Oberflächenfunktionalisierung und Beschichtung von
Magnesium mit Proteinen – Adsorptionsverhalten und
Einfluss der Schichten auf die Korrosion und die
Biokompatibilität von Magnesium
Der Technischen Fakultät der
Friedrich-Alexander Universität
Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Grades
Doktor der Ingenieurswissenschaften (Dr. Ing.)
vorgelegt von Frau Dipl. Ing. Victoria Wagener
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der
Technischen Fakultät der
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 06.07.2015
Vorsitzende des Promotionsorgans: Dekanin Prof. Dr. M. Merklein
Gutachter: Prof. Dr. S. Virtanen, Prof. Dr. A. Boccaccini
I
Kurzzusammenfassung
Bereits
seit
einigen
Jahrzehnten
steht
Magnesium
im
Fokus
der
Medizintechnikforschung im Bereich der bio-resorbierbaren Implantatmaterialien. Neben
den Eigenschaften, die Magnesium für die Anwendung als Implantatmaterial
auszeichnen, besteht jedoch nach wie vor das Problem der anfänglich starken Auflösung
von Magnesium verbunden mit hoher Wasserstoffentwicklung und lokaler Alkalisierung.
Ansätze zur Herabsetzung der Korrosionsrate, vor allem zu Beginn, sind neben der
Entwicklung von Magnesiumlegierungen, geeignete Beschichtungen. Mehrfach wird in
der Literatur vom Einfluss von Proteinen auf die Korrosion von Metallen berichtet. Für
Magnesium zeigte sich in der Vergangenheit ein überwiegend positiver Effekt von
Serumproteinen auf die Korrosionsbeständigkeit. Es wird angenommen, dass Proteine
auf der Magnesiumoberfläche adsorbieren und eine isolierende Schicht bilden können.
In der vorliegenden Arbeit werden Proteinschichten auf Magnesium hinsichtlich ihrer
Eignung
als
Korrosionsschutz
untersucht.
Als
Modellproteine
werden
bovines
Serumalbumin (BSA) und Lysozym (LYS) gewählt. Die Immobilisierung der Proteine
erfolgt teilweise über Linkermoleküle, wobei die Beschichtungszeit der Proteine von
0,25 h bis 24 h variiert wird. Die Oberflächencharakterisierung zeigt sowohl den Erfolg
aller Linkervorbehandlungen als auch der BSA- und LYS-Beschichtungen. Während für
BSA Beschichtungszeiten bis 0,5 h generell die größte Menge an Proteinen auf der
Oberfläche
aufweisen,
nimmt
für
LYS
die adsorbierte
Proteinmenge
nahezu
kontinuierlich mit der Beschichtungszeit zu. Erste elektrochemische Messungen weisen
darauf hin, dass sowohl die Linker- als auch die Proteinschichten zu einer Zunahme der
Korrosionsbeständigkeit von Magnesium in SBF führen können, wobei ein Vergleich der
Proteinschichten zeigt, dass die besten Ergebnisse für kurze Beschichtungszeiten
erreicht werden. Elektrochemische Messung in Zellkulturmedium (Dulbecco´s Modified
Eagles Medium, DMEM) bei 37°C machen deutlich, dass auch die Auslagerung im
teilweise organischen Elektrolyt zur Bildung einer Schicht führt, welche einen großen
Einfluss auf die Korrosion von Magnesium hat. Im Vergleich hierzu scheint vor allem der
Effekt von adsorbiertem BSA gering zu sein. Im Vergleich der beiden Proteine weisen
die LYS-Beschichtungen überwiegend höhere Korrosionsbeständigkeiten auf.
Um den Einfluss der in DMEM gebildeten Schichten auf die Korrosion von Magnesium
genauer zu untersuchen, wird die Passivierung von Rein-Magnesium für 1, 3 und 5 Tage
bei Raumtemperatur und im Inkubator bei 37°C vorgenommen. Durch die Zugabe von
FCS zum Medium im Inkubator wird der zusätzliche Einfluss von Proteinen auf die
Korrosionsbeständigkeit von Magnesium untersucht. Die Oberflächenanalyse zeigt, dass
sich
bei
allen
Auslagerungsparametern
hauptsächlich
amorphe
II
Calciumphosphatverbindungen ablagern, die sich in ihrem Ca/P-Verhältnis, sowie der
Schichtdicke und der Mikrostruktur unterscheiden. Die elektrochemische Analyse weist
auf eine Abhängigkeit der Korrosionsbeständigkeit vom Ca/P-Verhältnis hin. Bei der
Passivierung in DMEM + FCS wird der positive Einfluss der Proteine auf die
Magnesiumkorrosion deutlich. Eine Kombination der DMEM-Passivierung mit den
Linkermolekülbeschichtungen ist zwar möglich, führt jedoch zu keiner zusätzlichen
Steigerung der Korrosionsbeständigkeit.
Um den Einfluss der verschiedenen Linkermoleküle sowie der DMEM-Passivierung auf
die Zelladhäsion und –proliferation zu untersuchen, werden Zellversuche bis zu 20 Tage
mit zwei Zelllinien – Endothelzellen (DH1+/+) und Osteosarkomazellen (Mg63) –
durchgeführt. Im Vergleich zu reinem Magnesium weisen beide Zelllinien für alle
Linkermoleküle eine höhere anfängliche Zelladhäsion auf, die untersuchte DMEMPassivierung hingegen führt zu kaum einer Erhöhung der Zellzahl auf der Oberfläche.
Die Langzeitversuche zeigen, dass die Zellkultivierung bis zu 20 Tage sowohl auf
Reinmagnesium, als auch auf Linkermolekülbeschichtungen möglich ist. Im Vergleich zu
Magnesium weist die untersuchte Linkerschicht eine leicht verbesserte Zelladhäsion und
–proliferation sowie eine höhere Langzeitstabilität auf. Elektrochemische Messungen
zeigen den positiven Einfluss der Bedeckung der Oberfläche mit Zellen.
Im letzten Teil der Arbeit werden die Einflüsse der Messparameter Elektrolyt,
Temperatur und Fließgeschwindigkeit des Elektrolyten auf die Magnesiumkorrosion
untersucht. Während eine Temperaturerhöhung von Raumtemperatur auf 37°C die
Korrosionsbeständigkeit von Magnesium in den untersuchten Elektrolyten kaum
beeinflusst, findet ein deutlicher Anstieg des Ladungsdurchtrittswiderstandes für die
Messungen in DMEM im Vergleich zu denen in SBF statt. Es wird außerdem eine
Änderung des Korrosionsmechanismus beobachtet. Die elektrochemischen Messungen
mit fließendem Elektrolyt zeigen eine deutliche Abnahme der Korrosionsbeständigkeit im
Vergleich zum statischen Messsystem. Zudem korreliert die Korrosionsrate mit der
Fließgeschwindigkeit des Elektrolyten.
III
Abstract
For decades magnesium has been in the focus of medical technique research especially
for bio-resorbable implant materials. Besides some important properties outstanding for
biomedical application, the fast magnesium dissolution right after implantation, leading to
strong hydrogen evolution and localized alkalization, remains a problem. Besides the
development of bio-compatible alloys appropriate coatings are an approach to overcome
these back draws. The influence of proteins on metal corrosion was repeatedly reported
in the literature. For magnesium predominantly positive effects of serum proteins on the
corrosion resistance were described. It is considered that proteins adsorb on the magnesium surface and form an isolating layer.
In the present work the potential of protein layers on magnesium as possible corrosion
protection is investigated. As model proteins bovine serum albumin (BSA) and lysozyme
(LYS) are chosen. The immobilization of the proteins partially occurs via linker molecules
varying the protein coating time (0.25 h up to 24 h). The success of the linker pretreatment and the protein coatings can be shown by surface characterization. For BSA
short coating times up to 0.5 h lead to the largest amount of proteins on the surface in
contrary to LYS, for which the adsorbed amount of proteins increases with coating time.
First electrochemical measurements indicate the improvement of the corrosion resistance of magnesium in SBF by linker and protein coatings. A comparison of the different protein layers shows the best results for short coating times. Electrochemical analysis in cell culture medium (Dulbecco´s Modified Eagles Medium, DMEM) at 37°C points
out that a protective layer is built by the immersion in the partially organic electrolyte itself, leading to a significant increase in corrosion resistance. In comparison to this influence, the effect of the protein coatings is rather small, especially in the case of BSA.
Among the protein layers, LYS shows predominantly higher corrosion resistances.
In order to investigate the influence of the layers built during the immersion in DMEM,
pure magnesium is passivated in DMEM for 1, 3 and 5 days at room temperature and at
37°C in the incubator. The influence of proteins on the corrosion resistance of magnesium is elucidated by the addition of fetal calf serum (FCS) to the medium in the incubator.
Surface analysis shows the formation of calcium phosphate precipitation for all immersion parameters, differing in layer thickness, micro-structure and the Ca/P ratio. Electrochemical measurements for DMEM indicate the dependence of corrosion resistance and
Ca/P ratio. The immersion in DMEM + FCS elucidates the effect of proteins on magnesium corrosion. The combination of DMEM passivation and linker coating is possible.
However, it does not lead to a further improvement in corrosion resistance.
IV
Cell test with two different cell lines – endothelial cells (DH1+/+) and osteosarcoma cells
(Mg63) – for up to 20 days were conducted in order to investigate the influence of the
linker molecules and passivation in DMEM on the cell adhesion and proliferation behavior. Compared to pure magnesium, all linker coatings show higher initial cell adhesion.
For the DMEM passivation, however, almost no increase in cell density can be observed.
Long term experiments show that cell cultivation is possible for at least 20 days for pure
magnesium as well as for the investigated linker coating. Compared to magnesium, the
linker coating leads to a slight increase in cell density and spreading and a better longtime stability. Electrochemical measurements elucidate the positive effect of cell coverage.
In the last part of this work, the influence of the measuring parameters electrolyte, temperature and flow rate of the electrolyte on the corrosion behavior of magnesium are
investigated. Whereas the rise of temperature from room temperature to 37°C shows no
significant effect on the corrosion resistance of magnesium, the use of DMEM as electrolyte leads to a distinct increase in charge transfer resistance compared to the measurements conducted in SBF. In addition a change in corrosion mechanism can be observed.
Electrochemical measurements with flowing electrolyte indicate a decrease in corrosion
resistance compared to the static measuring system. Furthermore, the corrosion rate
shows a correlation with the flow rate.
V
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung und Motivation ................................................................................................1
2.
Theorie ............................................................................................................................6
2.1
2.1.1
Allgemeine Eigenschaften .................................................................................6
2.1.2
Korrosionsverhalten ..........................................................................................8
2.2
Albumin .................................................................................................................. 16
2.3
Lysozym ................................................................................................................. 18
2.4
Beschichtungsmechanismen .................................................................................. 20
2.4.1
Aminopropyltriethoxysilan plus Vitamin C (AV)................................................ 20
2.4.2
Carbonyldiimidazol (CDI) ................................................................................ 21
2.4.3
Stearinsäure.................................................................................................... 22
2.5
Elektrochemie ........................................................................................................ 24
2.5.1
(EIS)
Komplexer Widerstand und elektrochemische Impedanzspektroskopie
24
2.5.2
Polarisationskurven ......................................................................................... 28
2.6
3.
Magnesium ..............................................................................................................6
Oberflächenanalyse ............................................................................................... 31
2.6.1
XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy) ........................................................ 31
2.6.2
ToF-SIMS (Time of Flight Secondary Ion Mass Spectromerty) ........................ 32
Versuchsdurchführung .................................................................................................. 34
3.1
Probenpräparation ................................................................................................. 34
3.2
Beschichtung mit den Linkermolekülen .................................................................. 34
3.3
Proteinbeschichtung............................................................................................... 35
3.3.1
Beschichtung mit bovinem Serumalbumin (BSA) ............................................ 35
3.3.2
Beschichtung mit Lysozym (HEWL) ................................................................ 35
3.4
Oberflächenanalyse ............................................................................................... 36
3.4.1
Kontaktwinkel- und Oberflächenrauhigkeitsmessungen .................................. 36
3.4.2
Tof-SIMS ......................................................................................................... 37
3.4.3
XPS ................................................................................................................ 38
3.4.4
Rasterelektronenmikroskopie (REM) ............................................................... 38
3.4.5
Röntgendiffraktometrie (XRD) ......................................................................... 38
3.4.6
Fourier transformierte Infrarotspektroskopie (FTIR)......................................... 39
3.5
Elektrochemische Messungen................................................................................ 39
VI
3.5.1
Messaufbau .................................................................................................... 39
3.5.2
Elektrochemische Impedanz Spektroskopie (EIS) ........................................... 39
3.5.3
Polarisationsmessungen ................................................................................. 40
3.6
Wasserstoffmessungen ......................................................................................... 40
3.7
Verwendete Elektrolyte .......................................................................................... 41
3.7.1
Simulierte Körperflüssigkeit (engl. Simulated Body Fluid, SBF) ...................... 41
3.7.2
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium ............................................................. 42
3.8
4.
Zellversuche .......................................................................................................... 44
3.8.1
Zellkultivierung ................................................................................................ 44
3.8.2
Fixierung und Färbung .................................................................................... 45
3.8.3
Epifluoreszenzmikroskop ................................................................................ 46
3.8.4
Methoden zur Auswertung der Zellversuche ................................................... 46
Ergebnisse und Diskussion ........................................................................................... 48
4.1
Beschichtung von Magnesium mit BSA.................................................................. 48
4.1.1
Oberflächencharakterisierung der Linkermolekülbeschichtungen.................... 49
4.1.2
Oberflächeneigenschaften der Linkermolekülbeschichtung............................. 52
4.1.3
Oberflächencharakterisierung nach BSA-Beschichtung .................................. 54
4.1.4
Elektrochemie in SBF ..................................................................................... 58
4.1.5
Wasserstoffmessungen .................................................................................. 67
4.1.6
Elektrochemie in DMEM bei 37°C ................................................................... 77
4.1.7
Zwischenfazit der BSA Beschichtung .............................................................. 86
4.2
Beschichtung von Magnesium mit Lysozym (LYS) ................................................. 88
4.2.1
Oberflächencharakterisierung nach LYS-Beschichtung .................................. 88
4.2.2
Elektrochemie in DMEM bei 37°C ................................................................... 90
4.3
Vergleich der BSA- und LYS-Beschichtungen........................................................ 96
4.4
Passivierung von Magnesium in Zellkulturmedium ................................................. 99
4.4.1
Oberflächenanalyse der DMEM-Passivierungen ............................................. 99
4.4.2
Elektrochemie der DMEM-Passivierung ........................................................ 111
4.5
Kombination DMEM-Passivierung und Linkerbeschichtung ................................. 116
4.5.1
Oberflächenanalyse ...................................................................................... 116
4.5.2
Elektrochemie ............................................................................................... 117
4.6
Zellversuche ........................................................................................................ 120
4.6.1
Zelladhäsion und –proliferation nach 1 d Zellkultivierung .............................. 120
4.6.2
Zeitreihe – Endothelzellen............................................................................. 125
VII
4.6.3
Zeitreihe – Osteosarkomzellen ...................................................................... 127
4.6.4
Einfluss des Zellwachstums auf das Korrosionsverhalten von Mg ................. 131
4.7 Einfluss von Elektrolyt, Temperatur und Elektrolytbewegung auf die MgKorrosion ................................................................................................................ 134
4.7.1
Einfluss von Elektrolyt und Temperatur auf die Mg-Korrosion ....................... 134
4.7.2
Einfluss der Elektrolytbewegung auf die Mg-Korrosion .................................. 139
5.
Zusammenfassung ...................................................................................................... 143
6.
Literatur ....................................................................................................................... 147
Anhang............................................................................................................................... 154
VIII
Einleitung und Motivation
1
1. Einleitung und Motivation
Seit einigen Jahrzehnten ist der Einsatz von Magnesium als bio-resorbierbares
Implantatmaterial ein wesentlicher Bestandteil der Medizintechnikforschung. Vor allem
Schrauben und Platten zur Knochenfixation sowie kardiovaskuläre Stents zur Behandlung
von Gefäßstenosen stehen im Fokus [1]. Da das Leichtmetall ein Spurenelement im
menschlichen Körper ist, gilt es als bio-kompatibel und atoxisch [2-5]. Außerdem weist es im
Vergleich zu Polymeren und Keramiken bessere mechanische Eigenschaften auf [6, 7].
Zu den herkömmlichen metallischen Biomaterialien gehören u.a. nicht-rostende Edelstähle,
Titan- und Co-Cr-Legierungen [6, 8, 9]. Das mögliche Freisetzen von toxischen Metallionen
oder Partikeln stellt den größten Nachteil der Metallimplantate dar. Durch Abrieb oder
korrosionsbedingte Auflösung werden Metallionen frei und gelangen in das umliegende
Gewebe, was zu Entzündungen und im schlimmsten Fall zu Gewebeverlust führen kann [1014].
Ein wesentliches Problem, das im Bereich der Knochenfixation relevant ist, ist die Differenz
der E-Moduln der herkömmlichen metallischen Biomaterialien und des menschlichen
Knochens. Titan-, Co-Cr-Legierungen und nicht-rostende Edelstähle besitzen E-Moduli, die
bis zu mehr als 200 GPa über denen von Knochen liegen (vgl. Tabelle 1) [6, 15, 16].
Tabelle
1:
Zusammenstellung
einiger
Kennwerte
von
menschlichem
Knochen,
verschiedenen
metallischen und degradierbaren Implantatmaterialen [6, 8, 15-18].
Diese große Differenz kann zum sogenannten „Stress-Shielding“ führen. Durch den
wesentlich höheren E-Modul des Implantatmaterials wird die Druckbelastung durch das
Implantat umgeleitet. Das führt dazu, dass im Bereich des Implantates die Stimulation für
2
Einleitung und Motivation
das Knochenwachstum fehlt und der Knochen sich zurückbildet, was die Heilung hemmt und
in schweren Fällen eine Lockerung des Implantates nach sich ziehen kann [19-22]. Zudem
ist ein zweiter chirurgischer Eingriff nötig, um temporäre Knochenimplantate, wie Schrauben
oder Platten, nach ihrer Zweckerfüllung zu entfernen [6]. Laut des statistischen Bundesamtes
betrug im Jahr 2012 die Zahl der Operationen zur Entfernung von Osteosynthesematerial ca.
182.000. Damit liegt diese Art des chirurgischen Eingriffs unter den 15 am häufigsten
durchgeführten Operationen [23]. Im Bereich der endoluminalen Stent-Implantation tritt vor
allem das Problem der Re-Stenosen auf. Einmal implantiert, kann ein Stent nur schwer
wieder entfernt werden und bleibt so meist auch nach seiner Zweckerfüllung als
Fremdkörper im Blutgefäß zurück. Wobei das Hauptproblem darin besteht, dass durch den
Stent das Gefäßlumen im Vergleich zur gesunden Arterie verringert ist. Studien zeigten,
dass Ablagerungen im Stent Bereich häufig zu Re-Stenosen oder mechanischer Blockierung
durch Thrombosen führen [24-27].
Bio-resorbierbare Implantate stellen Lösungsansätze für die Überwindung der nachteiligen
Aspekte von herkömmlichen metallischen Implantaten für den temporären Einsatz dar. Nach
Implantation behalten sie im Idealfall ihre Stabilität über einige Wochen bis Monate, um die
Heilung des Gewebes zu garantieren (vgl. Abbildung 1). Nach Zweckerfüllung werden die
Implantate innerhalb eines bestimmten Zeitraumes vom Körper abgebaut bis sie sich
vollständig aufgelöst haben [28].
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Degradationsverhalten eines idealen bio-resorbierbaren
Stents: In den ersten Wochen bis Monaten nach der Implantation ist die Degradationsrate sehr gering, so
dass die mechanische Stabilität des Implantates gewährleistet ist, während neues gesundes Gewebe
gebildet wird. Die Dauer des vollständigen Heilungsprozesses wird auf 6-12 Monate geschätzt. Ab etwa 6
Monaten beginnt die eigentliche Degradation des Implantates, wobei nach und nach die Stabilität
abnimmt. Die Degradationsrate ist so gewählt, dass sich das Implantat innerhalb von zwei Jahren nach
Einleitung und Motivation
Implantation
vollständig
3
auflöst,
ohne
dass
jedoch
Gewebeschäden
durch
die
entstehenden
Korrosionsprodukte entstehen [28].
Wie bereits erwähnt eignen sich bio-resorbierbare Polymere, Keramiken und Gläser nur
eingeschränkt, da sie für viele Anwendungen unzureichende mechanische Festigkeit
besitzen [8]. Magnesium weist neben seiner Biokompatibilität bessere mechanische
Eigenschaften als Bio-Keramiken und –Polymere auf [17, 29]. Auch die Gefahr des „StressShielding“ ist beim Einsatz von Mg-Implantaten im Vergleich zu anderen Metallen nicht
gegeben, da der E-Modul von Magnesium mit ca. 45 GPa kaum höher ist als der von
menschlichem Knochen [6].
Die Degradation im Körper findet aufgrund der Korrosion von Magnesium in physiologischer
Umgebung statt [6]. Eine große Rolle spielen hierbei der hohe Chloridionengehalt [15] und
der gepufferte pH-Wert der Körperflüssigkeiten, sowie gegebenenfalls die Blutströmung [18,
30-32]. Magnesium wird unter Bildung von Hydroxidionen und gasförmigem Wasserstoff zu
Mg2+ oxidiert [33]. Die Hauptprobleme beim Einsatz von Magnesium als bio-resorbierbares
Implantatmaterial
stellen
die
vor
allem
anfänglich
hohe
Korrosionsrate
und
die
unkontrollierbare Auflösung dar [1]. Die Gefahr einer erhöhten Mg2+-Konzentration im Körper
während der Implantatauflösung ist zwar nicht gegeben, da das Mg2+-Gleichgewicht einem
äußerst guten Regulierungsmechanismus unterliegt. Probleme sind jedoch die hohe
Wasserstoffentwicklung und die lokale Alkalisierung im Bereich des Implantates [5, 34, 35].
Das umliegende Gewebe kann nur eine bestimmte Menge an Wasserstoff aufnehmen. Wird
diese überschritten, kann es zur Ansammlung von Wasserstoffgasblasen und zur
Schädigung des Gewebes kommen [31]. Im Blut kann eine zu große Menge an gasförmigem
Wasserstoff im schlimmsten Fall zur Unterbrechung des Blutkreislaufes führen [5]. Auch die
lokale Alkalisierung durch die bei der Mg-Korrosion entstehenden OH- -Ionen kann pHabhängige Reaktionen im Körper behindern [5]. Daher gilt es vor allem die anfängliche
Korrosionsrate von Magnesium herabzusetzen, um eine ausreichend andauernde Stabilität
des Implantates zu gewährleisten und die Wasserstoffentwicklung sowie die Alkalisierung in
einem tolerierbaren Bereich zu halten [18]. Hierfür gibt es verschiedene Ansätze. Zum einen
wird durch das Zu-Legieren von geeigneten Elementen versucht sowohl die mechanischen
Eigenschaften, als auch die Korrosionsbeständigkeit von Magnesium zu verbessern. Zum
anderen besteht der Ansatz, vor allem die anfängliche Korrosion mittels bio-kompatibler
Beschichtungen zu reduzieren [1, 5]. Die Schwierigkeit bei der Entwicklung von
Magnesiumlegierungen für den Einsatz im menschlichen Körper besteht hauptsächlich in der
Auswahl geeigneter Legierungselemente. Im Vergleich zu Magnesium besitzen die meisten
Metalle, die eine Verbesserung der Korrosionseigenschaften bewirken, eingeschränkte
Biokompatibilität. So wirken viele Metalle bereits in geringen Mengen toxisch und stehen im
Verdacht Auslöser für verschiedene Erkrankungen zu sein [5, 35]. Bei der Beschichtung von
4
Einleitung und Motivation
Magnesium bestehen ähnliche Schwierigkeiten. Voraussetzung der Schichten ist eine gute
Biokompatibilität und eine gute anfängliche Korrosionsbeständigkeit. Wobei die Problematik
darin besteht, dass die Schicht weder zu beständig noch zu unbeständig gegenüber
korrosiven Angriffen ist, damit eine optimale Stabilität sowie Resorption gewährleistet ist [1].
Als Legierungselemente kommen derzeit hauptsächlich Aluminium und Zink (z.B. AZ91,
AZ31), sowie Seltene Erden (z.B. WE43, LAE442) zum Einsatz und werden teilweise bereits
in klinischen Studien erforscht [17, 27]. Außerdem wird auch Calcium als Legierungselement
für biokompatible Magnesiumlegierungen in Betracht gezogen [15, 36, 37]. Im Fokus der
Beschichtung
von
Magnesium
für
Implantatanwendungen
stehen
vor
allem
Calciumphosphat- sowie verschiedene organische Schichten [1].
Eine weitere mögliche biokompatible Beschichtung stellen Proteine dar. Bei der in vivo
Korrosion spielen Proteine und organische Moleküle eine wichtige Rolle. Kommt ein
Implantat mit physiologischer Umgebung in Berührung, erfolgt als einer der ersten Schritte,
innerhalb weniger Sekunden, die Adsorption von Proteinen auf der Implantatoberfläche [38].
Je nach Art des verwendeten Werkstoffes, Art der adsorbierten Proteine und deren
Wechselwirkung mit der Oberfläche und dem Umgebungsmedium, kann die Korrosion eines
Implantates beschleunigt oder reduziert werden [9, 39-42]. Für Magnesium wird ein positiver
Effekt
von
Proteinen
auf
die
Korrosionsbeständigkeit
beschrieben.
Verschiedene
Untersuchungen zeigen, dass die Zugabe von BSA (bovines Serumalbumin) zum
Testelektrolyt eine Abnahme der Korrosionsrate zur Folge hat. Die positive Wirkung von BSA
auf die Magnesiumkorrosion wird dabei auf die Adsorption des Proteins auf der MgOberfläche und die damit verbundene isolierende Wirkung zurückgeführt [15, 35, 43].
Diese Kenntnisse über die Adsorption von BSA und die damit verbundene Verbesserung der
Korrosionseigenschaften von Magnesium werden in der vorliegenden Arbeit genutzt, um
gezielt Proteinschichten als biokompatiblen Korrosionsschutz auf die Mg-Oberfläche
aufzubringen. Zum Einsatz kommt in erster Linie das Modellprotein BSA sowie Lysozym. Da
angenommen wird, dass Proteine auf einer unbehandelten Mg bzw. Mg(OH) 2 Oberfläche
hauptsächlich physisorbieren und keine kovalenten Bindungen bilden, kommen in dieser
Arbeit unter anderem Linkermoleküle für die Anbindung von BSA zum Einsatz, die für die
dauerhafte Proteinimmobilisierung auf anderen Metallen bereits erfolgreich verwendet
werden. Neben Aminopropyltriethoxysilan + Ascorbinsäure (AV) und Carbonyldiimidazol
(CDI)
wurde
Stearinsäure
Linkermolekülbeschichtungen
(SA)
als
auch
als
die
Linker
ausgewählt.
Proteinschichten
Sowohl
werden
die
hinsichtlich
Beschichtungserfolg, Qualität und Quantität der adsorbierten Spezies oberflächenanalytisch
charakterisiert. Um den Einfluss der verschiedenen Schichten auf die Korrosion von
Magnesium zu ermitteln, werden elektrochemische Messungen durchgeführt. Zusätzlich wird
die Wasserstoffentwicklung gemessen. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Passivierung von
Einleitung und Motivation
5
Magnesium in Zellkulturmedium untersucht. Hierfür wird Magnesium für verschiedene Zeiten
und unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen in Dulbecco´s Modified Eagles
Medium (DMEM) ausgelagert. Die gebildeten Passivschichten werden hinsichtlich ihrer
Schichtdicke, Porosität und Zusammensetzung analysiert. Die Charakterisierung hinsichtlich
des Einflusses der gebildeten Schichten auf die Magnesiumkorrosion wird mittels
elektrochemischen Messungen vorgenommen. Um den Einfluss der verschiedenen LinkerBeschichtungen sowie der DMEM-Passivierung auf Zelladhäsion und –proliferation zu
untersuchen, werden Kurz- und Langzeit-Versuche mit zwei verschiedenen Zellreihen
durchgeführt.
Des
Weiteren
wird
untersucht,
Korrosionsverhalten von Magnesium beeinflusst.
inwiefern
die
Zelladhäsion
das
6
Theorie
2. Theorie
In der vorliegenden Arbeit wird die Oberflächenfunktionalisierung und Beschichtung von
reinem Magnesium (99,9 %) mit Proteinen vorgenommen. Neben den allgemeinen
Eigenschaften von Magnesium und dem Korrosionsmechanismus in vitro und in vivo, werden
im folgenden Kapitel die Anbindungsmechanismen der verwendeten Linkermoleküle, die
Eigenschaften der verwendeten Proteine und die Hauptcharakterisierungsmethoden näher
beleuchtet.
2.1
Magnesium
2.1.1 Allgemeine Eigenschaften
Magnesium ist ein Element der II. Hauptgruppe des Periodensystems. Mit einer Dichte von
1,74 g/cm³ zählt es zu den Leichtmetallen und ist das leichteste, das großindustriell
verfügbar ist. Magnesium macht ca. 1,95 gew% der Erdrinde aus und kommt aufgrund seiner
hohen Reaktivität ausschließlich in gebundener Form, z.B. als Carbonat-, Silicat- und
Sulfatverbindungen oder in gelöster Form (Meerwasser: 1,3 g/l) vor. Reines Magnesium
weist
bei
Raumtemperatur
eine
hexagonale
Kristallstruktur
auf,
die
auch
bei
Temperaturerhöhung keinen Modifikationswechsel durchläuft. Der Schmelzpunkt liegt im
Vergleich zu andern Metallen mit 650°C relativ niedrig [44].
Die geringe Dichte und die hexagonale Kristallstruktur verleihen Magnesium ein sehr gutes
Festigkeit/Gewichts- Verhältnis, was es für verschiedene Anwendungen in der Technik
interessant macht. Zudem besitzt Magnesium eine gute thermische Leitfähigkeit und ist sehr
gut
rezyklierbar.
Allerdings sind die Verschleißeigenschaften von Reinmagnesium
unzureichend, da es im Vergleich zu anderen Metallen relativ weich ist. Der jedoch größte
Nachteil von Magnesium ist seine hohe chemische Reaktivität. In Kontakt mit wässrigen oder
Chlorid haltigen Lösungen werden unmittelbar Mg-Verbindungen wie z.B. Mg(OH)2 oder
MgCl2 gebildet. Die sich ausbildenden Passivschichten auf Magnesium sind porös und
besitzen schlechte Korrosionseigenschaften. Tabelle 2 fasst einige charakteristische
Kennwerte von Magnesium zusammen [44-46].
Theorie
7
Tabelle 2: Einige Kennwerte von Magnesium
Vor allem aufgrund der geringeren Festigkeit im Vergleich zu anderen Metallen und der
problematischen Korrosionseigenschaften in aggressiven Medien (siehe Kap. 2.1.2), besitzt
reines Magnesium derzeit eine geringe technische Bedeutung. Anwendung findet es als
Reduktionsmittel bei der Gewinnung anderer Metalle wie z.B. Chrom, Kupfer oder Titan, der
Entschwefelung von Stahl und als Legierungselement in Aluminiumlegierungen [44]. Von
Relevanz
für
den
industriellen
Einsatz
ist
hingegen
derzeit
eine
Vielzahl
an
Magnesiumlegierungen. Hierbei spielen vor allem Mg-Al-Legierungen eine wichtige Rolle.
Weitere wichtige Legierungselemente sind Mangan, Zink, Silber, Kupfer und die SeltenerdElemente [47]. Mg-Legierungen kommen vor allem unter dem Aspekt der Gewichtsreduktion
in der Automobil- und der Luftfahrtindustrie zum Einsatz. Ein weiterer viel versprechender
Bereich ist die Medizintechnik. Hier werden derzeit sowohl reines Magnesium, als auch
einige Magnesiumlegierungen als Material für bioresorbierbare Implantate erforscht [44, 48].
Aufgrund seiner hohen Biokompatibilität, eignet sich Magnesium generell gut als
Implantatmaterial. Da Magnesium im menschlichen Körper als Spurenelement im Blut und in
verschiedenen Geweben vorhanden ist, kann es auch in größeren Mengen als nicht toxisch
eingeschätzt werden. Die Hälfte des sich im Körper befindlichen Magnesiums liegt im
Knochengewebe vor [6]. Im Blutserum, sowie in anderen extrazellulären Flüssigkeiten ist
Mg2+ mit einer Konzentration von 0,75-1,10 mmol/l vorhanden [49]. Neben Funktionen bei der
Knochenbildung und beim Muskelstoffwechsel, ist Magnesium ein Co-Faktor für viele
Enzyme und dient als Stabilisator für DNA und RNA [44]. Die Regulierung des
Magnesiumgehaltes im Körper findet über Niere und Darm statt. Die Gefahr einer Erhöhung
des Magnesiumspiegels im Blut, z.B. durch die Nahrungsaufnahme oder auch durch die
Degradation eines Mg-Implantates, wird als äußerst gering eingeschätzt, da das Mg2+-
8
Theorie
Gleichgewicht vom Körper sehr gut reguliert werden kann und überschüssiges Magnesium
ausgeschieden wird [2, 3, 6, 32].
2.1.2 Korrosionsverhalten
Korrosionsmechanismus
Die Magnesiumkorrosion kann als Redox-Reaktion, bestehend aus zwei Teilreaktionen,
dargestellt werden. In wässrigen Lösungen findet eine Oxidation von Magnesium statt, wobei
Metallionen in Lösung gehen. Gleichzeitig werden Protonen, die aufgrund der Dissoziation
von Wasser vorhanden sind, zu Wasserstoffgas reduziert. Die zugehörigen Reaktionen sind
in den Gleichungen 1-4 dargestellt [33, 35].
𝑴𝒈 → 𝑴𝒈𝟐+ + 𝟐𝒆−
Gl. 1
𝟐𝑯𝟐 𝑶 + 𝟐𝒆− → 𝑯𝟐 + 𝟐𝑶𝑯−
Gl. 2
Schichtbildung:
𝑴𝒈𝟐+ + 𝟐𝑶𝑯− → 𝑴𝒈(𝑶𝑯)𝟐
Gl. 3
Gesamtreaktion:
𝑴𝒈 + 𝟐𝑯𝟐 𝑶 → 𝑴𝒈(𝑶𝑯)𝟐 + 𝑯𝟐
Gl. 4
Anodische Teilreaktion:
Kathodische Teilreaktion:
Bildung und Stabilität von Magnesiumoxid bzw. –hydroxid
Gleichung 3 zeigt die Schichtbildungsreaktion, bei der aus den Mg2+-Ionen und den
entstandenen Hydroxid-Ionen Magnesiumhydroxid (Mg(OH)2) gebildet wird. Diese Reaktion
findet jedoch erst ab einem pH-Wert von ca. 8,5 statt, wobei Mg(OH)2 erst ab pH 11
thermodynamisch stabil ist (vgl. Pourbaix-Diagramm, Abbildung 2) [50]. Bei pH-Werten, die
unterhalb von 8,5 liegen, ist Mg(OH)2 in Wasser löslich und die Schichtbildungsreaktion kann
nicht stattfinden. Allerdings kommt es durch die Mg-Auflösung zu einer pH-Wert-Erhöhung,
vor allem an der Magnesiumoberfläche, bedingt durch die Bildung von OH--Ionen bei der
Wasserstoffreduktion (vgl. Gl. 2). Somit kann auch in ungepufferten sauren und neutralen
Medien rasch ein Oberflächen-pH-Wert von 9 bis 11 erreicht werden. In gewissem Maße gilt
die Magnesiumkorrosion daher als selbstlimitierend [33].
Theorie
Abbildung
9
2:
Pourbaix-Diagramm
von
Magnesium
(nach
M.
Pourbaix)[50].
Darstellung
der
thermodynamisch stabilen Spezies in Abhängigkeit vom Potential und vom pH-Wert bei 25°C in wässriger
Lösung. Bei pH-Werten unterhalb 8,5 und Potentialen positiver als -2,37 findet Magnesium-Auflösung
statt. Ab einem pH-Wert von 8,5 bildet sich Magnesiumhydroxid
Bei trockenen Umgebungsbedingungen, vorzugsweise an Luft, wird eine MagnesiumoxidSchicht (MgO) gebildet. Aufgrund der höheren thermodynamischen Stabilität von Mg(OH)2 in
wässrigen Lösungen, wird jedoch die MgO-Schicht in feuchter oder wässriger Umgebung zu
Mg(OH)2 umgewandelt [46, 51]. Da in der Normalatmosphäre immer eine gewisse
Luftfeuchtigkeit vorhanden ist, kann davon ausgegangen werden, dass die äußeren Bereiche
der gebildeten Schicht auch an Luft immer aus Mg(OH)2 bestehen [1, 52, 53]. Sowohl MgO
als auch Mg(OH)2 weisen ein Pilling-Bedworth-Verhältnis kleiner 1 auf. Das bedeutet, dass
das jeweilige Oxidvolumen kleiner als das Metallvolumen ist, was dazu führt, dass sich keine
kompakte Oxidschicht ausbilden kann. Sie ist porös und reißt, bedingt durch auftretende
Zugkräfte, auf. Dadurch schützt die gebildete Schicht das darunter liegende Magnesium nur
bedingt [46].
10
Theorie
Korrosionsbeständikeit von Magnesium in verschiedenen Umgebungen
Gegen atmosphärische Korrosion ist Magnesium in den meisten Umgebungen dennoch
verhältnismäßig resistent. Bedingt durch in der Luft vorhandenes Kohlenstoffdioxid (CO 2)
entsteht Magnesiumcarbonat, welches die Zwischenräume in der porösen MgO- bzw.
Mg(OH)2-Schicht füllt und somit eine kompakte Oxidschicht ausbilden kann [33] So besitzt
Magnesium z.B. besseren Schutz gegen atmosphärische Korrosion als niedergekohlte
Stähle. In stark alkalischen Medien (pH > 11) verhält sich Magnesium passiv. Auch in Säuren
weist Magnesium z.B. stabileres Korrosionsverhalten als Aluminium, aufgrund der Erhöhung
des Oberflächen-pH-Wertes, auf [46]. Vor allem in Flusssäure (HF) zeigt Magnesium im
Vergleich zu vielen anderen Metallen hohe Beständigkeit. Diese liegt in der Bildung einer
Magnesiumfluorid-Schicht (MgF2) begründet, welche in HF unlöslich ist [33].
Tabelle 3: Auflistung der Standardpotentiale einiger Metallionen- und Gaselektroden gemessen gegen die
Normalwasserstoffelektrode (NHE) bei 25°C.
In
neutralen
und
vor
allem
zusätzlich
gepufferten
Medien
stehen
die
Korrosionseigenschaften von Magnesium denen der meisten anderen Metalle jedoch nach.
Dies gilt vor allem bei Kontakt mit aggressiven Elektrolyten, wie z.B. Chlorid-haltigen
wässrigen Lösungen, welche von großer technischer Relevanz sind [6, 48]. Ab einer
genügend großen Cl--Konzentration (30 mmol/l) wird vorwiegend Magnesiumchlorid (MgCl2)
gebildet bzw. Mg(OH)2 in Magnesiumchlorid umgewandelt (vgl. Gleichung 5), welches eine
hohe Löslichkeit in Wasser aufweist [6, 33].
Theorie
11
𝑴𝒈(𝑶𝑯)𝟐 + 𝟐𝑪𝒍− → 𝑴𝒈𝑪𝒍𝟐 + 𝑶𝑯−
Gl. 5
Dies bedeutet, dass sich keine Mg(OH)2-Schicht bilden kann oder eine bereits vorhandene
Mg(OH)2-Schicht zerstört wird [15]. Zudem ist Magnesium sehr anfällig für mikro- und
makrogalvanische Korrosion, was in der Spannungsreihe der Metalle begründet liegt (vgl.
Tabelle 3). Mit einem Standard-Elektroden-Potential von -2,37 Vnhe (reines Mg in Kontakt mit
einer Lösung, die Mg2+-Ionen enthält, gemessen gegen die Wasserstoffnormalelektrode bei
25°C) ist Mg der unedelste Konstruktionswerkstoff. In Kontakt mit edleren Metallen wird die
Mg-Auflösung begünstigt, wohingegen das Kontaktmetall geschützt wird. Besonders
Verunreinigungen im Magnesium, die im Herstellungsprozess kaum zu vermeiden sind,
können so zu starker Korrosion führen [51].
Der Negative-Differenz-Effekt
Für die meisten Metalle und Legierungen korreliert ein durch Potential- bzw. Stromerhöhung
hervorgerufener Anstieg der anodischen Metallauflösung mit einer Abnahme der
kathodischen Reduktionsreaktion. Der Verlauf des zu erwartenden anodischen bzw.
kathodischen Stroms ist in Abbildung 3 durch die beiden Geraden Ia und Ik dargestellt, da
angenommen wird, dass die Teilreaktionen durch die Tafel-Kinetik bestimmt werden. Der
Schnittpunkt der Tafelgeraden bestimmt die Werte des Korrosionsstroms (I0) und des
zugehörigen Korrosions- oder Ruhepotentials (Ekorr). Dieses Verhalten entsprechend der
Tafel-Kinetik trifft beispielsweise auf Eisen, Stahl und Kupfer zu. Bei Magnesium tritt hier
jedoch eine Besonderheit auf. Mit einer Erhöhung des Potentials oder der Stromdichte nimmt
sowohl die anodische als auch die kathodische Reaktionsrate zu. Zudem ist die Rate der
Metallauflösung bei anodischer Polarisation deutlich höher als erwartet. Die experimentell
ermittelte
Magnesium-Auflösung
entspricht
in
Abbildung
3
der
mit
IMg,
die
Wasserstoffentwicklungsrate der mit IH gekennzeichneten Kurve.
Aus Abbildung 3 wird ersichtlich, dass bei einem angelegten Potential, welches positiver als
Ekorr ist, die gemessene H2-Entwicklung (IH,m) die erwartete H2-Entwicklung (IH,e) übersteigt.
Zudem nimmt die gemessene Magnesiumauflösung (IMg,m) einen höheren Wert an als die
erwartete (IMg,e). Das bedeutet, es findet eine unerwartet hohe H2-Entwicklung statt. Zudem
weicht der gemessene gravimetrische Masseverlust vom elektrochemischen Masseverlust,
berechnet nach dem Faraday’schen Gesetz, ab.
12
Abbildung
Theorie
3:
Schematische
Darstellung
des
Negative-Differenz-Effektes
(NDE)
bei
der
Magnesiumkorrosion anhand eines Stromdichte-Potential-Diagrammes. Die Geraden Ia und Ik stellen den
Verlauf der erwarteten Stromdichten für die anodsiche und kathodische Teilreaktion dar. Die Kurven I Mg
und IH stellen die experimentell ermittelten Stromdichten für die Magnesiumauflösung bzw. für die
Wasserstoffreduktion dar. Bei einem angelegten Potential das positiver als das Korrosionspotential E korr
ist, übersteigen die gemessenen Stromdichten (IMg,m bzw. IH,m) die erwarteten Stromdichten (IMg,e bzw.
IH,e)[48, 51].
Dieses Phänomen wird Negative-Differenz-Effekt (NDE) genannt und ist bei reinem
Magnesium und einigen Mg-Legierungen bekannt. Per Definition wird vom NDE gesprochen,
wenn die in Gleichung 6 gegebene Differenz bei anodischer Polarisation einen negativen
Wert annimmt [46, 51, 54, 55].
∆= 𝑰𝟎 − 𝑰𝑯,𝒎
Gl. 6
Die Ursache des NDE ist nicht völlig geklärt, jedoch gibt es hierfür etliche Theorien. Bereits
1954 betrachtete Brouillet die Möglichkeit der Existenz des monovalenten Magnesiumions
(Mg+), welches mit Protonen bzw. Hydroniumionen zu Mg2+ und H2 reagiert [56].
Theorie
13
𝑴𝒈 → 𝑴𝒈+ + 𝒆−
Gl. 7
𝟐𝑴𝒈+ + 𝟐𝑯+ → 𝟐𝑴𝒈𝟐+ + 𝑯𝟐
Gl. 8
Diese Theorie erklärt zum einen die erhöhte H2-Entwicklung, da die Wasserstoffreduktion wie
in Gleichung 8 dargestellt zusätzlich zur kathodischen Reduktionsreaktion abläuft. Zum
anderen kann auch die höhere Metallauflösungsrate auf die Existenz eines monovalenten
Magnesiumions zurückgeführt werden. Für die Berechnung des Masseverlustes mithilfe des
Faraday´schen
Gesetzes
wird
angenommen,
dass
zwei
Elektronen
an
der
elektrochemischen Reaktion beteiligt sind. Laut der obigen Theorie wird Mg elektrochemisch
jedoch vorwiegend zu Mg+ (vgl. Gleichung 7) umgesetzt und nur ein Elektron ist an der
elektrochemischen Reaktion beteiligt. Die weitere Oxidation zu Mg 2+ erfolgt als chemische
Reaktion [48]. Beweise für die Existenz des Mg+-Ions konnten bislang jedoch nicht erbracht
werden [57]. Song und Atrens [51] fassen neben der Existenz des monovalenten
Magnesiumions weitere Theorien zusammen, die dem NDE zugrunde liegen könnten. Dazu
gehört das Modell der potentialabhängigen Oxidschicht auf Magnesium. Es wird davon
ausgegangen, dass Magnesium von einer Schicht, bestehend aus MgO und Mg(OH)2,
bedeckt ist. Des Weiteren wird angenommen, dass bei Erhöhung der Spannung bzw. der
Stromdichte im anodischen Bereich der Bedeckungsgrad dieser Passivschicht auf
Magnesium abnimmt. Ein weiteres Model ist die Unterhöhlung von Partikeln. Grundlage
dieser
Theorie
sind
Verunreinigungen
im
Magnesium
oder
Sekundärphasen
bei
Legierungen, die als punktuelle Kathoden wirken. An den Phasengrenzen findet so vermehrt
Korrosion
der
Magnesiummatrix
statt
und
es
kommt
zur
Unterhöhlung
der
Verunreinigungsausscheidungen bzw. der Sekundärphasen, bis diese bei hohen Potentialen
bzw. hohen Stromdichten aus der Oberfläche herausfallen. Das letzte bei Song und Atrens
erwähnte Modell beruft sich auf die Bildung von Magnesiumhydrid (MgH2) auf der MgOberfläche. MgH2 ist in Wasser sehr reaktiv und zerfällt in Mg 2+ und H2. Auch hier wird
zusätzlich zur kathodischen Reduktionsreaktion Wasserstoff gebildet [51].
