Investigating the role of activated leukocyte cell - ETH E

DISS. ETH NO. 23187
Investigating the role of activated leukocyte cell
adhesion molecule in vascular biology and
its potential as a therapeutic target
A thesis submitted to attain the degree of
Doctor of Sciences of ETH Zurich
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Ann-Helen Willrodt
Master of Science in Biology
ETH Zurich, Switzerland
born on 03.05.1986
citizen of Germany
Accepted on the recommendation of:
Prof. Dr. Cornelia Halin Winter, examiner
Prof. Dr. Dario Neri, co-examiner
2016
1 Summary
1.1 Summary
Besides its physiological function, the vascular system is involved in a variety
of different diseases. Therefore, it is crucial to understand the underlying
mechanisms leading to the formation and function of the vasculature under
physiological and pathological conditions. Vertebrates have developed two
vascular systems, which work in concert to ensure tissue homeostasis of the
highly complex vertebrate body. The blood vascular system is a closed circuit
with a hierarchical network, which allows the efficient distribution of gases,
nutrients and cells throughout the vertebrate body. The lymphatic vascular
system, on the other hand, is based on blind-ended capillaries, which drain
fluid and immune cells through lymphatic collectors to tissue-draining lymph
nodes and finally back into the blood circulation.
Cell adhesion molecules are transmembrane proteins, which are involved in
cell-cell and cell-matrix interactions. Upon interaction with their ligands a
variety of different cellular processes are induced, which are also important for
vascular development and vessel stability. The activated leukocyte cell
adhesion molecule (ALCAM) is a molecule expressed by both vascular
systems, and its overexpression by tumor cells has been correlated with poor
survival of cancer patients, making it an interesting therapeutic target. ALCAM
is an adhesion molecule of the immunoglobulin superfamily with reported
expression on various leukocyte subsets, neurons, certain epithelial cells and
vascular endothelium. Analyses of ALCAM function have shown that it is
involved in cell differentiation, dynamic growth and migration. Furthermore, it
was reported to be involved in diverse cellular processes, such as T cell
activation, tumor invasion, neuronal and endothelial cell biology.
In the first project, we investigated the role of ALCAM in tumor growth. To this
end, in vivo lung metastasis models were performed using three different
tumor cell lines. We could show that ALCAM deficiency resulted in reduced
tumor burden in all three models tested. Furthermore, the reduced tumor
progression was shown to be in part due to a defect in tumor-associated
angiogenesis.
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Because ALCAM deficiency led to a striking reduction in tumor growth, we
wanted to investigate ALCAM`s potential as a therapeutic target. Therefore,
we engineered and characterized the ALCAM-blocking antibody scFv I/F8-Fc.
We could confirm its ability to specifically bind and block murine ALCAM. In
addition, functional in vitro assays demonstrated that the antibody could
interfere with (lymph-) angiogenic processes. Performing a developmental
blocking study in vivo, we could show its ability to interfere with the formation
of lymphatic vessels in the diaphragm and blood vessels in the retina.
In the third study, the role of ALCAM in immune-mediated diseases such as
contact hypersensitivity and asthma was investigated. Functional in vitro
assays confirmed that ALCAM contributes to dendritic cell transmigration, as
well as to T cell activation. In addition, in both mouse models of immunemediated inflammation, ALCAM-deficient mice showed a reduced immune
response.
Collectively, the results of this thesis provide new insights into the role of
ALCAM in vascular biology and immune-mediated diseases and provide a
rational for therapeutic blockade of ALCAM in diseases associated with
vascular expansion and/ or an over response of the immune system.
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1.2 Zusammenfassung
Neben
seiner
menschlichen
physiologischen
Körpers
in
der
Funktion
ist
Entstehung
das
Gefäßsystem
verschiedener
des
Krankheiten
involviert. Aus diesem Grund ist es von großer Bedeutung die Mechanismen
zu erforschen, welche zur Bildung von Gefäßen unter physiologischen und
pathologischen Bedingungen führen. Wirbeltiere haben zwei Gefäßsysteme
entwickelt, welche über den gesamten Organismus verteilt sind und unter
physiologischen Bedingungen die Homöostase des Körpers garantieren. Die
Hauptaufgabe
des
Blutgefäßsystems
ist
die
Sauerstoff-
und
Energieversorgung aller Zellen im Organismus. Um dies sicherstellen zu
können, pumpt das Herz sauerstoff- und nährstoffreiches Blut durch den weit
verzweigten Blutkreislauf. Im Gegensatz dazu bilden Lymphgefäße keinen
geschlossenen Kreislauf.
