖DNAのそれぞれの機能 ②ゲノム上のプロモーターとターミネーターとはどういうものか ③原核生物と真核生物でのRNAが合成されてからタンパク合成が始まるまでの違い ④UTRとreading frameとは何か ⑤原核生物で核膜がないことと真核生物で核膜が存在することの意味 ⑥真核生物での転写されたRNAからmRNAができるまでにどのような現象が見られるか ⑦リボソームでのmRNAからタンパクが出来る過程 ⑧翻訳過程のInitiation elongation termination の３つの過程を説明できるか ⑨大腸菌でラクトースが使われるようになる場合の、環境変化と大腸菌細胞内での変化 の相関 ⑩転写調節因子とはどのようなものか、ラクトースの転写開始を例に説明できるか ⑪リプレッサーとアクチベターとはどのようなものか ⑫大腸菌でヒトやマウスの蛋白を発現させるために必要なことは何か ⑬なぜRNAウイルスは免疫反応を逃れることができるのか ⑭遺伝子の配列が変化した遺伝子やmRNAから正常なタンパクができるのはどのような 場合か ⑮エラーを含むmRNAによりできたタンパクのうち正常なタンパクができず立体構造正常で ないものができた場合に、そのタンパクはどのようになるか。 32
© Copyright 2024 ExpyDoc