Jede der beschriebenen Theorien weist Schwachstellen auf. Meist kann mit einem Modell
lediglich eines der am NDE beteiligten Phänomene erklärt werden. Song und Atrens
schlagen daher die Kombination des Modells der potentialabhängigen Oxidschicht mit dem
Modell der Existenz des monovalenten Magnesiumions vor: Bei sehr negativen Potentialen
ist die Passivschicht auf Magnesium intakt und die anodische Magnesiumauflösung ist
nahezu Null. Die kathodische Wasserstoffentwicklung kann stattfinden und nimmt mit einer
Potentialerhöhung zunächst ab (vlg. Abbildung 3), bis das Lochfraß-Potential (EL) erreicht
wird, welches bei Mg noch unterhalb Ekorr liegt. Bei Überschreitung von EL beginnt die
partielle Zerstörung der Oxidschicht. Bei weiterer Erhöhung des Potentials bzw. der
Stromdichte wächst die dem Elektrolyten ausgesetzte Magnesiumoberfläche stetig. Dies
14
Theorie
bedeutet einen Anstieg der Magnesiumkorrosion, wobei der Korrosionsmechanismus, dem
die Bildung des monovalenten Magnesiumions zugrunde liegt (vgl. Gleichungen 7 und 8),
angenommen wird [48, 51].
Eine alternative Erklärung des NDE geben Williams et al. [57]. Es wird beschrieben, dass es
bei anodischer Polarisation zum lokalen Durchbruch der Passivschicht kommt, wobei dunkle
Stellen auf der hellen, schichtbedeckten Oberfläche entstehen. Diese Bereiche stellen
zunächst starke lokale Anoden dar. Bei weiterer Potential- bzw. Stromdichteerhöhung oder
bei konstant angelegtem Strom über längere Zeit, breiten sich die anfänglich punktförmigen
dunklen Stellen aus. Bei hp Magnesium (high purity) bilden sich filiform-ähnliche
(wurmartige) Bereiche, bei cp Magnesium (commercially pure) kreisförmige. Es zeigt sich,
dass diese Bereiche lokale Kathoden darstellen, wobei lediglich die Ausbreitungsfront
anodisch ist. Trotz anodischer
Polarisation bleibt
die Wasserstoffentwicklung
ein
kathodischer Prozess. Mit zunehmendem Potential bzw. zunehmender Stromdichte
vergrößern sich so die kathodischen Bereiche auf der Oberfläche.
In vivo Korrosion von Magnesium
Die in-vivo Korrosion von Magnesium unterscheidet sich deutlich von der in-vitro
stattfindenden Korrosion. Einflussgrößen auf die Magnesiumkorrosion in physiologischer
Umgebung sind neben dem pH-Wert und der hohe Chloridionenkonzentration vor allem das
Vorhandensein von organischen Molekülen (z.B. Proteinen) und Zellen.
Die pH-Werte für menschliches Blut, interstitielle (= Zellzwischenräume) sowie intrazelluläre
(= innerhalb der Zelle) Bereiche betragen 7,15-7,4, 7,0 bzw. 6,8 [35]. Hinzu kommt, dass die
Körperflüssigkeiten gepuffert sind und nach Implantation häufig eine lokale Absenkung des
pH-Wertes beobachtet wird. Diese wird durch Entzündungen des umliegenden Gewebes
verursacht, das durch den chirurgischen Eingriff verletzt wird [17]. Wie oben beschrieben, ist
die Korrosionsrate von Magnesium in sauren bis leicht basischen, gepufferten Medien sehr
hoch, da keine oder lediglich eine langsame Erhöhung des Oberflächen-pH-Wertes von
Magnesium stattfindet und keine stabile Mg(OH)2-Schicht gebildet werden kann [6, 48]. Die
Cl- -Konzentration von bis zu 150 mmol/l je nach Einsatzbereich im Körper liegt weit über
dem Grenzwert von 30 mmol/l, ab dem sich Mg(OH)2 zu MgCl2 umwandelt. Eine vorhandene
Mg(OH)2-Schicht wird durch den hohen Cl--Gehalt partiell zerstört und auch die Neubildung
von Mg(OH)2, die durch den Korrosionsmechanismus von Magnesium beding ist, wird
verhindert. Es kommt zu einem erhöhten, vor allem lokalen Angriff des Implantatmaterials
[15]. Ein weiterer Aspekt, der die Magnesiumauflösung begünstigt, ist die vor allen im Blut
vorhandene Strömung. Korrosionsprodukte (z.B. Mg(OH)2) werden laufend abtransportiert,
was die Bildung einer Schutzschicht zusätzlich erschwert [31, 32]. Die Selbstlimitierung der
Magnesiumkorrosion ist somit nicht gegeben und eine hohe anfängliche Korrosionsrate
Theorie
eines
15
Magnesiumimplantates
wird
erwartet.
Verbunden
hiermit
ist
eine
hohe
Wasserstoffentwicklung [35]. Die Absorption von H2 in unmittelbarer Nähe des Implantates
hängt zum einen von der Löslichkeit und vom Diffusionskoeffizienten des Gases im
jeweiligen Gewebe bzw. Medium ab. Zum anderen haben die Blutströmung im Gewebe und
dessen Wassergehalt großen Einfluss auf die Wasserstoffaufnahme. Je höher Blutfluss,
Wassergehalt, H2-Löslichkeit und H2-Diffusionskoeffizient im Gewebe, desto größer ist die
Menge an Wasserstoff, die absorbiert werden kann [15]. Song [5] nimmt an, dass jedoch
lediglich eine H2 Menge von maximal 0,01 ml/cm2/d tolerierbar ist [17]. Im Fall von
Knochenimplantaten bilden sich bei höherer Wasserstoffentwicklung – wie es bei
Verwendung von cp-Mg in der ersten post-operativen Woche der Fall ist – Ansammlungen
von Gasblasen. Diese können den Heilungsprozess verzögern und zu Gewebsnekrosen und
somit zur Instabilität des Implantates führen. Im Fall von Stents besteht bei extremer
Wasserstoffentwicklung das Risiko der Bildung großer Gasblasen, die den Blutkreislauf
unterbrechen können und im schlimmsten Fall zum Tod des Patienten führen [5]. Ein
weiteres Problem bei der in-vivo Korrosion von Magnesium ist die Alkalisierung, die durch
die Bildung von Hydroxid-Ionen bei der Wasserstoffreduktion (vgl. Gleichung 2) verursacht
wird. Bereits eine leichte lokale Erhöhung des physiologischen pH-Wertes (pH > 7,8) bringt
Störungen der pH-abhängigen physiologischen Reaktionsgleichgewichte mit sich und kann
zu einer alkalischen Vergiftung führen [5]. Auch die Zellanbindung und das Zellwachstum auf
der Implantatoberfläche kann durch Erhöhung des physiologischen pH-Wertes negativ
beeinflusst werden [58].
Positiven Einfluss auf die Magnesiumkorrosion hingegen können Proteine haben. Versuche,
bei denen Albumin zum jeweiligen Testmedium gegeben wurde, zeigten, dass die Auflösung
von
Magnesium
deutlich
abnahm.
Es
wird
vermutet,
dass
Albumin
auf
der
Magnesiumoberfläche adsorbiert und eine Schicht bildet, die die Korrosion verlangsamt. Die
Korrosionshemmung basiert möglicherweise auf der Tatsache, dass die Proteine isolierend
wirken und das Magnesiumsubstrat so vor der Umgebung abschirmen [15, 35]. Auch Zellen
können die Korrosion von Magnesium beeinflussen. Seuss et al. [58] beschreiben, dass die
Adhäsion von Zellen auf der Oberfläche eine Herabsetzung der Korrosionsrate von
Magnesium bewirken kann.
Vor allem der Einfluss der organischen Bestandteile ist ein Grund für die Schwierigkeiten der
experimentellen Simulation der in-vivo Korrosion von Magnesium. Selbst eine hohe
Anpassung der in-vitro Bedingungen an die physiologische Umgebung führt nicht zu einer
100 %-igen Übertragbarkeit der experimentellen Ergebnisse auf die Korrosionsvorgänge in
vivo. Weiterführende Ansätze sind Tierversuche sowie in einem fortgeschrittenen Stadium
der Forschung klinische Studien [17, 27, 59-62].
16
Theorie
2.2
Albumin
Albumin wird in dieser Arbeit als Modellprotein gewählt, da es hinreichend erforscht und in
hoher Konzentration im Körper vorhanden ist [9, 63]. Generell wird im Laborbereich
hauptsächlich bovines Serumalbumin (BSA) verwendet, da es sich in seinen Eigenschaften
und im Aufbau lediglich in geringem Maße von humanem Serumalbumin (HSA)
unterscheidet, jedoch deutlich kostengünstiger ist [64, 65].
Albumin ist ein globuläres Protein, das vorwiegend im Blutplasma von Menschen, vielen
Säugetieren, Vögeln und Reptilien vorkommt. Mit etwa 60 wt% macht Albumin den größten
Anteil der Plasmaproteine beim Menschen aus. Unabhängig von Alter und Geschlecht, liegt
die normale Konzentration im Blut zwischen 35-52 g/l. Hauptaufgabe von Albumin ist neben
der Bindung zahlreicher Liganden, die Aufrechterhaltung des osmo-kolloidalen Druckes und
die Pufferung im Blut [49, 66].
Albumin ist aus einer einzigen zusammenhängenden Peptidkette, bestehend aus einer
Sequenz von 585 Aminosäureresten, aufgebaut (siehe Tabelle 4) [67]. Die Molekülmasse
beträgt ca. 66.500 Da [68].
Tabelle 4: Zusammensetzung von humanem und bovinem Serumalbumin (HSA, BSA). Auflistung der an
der Zusammensetzung beteiligten 20 Aminosäuren und deren prozentualer Anteil in HSA und BSA [6971].
35 Cysteinreste bilden 17 Disulfidbrücken, welche maßgeblich für die Sekundärstruktur
verantwortlich sind. Insgesamt bildet die Peptidkette neun Schlaufen, die sich in drei
homologe Bereiche gliedern. Trotz der ähnlichen Anordnung hat jeder der drei Bereiche
unterschiedliche Ligandenbindungsfunktionen.
Theorie
17
Bei der Tertiärstruktur muss zwischen der kristallinen Form und der gelösten Form
unterschieden werden. Kristallines Albumin wird als herzförmig oder dreieckig (vgl.
Abbildung 4) beschrieben (Seitenlänge: ca. 80 Å, Dicke: ca. 30 Å), wohingegen gelöstes
Albumin nach hydrodynamischen Studien eine ellipsoide Form annimmt (40 x 140 Å) [68].
Abbildung 4: Schematische Darstellung von Albumin; a) kristallin: herzförmig; b) gelöst: elliptische Form
[72].
Zur Charakterisierung von Proteinen mittels XPS und ToF-SIMS ist vor allem der typisch
hohe Stickstoffgehalt ausschlaggebend. Bei Albumin beträgt dieser ca. 16 %. Außerdem
weist Albumin eine hohe Flexibilität und eine gute Resistenz gegenüber extremen
Bedingungen auf. Albumin besitzt eine hohe Anzahl an ionischen Restgruppen, was zu einer
hohen Gesamtladung des Proteins führt. Der isoelektrische Punkt (IEP) von BSA, bei dem
das Protein nach außen hin neutral ist, die positiven und negativen Ladungen sich also
ausgleichen, liegt bei einem pH-Wert von ca. 5. Bei pH-Werten, die unterhalb des IEP liegen,
nimmt die Dissoziation der sauren Carboxylgruppen ab und die Summenladung ist positiv.
pH-Werte, die höher liegen als der IEP führen zu einer Zunahme der Dissoziation der sauren
Carboxylgruppen
und
zu
einer
Abgabe
des Wasserstoffatoms,
welches
an
die
Aminogruppen gebunden ist. Damit kommt es zu einer negativen Gesamtladung. Bei
physiologischem pH (pH ~ 7) liegen 185 Ionen pro Molekül vor, wobei die sauren
Aminosäuren überwiegen und eine negative Nettoladung resultiert. Aufgrund seiner
negativen Gesamtladung in physiologischer Umgebung ist BSA sehr hydrophil und löst sich
daher gut in wässrigen neutralen bis alkalischen Medien [68].
18
Theorie
2.3
Lysozym
Neben BSA wird in dieser Arbeit Lysozym als weiteres Modellprotein verwendet. Als
Lysozyme werden Proteine bezeichnet, welche lytisch auf eine Suspension des Bakteriums
Micrococcus lysodeikticus wirken. Daher werden sie auch als anti-bakteriell bezeichnet. Sie
kommen u.a. in Tränenflüssigkeit und Sekreten des Verdauungstraktes vor. Lysozyme sind
in Menschen, vielen Tieren und Pflanzen zu finden. Dabei unterscheiden sie sich in ihrer
Aminosäuresequenz, je nachdem von welchem Organismus aber auch aus welchem Organ
sie stammen [73, 74].
Abbildung 5: Schematische Darstellung von Lysozym; a) Kugel- oder auch CPK (Corey-Pauling-Koltun)
Model: Diese Darstellung zeigt die Atome des Proteins als Kugeln, deren Größe vom jeweiligen Van-derWaals-Radius hergeleitet wird. Die grauen Kugeln entsprechen Kohlenstoff, die blauen Stickstoff, die
roten Sauerstoff und die gelben Schwefel. b) Solid-ribbon Model: Die roten Bereiche stellen eine -Helix
Struktur dar, -Stränge werden blau dargestellt. Die grauen Bereiche repräsentieren unregelmäßige
Strukturen [75].
In dieser Arbeit wurde aus Hühnereiweiß gewonnenes Lysozym (engl. Hen egg white
lysozyme, HWEL) verwendet. Es gilt als eines der am besten erforschten Lysozyme. Mit
einer Molekülmasse von ca. 14.500 Da handelt es sich bei HEWL um ein relativ kleines
globuläres Protein, das aus einer Peptidkette, bestehend aus 129 Aminosäureresten,
aufgebaut ist. Es besitzt 8 Cysteinreste, die 4 Disulfidbrücken bilden [73]. Die Tertiärstruktur
des Proteins wird als ellipsoid beschrieben und besitzt die Abmessungen von ca.
45 x 30 x 30 Å [76].
Theorie
19
Tabelle 5: Zusammensetzung von aus Hühnereiweiß gewonnenem Lysozym (Hen egg white lysozyme,
HEWL). Auflistung der an der Zusammensetzung beteiligten 20 Aminosäuren und deren prozentualer
Anteil in HWEL [69].
Der isoelektrische Punkt von HEWL befindet sich bei einem pH-Wert von 10,5 bis 11 [77,
78]. Bei niedrigeren pH-Werten kommt es zu einer positiven Summenladung, bei höheren
pH-Werten zu einer negativen Summenladung. In physiologischer Umgebung besitzt das
Protein daher eine positive Gesamtladung [79]. Der pH-Bereich in dem Lysozym als Enzym
aktiv ist liegt zwischen 3 und 9, wobei die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von ca. 6,2
erreicht wird.
20
Theorie
2.4
Beschichtungsmechanismen
Neben der direkten Proteinadsorption auf der Mg(OH)2 Oberfläche werden drei verschiedene
Linkermoleküle
für
die
Beschichtungsmechanismen
Immobilisierung
zur
der
Proteinanbindung
Proteine
wurden
verwendet.
aufgrund
Alle
bestehender
Ergebnisse auf Titan, Gold oder anderen Materialien ausgewählt. Die verwendeten
Linkermoleküle eignen sich laut Literatur für die Immobilisierung von Proteinen auf OHterminierten Oberflächen.
2.4.1 Aminopropyltriethoxysilan plus Vitamin C (AV)
Aminopropyltriethoxysilan (APTES) ist ein Molekül, das durch Tauchbeschichtung auf eine
Oberfläche aufgebracht und nach Aktivierung z.B. mit Vitamin C (Ascorbinsäure) zur
Proteinimmobilisierung verwendet werden kann [80]. Das Silan bindet über eine
Kondensationsreaktion, bei der Ethanol abgespalten wird, mit einer der Ethoxygruppen an
die OH-terminierte Oberfläche. In einem wasserfreien System kann eine Vernetzung der
APTES-Moleküle untereinander über die freien Ethoxy-Gruppen stattfinden. Im Idealfall
entsteht eine dichte Monolage. Die anschließende Bindung zwischen Ascorbinsäure und
APTES findet über die freie Keto-Gruppe der Ascorbinsäure mit der freien Amino-Gruppe
des Silans statt, wobei ein Imin (-N=C-) entsteht. Nach der Aktivierung von APTES mit
Vitamin C findet die Oxidation von Ascorbinsäure
zu Dehydroascorbinsäure an
Normalatmosphäre statt. Proteine können dann unspezifisch über eine Peptidbindung einer
primären Aminogruppen mit einer der freien Keto-Gruppen der Dehydroascorbinsäure
adsorbieren [80].
Theorie
21
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Beschichtungsmechanismus von Proteinen via APTES und
Vitamin C (Ascorbinsäure) (nach Oliveira et al. [80]). APTES bindet via Kondensationsreaktion an die OHterminierte Mg(OH)2 Oberfläche. In wasserfreier Beschichtungslösung kann eine Quervernetzung der
APTES-Moleküle über die freien Ethoxygruppen stattfinden. Ascorbinsäure bindet mit der Keto-Gruppe
an die freien Aminogruppen der APTES-Moleküle. Anschließend erfolgt die Oxidation von Ascorbinsäure
zu Dehydroascorbinsäure. Proteine können mit einer freien primären Aminogruppe an eine der neu
entstandenen Ketogruppen der Dehydroascorbinsäure binden.
2.4.2 Carbonyldiimidazol (CDI)
1,1‘ Carbonyldiimidazol (CDI) ist ein Molekül, das häufig zur Immobilisierung von Proteinen
auf Metalloxidoberflächen eingesetzt wird, da es nach Anbindung an die Oberfläche keine
zusätzlichen Gruppen besitzt, die zu unspezifischen Proteinadsorptionseffekten führen
könnten. Durch einfache Tauch-Beschichtung in einer CDI-Lösung kann das Molekül auf das
jeweilige Substrat aufgebracht werden. CDI reagiert z.B. mit den Hydroxylgruppen einer OHterminierten Metalloxidoberfläche, wobei typischerweise Imidazol-Carbamate gebildet
werden (vgl. Abbildung 7 a)). Proteine binden an diese Carbamate mittels einer freien
Aminogruppe (vgl. Abbildung 7 b) [81].
22
Theorie
Abbildung 7: Schematische Darstellung des Beschichtungsmechanismus von Proteinen via CDI (nach
McArthur et al. [81-83]). CDI kann über eine oder zwei Hydroxylgruppen kovalent an die OH-terminierte
Oberfläche anbinden. Bei der Bindung an eine Hydroxylgruppe werden Imidazol-Carbamate gebildet.
Proteine binden mittels einer freien Aminogruppe an die Carbamate unter Abspaltung des Imidazols.
2.4.3 Stearinsäure
Stearinsäure (C18H36O2) oder auch Octadecansäure ist ein Molekül mit einer Säure-Gruppe
als Kopf und einer hydrophoben Alkylkette als Rest. Die Anbindung an eine OH-terminierte
Metalloberfläche findet mittels einer Kondensationsreaktion der Säuregruppe, bei der
Wasser abgespalten wird, statt. Der Alkylrest soll sich senkrecht zur Oberfläche orientieren
und eine sogenannte selbstorganisierte Monolage wird gebildet. Je nach Vorbehandlung der
Metalloberfläche können so sehr hydrophobe Oberflächen erreicht werden. Die Anbindung
von Proteinen erfolgt aufgrund hydrophober Wechselwirkungen zwischen hydrophoben
Bereichen im Protein und der hydrophoben Alkylketten der Stearinsäuremoleküle. Es ist
bekannt, dass Proteinadsorption auf hydrophoben Oberflächen bevorzugt abläuft. Durch
konformative Änderungen und Ausbreitung der Proteine können so starke Bindungen
entstehen [84, 85].
Theorie
23
Abbildung 8: Schematische Darstellung des Beschichtungsmechanismus von Proteinen via Stearinsäure
(SA). Die Stearinsäure bindet durch eine Kondensationsreaktion der Säuregruppe mit den OH-Gruppen
des Magnesiumhydroxids an die Oberfläche an. Im Idealfall ordnen sich die SA-Moleküle senkrecht zur
Oberfläche und parallel zueinander an und bilden so eine Monolage. Aufgrund der CH3-Terminierung
erhält die Oberfläche hydrophobe Eigenschaften. Proteine können durch hydrophobe Wechselwirkungen
gebunden werden.
24
Theorie
2.5
Elektrochemie
Für die elektrochemische Analyse werden in dieser Arbeit in erster Linie Impedanzspektren
aufgenommen und ausgewertet. In einigen Fällen werden zusätzlich Polarisationskurven
gemessen.
2.5.1 Komplexer Widerstand und elektrochemische
Impedanzspektroskopie (EIS)
Die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) ist eine häufig angewandte Methode zur
Charakterisierung von Elektrodenoberflächen und Schichtsystemen. Als Impedanz wird der
komplexe Widerstand (Z) bezeichnet. Wie auch der Ohm’sche Widerstand R ist die
Impedanz ein Maß der Fähigkeit eines elektrischen Systems, dem Stromfluss einen
Widerstand entgegenzusetzten. Die Gesamtimpedanz eines Systems setzt sich aus den
ohmschen Widerständen und den Widerständen der Kondensatoren und Induktivitäten
zusammen.
Mittels einer elektrochemischen Zelle und einer Drei-Elektroden-Konfiguration kann die
Impedanz einer Elektrode bestimmt werden. An die Zelle wird eine Wechselspannung mit
kleiner Amplitude (einige mV) angelegt, die um das Ruhepotential schwingt. Die Frequenz
der Wechselspannung variiert über den Zeitraum der Messung und kann vom MHz- bis in
den mHz-Bereich reichen [86].
Das Anregungssignal bei der elektrochemischen Impedanz Spektroskopie ist die oben
genannte Wechselspannung, die durch Gleichung 9 beschrieben wird.
𝑬𝒕 = 𝑬𝟎 𝒔𝒊𝒏(𝝎𝒕)
Gl. 9
Wobei Et die Spannung zur Zeit t, E0 die Signalamplitude und  die radiale Frequenz ist. Der
Zusammenhang zwischen  und der Frequenz f der angelegten Spannung ergibt sich aus
Gleichung 10:
𝝎 = 𝟐𝝅𝒇
Gl. 10
Für ein lineares System folgt als Stromantwort ebenfalls eine Schwingung die sich von der
Kurve der Spannung lediglich hinsichtlich der Amplitude unterscheidet und in der Phase
verschoben ist.
𝑰𝒕 = 𝑰𝟎 𝐬𝐢𝐧(𝝎𝒕 + 𝚽)
Gl. 11
mit It = Strom zur Zeit t, I0 = Signalamplitude und Φ = Phasenverschiebung bezogen auf das
Anregungssignal.
Theorie
25
Da reale Systeme in der Regel nicht linear sind, wird die Anregungsamplitude wie oben
beschrieben sehr klein gewählt. So kann eine Pseudolinearität erzeugt werden [87].
Laut dem Ohm’schen Gesetz gilt für die Beziehung zwischen dem elektrischen Widerstand
R, der Spannung E und dem Strom I
𝑹=
𝑬
𝑰
Gl. 12
Analog zum Ohm’schen Gesetz gilt für den komplexen Widerstand:
𝒁=
𝑬𝒕
𝑬𝟎 𝒔𝒊𝒏(𝝎𝒕)
𝒔𝒊𝒏(𝝎𝒕)
=
= 𝒁𝟎
𝑰𝒕 𝑰𝟎 𝐬𝐢𝐧(𝝎𝒕 + 𝚽)
𝐬𝐢𝐧(𝝎𝒕 + 𝚽)
Gl. 13
Die Impedanz wird folglich durch den Betrag von Z0 und die Phasenverschiebung zwischen
Anregungsspannung und Stromantwort bestimmt. Mit Hilfe der Euler´schen Beziehung ist es
möglich die Impedanz als komplexe Zahl darzustellen [86, 88].
Euler´sche Beziehung:
Für das Potential gilt
Für die Stromantwort folgt
𝒆𝒋𝜱 = 𝒄𝒐𝒔 𝜱 + 𝒋 𝒔𝒊𝒏 𝜱
Gl. 14
𝑬𝒕 = 𝑬𝟎 𝒆𝒋𝝎𝒕
Gl. 15
𝑰𝒕 = 𝑰𝟎 𝒆𝒋𝝎𝒕−𝝓
Gl. 16
Somit ergibt sich für die Impedanz als komplexe Zahl:
𝒁(𝝎) =
𝑬
= 𝒁𝟎 𝒆𝒋𝝓 = 𝒁𝟎 (𝐜𝐨𝐬 𝚽 + 𝒋 𝐬𝐢𝐧 𝚽)
𝑰
Gl. 17
Generell setzt sich die Impedanz eines Systems aus verschiedenen Anteilen zusammen.
Taucht ein Metall in einen Elektrolyt, bildet sich an der Phasengrenze MetallelektrodeElektrolyt eine elektrochemische Doppelschicht aus. Legt man eine Wechselspannung an die
Zelle an, so wird diese Doppelschicht mit der Frequenz der Wechselspannung umgeladen.
Das Auf-, Ent- und Umladen an der Elektrodenoberfläche entspricht Kondensatorverhalten.
Man erhält somit eine Doppelschichtkapazität CD. Der kapazitive Anteil am komplexen
Widerstand (RC) ist umgekehrt proportional von der Frequenz abhängig und lässt sich wie
folgt berechnen [88, 89]:
𝑹𝑪 =
𝟏
𝝎𝑪𝑫
Gl. 18
Hinzu kommt der sogenannte Ladungsdurchtrittswiderstand RD, der durch die Kinetik der
Metallauflösung bzw. –abscheidung bestimmt wird. Außerdem fließt der Elektrolytwiderstand
RE mit in den Gesamtwiderstand ein. Dieser kommt durch den Abstand zwischen Arbeitsund Referenzelektrode zustande und wird neben der Leitfähigkeit des Elektrolyten
26
Theorie
maßgeblich vom Abstand bestimmt. Die Ohm´schen Widerstände sind im Gegensatz zum
kapazitiven Anteil an der Impedanz frequenzunabhängig [88].
Für die Auswertung der Messdaten gibt es verschiedene Auftragungsarten. Hier sollen
lediglich die zwei gängigsten erläutert werden, die Darstellung nach Nyquist und die
Darstellung nach Bode. Da die Impedanz eine komplexe Größe ist, ist es möglich die
gemessenen Impedanzwerte in ihren Real- und Imaginärteil zu zerlegen. Ohm´sche
Widerstände stellen dabei die realen Komponenten, Widerstände der Kondensatoren und
Induktivitäten die imaginären Komponenten dar. Die Umrechnung zwischen der Impedanz Z
und Real- und Imaginärteil (Z‘ und Z‘‘) sind in den Gleichungen 19 bis 22 dargestellt [86].
𝑹𝒆(𝒁) ≡ 𝒁′ = |𝒁| 𝐜𝐨𝐬(𝝓)
(Gl. 19)
wobei 𝝓 = 𝒕𝒂𝒏−𝟏 (𝒁′′⁄𝒁′)
(Gl. 21)
und
𝑰𝒎(𝒁) ≡ 𝒁′′ = |𝒁| 𝐬𝐢𝐧(𝝓)
und
(Gl. 20)
|𝒁| = √(𝒁′)𝟐 + (𝒁′′)𝟐 (Gl. 22)
Wird der negative Imaginärteil über dem Realteil aufgetragen, erhält man den sogenannten
Nyquist-Plot (Abbildung 9a) [88].
Abbildung 9: Schematische Darstellung der vereinfachten Randleszelle; a) Nyquist-Plot: aufgetragen ist
der negative Imaginärteil über dem Realteil der komplexen Impedanz. Die Werte von Re(z) bei hohen
Frequenzen (= 1. Schnittpunkt mit der x-Achse) werden vom Elektrolytwiderstand RE bestimmt. Die Werte
von Re(z) bei niedrigen Frequenzen (2. Schnittpunkt mit der x-Achse) zeigen den Durchtrittswiderstand
RD plus den Elektrolytwiderstand an; b) Bode-Plot: üblicherweise erfolgt die Auftragung des Betrags der
Impedanz Z über der Frequenz doppelt-logarithmisch. Auf der 2. y-Achse wird zudem der Phasenwinkel
aufgetragen. Die Plateaus bei hohen und niedrigen Frequenzen geben den Elektrolytwiderstand R E bzw.
RE+RD an; c) Darstellung des zugehörigen Ersatzschaltbildes.
Theorie
27
Im Idealfall ergibt sich ein Halbkreis, dessen Mittelpunkt auf der x-Achse liegt. Jeder Punkt
auf dem Halbkreis entspricht der Impedanz bei einer bestimmten Frequenz. Der Betrag der
Impedanz kann als Vektor vom Ursprung des Koordinatensystems zum jeweiligen
Messpunkt dargestellt werden. Der Winkel zwischen x-Achse und Vektor ist der
Phasenwinkel Φ. Messpunkte, die niedrigen Frequenzen zugeordnet werden, befinden sich
am rechten Ende des Halbkreises. Mit steigender Frequenz wandern die Messpunkte auf
dem Kreisbogen gegen den Uhrzeigersinn nach links (Vgl. Abbildung 9).
Aufgrund von Gleichung 18 wird bei sehr hohen Frequenzen der durch die Zelle fließende
Strom von RE bestimmt. Im Nyquist-Plot kann RE als der erste Schnittpunkt des Halbkreises
mit der x-Achse (nahe des Ursprungs) abgelesen werden. Im mittleren Frequenzbereich wird
die Impedanz vom kapazitiven Anteil bestimmt, der Phasenwinkel zeigt hier die höchsten
Werte. Bei niedrigen Frequenzen nimmt RC sehr große Werte an, was dazu führt, dass der
Strom durch den geringeren Widerstand RD fließt. RD plus RE kann somit durch den zweiten
Schnittpunkt mit der x-Achse (bei niedrigen Frequenzen) dargestellt werden [88].
Klarer wird dies, wenn man das korrespondierende Ersatzschaltbild, die sogenannte
vereinfachte Randles-Zelle (Abbildung 9c) betrachtet. Oft werden EIS Daten mithilfe von
Ersatzschaltbildern gefittet. Elemente solcher Darstellungen sind dieselben wie in einem
elektrischen Schaltkreis. Die gängigsten Komponenten und ihre Abhängigkeiten sind in
Tabelle 6 dargestellt. Für viele Systeme kann ein Ersatzschaltbild erstellt werden. Jedoch ist
dabei Vorsicht geboten, da oftmals mehrere Ersatzschalbilder zum gleichen Kurvenverlauf
führen können. Daher sollten die Modelle auf physikalischen und elektrochemischen
Eigenschaften des zu untersuchenden Systems basieren.
Tabelle 6: Einige Ersatzschaltbild-Komponenten mit den zugehörigen Beziehungen zur Impedanz [88]
Anhand des Nyquist-Plots lassen sich zahlreiche Aussagen über das zugrunde liegende
Material-Elektrolyt-System treffen. Die Form des Nyquist-Plots (perfekter oder abgeflachter,
ein oder mehrere Halbkreise) kann z.B. Aufschluss darüber geben, ob die Impedanz von
einer einzigen oder von mehreren Ladungsdurchtritts-Reaktionen abhängt und somit
mehrere Zeitkonstanten besitzt. So können u.a. Beschichtungen hinsichtlich ihrer Qualität
untersucht werden [88]. Der Nachteil der Auftragung nach Nyquist liegt jedoch darin
begründet, dass aus dem Diagramm nicht ersichtlich ist, welche Impedanzwerte welcher
28
Theorie
Messfrequenz
zugeordnet
werden
können.
Genauere
Informationen
über
den
Zusammenhang zwischen Impedanz und der Frequenz, bei der gemessen wird, liefert der
Bode-Plot (Abbildung 9b). Hierbei wird zum einen der Betrag der Impedanz logarithmisch
über der ebenfalls logarithmierten Frequenz aufgetragen, zum anderen beinhaltet das
Diagramm die Darstellung des Phasenwinkels Φ. Der Betrag des Phasenwinkels wird
ebenfalls über der logarithmierten Frequenz aufgetragen und gibt die Steigung der Impedanz
Kurve wieder. Bei hohen Frequenzen zeigt die Impedanz Kurve ein Plateau und es gilt
Φ = 0. D.h., es gibt keine Phasenverschiebung, was bedeutet, dass ein reiner Widerstand
vorliegt. Korrespondierend zum Nyquist-Plot stellt das Plateau bei hohen Frequenzen RE dar.
Wie oben beschrieben, gibt der mittlere Frequenzbereich Aufschluss über den kapazitiven
Anteil an der Gesamtimpedanz. Je größer die Steigung der Impedanz Kurve bzw. je größer
der Phasenwinkel, desto höhere Werte nimmt RC an. Bei niedrigen Frequenzen ist wieder ein
Plateau
zu
erkennen,
welches
korrespondierend
zum
Nyquist-Plot
den
Ladungsdurchtrittswiderstand RD plus RE anzeigt. Auch hier ist der Phasenwinkel Null.
Mehrere Zeitkonstanten werden im Bode-Plot durch mehrere lokale Maxima des
Phasenwinkels deutlich [86, 88].
2.5.2 Polarisationskurven
Polarisationskurven sind die mit am häufigsten eingesetzte Messmethode in der
Elektrochemie.
Mithilfe
der
Stromdichte-Potential-Messungen
kann
die
Korrosionsstromdichte iKorr sowie das Korrosionspotential Ekorr berechnet werden. Zudem
können Aussagen über Bildung von Passivschichten und deren Qualität und Stabilität
gemacht werden.
Befindet sich ein Metall in einem Elektrolyten, so treten elektrochemische Reaktionen auf,
welche in der Regel aus zwei Teilreaktionen, der anodischen und der kathodischen
Teilreaktion,
bestehen.
Beide
Teilreaktionen
führen
zu
einem
Stromfluss.
Die
Metallauflösung stellt dabei die anodische Stromdichte (ia) dar, die Reduktion von Protonen
zu Wasserstoff oder von O2 zu OH- die kathodische Stromdichte (ik). Sind anodische und
kathodische Stromdichte betragsmäßig gleich groß, wird nach außen hin kein Strom
gemessen. Dennoch kann Metallauflösung auftreten. Das zugehörige Potential wird
Ruhepotential oder OCP (eng.: open circuit potential) genannt. Wird von außen an das
System Metall-Elektrolyt kein Strom oder keine Spannung angelegt, stellt sich das jeweilige
OCP ein. Eine Polarisation erfolgt meist von einigen 100 mV unterhalb des Ruhepotentials
bis einige Volt in anodischer Richtung. Messtechnisch erfasst wird die Gesamtstromdichte,
welche die Summe aus ia und ik darstellt [90, 91].
Theorie
29
Abbildung 10: Tafel-Auftragung: logarithmische Auftragung der Stromdichte über dem Potential. Bei
größeren Überspannungen bezogen auf das OCP wird auf der kathodischen Seite die anodische
Stromdichte vernachlässigbar und umgekehrt. In diesem Bereich verlaufen beide Teilstromdichten bei
einer idealen Reaktion linear. Die Tafelgeraden sind eine Verlängerung der linearen Bereiche. Ihr
Schnittpunkt markiert die Korrosionsstromdichte sowie das Korrosionspotential.
In der Praxis wird die Stromdichte logarithmisch über dem Potential aufgetragen. Im Bereich
des Ruhepotentials erhält man so die Tafelauftragung (siehe Abbildung 10). Bei höheren
Überspannung (~50 mV) bezogen auf das Ruhepotential wird davon ausgegangen, dass auf
der kathodischen Seite die anodische Stromdichte vernachlässigbar wird und umgekehrt und
die Stromdichten im Idealfall einen linearen Verlauf zeigen. Die Tafelgeraden stellen eine
Verlängerung der linearen Bereiche beider Teilstromdichten dar. Der Schnittpunkt der
Tafelgeraden markiert die Korrosionsstromdichte sowie das Korrosionspotential [91].
Bei weiterer Polarisation in anodischer Richtung kommt es entweder zur Passivierung des
Metalls im Elektrolyten durch die Bildung einer Oxidschicht, welche den Ladungsaustausch
herabsetzt. Die Stromdichte fällt hierbei um Größenordnungen. Bei genügend hohen
Potentialen kommt es zum Durchbruch und zur Auflösung der Oxidschicht. Dieser Bereich
wird als transpassiv bezeichnet. Aktive Metalle zeigen keine Passivierung. Es findet
durchgehend aktive Auflösung statt. Magnesium zeigt in neutralen, vor allem stark Chloridhaltigen Medien aktives Verhalten [91].
30
Theorie
Abbildung 11: Stromdichte-Potential-Kurve: Bei Polarisation in anodischer Richtung kommt es entweder
zur Passivierung durch die Bildung einer Oxidschicht oder es findet aktive Auflösung statt [91].
Theorie
31
2.6
Oberflächenanalyse
Hauptanalysemethoden zur Oberflächencharakterisierung in dieser Arbeit sind XPS und
ToF-SIMS. Beide besitzen hohe Oberflächensensitivität und eignen sich daher zur Analyse
von Monolagen und Proteinschichten.
2.6.1 XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy)
Die Röntgen-Photoelektron-Spektroskopie (engl.: X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)
ist eine Methode zur qualitativen und quantitativen Oberflächenanalyse von Materialien.
Abbildung 12: Schematische Darstellung der Funktionsweise der XPS-Analyse. Oberflächenatome
werden mittels Röntgenstrahlen angeregt, was zur Emission eines kernnahen Elektrons mit spezifischer
kinetischer Energie führt. Aus dem detektierten kinetischen Energiespektrum lassen sich die
Bindungsenergien berechnen und somit die Oberflächenzusammensetzungen bestimmen.
Dabei findet eine Anregung der Oberflächenatome der Probe mit Röntgenstrahlen bekannter
Energie (E = h) statt, die die Emission eines Elektrons aus einer kernnahen Schale bewirkt
(vgl. Abbildung 12). Jedes Photoelektron verlässt das jeweilige Atom mit einer bestimmten
kinetischen Energie Ekin, die, wie in Gleichung 23 beschrieben, von der eingestrahlten
Energie h und der Bindungsenergie Eb abhängt.
𝑬𝒌𝒊𝒏 = 𝒉𝝊 − 𝑬𝒃
Aus
dem
detektierten
kinetischen
Energiespektrum
Gl. 23
lässt
sich
die
Oberflächenzusammensetzung bestimmen, da die eingestrahlte Energie bekannt ist und die
jeweilige Bindungsenergie für jedes Element spezifisch ist. Die Bindungsenergie eines
Elektrons hängt jedoch nicht nur vom jeweiligen Element und dem Orbital ab. Auch die
Oxidationsstufe und die Umgebung haben Einfluss auf den Bindungszustand und sind im
XPS-Spektrum anhand einer Verschiebung der Peaks zu erkennen [92, 93].
32
Theorie
Die XPS-Analyse besitzt hohe Oberflächensensitivität (einige nm) und eignet sich daher für
die Untersuchung der Proteinadsorption auf Oberflächen. Da es sich bei Proteinen um
organische
Moleküle
handelt,
bestehen
sie
zu
großen
Teilen
aus
Kohlenstoff.
Charakteristisch ist auch der verhältnismäßig hohe Anteil an Stickstoff, bedingt durch die
Peptidbindungen. Die Charakterisierung der Proteinadsorption erfolgt mittels des C- und NSignals. Eine Identifizierung von Proteinen sowie Aussagen über Konformationsänderungen
sind mittles XPS jedoch nicht möglich.
2.6.2 ToF-SIMS (Time of Flight Secondary Ion Mass Spectromerty)
Die statische Sekundärionen-Massenspektrometrie (Static SIMS) ist eine Methode zur
Oberflächenanalyse. Die zu untersuchende Probe wird mit einem Ionenstrahl mit einer
Energie von einigen keV beschossen. Die Primärionen dringen in die Probe ein und geben
dort in einer Kollisionskaskade ihre kinetische Energie Ekin an die umliegenden Atome des
Festkörpers
ab.
Für
die
ToF-SIMS-Analyse
(Time-of-Flight
Secondary
Ion
Mass
Spectrometry) wird die Generierung und die Emission von ionisierten Teilchen, den
sogenannten Sekundärionen, genutzt.
Abbildung 13: Schematische Darstellung der Generierung und Emission von Sekundärionen bei der ToFSIMS Analyse: Ein Primärionenstrahl wird auf die Probe geschossen und dringt in das Probenmaterial
ein. Durch Energieübertragung auf die umliegenden Atome kommt es u.a. zur Generierung von
Sekundärteilchen, welche neutral oder geladen sein können. Für die ToF-SIMS Analyse werden
ausschließlich die geladenen Teilchen genutzt (Abbildung bereitgestellt von M.Sc. Ina Hacker).
Ein gepulster Primärionen-Strahl (Bi, Au, Ga oder Cs) mit einem möglichst kurzen
Zeitintervall tp wird zur Generierung der Sekundärionen verwendet, um einen simultanen
Eintritt aller gebildeten Ionen in die Flugbahn zum Detektor zu erlangen. Die Sekundärionen
werden durch eine Beschleunigungsspannung Uac beschleunigt, bevor sie in die Flugbahn
(mit der Länge L) eintreten. Da die anfängliche Energie der Ionen relativ klein ist, wird diese
Theorie
33
vernachlässigt und es wird davon ausgegangen, dass alle Sekundärionen mit der gleichen
kinetischen Energie in die Flugbahn eintreten. Gemessen wird die Zeit t, die die Ionen vom
Beginn der Flugbahn bis zum Detektor brauchen. Mit Hilfe von Gleichung 24 kann die Masse
(m/z) berechnet werden [94].
𝒎 𝟐𝑼𝒂𝒄 𝒕𝟐
=
𝒛
𝑳𝟐
Gl. 24
Die ToF-SIMS Analyse zeichnet sich durch eine hohe Oberflächensensitivität, eine hohe
Nachweisgrenze und eine gute Molekülselektivität aus. Daher eignet sie sich zur
Charakterisierung von Proteinen und ist bisher die einzige Methode, die eine eindeutige
Identifizierung von Proteinen ermöglicht. Die Informationstiefe beträgt zwischen einigen
Zehntel nm bis zu 1-2 nm und ist somit geringer als die Dimension von Proteinen (vgl.
Abbildung 14). Dies macht eine Detektierung der Konformation und der Orientierung von
Proteinen auf Oberflächen möglich [69, 95, 96].
Abbildung 14: Schematische Darstellung der Dimension eines auf einer Oberfläche adsorbierten Proteins
im Vergleich zur Informationstiefe bei der Time of Flight Secondary Ion Mass Spectroscopy (ToF-SIMS).
Die Informationstiefe ist wesentlich kleiner als die Abmessungen des Proteins. Daher kann die ToF-SIMSAnalyse zur Detektierung und Identifizierung von Proteinen auf Oberflächen verwendet werden.
Außerdem besteht die Möglichkeit der Detektion von Konformation und Orientierung des Proteins.[97]
34
Versuchsdurchführung
3. Versuchsdurchführung
3.1
Probenpräparation
Für alle Versuche wurde technisch reines Magnesium (99,9 % Reinheit, Chempur
Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH) verwendet. Die einzelnen Mg-Proben
wurden als Scheiben mit einer Dicke von ca. 3-4 mm von einem Stab geschnitten. Für die
elektrochemischen Untersuchungen wurde als Ausgangsmaterial ein Mg-Stab mit einem
Durchmesser
von 25,4 mm
verwendet,
für die Wasserstoffmessungen
sowie die
Zellversuche ein Mg-Stab mit 9,5 mm Durchmesser. Für die Oberflächenanalyse mittels XPS
und ToF-SIMS wurden die 25,4 mm Proben nochmals halbiert.
Alle Proben wurden zunächst mit einem SiC-Schleifpapier (Körnung 800) entgratet und
anschließend mit einem SiC-Schleifvließ (Körnung 1200) geschliffen, wobei ein EthanolGlycerin-Gemisch im Verhältnis 3:1 als Flussmittel verwendet wurde. Abschließend wurden
die Proben für ca. 3 min in Ethanol im Ultraschallbad gereinigt.
Vor dem eigentlichen Beschichtungsprozess wurden die Proben für 20 min in kochender
1M Natronlauge (NaOH) passiviert, um eine möglichst homogene und dichte Mg(OH) 2Schicht zu erzeugen und eine gleichmäßige OH-Terminierung der Probenoberfläche zu
garantieren.
3.2
Beschichtung mit den Linkermolekülen
Aminopropyltriethoxysilan (APTES) plus Vitamin C (Ascorbinsäure) (AV)
Um Magnesium mit einer Monolage APTES zu beschichten, wurden die Proben für 24 h in
einer 10 mM APTES-Lösung in Toluol eingelegt [98, 99]. Hierfür wurden ein Wasserbad mit
einer Temperatur von 70°C und ein Rücklaufkühler verwendet. Anschließend wurden die
Proben mit Aceton und mit Ethanol gespült und dazwischen jeweils mit Stickstoff getrocknet.
Als abschließender Schritt der APTES-Beschichtung wurden die Proben für ca. 10 min in
Ethanol im Ultraschallbad gereinigt, um alle überschüssigen, nicht kovalent gebundenen
APTES-Moleküle zu entfernen. Zur Aktivierung mittels Ascorbinsäure wurde eine gesättigte
Lösung von Ascorbinsäure in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt, in die die APTES
beschichteten Proben für etwa 30 min unter Rühren eingelegt wurden. Anschließend wurden
die Proben zweimal mit Reinstwasser gespült und mit Stickstoff getrocknet. Nach einer
Lagerzeit von mindestens zwei Stunden fand die BSA-Beschichtung statt [100].
Versuchsdurchführung
35
Carbonyldiimidazol (CDI)
Die Beschichtung der Mg-Proben mit Carbonyldiimidazol (CDI) fand ebenfalls mittels des
Verfahrens der Tauchbeschichtung statt. Die Proben wurden für 6 h in eine 25 mM CDILösung eingelegt. Als Lösungsmittel diente Chloroform. Nach Ablauf der Beschichtungszeit
wurden die Proben für ca. 5 min in Chloroform gewaschen und an Luft getrocknet.
Anschließend fand die BSA-Beschichtung statt [101].
Stearinsäure (SA)
Für die Stearinsäurebeschichtung wurde eine 0,05 M Lösung in Ethanol verwendet, in der
die passivierten Proben für 1 h unter Rühren eingelegt wurden. Anschließend wurden die
Proben für ca. 5 min mit Ethanol gespült und mit Stickstoff getrocknet [102].
3.3
Proteinbeschichtung
3.3.1 Beschichtung mit bovinem Serumalbumin (BSA)
Anschließend an die Linkermolekülbeschichtung bzw. die Passivierung wurden die Proben
mit BSA (Sigma Aldrich, Cohn V fraction) beschichtet. Hierfür wurden die Proben unter
Rühren bei Raumtemperatur in eine 0,1 mM BSA-Lösung in Reinstwasser eingelegt. Die
Beschichtungszeiten variierten von 0,25, 0,5, 1, 3 bis 24 h. Nach der gewünschten
Beschichtungsdauer wurden die Proben für ca. 5 min in Reinstwasser gespült und mit
Stickstoff getrocknet.
