Überprüfung der Transformationseffizienz SOP

Überprüfung der Transformationseffizienz SOP
2011
SOP: Überprüfung der Transformationseffizienz
Die Transformationseffizienz gibt die Anzahl der Kolonien pro 1 ug eingesetzter DNA
an.
Unter optimalen Bedingungen erreicht man im Routinelabor eine TE von
106- 107 Kolonien pro 1ug eingesetzter Plasmid-DNA.
Methode:
-
1, 10 und/oder (100 pg) DNA von Puc19 (unbedingt dieses Plasmid
einsetzen in 100ul kompetente Zellen (man nimmt das Volumen, mit dem
die routinemäßigen Transformationen durchgeführt werden)
-
Kolonien auszählen
Richtwert:
100 Kolonien in 10 pg Plasmideinsatz entsprechen :
1x107 Kolonien/ugDNA
(100 Kolonien/10 pg =
10 Kolonien/ 1pg =
104 Kolonien/ 1ng =
107 Kolonien/ 1µg )
Durchführung:
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Kompetente Zellen vom -80°C Freezer direkt auf Eis überführen
ca. 1µl (10pg) DNA werden mit 100µl kompetenten DH10B darauf pipettiert
(nicht mischen)
10 min auf Eis inkubieren
Hitzeschock bei 42°C im Thermoblock für 90 Sek
2 min auf Eis
200µl LB-Medium dazugeben und mind.30 ` bei 37°C schütteln
alles ausplattieren auf LB-Amp-Platten (Probe kann kurz abzentrifugiert werden; ca.
4000rpm, max. 1 min; Überstand kurz abkippen, Pellet resuspendieren und auf Platte
ausplattieren)
-
ÜN 37°C ca. 16 h
Optional: kann zweiter Ansatz parallel mit laufen, indem nur die Hälfte der Probe
ausplattiert wird (macht das Zählen eventuell leichter)

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