Lymphgefäße in peripheren Geweben nehmen
Gewebeflüssigkeit, Zellen und Makromoleküle auf, welche sie über
Lymphknoten zurück in das Blutgefäßsystem transportieren.
Zelladhäsionsmoleküle sind transmembrane Proteine, welche zum einen
Interaktionen von Zellen miteinander und zum anderen Interaktionen
von
Zellen mit der extrazellularen Matrix des Gewebes vermitteln. Eine derartige
Interaktion zwischen Zelladhäsionsmolekülen und ihren Liganden induziert
eine Vielzahl an verschiedensten Zellprozessen, welche unter anderem bei
der Entwicklung von Gefäßen eine zentrale Rolle spielen. Das Aktivierte
Leukozyten Zelladhäsionsmolekül (ALCAM) ist ein Molekül, welches von
Zellen beider Gefäßsysteme exprimiert wird. Die Tatsache, dass für einige
Krebsarten eine
erhöhte ALCAM Expression mit einer geringeren
Überlebenschance der Krebspatienten korreliert,
interessanten therapeutischen Ansatzpunkt.
macht es zu einem
ALCAM ist ein Adhäsions-
molekül der Immunglobulin-Superfamilie, dessen Expression in einer Vielzahl
von verschiedensten Zellen gezeigt worden ist. Unter anderem wird ALCAM
von Immunzellen, Nervenzellen, bestimmten Epithelzellen und Endothelzellen
exprimiert. Die Forschung hat gezeigt, dass ALCAM in Prozesse wie der
Zelldifferenzierung, dem dynamischen Wachstum und der Migration involviert
ist. Des Weiteren wurde gezeigt, dass ALCAM eine wichtige Rolle bei der T-
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Zell Aktivierung, der Tumorinvasion, sowie der neuronalen und vaskuläre
Zellbiologie spielt.
Im ersten Projekt der Doktorarbeit wurde die Rolle von ALCAM im
Tumorwachstum untersucht. Mittels drei verschiedener LungenmetastasenModelle konnten wir zeigen, dass ALCAM Knockout Mäuse (ALCAM-/-)
gegenüber Wildtyp (WT) Mäusen ein geringeres Tumorwachstum aufweisen.
Wir konnten zeigen, dass das geringere Tumorwachstum zum Teil durch
einen Defekt in der Neubildung von Tumor-assoziierten Blutgefäßen
verursacht wurde.
Da ALCAM-/- Mäuse ein geringeres Tumorwachstum aufweisen, war das Ziel
des zweiten Projektes, ALCAM hinsichtlich seines therapeutischen Potenzials
zu testen. Hierfür wurde ein Antikörper gegen ALCAM generiert und
charakterisiert. Wir konnten bestätigen, dass der anti-ALCAM Antikörper
scFv I/F8-Fc humanes und murines ALCAM spezifisch bindet und blockiert.
Des Weiteren konnten wir mittels in vitro Experimenten zeigen, dass der
Antikörper in der Lage ist Prozesse zu blockieren, welche für die (Lymph-)
Angiogenese wichtig sind. Abschließend konnten wir die in vivo Aktivität des
Antikörpers in einem Entwicklungsmodel bestätigen. Mäuse, welche während
ihrer Entwicklung dem blockierenden ALCAM Antikörper scFv I/F8-Fc
ausgesetzte waren, wiesen ein reduziertes Lymphgefäßsystem im Zwerchfell
und Blutgefäßsystem in der Retina auf.
Im dritten Projekt wurde der Einfluss von ALCAM in der Entstehung von
Krankheiten, in denen das Immunsystem eine zentrale Rolle spielt,
untersucht. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnten wir zunächst
bestätigen, dass ALCAM eine Rolle bei der Transmigration von dendritischen
Zellen und der Aktivierung von T-Zellen spielt. Anschließend wurde die Rolle
von ALCAM in der Entwicklung von Asthma und der allergischen
Kontaktdermatitis untersucht. In beiden getesteten Modellen zeigten ALCAM-/Mäuse im Vergleich zu WT Mäusen eine reduzierte Immunantwort.
Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass ALCAM eine wichtige Rolle in
der vaskulären Biologie, sowie der Entwicklung einer Immunantwort spielt.
Aus diesem Grund stellen unsere Forschungsergebnisse eine Grundlage für
die therapeutische Blockierung von ALCAM in pathologischen Prozessen,
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welche auf der Expansion des Gefäßsystems oder der Überreaktion des
Immunsystems basieren, da.
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