3.3.2 Beschichtung mit Lysozym (LYS)
Um zu garantieren, dass neben dem Modellprotein BSA auch andere Proteine auf
Magnesium anbinden können, wurde Lysozym als weiteres Protein für die Beschichtung von
Magnesium gewählt. Lysozym unterscheidet sich von BSA zum einen in der Molekülgröße
(vlg. Kap. 2.2 und 2.3), zum anderen in der Schichtbildung. Während BSA-Moleküle keine
Bindung miteinander eingehen und daher davon ausgegangen wird, dass sie eine Monolage
bzw. eine Sub-Monolage bilden, können Lysozyme Multilagen bilden [39, 103]. Für die
Beschichtung mit LYS wurde die Vorbehandlung mit SA gewählt. Als Referenz-Serie wurde
auch hier die direkte Beschichtung nach NaOH-Passivierung der Mg-Oberfläche verwendet.
Analog zur BSA-Beschichtung wurden Beschichtungszeiten von 0,25, 0,5, 1, 3 und 24 h
gewählt. Die Beschichtung fand ebenfalls mittels Tauchbeschichtung in einer gerührten LYS-
36
Versuchsdurchführung
Lösung in Reinstwasser (1 g/l, HEWL, Sigma) bei Raumtemperatur statt. Abschließend
wurden die Proben für ca. 5 min in Reinstwasser gespült und mit Stickstoff getrocknet.
3.4
Oberflächenanalyse
3.4.1 Kontaktwinkel- und Oberflächenrauhigkeitsmessungen
Sowohl die Oberflächenrauigkeit als auch die Hydrophobizität einer Oberfläche spielen bei
der Korrosion, bei vielen Beschichtungsprozessen und Protein- sowie Zelladhäsion eine
wichtige Rolle.
Die Kontaktwinkelmessung dient der Untersuchung der Benetzbarkeit einer Oberfläche. Die
Oberflächenspannung einer Flüssigkeit ist die Kraft, die der Vergrößerung der Oberfläche
entgegen wirkt. Diese Oberflächenspannung besteht nicht nur an der Phasengrenze flüssigfest, sie wirkt sich auch in der Grenzflächenspannung zwischen einer Flüssigphase und
einem Festkörper (oder zwischen zwei Flüssigphasen) aus.
Je mehr sich die flüssige und die feste Phase abstoßen, desto größer ist die
Grenzflächenspannung und desto kleiner wird die Kontaktfläche zwischen Flüssigkeit und
Festkörper. Die kleinste Kontaktfläche entsteht durch Bildung eines kugelförmigen Tropfens,
der einen Kontaktwinkel von 180° auf der Festkörperoberfläche besitzt.
Abbildung 15: Schematische Darstellung verschiedener Benetzungsverhalten von Oberflächen mit
appliziertem Wassertropfen und zugehörigem Kontaktwinkel .
Zur Messung des Kontaktwinkels wird ein Tropfen einer Flüssigkeit (meist Wasser) eines
definierten Volumens auf die zu untersuchende Oberfläche aufgebracht. Mittels eines
Okulars oder einer Kamera wird eine Vergrößerung des Wassertropfens betrachtet. Durch
den Dreiphasenpunkt wird eine Tangente an den Wassertropfen gelegt. Wie in Abbildung 15
schematisch
gezeigt wird,
ist
der Winkel, der
durch diese Tangente und die
Substratoberfläche gebildet wird, per Definition der Kontaktwinkel [104, 105].
Versuchsdurchführung
37
Die Kontaktwinkelmessungen der Magnesiumoberflächen wurden mittels eines Makroskops
(WILD, Typ 246634, Heerbrugg, Schweiz) in Kombination mit einer Kamera (Leica) und der
zugehörigen Software (LAS V3.7) durchgeführt. Da die Proben hinsichtlich ihrer
Hydrophobizität untersucht werden sollen, wurde als Messflüssigkeit Reinstwasser mit einem
Volumen von ca. 15 µl pro Wassertropfen verwendet. Die Tropfen wurden mittels einer
Pipette auf die Probenoberfläche aufgebracht. Für jede Linkermolekülbeschichtung und nach
Passivierung wurden jeweils zwei Proben untersucht, wobei je Probe die Kontaktwinkel von
zwei Tropfen beidseitig an unterschiedlichen Stellen auf der Probenoberfläche gemessen
wurden.
Die Oberflächenrauigkeitsmessungen wurden an einem Laserprofilometer (UBM) mit einer
vertikalen Auflösung von 0,06 µm durchgeführt. Für jede Linkermolekülbeschichtung und für
die NaOH-Passivierung wurden zwei Proben untersucht. Auf jeder Probe wurden zwei
Linien-Scans mit einer Länge von je 15 mm gemessen aus denen die Mittenrauigkeit Ra und
die maximale Rauigkeit Rmax nach DIN 4768 berechnet wurde.
3.4.2 Tof-SIMS
Für die ToF-SIMS Analyse in dieser Arbeit wurde ein TOF.SIMS 5 Massenspektrometer von
ION-TOF (Münster) verwendet. Die verschiedenen zu charakterisierenden Proben wurden
mit einem gepulsten Bi3+ Flüssigmetallionenstrahl beschossen (E = 25 keV), wobei die
Pulsdauer auf weniger als 1 ns reduziert wurde, um die Massenauflösung zu erhöhen. Die
Spektren wurden im Hochauflösungsmodus (m/m > 8000 bei
29
Si) aufgenommen, die
gemessene Fläche betrug jeweils 500 x 500 µm². Um statische Bedingungen zu garantieren,
wurde die Primärionendosis bei circa 1 x 1011 Ionen cm-2 gehalten. Die Signale wurden
sowohl mittels der genauen Masse als auch mittels des Isotop-Musters identifiziert. Die
Kalibrierung erfolgte für die positiven Spektren hinsichtlich des C+-, CH+-, CH2+-, CH3+- und
C7H7+- Signals, im negativen Spektrum hinsichtlich des CH2--, C2--, CN-- und CNO--Signals.
Für die Integration der Signale wurde die Poisson-Korrektur verwendet [106].
Da die ToF-SIMS-Analyse eine semi-quantitative Methode ist, wurden zum einen lediglich
ähnliche
Systeme
miteinander
verglichen,
zum
Peakflächenverhältnisse gebildet, die ausgewertet wurden.
anderen
wurden
jeweils
38
Versuchsdurchführung
3.4.3 XPS
Die XPS-Messungen in dieser Arbeit wurden mittels eines hochauflösenden PHI 5600 (USA)
Röntgenstrahlen-Photoelektronen-Spektrometers durchgeführt, wobei für die Anregung
monochromatische Aluminium KStrahlung (1486,6 eV, 300W) verwendet wurde. Für jede
untersuchte Probe wurde ein Übersichtsspektrum von 0 bis 1200 eV aufgenommen.
Anschließend wurden relevante Bereiche nochmals
Bindungsenergien
der
verschiedenen
hochaufgelöst gemessen. Die
Oberflächen-Elemente
wurde
bei
einer
Durchlassenergie von 23,5 eV mit einer Auflösung von <0,4 eV (Messpunkte alle 0,2 eV für
hochaufgelöste Bereiche und alle 0,8 eV für die Übersichtsspektren) und einem
Abstrahlwinkel von 45° bezüglich der Oberflächennormalen ermittelt.
Die Korrektur hinsichtlich Aufladung erfolgte mit Hilfe der Bindungsenergie des C1s-Signals,
zur Subtraktion des Hintergrundrauschens wurde die Shirley Methode angewandt. Um den
molaren Anteil jeder Spezies zu erhalten, wurden die Peakflächen der gemessenen XPSSpektren mittels des Photoionisationsquerschnittes () nach Scofield [107] und des
Asymmetrie-Parameters (Orbitalgeometrie) [108] korrigiert (beide enthalten in den
Sensivitätsfaktoren der Messsoftware MultiPakV6.1A, 99 June 16, copyright Physical
Electronics Inc.,1994-1999).
3.4.4 Rasterelektronenmikroskopie (REM)
Ein Feldemissions- Rasterelektronenmikroskop (FE-REM S4800, Hitachi, Japan) wurde für
die
Charakterisierung
der
Querschliffe
der
DMEM-Passivierung
sowie
zur
Oberflächenanalyse nach Elektrochemie in SBF und DMEM eingesetzt. Dabei wurde mit
Beschleunigungsspannungen zwischen 3 kV und 10 kV und einem Arbeitsabstand zwischen
4 und 6 mm gearbeitet. Die Querschliffe wurden mit einer Ionen-Mühle (IM4000, Hitachi)
präpariert, wobei eine Beschleunigungsspannung von 6 kV, sowie eine Entladung von 1,5 kV
verwendet wurde. Geschnitten wurden die Proben im „Cross Milling“ Modus mit 3
Wiederholungen pro Minute mit einem Winkel von +- 30°.
3.4.5 Röntgendiffraktometrie (XRD)
Die während der Auslagerung in DMEM gebildeten Schichten wurden mittels XRD
hinsichtlich ihrer Kristallinität untersucht. Hierfür wurde ein Röntgendiffraktometer (X’PERT
PW 3040 MPD, Panalytical) mit einer monochromatischen Cu-K Strahlung verwendet
( = 1,54 Å)
verwendet.
Der
Divergenzspalt
wurde
auf
0,19 mm
eingestellt.
Die
Versuchsdurchführung
39
Beugungsmuster wurden aus 2 (10°-80°) für jede Probe berechnet, wobei die Schrittweite
0,03° und der Eintrittswinkel 1° betrug.
3.4.6 Fourier transformierte Infrarotspektroskopie (FTIR)
Ebenfalls für die Analyse der während der Auslagerung in DMEM gebildeten Schichten
wurde die Fourier transformierte Infrarotspektroskopie (FTIR) verwendet. Zum Einsatz kam
ein
Infrarotspektrometer
(Thermo
Scientific
Nicolet
6700/Smart
iTR)
mit
einem
Diamantreferenzkristall und einer Eindringtiefe von 2 µm. Gemessen wurde jeweils über
einen Wellenzahlbereich von 500-4000 cm-1.
3.5
Elektrochemische Messungen
3.5.1 Messaufbau
Die Elektrochemischen Messungen wurden in einer elektrochemischen Zelle mit einem 3Elektroden-Aufbau durchgeführt. Für die statischen Messungen (unbewegter Elektrolyt)
wurde eine Lochzelle mit einer Messfläche von 0,7854 cm2 verwendet. Als Arbeitselektrode
fungierte die jeweilige zu untersuchende Probe.
Als Gegenelektrode diente
ein
Platinplättchen und als Referenz eine Silber-Silberchlorid (Ag/AgCl) Elektrode in 3 M
Kaliumchloridlösung
(KCl)
mit
einem
Spannungsunterschied
von
+212mV
zur
Normalwasserstoffelektrode. Gemessen wurde in je ca. 100 ml Elektrolyt, entweder bei
Raumtemperatur oder bei 37°C (+/-1°C).
Für die dynamischen Messungen (bewegter Elektrolyt) wurde eine eigens angefertigte
Durchflusszelle mit einer Messfläche von 1 cm2 verwendet. Als Referenz diente ebenfalls
eine Ag/AgCl Elektrode in 3 M KCl, als Gegenelektrode ein Platindraht. Die beiden
Elektroden wurden so platziert, dass sie keine Turbulenzen über der Probe erzeugten. Der
Elektrolytfluss wurde mittels einer Pumpe erzeugt. Untersucht wurden zwei verschiedene
Fließgeschwindigkeiten: 2,11 ml/min (= 24 rpm) und 10,35 ml/min (= 100 rpm).
Alle elektrochemischen Messungen wurden mittels eines Potentiostaten der Firma Zahner
Elektronik (Kronach) und der zugehörigen Software (Thales) durchgeführt.
3.5.2 Elektrochemische Impedanz Spektroskopie (EIS)
Vor den EIS Messungen wurde jeweils das Ruhepotential (engl.: open circuit potential, OCP)
für entweder 75, 30 oder 15 min (je nach verwendetem Elektrolyt) aufgenommen. Der
40
Versuchsdurchführung
Verlauf des Ruhepotentials wird nur in einigen relevanten Fällen ausgewertet und in dieser
Arbeit gezeigt. Die Aufzeichnung des OCP garantiert im Allgemeinen, dass die weiteren
Messungen bei einem stabilen Ruhepotential durchgeführt werden können.
Die EIS Messungen wurden bei einer Frequenz von 100 kHz bis 10 mHz durchgeführt. Die
angelegte Spannungsamplitude betrug +/- 10 mV relativ zum jeweiligen Ruhepotential. Für
die Auswertung wurde die Auftragung nach Nyquist verwendet und die daraus berechneten
Ladungsdurchtrittswiderstände. Als Elektrolyte wurden SBF und Zellkulturmedium (DMEM)
bei Raumtemperatur und 37°C verwendet.
Bei der elektrochemischen Charakterisierung der mit Zellen besiedelten Magnesium-Proben
wurde der Frequenzbereich auf 100 kHz bis 100 mHz beschränkt, um so dem Ablösen bzw.
Absterben der Zellen entgegenzuwirken.
3.5.3 Polarisationsmessungen
Zusätzlich zu den EIS-Messungen wurden für einige Proben Polarisationskurven
aufgenommen und die jeweiligen Korrosionsstromdichten berechnet. Die Messungen fanden
im Anschluss an die EIS statt. Polarisiert wurde von -0,3 V relativ vom jeweiligen
Ruhepotential bis 0 V, mit einer Schrittweite von 3 mV/s Als Abbruchkriterium wurde ein
Strom von 10 mA gewählt. Die Korrosionsstromdichte wurde mit Hilfe der Tafelgeraden
berechnet. 0,05 V relativ vom OCP in anodischer und kathodischer Richtung wurde jeweils
eine Tangente an die Kurve gelegt. Der Schnittpunkt beider Tangenten bezeichnet die
Korrosionsstromdichte.
3.6
Eine
Wasserstoffmessungen
Methode
zur
Bestimmung
der
Korrosionsrate
von
Magnesium
ist
die
Wasserstoffmessung. Hierbei wird das während der Magnesiumkorrosion gebildete
Wasserstoffgas gesammelt und das Volumen bezogen auf die Probenoberfläche gemessen.
Bei der Korrosion von Magnesium ist die Wasserstoffentwicklung direkt mit der
Magneisumauflösung
verknüpft.
Betrachtet
man
die
Summengleichung
für
die
Magnesiumkorrosion (Kap. 2.2, Gl. 4), wird klar, dass für ein oxidiertes Magnesiumatom ein
Molekül Wasserstoff entsteht. Daher gilt im Allgemeinen, dass für ein Mol aufgelöstes Mg
(24,31 g) ein Mol H2 (22,4 l) gebildet wird. Die Rate der Wasserstoffentwicklung RH wird in
ml/cm²/d angegeben.
Für die Wasserstoffmessungen wurden die Mg-Proben (Durchmesser: 9,5 mm, Dicke: 1,52,5 mm) in einem Gefäß aufgehängt. Über den hängenden Proben wurde eine Glasbürette
Versuchsdurchführung
41
mit Trichter, wie in Abbildung 16 dargestellt ist, befestigt. Die Messungen wurden für 24 h in
ca. 150 ml DMEM bei 37°C durchgeführt. Nach jeweils 1, 2, 3 und 24 h wurde der
entstandene Wasserstoff abgelesen und auf die Fläche von 1 cm2 normiert. Neben der
Gesamtwasserstoffentwicklung, wurde die anfängliche Wasserstoffentwicklungsrate RH1
während der ersten Stunde und RH2 (zwischen 3 und 24 h) berechnet.
Abbildung 16: Versuchsaufbau für die Wasserstoffmessung: Die Magnesiumprobe befindet sich im
Elektrolyten (Zellkulturmedium) innerhalb eines Trichters, der mit einer Bürette verbunden ist. Bedingt
durch
die
Korrosion
entsteht
Wasserstoff,
der
aufsteigt
und
das
Medium
verdrängt.
Die
Volumenänderung in der Bürette bezeichnet die Menge an entstandenem Wasserstoff.
3.7
Verwendete Elektrolyte
Für die ersten elektrochemischen Messungen in dieser Arbeit wurde SBF als Elektrolyt
verwendet. Um die in vitro Bedingungen besser den in vivo Bedingungen anzupassen, wurde
die elektrochemische Analyse außerdem in DMEM bei 37°C durchgeführt.
3.7.1 Simulierte Körperflüssigkeit (engl. Simulated Body Fluid, SBF)
Simulierte Körperflüssigkeit (SBF) gehört zu einem der Medien, die in vitro zur Nachbildung
physiologischer Bedingungen verwendet werden. Jedoch wird durch SBF lediglich der
anorganische Teil des Blutplasmas sowie der pH-Wert simuliert.
Ein Teil der elektrochemischen Messungen dieser Arbeit wurde zunächst in SBF bei
Raumtemperatur durchgeführt, um das Messsystem möglichst einfach zu halten. Die
verwendete SBF wurde aus Stammlösungen hergestellt. Die Vorgehensweise sowie die
Konzentration der Stammlösungen wurde dabei von Müller et al. [109] übernommen. Die in
42
Versuchsdurchführung
der SBF enthaltenen Ionen und deren Konzentration im Vergleich zum Blutplasma sind in
Tabelle 7 aufgelistet.
Tabelle 7: Ionenkonzentrationen im menschlichen Blutplasma und in der verwendeten SBF 5 nach Müller
[mmol/l] [109]
Neben den genannten Ionen beinhaltet die SBF Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Im Blut
übernehmen unter anderem BSA (siehe Kap. 2.2) und Hydrogencarbonat die Pufferung des
pH-Wertes. In der verwendeten SBF ist aus Stabilitätsgründen die HCO3- Konzentration
gegenüber menschlichem Blutplasma deutlich verringert. Die Aufgabe des pH-Puffers
übernimmt Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Des Weiteren wird der SBF Natriumazid
(NaN3) zugefügt, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
3.7.2 Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) ist eines der meist verwendeten
standardisierten Nährmedien zur Kultivierung von Zellen. Zu den Hauptbestandteilen
gehören neben anorganischen Salzen, organische Salze, Glukose, Aminosäuren und
Vitamine. Des Weiteren enthält DMEM meist Phenolrot als pH-Indikator. Als Puffer fungiert
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) im Zusammenspiel mit CO2. Variationen ergeben sich
vor allem durch unterschiedliche Glukose- und NaHCO3-Gehalte. Neben der Zellkultivierung
wird DMEM insbesondere häufig für in vitro Versuche im Bereich der Bio-Degradierbarkeit
von Magnesium verwendet. Einen Vorteil gegenüber SBF stellen hierbei die organischen
Bestandteile von DMEM dar. Der Einfluss dieser auf die Magnesiumkorrosion kann so
eingeschätzt werden.
In dieser Arbeit wurde DMEM mit einer Glukosekonzentration von 1 g/l und einer NaHCO3Konzentration von 3,7 g/l (Biochrom AG) verwendet. Die genaue Zusammensetzung ist in
Tabelle 8 angegeben.
Versuchsdurchführung
43
Tabelle 8: Zusammensetzung des verwendeten Zellkulturmediums (Dulbecco´s Modified Eagle Medium,
DMEM) laut Herstellerinformationen
44
Versuchsdurchführung
3.8
Zellversuche
Für die Zellversuche wurden zwei verschiedene Zelllinien verwendet: Mausendothelzellen
(DH1+/+) im Hinblick auf die Anwendung von Magnesium als Stent-Material und humane
Osteosarkomzellen (Mg63) im Hinblick auf die Anwendung von Magnesium als Material zur
kurzfristigen Knochenfixation. Osteosarkomzelllinien wie die verwendete Mg63, werden
häufig als Ersatz für Osteoblasten verwendet, da sie ähnliche Phänotypeigenschaften
besitzen [110]. Die zugrundeliegenden Magnesium-Proben wurden aus einem Mg-Stab
(99,9 % Reinheit, Durchmesser 9,5 mm) mit einer Dicke von ca. 3 mm gesägt und wie in
Kapitel 3.1 beschrieben, geschliffen und passiviert.
Zunächst wurden die drei Linkermolekülbeschichtungen (AV, CDI und SA) hinsichtlich
Zellwachstum und –ausbreitung untersucht. Hierfür wurden Zellen für einen Tag auf den
Proben ausgesät. Als Vergleich diente – wie auch bei der Elektrochemie und der
Oberflächenanalyse – passiviertes und geschliffenes Magnesium. Als Referenz wurde
Tissue-Culture-Plastik
verwendet,
um
das
Zellwachstum
ohne
den
Einfluss
der
Oberflächeneigenschaften der verschiedenen Magnesium-Proben zu untersuchen. Für die
Magnesium-Proben sowie für die Referenzen wurden vier Proben untersucht, aus denen
jeweils zwei Proben für die Auswertung ausgewählt wurden. Pro Probe wurden fünf
repräsentative Stellen ausgewertet.
Neben den Zellversuchen mit den Linkermolekülen für einen Tag, wurden Langzeitversuche
durchgeführt. Hierfür wurden Zellen auf der Tissue-Culture-Plastik Referenz und auf
geschliffenem Magnesium kultiviert. Des Weiteren wurde die Linkermolekülbeschichtung die
bei einem Tag Zellkultivierung die besten Ergebnisse lieferte für die Langzeitversuche
ausgewählt. Für die Langzeitversuche wurden Zellen für 1, 5, 15 und 20 Tage auf den
Proben kultiviert, wobei anfänglich alle 2 Tage, nach 5 Tagen jeden Tag jeweils das
vollständige Medium gewechselt wurde. Für alle Zellversuche wurden 50.000 Zellen pro
Probe ausgesät. Als Zellkulturmedium wurden je ca. 12 ml DMEM verwendet.
3.8.1 Zellkultivierung
Die Zellkultivierung und alle Versuche erfolgten mit beiden Zelllinien bis auf wenige
Unterschiede gleich. Daher sind die folgenden Protokolle für beide Zelllinien gültig. Auf
Unterschiede wird an den betreffenden Stellen hingewiesen.
Die Zellen wurden in ca. 10 ml Zellkulturmedium in Zellkulturflaschen im Inkubator bei 37°C
und einem CO2-Gehalt von 5 % kultiviert. Als Kulturmedium wurde DMEM mit einer
Glukosekonzentration von 1 g/l verwendet, das im Fall der Mg63 Zelllinie mit 10 % FCS
(Sigma), im Fall der DH1+/+ Zellline mit 20 % FCS versetzt wurde. Um eine Infektion der
Versuchsdurchführung
45
Zellkulturen durch Bakterien zu vermeiden, wurde dem Medium 1 % der Antibiotikamischung
PSG (Penicillin-Streptomycin-Glutamin) zugefügt. Da beide Zelllinien schnelles Wachstum
aufweisen, wurden die Zellkulturen alle zwei Tage passagiert. Für die Endothelzellen wurden
die Kulturflaschen vorbehandelt. Hierfür wurden 1,5 ml Gelatine-Lösung (2 % Gelatine in
Reinstwasser) mit 2 g/ml humanem Fibronectin (Fn) und 1 % FCS hergestellt, die am Tag
der Passage mit 1,5 ml PBS gemischt wurde. Diese Mischung wurde in die Kulturflaschen
pipettiert, so dass sie den Boden dieser vollständig bedeckte. Anschließend wurde die
Kulturflasche für ca. 1 h inkubiert. Für die Osteosarkomzellen ist diese Vorbehandlung nicht
nötig.
Als erster Schritt der Teilung der Zellkultur wurde das verbrauchte Medium entsorgt. Um
etwaige Rückstände vom Kulturmedium zu entfernen, wurden die Zellen mit PBS (Phosphate
Buffered Saline) gewaschen. Anschließend wurden ca. 2 ml des Enzyms Trypsin in die
Kulturflasche gegeben und gleichmäßig auf dem Flaschenboden verteilt. Die Enzym-Lösung
wurde nach ein paar Sekunden wieder entfernt. Nach einigen Minuten lösten sich die Zellen
vom Flaschenboden und konnten in 10 ml frisches Medium gegeben werden. Zum Teilen der
Zellkultur wurden ein paar Milliliter dieser Lösung (Menge abhängig von der ursprünglichen
Zelldichte) in frisches Kulturmedium in einer neuen Kulturflasche gegeben, so dass sich
wieder ein Volumen von ca. 10 ml ergab. Die Flaschen mit den geteilten Zellkulturen wurden
im Inkubator (37°C, 5 % CO2) gelagert.
Um die Zellen für Experimente verwenden zu können, müssen sie gezählt werden. Dadurch
kann die gleiche Zelldichte im Medium für jeden Versuch garantiert werden. Hierfür wurden
20 µl der Zelllösung mit 20 µl Trypsin (Gibco) gemischt und in eine Neubauer Zählkammer
gegeben. Mithilfe dieser kann die Menge an Zelllösung und frischem Zellkulturmedium
errechnet werden, die gebraucht werden, um die gewünschte Zellzahl pro Probe auszusäen.
3.8.2 Fixierung und Färbung
Nach der gewünschten Kultivierungszeit wurden die Proben aus dem Inkubator genommen
und in 6-Well-Petrischalen gelegt. Zur Fixierung der Zellen auf der Magnesium-Oberfläche
wurde eine Lösung aus 4 % Paraformaledhyd (PFA, Thermo Scientific) und 20 % fötalem
Kälberserum (engl.: fetal calf serum, FCS) in phosphat-gepufferter Salinelösung (engl.:
Phosphate Buffered Saline, PBS, Gibco) hergestellt, zu der Triton X (Sigma) (50µl pro 10ml
Lösung) gegeben wurde. Jede Probe wurde für 20 min in 3 ml der Fixierungslösung
eingelegt und anschließend für einige Minuten in einer 10 %igen FCS Lösung in PBS
gespült.
46
Versuchsdurchführung
Die Zellfärbung erfolgte mittels Phalloidin-Rot (Sigma) und Sytox-Grün (Gibco). Dazu wurde
eine Lösung aus 3 µl Phalloidin-Rot (Anregung bei 556 nm), 1 µl Sytox-Grün (Anregung bei
504 nm) und 1 ml 10 % FCS in PBS hergestellt. Ein Tropfen dieser Lösung wurde auf ein
Stück Parafilm gegeben und pro Tropfen jeweils eine Mg-Probe mit der Oberseite nach
unten für 1 h in die Färbelösung gelegt. Anschließend wurden die Proben in 10 % FCS in
PBS für 5 min auf einem Schüttler gewaschen. Dieser Schritt wurde weitere zweimal
wiederholt. Folgend wurden die Proben kurz mit destilliertem Wasser gespült. Um die Proben
von Wasser zu befreien wurde eine Alkoholreihe durchgeführt. Hierfür wurden die Proben für
je 10 min in 90 %, 96 % und 100 % Isopropanol (Sigma) und zuletzt in Xylol (Sigma)
eingelegt.
Das Eindecken der Proben erfolgte mittels Eukit (Fluka). Jeweils ein Tropfen Eukit wurde
zwischen Objektträger und Mg-Proben bzw. zwischen Mg-Probe und Deckglas gegeben.
Anschließend wurden die eingedeckten Proben über Nacht getrocknet und dunkel gelagert.
3.8.3 Epifluoreszenzmikroskop
Mittels eines Epifluoreszenzmikroskops (Leica DMI 6000 B) wurden Bilder der ProbenOberflächen gemacht. Es wurde ein Objektiv mit 10-facher Vergrößerung und einem
einfachen Kuppler verwendet.
Pro Probe wurden fünf Bilder an unterschiedlichen Stellen aufgenommen. Es wurde auf eine
gleichmäßige Verteilung der betrachteten Ausschnitte geachtet. Von jeder ausgewählten
Stelle wurden zwei Bilder mit einer Auflösung von 1344 x 1024 Pixeln aufgenommen. Um
das Cytoskelett sichtbar zu machen, wurde das Phalloidinrot angeregt, um die Zellkerne
abzubilden, wurde das Sytox Green angeregt.
3.8.4 Methoden zur Auswertung der Zellversuche
Für die Auswertung der Zellversuche anhand der aufgenommenen Bilder wurden eigens für
die Versuche mit Magnesium geschriebene Programme (mittels MATLAB) verwendet.
Ermittelt wurden die Zelldichte sowie die prozentuale Bedeckung der jeweiligen Oberfläche
mit Zellen.
Um die Zelldichte auf den Mg-Proben berechnen zu können, wurde ein Algorithmus zur
Segmentierung und Zählung der Nuclei entwickelt, der es möglich machte, eine große
Menge an Bildern automatisch auszuwerten. Hierfür wurde ein neuer Ansatz für einen
stabilen Algorithmus verwendet, um eine Behinderung durch die teilweise starken
Hintergrundsignale der Mg-Proben zu vermeiden.
Versuchsdurchführung
47
Um den Anteil der mit Zellen bedeckten Fläche zu ermitteln, musste ebenfalls ein stabiler
Algorithmus gefunden werden, dem es möglich war das Hintergrundsignal von der Zellfläche
zu separieren.
48
Ergebnisse und Diskussion
4. Ergebnisse und Diskussion
Das Kapitel „Ergebnisse und Diskussion“ lässt sich thematisch in fünf übergeordnete Teile
gliedern. Im ersten Teil (Kap. 4.1 - 4.3) werden die Ergebnisse der verschiedenen
Proteinbeschichtungen über die Linkermoleküle dargestellt. Hierbei wird auf die Qualität der
gebildeten Schichten und deren Einfluss auf das Korrosionsverhalten von Magnesium
eingegangen. Im zweiten Teil (Kap. 4.4) wird die Passivierung von Magnesium im
Zellkulturmedium dargestellt, wobei die Zusammensetzung der gebildeten Schicht und ihr
Einfluss auf die Korrosionseigenschaften von Magnesium im Mittelpunkt stehen. Der dritte
Teil (Kap. 4.5) zeigt eine Kombination der beiden ersten Teile. Hier wurde analysiert
inwiefern die Funktionalisierung in Zellkulturmedium passivierten Proben mit den
Linkermolekülen
möglich
ist
und
ob
sich
eine
zusätzliche
Erhöhung
der
Korrosionsbeständigkeit ergibt. Im vierten Teil (Kap. 4.6) werden die Ergebnisse der
durchgeführten Versuche zur Adhäsion, zum Wachstum und zur Proliferation von Zellen
gezeigt. Der letzte Teil (Kap.4.7) behandelt den Einfluss verschiedener Versuchsparameter
auf die Magnesiumkorrosion. Hierbei wurde der Elektrolyt, die Temperatur und die
Fließgeschwindigkeit des Elektrolyt variiert.
4.1
Beschichtung von Magnesium mit BSA
Die Ergebnisse im folgenden Kapitel wurden größten Teils bereits publiziert [111].
Killian et al. zeigten, dass eine Anbindung von BSA auf Magnesium möglich ist [112]. Des
Weiteren ergab sich, dass der Einsatz von Linkermolekülen zu einer verbesserten Adhäsion
von Albumin führen kann. Ausgehend von dieser Arbeit wurden, neben dem LinkermolekülSystem Aminopropyltriethoxysilan plus Vitamin C (AV), weitere geeignete Linkermoleküle für
die Anbindung von BSA auf Magnesium gesucht. Dabei wurden vor allem gängige LinkerSysteme für die Proteinimmobilisierung auf Titan oder Gold in Betracht gezogen.
Grundvoraussetzung für die Auswahl von geeigneten Linkermolekülen ist die Löslichkeit in
organischen Lösungsmitteln, da Magnesium in wässrigen Lösungen sehr reaktiv ist und
davon ausgegangen werden muss, dass Linkermolekülbeschichtungen durch ablaufende
Korrosionsprozesse gestört werden. Außerdem wurden Linkermoleküle gewählt, die sich
hinsichtlich der Bindungsmechanismen, die der Adsorption von BSA zugrunde liegen,
unterscheiden. Wie in Kapitel 2.4 beschrieben, werden in dieser Arbeit neben
Aminopropyltriethoxysilan plus Vitamin C (AV), Carbonyldiimidazol (CDI) und Stearinsäure
(SA) als Linkermoleküle für die BSA-Anbindung verwendet. Als Referenz diente eine
lediglich in NaOH vorbehandelte Magnesium-Probe. Bei AV und CDI wird angenommen,
dass die BSA-Beschichtung über Chemisorption geschieht, wobei BSA über eine
Peptidbindung am jeweiligen Linkermolekül anbindet. Bei SA und NaOH hingegen, wird
Ergebnisse und Diskussion
davon
ausgegangen,
dass
49
Proteine
aufgrund
hydrophober
bzw.
hydrophiler
Wechselwirkungen auf der Probenoberfläche physisorbieren.
4.1.1 Oberflächencharakterisierung der Linkermolekülbeschichtungen
Zu Beginn wurden die Magnesiumoberflächen hinsichtlich Qualität und Quantität der
Linkermolekülbeschichtungen untersucht. Hierfür wurden XPS und ToF-SIMS Messungen
durchgeführt.
XPS
Abbildung 17 zeigt die Ergebnisse der XPS-Analyse nach Beschichtung mit den drei
Linkermolekülen und nach NaOH-Passivierung. Näher betrachtet werden die C1s-, N1s-,
O1s- und Mg2p-Signale.
Abbildung 17: XPS-Ergebnisse nach den verschiedenen Linkermolekül-Beschichtungen und nach NaOHPassivierung. Gezeigt werden die C1s-, N1s-, O1s und Mg2p-Signale.
Wie zu erwarten, erreichen die Mg2p- und O1s-Signale ihre höchsten Werte (ca. 25 at%
bzw. ca. 60 at%) für passiviertes Magnesium. Das Verhältnis von O zu Mg beträgt ungefähr
2:1, weshalb davon ausgegangen wird, dass die während der Passivierung in NaOH
gebildete Schicht hauptsächlich aus Mg(OH)2 besteht. Das Kohlenstoffsignal mit Werten um
die 12 at% wird hauptsächlich durch atmosphärische Kontamination verursacht. Wie in
Kapitel 2.1.2 beschrieben, können außerdem an Luft Magnesiumcarbonate gebildet werden.
Diese tragen ebenfalls zum C1s-Signal bei. Das N1s-Signal beträgt etwa 0,1 at% und wird
vom Hintergrundrauschen überlagert. Es kann davon ausgegangen werden, dass sich keine
Stickstoffverbindungen auf der Oberfläche befinden.
Nach AV Beschichtung ist ein starker Anstieg des C1s-Signals (~55 at%) im Vergleich zur
Referenz zu beobachten. Des Weiteren ist ein deutliches Stickstoffsignal (~7 at%) zu
50
Ergebnisse und Diskussion
erkennen, welches durch die Stickstoffatome in den APTES- und Vitamin C Molekülen
verursacht wird. Gleichzeitig sinkt das Mg2p-Signal auf ca. 2 at%. Auch das O1s-Signal
nimmt im Vergleich zur NaOH-Passivierung um etwa die Hälfte ab (~30 at%). Das lässt
darauf schließen, dass sich auf der Oberfläche eine dichte AV Schicht gebildet hat. Wird
angenommen, dass APTES eine Monolage bildet, kann die Dicke der AV Schicht auf kleiner
2 nm geschätzt werden, berechnet aus der Größe der beiden Linkermoleküle. Bei einer
Informationstiefe des XPS von ca. 1-2 nm ist zu erwarten, dass ebenfalls deutliche Signale
des Substrates detektiert werden. Die AV Beschichtung jedoch weist lediglich ein sehr
niedriges Mg2p-Signal einhergehend mit einem unerwartet hohen C1s-Signal auf. Das führt
zu der Annahme, dass APTES eine Multilage auf der Oberfläche bildet. Diese These wird
durch die Arbeit von Howarter et al. [113] gestützt. Es wird berichtet, dass APTES während
des
Beschichtungsprozesses
Multilagen
bilden
kann,
wenn
Wasser
auf
der
Substratoberfläche vorhanden ist. Es ist wahrscheinlich, dass Wasser im vorliegenden
Beschichtungssystem vorhanden ist, da angenommen wird, dass geringe Mengen an
Wasser in der teilweise porösen Mg(OH)2 Schicht über längere Zeiträume gespeichert
werden können.
Nach der CDI Beschichtung ist im Vergleich zur passivierten Magnesiumprobe ebenfalls ein
deutlicher Anstieg des C1s-Signals (34 at%) sowie des N1s-Signals (~19 at%) zu
beobachten. Gleichzeitig nehmen das Mg2p- und das O1s-Signal ab. Auch hier wird deutlich,
dass die Linkermolekülbeschichtung erfolgreich war. Vor allem die hohen Stickstoffsignale
sind charakteristisch für die Anbindung von CDI, da wie in Kapitel 2.4.2 beschrieben,
Imidazol-Carbamate mit den Hydroxylgruppen der Mg(OH)2 Oberfläche gebildet werden. Das
geringere C1s-Signal im Vergleich zur AV Beschichtung lässt sich mit der Größe der
Imidazol-Carbamat-Gruppe und der Vermutung, dass APTES eine Multilage bildet, erklären.
Für die SA Beschichtung wird der C1s-Peak als charakteristisches Signal verwendet. Mit
einer Moleküllänge von ca. 2-3 nm ist die Fettsäure das Größte der drei Linkermoleküle und
besitzt mit 18 C-Atomen den höchsten C-Gehalt. Nach Beschichtung mit SA findet ebenfalls
ein Anstieg des C1s-Signals bezüglich der Referenzprobe statt. Jedoch fällt die Zunahme
des Kohlenstoffgehaltes deutlich geringer aus als für die AV und die CDI Beschichtung.
Sowohl das Mg2p-Signal, als auch das O1s-Signal zeigen kaum eine Veränderung zur
passivierten Probe. Es findet lediglich eine Abnahme der Atomkonzentration von 25 at% auf
23 at% für Mg2p und von 62 at% auf 56 at% für O1s statt. Es muss angenommen werden,
dass SA keine selbstorganisierte Monolage bildet, bei der die Moleküle parallel zueinander
und senkrecht zur Substratoberfläche angeordnet sind. Diese Annahme konnte mittels SFGAnalyse (Sum Frequency Generation) bestätigt werden (hier nicht gezeigt). Es wird vermutet,
dass die SA Moleküle zwar auf der Oberfläche anbinden können, sich jedoch nicht oder nicht
Ergebnisse und Diskussion
51
vollständig aufrichten, so dass die Schichtdicke weniger als einen Nanometer beträgt. Das
erklärt die verhältnismäßig niedrigen C1s-Signale verbunden mit den unerwartet hohen
Signalen, die vom Substrat verursacht werden.
ToF-SIMS
Bei der Linkermolekülbeschichtung sollen die ToF-SIMS Messungen ergänzend zur XPS der
qualitativen Analyse dienen, um das jeweilige Molekül eindeutig auf der Oberfläche
nachzuweisen. Die Ergebnisse der ToF-SIMS Analyse nach Beschichtung mit den
Linkermolekülen sind in Abbildung 18 dargestellt. Es werden für jedes Linker-System
charakteristische Signale ausgewählt. Um Aussagen über den Beschichtungserfolg treffen
zu können, werden zum Vergleich die relevanten Bereiche des Spektrums einer passivierten
Probe gezeigt.
Abbildung 18: Charakteristische ToF-SIMS Signale der drei Linkermoleküle nach Linker Beschichtung
und nach 0,25h BSA Beschichtung im Vergleich zur NaOH Passivierung: a) Signal bei m/z = 28,98,
52
Ergebnisse und Diskussion
verursacht durch SiH+, charakteristisch für APTES, b) m/z = 69,05 charakteristisches Signal für CDI nach
Kondensationsreaktion mit der OH-terminierten Oberfläche, c) Molekülfragment von SA bei m/z = 283,27
Die charakteristischen Signale für die AV Beschichtung sind in Abbildung 18 a dargestellt.
Für APTES wird das Signal bei m/z = 28,98, welches durch SiH+ verursacht wird, gewählt.
Nach AV Beschichtung zeigt sich ein deutlich erkennbares Signal im Vergleich zur
passivierten Probe.
Abbildung 18 b zeigt ein charakteristisches Signal für CDI nach Anbindung auf der
Oberfläche. Der Peak bei m/z = 69,05 wird von C3H5N2+ hervorgerufen. Dieses Fragment
entspricht der -Abspaltung des auf der Oberfläche adsorbierten CDI Moleküls (vgl. Kapitel
2.4.2, Abbildung 7). Auch hier ist erst nach CDI Beschichtung ein Signal erkennbar.
Als charakteristisches Signal für SA wird das Molekülfragment bei einer Masse von
m/z = 283,27 verwendet. Auch hier wird deutlich, dass lediglich bei der SA beschichteten
Probe ein eindeutiges Signal zu sehen ist.
Die
ToF-SIMS
Ergebnisse
Beschichtungserfolg
für
jeden
der
drei
Linkermolekülbeschichtungen
Beschichtungsmechanismus
anhand
zeigen
der
den
jeweiligen
charakteristischen Signale und bestätigen die XPS Ergebnisse. Es kann davon ausgegangen
werden, dass die Linkermoleküle auf der Magnesiumoberfläche angebunden sind.
4.1.2 Oberflächeneigenschaften der Linkermolekülbeschichtung
Oberflächeneigenschaften wie die Rauigkeit und die Hydrophobizität können großen Einfluss
auf die Protein- und Zelladhäsion haben. In Abbildung 19 sind sowohl die Kontaktwinkel von
Wasser, als auch die mittlere und maximale Oberflächenrauigkeit nach Beschichtung mit den
Linkermolekülen und nach NaOH Passvierung sowie von geschliffenem Magnesium
dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion
53
Abbildung 19: a) durchschnittliche und maximale Oberflächenrauigkeit (Rmax, Ra) und b) Kontaktwinkel
von
geschliffenem Magnesium sowie
nach
NaOH-Passivierung
und
nach den
verschiedenen
Linkermolekül-Beschichtungen
Die mittlere Oberflächenrauigkeit von geschliffenem Magnesium (Abbildung 19 a) liegt bei
0,27 µm, die maximale Oberflächenrauigkeit bei 2,22 µm.
Die kaum
vorhandene
Standardabweichung lässt auf eine gute Reproduzierbarkeit der Probenpräparation
schließen. Nach NaOH Passivierung findet ein geringer Anstieg von Ra auf einen Wert von
0,41 µm und von Rmax auf 3,6 µm statt. Die höheren Werte für Ra bzw. Rmax können durch die
Bildung einer Mg(OH)2 Schicht auf der Oberfläche während des Passivierungsvorganges
erklärt werden. Auch hier sind lediglich geringe Standardabweichungen zu erkennen, was
ebenfalls auf eine gute Reproduzierbarkeit bezüglich der Oberflächenrauigkeit im Rahmen
der Auflösungsgrenze des Laserprofilometers schließen lässt. Die Werte für Ra nach AV und
SA Beschichtung zeigen keinen weiteren Anstieg im Vergleich zur passivierten Probe.
Gleiches gilt für die maximale Rauigkeit. Da die Auflösung des Laserprofilometers 0,06 µm
beträgt, kann davon ausgegangen werden, dass sich durch die Beschichtungen mit AV und
SA lediglich Änderungen der Oberflächenrauigkeit unterhalb der Auflösungsgrenze ergeben.
Dies ist zu erwarten, wenn davon ausgegangen wird, dass sich Monolagen bzw.
Submonolagen bilden. Sowohl die mittleren als auch die maximalen Rauigkeiten weisen
lediglich kleine Standardabweichungen auf. Im Gegensatz zur AV und SA Beschichtung ist
nach CDI Beschichtung ein Anstieg von Ra auf etwa 3 µm zu erkennen. Vor allem die
maximale Rauigkeit, welche Werte von ca. 28 µm annimmt und eine Standardabweichung
von 35 % aufweist, zeigt deutlich, dass keine homogene Oberfläche entsteht. Dies ist auf die
Beschichtungsprozedur zurückzuführen. Betrachtet man die Proben nach CDI Beschichtung
wird bereits mit bloßem Auge ein punktförmiger Angriff der Probenoberfläche sichtbar (vgl.
Anhang, Abbildung 73). Als Lösungsmittel für CDI wird Chloroform verwendet. Der korrosive
Probenangriff wird auf Wasser im Beschichtungssystem, welches aufgrund der stark
hygroskopischen Eigenschaften von Chloroform vorhanden ist, zurückgeführt.
Die Kontaktwinkel nach Beschichtung mit den Linkermolekülen, nach NaOH Passvierung
und von geschliffenem Magnesium sind in Abbildung 19 b dargestellt. Nach AV und SA
Beschichtung zeigen die Kontaktwinkel jeweils Werte um die 50°. Die passivierte Probe weist
Kontaktwinkel von etwa 11°, die CDI Probe Kontaktwinkel von etwa 6° auf. Wie erwartet
zeigt die Oberfläche nach Passivierung hydrophilen Charakter, da durch die Bildung der
Mg(OH)2 Schicht eine OH-terminierte Oberfläche entsteht. Zudem wird angenommen, dass
die Passivschicht porös ist. Der Anstieg der Kontaktwinkel nach AV und SA Beschichtung
weist auf eine erfolgreiche Adsorption der beiden Linkermoleküle hin. Für SA Monolagen
werden Kontaktwinkel von bis zu 120° beschrieben [102]. Die hier gemessenen Werte liegen
jedoch deutlich niedriger. Zum einen kann diese Abweichung mit einer unterschiedlichen
54
Ergebnisse und Diskussion
Vorbehandlung der Proben erklärt werden, da der Kontaktwinkel auch immer von der
Oberflächenrauigkeit im nm- und µm-Bereich abhängig ist. Wenn man die XPS Ergebnisse
für die SA Beschichtung betrachtet (vgl. Abbildung 17), ist es jedoch wahrscheinlich, dass
die niedrigen Kontaktwinkel daher rühren, dass sich keine Monolage bildet, bei der sich die
SA Moleküle senkrecht zur Probenoberfläche anordnen. SFG-Messungen ergaben (in dieser
Arbeit
nicht gezeigt),
dass keine
vollständig
CH3-terminierte Oberfläche
sondern
hauptsächlich eine CH2-terminierte Oberfläche entsteht, die geringere Hydrophobizität
besitzt. Die im Vergleich zu den anderen Beschichtungen hohen Standardabweichungen bei
SA weisen auf eine inhomogene Schichtbildung hin. Möglicherweise sind unterschiedliche
Bereiche vorhanden, in denen Moleküle parallel zur Oberfläche liegen oder sich Monolagen
bilden, die jedoch nicht senkrecht zur Oberfläche angeordnet sind. Im Gegensatz zu AV und
SA, besitzt die Oberfläche nach CDI Beschichtung hydrophilen Charakter. Eine mögliche
Erklärung hierfür ist der Einfluss der deutlich höheren Oberflächenrauigkeit. Ebenfalls
wahrscheinlich scheint die Bildung von porösem Mg(OH)2 während der CDI Beschichtung
aufgrund des bereits erwähnten Korrosionsangriffs.
4.1.3 Oberflächencharakterisierung nach BSA-Beschichtung
Die
Charakterisierung
der
BSA-Schichten
wurde
ausschließlich
mittels
ToF-SIMS
vorgenommen. Auf die XPS-Analyse wurde verzichtet, da für den Nachweis von Proteinen
die C1s und N1s Signale verwendet werden und diese teilweise durch die Linkermoleküle
verursacht werden.
Proteine können bei der ToF-SIMS Analyse mittels der charakteristischen Signale der
Aminosäurereste detektiert werden. Für die Charakterisierung der BSA-Beschichtungen
wurde das Signal bei m/z = 110,07, welches von Histidin (His) verursacht wird, und das für
Phenylalanin (Phe) charakteristische Signal bei m/z = 120,08 verwendet. Diese Signale
wurden gewählt, da sie relativ hohe Massen besitzen und somit eine Beteiligung von
Fragmenten der Linkermoleküle an der Peakintensität ausgeschlossen werden kann. Die
beiden Aminosäurereste, die zugehörige detektierte Masse und das Molekülfragment sowie
das prozentuale Vorkommen in BSA sind in Tabelle 9 aufgelistet.
Tabelle 9: Detektierte Masse und prozentuales Vorkommen in BSA von den Aminosäureresten Histidin
und Phenylalanin [69, 70].
Ergebnisse und Diskussion
55
Da es sich bei der ToF-SIMS Analyse um eine semiquantitative Methode handelt, wurden für
die Auswertung der Ergebnisse Peakflächenverhältnisse aus dem jeweiligen Aminosäurerest
und
den
Magnesiumsignalen
gebildet.
So
ist
es
möglich
verschiedene
Beschichtungsmechanismen und unterschiedliche BSA Beschichtungszeiten miteinander zu
vergleichen. Die Aminosäuresignale wurden aus der Literatur übernommen [69, 70]. Für die
Magnesiumsignale wurden die drei isotopen Atommassen m/z = 23.99, m/z = 24.99 und
m/z = 25.983 und das MgH+ Signal bei m/z = 24.99 verwendet.
Abbildung 20 zeigt die Peakflächenverhältnisse His/Mg und Phe/Mg nach der jeweiligen
Linkermolekülbeschichtung und nach 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 3 h und 24 h BSA Beschichtung.
Abbildung 20: ToF-SIMS Ergebnisse: Peakflächenverhältnisse zweier charakteristischer Protein-Signale
(His: Histidin, Phe: Phenylalanin) zu den detektierten Mg-Signalen für die Linkermolekülbeschichtungen
und für verschiedene BSA-Beschichtungszeiten; a) direkte BSA-Beschichtung ohne Verwendung von
Linkermolekülen; b) BSA-Beschichtung via APTES+VitC c) BSA-Beschichtung via CDI; d) BSABeschichtung via SA.
Für alle Linkermoleküle und die NaOH Passivierung ohne BSA Beschichtung gehen beide
Peakflächenverhältnisse gegen 0. Dies ist ein Indiz dafür, dass weder das Signal bei
56
Ergebnisse und Diskussion
m/z = 110,07 noch das Signal bei m/z = 120,08 von einem der Linkermoleküle oder der
Passivierung verursacht wird. Die Referenzserie, bei der keine Linkermoleküle verwendet
wurden, ist in Abbildung 20 a dargestellt. Es ist deutlich zu erkennen, dass sich für alle
Beschichtungszeiten Proteine auf der Oberfläche befinden. Jedoch ist keine eindeutige
Abhängigkeit der Menge an BSA von der Beschichtungszeit ersichtlich. Für 0,25 h ist ein
Anstieg beider Peakflächenverhältnisse auf Werte von 0,16 für His/Mg bzw. 0,12 für Phe/Mg
zu erkennen. Für eine Beschichtungszeit von 0,5 h erreichen sowohl His/Mg als auch
Phe/Mg ihre Tiefstwerte bei ca. 0,07. Bis 3 h steigen beide Peakflächenverhältnisse wieder
an (His/Mg: 0,24, Phe/Mg:0,18) und bleiben auch für eine Beschichtungszeit von 24 h auf
gleichem Niveau. Es zeigt sich, dass sich bereits auf den passivierten Proben BSA auf der
Oberfläche befindet. Es wird angenommen, dass die Anbindung des Proteins über die
Hydroxylgruppen der Mg(OH)2 Schicht erfolgt. Bei hydrophilen Oberflächen spielen auch die
elektrostatischen Wechselwirkungen eine große Rolle bei der Proteinadsorption. Die BSALösung besitzt zu Beginn einen pH-Wert von ca. 5,6. In diesem pH-Bereich ist die Mg(OH)2
Oberfläche stark positiv geladen [114], während BSA einen leichten Überschuss an
negativen Ladungen aufweist. Die elektrostatischen Voraussetzungen für eine Adsorption
von BSA sind somit gegeben. Im Laufe der Beschichtung findet eine leichte Zunahme des
pH-Wertes – bedingt durch den Korrosionsmechanismus von Magnesium – statt. Dies führt
dazu, dass die BSA-Moleküle in Lösung mit zunehmender Beschichtungszeit eine Zunahme
an negativer Ladung erfahren. Die Mg(OH)2 Oberfläche bleibt weiterhin positiv geladen und
somit kann eine stärkere BSA Adsorption erwartet werden.
Die Peakflächenverhältnisse für AV sind in Abbildung 20 b dargestellt. Auch hier können für
alle Beschichtungszeiten deutliche Aminosäuresignale detektiert werden, was darauf
schließen lässt, dass BSA auf der AV Oberfläche gebunden werden kann. Bereits nach
0,25 h erreichen die Peakflächenverhältnisse ihre Maximalwerte (His/Mg: 2,5; Phe/Mg: 1,9).
Nach
einer
Beschichtungszeit
von
0,5 h
findet
eine
signifikante
Abnahme
der
Aminosäurefragmente im Vergleich zu den Mg Signalen statt (His/Mg: 0,52; Phe/Mg: 0,43).
Unter
Berücksichtigung
der
Standardabweichungen
bewegen
sich
die
Peakflächenverhältnisse zwischen 0,5 h und 3 h im selben Bereich. Nach 24 h findet erneut
ein geringer Rückgang der Peakflächenverhältnisse statt. Mit 0,33 (His/Mg) bzw. 0,26
(Phe/Mg) erreichen die Werte hier ihr Minimum. Generell kann bei AV der Trend beobachtet
werden, dass die Peakflächenverhältnisse beider Proteinsignale mit zunehmender BSA
Beschichtungszeit abnehmen. Das bedeutet, im Vergleich zu Magnesium befindet sich
weniger BSA auf der Oberfläche, je länger die Proben der Beschichtungslösung ausgesetzt
sind. Ein Grund für diese Ergebnisse könnte sein, dass APTES und Vitamin C keine
vollständig dichte Schicht auf der Oberfläche bilden. Dies kann zu Korrosion von Magnesium
während der Beschichtung mit BSA in der wässrigen Lösung führen, wobei Mg(OH)2 gebildet
Ergebnisse und Diskussion
57
wird. Auch die dabei stattfindende Wasserstoffentwicklung sowie eine mögliche pH-WertErhöhung an der Oberfläche können die Proteinadsorption beeinflussen. Eine weitere
Erklärung für die Abnahme der Peakflächenverhältnisse könnte die Ablösung der APTES
Moleküle von der Magnesiumoberfläche sein. Es wird berichtet, dass die Bindung zwischen
APTES und der OH-terminierten Oberfläche in wässrigen Lösungen nicht stabil ist [115].
Dies könnte dazu führen, dass je länger sich die AV Proben in der Beschichtungslösung
befinden,
sich
mehr
APTES
Moleküle
von
der
Oberfläche
lösen.
Mit
längerer
Beschichtungszeit kann es zu vermehrter Korrosion und Bildung von Mg(OH)2 kommen.
Abbildung 20 c zeigt die Peakflächenverhältnisse der beiden Aminosäure Signale und
Magnesium für die Vorbehandlung mit CDI. Wie bei der Referenzserie und AV können ab
einer Beschichtungszeit von 0,25 h Aminosäuresignale detektiert werden. Bis 0,5 h findet ein
leichter Anstieg beider Peakflächenverhältnisse statt (His/Mg: 0,14; Phe/Mg: 0,11). 1 h
Beschichtungszeit führt zu einem Rückgang der Werte (His/Mg: 0,08; Phe/Mg: 0,06),
während nach 3 h BSA ein erneuter Anstieg der Peakflächenverhältnisse auf das Niveau der
0,5 h Beschichtung stattfindet (His/Mg: 0,14; Phe/Mg: 0,11). Für 24 h BSA liegen die Werte
wieder im Bereich der 1 h Beschichtung (His/Mg: 0,09; Phe/Mg: 0,08). Es ist deutlich zu
erkennen, dass die Peakflächenverhältnisse für CDI mit denen für die NaOH Passivierung
vergleichbar sind und durchgehend unterhalb der Werte für AV liegen. Die geringe
Adsorption von BSA im Vergleich zur AV Beschichtung ist möglicherweise durch die
hydrophilen Oberflächeneigenschaften der CDI Beschichtung bedingt. Im Allgemeinen findet
Proteinadsorption bevorzugt auf leicht hydrophoben Oberflächen statt [84, 85]. Auch eine
Korrelation zwischen Beschichtungszeit und BSA auf der Oberfläche konnte für CDI nicht
gefunden werden. Jedoch variiert die Oberflächenbedeckung mit BSA lediglich in einem
kleinen Bereich verglichen mit AV.
Die ToF-SIMS Ergebnisse für die BSA Beschichtung via SA sind in Abbildung 20 d
dargestellt. Die höchsten Werte für His/Mg werden nach einer Beschichtungszeit von 0,5 h
erreicht, wobei das Verhältnis Phe/Mg bereits nach 0,25 h maximale Werte annimmt (0,29).
Auffällig ist, dass das Verhältnis von Phe zu His im Allgemeinen für die Anbindung via SA im
Vergleich zu den anderen Beschichtungsmechanismen stark schwankt. Bei 0,25 h ist es im
Vergleich zu den übrigen Beschichtungszeiten sogar verdreht. Möglicherweise weist dies auf
eine bevorzugte Orientierung der Proteine während der anfänglichen Adsorption hin. Ein
weiterer Grund könnten konformative Änderungen aufgrund hydrophober Wechselwirkungen
sein. Ein Vergleich der S2/CNO Verhältnisses aller untersuchten Beschichtungssysteme
zeigte jedoch keine Unterschiede für die verschiedenen Linker und Beschichtungszeiten. Für
1h
BSA
Beschichtung
nehmen
beide
Peakflächenverhältnisse
ab.
Das
Peakflächenverhältnis His/Mg zeigt eine weitere Abnahme bis 24 h (ca. 0,2), während sich
58
Ergebnisse und Diskussion
das Verhältnis Phe/Mg nur geringfügig und im Bereich der Standardabweichung ändert. Für
die BSA Beschichtung via SA erweisen sich – ebenfalls wie bei AV – kurze
Beschichtungszeiten als erfolgversprechender was die BSA Adsorption auf der Oberfläche
betrifft. Für längere Zeiten (ab 3 h) liegen die Werte für beide Peakflächenverhältnisse im
Bereich derer für die Referenzserie. Auch hier wird als Grund für die niedrigen
Peakflächenverhältnisse bei längeren Beschichtungszeiten die unvollständige Bedeckung
der Magnesium Oberfläche mit dem Linkermolekül und die damit verbundene Korrosion
angenommen. Die Bildung von Mg(OH)2 führt zu einem relativen Anstieg der Mg-Signale.
Die Ergebnisse der ToF-SIMS Analyse zeigen, dass für alle untersuchten Mechanismen zur
Proteinanbindung BSA auf der jeweiligen Oberfläche gefunden wird. Während für AV und SA
die höchsten Peakflächenverhältnisse für die kurzen Beschichtungszeiten erzielt werden, ist
für CDI und die direkte Anbindung keine Korrelation der adsorbierten Menge an BSA mit der
Beschichtungszeit
vorhanden.
AV
weist
im
Vergleich
durchgängig
die
höchsten
Peakflächenverhältnisse auf, wobei sowohl für Phe/Mg, als auch für His/Mg die höchsten
Werte für eine Beschichtungszeit von 0,25 h erreicht werden. Für SA ist anfänglich eine
stärkere BSA-Adsorption als für CDI und NaOH zu erkennen. Die Werte für die längeren
Beschichtungszeiten gleichen sich jedoch an. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass vor
allem die Hydrophobizität der Oberflächen eine große Rolle spielt, da die vergleichsweise
höchste Proteinadsorption bei AV und SA erzielt wird, welche beide Kontaktwinkel im leicht
hydrophoben Bereich aufweisen.
4.1.4 Elektrochemie in SBF
Um Informationen über den Einfluss der Linkermolekül- sowie der verschiedenen BSASchichten auf die Korrosion von Magnesium zu erhalten, wurden zunächst EIS-Messungen
in SBF bei Raumtemperatur durchgeführt. Vor Beginn der EIS-Messungen wurde jeweils für
75 min das Ruhepotential (OCP) aufgezeichnet. Die OCP-Verläufe werden in dieser Arbeit
nur in einigen wenigen relevanten Fällen gezeigt, da die Messung des Ruhepotentials vor
allem dazu diente ein stabiles Potential für die EIS-Messungen zu garantieren. Die
Auswertung der Impedanzspektren erfolgt mittels der Nyquist-Plots. Für jedes Linkermolekül
und jede BSA Beschichtungszeit wurden mindestens drei Proben gemessen. Dargestellt
werden jeweils eine repräsentative Kurve sowie der aus den Nyquist-Plots berechnete
mittlere Ladungsdurchtrittswiderstand RD mit der zugehörigen Standardabweichung.
Als Referenz wurden geschliffenes und zusätzlich in NaOH passiviertes Magnesium
gemessen. Die zugehörigen Ergebnisse sind in Abbildung 21 dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion
59
Abbildung 21: EIS-Ergebnisse der beiden Vorbehandlungsschritte Schleifen und Passivieren, a) NyquistPlots von je einer repräsentativen Messung, b) durchschnittliche Ladungsdurchtrittswiderstände (R D).
Beide Nyquist-Kurven zeigen die gleiche Form und liegen im selben Wertebereich. Zunächst
bildet sich ein größerer Halbkreis (Durchmesser ca. 300 *cm²). Der zweite deutlich kleinere
Halbkreis (Durchmesser ca. 100-150 *cm²) schließt sich an den ersten an, wobei die
beiden Halbkreise sich nicht vollständig voneinander abgrenzen. Zwei Halbkreise im NyquistPlot sind gleichbedeutend mit dem Auftreten von zwei Zeitkonstanten [88]. Überlappen sich
die Halbkreise, überschneiden sich die beiden Zeitkonstanten. Generell weisen zwei
Halbkreise im Nyquist-Plot auf eine Schicht hin, die die Oberfläche nicht komplett vor
Korrosion schützt. Aufgrund von Poren oder Fehlstellen in der Schicht kann Elektrolyt an die
Substratoberfläche vordringen. Die Gesamtimpedanz beinhaltet zwei unterschiedliche
kapazitive Anteile. Zum einen die Kapazität, die durch die Phasengrenze Substrat-Elektrolyt
gegeben ist, zum anderen die Kapazität, die durch die Schicht auf der Oberfläche verursacht
wird. Die Induktivitäten (Werte < 0 bei niedrigen Frequenzen) werden durch die Auflösung
des Substrates unter der Schicht hervorgerufen. Induktivitäten sind im Nyquist-Plot anhand
eines Halbkreises zu erkennen, der sich im negativen Bereich entlang der x-Achse zum
Ursprung zurück bildet. Je mehr Magnesium in Lösung geht, desto größer sind die
Induktivitäten und desto größer wird jener Halbkreis [88].
Ein Grund, der das ähnliche Verhalten von geschliffenem und passiviertem Magnesium
erklärt, ist die Auflösung der Mg(OH)2 Schicht, die während der NaOH-Passivierung gebildet
wird. Aufgrund des pH-Wertes und der hohen Cl--Konzentration der SBF ist Mg(OH)2 nicht
stabil. Betrachtet man den Verlauf des Ruhepotentials vor der EIS-Messung (Anhang,
Abbildung 74), bestätigt sich diese Annahme. Während bei geschliffenem Magnesium in den
ersten 15 Minuten ein Anstieg des OCP von -1,86 V auf -1,82 V erfolgt, nimmt das
Ruhepotential der NaOH-passivierten Probe von -1,65 auf -1,81 bis ca. 30 Minuten ab. Im
weiteren Verlauf variieren die Werte beider Kurven kaum und bilden ein Plateau, das etwa
60
Ergebnisse und Diskussion
auf gleichem Niveau liegt. Die Abnahme des OCP von passiviertem Magnesium lässt darauf
schließen, dass sich die auf der Oberfläche vorhandene Mg(OH)2 Schicht auflöst, sobald sie
mit dem Elektrolyten in Kontakt kommt. Die mittleren Ladungsdurchtrittswiderstände
(Abbildung 21 b) beider Vorbehandlungsschritte liegen wie aufgrund der Nyquist-Plots zu
erwarten in einem engen Bereich. Die mittleren RD Werte für geschliffenes Magnesium liegen
bei ca. 0,22 *cm². Unter Berücksichtigung der Standardabweichungen, ändern sich die
Werte für die NaOH-Passivierung kaum.
Der Einfluss der Linkerbeschichtungen auf die Magnesiumkorrosion ist in Abbildung 22
dargestellt.
Abbildung 22: EIS-Ergebnisse der Linkermolekülbeschichtungen mit AV, CDI und SA; a) Nyquist-Plots je
einer repräsentativen Messung, b) mittlere Ladungsdurchtrittswiderstände (R D) mit der zugehörigen
Standardabweichung.
Wie auch bei geschliffenem und passiviertem Magnesium zeigen die Beschichtungen mit
den Linkermolekülen eine ähnliche Form der Nyquist-Plots, was darauf hinweist, dass keine
grundsätzliche Änderung des Korrosionsmechanismus durch die Linkeranbindung stattfindet.
Im Vergleich zu NaOH-passiviertem Magnesium wird für AV sowie für SA eine deutliche
Erhöhung des mittleren Ladungsdurchtrittswiderstandes beobachtet, wobei die höchsten
Werte nach AV-Beschichtung erreicht werden (1,53 k*cm²). Jedoch zeigen beide
Beschichtungen vergleichsweise hohe Schwankungen. Für CDI findet lediglich eine leichte
Zunahme von RD im Vergleich zur NaOH-Passivierung auf rund 0,29 k*cm² statt. Diese
Ergebnisse korrelieren mit denen der Oberflächenanalyse der Linkerbeschichtungen. Der
gute
Beschichtungserfolg
von
AV
führt
zu
einer
starken
Erhöhung
der
Korrosionsbeständigkeit, während CDI, aufgrund der bereits während der Beschichtung
auftretenden Korrosion, die vergleichsweise schlechtesten Ergebnisse erzielt. SA befindet
sich im Mittelfeld zwischen CDI und AV, weist jedoch die höchste Standardabweichung auf.
Ergebnisse und Diskussion
61
Auch dies lässt sich anhand der Oberflächencharakterisierung erklären, die auf eine nicht
dichte, teilweise inhomogene Schichtbildung von SA auf der Mg-Oberfläche hinweist.
Abbildung 23 zeigt den Einfluss der BSA-Adsorption auf die Korrosionsbeständigkeit der
NaOH passivierten Proben.
Abbildung 23: EIS-Ergebnisse der Magnesiumproben, die ohne die Verwendung von Linkermolekülen mit
BSA beschichtet wurden; a) Nyquist-Plots von je einer repräsentativen Messung, b) durchschnittliche
Ladungsdurchtrittswiderstände (RD) und zugehörige Standardabweichungen nach NaOH-Passivierung
und zusätzlicher BSA-Beschichtung.
Auch nach der Beschichtung mit BSA zeigen die Nyquist-Plots eine ähnliche Form wie bei
reinem Magnesium und nach Passivierung. Für alle Beschichtungszeiten sind zwei
Halbkreise und Induktivitäten zu erkennen. Allerdings liegen die Werte für alle BSABeschichtungen höher als die für die passivierten Proben. Dies zeigt zum einen den
positiven Einfluss von adsorbiertem BSA auf die Korrosionsbeständigkeit von Magnesium.
Zum anderen wird jedoch klar, dass BSA keine dichte Schicht auf der Oberfläche bildet, die
Magnesium vollständig passiviert. Wie in Abbildung 23 b zu sehen ist, führen vor allem kurze
Beschichtungszeiten
(0,25-3 h)
zu
einem
deutlichen
Anstieg
des
Ladungsdurchtrittswiderstandes (bis ca. 1,60 k*cm²). Jedoch weisen gerade die kurzen
Beschichtungszeiten teilweise extrem hohe Schwankungen von bis zu 1,1 k*cm² auf. Unter
Berücksichtigung der Standardabweichungen, liegen die RD Werte zwischen 0,25 h und 3 h
im selben Bereich. Für eine Beschichtungszeit von 24 h findet ein deutlicher Rückgang des
RD auf etwa 0,34 k*cm² statt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die BSA Beschichtung einen
deutlichen Einfluss auf die Korrosionsbeständigkeit von Magnesium hat. Jedoch konnte
keine Korrelation zwischen RD und der BSA Menge auf der Oberfläche gefunden werden
(vgl. ToF-SIMS Ergebnisse Abbildung 20 a)). Des Weiteren weist die direkte BSABeschichtung eine niedrige Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf.
62
Ergebnisse und Diskussion
Vor allem auf hydrophilen Oberflächen spielen die elektrostatischen Wechselwirkungen eine
große Rolle bei der Proteinadsorption. Der pH-Wert der BSA-Lösung beträgt zu Beginn ca.
5,6. Bei diesem pH ist die Mg(OH)2 Oberfläche sehr stark positiv, BSA leicht negativ
geladen. Eine Proteinanbindung ist möglich. Aufgrund von Korrosion in der wässrigen
Beschichtungslösung findet ein pH-Anstieg statt, der zunächst zu einer höheren negativen
Gesamtladung von BSA und einer weniger positiven Oberflächenladung führt und so zu
einer stärkeren Wechselwirkung führen müsste. Möglicherweise lassen sich so die
anfänglich hohen Standardabweichungen erklären. Je nachdem, wie stark die pH-WertErhöhung zu Beginn ist, kommt es zu unterschiedlich starker Adsorption von BSA auf der
Mg-Oberfläche. Da BSA bei diesem Anbindungsmechanismus wahrscheinlich nicht
dauerhaft fest gebunden wird, ist auch eine stetige Ad- und Desorption möglich, welche
ebenfalls
starke
Schwankungen
auslösen
können.
Die
Abnahme
der
Ladungsdurchtrittswiderstände für die 24 h BSA-Beschichtung auf das Niveau der NaOHPassivierung rührt möglicherweise daher, dass hier verhältnismäßig viel Mg(OH) 2 aufgrund
der stetigen pH-Wert-Erhöhung, vor allem an der Mg-Oberfläche, gebildet wird und mit der
BSA-Adsorption konkurriert. Wie bei der reinen Passivierung kommt es zu einer Auflösung
der hauptsächlich aus Mg(OH)2 bestehenden Schicht in SBF.
Die Ergebnisse der EIS nach AV- bzw. nach zusätzlicher BSA-Beschichtung sind in
Abbildung 24 dargestellt.
Abbildung 24: EIS-Ergebnisse der Magnesiumproben, die mit APTES plus VitC und BSA beschichtet
wurden,
a)
Nyquist-Plots
von
je
einer
repräsentativen
Messung,
b)
durchschnittliche
Ladungsdurchtrittswiderstände (Rd) der Linkermolekül-Beschichtung und der verschiedenen BSABeschichtungszeiten.
Die Nyquist-Plots unterscheiden sich kaum in ihrer Form jedoch deutlich in ihren Werten. Die
ebenfalls vorhandenen zwei Halbkreise zeigen, dass sowohl die AV Schicht als auch die
zusätzlichen BSA Schichten die Oberfläche nicht komplett bedecken oder Poren und
Fehlstellen aufweisen. Zunächst wird deutlich, dass sowohl die reine AV-, als auch alle BSA-
Ergebnisse und Diskussion
Beschichtungen
signifikant
63
höhere
Ladungsdurchtrittswiderstände
als
die
beiden
Vorbehandlungen (geschliffen und NaOH-passiviert) besitzen (vgl. Abbildung 21). AV ohne
zusätzliche
BSA
Beschichtung
zeigt
die
höchsten
durchschnittlichen
RD
Werte
(~1,5 k*cm²). Jedoch sind für die reine AV Beschichtung die Standardabweichungen am
höchsten (ca. 0,44 k*cm²). Die Ladungsdurchtrittswiderstände der BSA Beschichtungen bis
3 h variieren lediglich im Bereich der Standardabweichungen. Erst für eine Beschichtungszeit
von 24 h ist eine deutliche Abnahme von RD auf einen Wert von ca. 0,70 k*cm² zu
erkennen. Der Fehler für 0,25 h, 0,5 h und 1 h BSA liegt bei etwa 0,25 k*cm² und fällt somit
geringer aus als für AV ohne BSA Beschichtung. Für 3 h und 24 h BSA gehen die
Standardabweichungen weiter zurück (0,06 bzw. 0,05 k*cm²). Die Beschichtung mit AV
zeigt bereits eine deutliche Verbesserung der Korrosionseigenschaften gegenüber
geschliffenem und passiviertem Magnesium. Für kurze Beschichtungszeiten (bis 3 h) zeigt
sich keine zusätzliche Verbesserung der Korrosionsresistenz gegenüber AV. 24 h BSA
scheint einen negativen Einfluss zu haben. Auch im Vergleich zur Referenzserie kann durch
die BSA-Beschichtungen via AV keine höhere Korrosionsbeständigkeit erzielt werden.
Lediglich die Reproduzierbarkeit nimmt deutlich zu. Es wird angenommen, dass die
Ablösung der APTES Moleküle in wässriger Umgebung der Hauptgrund dafür ist, dass keine
Verbesserung der Korrosionseigenschaften durch die Proteinadsorption erzielt werden kann.
Durch die Beschichtung in der wässrigen BSA-Lösung wird die AV-Oberfläche bereits
angegriffen. Wie oben beschrieben, ist eine Spaltung der Bindung zwischen APTES und der
OH-terminierten Oberfläche wahrscheinlich. Dadurch kommt es zur Korrosion von
Magnesium und zur Bildung von Mg(OH)2 bereits während der Beschichtung mit BSA.
Obwohl sich nach kurzen Beschichtungszeiten (vgl. Abbildung 20 a) vergleichsweise viel
BSA auf der Oberfläche befindet, kann kein positiver Effekt beobachtet werden. Es scheint
eine Abhängigkeit der Korrosionsbeständigkeit von der Beschichtungszeit zu bestehen. Die
24 h Beschichtungen weisen die niedrigsten Ladungsdurchtrittswiderstände auf. Je länger
sich die Proben in der BSA-Lösung befinden, desto mehr APTES-Moleküle lösen sich von
der Oberfläche und mit ihnen ebenfalls die gebundenen BSA-Moleküle. Eine vermehrte
Bildung von Mg(OH)2 wird möglich.
Die Nyquist-Plots für CDI und die zugehörigen BSA-Beschichtungen (Abbildung 25 a) zeigen
sowohl untereinander als auch im Vergleich zu den Vorbehandlungen und der Referenzserie
ähnliche Verläufe. Auch hier wird deutlich, dass weder die CDI- noch die BSABeschichtungen die Oberfläche vollständig bedecken.
64
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 25: EIS-Ergebnisse der Magnesiumproben, die mit CDI und BSA beschichtet wurden, a)
Nyquist-Plots von je einer repräsentativen Messung, b) durchschnittliche Ladungsdurchtrittswiderstände
(Rd) der Linkermolekül-Beschichtung und der verschiedenen BSA-Beschichtungszeiten.
Bis zu einer Beschichtungszeit von 0,5 h findet ein Anstieg von RD auf ca. 2,20 k*cm² statt.
Anschließend nehmen die Ladungsdurchtrittswiderstände bis 24 h kontinuierlich ab. Hier
werden durchschnittliche Werte um 1,20 k*cm² gemessen. Die Standardabweichungen
liegen zwischen 0,09 k*cm² für die reine CDI Beschichtung und 0,58 k*cm² für 0,5 h BSA.
Damit ist die Reproduzierbarkeit zwar deutlich besser als für die Referenzserie, steht im
Durchschnitt jedoch der Reproduzierbarkeit der Beschichtungen via AV nach. Die BSAAdsorption zeigt hier durchweg positiven Einfluss auf die Korrosionsbeständigkeit. 0,5 h BSA
erreichen im Vergleich zu allen Beschichtungen ohne Linker und via AV die höchsten RDWerte. Eine Korrelation der EIS-Ergebnisse mit den Ergebnissen der ToF-SIMS Analyse
(vgl. Abbildung 20 c) ergibt sich nur teilweise. Bis zu einer Beschichtungszeit von 1 h sind die
Ergebnisse der Oberflächenanalyse und die der Elektrochemie konform. Für 3 h und 24 h
treten jedoch Abweichungen auf. Da die Oberfläche nach CDI-Beschichtung sehr hydrophil
ist, spielen auch hier bei der BSA-Adsorption die elektrostatischen Wechselwirkungen eine
große
Rolle.
Aufgrund
des
während
der
CDI-Vorbehandlung
stattfindenden
Korrosionsangriffes kann davon ausgegangen werden, dass die Oberfläche teilweise von
Mg(OH)2 bedeckt ist. Im Vergleich zur direkten BSA-Anbindung, kann eine kovalente
Bindung zwischen Protein und den Carbamat-Gruppen gebildet werden. Diese kovalenten
Bindungen sind möglicherweise ein Grund für die verbesserte Reproduzierbarkeit im
Vergleich zur direkten Beschichtung.
Abbildung 26 zeigt die EIS-Ergebnisse der SA-Serie.
Ergebnisse und Diskussion
65
Abbildung 26: EIS-Ergebnisse der Magnesiumproben, die mit SA und BSA beschichtet wurden, a)
Nyquist-Plots von je einer repräsentativen Messung, b) durchschnittliche Ladungsdurchtrittswiderstände
(Rd) der Linkermolekül-Beschichtung und der verschiedenen BSA-Beschichtungszeiten.
Wie bei den vorherigen Beschichtungen zeigen die Nyquist-Plots auch hier zwei mehr oder
weniger stark ausgeprägte Halbkreise und induktive Anteile. Wie bereits in Abbildung 22
gezeigt wurde, weist die SA Beschichtung eine Zunahme des RD von ca. 0,45 k*cm²
gegenüber passiviertem Magnesium auf. Nach BSA-Beschichtung findet eine weitere
Erhöhung der Ladungsdurchtrittswiderstände für Zeiten zwischen 0,25 h und 3 h statt. Die
BSA-Beschichtungen
für
0,25 h
bis
1h
variieren
dabei
im
Bereich
der
Standardabweichungen zwischen 1,60 und 1,90 k*cm². Für 3 h ist bereits ein Rückgang
der RD-Werte zu erkennen (~1,00 k*cm²). Die Werte für 24 h BSA liegen auf dem Niveau
der
reinen
SA-Beschichtung
und
stellen
somit
keine
Verbesserung
der
Korrosionsbeständigkeit gegenüber dieser dar. Die Standardabweichungen liegen für SA,
0,25 h und 1 h bei Werten zwischen ca. 0,50 k*cm² und ca. 0,75 k*cm². Für 3 h und 24 h
nehmen die Schwankungen ab. 0,5 h weist die geringsten Standardabweichungen auf.
Wie bei den BSA-Beschichtungen via CDI, bestätigen die EIS-Ergebnisse die Vermutung,
dass SA keine dichte Schicht auf der Oberfläche bildet (vgl. Kapitel 4.1.2, Abbildung 17).
Auch die adsorbierten BSA-Moleküle führen nicht zu einer porenfreien Schutzschicht. Kurze
Beschichtungszeiten (0,25 h bis 1 h) erzielen jedoch gute Ergebnisse im Vergleich mit den
BSA-Beschichtungen via AV und CDI. Die durchschnittliche Reproduzierbarkeit hingegen ist
vor allem im Vergleich mit der AV-Serie gering.
Die EIS-Ergebnisse zeigen, dass durch die Beschichtung mit Linkermolekülen und Proteinen
die Korrosionsbeständigkeit von reinem bzw. passiviertem Magnesium in SBF erhöht werden
kann. Tabelle 10 fasst die Ergebnisse der Elektrochemie in SBF zusammen.
66
Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 10: Zusammenfassung der EIS-Ergebnisse, gemessen in SBF bei RT.
RD in SBF (W*cm-2)
Mg
NaOH
AV
CDI
SA
224
207
1584
1533
1274
294
1152
657
1948
0,5h BSA
1239
1400
2169
1578
1h BSA
3h BSA
24h BSA
1565
1586
339
1385
1226
678
1498
1191
690
1683
998
526
0h BSA
0,25h BSA
Unter den reinen Linkerbeschichtungen weist AV die größte Zunahme von RD im Vergleich
zu Mg auf. Wie bereits erwähnt, wird die verhältnismäßig hohe Korrosionsbeständigkeit von
AV auf die Bildung einer dichten Multilage von APTES-Molekülen zurückgeführt. CDI und SA
bewirken hingegen keine bzw. lediglich eine geringe Erhöhung der Durchtrittswiderstände.
Probleme
bei
der
CDI-Beschichtung
stellen
möglicherweise
die
nicht
vollständig
wasserfreien Lösungen dar, wodurch es bereits während der Beschichtung mit CDI zu
vermehrter Korrosion von Magnesium kommt. Die im Vergleich zu AV relativ geringen R DWerte von SA sind auf den Anbindungsmechanismus von SA auf Mg zurückzuführen. Hier
entstehen nicht wie erwartet selbstorganisierte Monolagen, die Moleküle scheinen sich eher
parallel zur Oberfläche anzuordnen und bilden keine dichte homogene Schicht. Die
Ergebnisse
für
die
zusätzlichen
BSA-Schichten
zeigen
zunächst,
dass
kurze
Beschichtungszeiten (0,25-0,5 h) die vergleichsweise besten RD-Werte aufweisen. In
physiologischer Umgebung wird bereits nach wenigen Sekunden eine nahezu vollständige
Belegung einer Oberfläche mit Proteinen erwartet. Jedoch haben die jeweiligen
Oberflächeneigenschaften großen Einfluss. Neben der Hydrophobizität der Oberfläche,
spielen elektrostatische Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Für die deutlich reduzierte
Anbindung von BSA für längere Beschichtungszeiten kann unter anderem eine pH-WertErhöhung (vor allem an der Oberfläche) und die damit veränderten elektrostatischen
Wechselwirkungen verantwortlich sein. Ein weiterer Grund ist die konkurrierende Bildung von
Mg(OH)2, die ebenfalls durch eine pH-Wert-Erhöhung vermehrt stattfindet. Für alle
Beschichtungssysteme, außer für AV, wird durch die BSA Adsorption eine Verbesserung der
Korrosionseigenschaften erzielt. Die höchsten Ladungsdurchtrittswiderstände werden bei der
BSA Anbindung via CDI und SA erreicht.
Ergebnisse und Diskussion
4.1.5
67
Wasserstoffmessungen
Ein wichtiger Aspekt für den Einsatz von Magnesium als Implantatmaterial, neben der zu
schnellen
Auflösung
in
physiologischer
Umgebung
und
der
damit
verbundenen
ungenügenden Stabilität, ist die durch den Korrosionsmechanismus von Magnesium
bedingte Wasserstoffentwicklung. Ist diese zu hoch, kann es nach Implantation zu
Schädigungen des umliegenden Gewebes kommen. Neben der EIS wurden daher ebenfalls
Wasserstoffmessungen durchgeführt um die verschiedenen Linkermolekül- und BSASchichten hinsichtlich des frei werdenden H2-Volumens zu charakterisieren. Gleichzeitig ist
die Wasserstoffentwicklung ein Maß für die Korrosion. Um einen besseren Eindruck über die
H2-Entwicklung in vivo zu gewinnen wurden die Wasserstoffmessungen in DMEM bei 37°C
durchgeführt. Um das Wachstum von Mikroorganismen während der Messung zu vermeiden,
wurde dem Medium 1% Natriumazid (ca. 1,54 M) zugefügt. Dies entspricht der Menge an
NaN3, die in der ebenfalls in dieser Arbeit verwendeten SBF vorhanden ist. Das entstandene
H2-Volumen wurde jeweils nach 1, 2, 3 und 24 h abgelesen. Des Weiteren wurden zwei H2Entwicklungsraten RH1 und RH2 berechnet. RH1 stellt dabei die Wasserstoffentwicklungsrate
innerhalb
der
ersten
Stunde
in
DMEM
dar.
RH2
bezeichnet
die
Rate
der
Wasserstoffentwicklung für den Bereich zwischen 3 h und 24 h Auslagerungszeit in DMEM.
Abbildung 27 zeigt die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen der verschiedenen
Vorbehandlungsschritte.
Abbildung 27: Vergleich der Ergebnisse der Wasserstoffmessungen der Vorbehandlungsschritte; a)
geschliffenes und in 1M NaOH passiviertes Magnesium; b) Magnesium nach Beschichtung mit den
Linkermolekülen AV, CDI und SA.
Generell kann die Kinetik der Wasserstoffentwicklung in drei Bereiche unterteilt werden.
Zunächst findet innerhalb der ersten Stunde ein steiler Anstieg des Wasserstoffvolumens
statt. Zwischen einer Auslagerungszeit von 3 h und 24 h zeigen viele Kurven ein Plateau
oder eine deutlich geringe Steigung im Vergleich zur ersten Stunde. Zwischen 1 h und 3 h
68
Ergebnisse und Diskussion
befindet sich ein Übergangsbereich, in dem die Kurven abflachen. Bei geschliffenem
Magnesium (Abbildung 27 a)) steigt die Wasserstoffentwicklung nach 1 h auf ca.
0,42 ml/cm². Bis zu einer Auslagerungszeit von 3 h findet ein weiterer geringer Anstieg auf
etwa 0,54 ml/cm² statt. Nach einer Auslagerungszeit von 24 h tritt kaum eine Zunahme des
Wasserstoffvolumens auf (0,57 ml/cm²). Die Wasserstoffentwicklung scheint ein Plateau zu
erreichen und die H2-Entwicklungsrate nimmt von ca. 10 ml*cm-2*d-1 in der ersten Stunde auf
0,035 ml*cm-2*d-1 für RH2 ab (vgl. Abbildung 28). Nach der NaOH-Passivierung fällt der
anfängliche Anstieg der Wasserstoffentwicklung etwas geringer aus als bei geschliffenem
Mg (0,34 ml/cm² nach 1 h). Nach einer Auslagerungszeit von 3 h werden Werte von
0,43 ml/cm² erreicht. Im Gegensatz zu geschliffenem Mg folgt jedoch kein Plateau für den
Bereich zwischen 3 h und 24 h, die Wasserstoffentwicklung nimmt weiter deutlich zu.
Abbildung 28 zeigt, dass RH2 mit einem Mittelwert von ca. 0,41 ml*cm-2*d-1 Werte annimmt,
die in etwa das Zehnfache im Vergleich zu unbehandeltem Mg betragen. Zudem nimmt die
Reproduzierbarkeit nach NaOH-Passivierung deutlich ab.
Abbildung 28: Wasserstoffentwicklungsraten der verschiedenen Vorbehandlungsschritte: geschliffenes
und in NaOH passiviertes Magnesium und zusätzlich mit den drei verschiedenen Linkermolekülen
beschichtetes Magnesium. Es wurde jeweils das Wasserstoffvolumen pro cm² pro Tag für die erste
Stunde in DMEM und zwischen 3 und 24 h Auslagerung berechnet.
Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen nach Beschichtung mit den Linkermolekülen sind
in Abbildung 27 b dargestellt. Während der ersten Stunde zeigt SA mit einer
Wasserstoffentwicklung
von
0,26 ml/cm²
die
besten
Ergebnisse,
gefolgt
von
AV
(0,32 ml/cm²) und CDI (0,47 ml/cm²). Dieser Trend bleibt auch nach einer Auslagerungszeit
von 3 h und 24 h bestehen. Jedoch nähert sich die SA-Kurve der AV-Kurve an. Bei 24 h
zeigen beide Beschichtungen eine Wasserstoffentwicklung von ca. 0,5 ml/cm². Während die
H2-Entwicklung für AV und CDI zwischen 3 h und 24 h nahezu ein Plateau bildet, steigt das
H2-Volumen für SA in diesem Bereich deutlich stärker an. Dies wird auch in Abbildung 28 bei
Ergebnisse und Diskussion
69
einem Vergleich der RH2-Werte deutlich. Vor allem AV zeigt mit 0,016 ml*cm-2*d-1 eine sehr
geringe H2-Entwicklungsrate zwischen 3 h und 24 h Auslagerung in DMEM. Die geringen
Standardabweichungen
der
AV-
und
CDI-Beschichtung
weisen
auf
eine
gute
Reproduzierbarkeit hin. Im Gegensatz dazu treten bei SA vor allem innerhalb der ersten
Auslagerungsstunde deutlich höhere Schwankungen auf.
Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen der verschiedenen Vorbehandlungsschritte in
Abbildung 27 und Abbildung 28 zeigen, dass alle Vorbehandlungsschritte anfänglich eine
relativ hohe Wasserstoffentwicklung aufweisen. Geschliffenes Magnesium liegt auf einem
Niveau von etwa 10 ml*cm-2d-1. Die Passivierung in 1 M NaOH führt zu einer leichten
Abnahme des frei werdenden Wasserstoffes während der ersten Stunde. Sowohl die AV-,
als auch die SA-Beschichtung haben eine weitere Verringerung der anfänglichen
Wasserstoffentwicklung zur Folge, wobei für SA durchschnittlich die besten Ergebnisse
erzielt werden. Die CDI-Beschichtung zeigt hingegen eine Zunahme des frei werdenden
Wasserstoffvolumens
gegenüber
geschliffenem
Mg.
Betrachtet
man
die
Wasserstoffentwicklungsraten für den Bereich zwischen 3 h und 24 h (RH2), so wird klar,
dass bereits bei geschliffenem Magnesium die H2-Entwicklung nach 3 h Auslagerung in
DMEM signifikant abnimmt (RH2 = 0,035 ml*cm-2*d-1). Eine weitere Verringerung von RH2
kann lediglich durch die AV-Beschichtung erzielt werden (RH2 = 0,016 ml*cm-2*d-1). Die CDIBeschichtung weist eine Wasserstoffentwicklungsrate RH2 von etwa 0,04 ml*cm-2*d-1 und
liegt somit im Bereich der Werte für geschliffenes Mg und stellt keine Verbesserung dar.
Obwohl SA insgesamt die geringste Wasserstoffentwicklung aufweist, nimmt RH2 den
höchsten Wert der verglichenen Linkermolekülbeschichtungen an.
Diese Ergebnisse sind nur teilweise mit denen der EIS-Messungen in Einklang zu bringen.
Unerwartet scheint zunächst die deutliche Zunahme der Wasserstoffentwicklung der NaOHpassivierten Proben im Vergleich zu geschliffenem Mg, während die Nyquist-Plots und
Ladungsdurchtrittswiderstände beider Proben kaum Unterschiede aufweisen (vgl. Abbildung
21). Dieses abweichende Verhalten könnte durch die Änderung der Parameter Elektrolyt,
Temperatur
und
Messdauer
Korrosionsverhalten
könnte
währen
der
sich
mit
H2-Messungen
zunehmender
zustande
kommen.
Temperatur,
Das
anderer
Elektrolytzusammensetzung und über eine Auslagerungszeit von 24 h signifikant verändern.
Die Ergebnisse der AV- und SA-Beschichtung hingegen zeigen bei der Wasserstoffmessung
wie auch bei der EIS eine Verbesserung bezogen auf geschliffenes und passiviertes Mg.
Jedoch weist SA bei der H2-Entwicklung bessere Ergebnisse auf als AV. Dies könnte mit der
möglichen Ablösung der APTES-Moleküle in wässriger Umgebung verbunden sein, wie
bereits in Kapitel 4.1.3 beschrieben. Die längeren Auslagerungszeiten könnten sich in
diesem Fall negativ auswirken. Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen für die CDIBeschichtung zeigen den gleichen Trend wie die der EIS, bei der die mittleren
70
Ergebnisse und Diskussion
Ladungsdurchtrittswiderstände noch niedriger als die von geschliffenem Magnesium liegen
und CDI somit die geringste Korrosionsbeständigkeit aufweist.
Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen der zusätzlichen BSA-Beschichtungen sind in
Abbildung 29 dargestellt. Auch hier lassen sich alle Kurven in drei Bereiche gliedern.
Abbildung 29: Ergebnisse der Wasserstoffmessungen für 0 bis 24 h in DMEM bei 37°C. Gemessen wurde
das H2-Volumen jeweils nach 1, 2, 3 und 24 h; a) direkte BSA-Beschichtung nach NaOH-Passivierung, b)
BSA-Beschichtung via AV, c) BSA-Beschichtung via CDI, d) BSA-Beschichtung via SA.
Bei der direkten Beschichtung nach NaOH-Passivierung (Abbildung 29 a) ist für BSABeschichtungszeiten bis zu 3 h eine deutliche Verringerung der Wasserstoffentwicklung –
bezogen auf die Vorbehandlung – zu erkennen. Zudem zeigen die kurzen BSABeschichtungszeiten bis 3 h sehr geringe Steigungen im Bereich zwischen 3 h und 24 h
Auslagerung. Dabei liegt die Wasserstoffentwicklung nach 24 h in DMEM bei 0,25 h BSA
und 3 h BSA in einem Bereich von 0,43 bis 0,46 ml/cm². Die geringste gesamte
Wasserstofffreisetzung erfolgt bei BSA-Beschichtungszeiten von 0,5 h und 1 h (ca.
0,34 ml/cm²). Die 24 h BSA-Beschichtung hingegen besitzt mit ca. 0,97 ml/cm² die höchste
gesamte Wasserstoffentwicklung und liegt noch über der der Vorbehandlungsschritte.
Insgesamt weisen alle BSA-Beschichtungszeiten deutliche Standardabweichungen auf, die
Ergebnisse und Diskussion
71
vor allem für die NaOH-Passivierung, die 3 h und die 24 h BSA-Beschichtung hohe Werte
annehmen (vgl. Anhang, Abbildung 75). Diese Schwankungen werden auch bei Betrachtung
der Wasserstoffentwicklungsraten RH1 und RH2 in Abbildung 30 deutlich.
Abbildung 30: Wasserstoffentwicklungsraten RH1 und RH2 der NaOH-Passivierung und der direkten BSABeschichtungen ohne die Verwendung von Linkermolekülen. Es wurde jeweils das Wasserstoffvolumen
pro cm² pro Tag für die erste Stunde in DMEM (RH1) und zwischen 3 und 24 h Auslagerung (RH2)
berechnet.
Während bei der reinen NaOH-Passivierung vor allem RH2 eine große Standardabweichung
aufweist, werden die Schwankungen der Gesamtwasserstoffentwicklung bei 3 h und 24 h
BSA größtenteils durch die hohen Standardabweichungen von RH1 verursacht.
Im Vergleich zur reinen NaOH-Passivierung weisen die kurzen BSA-Beschichtungen für RH2
teilweise eine signifikante Abnahme auf. Für RH1 findet ein Rückgang für BSABeschichtungszeiten von 0,25 h bis 3 h statt. Die Wasserstoffentwicklungsrate während der
ersten Auslagerungsstunde nimmt von ca. 8,3 ml*cm-2*d-1 für die NaOH-Passivierung auf
Werte um ca. 6 ml*cm-2*d-1 für 0,25 h ab. Für Beschichtungszeiten bis 3 h findet lediglich
eine Variation der Werte innerhalb der Fehlerbalken statt. Für 24 h BSA ist wiederum ein
Anstieg auf Mittelwerte von ca. 11,8 ml*cm-2*d-1 zu verzeichnen. Die längste BSABeschichtung zeigt damit insgesamt die höchsten Werte für RH1 und weist eine höhere
anfängliche H2-Entwicklungsrate auf als die NaOH-Passivierung ohne zusätzliche BSABeschichtung. RH2 zeigt einen ähnlichen Verlauf wie RH1, wobei alle Werte auf deutlich
niedrigerem Niveau liegen. Nach 0,25 h BSA-Beschichtung sinkt RH2 von 0,41 ml*cm-2*d-1 auf
0,098 ml*cm-2*d-1. Eine weitere Verlangsamung der H2-Entwicklungsrate RH2 kann für 0,5 h,
1 h und 3 h BSA verzeichnet werden. Hier erreicht RH2 mit ca. 0,026 ml*cm-2*d-1
Minimalwerte. Wie auch bei RH1 steigt RH2 für die 24 h BSA-Beschichtung erneut
(0,415 ml*cm-2*d-1). Hier wird das Niveau der reinen Passivierung erreicht.
72
Ergebnisse und Diskussion
Bereits bei der Referenzserie kann durch zusätzliche BSA-Beschichtung eine deutliche
Reduktion der Wasserstoffentwicklung im Vergleich zur Passivierung und zu geschliffenem
Magnesium
erzielt
werden.
Dabei
zeichnen
sich
0,5 h
und
1h
als
besonders
vielversprechend aus.
Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen der Referenzserie korrelieren größtenteils mit
den EIS-Ergebnissen (vgl. Abbildung 23). Für BSA-Beschichtungszeiten zwischen 0,25 h
und 3 h findet ein Rückgang der H2-Entwicklung und somit ebenfalls eine Verlangsamung
der Korrosionsrate statt. 24 h BSA hingegen zeigt sowohl bei der EIS-Messung als auch bei
der Wasserstoffentwicklung Ergebnisse auf dem Niveau der reinen NaOH-Passivierung.
Die Wasserstoffentwicklung der BSA-Beschichtungen via AV ist in Abbildung 29 b
dargestellt. Wie in den Abbildung 27 und 26 bereits gezeigt, stellt die reine AV Beschichtung
lediglich eine geringe Verbesserung bezüglich der Wasserstoffentwicklung im Vergleich zu
geschliffenem Magnesium dar. Durch die zusätzliche Beschichtung mit BSA kann jedoch für
alle Beschichtungszeiten eine Abnahme des frei werdenden Volumens an Wasserstoff erzielt
werden. Nach 0,25 h BSA-Beschichtung sinkt die gesamte Wasserstoffentwicklung von
0,51 ml/cm² für AV auf 0,39 ml/cm². Berücksichtigt man die Standardabweichung (vgl.
Anhang, Abbildung 76 b), so findet für 1 h, 3 h und 24 h lediglich eine geringe Variation der
Gesamtwasserstoffentwicklung statt. Die niedrigste H2-Entwicklung nach 24 h Auslagerung
zeigt die BSA-Beschichtung für 0,5 h (0,30 ml/cm²).
Abbildung 31 zeigt die H2-Entwicklungsraten RH1 und RH2 der BSA-Beschichtungen via AV.
Abbildung 31: Wasserstoffentwicklungsraten RH1 und RH2 der AV-Vorbehandlung und der verschiedenen
BSA-Beschichtungen via AV. Es wurde jeweils das Wasserstoffvolumen pro cm² pro Tag für die erste
Stunde in DMEM (RH1) und zwischen 3 und 24 h Auslagerung (RH2) berechnet.
Vor allem bei der anfänglichen Wasserstoffentwicklungsrate ist eine Abnahme bis zu einer
Beschichtungszeit von 0,5 h zu erkennen (4,15 ml*cm-2*d-1). Die Werte für 1 h bis 24 h BSA
Ergebnisse und Diskussion
73
variieren kaum (6,00-6,46 ml*cm-2*d-1) und liegen minimal höher als die 0,25 h Beschichtung.
Auch bei RH2 weist die 0,5 h BSA-Beschichtung mit 0,013 ml*cm-2*d-1 die niedrigsten Werte
auf und liegt noch unterhalb der bereits sehr geringen Werte der AV-Vorbehandlung. Neben
0,5 h BSA besitzt lediglich 24 h BSA niedrigere Werte für RH2 als die reine AV-Beschichtung.
Für die BSA-Beschichtung via AV nimmt wie auch bei der direkten Beschichtung ohne
Linkermoleküle
die
0,5 h
BSA-Beschichtung
die
geringsten
Werte
für
die
Gesamtwasserstoffentwicklung an. Des Weiteren weist sowohl RH1, als auch RH2
Minimalwerte für die 0,5 h Beschichtung auf. Im Vergleich zur 0,5 h BSA-Beschichtung der
Referenzserie ist eine weitere leichte Abnahme der Wasserstoffentwicklung für 0,5 h BSA via
AV zu verzeichnen. Beide Wasserstoffentwicklungsraten liegen für 0,5 h BSA via AV
niedriger
als
bei
der
vergleichbaren
direkten
Beschichtung.
Zudem
nimmt
die
Reproduzierbarkeit bei der Beschichtung via AV zu. Dies zeigt ein Vergleich der
Standardabweichungen (Abbildung 30, Abbildung 31 und Anhang, Abbildung 76). Die
Fehlerbalken sind durchgängig für das AV-Beschichtungssystem kleiner als für die
Referenzserie.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der EIS-Messungen, die zeigen, dass die zusätzliche
BSA-Beschichtung keine Erhöhung der Ladungsdurchtrittswiderstände zur Folge hat, wird
die H2-Freisetzung für alle BSA-Beschichtungszeiten verringert.
Die Wasserstoffentwicklung der BSA-Beschichtung via CDI ist in Abbildung 29 c zu sehen.
Im Gegensatz zur Protein-Beschichtung via AV, führen nicht alle Beschichtungszeiten zu
einer Abnahme der Gesamtwasserstoffentwicklung. Nach einer Auslagerungszeit von 24 h in
DMEM liegt das H2-Volumen der 0,25 h, der 1 h und der 3 h BSA-Beschichtung im Bereich
der CDI-Vorbehandlung. Lediglich die 0,5 h und die 24 h Beschichtung weisen eine
Verringerung des gebildeten Wasserstoffes, bezogen auf die CDI-Vorbehandlung, auf. Die
Gesamtwasserstoffentwicklung der 24 h BSA-Beschichtung liegt bei etwa 0,52 ml/cm², die
der 0,5 h BSA-Beschichtung bei etwa 0,48 ml/cm².
Auch hier werden nach 0,5 h Beschichtung mit BSA die besten Ergebnisse erzielt. Dies wird
ebenfalls bei Betrachtung der Wasserstoffentwicklungsraten in Abbildung 32 deutlich.
74
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 32: Wasserstoffentwicklungsraten RH1 und RH2 der CDI-Vorbehandlung und der verschiedenen
BSA-Beschichtungen via CDI. Es wurde jeweils das Wasserstoffvolumen pro cm² pro Tag für die erste
Stunde in DMEM (RH1) und zwischen 3 und 24 h Auslagerung (RH2) berechnet.
0,5 h BSA zeigt die niedrigsten RH1-Werte (6,73 ml*cm-2*d-1). Die übrigen BSABeschichtungen zeigen Werte zwischen 7,91 ml*cm-2*d-1 und 9,31 ml*cm-2*d-1 und liegen im
Mittel
allesamt
unterhalb
der
anfänglichen
Wasserstoffentwicklungsrate
der
CDI-
Vorbehandlung. Wie bereits in Abbildung 28 gezeigt, weist die reine CDI-Beschichtung
jedoch einen relativ niedrigen Wert für RH2 auf (0,042 ml*cm-2*d-1). Unter Berücksichtigung
der Standardabweichungen liegen alle BSA-Beschichtungen im selben Bereich wie die CDIVorbehandlung und variieren lediglich innerhalb der Fehlerbalken. Den höchsten Mittelwert
für die Wasserstoffentwicklungsrate RH2 zeigt 1 h BSA (0,185 ml*cm-2*d-1).
Wie bei der Referenzserie und der BSA-Beschichtung via AV, können auch bei Verwendung
von CDI als Linkermolekül die besten Ergebnisse nach einer BSA-Beschichtungszeit von
0,5 h erzielt werden. Jedoch zeigt ein Vergleich der 0,5 h BSA-Beschichtung ohne Linker
Vorbehandlung, via AV und via CDI, dass das CDI-System sowohl die höchste
Gesamtwasserstoffentwicklung, als auch die höchsten Werte für RH1 und RH2 besitzt. Die
BSA-Beschichtung unter der Verwendung von CDI als Linkermolekül führt somit zwar
teilweise zu einer Abnahme der Wasserstoffentwicklung im Vergleich zu geschliffenem Mg.
Allerdings zeigt vor allem die BSA-Beschichtung via AV deutlich geringere H2Entwicklungsraten. Ein Grund für das schlechte Abschneiden der CDI-Vorbehandlung und
der Beschichtung von BSA via CDI könnte der in Kap. 4.1.4 bereits erwähnte Angriff der MgOberfläche während der CDI-Beschichtung in Chloroform sein.
Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen und der EIS zeigen teilweise einen ähnlichen
Trend. Die 0,5 h BSA-Beschichtung führt bei beiden Messungen zu den besten Ergebnissen.
Ergebnisse und Diskussion
75
Ebenfalls weisen beide Messungen relativ hohe Standardabweichungen bei den BSABeschichtungen auf, was auf eine geringe Reproduzierbarkeit schließen lässt.
Die Ergebnisse der Wasserstoffentwicklung der BSA-Beschichtung via SA sind in Abbildung
29 d dargestellt. Wie der Vergleich der Vorbehandlungen zeigte (Abbildung 27), weist die
Beschichtung mit dem Linkermolekül SA die geringste Gesamtwasserstoffentwicklung auf.
Mit zusätzlicher BSA-Beschichtung kann teilweise eine weitere Reduktion des frei
werdenden
Wasserstoffvolumens
erzielt
werden.
Wie
auch
bei
den
anderen
Beschichtungsmechanismen zeigt besonders die BSA-Beschichtungszeit 0,5 h niedrige
Werte (0,38 ml/cm²). Die Gesamtwasserstoffentwicklung der 0,25 h, 1 h und 24 h BSAProben liegt im Bereich der SA-Vorbehandlung (0,45-0,48 ml/cm²). 3 h BSA-Beschichtung
führt zu einer Zunahme der Wasserstoffentwicklung nach einer Auslagerungszeit von 24 h
(0,56 ml/cm²).
Die berechneten Wasserstoffentwicklungsraten RH1 und RH2 der BSA-Beschichtungen via SA
sind in Abbildung 33 zu sehen.
Abbildung 33: Wasserstoffentwicklungsraten RH1 und RH2 der SA-Vorbehandlung und der verschiedenen
BSA-Beschichtungen via SA. Es wurde jeweils das Wasserstoffvolumen pro cm² pro Tag für die erste
Stunde in DMEM (RH1) und zwischen 3 und 24 h Auslagerung (RH2) berechnet.
Für RH1 wird klar, dass durch die zusätzliche BSA-Beschichtung keine weitere Abnahme im
Vergleich zur SA-Vorbehandlung erzielt werden kann. Unter Berücksichtigung der
Standardabweichungen, befinden sich 0,5 h, 1 h und 24 h auf gleichem Niveau wie die reine
SA-Beschichtung. RH1 der 0,25 h und der 3 h BSA-Beschichtung zeigt höhere Werte bis zu
9,45 ml*cm-2*d-1 (für 3 h BSA). Im Gegensatz dazu ist für alle BSA-Beschichtungszeiten eine
Abnahme von RH2 bezogen auf die SA-Vorbehandlung zu erkennen. Die niedrigsten Werte
nehmen die 0,5 h (0,040 ml*cm-2*d-1) und die 24 h Beschichtung (0,030 ml*cm-2*d-1) an.
76
Ergebnisse und Diskussion
Wie bei den vorherigen Beschichtungsmechanismen lassen sich die besten Ergebnisse auch
bei der Verwendung von SA als Linkermolekül mit einer BSA-Beschichtungszeit von 0,5 h
erzielen. Im Vergleich mit den 0,5 h BSA-Schichten der drei anderen Anbindungsmechanismen lässt sich die Beschichtung via SA zwischen der via AV und der direkten
Proteinadsorption einordnen.
Eine Korrelation der Ergebnisse der Wasserstoffentwicklung und der EIS ist für die BSABeschichtung
via
SA
nur
teilweise
gegeben.
Beide
Messungen
zeigen,
dass
Beschichtungszeiten von 0,5 h und 1 h eine Verbesserung der Korrosionsbeständigkeit
gegenüber der SA-Vorbehandlung aufweisen, während die 3 h und die 24 h BSABeschichtung
im
Bereich
von
SA
liegen.
Ebenfalls
wird
die
Problematik
der
Reproduzierbarkeit in beiden Messungen deutlich. Im Vergleich zu AV treten beispielsweise
sowohl bei den elektrochemischen als auch bei den Wasserstoffmessungen wesentlich
höhere Standardabweichungen auf.
Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen zeigen, dass bereits durch die Beschichtung mit
Linkermolekülen eine Abnahme der H2-Entwicklung erzielt werden kann. So weisen AV und
SA eine reduzierte Bildung von Wasserstoff im Vergleich zu geschliffenem und passiviertem
Magnesium auf. Die Beschichtung mit BSA führt nicht in allen Fällen zu einer zusätzlichen
Abnahme
der
H2-Entwicklung.
Für
alle
Beschichtungssysteme weist
jedoch eine
Beschichtungszeit von 0,5 h die besten Ergebnisse auf. Eine Gesamtübersicht der
Ergebnisse ist in Tabelle 11 zusammengefasst.
Tabelle 11: Zusammenfassung der Ergebnisse der Wasserstoffmessungen: Übersicht über die
Gesamtwasserstoffentwicklung sowie über die beiden H2-Entwicklungsraten RH1 und RH2
-2
-1
H2 gesamt (ml*cm *d )
Mg NaOH AV
CDI
SA
-2
-1
-2
RH1 (ml*cm *d )
Mg NaOH AV
CDI
-1
RH2 (ml*cm *d )
SA
Mg NaOH AV
CDI
SA
0,57 0,79 0,51 0,63 0,48 10,08 8,27 7,75 11,28 6,27 0,04 0,41 0,02 0,04 0,16
0h BSA
0,25h BSA
0,43 0,39 0,63 0,47
5,85 5,62 8,79 7,66
0,10 0,03 0,13 0,09
0,5h BSA
0,34 0,30 0,48 0,38
5,57 4,15 6,73 6,26
0,03 0,01 0,09 0,04
1h BSA
3h BSA
24h BSA
0,35 0,47 0,64 0,45
0,46 0,43 0,63 0,56
0,97 0,39 0,52 0,48
5,64 6,46 9,31 8,08
7,09 6,00 8,56 9,45
11,85 6,30 7,91 7,92
0,03 0,08 0,19 0,06
0,05 0,06 0,10 0,06
0,42 0,02 0,03 0,03
Es wird klar, dass bei allen untersuchten Proben die Gesamtwasserstoffentwicklung für 24 h
deutlich den von Song postulierten Maximalwert von 0,01 ml*cm-2*d-1 übersteigt [5].
Innerhalb der ersten Stunde nimmt die Wasserstoffentwicklungsrate Werte an, die zwei bis
drei Größenordnungen über dem tolerierbaren Maximalwert liegen. Für RH2 werden jedoch
Werte erreicht, die teilweise nur knapp oberhalb von 0,01 ml*cm-2*d-1 liegen. Dies zeigt, dass
bereits nach 3 h in DMEM die Wasserstoffentwicklung auf ein nahezu tolerierbares Maß
reduziert werden kann. Problematisch bleibt hingegen die starke Wasserstoffentwicklung
innerhalb der ersten Stunde. Die besten Ergebnisse sind für AV + 0,5 h BSA zu verzeichnen.
Ergebnisse und Diskussion
77
4.1.6 Elektrochemie in DMEM bei 37°C
Wie in Kapitel 4.1.5 bereits erwähnt, ist ein Vergleich der elektrochemischen Messungen in
SBF bei RT mit den Wasserstoffmessungen in DMEM bei 37°C schwierig. Das Verhalten der
verschiedenen Beschichtungen wird möglicherweise unterschiedlich stark durch die
Änderung der Parameter Elektrolyt und Temperatur beeinflusst. Daher wurden für zwei
Beschichtungssysteme beispielhaft die EIS-Messungen in DMEM bei 37°C wiederholt. Um
einen besseren Vergleich zur H2-Entwicklung zu gewährleisten, wurde jeweils nach einer
Auslagerungszeit der Proben von 0 h und 24 h in DMEM zunächst für 15 min das OCP
detektiert und anschließend die EIS durchgeführt. Als Beschichtungssystem wurde BSA via
SA gewählt. Außerdem wurde ebenfalls die Referenzserie (direkte BSA-Beschichtung ohne
die Verwendung von Linkermolekülen) mit den geänderten Parametern gemessen. Die
Verwendung von SA stützt sich auf die bisherigen Ergebnisse der verschiedenen
Mechanismen
zur
BSA-Anbindung.
Die
ToF-SIMS
Analyse
zeigt
für
kurze
Beschichtungszeiten deutlich mehr Proteine auf der Oberfläche als für die Anbindung via
CDI und die Referenzserie. Die AV-Vorbehandlung erzielt bei der Oberflächenanalyse zwar
bessere Ergebnisse, allerdings zeigen die Resultate der Elektrochemie in SBF bei RT, dass
durch die Anbindung von BSA via AV kein weiterer Anstieg des Korrosionswiderstandes
stattfindet. Des Weiteren bleibt die mögliche Ablösung der APTES-Moleküle von der MgOberfläche in wässrigen Lösungen als Problematik zu beachten. Die Wasserstoffmessungen
zeigen zudem ebenfalls gute Ergebnisse für das SA-System. Vom biologischen Standpunkt
aus, weist SA zudem einige Vorteile gegenüber AV auf. Aufgrund der Degradation von
Magnesium, kann davon ausgegangen werden, dass die an die Mg-Oberfläche gebundenen
Moleküle während der Implantatauflösung freigesetzt werden. Bei Stearinsäure handelt es
sich um eine Fettsäure, die im menschlichen Körper bereits vorhanden ist. Probleme
könnten jedoch die APTES-Moleküle darstellen, deren Wirkung auf den Organismus nicht
bekannt ist.
Im Vergleich mit den EIS-Messungen in SBF bei RT zeigt sich für die Messungen in DMEM
bei 37°C generell eine andere Kurvenform für die Nyquist-Plots. Zwar sind auch hier bei den
meisten Kurven zwei Halbkreise vorhanden. Der erste Halbkreis ist jedoch im Verhältnis zum
zweiten sehr klein und ist in der vollständigen Abbildung meist nicht als solcher zu erkennen.
Zudem überschneidet der zweite den ersten Halbkreis vor allem bei den 0 h DMEM
Messungen häufig sehr stark. Dies bestätigt sich auch bei Betrachtung der zugehörigen
Bode-Plots (siehe Anhang, Abbildung 77 bis Abbildung 79), die für die 0 h Auslagerung in
DMEM zwei Peaks im Verlauf des Phasenwinkels zeigen, die jedoch stark überlappen und
teils nur als ein verbreiterter Peak zu erkennen sind. Des Weiteren sind die Induktivitäten
nach 0 h Auslagerung in DMEM teilweise wesentlich deutlicher ausgeprägt als bei den
zeitlich vergleichbaren EIS-Messungen in SBF. Diese Unterschiede sind der anderen
78
Ergebnisse und Diskussion
Zusammensetzung des Elektrolyten und der erhöhten Umgebungstemperatur geschuldet. Es
wird angenommen, dass vor allem der hohe Anteil an organischen Bestandteilen des DMEM
für das abweichende Verhalten verantwortlich ist.
Zunächst
wurden EIS-Messungen der
verschiedenen Vorbehandlungsschritte ohne
vorherige Auslagerung in DMEM durchgeführt. Abbildung 34 zeigt jeweils einen
repräsentativen Nyquist-Plot und die zugehörigen mittleren Ladungsdurchtrittswiderstände
mit den berechneten Standardabweichungen von geschliffenem Magnesium, nach NaOHPassivierung und nach zusätzlicher SA-Beschichtung.
Abbildung
34:
EIS-Ergebnisse
der
Vorbehandlungsschritte
Schleifen,
NaOH-Passivierung
und
Beschichtung mit dem Linkermolekül SA nach einer Auslagerungszeit von 0 h in DMEM bei 37°C; a)
Nyquist-Plots;
b)
durchschnittliche
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
zugehöriger
Standardabweichung
Wie auch bei den EIS-Messungen in SBF bei RT zeigen die Nyquist-Plots von geschliffenem
und passiviertem Mg sehr ähnliche Kurven (vgl. Abbildung 34 a), die über einen weiten
Frequenzbereich im gleichen Wertebereich liegen. Lediglich bei niedrigen Frequenzen zeigt
passiviertes Mg mit einem Halbkreis im negativen Bereich, der sich zurück Richtung
Ursprung bildet, eine deutliche Abweichung vom Verhalten des geschliffenen Mg. Dies
könnte dafür sprechen, dass nach der NaOH-Passivierung höhere Induktivitäten auftreten
und der Polarisationswiderstand so stark abnimmt. Jedoch kann darüber keine eindeutige
Aussage getroffen werden, da die Kurven wie oben bereits erwähnt nicht gefittet wurden. Die
SA-Beschichtung zeigt einen Kurvenverlauf der dem der NaOH-Probe ähnelt, wobei der
zweite Halbkreis einen größeren Durchmesser besitzt. Auch hier treten ausgeprägte
induktive Anteile auf. Im Vergleich zu den Nyquist-Plots der EIS-Messungen in SBF bei RT
ändert sich wie oben bereits beschrieben die Kurvenform. Zudem zeigen die Nyquist-Plots
deutlich höhere Werte sowohl für die Real- als auch die Imaginärteile. Für alle drei
Ergebnisse und Diskussion
79
Vorbehandlungsschritte wird für Z‘ und -Z‘‘ rund das Sechsfache im Vergleich zu den
Messungen in SBF bei RT erreicht. Die Ladungsdurchtrittswiderstände in Abbildung 34 b
weisen bei allen Vorbehandlungsschritten relativ hohe Fehlerbalken auf, wobei die
Standardabweichung
für
geschliffenes
Magnesium
am
höchsten
ausfällt.
Unter
Berücksichtigung dieser Schwankungen liegen die RD-Werte für alle drei Vorbehandlungen
etwa im selben Bereich. Für die Beschichtung mit SA findet jedoch eine leichte Erhöhung
des mittleren RD auf rund 2,7 k*cm² statt. Diese Ergebnisse zeigen eine gute Korrelation
mit denen der Wasserstoffentwicklung innerhalb der ersten Auslagerungsstunde, die eine
Abnahme der Wasserstoffentwicklung von geschliffenem Mg bis zur SA-Beschichtung
zeigen. Dies ist gleichbedeutend mit einer Zunahme der Korrosionsbeständigkeit.
Abbildung 35 zeigt die Ergebnisse der EIS der Referenzserie und der BSA-Beschichtung via
SA ohne vorherige Auslagerung in DMEM bei 37°C.
Abbildung 35: EIS-Ergebnisse der BSA-Beschichtungen nach einer Auslagerungszeit von 0 h in DMEM
bei 37°C; a) Nyquist-Plots nach NaOH-Passivierung und nach zusätzlicher Beschichtung mit BSA für
verschiedene
Zeiten,
b)
mittlere
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
den
zugehörigen
Standardabweichungen für die direkte BSA-Beschichtung; c) Nyquist-Plots nach Vorbehandlung mit SA
80
und
Ergebnisse und Diskussion
nach
zusätzlicher
Beschichtung
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
mit
den
BSA
für
verschiedene
zugehörigen
Zeiten
und
Standardabweichungen
für
d)
mittlere
die
LYS-
Beschichtung via SA.
Wie auch bei den EIS-Messungen in SBF bei RT ähneln sich alle Kurven bezüglich ihres
Verlaufes. Die Ladungsdurchtrittswiderstände für die direkte BSA-Beschichtung nach NaOHPassivierung sind in Abbildung 35 b dargestellt. Passiviertes Magnesium an sich besitzt
einen mittleren RD von ca. 2,0 k*cm². Für 0,25 h BSA findet ein Anstieg auf Werte von rund
2,7 k*cm² statt. Die Beschichtungszeiten von 0,5 h und 1 h zeigen einen Rückgang des
Ladungsdurchtrittswiderstandes auf Werte knapp oberhalb des mittleren RD der passivierten
Proben.
Unter
Berücksichtigung
der
Standardabweichung
liegen
jedoch
alle
Ladungsdurchtrittswiderstände bis 1 h Beschichtungszeit im Bereich der Vorbehandlung.
Eine tatsächliche Abnahme wird durch die 3 h BSA-Beschichtung verursacht, bei der RD mit
ca. 1,7 k*cm² ein Minimum erreicht. Die 24 h Beschichtung zeigt einen erneuten leichten
Anstieg (2,0 k*cm²). Mit Ausnahme der reinen Passivierung weisen die BSA-Schichten
ohne die Verwendung von Linkermolekülen teilweise sehr geringe Standardabweichungen
auf, was auf eine vergleichsweise gute Reproduzierbarkeit hinweist. Im Vergleich mit den
EIS-Messungen in SBF bei RT findet ein durchgängiger Anstieg der RD-Werte für die
Messungen
in
DMEM
bei
37°C
statt.
Jedoch
liegt
diese
Zunahme
für
alle
Beschichtungszeiten bis 3 h lediglich im Bereich des 1,1- bis 1,9-Fachen. Eine Erhöhung des
Ladungsdurchtrittswiderstandes um das ca. 6- bis 7-Fache kann für die 24 h BSABeschichtung verzeichnet werden. Eine Korrelation zwischen den EIS-Ergebnissen mit den
unterschiedlichen Messparametern konnte nicht gefunden werden. Eine mögliche Erklärung
hierfür ist die Entstehung und Anlagerung von unterschiedlichen Korrosionsprodukten bis hin
zu einer Schichtbildung, bedingt durch die andere Elektrolytzusammensetzung. Wie bereits
erwähnt, spielen dabei wahrscheinlich vor allem die organischen Bestandteile des DMEM
eine Rolle.
Während kein einheitlicher Trend für die EIS-Messungen in SBF und DMEM zu sehen ist,
zeigt ein Vergleich mit den RH1-Raten der H2-Messungen der BSA-Beschichtung ohne Linker
(vgl. Abbildung 30), dass eine Korrelation zwischen der anfänglichen H2-Entwicklung und
den
EIS-Ergebnissen
für
0h
Auslagerung
in
DMEM
teilweise
besteht.
Unter
Berücksichtigung der Standardabweichungen liegen die RH1-Werte der Passivierung und der
Beschichtungszeiten 0,25 h bis 1h im selben Bereich. Vor allem für 24 h findet eine deutliche
Zunahme des Wasserstoffvolumens und somit eine Abnahme der Korrosionsbeständigkeit
statt. Die EIS-Ergebnisse zeigen einen sehr ähnlichen Trend, ebenfalls unter Einbeziehung
der Standardabweichungen.
Für die BSA-Anbindung via SA zeigen die Vorbehandlung ohne zusätzliche BSABeschichtung und 0,25 h BSA mit durchschnittlich ca. 2,7 k*cm² die höchsten RD Werte
Ergebnisse und Diskussion
81
(vgl. Abbildung 35 d). Für Beschichtungszeiten bis 3 h findet ein kontinuierlicher Rückgang
der Ladungsdurchtrittswiderstände auf ca. 1,3 k*cm² statt, während für die 24 h
Beschichtung der mittlere RD erneut auf das Niveau der kurzen Beschichtungszeiten (0,25 h
und 0,5 h) ansteigt. Im Vergleich mit den Ladungsdurchtrittswiderständen der direkten BSABeschichtung weist das SA-System bei einer Auslagerungszeit von 0 h in DMEM bei 37°C
lediglich bei der SA-Beschichtung ohne zusätzliche BSA-Adsorption höhere Werte auf. Die
mittleren
Ladungsdurchtrittswiderstände
für
0,25 h
und
0,5 h
liegen
für
beide
Beschichtungsmechanismen auf gleichem Niveau (~2,7 k*cm² für 0,25 h und ~2,4 k*cm²
für 0,5 h). Jedoch treten für die BSA-Anbindung via SA deutlich höhere Fehlerbalken auf,
was auf eine geringere Reproduzierbarkeit hinweist. Für 1 h und 3 h BSA zeigt die
Beschichtung via SA um 0,3-0,4 k*cm² geringere Werte für RD. Die Standardabweichungen
liegen hier jedoch für beide Beschichtungssysteme in der gleichen Größenordnung. Die RDWerte der 24 h BSA-Beschichtung befinden sich wiederum im selben Wertebereich, wobei
die Anbindung via SA eine extrem hohe Standardabweichung aufweist (1,9 k*cm²).
Generell kann zwar durch die Beschichtung mit dem Linkermolekül SA eine Verbesserung
der Korrosionsbeständigkeit erzielt werden. Jedoch hat eine zusätzliche Anbindung von BSA
auf der Oberfläche keinen weiteren positiven Einfluss auf die Korrosionseigenschaften von
Magnesium. Im Gegenteil findet sogar eine Abnahme der Korrosionsbeständigkeit für alle
BSA-Beschichtungszeiten statt. Außerdem weisen die BSA-Schichten via SA im Vergleich
zur Referenzserie niedrigere RD-Werte auf.
Wie auch bei der Referenzserie ergibt sich keine Korrelation der EIS-Ergebnisse für die
unterschiedlichen
Messparameter.
Die
Ladungsdurchtrittswiderstände
für
die
BSA-
Beschichtung via SA, gemessen in DMEM bei 37°C, nehmen bis 3 h BSA um das 1,1 bis
1,5-Fache zu. Ein signifikanter Anstieg des mittleren RD um das ca. 5-Fache findet lediglich
bei der 24 h BSA-Beschichtung statt. Wie oben bereits erwähnt sind jedoch die
Standardabweichungen hier extrem hoch.
Ein Vergleich von RH1 (vgl. Abbildung 33) mit den RD-Werten der BSA-Anbindung via SA
lässt
auf
eine
gewisse
Korrelation
der
Ergebnisse
schließen.
Auch
bei
der
Wasserstoffentwicklung innerhalb der ersten Stunde weist die SA-Vorbehandlung die besten
Ergebnisse auf. Die Wasserstoffentwicklung für 3 h BSA ist im Anfangsstadium am
höchsten. Somit besitzt die Beschichtung für 3 h – wie auch bei der EIS – die geringste
Korrosionsbeständigkeit. Auch der Vergleich der RH1 Werte der Referenzserie und der BSAAnbindung via SA zeigt, dass für die erste Stunde in DMEM bei 37°C ein ähnlicher Trend wie
bei den Ladungsdurchtrittswiderständen vorhanden ist. Das SA-System zeigt lediglich für die
Vorbehandlung eine niedrigere H2-Entwicklung als die direkte Beschichtung. Unter
Einbeziehung
der
Fehlerbalken
liegen
0,25 h
und
0,5 h
BSA
bei
beiden
Beschichtungsmechanismen auch bei der Wasserstoffentwicklung im selben Wertebereich.
82
Ergebnisse und Diskussion
Während das entstandene H2-Volumen für 1 h und 3 h für SA im Vergleich zu NaOH
ansteigt, befinden sich die 24 h BSA-Beschichtungen beider Systeme wieder im gleichen
Bereich.
Um die Auswirkung der Auslagerungszeit in DMEM zu untersuchen und um einen besseren
Vergleich mit den Wasserstoffmessungen zu ermöglichen, wurden EIS-Messungen nach
24 h
in
DMEM
bei
37°C
durchgeführt.
Auch
hier
wurden
zunächst
die
drei
Vorbehandlungsschritte Schleifen, NaOH-Passivierung und SA-Beschichtung untersucht.
Abbildung 36 stellt die zugehörigen Ergebnisse als Nyquist-Plots (Abbildung 36 a) und die
mittleren RD-Werte mit den Standardabweichungen (Abbildung 36 b) dar.
Abbildung
36:
EIS-Ergebnisse
der
Vorbehandlungsschritte
Schleifen,
NaOH-Passivierung
und
Beschichtung mit dem Linkermolekül SA nach einer Auslagerungszeit von 24 h in DMEM; a) NyquistPlots; b) durchschnittliche Ladungsdurchtrittswiderstände RD mit zugehöriger Standardabweichung
Wie auch bei den EIS-Messungen ohne Auslagerung in DMEM, weisen alle Kurven ähnliche
Form auf. Der erste Halbkreis ist zwar immer noch relativ klein im Verhältnis zum Zweiten.
Jedoch überschneiden sich die beiden Halbkreise kaum, was deutlicher in den zugehörigen
Bode-Plots (siehe Anhang, Abbildung 78 und Abbildung 79) zu sehen ist. Der Verlauf des
Phasenwinkels weist hier zwei eigenständige Peaks auf, die Impedanz zeigt zwei getrennte
kapazitive Anteile. Somit sind die Reaktionen, die dieser Kurvenform zugrunde liegen
deutlicher voneinander getrennt.
Für die Ladungsdurchtrittswiderstände der Vorbehandlungsschritte erfolgt ein ähnlicher
Anstieg wie bei der 0 h DMEM Auslagerung. Im Unterschied hierzu liegen jedoch
geschliffenes und passiviertes Mg nicht mehr auf ähnlichem Niveau. Geschliffenes Mg erzielt
mit
ca.
29 k*cm²
die
geringsten
RD-Werte.
Für
die
zwei
zusätzlichen
Vorbehandlungsschritte erfolgt eine Zunahme des RD auf ca. 65 k*cm² für die NaOHPassivierung bis auf rund 105 k*cm² für die SA-Beschichtung. Im Vergleich zu einer
Auslagerungszeit von 0 h, findet für alle RD-Werte eine signifikante Zunahme nach 24 h in
Ergebnisse und Diskussion
83
DMEM statt. Für geschliffenes Mg steigt der mittlere RD um das ca. 13-Fache. Die
Passivierung und die SA-Beschichtung verzeichnen einen Anstieg um das 26- bzw. 28Fache. Eine Korrelation mit den Ergebnissen der Wasserstoffmessungen ist nicht
durchgängig gegeben. Während NaOH die höchste H2-Entwicklung nach 24 h zeigt (vgl.
Anhang, Abbildung 75), befindet sich die Passivierung, was den mittleren RD angeht, im
Wertebereich zwischen geschliffenem Mg und der SA-Beschichtung. Jedoch weisen beide
Messungen sehr hohe Fehlerbalken für die NaOH-Passivierung auf. Zudem treten im
Vergleich zu geschliffenem Mg bei der EIS höhere induktive Anteile auf. Dies könnte zur
Folge haben, dass trotz des höheren RD der Passivierung der Polarisationswiderstand im
selben
Bereich
wie
bei
Magnesium
liegt
und
beide
Proben
somit
ähnliche
Korrosionsbeständigkeit besitzen.
Die Ergebnisse der EIS der BSA-Beschichtungen via NaOH bzw. via SA nach einer
Auslagerungszeit von 24 h in DMEM bei 37°C sind in Abbildung 37 dargestellt.
Abbildung 37: EIS-Ergebnisse der BSA-Beschichtungen nach einer Auslagerungszeit von 24 h in DMEM
bei 37°C; a) Nyquist-Plots nach NaOH-Passivierung und nach zusätzlicher Beschichtung mit BSA für
verschiedene
Zeiten,
b)
mittlere
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
den
zugehörigen
Standardabweichungen für die direkte BSA-Beschichtung; c) Nyquist-Plots nach Vorbehandlung mit SA
84
und
Ergebnisse und Diskussion
nach
zusätzlicher
Beschichtung
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
mit
den
BSA
für
zugehörigen
verschiedene
Zeiten
und
Standardabweichungen
für
d)
mittlere
die
LYS-
Beschichtung via SA.
Auch hier ist anhand der zugehörigen Bode-Plots (Abbildung 78 und Abbildung 79) zu
erkennen, dass die Messungen zwei voneinander abgegrenzte Zeitkonstanten und somit
zwei
unabhängige
Reaktionen
Ladungsdurchtrittswiderstände
und
aufweisen.
die
Abbildung
37 b
Standardabweichungen
zeigt
der
die
mittleren
direkten
BSA-
Beschichtung. Die höchsten Werte für RD werden nach der NaOH-Passivierung erreicht
(65 k*cm²). Allerdings weist die reine Passivierung ebenfalls die höchsten Fehlerbalken
auf, was für eine schlechtere Reproduzierbarkeit im Vergleich zur zusätzlichen BSABeschichtung spricht. Für die BSA-Beschichtungszeiten 0,25 h und 0,5 h findet ein
Rückgang von RD auf ca. 40 k*cm² statt. Nach einer erneuten leichten Zunahme des
mittleren RD für 1 h BSA, nehmen die Ladungsdurchtrittswiderstände bis 24 h BSA ab, wo sie
mit ca. 15 k*cm² ihr Minimum erreichen. Im Vergleich zu den EIS-Ergebnissen ohne
Auslagerung in DMEM findet sowohl für die Vorbehandlung als auch für alle BSABeschichtungszeiten eine signifikante Erhöhung der mittleren Ladungsdurchtrittswiderstände
statt. Die größte Zunahme des RD erfährt die NaOH-Passivierung (ca. 26-fach) und 1 h BSA
(~24-fach), die geringste Zunahme erfolgt bei der 24 h BSA-Beschichtung (8-fach). Die
übrigen Beschichtungen weisen einen Anstieg um das 15- bis 19-Fache auf.
Ein Vergleich mit dem gebildeten Wasserstoffvolumen nach 24 h zeigt, dass die
Korrosionsbeständigkeit der verschiedenen BSA-Schichten bei der EIS sowie der H2Messung dem gleichen Trend folgt. Unter Berücksichtigung der Standardabweichungen
treten für die kurzen Beschichtungszeiten bis 1 h kaum Variationen auf. Für 3 h und 24 h
BSA tritt ein kontinuierlicher Rückgang der Korrosionsbeständigkeit auf. Eine Ausnahme bei
der direkten Beschichtung ohne die Verwendung von Linkermolekülen bildet die
Passivierung an sich. Während hier für die EIS die besten Ergebnisse erreicht werden,
weisen die H2-Messungen für die reine Passivierung mit die schlechtesten Ergebnisse auf.
Die Ladungsdurchtrittswiderstände der BSA-Beschichtung via SA sind in Abbildung 37 d
dargestellt. Die SA-Beschichtung ohne zusätzliche BSA-Anbindung weist mit durchschnittlich
ca. 105 k*cm² bereits relativ hohe Werte für RD auf. Ein weiterer Anstieg kann lediglich
nach 0,5 h BSA-Beschichtung verzeichnet werden (~136 k*cm²). 0,25 h, 1 h und 3 h BSA
liegen in einem Bereich von 40-60 k*cm². Für 24 h BSA erreicht RD mit ca. 19 k*cm² ein
Minium. Aus dem Vergleich des Beschichtungsmechanismus via SA und der Referenzserie
wird klar, dass mit der Verwendung von SA als Linkermolekül teilweise deutlich höhere RDWerte als für die Referenzserie erreicht werden können. Dies trifft auf alle BSABeschichtungszeiten
bis
auf
1h
zu.
Durchschnittlich
liegen
die
Ladungsdurchtrittswiderstände für das SA-System um das 1,5-Fache höher als die
Ergebnisse und Diskussion
85
korrespondierenden RD-Werte der Referenzserie. Eine Zunahme des RD auf mehr als das
Dreifache ergibt sich für eine BSA-Beschichtungszeit von 0,5 h, während die 1 h BSABeschichtung via SA ca. 20% niedriger als die vergleichbare direkte Beschichtung liegt.
Wie bei der Referenzserie findet nach der 24 h Auslagerung in DMEM durchgängig ein
signifikanter Anstieg der Ladungsdurchtrittswiderstände im Vergleich zur 0 h DMEM
Auslagerung statt. Die größte Zunahme des RD um das knapp 60-Fache weist dabei die
0,5 h BSA-Beschichtung auf. Die geringste Erhöhung erzielt – wie auch bei der
Referenzserie – die 24 h Beschichtung.
Der Vergleich mit den Wasserstoffmessungen zeigt, dass teilweise eine Korrelation der
Ergebnisse vorhanden ist. Sowohl die H2-Entwicklung als auch die EIS weisen für eine 0,5 h
BSA die besten Ergebnisse auf. Alle anderen Beschichtungszeiten sowie die Vorbehandlung
mit SA zeigen geringere Korrosionsbeständigkeit. Dabei liegen bei beiden Messmethoden
die 0,25 h, die 1 h und die 3 h BSA-Beschichtung im selben Wertebereich.
Tabelle 12: Zusammenfassung der EIS-Ergebnisse der BSA-Beschichtungen, gemessen in DMEM ohne
vorherige Auslagerung und nach 24 h Auslagerung in DMEM bei 37°C
RD nach 0h DMEM (*cm-2)
RD nach 24h DMEM (*cm-2)
Mg
NaOH
SA
Mg
NaOH
SA
2233
1982
2695
29104
65131
105181
0,25h BSA
2680
2670
40113
58201
0,5h BSA
2343
2377
39625
135504
1h BSA
2197
1852
52525
42687
3h BSA
1686
1262
31758
46599
24h BSA
2018
2593
14945
18521
0h BSA
Die Übersicht der EIS-Ergebnisse der BSA-Beschichtungen in DMEM (Tabelle 12) zeigt,
dass ein leichter positiver Einfluss der Oberflächenvorbehandlung und der BSABeschichtung bereits bei den Messungen ohne vorherige Auslagerung in DMEM teilweise
vorhanden ist. Deutlich ausgeprägter ist dieser Einfluss jedoch nach 24 h in DMEM. Die
höchsten Durchtrittswiderstände werden von der reinen SA-Beschichtung (bei 0 h DMEM)
und von SA+0,5 h BSA (bei 24 h DMEM) erreicht. Auch die Auslagerungszeit in DMEM hat
einen deutlichen Einfluss auf die Korrosionsbeständigkeit der Magnesium-Proben. So führt
eine Auslagerung von 24 h zu einer signifikanten Zunahme von RD um mindestens eine
Größenordnung im Vergleich zu den nicht ausgelagerten Proben. Diese Ergebnisse
implizieren, dass die Auslagerung in DMEM bei 37°C zur Bildung einer Schicht führt, welche
die Auflösung von Magnesium deutlich reduziert.
86
Ergebnisse und Diskussion
4.1.7 Zwischenfazit der BSA Beschichtung
Die Oberflächencharakterisierung der Vorbehandlungen und der BSA-Anbindung zeigt
neben
der
erfolgreichen
Beschichtung
mit
den
Linkermolekülen,
dass
für
alle
Beschichtungsmechanismen und für alle Beschichtungszeiten BSA auf den jeweiligen
Oberflächen adsorbiert. Die größte Menge an BSA kann bei der Anbindung via AV und SA
für kurze Beschichtungszeiten erzielt werden. CDI und NaOH stehen den beiden anderen
Linkermolekülen vor allem anfänglich deutlich nach.
Erste elektrochemische Messungen ergaben, dass sowohl die Linkerbeschichtungen als
auch die zusätzliche BSA Adsorption zu einer Erhöhung der Korrosionsbeständigkeit im
Vergleich zu reinem Magnesium in SBF führen können. Während die AV Beschichtung den
höchsten Anstieg von RD im Vergleich mit den anderen Linkermolekülen bewirkt, zeigt hier
die
zusätzliche
BSA-Adsorption
keinen
weiteren
positiven
Einfluss
auf
die
Korrosionsbeständigkeit. Für die anderen Anbindungsmechanismen hingegen kann durch
BSA eine Zunahme von RD für alle Beschichtungszeiten im Vergleich zur jeweiligen
Vorbehandlung erzielt werden. Die höchste Korrosionsbeständigkeit zeigen die kurzen
Beschichtungszeiten für die Anbindungen via SA und CDI.
Die EIS-Messungen in DMEM bei 37°C weisen durchgehend eine signifikante Zunahme der
Korrosionsbeständigkeit im Vergleich zu den Messungen in SBF bei RT auf. Des Weiteren
findet sowohl für die BSA-Beschichtungen via NaOH als auch via SA ein starker Anstieg der
Ladungsdurchtrittswiderstände nach 24 h Auslagerung in DMEM bei 37°C statt. Außerdem
ändert sich die Form der Nyquist- sowie der Bode-Plots. Diese Ergebnisse sowie die
veränderte Optik der Proben im Vergleich zu SBF lassen vermuten, dass die Auslagerung in
DMEM an sich einen großen Einfluss auf die Korrosionsbeständigkeit hat. Bereits für die
Proben, die nicht in DMEM ausgelagert wurden und nur für die Messzeit (15 min OCP +
30 min EIS) dem Zellkulturmedium ausgesetzt waren, ist die Bildung einer mehr oder
weniger homogenen dunklen Schicht zu erkennen. Es wird angenommen, dass diese
Schichtbildung aus Korrosionsprodukten der Magnesium-Auflösung und Bestandteilen des
DMEM erfolgt. Eine genauere Untersuchung dieser Schichten erfolgt in Kapitel 4.4.
Da Unterschiede zwischen den Beschichtungsmechanismen und den verschiedenen BSABeschichtungszeiten vorhanden sind, scheinen diese ebenfalls einen Einfluss auf die
Korrosionsbeständigkeit zu haben. Womöglich beeinflusst die Vorbehandlung sowie die
BSA-Adsorption auf der Oberfläche die Kinetik der Schichtbildung während der Auslagerung
in DMEM. Außerdem wird eine Variation der Schichtdicke, der Zusammensetzung, der
Struktur und der Porosität der gebildeten Schicht als möglich erachtet. Vor allem die
Porosität einer sich bildenden Schicht wird stark von der Gasbildung an der Oberfläche
beeinflusst.
Eventuell
findet
eine
Potenzierung
der
positiven
Eigenschaften
der
Ergebnisse und Diskussion
87
Vorbehandlungen bzw. der BSA-Schichten und des Einflusses der DMEM-Auslagerung statt.
So erfolgt der korrosive Angriff in DMEM möglicherweise unterschiedlich stark, je nachdem
wie gut die Korrosionsbeständigkeit der vorher aufgebrachten BSA-Schichten ist. Generell
scheint der Einfluss der DMEM-Auslagerung an sich jedoch größer zu sein als der der
NaOH-Passivierung, der SA- und der BSA-Beschichtungen.
Die Ergebnisse der Wasserstoffmessungen stützen die These der Bildung einer
verhältnismäßig gut schützenden Schicht in DMEM. Während für reines Magnesium sowie
für alle Vorbehandlungen und Beschichtungen die anfängliche Wasserstoffentwicklung hohe
Werte
aufweist,
findet
bereits
nach
3h
eine
deutliche
Abnahme
der
Wasserstoffentwicklungsrate für fast alle Proben statt. Die durchgängig besten Ergebnisse
zeigt die 0,5 h BSA-Beschichtung via AV.
88
Ergebnisse und Diskussion
4.2
Beschichtung von Magnesium mit Lysozym (LYS)
Neben BSA wurde Lysozym als weiteres Protein für die mögliche Beschichtung von
Magnesium verwendet. Generell soll so untersucht werden, ob auch andere Proteine auf der
Mg-Oberfläche adhärieren und eine schützende Schicht bilden können. Lysozym
unterscheidet sich von BSA unter anderem in der Molekülgröße, dem IEP und in der Art des
Schichtbildungsverhaltens und eignet sich so als zweites Model-Protein. Des Weiteren gilt
LYS als antibakteriell, was es generell für die Anwendung im Implantat-Bereich interessant
macht. Für die LYS-Anbindung wurde das Linkermolekül SA und als Referenz die direkte
Beschichtung gewählt, da die elektrochemische Charakterisierung in DMEM bei 37°C
stattfand und so ein direkter Vergleich zu den BSA-Beschichtungen möglich ist.
4.2.1 Oberflächencharakterisierung nach LYS-Beschichtung
Zur Oberflächencharakterisierung der verschiedenen LYS-Beschichtungen wurden XPSMessungen durchgeführt. Bei der XPS-Analyse wurden die C1s, N1s, O1s und Mg2p
Signale genauer untersucht. Im Fall der Proteinanbindung via SA und der direkten
Beschichtung kann vor allem das N1s-Signal als direkter Indikator für adsorbierte LYSMoleküle verwendet werden.
Die C1s-, N1s- und Mg2p-Signale für die Referenzserie sind in Abbildung 38 a dargestellt.
Abbildung 38: XPS-Ergebnisse der verschiedenen LYS-Beschichtungen zur Charakterisierung der
adsorbierten Proteinmenge; a) direkte Beschichtung mit LYS ohne die Verwendung von Linkermolekülen,
b) LYS-Beschichtung via SA.
Das Zustandekommen der Ergebnisse nach NaOH-Passivierung ohne zusätzliche ProteinBeschichtung wurde bereits in Kapitel 4.1.1 näher erklärt. Wie zu erwarten zeigt passiviertes
Magnesium mit ca. 26 at% das höchste Mg2p-Signal. Das C1s-Signal beträgt 12 at%, das
Ergebnisse und Diskussion
89
N1s-Signal geht gegen 0 und wird vom Hintergrundrauschen überlagert. Bereits nach einer
Beschichtungszeit von 0,25 h findet ein Anstieg sowohl des C1s- (ca. 27 at%) als auch des
N1s-Signals (ca. 5 at%) statt. Gleichzeitig nimmt das Mg2p-Signal leicht ab (~20 at%). Bis zu
einer Beschichtungszeit von 3 h nehmen die C1s- und N1s-Signale weiter zu (ca. 42 at%
bzw. ca. 11 at%). Für die 24 h LYS-Beschichtung ist kaum ein weiterer Anstieg der beiden
Signale zu beobachten. Für das Mg2p-Signal zeigt sich eine nahezu kontinuierliche
Abnahme mit zunehmender Beschichtungszeit. Der niedrigste Wert wird für 24 h erreicht
(~9 at%). Diese Ergebnisse zeigen deutlich den Erfolg der LYS-Beschichtung. Bereits nach
0,25 h in der LYS-Lösung findet eine Adsorption der Proteine auf der OH-terminierten
Oberfläche statt. Außerdem führen längere Beschichtungszeiten zu einer dichteren bzw.
dickeren LYS-Schicht. Im Gegensatz zu BSA zeigt sich eine kontinuierliche Zunahme der
Menge an LYS auf der Oberfläche über die Beschichtungszeit. Dies deutet darauf hin, dass
während der LYS-Beschichtung kein oder zumindest ein geringerer korrosiver Angriff in der
wässrigen Beschichtungslösung stattfindet. Während der Beschichtung in der LYS-Lösung
konnte beobachtet werden, dass sich kaum Gasblasen bilden, was die Annahme bestätigt,
dass der korrosive Angriff während der LYS-Beschichtung verhältnismäßig gering ist.
Allerdings sind auch nach einer Beschichtungszeit von 24 h noch deutliche Mg2p Signale
vorhanden. Dies spricht entweder dafür, dass sich keine dicke bzw. keine dichte LYS-Schicht
bildet oder dass sich in geringem Maße Mg(OH)2 durch Auflösung des Substrates bildet.
Abbildung 38 b zeigt die XPS-Ergebnisse für die LYS-Anbindung via SA. Auch hier können
für die reine SA-Beschichtung die höchsten Mg2p-Signale beobachtet werden (~24 at%).
Das C1s-Signal liegt bei etwa 18 at%, das N1s Signal wird wie auch bei passiviertem Mg
vom Hintergrundrauschen überlagert. Eine genauere Erklärung zu den XPS-Ergebnissen
nach SA-Beschichtung findet sich in Kapitel 4.1.1. Nach einer Beschichtungszeit von 0,25 h
ist ein deutlicher Anstieg des C1s- und des N1s- Signals zu erkennen (ca. 33 at% bwz. ca.
8 at%). Analog zur Referenzserie geht dieser Anstieg mit einer Abnahme des Mg2p-Signals
einher (16 at%). 0,5 h LYS-Beschichtung zeigen eine weitere Zunahme des C1s- und des
N1s-Signals (ca. 42 at% und ca. 11 at%). Korrespondierend dazu sinkt das Mg2p Signal auf
einen Wert von 12 at%. Im Gegensatz zur Referenzserie bleiben alle Signale bis zu einer
Beschichtungszeit von 3 h auf einem Niveau und variieren nur marginal im Bereich der
Fehlerbalken. Für 24 h LYS-Beschichtung ist sowohl für das C1s als auch für das N1s Signal
ein Rückgang auf das Niveau der 0,25 h Beschichtung zu verzeichnen (ca. 36 at% bzw. ca.
9 at%). Das Mg2p Signal erfährt für eine Beschichtungszeit von 24 h einen leichten Anstieg
auf einen Wert von etwa 14 at%.
Auch für die Vorbehandlung mit SA zeigen die XPS-Ergebnisse den Erfolg der Beschichtung
mit LYS. Ab einer Beschichtungszeit von 0,5 h scheint eine Sättigung der LYS-Adsorption
erreicht zu sein. Für Beschichtungen bis 3 h findet keine weitere Zunahme der Proteinmenge
90
Ergebnisse und Diskussion
auf der Oberfläche statt. Der Rückgang des C1s und des N1s Signals mit einer
gleichzeitigen Zunahme des Mg2p Signals nach 24 h lassen vermuten, dass die Menge an
adsorbierten Proteinen auf der Oberfläche rückläufig ist. Dies könnte durch einen leichten
korrosiven Angriff im wässrigen Beschichtungsmedium mit einhergehender Mg(OH)2 Bildung
verursacht werden. Ein weiterer Grund für diese Ergebnisse könnte auch die Desorption von
LYS bei langen Beschichtungszeiten sein. Im Vergleich zur Referenzserie kann durch die
zusätzliche Beschichtung mit SA keine wesentliche Erhöhung der LYS-Adsorption erzielt
werden. Es scheint lediglich eine anfänglich beschleunigte Adsorption von LYS stattzufinden.
Für 24 h weisen die NaOH passivierten Proben jedoch mehr gebundenes LYS als die SA
Proben auf. Wie bereits bei der BSA-Beschichtung erläutert, wird angenommen, dass bei der
direkten Beschichtung Proteine hauptsächlich aufgrund von hydrophilen Wechselwirkungen
an der Oberfläche adsorbieren. Bei der Beschichtung via SA sind dagegen vor allem
hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Protein und Oberfläche für die Proteinanbindung
verantwortlich. Die Proteinadsorption beider Beschichtungsmechanismen findet über
Physisorption statt. Dies erklärt bei der LYS-Beschichtung möglicherweise das sehr ähnlich
Verhalten der Anbindung sowohl auf der passivierten Oberfläche, als auch nach SABeschichtung.
4.2.2 Elektrochemie in DMEM bei 37°C
Aufgrund der im Vergleich zu SBF zusätzlichen organischen Bestandteile des DMEM sowie
durch
eine
Temperaturerhöhung
auf
37°C
kann
eine
bessere
Nachbildung
der
physiologischen Bedingungen erzielt werden. Die Ergebnisse der Elektrochemie der BSABeschichtungen zeigen, dass sich deutliche Unterschiede für die Korrosionsbeständigkeit in
den Elektrolyten SBF und DMEM ergeben. Basierend auf diesen Erkenntnissen, wurden die
elektrochemischen Messungen nach LYS-Beschichtung in Zellkulturmedium (DMEM) bei
37°C durchgeführt. Analog zur Elektrochemie der BSA-Beschichtungen in DMEM, wurden
die Proben für verschiedene Zeiten in 100 ml DMEM bei 37°C ausgelagert, bevor zunächst
das OCP für 15 min aufgezeichnet wurde und anschließend die EIS-Messungen am
jeweiligen Ruhepotential durchgeführt wurden.
Abbildung 39 zeigt die Ergebnisse der EIS-Messungen der LYS-Beschichtung via SA sowie
der Referenzserie nach einer Auslagerungszeit von 0 h.
Ergebnisse und Diskussion
91
Abbildung 39: EIS-Ergebnisse der Lysozym-Beschichtungen nach einer Auslagerungszeit von 0 h in
DMEM bei 37°C; a) Nyquist-Plots nach NaOH-Passivierung und nach zusätlicher Beschichtung mit LYS
für
verschiedene
Zeiten,
b)
mittlere
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
den
zugehörigen
Standardabweichungen für die direkte LYS-Beschichtung ; c) Nyquist-Plots nach Vorbehandlung mit SA
und
nach
zusätlicher
Beschichtung
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
mit
LYS
für
verschiedene
den
zugehörigen
Zeiten
und
Standardabweichungen
für
d)
mittlere
die
LYS-
Beschichtung via SA
Betrachtet man zunächst die Nyquist-Plots der direkten LYS-Beschichtung (Abbildung 39 a),
so weisen alle Kurven einen ähnlichen Verlauf auf. Auch hier sind jeweils zwei Halbkreise
vorhanden. Wobei der erste Halbkreis einen wesentlich kleineren Durchmesser als der
Zweite aufweist. Jede Beschichtung sowie NaOH passiviertes Mg besitzt Werte bei niedrigen
Frequenzen, die im negativen Bereich liegen. Somit weisen alle Impedanzen induktive
Anteile. Die einzige nahezu abgeschlossene induktive Schleife zeigt jedoch nur passiviertes
Mg. Bei den verschiedenen LYS-Beschichtungen ist teilweise lediglich ein kleiner Teil dieser
Schleife angedeutet. Es wird davon ausgegangen, dass sich bei weiterhin abnehmenden
Frequenzen die induktiven Schleifen ausbilden. Generell kann durch das Fitten mit
geeigneten Parametern die induktive Schleife simuliert werden. Bei komplexen Systemen,
92
Ergebnisse und Diskussion
wie sie hier vorhanden sind, ist jedoch eine realistische Simulation kaum möglich. Aufgrund
dessen werden auch hier vor allem die mittleren Ladungsdurchtrittswiderstände als
Abschätzung für die Korrosionsbeständigkeit verwendet. In Abbildung 39 b sind die
berechneten RD-Werte für NaOH-passiviertes Magnesium und die direkten LYSBeschichtungen zu sehen. Die Passivierung zeigt einen mittleren RD von ca. 2,0 k*cm². Bis
zu einer Beschichtungszeit von 1 h erfolgt ein Anstieg der Durchtrittswiderstände bis auf ca.
4,2 k*cm². Nach einer LYS-Beschichtung für 3 h findet ein jäher Abfall von RD auf Werte im
Bereich der unbeschichteten NaOH-Proben statt. 24 h LYS führen zu einer weiteren
Abnahme der Korrosionsbeständigkeit (RD ~ 0,8 k*cm²).
Es zeigt sich, dass kurze Beschichtungszeiten (bis 1 h) bei der direkten LYS-Beschichtung
zu einer signifikanten Zunahme der Korrosionsbeständigkeit im Vergleich zu lediglich
passiviertem Magnesium führen. Hier hat das auf der Oberfläche adsorbierte LYS einen
positiven
Einfluss
auf
die
Korrosion
von
Magnesium.
Wie
bei
BSA
wird
die
korrosionshemmende Wirkung auf die Blockierung der Oberfläche durch das Protein
zurückgeführt. Ungeklärt bleibt hingegen die deutliche Abnahme der Korrosionsbeständigkeit
für LYS-Beschichtungszeiten von 3 h und 24 h, da die Ergebnisse der XPS-Analyse
implizieren, dass längere Beschichtungszeiten mit LYS mit einer stetigen Zunahme der
Protein-Adsorption und damit mit einer Erhöhung der Korrosionsbeständigkeit einhergehen
müssten.
In Abbildung 39 c sind die Nyquist-Plots der LYS- Beschichtungen via SA aufgetragen. Wie
bei der direkten Beschichtung besitzen auch hier alle Kurven ähnliche Form, mit einem
kleinen Halbkreis bei hohen Frequenzen und einem darauf folgenden Halbkreis mit
wesentlich größerem Durchmesser. Analog zur NaOH-Vorbehandlung weisen alle Kurven
induktive Anteile auf. Die reine SA-Beschichtung ist ebenfalls die einzige Kurve, die eine
nahezu abgeschlossene induktive Schleife zeigt. Der mittlere Durchtrittswiderstand nach SABeschichtung liegt mit 2,7 k*cm² etwas höher als der Durchtrittswiderstand nach NaOHPassivierung. Generell zeigt die LYS-Beschichtung via SA einen ähnlichen Trend wie die
Beschichtung mit LYS ohne die Verwendung von Linkermolekülen. Für die Anbindung via SA
findet ebenfalls ein starker Abfall der mittleren Durchtrittswiderstände für 3 h und 24 h LYSBeschichtung auf Werte unterhalb der SA-Vorbehandlung statt (4,7 k*cm²). Bis 1 h bleiben
die Werte auf gleichem Niveau, wenn man die Standardabweichungen berücksichtig. Im
Vergleich zur direkten Beschichtung findet bei der Beschichtung via SA ebenfalls ein starker
Abfall der mittleren Durchtrittswiderstände auf das Niveau der SA-Vorbehandlung statt. Für
eine Beschichtungszeit von 24 h werden die niedrigsten Werte erreicht (RD ~ 0,7 k*cm²).
Diese Ergebnisse zeigen zum einen eine leichte Verbesserung der Korrosionsbeständigkeit
nach SA-Beschichtung. Auch für kurze Beschichtungszeiten (0,25 bis 1 h) werden im
Vergleich zur direkten LYS-Beschichtung höhere RD-Werte erreicht. Jedoch sinkt hier die
Ergebnisse und Diskussion
93
Reproduzierbarkeit, was durch die deutlich höheren Schwankungen bei Beschichtungszeiten
von 0,25 und 0,5 h impliziert wird. Auch durch die SA-Vorbehandlung kann für 3 und 24 h
keine Verbesserung der Korrosionsbeständigkeit erzielt werden.
Im Wesentlichen zeigen die Ergebnisse der Elektrochemie den gleichen Trend wie die XPSAnalyse, welche vor allem für 0,25 h und 0,5 h LYS mehr Protein auf der Oberfläche zeigt als
für die direkte Anbindung. Sowohl die Durchtrittswiderstände als auch die charakteristischen
Protein-Signale nehmen für 3 h und 24 h LYS ab. Es scheint, dass sich bei längeren
Beschichtungszeiten weniger Lysozym auf der Oberfläche befindet. Dies könnte wie oben
bereits beschrieben durch eine Desorption der Proteine und/oder durch korrosionsbedingte
Bildung von Mg(OH)2 verursacht werden. Beides führt zu einer geringeren Schutzwirkung der
Proteine gegen Korrosion.
Sowohl die LYS-Anbindung via NaOH als auch via SA zeigt für 0,25, 0,5 und 1 h höhere RDWerte als die vergleichbaren BSA-Beschichtungen. Ein ausführlicher Vergleich der EISErgebnisse der LYS- mit den BSA-Beschichtungen findet in Kapitel 4.3 statt.
Die EIS-Ergebnisse der beiden unterschiedlichen Beschichtungsmechanismen nach einer
Auslagerungszeit von 24 h in DMEM bei 37°C sind in Abbildung 40 dargestellt.
94
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 40: EIS-Ergebnisse der Lysozym-Beschichtungen nach einer Auslagerungszeit von 24 h in
DMEM bei 37°C; a) Nyquist-Plots nach NaOH-Passivierung und nach zusätzlicher Beschichtung mit LYS
für
verschiedene
Zeiten,
b)
mittlere
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
den
zugehörigen
Standardabweichungen für die direkte LYS-Beschichtung; c) Nyquist-Plots nach Vorbehandlung mit SA
und
nach
zusätzlicher
Beschichtung
Ladungsdurchtrittswiderstände
RD
mit
mit
den
LYS
für
zugehörigen
verschiedene
Zeiten
und
Standardabweichungen
für
d)
mittlere
die
LYS-
Beschichtung via SA.
Erneut weisen alle Nyquist-Plots (Abbildung 40 a und c) zwei Halbkreise auf. Im Vergleich zu
einer Auslagerungszeit von 0 h besitzen alle Kurven eine vollständige induktive Schleife oder
einen Teil davon. Auch befinden sich die Induktivitäten jeweils in der gleichen
Größenordnung, was den Vergleich der Ladungsdurchtrittswiderstände berechtigt. Bedingt
durch die längere Auslagerungszeit in DMEM findet auch hier ein genereller Anstieg der
Ladungsdurchtrittswiderstände statt (Abbildung 40 b und d). Für die NaOH-Passivierung
nimmt RD im Vergleich zur 0 h Auslagerung in DMEM um mehr als das 20-Fache zu
(~ 65 k*cm²). Die LYS-Beschichtungen von 0,25 bis 3 h verändern sich lediglich im Bereich
der Standardabweichung der NaOH-Proben. Eine Beschichtungszeit von 24 h führt zu einem
Rückgang von RD auf einen Wert von etwa 10 k*cm². Im Gegensatz zu den kürzeren
Ergebnisse und Diskussion
95
Auslagerungszeiten, zeigen die LYS-Beschichtungen nach 24 h in DMEM keine weitere
Verbesserung der Korrosionsbeständigkeit mehr.
Abbildung 40 d zeigt die Ladungsdurchtrittswiderstände der LYS-Beschichtung via SA. Der
RD für die SA-Vorbehandlung liegt bei ca. 105 k*cm² und ist somit deutlich höher als der RD
für die NaOH-Passivierung. Hier zeigt sich erstmals eine signifikante Erhöhung der
Korrosionsbeständigkeit bedingt durch die SA-Beschichtung. Für 0,25 h LYS-Beschichtung
findet jedoch ein deutlicher Rückgang des RD auf einen Wert von ca. 58 k*cm² statt. Bis 1 h
steigen die Ladungsdurchtrittswiderstände wieder an und erreichen ein Maximum mit Werten
um die 189 k*cm². Beschichtungszeiten von 3 h und 24 h führen erneut zu einer Abnahme
der Korrosionsbeständigkeit, wobei die niedrigsten Werte mit ca. 15 k*cm² für 24 h erreicht
werden. Im Vergleich zu den kürzeren Auslagerungszeiten in DMEM verschwindet die
positive Wirkung der zusätzlichen LYS-Beschichtungen auch bei der Verwendung des
Linkermoleküls SA fast vollständig. Lediglich für eine Beschichtungszeit von 1 h können
höhere Ladungsdurchtrittswiderstände als für die SA-Vorbehandlung erzielt werden.
Tabelle 13: Zusammenfassung der EIS-Ergebnisse der LYS-Beschichtungen, gemessen in DMEM ohne
vorherige Auslagerung und nach 24 h Auslagerung in DMEM bei 37°C
RD nach 0h DMEM (*cm-2)
RD nach 24h DMEM (*c-2)
Mg
NaOH
SA
Mg
NaOH
SA
2233
1982
2695
29104
65131
105181
0,25h LYS
3253
4677
42844
57730
0,5h LYS
3851
4683
59667
103731
1h LYS
4236
5528
90583
189271
3h LYS
1432
2229
53977
111896
24h LYS
770
663
9620
15318
0h LYS
Die Übersicht der LYS-Ergebnisse der LYS-Beschichtungen in DMEM (Tabelle 13) zeigt,
dass ein positiver Einfluss der LYS-Beschichtung für Beschichtungszeiten bis 1 h bei den
Messungen ohne vorherige Auslagerung in DMEM vorhanden ist. Die reine SAVorbehandlung hat hingegen lediglich einen geringen Effekt auf die Korrosionsbeständigkeit
von Magnesium in DMEM. Im Gegensatz dazu zeigt sich ein positiver Effekt von SA nach
24 h Auslagerung in DMEM, während eine weitere Erhöhung der Korrosionsbeständigkeit
durch die LYS-Beschichtung lediglich bei 1 h Beschichtungszeit verzeichnet werden kann.
Die höchsten RD-Werte werden sowohl bei 0 h Auslagerung, als auch bei 24 h Auslagerung
durch SA+1 h LYS erzielt.
96
Ergebnisse und Diskussion
4.3
Vergleich der BSA- und LYS-Beschichtungen
Um einen ausführlichen und direkten Vergleich des Einflusses der BSA- und der LYSSchichten auf die Mg-Korrosion zu ermöglichen, sind in Abbildung 41 und in Abbildung 42
die Durchtrittswiderstände beider Protein-Anbindungen dargestellt. Abbildung 41 zeigt dabei
die RD-Werte der Proteinanbindung via NaOH sowie via SA nach einer Auslagerungszeit von
0 in DMEM.
Abbildung 41: Vergleich der Ladungsdurchtrittswiderstände der verschiedenen BSA- und LYSBeschichtungszeiten nach einer Auslagerungszeit von 0 h in DMEM bei 37°C; a) direkte Proteinanbindung
ohne die Verwendung von Linkermolekülen; b) Proteinanbindung via SA
Sowohl für die direkte Adsorption als auch für die Beschichtung über das Linkermolekül SA
ist der gleiche Trend zu erkennen. Für die kurzen Beschichtungszeiten bis 1 h weist LYS
durchgängig
höhere
mittlere
Durchtrittswiderstände
auf.
Vor
allem
für
das
SA-
Beschichtungssystem ist teilweise eine Zunahme von RD um mehr als das 2-Fache
gegenüber BSA zu verzeichnen. Jedoch weisen die LYS-Beschichtungen für die kurzen
Zeiten deutlich höhere Standardabweichungen im Vergleich zu BSA auf. Für 3 h
Beschichtung liegt der RD beider Proteine für die Referenzserie im gleichen Bereich. Für die
Adsorption via SA werden für LYS etwas höhere Durchtrittswiderstände im Vergleich zu BSA
erreicht. 24 h ist die einzige Beschichtungszeit, bei der BSA für beide Beschichtungssysteme
höhere Korrosionsbeständigkeit aufweist als LYS. Während die Verwendung des
Linkermoleküls SA bei der BSA-Anbindung kaum eine Verbesserung bringt, kann durch den
zusätzlichen Vorbehandlungsschritt teilweise eine Zunahme der Korrosionsbeständigkeit für
die LYS-Schichten auf Magnesium erzielt werden. Dies deutet womöglich auf eine bessere
bzw. stärkere Bindung von Lysozym an die SA-Oberfläche hin.
Ergebnisse und Diskussion
97
Abbildung 42 zeigt die Durchtrittswiderstände der beiden Proteinbeschichtungen via NaOH
und via SA nach einer Auslagerungszeit in DMEM von 24 h.
Abbildung 42: Vergleich der Ladungsdurchtrittswiderstände der verschiedenen BSA- und LYSBeschichtungszeiten
nach
einer
Auslagerungszeit
von
24 h
in
DMEM
bei
37°C;
a)
direkte
Proteinanbindung ohne die Verwendung von Linkermolekülen; b) Proteinanbindung via SA
Für die direkte Anbindung zeigen beide Proteine generell den gleichen Trend: ein Anstieg
der Korrosionsbeständigkeit bis 1 h Beschichtungszeit mit einem Rückgang von RD für 3 h
und 24 h. Unter Berücksichtigung der Streuung liegen die RD-Werte beider Proteine für fast
alle Beschichtungszeiten im gleichen Bereich. Eine Ausnahme bilden die Beschichtungen für
1 h und für 3 h, bei welchen durch die Verwendung von LYS etwas höhere
Durchtrittswiderstände im Vergleich zu BSA erzielt werden.
Für die Proteinanbindung via SA ist im Gegensatz zur direkten Beschichtung kein
einheitlicher Trend von BSA und LYS zu beobachten. Zwar liegen die RD–Werte für die
0,25 h sowie für die 0,5 h Beschichtung bei beiden Proteinen im selben Bereich. Jedoch
findet für LYS ein weiterer Anstieg von RD bis 1 h Beschichtung statt, während für die BSABeschichtung bereits ab 1 h ein starker Rückgang des Durchtrittswiderstandes auf Werte
unterhalb der 0,25 h Beschichtung auftritt. Der RD der LYS-Beschichtung geht ab einer
Beschichtungszeit von 3 h zurück und nimmt für 24 h Werte im Bereich der vergleichbaren
BSA-Beschichtung an. Wie bei den Ergebnissen ohne vorherige Auslagerung in DMEM,
unterscheiden sich die BSA-Anbindung via NaOH und via SA kaum bezüglich ihrer
Korrosionsbeständigkeit. Eine eindeutig positive Auswirkung der SA-Vorbehandlung bei BSA
zeigt sich lediglich bei einer Beschichtungszeit von 0,5 h. Im Gegensatz dazu können bei
LYS für fast alle Beschichtungszeiten deutlich höhere Durchtrittswiderstände für die
Anbindung via SA gegenüber der direkten Anbindung erzielt werden.
98
Auch
Ergebnisse und Diskussion
nach
einer
Auslagerungszeit
von
24 h
in
DMEM
zeigt
sich
bei
beiden
Anbindungsmechanismen tendenziell eine höhere Korrosionsbeständigkeit der LYSBeschichtung im Vergleich zu BSA.
Der Vergleich der BSA- und LYS-Anbindung macht den unterschiedlichen Einfluss der
Oberflächenvorbehandlung auf die Adsorption von unterschiedlichen Proteinen deutlich.
Während die Beschichtung von SA nur vereinzelt einen Effekt auf die BSA-Anbindung im
Vergleich zur OH-terminierten Oberfläche hat, zeigt sich für LYS teilweise eine deutliche
Erhöhung der Korrosionsbeständigkeit durch die zusätzliche Linkerbeschichtung. Vor allem
der deutlich voneinander abweichende IEP der beiden verwendeten Proteine könnte der
Grund für die unterschiedlich starken Einflüsse der SA-Vorbehandlung sein. Während der
IEP von BSA bei ca. 5 liegt [68] und sich somit deutlich vom IEP von Mg(OH)2 (~12) [114]
unterscheidet, liegt der IEP von LYS mit ca. 11 [76-79] nur leicht unterhalb dem von
Mg(OH)2. Dies führt dazu, dass BSA und die Mg(OH)2 Oberfläche sich bei den während der
Beschichtung herrschenden pH-Werten elektrostatisch anziehen, während zwischen LYS
und Mg(OH)2 abstoßende Kräfte wirken. Durch die Beschichtung mit SA ändert sich
womöglich die Ladung der Probenoberfläche. Außerdem wird die Oberfläche im Vergleich
zur NaOH-Passivierung durch die SA-Anbindung deutlich hydrophober, was elektrostatische
Wechselwirkungen in den Hintergrund drängt. Auch die Unterschiede in Molekülgröße und
Schichtbildungsmechanismus der beiden Proteine können Gründe für den unterschiedlichen
Einfluss der SA-Vorbehandlung auf die Adsorption sein.
Ergebnisse und Diskussion
4.4
99
Passivierung von Magnesium in Zellkulturmedium
Wie in den Kapiteln 4.1.6 und 4.2.2 bereits beschrieben, zeigt sich ein relativ großer Einfluss
des Elektrolyten auf das Korrosionsverhalten von Magnesium. So weisen alle in DMEM
durchgeführten elektrochemischen Messungen höhere Korrosionsbeständigkeit auf als
vergleichbare Messungen in SBF. Zudem zeigen die dem Zellkulturmedium ausgesetzten
Proben bereits ohne mikroskopische Vergrößerung ein anderes Erscheinungsbild als die in
SBF analysierten Proben. Diese Beobachtung führte zur Vermutung, dass sich aus
Bestandteilen des DMEM und eventuell
aus Produkten der Magnesiumkorrosion eine
Schicht auf der Oberfläche bildet, die in gewissem Maße vor Korrosion schützt und die
weitere Mg-Auflösung herabsetzt. Im folgenden Kapitel wird der Einfluss der Auslagerung in
DMEM
näher
untersucht.
Vor
allem
der
Zusammenhang
zwischen
den
Auslagerungsparametern und der Schichtdicke, der Schichtzusammensetzung und –
morphologie, sowie der Korrosionsbeständigkeit steht dabei im Fokus. Zunächst wurden MgProben für 1, 3 und 5 Tage in DMEM bei RT und im Inkubator bei 37°C und 5 % CO2
ausgelagert und sowohl oberflächenanalytisch als auch elektrochemisch charakterisiert. In
Anlehnung an die Zellversuche, wurde ebenfalls der Einfluss von Serum auf die
Korrosionseigenschaften von Magnesium sowie auf die Schichtbildung untersucht. Hierfür
wurde dem Auslagerungsmedium 20 % fötales Kälberserum (FCS) zugefügt. Die
Auslagerung fand ebenfalls für 1, 3 und 5 Tage im Inkubator statt.
4.4.1 Oberflächenanalyse der DMEM-Passivierungen
Um
die
während
der
Passivierung
in
DMEM
bei
den
verschiedenen
Auslagerungsparametern gebildeten Schichten oberflächenanalytisch zu charakterisieren,
wurden Aufnahmen der Schichten mit dem Rasterelektronenmikroskop sowie XPS- (X-ray
Photoelectron Spectroscopy), XRD- (Röntgendiffraktometrie) und FTIR-Messungen (Fourier
transformierte Infrarotspektroskopie) durchgeführt.
Rasterelektronenmikroskopie
Um
die
während
der
Passivierung
in
DMEM
mit
den
unterschiedlichen
Auslagerungsparametern gebildeten Schichten hinsichtlich Schichtdicke und -morphologie
zu charakterisieren, wurden Querschliffe mittels einer Ionenmühle präpariert, von welchen im
Anschluss Aufnahmen mit einem Rasterelektronenmikroskop angefertigt wurden.
Die REM-Aufnahmen der Passivierung in DMEM bei Raumtemperatur sind in Abbildung 43
dargestellt.
100
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 43: REM Aufnahmen der mit der Ionenmühle präparierten Querschliffe der in DMEM bei
Raumtemperatur passivierten Proben; a)-c) Auslagerung für 1 d, d)-f) Auslagerung für 3 d, g)-i)
Auslagerung für 5 d.
Alle drei Auslagerungszeiten weisen eine sehr ähnliche Schichtmorphologie auf. Abbildung
43 a, d und g zeigen jeweils eine Übersicht der gebildeten Schichten bei Vergrößerungen um
das 8.000- bis 22.000-Fache. Hier sind durchgehend Risse, die sich jeweils über die
gesamte Schichtdicke erstrecken, zu beobachten. Es wird angenommen, dass die Risse
durch Eigenspannungen in den Schichten hervorgerufen werden und entweder bereits
während der Auslagerung oder durch das anschließende Trocknen entstehen. Die
Schichten, die in DMEM bei Raumtemperatur gebildet werden, lassen sich grob in zwei
Bereiche aufteilen. Im unteren Bereich, nahe dem Substrat, ist eine poröse Struktur zu
erkennen. Im oberen Drittel schließt sich ein Bereich an, der auch bei höheren
Vergrößerungen kompakte Struktur aufweist. Generell findet eine kontinuierliche Abnahme
der Porosität der Schichten von innen nach außen statt. Die hohe Porendichte in
Substratnähe steht vermutlich mit der anfänglichen Auflösung von Magnesium in DMEM und
der damit verbundenen Wasserstoffentwicklung in Zusammenhang. Die Entwicklung von
Gasblasen führt zur Entstehung von Poren während der anfänglichen Schichtbildung. Je
dicker die Schicht wird, die sich auf Magnesium ablagert, desto mehr wird das Substrat vom
Elektrolyt abgeschirmt und die Magnesiumauflösung und somit die Wasserstoffentwicklung
Ergebnisse und Diskussion
101
nehmen ab, was zu einer verringerten Porosität in höheren Schichtlagen führt. Die
Vergrößerung eines Risses in Abbildung 43 c zeigt eine sphärische Struktur im
Schichtinneren. Auch hier ist deutlich der Übergang zwischen einer lockereren Struktur und
dem kompakten Äußeren der Schicht zu erkennen. Eine Besonderheit weist die Passivierung
für 5 Tage auf. Hier wurden – wie in Abbildung 43 i dargestellt – regelmäßig unterhalb der
Schicht, im Substrat Strukturen gefunden, die auf korrosive Angriffe hinweisen. Diese
Bereiche scheinen direkt an der ursprünglichen Oberfläche zu beginnen und sich ins
Substratinnere auszubreiten. Die gebildeten Strukturen deuten möglicherweise auf Mg(OH) 2
hin.
Die REM-Aufnahmen der Passivierung in DMEM im Inkubator bei 37°C und einem CO 2Gehalt von 5 % sind in Abbildung 44 dargestellt.
Abbildung 44: REM Aufnahmen der mit der Ionenmühle präparierten Querschliffe der in DMEM im
Inkubator (37°C, 5 % CO2) ausgelagerten Proben; a)-c) Auslagerung für 1 d, d)-f) Auslagerung für 3 d, g)-i)
Auslagerung für 5 d.
Im Gegensatz zur Auslagerung bei Raumtemperatur treten bei der Auslagerung im Inkubator
einige Unterschiede bezüglich der Morphologie der gebildeten Schichten bei den
verschiedenen Auslagerungszeiten auf. Die Passivierung für einen Tag zeigt eine
Rissbildung, vergleichbar mit den bei Raumtemperatur ausgelagerten Proben. Ebenfalls
102
Ergebnisse und Diskussion
kann eine poröse Struktur der Schicht beobachtet werden. Allerdings sind die Poren
gleichmäßig über die gesamte Schichtdicke verteilt. Es tritt weder eine Abnahme der
Porosität von innen nach außen auf, noch ist ein kompakter äußerer Bereich der Schicht
vorhanden. Die Struktur der Schicht, die durch die Vergrößerung eines Risses sichtbar wird,
ist jedoch ähnlich der der Auslagerung bei Raumtemperatur.
Im Vergleich zur 1 d-Auslagerung im Inkubator, weist die 3 d Passivierung im Inkubator
deutlich höhere Schichtdicken auf. Jedoch zeigt diese Probe eine wesentlich stärkere
Rissbildung (vgl. Abbildung 44 d), womöglich bedingt durch höhere Eigenspannungen in der
dickeren Schicht. Des Weiteren sind bei der Auslagerung für 3 Tage im Inkubator wieder
zwei Bereiche innerhalb der Schicht zu erkennen. Wie bei der DMEM-Passivierung bei
Raumtemperatur ist eine hohe Porosität in den unteren Bereichen der Schicht zu
beobachten, während die Poren nach außen hin kleiner und weniger werden. Bei höheren
Vergrößerungen ist jedoch ersichtlich, dass der äußere Bereich der gebildeten Schicht nicht
vollständig kompakt ist.
Die Passivierung für 5 Tage im Inkubator zeigt erneut ein anderes Erscheinungsbild als die
beiden kürzeren Auslagerungszeiten. Die Schichtdicke ist vergleichsweise unregelmäßig,
wie in Abbildung 44 g beispielhaft gezeigt wird. Generell werden hier jedoch die höchsten
Schichtdicken aller untersuchten Proben erreicht. Wie auch bei der 3 d Auslagerung im
Inkubator, wird eine starke Rissbildung beobachtet.
Die REM Aufnahmen der in DMEM + 20 % FCS im Inkubator passivierten Proben sind in
Abbildung 45 dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion
103
Abbildung 45: REM Aufnahmen der mit der Ionenmühle präparierten Querschliffe der in DMEM + 20 %
FCS im Inkubator (37°C, 5 % CO2) ausgelagerten Proben; a)-c) Auslagerung für 1 d, d)-f) Auslagerung für
3 d, g)-i) Auslagerung für 5 d.
Alle Auslagerungszeiten zeigen deutlich geringere Schichtdicken als die Passivierungen in
DMEM ohne den Zusatz von FCS. Außerdem ist die Grenzfläche zwischen Substrat und
Schicht durchweg uneben. Für alle Auslagerungszeiten lassen sich Poren in den Schichten
erkennen, jedoch weist lediglich die 3 d Auslagerung eine poröse Struktur der Schicht
ähnlich der Passivierungen in DMEM ohne FCS auf. Auffällig ist, dass weder bei 1 d noch
5 d regelmäßig Risse in den gebildeten Schichten vorhanden sind. Da hier die Schichten
vergleichsweise dünn sind, kann die Annahme bestätigt werden, dass die Risse durch
Eigenspannungen in den gebildeten Schichten ab einer genügend hohen Dicke entstehen.
Für die Berechnung der Schichtdicke wurden jeweils 3-4 Stellen pro Probe ausgewählt aus
denen der jeweilige Mittelwert gebildet wurde. Abbildung 46 zeigt die durchschnittlichen
Schichtdicken der drei verschiedenen Passivierungen für 1, 3 und 5 Tage Auslagerung im
Medium.
104
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 46. Vergleich der Schichtdicken für die verschiedenen Auslagerungszeiten der DMEMPassivierung bei Raumtemperatur, im Inkubator bei 37°C und 5 % CO2 und nach Zugabe von 20 %FCS
zum Medium
Die Passivierung in DMEM bei Raumtemperatur zeigt eine leichte aber kontinuierliche
Abnahme der Schichtdicke mit zunehmender Auslagerungszeit. Dabei sinken die Werte von
ca. 3,5 µm für 1 d auf ca. 2,1 µm für 5 d. Die Schichtbildung scheint vergleichsweise
homogen zu sein, da lediglich geringe Schwankungen auftreten. Die Passivierung in DMEM
im Inkubator zeigt ein abweichendes Verhalten. Im Gegensatz zur Passivierung bei
Raumtemperatur nimmt die Schichtdicke mit längerer Auslagerung stetig zu, wobei auch die
Schwankungen eine starke Zunahme erfahren. Insgesamt werden für die Auslagerung in
DMEM im Inkubator die höchsten Schichtdicken mit stellenweise bis zu 24 µm für 5 d
erreicht. Die Zugabe von 20 % FCS zum Medium führt zu einer deutlichen Abnahme der
Schichtdicken. So werden für 1 d lediglich 0,2 µm im Durchschnitt erreicht. Ein Anstieg
erfolgt für 3 d auf Werte um 1,1 µm, während die Schichtdicke für die Auslagerung für 5 Tage
wieder zurückgeht (0,4 µm).
Auch
im
Vergleich
der
Schichtdicken
wird
der
Einfluss
der
verschiedenen
Auslagerungsparameter deutlich. Die leichte Abnahme der Schichtdicken mit zunehmender
Auslagerungszeit für die Passivierung bei Raumtemperatur kann vermutlich auf die
Erhöhung des pH-Wertes des Zellkulturmediums, bedingt durch die anfängliche starke
Magnesiumauflösung und die hohe Sauerstoffkonzentration sowie die unzureichende
Pufferung in Normalatmosphäre, zurückgeführt werden (vgl. Abbildung 47).
Ergebnisse und Diskussion
105
Abbildung 47: pH-Wert Entwicklung während der Auslagerung in DMEM bei Raumtemperatur, im
Inkubator bei 37°C und 5 % CO2 und nach Zugabe von 20 %FCS zum Medium
Die kompakten Außenbereiche der gebildeten Schichten lassen darauf schließen, dass eine
gewisse Selbstlimitierung der Magnesiumkorrosion stattfindet.
Die Passivierung im Inkubator mit einem CO2-Gehalt von 5 % führt zu einer wesentlich
stärkeren Pufferung des Zellkulturmediums und so zu einem schwächeren pH-Anstieg. Die
Selbstlimitierung der Magnesiumkorrosion ist hier im Vergleich zur RT-Passivierung
eingeschränkt. Dies wird auch aus den REM-Aufnahmen der Querschliffe ersichtlich, die für
die Auslagerung im Inkubator eine durchgängige Porosität der Passivschichten zeigen.
Die Zugabe von FCS zum Medium führt zu einer vergleichsweise starken Reduktion der
Schichtdicken. Möglicherweise haben die Proteine in der Lösung eine hemmende Wirkung,
indem sie sich auf der Oberfläche anlagern und so die Schichtbildung einschränken. Die
Zunahme des pH-Wertes ist etwas geringer als für DMEM im Inkubator, was vermutlich
durch die zusätzlich Pufferwirkung von BSA im zugegebenen FCS bewirkt wird.
XPS
Um Aufschluss über die Zusammensetzung der gebildeten Schichten zu erhalten, wurden
XPS-Messungen durchgeführt. Die zugehörigen Ergebnisse sind in Abbildung 48 dargestellt.
Neben den Atomkonzentrationen einiger Signale, ist das Ca/P-Verhältnis aufgetragen,
welches Aufschluss über die gebildeten Calciumphosphatverbindungen geben soll.
106
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 48: XPS-Ergebnisse der verschiedenen DMEM-Passivierungen für 1, 3 und 5 Tage.
Aufgetragen sind die Atomkonzentrationen der C1s-, N1s, O1s-, Ca2p-, P2p- und der Mg2p-Signale; a)
Passivierung in DMEM bei Raumtemperatur; b) Passivierung in DMEM im Inkubator bei 37°C und 5 % CO2;
c) Passivierung in DMEM +20 % FCS im Inkubator bei 37°C und 5 % CO2; d) Verhältnis des Ca2p- und des
P2p-Signals der verschiedenen Passivierungsparameter.
Abbildung 48 a zeigt die XPS-Ergebnisse für die DMEM-Passivierung bei Raumtemperatur.
Generell weisen die drei verschiedenen Auslagerungszeiten für alle analysierten Signale
ähnliche Werte auf. Die größten Abweichungen finden sich bei C1s und O1s. Während der
Kohlenstoffgehalt nach 3 Tagen von ca. 27,4 at% (für 1 d) auf etwa 20,2 at% sinkt, findet
nach einer Auslagerungszeit von 5 Tagen ein Anstieg des C1s-Signals statt und nimmt mit
etwa 33,0 at% Maximalwerte an. Umgekehrt verhält es sich beim O1s-Signal. Hier weist 3 d
die höchsten Werte auf (~55,5 at%), 5 d die niedrigsten (46,7 at%). Die N1s-Signale liegen
bei allen Auslagerungszeiten unter 1,5 at%, wobei die Peaks vom Rauschen überlagert
werden, weshalb davon ausgegangen werden kann, dass sich kaum bzw. keine
Stickstoffverbindungen oder Aminosäuren auf der Oberfläche befinden. Die Ca2p-Signale
bewegen sich im Bereich zwischen ca. 10,6 und 13,1 at%, die P2p-Signale zwischen 6,6 und
7,6 at%, wobei hier ähnlich wie beim O1s-Signal die Auslagerung für 3 Tage jeweils die
höchsten Atomkonzentrationen und die Auslagerung für 5 Tage die niedrigsten Werte
Ergebnisse und Diskussion
107
annimmt. Die Mg2p-Signale fallen durchweg vergleichsweise gering aus. Für 1 d und 3 d
liegen sie um 2,8 at%, für 5 d findet sogar eine Abnahme auf rund 1,6 at% statt. Diese
Ergebnisse lassen darauf schließen, dass sich während der Auslagerung in DMEM bei
Raumtemperatur kaum Magnesiumverbindungen, zumindest in den äußeren Schichtlagen,
bilden. Eine Detektion von Signalen des Substrates ist auch im Bereich der Risse aufgrund
der gegebenen Schichtdicken unwahrscheinlich. Die hohen Atomkonzentrationen für
Calcium,
Phosphor
und
Sauerstoff
weisen
darauf
hin,
dass
sich
bevorzugt
Calciumphosphatverbindungen auf der Mg-Oberfläche ablagern. Diese Annahme wird durch
Studien gestützt, in denen die Bildung von verschiedenen Calciumphosphaten auf
Magnesium in simulierten Körperflüssigkeiten oder Zellkulturmedium beschrieben wird [6,
116-118]. Die Kohlenstoffsignale können zum Teil durch atmosphärische Kontamination
verursacht werden. Die hohen Werte für C1s sprechen jedoch dafür, dass Carbonate in die
Schicht eingebaut werden.
Auch die XPS-Ergebnisse der DMEM-Passivierung im Inkubator zeigen für alle
Auslagerungszeiten
ähnliche Werte
der
einzelnen
Signale
(Abbildung
48 b).
Die
Atomkonzentrationen für C1s fallen für 1 d und 5 d deutlich geringer im Vergleich zur
Passivierung bei Raumtemperatur aus, während die O1s-Signale höhere Werte zeigen. Die
Ca2p- sowie die P2p-Signale weisen Atomkonzentrationen auf, die im Bereich der RTPassivierung liegen. Der Trend der Auslagerungszeiten ist bei der Passivierung im Inkubator
jedoch umgekehrt. Während für C1s 3 Tage die höchsten Werte zeigen, sind die
Atomkonzentrationen für O1s, Ca2p und P2p für 3 Tage am geringsten. Die N1s-Signale
liegen wiederum unter 1,5 at%, wobei auch hier keine eindeutigen Peaks vorhanden sind.
Die Atomkonzentrationen für die Mg2p-Signale zeigen eine leichte Abnahme mit
zunehmender Auslagerungszeit, wobei die Werte deutlich höher als bei der RT-Passivierung
liegen. Wie bereits bei der REM-Analyse besprochen, wird angenommen, dass die
Selbstlimitierung der Magnesiumkorrosion im Inkubator deutlich herabgesetzt ist. Dies ist
auch eine Erklärung für die höheren Magnesiumkonzentrationen für die Passivierungen, die
im Inkubator stattfinden. Hiromoto et al. beschreiben, dass durch die korrosionsbedingte
Auflösung von Magnesium eine Substitution von Ca- durch Mg-Ionen in den gebildeten
Calciumphosphatverbindungen stattfindet [119].
Für die Passivierung in DMEM + FCS weisen die Atomkonzentrationen der einzelnen
Signale für die verschiedenen Auslagerungszeiten kaum Abweichungen auf (Abbildung
48 c). Im Vergleich zur Passivierungen in reinem DMEM im Inkubator führt die Zugabe von
20 % FCS zum Medium zu einer signifikanten Erhöhung des C1s- und des N1s-Signals,
wohingegen die O1s-, sowie die Ca2p- und P2p-Signale abnehmen. Dies führt zu der
108
Ergebnisse und Diskussion
Annahme, dass sich im FCS vorhandene Proteine auf der Oberfläche anlagern. Mg2p weist
mit ca. 7-8 at% die höchsten Atomkonzentrationen der drei Passivierungen auf.
Die Abbildung 48 a-c zeigen, dass sich bei allen Auslagerungsparametern der DMEMPassivierung Calcium, Phosphor, Sauerstoff und Kohlenstoff auf der Oberfläche befinden.
Dies sowie die sphärischen Strukturen der gebildeten Schichten, die im REM beobachtet
werden (vgl. Abbildung 43 bis Abbildung 45), lässt darauf schließen, dass sich bei der
Passivierung in DMEM vor allem Calciumphosphatverbindungen bilden [120]. Die hohen
C1s-Signale könnten durch die Substitution von Phosphatgruppen mit Carbonatgruppen in
den jeweiligen Verbindungen herrühren [121, 122].
Um Aufschluss darüber zu erlangen, welche Ca-Phosphatverbindungen während der
verschiedenen Passivierungen gebildet werden, sind in Abbildung 48 d die Ca2p/P2pVerhältnisse
für
die
unterschiedlichen
Passivierungsparameter
gegenüber
der
Auslagerungszeit aufgetragen. Für die Passivierung bei Raumtemperatur nimmt das Ca/PVerhältnis durchgehend Werte um 1,67 an. Dieses Verhältnis von Calcium zu Phosphor wird
für Hydroxylapatit (HA) beschrieben und ergibt sich aus der Summenformel Ca5(PO4)3OH
[123, 124]. Leichte Abweichungen des Verhältnisses können durch die Substitution von CaIonen durch Mg-Ionen, sowie durch Substitution von PO4-Gruppen durch CO3-Gruppen
entstehen [119, 121]. Für die Passivierung im Inkubator ist eine starke Zeitabhängigkeit des
Ca/P-Verhältnisses zu beobachten. Mit zunehmender Auslagerungszeit findet ein nahezu
linearer Abfall von ca. 1,53 für 1 d auf ca. 1,29 für 5 d statt. Diese großen Abweichungen
vom Ca/P Verhältnis für HA lassen sich nicht ausschließlich durch Substitution von Ca oder
Phosphat- bzw. OH-Gruppen erklären. Es wird angenommen, dass hier hauptsächlich
Vorstufen von HA wie amorphes Calciumphosphat (Ca/P: ~1,00) [125], Tricalciumphosphat
(TCP, Ca/P: 1,50) oder Octacalciumphosphat (OCP, Ca/P: 1,33) [123] gebildet werden. Auch
möglich ist, dass eine Mischung aus verschiedenen Calciumphosphatverbindungen vorliegt
[123]. Eine weitere Ursache für die niedrigeren Ca/P-Verhältnisse sowie die zeitlich bedingte
Abnahme ist eine Substitution von Ca durch Mg. Aufgrund der stärkeren Auflösung von
Magnesium in DMEM im Inkubator steht eine größere Menge an Mg-Ionen in der Schicht zur
Verfügung.
Die Zugabe von FCS zum Medium verursacht eine weitere Abnahme des Ca/PVerhältnisses. Für 1 und 3 Tage liegen die Werte bei 1,31, die 5 d Auslagerung besitzt im
Vergleich aller Passivierungen mit 1,25 die niedrigsten Werte für das Ca/P-Verhältnis.
Möglicherweise wird die Bildung einer Calciumphosphatschicht durch Proteinanlagerung auf
der Mg-Oberfläche behindert. Die auf der Oberfläche adsorbierten Proteine bilden eine
Schicht, die in gewissem Maß vor Korrosion schützt. Dies führt zur Abnahme der MgAuflösung und möglicherweise wird so die Bildung von Calciumphosphaten behindert, die
durch die frei werdenden Mg-Ionen getriggert wird. Auch die REM-Aufnahmen zeigen, dass
Ergebnisse und Diskussion
109
sich sowohl die Ausmaße als auch die Morphologie der in DMEM + 20 % FCS gebildeten
Schichten stark von den Passivierungen in DMEM unterscheiden. Ein weiterer Grund für die
deutliche Abnahme des Ca/P-Verhältnisses könnte auch die zusätzliche Pufferwirkung des
FCS, welches zu großen Teilen BSA enthält, sein. Im Vergleich zur Passivierung in DMEM
im Inkubator, ist eine korrosionsbedingte pH-Wert-Erhöhung weiter herabgesetzt, was zu
vermehrter Magnesiumauflösung und somit zu einer vermehrten Substitution von Ca2+ durch
Mg2+ führt.
FTIR
Um zu bestätigen, dass es sich bei den in DMEM gebildeten Schichten um
Phosphatverbindungen handelt, wurden für die drei 1 d Passivierungen FTIR-Messungen
durchgeführt. Calcium- und Magnesiumionen lassen sich mittels FTIR nicht detektieren.
Abbildung 49: FTIR Spektren nach jeweils einem Tag Passivierung in DMEM bei Raumtemperatur, in
DMEM im Inkubator (37°C, 5 % CO2) und in DMEM + 20 % FCS im Inkubator.
Die Ergebnisse der FTIR-Spektren in Abbildung 49 zeigen, dass sowohl für die Auslagerung
bei Raumtemperatur, als auch für die Auslagerungen im Inkubator Phosphatgruppen
detektiert werden können. Alle Passivierungen weisen außerdem Carbonate auf. Dies lässt
vermuten, dass bei allen Passivierungsparametern Calciumphosphatschichten gebildet
werden, wobei sowohl bei Raumtemperatur, als auch im Inkubator eine Substitution mit
Carbonatgruppen stattfindet.
XRD
Hydroxylapatit sowie viele andere Calciumphosphatverbindungen werden in der Literatur
meist als kristallin beschrieben [121]. Zusätzlich zur XPS- und FTIR-Analyse wurden XRD-
110
Ergebnisse und Diskussion
Spektren aufgenommen, um Informationen über die Kristallinität der gebildeten Schichten zu
erhalten. Gemessen wurde jeweils ein Spektrum für die 1 d Auslagerung bei den
verschiedenen Parametern.
Abbildung 50: XRD Spektren nach jeweils einem Tag Passivierung in DMEM bei Raumtemperatur, in
DMEM im Inkubator (37°C, 5 % CO2) und in DMEM + 20 % FCS im Inkubator.
Die XRD-Ergebnisse (Abbildung 50) zeigen, dass weder für die Auslagerung bei
Raumtemperatur,
noch
für
die
beiden
Passivierungen
im
Inkubator
kristalline
Calciumphosphatverbindungen gefunden werden können. Alle detektierten Peaks werden
von Magnesium bzw. von Mg(OH)2 verursacht. Da die Informationstiefe der Proben auf
mehrere Mikrometer geschätzt wird, wird davon ausgegangen, dass die Mg-Signale vom
Substrat stammen. Im Bereich zwischen 25° und 40° ist jedoch vor allem für RT, aber auch
für Ink eine leichte Erhebung im Spektrum zu beobachten, welche auf eine amorphe Spezies
hindeutet. Die Hauptsignale für kristallinen HA befinden sich bei 2 = 25°-55° [126]. Dies
deutet darauf hin, dass für die beiden Auslagerungen in DMEM ohne FCS amorpher
Hydroxylapatit gebildet wird. Es ist bekannt, dass die Anwesenheit von Magnesiumionen die
Kristallisation von HA und anderen Calciumphosphaten aufgrund der Substitution von CaIonen durch Mg-Ionen in der HA-Struktur behindert [119, 127-129]. So wird für die Korrosion
von
Magnesium
in
physiologischer
Umgebung
oft
Calciumphosphaten auf der Oberfläche beschrieben [6, 125].
die
Bildung
von
amorphen
Ergebnisse und Diskussion
111
4.4.2 Elektrochemie der DMEM-Passivierung
Die elektrochemischen Messungen der DMEM-Passivierung wurden in DMEM bei 37°C
durchgeführt. Nach der jeweiligen Auslagerungszeit wurde zunächst das OCP für 30 min
aufgezeichnet, bevor die EIS mit den Parametern analog zur BSA- und LYS-Beschichtung
stattfand. Zuletzt wurden Polarisationskurven aufgenommen.
Impedanzspektroskopie
Die Ergebnisse der EIS der DMEM-Passivierung sind in Abbildung 51 dargestellt.
Aufgetragen sind die Nyquist-Plots der drei verschiedenen Auslagerungen (a-c) und die
mittleren Durchtrittswiderstände mit den zugehörigen Standardabweichungen (d).
Abbildung 51: EIS-Ergebnisse der verschiedenen DMEM-Passivierungen; a) repräsentative Nyquist-Plots
der Passivierung für 1, 3 und 5 Tage in DMEM bei Raumtemperatur; b) repräsentative Nyquist-Plots der
Passivierung für 1, 3 und 5 Tage in DMEM im Inkubator (37°C, 5 % CO2); c) repräsentative Nyquist-Plots
der Passivierung für 1, 3 und 5 Tage in DMEM + 20 % FCS im Inkubator (37°C, 5 % CO2); d) mittlere
Ladungsdurchtrittswiderstände aller Passivierungen mit den zugehörigen Standardabweichungen.
112
Ergebnisse und Diskussion
Wie bereits bei der Auslagerung der verschiedenen BSA- und LYS-Beschichtungen in
DMEM, weisen die Nyquist-Plots der DMEM-Passivierung (Abbildung 51 a-c) zwei
Halbkreise auf, wobei der erste deutlich kleiner ausfällt als der Zweite bei mittleren bis
niedrigen Frequenzen. Dies ist auch in den zugehörigen Bode-Plots (Anhang, Abbildung 82)
zu sehen, bei denen die Phasenwinkel für alle Auslagerungszeiten zwei Peaks und somit
zwei Zeitkonstanten besitzen. Die Nyquist-Plots für alle Auslagerungen weisen fast
durchgehend induktive Anteile auf. Der Vergleich der Ladungsdurchtrittswiderstände in
Abbildung 51 d zeigt, dass die bei Raumtemperatur gebildeten Schichten die besten
Korrosionseigenschaften aufweisen. 1 d DMEM-RT weist dabei einen mittleren RD von ca.
14 k*cm² auf. Bis zu einer Auslagerungszeit von 3 d findet ein Anstieg auf etwa 32 k*cm²
statt. Für 5 d DMEM zeigt sich ein deutlicher Abfall der Ladungsdurchtrittswiderstände auf
Werte, die mit ca. 8 k*cm² noch unterhalb derer für 1 d liegen. Die größten Schwankungen
treten für eine Auslagerungszeit von 3 Tagen auf. 5 d Auslagerung hingegen zeigt mit
Abstand die kleinsten Fehlerbalken für die RT-Passivierung.
Im Vergleich zur DMEM-Passivierung bei RT zeigt sich ein anderer Trend für die beiden
Auslagerungen im Inkubator. Mit zunehmender Auslagerungszeit findet hier lediglich eine
geringe Variation der Korrosionsbeständigkeit statt. Im Gegensatz zur Auslagerung bei RT
zeigt sich eine geringe Abnahme der Ladungsdurchtrittswiderstände innerhalb der ersten
drei
Tage.
Für
die
weitere
Auslagerung
ist
unter
Berücksichtigung
der
Standardabweichungen keine Änderung der Korrosionsbeständigkeit zu beobachten. Des
Weiteren weisen die Auslagerungen im Inkubator sehr viel niedrigere RD-Werte als die
Passivierung bei RT auf. Für DMEM ohne FCS liegen die mittleren RD-Werte zwischen
3,2 k*cm² und 2,5 k*cm². Die Zugabe von 20 % FCS zum Medium führt zu kaum einer
Änderung der Durchtrittswiderstände im Vergleich zu DMEM. Während die Passivierung in
DMEM im Inkubator deutliche Schwankungen aufweist, sind für DMEM + 20 % FCS kaum
Abweichungen vorhanden.
Polarisationskurven
Die Polarisationskurven der verschiedenen DMEM-Passivierungen sowie die berechneten
Korrosionsstromdichten sind in Abbildung 52 dargestellt.
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung
52:
Ergebnisse
113
der
Stromdichte-Potential-Messungen
in
DMEM
bei
37°C;
a)
Polarisationskurven der in DMEM bei Raumtemperatur für 1, 3 und 5 Tage passivierten Proben; b)
Polarisationskurven der in DMEM im Inkubator (37°C, 5 %CO2) für 1, 3 und 5 Tage passivierten Proben; c)
Polarisationskurven der in DMEM + 20 % FCS im Inkubator (37°C, 5 %CO2) für 1, 3 und 5 Tage
passivierten Proben; d) Vergleich der Korrosionsstromdichten für alle Auslagerungsparameter.
Die Passivierung bei Raumtemperatur (Abbildung 52 a) zeigt für alle Auslagerungszeiten
eine ähnliche Kurvenform. Nach Erreichen des Ruhepotentials findet ein kurzer Anstieg der
Stromdichte statt, welcher in ein Plateau übergeht. Dies weist darauf hin, dass die Proben in
diesem Bereich passives Verhalten zeigen. Zwischen Potentialen von ca. -1,29 V und ca. 1,17 V kommt es zum Durchbruch und somit zu einem erneuten starken Anstieg der
Stromdichten. Die Kurven für die verschiedenen Auslagerungszeiten unterscheiden sich in
der Lage der Ruhepotentiale, der Niveaus der Passivstromdichte, sowie in den
Durchbruchpotentialen. Der Trend ist sowohl bei den Ruhepotentialen als auch bei den
Passivstromdichten und den Durchbruchpotentialen der gleiche. 3 d DMEM zeigt mit
ca. -1,43 V das positivste Ruhepotential, die niedrigste Passivstromdichte (~2,5 µA) und das
positivste Durchbruchpotential (~1,17 V) und besitzt somit vergleichsweise die besten
Korrosionseigenschaften. Die geringste Korrosionsbeständigkeit für die Passivierung bei
114
Ergebnisse und Diskussion
Raumtemperatur weist die Auslagerung für 5 Tage auf. Es wird sowohl das negativste
Ruhepotential (ca. -1,57 V), als auch das negativste Durchbruchpotential (ca. -1,29) erreicht.
Auch die Passivstromdichte liegt vergleichsweise am höchsten. Die 1 d Passivierung liegt
bezüglich der Korrosionsbeständigkeit zwischen 3 d und 5 d.
Für die Passivierung im Inkubator zeigt sich ein ähnlicher Kurvenverlauf wie bei der
Passivierung bei Raumtemperatur. Allerdings findet eine Verschiebung der Kurven zu
negativeren Potentialen sowie zu höheren Stromdichten hin statt. Dies zeigt bereits eine
Abnahme der Korrosionsbeständigkeit für die Auslagerung im Inkubator. Des Weiteren geht
der starke Anstieg der Stromdichte nach Erreichen des Ruhepotentials nicht in ein Plateau
über. In diesem Bereich findet zwar eine vergleichsweise leichte Zunahme der Stromdichte
statt, die sich allerdings über eine Größenordnung erstreckt. Es wird kein Passivbereich im
Sinne
der
Definition
beobachtet.
1d
und
3d
besitzen
ungefähr
die
gleiche
Korrosionsbeständigkeit. Für die Passivierung im Inkubator für 5 Tage findet eine Abnahme
der Korrosionsbeständigkeit statt.
Die Zugabe von FCS zum Medium führt zu keinen großen Änderungen bezüglich der
Ruhepotentiale. Allerdings ist für 3 und 5 d ein Passivbereich mit einem deutlichen
Durchbruch zu beobachten. Die Passivstromdichten liegen mit rund 40 µA jedoch wesentlich
höher als für die Passivierung bei Raumtemperatur. Die Durchbruchpotentiale weisen Werte
auf, die im Bereich der RT-Auslagerung liegen.
Der Vergleich der Korrosionsstromdichten in Abbildung 52 d zeigt, dass die Passivierungen
bei Raumtemperatur für 1 und 3 Tage mit Werten unter 1 µ/cm² mit Abstand die niedrigsten
Korrosionsstromdichten aufweisen. Die Auslagerung bei RT für 5 Tage erfährt hingegen
einen deutlichen Anstieg von iKorr. Die Passivierung im Inkubator zeigt einen ähnlichen
Verlauf mit einer deutlichen Zunahme von iKorr nach 5 Tagen Auslagerung, jedoch nehmen
die Korrosionsstromdichten wesentlich höhere Werte als bei der RT-Passivierung an. Die
Zugabe von FCS zum
Medium
verändert den Verlauf
von iKorr. Während die
Korrosionsstromdichte für 1 d auf dem Niveau der Passivierung in DMEM im Inkubator ist,
findet für längere Auslagerungen eine Abnahme von iKorr statt, sodass die Werte für 5 Tage
auf dem Niveau der RT-Passivierung liegen.
Eine Korrelation der Ergebnisse der Elektrochemie mit der Schichtdicke konnte nicht
gefunden werden. Dies liegt vermutlich unter anderem an der Rissbildung, die mit
zunehmender Schichtdicke stärker
ausgeprägt ist. Generell scheinen sowohl die
Morphologie der Schichten, als auch das Ca/P-Verhältnis Haupteinflussfaktoren für die
Korrosionsbeständigkeit zu sein. Der höchste Korrosionsschutz wird durch die Passivierung
bei Raumtemperatur erzielt, für die das Ca/P-Verhältnis die Bildung von HA impliziert. Die
REM-Aufnahmen zeigen außerdem, dass die gebildeten Schichten kompakte Bereiche
aufweisen, die den Ladungs- und Ionenaustausch hemmen und so zu einer Herabsetzung
Ergebnisse und Diskussion
115
der Magnesiumkorrosion führen. Im Inkubator nimmt die Korrosionsneigung von Magnesium
wie bereits erwähnt zu. Die gebildeten Schichten sind durchgehend porös und weisen
wesentlich geringere Ca/P-Verhältnisse als bei der RT-Passivierung auf. Dies führt zu einer
Abnahme
des
Korrosionsschutzes,
wie
die
EIS-Ergebnisse
zeigen.
Die
Korrosionsbeständigkeit wird durch die Zugabe von FCS zum Medium im Inkubator kaum
beeinflusst. Die REM Aufnahmen zeigen eine vergleichsweise deutlich verringerte
Schichtdicke, wobei die Schichten durchgehend hohe Porosität aufweisen. Außerdem sind
die Ca/P-Verhältnisse hier am niedrigsten. Die Proteine im FCS scheinen zwar die Bildung
einer
Schutzschicht aus Calciumphosphatverbindungen durch Anlagerung
Oberfläche oder durch Bindung von Ca
2+
auf
der
im Medium zu hemmen. Jedoch hat die
Proteinadsorption einen schützenden Effekt. Die isolierende Wirkung der Proteine auf der
Oberfläche wird in den Stromdichte-Potential-Kurven deutlich, die im Gegensatz zu DMEM
im Inkubator für die Zugabe von FCS einen Passivbereich zeigen.
116
Ergebnisse und Diskussion
4.5
Kombination DMEM-Passivierung und Linkerbeschichtung
Wie in Kapitel 4.4 gezeigt, stellt die Passivierung in DMEM eine Möglichkeit zur Erhöhung
der Korrosionsbeständigkeit von Magnesium dar. Insbesondere die Auslagerung bei
Raumtemperatur
führt
zu
hohen
Ladungsdurchtrittswiderständen.
Diese
guten
Korrosionseigenschaften sollen im folgenden Kapitel mit der Oberflächenfunktionalisierung
mit den bereits in dieser Arbeit untersuchten Linkermolekülbeschichtungen kombiniert
werden. Hierfür wurden geschliffene Mg-Proben für einen Tag in DMEM bei Raumtemperatur
ausgelagert und anschließend jeweils mit den Linkermolekülen AV, CDI und SA beschichtet.
XPS-Messungen geben Aufschluss über den Erfolg der Beschichtung mit dem jeweiligen
Linkermolekül. Außerdem wurden EIS- und Polarisationsmessungen durchgeführt, um die
Auswirkung der zusätzlichen Linker Beschichtung auf die Korrosionseigenschaften zu
untersuchen.
4.5.1 Oberflächenanalyse
Um
Informationen
Linkermolekülen
über
zu
den
erhalten,
Erfolg
der
wurden
Oberflächenfunktionalisierung
XPS-Messungen
mit
durchgeführt.
den
Die
Atomkonzentrationen einiger zur Auswertung verwendeter Signale sind in Abbildung 53
dargestellt.
Abbildung 53: Ergebnisse der XPS-Analyse der DMEM-Passivierung für einen Tag bei Raumtemperatur
und nach zusätzlicher Beschichtung mit den Linkermolekülen AV, CDI und SA. Aufgetragen sind die
Atomkonzentrationen der C1s-, N1s-, O1s-, Ca2p- und Mg2p-Signale.
Die C1s-Signale wurden für die Auswertung ausgewählt, da alle drei Linkermoleküle
größtenteils aus Kohlenstoff bestehen. Im Vergleich zur reinen DMEM-Passivierung, findet
ein deutlicher Anstieg des C1s-Signals statt, wobei für AV die höchsten Werte erreicht
werden (~49,4 at%), gefolgt von SA (~44,0 at%) und schließlich CDI (~37,2 at%). Ein
weiterer Hinweis für AV und CDI auf der Oberfläche ist der Anstieg des N1s-Signals.
Ergebnisse und Diskussion
117
Verglichen mit der DMEM-Passivierung nimmt das N1s-Signal für alle Linkerbeschichtungen
zu. Während der Anstieg für SA eher gering ist und möglicherweise durch Kontamination
oder durch die darunter liegende Schicht verursacht wird, findet für AV und CDI eine
signifikante Zunahme statt. AV weist mit ca. 9,2 at% die höchsten Werte auf. Die O1s-,
Ca2p-,
P2p-
und
Mg2p-Signale
wurden
ebenfalls
für
die
Dokumentation
des
Beschichtungserfolgs gewählt, da wie in Kapitel 4.4 beschrieben die in DMEM gebildeten
Schichten aus Calciumphosphat Verbindungen bestehen. Bei erfolgreicher Beschichtung mit
den Linkermolekülen erfolgt eine Abschirmung und somit eine Abnahme der Signale der
Calciumphosphat-Schicht. Alle drei Linkermolekülbeschichtungen zeigen eine Abnahme des
O1s-, Ca2p- und des P2p-Signals. Die niedrigsten Werte zeigt die DMEM-Passivierung mit
der zusätzlichen AV-Beschichtung. Die Atomkonzentrationen für Ca2p und P2p liegen unter
1 at% und die Signale werden vom Rauschen überlagert. Diese Ergebnisse bestätigen in
Zusammenhang mit den hohen C1s- und N1s-Signalen die AV-Anbindung an die DMEMpassivierte Oberfläche. Wie bei der AV-Beschichtung von reinem Magnesium (vgl. Kapitel
4.1.1), scheint AV eine dichte Multilage zu bilden. CDI und SA zeigen vergleichsweise hohe
Ca2p und P2p Signale, wobei SA die höchsten Atomkonzentrationen aufweist. Wie auch bei
der Linker Beschichtung von geschliffenem Magnesium kann davon ausgegangen werden,
dass SA keine Monolage mit senkrecht zur Substratoberfläche angeordneten Molekülen
bildet. Jedoch lassen die stärkere Zunahme des C1s-Signals sowie die deutlichere Abnahme
des O1s-, Ca2p-, und P2p-Signals im Vergleich zur DMEM-Passivierung darauf schließen,
dass mehr SA an die Calciumphosphat-Oberfläche gebunden ist als an die Mg(OH)2-Schicht.
Möglicherweise spielen hier die höhere Oberflächenrauigkeit und der höhere Kontaktwinkel
nach der DMEM-Passivierung eine Rolle. Ebenfalls erfolgreich scheint die Beschichtung mit
CDI zu sein. Einzige Auffälligkeit ist hier die deutliche Zunahme des Mg2p-Signals nach CDIAnbindung. Möglicherweise tritt wie in Kapitel 4.1.1 bereits beschrieben ein korrosiver Angriff
der Oberfläche, verbunden mit der Bildung von Mg(OH)2, in der Beschichtungslösung auf.
Denkbar wäre dies in den Rissen der Calciumphosphat-Schicht.
4.5.2 Elektrochemie
Um die Auswirkung der zusätzlichen Linker Beschichtung auf die Korrosion von Magnesium
zu untersuchen, wurden Impedanz Spektren sowie Polarisationskurven in DMEM bei 37°C
aufgezeichnet.
Abbildung 54 zeigt die Ergebnisse der EIS-Messungen der DMEM-Passivierung und der
zusätzlichen Linkermolekülbeschichtungen.
118
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 54: EIS-Ergebnisse der DMEM-Passivierung für einen Tag bei Raumtemperatur und nach
zusätzlicher Beschichtung mit den Linkermolekülen AV, CDI und SA; a) repräsentative Nyquist-Plots; b)
mittlere Ladungsdurchtrittswiderstände mit den zugehörigen Standardabweichungen.
Im Vergleich zur DMEM-Passivierung findet für alle Linkermoleküle eine deutliche Abnahme
des Durchtrittswiderstandes statt, wobei die Reproduzierbarkeit für die Linkerbeschichtungen
zunimmt. Die niedrigste Korrosionsbeständigkeit zeigt die zusätzliche Beschichtung mit AV
(RD ~ 4,4 k*cm²). CDI und SA weisen mit Durchtrittswiderständen um 7,6 bzw. 6,4 k*cm²
etwas bessere Korrosionseigenschaften als AV auf.
Die Ergebnisse der Stromdichte-Potential-Messungen in Abbildung 55 zeigen einen
ähnlichen Trend wie die EIS-Messungen.
Abbildung 55: Ergebnisse der Stromdichte-Potential-Messungen der DMEM-Passivierung und der
zusätzlichen
Linkermolekülbeschichtungen;
Korrosionsstromdichten.
a)
Polarisationskurven;
b)
berechnete
Ergebnisse und Diskussion
119
Generell weisen alle Kurven ähnliche Form auf. Nach Erreichen des Ruhepotentials findet
ein kurzer Anstieg der Stromdichte statt. Es schließt sich ein Bereich an, in dem die
Stromdichte nur sehr langsam steigt, teilweise sogar ein Plateau bildet, bis es schließlich
zum Durchbruch der Passivschicht kommt.
Die DMEM-Passivierung weist insgesamt das positivste Ruhepotential, die niedrigste
Korrosionsstromdichte, sowie die niedrigste Passivstromdichte auf. Zudem ist lediglich für
die DMEM-Passivierung ein Plateau in anodischer Richtung vorhanden. Somit weist die
Vorbehandlung in DMEM ohne weitere Beschichtung die vergleichsweise besten
Korrosionseigenschaften auf. Nach Beschichtung mit den Linkermolekülen findet sowohl
eine Abnahme der Ruhepotentiale, als auch eine Erhöhung der Korrosions- und
Passivstromdichten statt. Die vergleichsweise geringste Korrosionsbeständigkeit zeigt AV.
Obwohl die Anbindung der Linkermoleküle auf der DMEM-passivierten Oberfläche
nachgewiesen
werden
konnte,
zeigt
sich
kein
positiver
Einfluss
der
Oberflächenfunktionalisierung auf die Korrosionsbeständigkeit. Im Gegenteil finden eine
Abnahme
der
Ladungsdurchtrittswiderstände,
sowie
eine
Zunahme
der
Korrosionsstromdichte im Vergleich zur reinen DMEM-Passivierung statt. Möglicherweise
haben die organischen Beschichtungslösungen einen negativen Einfluss auf die während der
DMEM-Passivierung gebildeten Schichten und vermindern somit den Korrosionsschutz der
durch die Calciumphosphatverbindungen auf der Oberfläche gegeben ist.
120
4.6
Ergebnisse und Diskussion
Zellversuche
Für die Zellversuche wurden zwei unterschiedliche Zelllinien verwendet. Zum Einsatz kamen
Endothelzellen (DH1+/+) und Osteosarkomzellen (Mg63), um die Biokompatibilität der
verschiedenen Passivierungen bzw. Beschichtungen auf Magnesium in den zwei
Hauptanwendungsgebieten
der
Implantologie
–
Stents
bzw.
Knochenimplantate
–
abschätzen zu können. Für die Zellversuche wurde zunächst eine Dauer von einem Tag
gewählt, um reines Magnesium, die DMEM- und die NaOH-Passivierung sowie die
Linkermolekülbeschichtungen AV, CDI und SA bezüglich Zelladhäsion und –proliferation zu
untersuchen. Langzeitversuche bis zu 20 Tage wurden mit reinem Mg und der
vielversprechendsten Linkermolekülbeschichtung durchgeführt. Als Referenz wurde für alle
Versuche Tissue-Culture Plastik verwendet, welches in etwa die gleichen Abmessungen
besaß wie die Mg-Proben. Pro Probenart wurden 3 bis 4 Versuchsreihen durchgeführt. Für
die Auswertung wurden jeweils lediglich zwei Versuchsreihen pro Probenart ausgewählt. Auf
jeder Probe wurden fünf repräsentative Bilder aufgenommen, aus denen die Zelldichte sowie
die Zellbedeckung auf der Oberfläche berechnet wurde.
4.6.1 Zelladhäsion und –proliferation nach 1 d Zellkultivierung
In Abbildung 56 sind die Ergebnisse der Zellkultivierung mit Endothelzellen für einen Tag
dargestellt.
Abbildung 56: Ergebnisse der Versuche zur Zelladhäsion und –proliferation von Endothelzellen für 1 d.
Untersucht wurden, neben der DMEM-Vorpassivierung, geschliffenem Mg und der NaOH-Passivierung,
die Linkermolekülbeschichtungen AV, CDI und SA. Als Referenz diente Tissue-Culture Plastik; a)
Zelldichte auf den verschiedenen Proben; b) durchschnittliche, normierte Zellbedeckung der Oberfläche.
Abbildung 56 a zeigt die Zelldichte der beiden Versuchsreihen (ZV1 und ZV2) mit den
zugehörigen Standardfehlern, sowie die aus ZV1 und ZV2 berechnete mittlere Zelldichte
(ZDMittel) auf den verschiedenen Proben. Die Referenz besitzt eine mittlere Zelldichte von
rund 28 Zellen/mm². ZV1 und ZV2 zeigen hier eine deutliche Abweichung voneinander. Der
Standardfehler ist für beide Versuchsreihen relativ gering. Im Vergleich zur Referenz
Ergebnisse und Diskussion
121
befinden sich für geschliffenes Magnesium und für die DMEM-Passivierung weniger Zellen
auf der Oberfläche. Beide Vorbehandlungen weisen eine mittlere Zelldichte von 13-14
Zellen/mm² auf. Während für Magnesium eine deutliche Abweichung von ZV1 und ZV2 zu
beobachten ist, weist die DMEM-Passivierung gute Reproduzierbarkeit auf. Die NaOHPassivierung sowie fast alle Linkerbeschichtungen zeigen im Vergleich zur Referenz einen
Anstieg von ZDMittel. NaOH weist dabei mit ca. 56 Zellen/mm² die höchste mittlere Zelldichte
auf. Jedoch treten hier im Vergleich die größten Schwankungen zwischen ZV1 und ZV2 auf.
AV und CDI liegen im selben Bereich (~ 37-41 Zellen/mm²). Für die SA-Beschichtung sinkt
die Zelldichte auf das Niveau der Referenz. Bei den Linkermolekülbeschichtungen zeigt AV
die beste Reproduzierbarkeit, CDI die schlechteste. Der Standardfehler von ZV2 der CDIBeschichtung zeigt, dass auch auf derselben Probe signifikante Inhomogenitäten auftreten,
die zu relativen hohen Schwankungen der Zellzahl auf der Oberfläche führen.
Neben der Zelldichte, ist die prozentuale Zellbedeckung in Abbildung 56 b dargestellt. Diese
gibt Aufschluss darüber, in welchem Maß die Zellen sich ausbreiten und ist somit ein
Indikator dafür, wie wohl sich die Zellen auf der jeweiligen Oberfläche fühlen. Auch hier sind
die gemittelten Ergebnisse der beiden Versuchsreihen (ZV1 und ZV2) mit den zugehörigen
Standardfehlern, sowie die mittlere Zellbedeckung (ZBMittel), berechnet aus ZV1 und ZV2,
aufgetragen. Die Referenz zeigt mit ca. 5,9 % die höchste mittlere Zellbedeckung. Jedoch ist
hier die größte Abweichung zwischen ZV1 und ZV2 sowie die höchste Schwankung auf einer
Probe (vgl. ZV1) zu beobachten. Wie auch bei der Zelldichte findet für Magnesium und die
DMEM-Passivierung ein deutlicher Rückgang der Zellbedeckung statt, wobei Mg mit 0,6 %
die vergleichsweise geringsten Werte für ZBMittel nach einem Tag aufweist. Bei der NaOHPassivierung findet eine mittlere Zellbedeckung von rund 3,3 % statt. Abgesehen von der
Referenz zeigt AV die höchste Ausbreitung der Zellen auf der Oberfläche (3,9 %). CDI und
SA stehen der AV-Beschichtung mit 1,7 bzw. 1,6 % deutlich nach.
Sowohl für die Zelldichte als auch für die Zellbedeckung weist die Referenz deutliche
Schwankungen auf. Besonders die Zellausbreitung zeigt von Probe zu Probe große
Abweichungen. Zudem liegt die mittlere Zelldichte lediglich im Mittelfeld der untersuchten
Proben, wobei normalerweise davon ausgegangen wird, dass die Referenz optimale
Bedingungen für Zelladhäsion und Proliferation bietet. Dies deutet darauf hin, dass die
Zellversuche selbst ohne korrosionsbedingte Änderung der Oberflächeneigenschaften
Fehlern unterliegen. Mögliche Quellen dabei sind die Handhabung während des Aussäens
der Zellen, sowie während Fixierung und Färbung. Des Weiteren können Fehler in der
Detektion der Zellzahl und der Berechnung der Oberflächenbedeckung mittels des
verwendeten Auswertungsprogrammes auftreten. Ein generelles Problem bei Magnesium ist,
dass teilweise Korrosionsprodukte auf der Oberfläche ebenfalls angefärbt werden, was es
dem Programm erschwert einzelne Zellkerne sowie die Abgrenzung des Zytoskeletts zu
122
Ergebnisse und Diskussion
erkennen. Sowohl bei der Zelldichte, als auch bei der Zellbedeckung der Kultivierung mit
Endothelzellen für einen Tag, weist reines Magnesium die schlechtesten Ergebnisse auf.
Dies wird auf die anfänglich hohe Korrosionsrate von unbehandeltem Magnesium in
Zellkulturmedium und die damit verbundene hohe Wasserstoffentwicklung zurückgeführt.
Sowohl ein Anstieg des Oberflächen-pH-Wertes, als auch die stetige Entstehung von H2Blasen auf der Oberfläche können die Zelladhäsion behindern und stellen keine optimalen
Bedingungen für Zellwachstum und –ausbreitung dar. Um die anfänglich starke Korrosion
von Magnesium zu umgehen, wurden geschliffene Mg-Proben für 3 Tage in dem auch für die
Zellversuche verwendeten Zellkulturmedium (DMEM + 1 % PSG + 20 % FCS) vorpassiviert.
Die Ergebnisse in Abbildung 56 zeigen jedoch kaum eine Zunahme der Zelladhäsion bzw. –
proliferation gegenüber unbehandeltem Mg. Ein Vergleich mit den EIS-Messungen der
Auslagerung in DMEM + 20 % FCS (Kapitel 4.4.2) zeigt, dass durch die Zugabe von FCS
zum Medium eine generelle Abnahme der Korrosionsbeständigkeit stattfindet. Des Weiteren
können weder für 1 d, 3 d noch für 5 d Passivierung in FCS versetztem Medium höhere
Ladungsdurchtrittswiderstände als für geschliffenes Magnesium gefunden werden. Dies
könnte das ebenfalls schlechte Abschneiden der DMEM-Passivierung im Zuge der
Zellversuche erklären. Zudem ist es möglich, dass die relativ hohe Oberflächenrauigkeit, die
durch die Vorpassivierung in Zellkulturmedium entsteht, negative Auswirkungen auf die
Zelladhäsion besitzt. Die NaOH-Passivierung zeigt die höchste mittlere Zelldichte, jedoch ist
die Ausbreitung der Zellen geringer als bei AV und der Referenz. Dies spricht dafür, dass
Zellen zwar relativ gut adhärieren, die sehr hydrophile Oberfläche jedoch die Zellausbreitung
nicht in gleichem Maße begünstigt. Zudem treten bei der NaOH-Passivierung sowohl bei
Zelldichte als auch bei Zellbedeckung hohe Schwankungen auf. Dennoch liegt sowohl ZDMittel
als auch ZBMittel wesentlich höher als bei reinem Magnesium. Ein Grund hierfür könnte die im
Vergleich zu geschliffenem Magnesium reduzierte Wasserstoffentwicklung während der
ersten Stunden sein, die in Kap. 4.1.5 (Abbildung 27) festgestellt wurde. Da die Zelladhäsion
auf der Adsorption von Proteinen an der Oberfläche basiert, ist vor allem das anfängliche
Korrosionsverhalten entscheidend [38, 63]. Während alle drei Linkermolekülbeschichtungen
niedrigere mittlere Zelldichten als die NaOH-Passivierung aufweisen, zeigt AV die höchste
Zellbedeckung
abgesehen
von
der
Referenz.
Bei
erneuter
Betrachtung
der
Wasserstoffentwicklung (Kapitel 4.1.5, Abbildung 28) zeigt sich, dass NaOH und AV
während der ersten Stunde eine ähnliche H2-Rate aufweisen. Erst zwischen 3 h und 24 h
kann für AV eine deutlich reduzierte Wasserstoffentwicklung verzeichnet werden. Auffällig
sind die hohen Fehler, die sowohl für die H2-Messungen als auch für die Zellversuche auf
NaOH-passivierten
Oberflächen
Reproduzierbarkeit hinweisen.
auftreten,
welche
auf
eine
generell
geringe
Ergebnisse und Diskussion
123
Die starke Abnahme von ZBMittel gegenüber AV sowie die hohen Schwankungen der CDIBeschichtung bezüglich der Zelldichte korrelieren ebenfalls mit den Ergebnissen der H2Messungen. CDI weist die höchste anfängliche H2-Entwicklungsrate auf (vgl. Kap. 4.1.5,
Abbildung 28). Vor allem bei längeren Auslagerungszeiten in DMEM treten deutliche
Standardabweichungen auf. Wie bereits erwähnt, wird bei CDI davon ausgegangen, dass die
geringe Reproduzierbarkeit auf Inhomogenitäten zurückzuführen ist, die während des
Beschichtungsprozesses entstehen. Ebenfalls gezeigt wurde eine vergleichsweise hohe und
ungleichmäßige Oberflächenrauigkeit nach CDI-Beschichtung (vgl. Abbildung 19). Neben der
hohen Wasserstoffentwicklung ist dies ein weiterer Grund für die geringe Bedeckung der
Oberfläche mit Zellen.
SA besitzt sowohl für die Zelldichte, als auch für die Zellbedeckung die niedrigsten Werte
aller Linkermolekülbeschichtungen. Hier ist eine Korrelation mit den Ergebnissen der
Wasserstoffentwicklung nicht gegeben, da SA die geringste anfängliche H2-Rate aller
untersuchten Proben aufweist. Jedoch zeigt SA hier die größte Standardabweichung.
Dennoch fällt vor allem die Zellausbreitung geringer als erwartet aus.
Die Ergebnisse nach einem Tag Zellkultivierung mit Osteosarkomzellen sind in Abbildung 57
dargestellt.
Abbildung 57: Ergebnisse der Versuche zur Zelladhäsion und –proliferation von Osteosarkomzellen für
1 d. Untersucht wurden, neben der geschliffenem Mg, der DMEM- und der NaOH-Passivierung, die
Linkermolekülbeschichtungen AV, CDI und SA. Als Referenz diente Tissue-Culture Plastik; a) Zelldichte
auf den verschiedenen Proben; b) durchschnittliche, normierte Zellbedeckung der Oberfläche.
Abbildung 57 a zeigt die Zelldichten der verschiedenen untersuchten Proben. Die Referenz
weist mit rund 110,5 Zellen/mm² die höchste mittlere Zelldichte auf. Für Magnesium und die
DMEM-Vorpassivierung ergibt sich der gleiche Trend wie bei der Kultivierung mit
Endothelzellen. Beide Proben erfahren eine deutliche Abnahme der mittleren Zelldichte und
liegen in etwa auf einem Niveau (23,7 Zellen/mm² bzw. 17,6 Zellen/mm²). Ebenfalls ähnlich
wie bei den Endothelzellen ist der Anstieg von ZDMittel für die NaOH-Passivierung sowie für
die drei Linkerbeschichtungen. NaOH, AV und SA liegen dabei alle im Bereich zwischen 47
124
Ergebnisse und Diskussion
und 53 Zellen/mm². Lediglich CDI zeigt eine deutlich geringere mittlere Zelldichte
(25,8 Zellen/mm²). Die Zellbedeckung (Abbildung 57 b) folgt dem Trend der Zelldichte. Die
Referenz weist die höchste mittlere Zellbedeckung auf (~9,0 %), während Magnesium und
die DMEM-Passivierung mit 1,6 % bzw. 1,2 % die geringsten Werte annehmen. Die NaOHPassivierung sowie die Linkermolekülbeschichtungen liegen im mittleren Bereich. Im
Gegensatz zur Zelldichte ist die Variation der mittleren Zellbedeckung hier für alle
Beschichtungen relativ gering. CDI weist zwar immer noch die geringsten Werte für ZB Mittel
auf, jedoch liegen diese nur knapp unterhalb von AV und NaOH, welche eine mittlere
Zellbedeckung von 2,9 % bzw. 3,1 % zeigen. Die höchste Zellbedeckung wird auf der SABeschichtung erreicht, welche mit ca. 3,9 % jedoch nur unwesentlich höher liegt als bei AV
und NaOH. Die Schwankungen auf den einzelnen Proben sowie zwischen den beiden
Versuchsreihen sind bei Zelldichte und Zellbedeckung ähnlich ausgeprägt. Die größten
Abweichungen sind für die Referenz zu verzeichnen, die geringsten treten für Magnesium
und die DMEM-Passivierung auf. Die Schwankungen für die NaOH-Passivierung sowie für
die Linkerbeschichtungen liegen in einem engen Bereich.
Die Referenz zeigt bei der Kultivierung mit Osteosarkomzellen zwar sowohl für die Zelldichte
als auch für die Zellbedeckung die höchsten Mittelwerte. Jedoch sind hier ebenfalls sehr
große Abweichungen zu verzeichnen. Wie bei den 1 d Versuchen mit Endothelzellen weisen
diese Ergebnisse auf Fehlerquellen bei der Durchführung der Zellversuche sowie deren
Auswertung hin. Abgesehen von der mittleren Zelldichte der Referenz zeigen alle Proben für
beide Zelllinien einen überwiegend übereinstimmenden Trend. Ein signifikanter Unterschied
zwischen Osteosarkom- und Endothelzellen besteht bei der SA-Beschichtung. Während für
die Endothelzellen eine unerwartet geringe Zelladhäsion und –ausbreitung gefunden wurde,
zeigen die Osteosarkomzellen hier Werte für ZDMittel und ZBMittel, die im Bereich von NaOH
und AV liegen. Bei der Interpretation der Kultivierung mit Endothelzellen für einen Tag
konnte
für
alle
Proben
außer
SA
eine
Korrelation
der
Ergebnisse
mit
der
Wasserstoffentwicklung gefunden werden. Der Erfolg der Adhäsion und Proliferation der
Osteosarkomzellen auf den unterschiedlichen Oberflächen korreliert ebenfalls mit der
jeweiligen Wasserstofffreisetzung. Im Gegensatz zu den Endothelzellen folgen auch die
Ergebnisse auf SA-beschichtetem Magnesium dieser Korrelation. Wie in Abbildung 28
(Kapitel 4.1.5) gezeigt, kann für SA die geringste anfängliche H2-Rate verzeichnet werden.
Ein Vergleich der 1 d Versuche beider Zelllinien zeigt lediglich für die Referenz große
Unterschiede. Dies lässt darauf schließen, dass Endothel- und Osteosarkomzellen nach
einem Tag in gleichem Maße auf den verschieden behandelten Magnesiumoberflächen
adhärieren und sich ausbreiten können.
Ergebnisse und Diskussion
125
4.6.2 Zeitreihe – Endothelzellen
Für die Langzeitversuche mit Endothelzellen wurde die AV-Beschichtung ausgewählt. Zwar
zeigen sowohl CDI als auch die NaOH-Passivierung höhere mittlere Zelldichten nach einem
Tag, jedoch ist die Zellbedeckung auf den AV-Proben am höchsten. Auch die gute
Reproduzierbarkeit für AV führte zur Einschätzung, dass es sich hierbei um eine
vielversprechende Beschichtung für weitere Zellversuche handelt. Des Weiteren wurde
geschliffenes Magnesium für die weiterführenden Versuche gewählt, um eine mögliche
Verbesserung der Zelladhäsion und –proliferation durch die AV-Beschichtung klar
herauszustellen. Als Referenz diente wie bei den 1 d Versuchen Tissue-Culture Plastik.
Die Ergebnisse der Kultivierung der Referenz-Proben mit Endothelzellen für 20 Tage sind in
Abbildung 58 aufgetragen.
Abbildung 58: Ergebnisse der Zellkultivierung der Referenz mit Endothelzellen (DH1+/+) über 20 Tage.
Zellen wurden für jeweils 1, 5, 10, 15 und 20 d ausgesät. Für jede Probenart sind zwei Versuchsreihen mit
dem zugehörigen Standardfehler aufgetragen (ZV1 und ZV2). Die mittlere Zelldichte (ZD Mittel) bzw. die
mittlere Zellbedeckung (ZBMittel) wurde jeweils aus den beiden Mittelwerten ZV1 und ZV2 berechnet; a)
Zelldichte; b) durchschnittliche normierte Zellbedeckung
Innerhalb der ersten 5 Tage findet sowohl ein Anstieg der Zelldichte, als auch der
Zellbedeckung statt. Zwar ist die Zellzahl mit 300 Zellen/mm² nicht sehr hoch, jedoch ist die
Oberfläche bereits zu ca. 90% bedeckt. Für längere Kultivierungszeiten findet kaum eine
Änderung der Zelldichte statt. Die Zellbedeckung sinkt zunächst bis 15 Tage auf etwa 74 %,
während für 20 Tage wieder das Niveau der 5 Tage Kultivierung erreicht wird. Die
Ergebnisse zeigen, dass generell ein relativ stabiles Wachstum von Endothelzellen über 20
Tage möglich ist.
Die Zelldichte sowie die Zellbedeckung für die Kultivierung von Endothelzellen auf
geschliffenem Magnesium sind in Abbildung 59 dargestellt.
126
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 59: Ergebnisse der Zellkultivierung auf geschliffenem Magnesium mit Endothelzellen (DH1+/+)
über 20 Tage. Zellen wurden für jeweils 1, 5, 10, 15 und 20 d ausgesät. Für jede Probenart sind zwei
Versuchsreihen mit dem zugehörigen Standardfehler aufgetragen (ZV1 und ZV2). Die mittlere Zelldichte
(ZDMittel) bzw. die mittlere Zellbedeckung (ZBMittel) wurde jeweils aus den beiden Mittelwerten ZV1 und ZV2
berechnet; a) Zelldichte; b) durchschnittliche normierte Zellbedeckung
Im Vergleich zur Referenz findet für Magnesium ein langsamer Anstieg der Zelldichte sowie
der Zellbedeckung statt. Bis 10 Tage werden lediglich rund 100 Zellen/mm² gezählt, welche
die Oberfläche zu ca. 25 % bedecken. Für 15 Tage ergibt sich eine etwas stärkere Zunahme
von Zelldichte und Zellbedeckung, für ZDMittel sowie ZBMittel wird jeweils ein Maximum erreicht.
Mit ca. 500 Zellen/mm² übersteigt Magnesium die Referenz bezüglich der Zelldichte. Die
durchschnittliche Bedeckung der Oberfläche ist mit maximal 66 % jedoch deutlich geringer
als auf der Referenz. Die Ergebnisse zeigen, dass auf Magnesium ebenfalls Zellwachstum
über mehrere Tage bis Wochen möglich ist. Im Vergleich zur Referenz ist jedoch das
Wachstum von Endothelzellen reduziert. Auch scheint die Biokompatibilität für reines
Magnesium geringer zu sein als für die Referenz, da die Zellen sich wesentlich schwächer
auf der Oberfläche ausbreiten.
Für die AV-Beschichtung (Abbildung 60) findet innerhalb der ersten 10 Tage ein nahezu
linearer Anstieg der Zelldichte sowie der Zellbedeckung statt. Sowohl für ZD Mittel, als auch für
ZBMittel
werden hier
Maximalwerte erreicht (400 Zellen/mm², 77 %). Für längere
Kultivierungszeiten findet ein Rückgang für beide Werte statt. Im Vergleich zu geschliffenem
Magnesium ist das Zellwachstum für AV in den ersten 10 Tagen stärker ausgeprägt.
Außerdem liegt die maximal erreichte Bedeckung der Oberfläche mit Zellen ca. 10 % höher
als bei reinem Magnesium. Der Trend der 1 Tages Versuche setzt sich auch bei den
Langzeitversuchen fort. Durch die Beschichtung mit AV kann die Zelladhäsion sowie die die
Zellausbreitung auch für längere Kultivierungszeiten gefördert werden.
Ergebnisse und Diskussion
127
Abbildung 60: Ergebnisse der Zellkultivierung auf AV beschichtetem Magnesium mit Endothelzellen
(DH1+/+) über 20 Tage. Zellen wurden für jeweils 1, 5, 10, 15 und 20 d ausgesät. Für jede Probenart sind
zwei Versuchsreihen mit dem zugehörigen Standardfehler aufgetragen (ZV1 und ZV2). Die mittlere
Zelldichte (ZDMittel) bzw. die mittlere Zellbedeckung (ZBMittel) wurde jeweils aus den beiden Mittelwerten
ZV1 und ZV2 berechnet; a) Zelldichte; b) durchschnittliche normierte Zellbedeckung
4.6.3 Zeitreihe – Osteosarkomzellen
Für die Osteosarkomzellen wurde neben reinem Magnesium ebenfalls wie bei den
Endothelzellen AV für die Langzeitversuche ausgewählt. Zwar zeigt SA in den 1 d Versuchen
geringfügig bessere Ergebnisse als AV, jedoch werden die Unterschiede nicht als signifikant
erachtet. Zudem ist so ein besserer Vergleich der Zeitreihen zwischen den beiden Zelllinien
möglich. Auch für die Zeitreihe mit den Osteosarkomzellen wurde außerdem lediglich
geschliffenes Magnesium und Tissue-Culture Plastik als Referenz verwendet.
Die Ergebnisse der Zellkultivierung mit Osteosarkomzellen der Referenzproben sind in
Abbildung 61 dargestellt.
128
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 61: Ergebnisse der Zellkultivierung der Referenz mit Osteosarkomzellen (Mg63) über 20 Tage.
Zellen wurden für jeweils 1, 5, 10, 15 und 20 d ausgesät. Für jede Probenart sind zwei Versuchsreihen mit
dem zugehörigen Standardfehler aufgetragen (ZV1 und ZV2). Die mittlere Zelldichte (ZDMittel) bzw. die
mittlere Zellbedeckung (ZBMittel) wurde jeweils aus den beiden Mittelwerten ZV1 und ZV2 berechnet; a)
Zelldichte; b) durchschnittliche normierte Zellbedeckung
Sowohl für die Zelldichte, als auch für die Zellbedeckung der Oberfläche findet innerhalb der
ersten 5 Tage ein starker Anstieg statt. Bis 10 Tage erfolgt eine weitere leichte Zunahme der
Zelldichte und der Zellausbreitung. Die durchschnittliche Zellbedeckung beträgt ca. 97 %,
wobei sich ca. 1500 Zellen/mm² auf der Oberfläche befinden. Während die Zellbedeckung für
längere Kultivierungszeiten kaum variiert (97-99 %), treten für die Zelldichte einige
Schwankungen auf. Diese werden jedoch wahrscheinlich durch Schwachstellen des
Auswertungsprogrammes verursacht. Bei nahezu vollständiger Bedeckung der Oberfläche
kann es zu einer Überlappung einzelner Zellen kommen, die so nicht vom Programm
detektiert werden können. Denkbar ist auch, dass sich weniger Zellen auf der Oberfläche
befinden, die sich allerdings stärker ausbreiten.
Generell zeigen die Ergebnisse, dass bis 5 Tage starkes Zellwachstum auf der Oberfläche
der Referenz stattfindet. Eine nahezu komplette Bedeckung der Oberfläche mit Zellen wird
nach 10 Tagen Zellkultivierung erreicht.
Für die Kultivierung von reinem Magnesium mit Osteosarkomzellen sind die Ergebnisse in
Abbildung 62 gezeigt.
Ergebnisse und Diskussion
129
Abbildung 62: Ergebnisse der Zellkultivierung auf geschliffenem Magnesium mit Osteosarkomzellen
(Mg63) über 20 Tage. Zellen wurden für jeweils 1, 5, 10, 15 und 20 d ausgesät. Für jede Probenart sind
zwei Versuchsreihen mit dem zugehörigen Standardfehler aufgetragen (ZV1 und ZV2). Die mittlere
Zelldichte (ZDMittel) bzw. die mittlere Zellbedeckung (ZBMittel) wurde jeweils aus den beiden Mittelwerten
ZV1 und ZV2 berechnet; a) Zelldichte; b) durchschnittliche normierte Zellbedeckung
Wie bei der Referenz findet innerhalb der ersten 10 Tage ein Anstieg der Zelldichte sowie
der Oberflächenbedeckung statt, wobei für 5 Tage hohe Schwankungen auftreten. Sowohl
die Zelldichte, als auch die Zellbedeckung weisen nach 10 Tagen etwas niedrigere Werte im
Vergleich
zur
Referenz
auf
(ZDMittel ~1000/mm²;
ZBMittel ~ 86 %).
Für
längere
Kultivierungszeiten treten bei Mg sowohl für ZDMittel, als auch für ZBMittel Schwankungen auf.
Auch die Abweichungen auf den einzelnen Proben steigen, vor allem bei der Zellbedeckung.
Generell können Osteosarkomzellen auf geschliffenem Magnesium anwachsen, sich
vermehren und für mehrere Tage bzw. Wochen überleben. Jedoch wird auch für längere
Kultivierungszeiten keine vollständige Oberflächenbedeckung erreicht. Die Abnahme der
Zelldichte für 15 und 20 Tage Kultivierung und die hier auftretenden Schwankungen in der
Zellbedeckung weisen auf ein nicht stabiles Zellwachstum über längere Zeit hin.
Die Beschichtung von Magnesium mit AV zeigt während der ersten 10 Tage ein ähnliches
Verhalten wie reines Magnesium und die Referenz (siehe Abbildung 63).
130
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 63: Ergebnisse der Zellkultivierung auf AV beschichtetem Magnesium mit Osteosarkomzellen
(Mg63) über 20 Tage. Zellen wurden für jeweils 1, 5, 10, 15 und 20 d ausgesät. Für jede Probenart sind
zwei Versuchsreihen mit dem zugehörigen Standardfehler aufgetragen (ZV1 und ZV2). Die mittlere
Zelldichte (ZDMittel) bzw. die mittlere Zellbedeckung (ZBMittel) wurde jeweils aus den beiden Mittelwerten
ZV1 und ZV2 berechnet; a) Zelldichte; b) durchschnittliche normierte Zellbedeckung
Die Werte für ZDMittel steigen bis 10 Tage auf etwa 900 Zellen/mm², die Werte für ZBMittel auf
etwa 73 %. Damit liegt sowohl die Zelldichte, als auch die Bedeckung der Oberfläche leicht
unterhalb von reinem Magnesium. Jedoch treten für längere Kultivierungszeiten nur kleine
Schwankungen von ZDMittel und ZBMittel auf. Die Zellbedeckung erfährt sogar einen weiteren
leichten Anstieg bis auf 86 %.
Auch für AV ist Zellwachstum über längere Zeit möglich, jedoch kann durch die zusätzliche
Beschichtung von Magnesium mit dem Linkermolekül keine signifikante Verbesserung erzielt
werden. Zellzahl sowie Bedeckung der Oberfläche liegen bei AV im Bereich von reinem
Magnesium. Ein positiver Effekt der Beschichtung ist jedoch die vergleichsweise höhere
Langzeitstabilität.
Ein Vergleich der Zeitreihen beider Zelllinien zeigt eine generell höhere Zelldichte für die
Osteosarkomzellen als für die Endothelzellen. Außerdem ist eine nahezu vollständige
Oberflächenbedeckung mit Osteosarkomzellen möglich, während auch die Referenz lediglich
maximal zu 90 % im Fall der Endothelzellen bedeckt ist. Dies lässt vermuten, dass beide
Zelllinien generell unterschiedliches Adhäsions- und Proliferationsverhalten besitzen. Es wird
berichtet, dass vor allem die Topographie der Implantatoberfläche unterschiedliche
Auswirkungen auf das Anbindungsverhalten von Endothelzellen und Osteoblasten hat [130,
131].
Ergebnisse und Diskussion
131
4.6.4 Einfluss des Zellwachstums auf das Korrosionsverhalten von Mg
Wie in den Kapiteln 4.6.1 bis 4.6.3 gezeigt werden konnte, findet auf allen untersuchten
Proben vor allem in den ersten fünf bis zehn Tagen ein starker Anstieg der Zelladhäsion und
Zellausbreitung statt. Um den Einfluss des Zellwachstums auf die Magnesiumkorrosion zu
untersuchen, wurden EIS-Messsungen nach 1, 3 und 5 d Zellkultivierung mit Endothel- bzw.
Osteosarkomzellen durchgeführt. Für diese Versuchsreihe wurde die AV-Beschichtung
ausgewählt, da diese im Vergleich zu unbeschichtetem Magnesium höhere Zellbedeckung
sowie geringere Schwankungen aufweist. Als Referenz wurde AV beschichtetes Magnesium
in DMEM + 20 % FCS ohne Zellen für 1, 3 und 5 Tage ausgelagert. Für alle Proben wurde
nach jeweils 2 Tagen ein Mediumwechsel vorgenommen. Nach der jeweiligen Auslagerungs/Kultivierungszeit wurde zunächst für 15 min das OCP und anschließend Impdanzspektren
aufgezeichnet. Die Messungen wurden in 100ml DMEM bei 37°C durchgeführt. Der
Frequenzbereich wurde auf 100 kHz – 100 mHz herabgesetzt, um die Messungen zu
verkürzen und so dem Absterben der Zellen während der EIS entgegenzuwirken. Alle
übrigen Parameter wurden von vorherigen Messungen übernommen.
Abbildung 64 zeigt die Ergebnisse der Impedanzspektroskopie der Referenzproben und
nach Zellkultivierung mit Endothel- bzw. Osteosarkomzellen.
132
Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 64: Ergebnisse der EIS-Messungen für 1, 3 und 5 d Zellkultivierung auf AV-beschichteten MgProben; a) repräsentative Nyquist-Plots der Referenzproben ohne Zellen; b) repräsentative Nyquist-Plots
der Kultivierung mit Endothelzellen (DH1+/+); c) repräsentative Nyquist-Plots der Kultivierung mit
Osteosarkomzellen (Mg63); d) mittlere Ladungsdurchtrittswiderstände der Referenzproben sowie beider
Zellkultivierungen mit den zugehörigen Standardabweichungen.
Wie bei allen vorherigen Auslagerungen bzw. Messungen von Magnesium in DMEM, weisen
die Nyquist-Plots zwei Halbkreise auf, wobei der zweite wesentlich größer ist als der erste
bei hohen Frequenzen. Zudem ist der zweite Halbkreis fast durchgängig sehr flach, wie
bereits für die DMEM-Passivierungen im Inkubator beschrieben. Der Vergleich der
Ladungsdurchtrittswiderstände in Abbildung 64 d zeigt, dass für die ersten 3 Tage nur eine
geringe Variation zwischen Referenz und Kultivierung mit Endothel- und Osteosarkomzellen
stattfindet. Erst nach 5 Tagen zeigen sich deutliche Unterschiede der verschiedenen Proben.
Während für die Referenz die Ladungsdurchtrittswiderstände deutlich bis auf Werte
unterhalb der Auslagerung für 1 d zurückgehen, steigt RD für die Proben mit Endothel- und
Osteosarkomzellen
weiter
an.
Die
beste
Korrosionsbeständigkeit
weisen
die
mit
Osteosarkomzellen besiedelten Proben auf (RD ~ 13 k*cm²). Wie in den Zeitreihen (Kapitel
4.6.2 und 4.6.3) gezeigt wurde, ist die Oberflächenbedeckung der Osteosarkomzellen
deutlich höher als die der Endothelzellen. Die Korrosionsbeständigkeit korreliert mit der
Ergebnisse und Diskussion
133
Oberflächenbedeckung mit Zellen. Die EIS-Ergebnisse bestätigen somit den positiven
Einfluss der Zelladhäsion auf die Magnesiumkorrosion.
134
4.7
Ergebnisse und Diskussion
Einfluss von Elektrolyt, Temperatur und Elektrolytbewegung
auf die Mg-Korrosion
In dieser Arbeit wurden verschiedene Elektrolyte für die elektrochemische Analyse von
Magnesium
verwendet.
Die
anfängliche
Charakterisierung
der
Linker-
und
Proteinbeschichtungen wurde in SBF bei Raumtemperatur vorgenommen. Um die
Messparameter den physiologischen Bedingungen anzugleichen wurde für weitere Versuche
DMEM als Elektrolyt verwendet und die Messungen bei 37°C durchgeführt. Im folgenden
Kapitel soll der Einfluss der verschiedenen Messparameter auf die Magnesiumkorrosion
herausgestellt werden. Außerdem werden elektrochemische Messungen in einer Flusszelle
durchgeführt. Diese können z.B. den Blutfluss simulieren und führen so zu einer weiteren
Annäherung der Messparameter an die physiologischen Bedingungen.
4.7.1 Einfluss von Elektrolyt und Temperatur auf die Mg-Korrosion
Zunächst wurde mittels elektrochemischer Messung der Einfluss des verwendeten
Elektrolyten und der Temperatur auf die Magnesiumkorrosion untersucht. Nachdem das
Ruhepotential für 30 min aufgezeichnet wurde, wurden Impedanzspektren und anschließend
Polarisationskurven gemessen. Im Anschluss an die Elektrochemie wurden die Proben
mittels REM und XPS oberflächenanalytisch untersucht.
Elektrochemie
Zunächst wurde der Einfluss der Temperatur bei der Verwendung von SBF als Elektrolyt
untersucht. Die Ergebnisse der EIS-Messungen in SBF bei Raumtemperatur und bei 37°C
sind in Abbildung 65 dargestellt.
Abbildung 65: Ergebnisse der EIS-Messungen von geschliffenem Magnesium gemessen in SBF bei
Raumtemperatur (RT) und bei Körpertemperatur (37°C); a) repräsentative Nyquist-Plots; b) berechnete
mittlere Durchtrittswiderstände RD mit den zugehörigen Standardabweichungen.
Ergebnisse und Diskussion
135
Wie bereits in Kapitel 4.1.4 beschrieben wurde, weisen die Nyquist-Plots der in SBF
gemessenen Mg-Proben zwei Halbkreise auf, die darauf hinweisen, dass sich auf der
Oberfläche eine poröse Schicht befindet bzw. in SBF gebildet wird. Der erste Halbkreis bei
hohen Frequenzen besitzt einen größeren Durchmesser verglichen mit dem Zweiten bei
mittleren Frequenzen. Bei niedrigen Frequenzen treten Induktivitäten auf, die durch
Magnesiumauflösung unter der gebildeten Schicht verursacht werden. Diese Kurvenform ist
sowohl für die Messungen bei Raumtemperatur als auch bei 37°C zu finden. Dies zeigt, dass
die
Temperaturerhöhung
nicht
zu
einer
grundlegenden
Veränderung
des
Korrosionsverhaltens von Magnesium in SBF führt. Auch kann kein großer Unterschied der
Ladungsdurchtrittswiderstände beobachtet werden. Im Vergleich zu den Messungen bei
Raumtemperatur findet für 37°C ein leichter Anstieg des Ladungsdurchtrittswiderstandes
statt. Zwar wird angenommen, dass die Reaktionskinetik mit Erhöhung der Temperatur
zunimmt, was zu einer beschleunigten Korrosion führen könnte. Ein weiterer Einflussfaktor
bei der Magnesiumkorrosion ist jedoch die CO2-Konzentration in der Umgebung. So führt
eine Zunahme der CO2-Konzentation zur Herabsetzung der Korrosionsbeständigkeit von
Magnesium [132]. Mit Erhöhung der Temperatur des Elektrolyten nimmt allerdings die CO2Löslichkeit ab [133]. Dies erklärt die leichte Steigerung von RD bei den EIS-Messungen in
SBF bei 37°C. Jedoch sinkt die Reproduzierbarkeit mit Erhöhung der Temperatur.
Neben den Messungen in SBF wurden Impedanzspektren in DMEM ebenfalls bei
Raumtemperatur und bei 37°C aufgezeichnet. Abbildung 66 zeigt die zugehörigen NyquistPlots (a) und die mittleren Ladungsdurchtrittswiderstände (b).
Abbildung 66: Ergebnisse der EIS-Messungen von geschliffenem Magnesium gemessen in SBF bei
Raumtemperatur (RT) und bei Körpertemperatur (37°C); a) repräsentative Nyquist-Plots; b) berechnete
mittlere Durchtrittswiderstände RD mit den zugehörigen Standardabweichungen.
Die Nyquist-Plots der Messungen in DMEM bei Raumtemperatur sowie bei 37°C weisen
ähnliche Form auf, die sich jedoch von der Kurvenform der Messungen in SBF
136
Ergebnisse und Diskussion
unterscheidet. Zwar treten hier ebenfalls zwei Halbkreise auf, jedoch besitzt der Erste einen
wesentlich geringeren Durchmesser als der Zweite, so dass der Halbkreis bei hohen
Frequenzen im vollständigen Diagramm kaum zu erkennen ist. Ein weiterer Unterschied zu
den Nyquist-Plots der SBF-Messungen ist die starke Überschneidung der beiden Halbkreise.
Außerdem tritt im Anfangsbereich des zweiten Halbkreises bei mittleren Frequenzen ein
linearer Anstieg mit einem Winkel von ungefähr 45° auf. Dies deutet auf eine
Diffusionsschicht hin [88]. Die Ladungsdurchtrittswiderstände liegen für die Messungen in
DMEM bei Raumtemperatur und bei 37°C im selben Bereich. Im Vergleich zu SBF werden
RD-Werte erzielt, die über das Zehnfache höher liegen. Auch bei DMEM sind für die
Messungen bei Raumtemperatur geringere Schwankungen als bei 37°C zu beobachten. Es
wird angenommen, dass sich in DMEM ebenfalls eine teilweise poröse Schicht auf der
Oberfläche bildet, die jedoch besseren Korrosionsschutz bildet als die in SBF gebildeten
Schichten.
Die Ergebnisse der Polarisationsmessungen von Magnesium in SBF und DMEM bei
Raumtemperatur und bei 37°C sind in Abbildung 67 dargestellt.
Abbildung 67: Ergebnisse der Stromdichte-Potential-Messungen in SBF und DMEM bei Raumtemperatur
und bei 37°C; a) repräsentative Polarisationskurven; b) berechnete Korrosionsstromdichten iKorr.
Auch hier zeigt der Verlauf der Stromdichte-Potential-Kurven deutliche Unterschiede für die
Messungen in SBF und in DMEM. In SBF wird im anodischen Bereich durchgehend aktive
Auflösung beobachtet, während in DMEM eine leichte Passivierung erreicht wird. Zudem ist
das Ruhepotential für die Messungen in DMEM zu positiveren Werten hin verschoben. Die
Korrosionsstromdichten in Abbildung 67 b zeigen, dass in DMEM eine deutliche Zunahme
der
Korrosionsbeständigkeit
erfolgt.
Mit
Werten
von
100-140 µA/cm²
liegen
die
Korrosionsstromdichten in SBF um das ca. 5-Fache höher als in DMEM. Die
Temperaturerhöhung hat lediglich einen geringen Einfluss auf die Korrosionsbeständigkeit im
untersuchten Bereich. Sowohl in SBF als auch in DMEM zeigt sich eine leichte Abnahme von
Ergebnisse und Diskussion
137
iKorr für 37°C. Wie bereits bei den EIS-Messungen beschrieben, ist die mit der
Temperaturerhöhung einhergehende Abnahme der CO2-Konzentration im Elektrolyt eine
mögliche Ursache hierfür.
Die Ergebnisse der Elektrochemie zeigen, dass die Temperaturänderung im untersuchten
Bereich kaum einen Effekt auf die Magnesiumkorrosion hat, wohingegen der Elektrolyt
großen Einfluss besitzt. Es scheint sich nicht nur die Korrosionsbeständigkeit bei der
Verwendung von DMEM zu erhöhen, sondern auch der Korrosionsmechanismus zu ändern,
was die unterschiedliche Kurvenform im Nyquist-Plot und bei den Polarisationsmessungen
vermuten lässt.
Oberflächenanalyse
Anschließend an die Elektrochemie wurden von den Proben zunächst makroskopische
Aufnahmen
gemacht.
Die
Oberflächencharakterisierung
fand
mittels
Rasterelektronenmikroskop und XPS statt. Die Makroskop-Aufnahmen der verschiedenen
Messparameter sind in Abbildung 68 dargestellt.
Abbildung 68: Makroskop-Aufnahmen nach den elektrochemischen Messungen mit den verschiedenen
Parametern. Die runde Messfläche besitzt einen Durchmesser von 1 cm; a) nach Elektrochemie in SBF bei
138
Ergebnisse und Diskussion
Raumtemperatur; b) nach Elektrochemie in DMEM bei Raumtemperatur; c) nach Elektrochemie in SBF bei
37°C; d) nach Elektrochemie in DMEM bei 37°C.
Bereits ohne mikroskopische Vergrößerung zeigen die in SBF und in DMEM korrodierten
Proben ein unterschiedliches Erscheinungsbild. Während sich bei den elektrochemischen
Messungen in SBF eine relativ helle Schicht mit dunkleren Bereichen bildet, entsteht in
DMEM eine verhältnismäßig homogene dunkle Schicht. In SBF scheint lokale Korrosion eine
größere Rolle zu spielen als in DMEM. Auch entsteht der Eindruck, dass die Oberfläche
nach den Messungen in SBF eine höhere Rauigkeit aufweist als nach den Messungen in
DMEM. Die Temperaturerhöhung scheint bei beiden Elektrolyten zu einer kompakteren
Schichtbildung zu führen.
Abbildung 69 zeigt die REM Aufnahmen nach den elektrochemischen Messungen in SBF
und DMEM bei den beiden verschiedenen Temperaturen.
Abbildung 69: REM Aufnahmen nach den elektrochemischen Messungen mit den verschiedenen
Parametern; a) REM Aufnahme nach Elektrochemie in SBF bei Raumtemperatur; b) REM Aufnahme nach
Elektrochemie in DMEM bei Raumtemperatur; c) REM Aufnahme nach Elektrochemie in SBF bei 37°C; d)
REM Aufnahme nach Elektrochemie in DMEM bei 37°C.
Wie bereits bei den makroskopischen Aufnahmen zu sehen, unterscheiden sich die
Oberflächen auch in ihrer Mikrostruktur sehr deutlich nach den elektrochemischen
Messungen in SBF und DMEM. Die in SBF gemessen Proben weisen eine ausgeprägte
Ergebnisse und Diskussion
139
schollenartige Struktur auf. Eine Schicht hat sich zwar auf der Oberfläche abgelagert, jedoch
weist sie starke Rissbildung auf. Im Vergleich dazu scheinen die in DMEM gebildeten
Schichten wesentlich homogener zu sein. Zwar ist auch hier die Oberfläche von Rissen
durchzogen, die jedoch nicht die Ausmaße wie bei SBF annehmen. Die Erhöhung der
Temperatur zeigt bei beiden Elektrolyten wie erwartet kaum einen Einfluss auf die
Mikrostruktur.
4.7.2 Einfluss der Elektrolytbewegung auf die Mg-Korrosion
Um
neben
der
Wahl
des
Elektrolyten
und
der
Temperatur
den
Einfluss
der
Elektrolytbewegung zu untersuchen, wurden Messungen in einer elektrochemischen
Durchflusszelle durchgeführt. Die Elektrodenanordnung war die gleiche wie bei den
statischen Messungen. Mittels einer Pumpe wurde während der Messung ein Elektrolytfluss
erzeugt, wobei zwei unterschiedliche Fließgeschwindigkeiten untersucht wurden. Die
Messungen wurden in DMEM bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschließend an die
Elektrochemie
wurden
auch
hier
die
Probenoberflächen
mittels
REM
und
XPS
charakterisiert.
Elektrochemie
Abbildung 70 zeigt die Ergebnisse der EIS-Messungen für das statische System und die
zwei unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten des Elektrolyten.
Abbildung 70: Ergebnisse der EIS-Messungen von geschliffenem Magnesium gemessen in DMEM bei
Raumtemperatur
mit
ruhendem
Elektrolyten
(0 ml/min)
und
bei
zwei
unterschiedlichen
Fließgeschwindigkeiten des Elektrolyten (2,11 ml/min und 10,35 ml/min); a) repräsentative Nyquist-Plots;
b) berechnete mittlere Durchtrittswiderstände RD mit den zugehörigen Standardabweichungen.
140
Ergebnisse und Diskussion
Im Vergleich zur statischen Messung in DMEM bei Raumtemperatur findet eine signifikante
Abnahme der Ladungsdurchtrittswiderstände für die Messungen mit bewegtem Elektrolyt
statt. Auch ist eine Abhängigkeit der Korrosionsbeständigkeit von der Fließgeschwindigkeit
zu beobachten. So sinkt RD von ca. 0,48 k*cm² auf ca. 0,29 k*cm² bei Erhöhung der
Fließgeschwindigkeit von 2,11 ml/min auf 10,35 ml/min. Außerdem fällt eine Änderung der
Kurvenform für die Messungen mit bewegtem Elektrolyt im Vergleich zum statischen System
auf (vgl. Vergrößerung in Abbildung 70 a). Die Nyquist-Plots gleichen in ihrer Form denen
der in SBF gemessenen Kurven. Das Fließen des Elektrolyten bewirkt unter anderem einen
stetigen Abtransport der Korrosionsprodukte und verhindert den korrosionsbedingten pHAnstieg an der Probenoberfläche. Dies führt vermutlich dazu, dass die Schichtbildung nicht
in
dem
Maße
wie
bei
ruhendem
Elektrolyten
stattfinden
kann
und
die
Korrosionsbeständigkeit von Magnesium vergleichsweise gering ist.
Die Ergebnisse der Polarisationsmessungen sind in Abbildung 71 dargestellt.
Abbildung 71: Ergebnisse der Stromdichte-Potential-Messungen von geschliffenem Magnesium in DMEM
bei
Raumtemperatur
mit
Fließgeschwindigkeiten
ruhendem
des
Elektrolyten
Elektrolyten
(0 ml/min)
(2,11 ml/min
und
und
bei
zwei
10,35 ml/min);
unterschiedlichen
a)
repräsentative
Polarisationskurven; b) berechnete Korrosionsstromdichten iKorr.
Wie bei der EIS zeigt sich auch bei den Stromdichte-Potential-Messungen eine starke
Abnahme
der
Korrosionsbeständigkeit
für
das
dynamische
Messsystem.
Die
Korrosionsstromdichte steigt von ca. 5 µA/cm² für den ruhenden Elektrolyt auf Werte über
60 µA/cm²
für
die
Messungen
in
der
Durchflusszelle.
Die
Korrelation
der
Korrosionsbeständigkeit mit der Fließgeschwindigkeit, die die EIS Ergebnisse zeigen, wird
hier bestätigt. So werden für eine Fließgeschwindigkeit von 10,35 ml/min die höchsten Werte
für
iKorr
erreicht
(77 µA/cm²).
Ebenfalls
deutlich
wird
die
Änderung
des
Korrosionsmechanismus bei Verwendung eines fließenden Elektrolyten. Während für das
Ergebnisse und Diskussion
141
statische System eine leichte Passivierung in DMEM beobachtet wird, bewirkt der
Elektrolytfluss eine durchgehend aktive anodische Auflösung. Die Polarisationskurven
ähneln den in SBF gemessenen.
Oberflächenanalyse
Anschließend
an
die
Elektrochemie
wurden
die
Probenoberflächen
mittels
REM
charakterisiert.
Die REM Aufnahmen für das statische System sowie für die Messungen bei zwei
unterschiedlichen ElektrolytFließgeschwindigkeiten sind in Abbildung 72 dargestellt.
Abbildung 72: REM Aufnahmen nach den elektrochemischen Messungen in DMEM bei Raumtemperatur
mit unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten des Elektrolyten; a) und b) ruhender Elektrolyt; c) und d)
2,11 ml/min Fließgeschwindigkeit; e) und f) 10,35 ml/min Fließgeschwindigkeit.
142
Ergebnisse und Diskussion
Im Vergleich zu den Messungen ohne Elektrolytfluss wird bei beiden untersuchten
Fließgeschwindigkeiten eine Veränderung der Oberfläche deutlich. Die Rissstruktur ist zwar
sowohl beim statischen System als auch bei bewegtem Elektrolyt vorhanden, jedoch sind die
Risse für 2,11 ml/min und 10,35 ml/min wesentlich stärker ausgeprägt als bei ruhendem
Elektrolyt. Vor allem bei höheren Vergrößerungen wird eine ähnliche Schollen-Struktur wie
bei den Messungen in SBF beobachtet.
Zusammenfassung
143
5. Zusammenfassung
Bereits seit einigen Jahrzehnten steht Magnesium im Fokus der Medizintechnikforschung im
Bereich der bio-resorbierbaren Implantatmaterialien. Vor allem die hohe Biokompatibilität, die
korrosionsbedingte Degradation in physiologischer Umgebung sowie die verhältnismäßig
günstigen mechanischen Eigenschaften zeichnen Magnesium für den Einsatz als biodegradierbares Material für temporäre Implantatanwendungen aus. Probleme hingegen
stellen die anfänglich starke Korrosion und die Unkontrollierbarkeit der Magnesiumauflösung,
verbunden mit hoher Wasserstoffentwicklung und lokaler Alkalisierung dar. Ansätze zur
Herabsetzung der Korrosionsrate, vor allem zu Beginn, sind, neben der Entwicklung von
Magnesiumlegierungen, geeignete Beschichtungen. Mehrfach wird in der Literatur vom
Einfluss von Proteinen auf die Korrosion von Metallen berichtet. Für Magnesium zeigte sich
in der Vergangenheit ein überwiegend positiver Effekt von Serumproteinen auf die
Korrosionsbeständigkeit. Es wird angenommen, dass Proteine auf der Magnesiumoberfläche
adsorbieren und eine isolierende Schicht bilden können.
In der vorliegenden Arbeit wurden Proteinbeschichtungen als möglicher Korrosionsschutz
von Rein-Magnesium für Implantatanwendungen untersucht.
Als Modellprotein wurde zunächst bovines Serumalbumin (BSA) verwendet. Für die
Proteinanbindung
an
die
Mg-Oberfläche
wurden
die
Linkermoleküle
Aminopropyltriethoxysilan + Vitamin C (A), Carbonyldiimidazol (CDI) und Stearinsäure (SA)
gewählt, als Referenz diente die direkte Anbindung von BSA an die passivierte MgOberfläche. Die Proteinbeschichtung fand mittels Tauchverfahren statt, wobei die
Beschichtungszeit von 0,25 h bis 24 h variiert wurde. Die Oberflächenanalyse mittels
Röntgenstrahlen-Photoelektron-Spektroskopie
Massenspektrometrie
(ToF-SIMS)
zeigt
(XPS)
sowohl
den
und
Flugzeit-Sekundärionen-
Beschichtungserfolg
für
alle
verwendeten Linkermoleküle als auch für die BSA-Adsorption. Die größte Menge an BSA auf
der Oberfläche wird für die Anbindung via AV und SA für kurze Beschichtungszeiten (0,25
und 0,5 h) gefunden. Erste elektrochemische Messungen in simulierter Körperflüssigkeit
(SBF) zeigen, dass teilweise eine signifikante Zunahme der Korrosionsbeständigkeit durch
die Beschichtung mit den Linkermolekülen und BSA erzielt werden kann. Im Vergleich der
verschiedenen BSA-Beschichtungen werden die besten Ergebnisse generell für kurze
Beschichtungszeiten
bis
0,5 h
erzielt.
Die
höchsten
durchschnittlichen
Ladungsdurchtrittswiderstände werden für SA+0,25 h BSA und für CDI+0,5 h BSA
gemessen. Wasserstoffmessungen in Zellkulturmedium (Dulbecco´s Modified Eagles
Medium, DMEM) zeigen teilweise den gleichen Trend wie die Impedanzmessungen in SBF.
Auch hier werden die niedrigsten Wasserstoffentwicklungsraten für die 0,5 h BSA-
144
Zusammenfassung
Beschichtungen gemessen. Die vergleichsweise besten Ergebnisse werden durchgängig mit
AV+0,5 h BSA erzielt. Die EIS-Messungen (elektrochemische Impedanzspektroskopie) in
Zellkulturmedium bei 37°C zeigen einen positiven Einfluss der SA-Vorbehandlung auf die
Korrosionsbeständigkeit von Magnesium. Die zusätzliche BSA-Adsorption führt jedoch fast
durchgängig zu keiner weiteren Erhöhung der Ladungsdurchtrittswiderstände. Allerdings
bewirkt die Verwendung von DMEM als Elektrolyt eine signifikante Steigerung der
Korrosionsbeständigkeit
im
Vergleich
zu
SBF.
Zudem
ändert
sich
der
Korrosionsmechanismus in Zellkulturmedium. Die Auslagerung der Magnesiumproben im
teilweise organischen Elektrolyt scheint zur Bildung einer Schicht zu führen, welche einen
großen Einfluss auf die Korrosion von Magnesium hat. Im Vergleich hierzu scheint vor allem
der Effekt von adsorbiertem BSA gering zu sein.
Neben BSA wird Lysozym (LYS) als weiteres Modellprotein für biokompatible Schichten auf
Magnesium untersucht. Für die Beschichtung von Magnesium mit LYS wird das
Linkermolekül SA und die direkte Anbindung gewählt. Wie bei BSA wird das Tauchverfahren
mit Beschichtungszeiten von 0,25 h bis 24 h verwendet. Die Oberflächencharakterisierung
hinsichtlich Qualität und Quantität der Proteinschichten findet mittels XPS statt. Der Einfluss
der gebildeten LYS-Schichten auf die Korrosion von Magnesium wird mithilfe der
elektrochemischen Impedanzspektroskopie (EIS) in Zellkulturmedium bei 37°C untersucht.
Wie bei BSA zeigt die Oberflächenanalyse auch für LYS den Erfolg der Beschichtung für alle
untersuchten Beschichtungszeiten. Im Gegensatz zu BSA wird jedoch für beide
Anbindungsmechanismen ein nahezu kontinuierlicher Anstieg der Menge an LYS auf der
Oberfläche mit zunehmender Beschichtungszeit beobachtet. Für kurze Zeiten bis 1 h scheint
die LYS-Anbindung via SA bevorzugt zu sein. Die Elektrochemie in DMEM bei 37°C zeigt
teilweise einen deutlichen positiven Einfluss von LYS auf die Korrosionsbeständigkeit von
Magnesium. Im Vergleich zu BSA erzielen die LYS-Beschichtungen überwiegend höhere
Ladungsdurchtrittswiderstände.
Um den Einfluss der in DMEM gebildeten Schichten auf die Korrosion von Magnesium
genauer zu untersuchen, wurde Rein-Magnesium für 1, 3 und 5 Tage bei Raumtemperatur
und im Inkubator bei 37°C und 5 % CO2 in DMEM ausgelagert. Durch die Zugabe von FCS
zum Medium im Inkubator wurde der zusätzliche Einfluss von Proteinen auf die
Korrosionsbeständigkeit von Magnesium untersucht. Die Oberflächenanalyse mittels
Rasterelektronenmikroskop, XPS, Röntgendiffraktometrie (XRD) und Infrarot-Spektroskopie
(FTIR) zeigt, dass sich bei allen Auslagerungsparametern hauptsächlich Schichten aus
amorphen Calciumphosphatverbindungen bilden, die sich in ihrem Ca/P-Verhältnis, sowie
der Schichtdicke und der Mikrostruktur unterscheiden.
Für die Auslagerung bei
Raumtemperatur weist das Ca/P Verhältnis durchgängig Werte um 1,67 auf, was auf die
Bildung von Hydroxylapatit hinweist, die Schichtdicken variieren kaum für die verschieden
Zusammenfassung
145
Auslagerungszeiten. Für die Passivierung in DMEM im Inkubator findet zwar ein starker
Anstieg der Schichtdicke mit zunehmender Auslagerungszeit statt, jedoch variiert die
Schichtdicke teilweise deutlich. Gleichzeitig findet eine Abnahme des Ca/P Verhältnisses
statt. Die Zugabe von FCS zum Medium im Inkubator führt sowohl zu den niedrigsten
Schichtdicken, als auch zu den kleinsten Ca/P Verhältnissen. Hohe Stickstoffsignale weisen
jedoch auf Proteinadsorption hin. Die elektrochemische Analyse weist generell auf eine
Abhängigkeit der Korrosionsbeständigkeit vom Ca/P-Verhältnis hin. So zeigt die Auslagerung
bei Raumtemperatur die höchsten Durchtrittswiderstände. Beide Passivierungen im
Inkubator zeigen ähnliche Korrosionsbeständigkeit. Durch die Zugabe von FCS zum Medium
scheint sich zwar keine Calciumphosphatschicht in dem Maße wie in DMEM ohne Proteine
auszubilden, jedoch führt die Proteinadsorption ebenfalls zu einem vergleichbaren
Korrosionsschutz.
Um Informationen über die Biokompatibilität der verschiedenen Linkermoleküle sowie der
DMEM-Passivierung in Form von Zelladhäsion und –proliferation zu erlangen, wurden
Zellversuche bis zu 20 Tage mit zwei unterschiedlichen Zelllinien – Endothelzellen (DH1+/+)
und Osteosarkomazellen (Mg63) – durchgeführt. Im Vergleich zu reinem Magnesium weisen
beide Zelllinien für alle Linkermoleküle eine höhere anfängliche Zelladhäsion auf, die
untersuchte DMEM-Passivierung hingegen führt zu kaum einer Erhöhung der Zelldichte auf
der Oberfläche. Für die Endothelzellen werden die besten Ergebnisse der anfänglichen
Zelladhäsion mit AV erzielt, für die Osteosarkomazellen mit SA und AV. Langzeitversuche
bis 20 Tage wurden für beide Zelllinien mit Rein-Magnesium und der AV-Vorbehandlung
durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zellkultivierung bis zu 20 Tage sowohl auf
Reinmagnesium, als auch auf AV möglich ist. Im Vergleich zu Magnesium weist die AVVorbehandlung eine leicht verbesserte Zelladhäsion und –proliferation sowie eine höhere
Langzeitstabilität auf. Elektrochemische Messungen zeigen den positiven Einfluss der
Bedeckung der Oberfläche mit Zellen. Vor allem für die Osteosarkomazellen wird nach fünf
Tagen ein signifikanter Anstieg der Korrosionsbeständigkeit beobachtet.
Im letzten Teil der Arbeit wurden die Einflüsse der Messparameter Elektrolyt, Temperatur
und Fließgeschwindigkeit des Elektrolyten auf die Magnesiumkorrosion untersucht. Während
eine Temperaturerhöhung von Raumtemperatur auf 37°C die Korrosionsbeständigkeit von
Magnesium in den untersuchten Elektrolyten kaum beeinflusst, findet ein deutlicher Anstieg
des Ladungsdurchtrittswiderstandes für die Messungen in DMEM im Vergleich zu denen in
SBF statt. Es wird außerdem eine Änderung des Korrosionsmechanismus beobachtet. Die
elektrochemischen Messungen mit fließendem Elektrolyt zeigen eine deutliche Abnahme der
Korrosionsbeständigkeit im Vergleich zum statischen Messsystem. Zudem korreliert die
Korrosionsrate
mit
der
Fließgeschwindigkeit
des
Elektrolyten.
Je
Fließgeschwindigkeit, desto geringer die gemessenen Durchtrittswiderstände.
höher
die
146
Zusammenfassung
Literatur
147
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154
Anhang
Anhang
Abbildung 73: Kameraaufnahmen und Mikroskopobilder nach Beschichtung von Mg mit den drei
Linkermolekülen AV, CDI und SA und nach Passivierung in 1 M NaOH
Anhang
155
Mg geschl.
NaOH
OCP vs. Ag/AgCl in V
-1.65
-1.70
-1.75
-1.80
-1.85
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Zeit in h
Abbildung 74: Repräsentative OCP –Aufzeichnung einer geschliffenen und einer NaOH-passivierten MgProbe. Das OCP wurde gegen eine Ag/AgCl Referenzelektrode für 75 min aufgezeichnet.
Abbildung 75: Mittelwerte der Wasserstoffmessungen mit zugehöriger Standardabweichung der
Vorbehandlungschritte Schleifen, NaOH-Passivierung und Beschichtung mit den Linkermolekülen AV,
CDI und SA
156
Anhang
Abbildung 76: Mittelwerte der Wasserstoffmessungen mit zugehöriger Standardabweichung; a) direkte
BSA-Beschichtung ohne die Verwendung von Linkermolekülen; b) BSA-Beschichtung via AV; c) BSABeschichtung via CDI; d) BSA-Beschichtung via SA.
Anhang
Abbildung
157
77:
Vergleich
der
Bode-Plots
der
EIS-Messungen
in
DMEM
bei
37°C
der
Vorbehandlungsschritte Schleifen, NaOH-Passivierung und SA-Beschichtung nach 0 (oben) und nach
24 h (unten) Auslagerung in DMEM
158
Anhang
Abbildung 78: Vergleich der Bode-Plots der EIS-Messungen in DMEM bei 37°C der direkten BSABeschichtung nach 0 h (oben) und nach 24 h (unten) Auslagerung in DMEM.
Anhang
159
Abbildung 79: Vergleich der Bode-Plots der EIS-Messungen in DMEM bei 37°C der BSA-Beschichtung via
SA nach 0 h (oben) und nach 24 h (unten) Auslagerung in DMEM.
160
Anhang
Abbildung 80: Vergleich der Bode-Plots der EIS-Messungen in DMEM bei 37°C der direkten LYSBeschichtung nach 0 h (oben) und nach 24 h (unten) Auslagerung in DMEM.
Anhang
161
Abbildung 81: Vergleich der Bode-Plots der EIS-Messungen in DMEM bei 37°C der LYS-Beschichtung via
SA nach 0 h (oben) und nach 24 h (unten) Auslagerung in DMEM.
162
Anhang
Abbildung 82: Vergleich der Bode-Plots der EIS-Messungen nach Auslagerung in DMEM für 1, 3 und 5
Tage bei Raumtemperatur (oben), im Inkubator bei 37°C und 5% CO2 Gehalt (Mitte) und nach Zugabe von
20 % FCS zum Medium im Inkubator (unten).
Anhang
163
Abkürzungsverzeichnis
APTES
Aminopropyltriethoxysilan
AV
APTES + Vitamin C
BSA
bovines Serumabumin (bovine serum albumin)
CDI
Carbonyldiimidazol
d
Tag
Da
Dalton
DMEM
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
EDX
Energiedispersive Röntgen
EIS
Elektrochemische Impedanz Spektroskopie
EtOH
Ethanol
FCS
fötales Kälberserum (fetal calf serum)
FTIR
Fourier transformierte Infrarotspektroskopie
HA
Hydroxylapatit
HEWL
aus Hühnereiweiß gewonnenes Lysozym (hen egg white lysozyme)
IEP
isoelektrischer Punkt
Ekin
kinetische Energie
L
Länge
LYS
Lysozym
Mg
Magnesium
MgCl2
Magnesiumchlorid
Mg(CO)3
Magnesiumcarbonat
Mg(OH)2
Magnesiumhydroxid
OCP
Open Circuit Potential (Ruhepotential)
OCP
Octacalciumphosphat
PBS
Phosphate Buffered Saline
PSG
Penicillin-Streptomycin-Glutamin
Ra
Mittenrauigkeit
RD
Ladungsdurchtrittswiderstand
RE
Elektrolytwiderstand
RH1
Wasserstoffentwicklungsrat während der ersten Stunde
RH2
Wasserstoffentwicklungsrate zwischen 3 und 24 h
Rmax
maximale Rauigkeit
REM
Rasterelektronenmikroskop
rpm
Runden pro Minute
SA
Stearinsäure (stearic acid)
SBF
Simulated Body Fluid
164
Anhang
t
Zeit
ToF-SIMS
Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry
Uac
Beschleunigungsspannung
XPS
X-ray Photoelectron Spectroscopy
XRD
X-ray Diffraction
Z
Impedanz
Z‘
Realteil der Impedanz
Z‘‘
Imaginärteil der Impedanz

Kontaktwinkel

Phasenwinkel

Dichte

Frequenz
Anhang
165
Publikationsliste
Publikationen
2010
Killian MS, Wagener V, Schmuki P, Virtanen S. Functionalization of Metallic Magnesium with
Protein Layers via Linker Molecules. Langmuir. 2010;26:12044-8
2013
Wagener V, Killian MS, Turhan CM, Virtanen S. Albumin Coating on Magnesium via Linker
Molecules – Comparing Different Coating Mechanisms. Colloid
Killian MS, Wagener V, Schmuki P. Adsorption Characteristics of a Zn-Porphyrin on MgO
Surfaces. Surface and Interface Analysis. 2013, 45 (1):194-7
2015
Wagener V, Faltz A-S, Killian MS, Schmuki P, Virtanen S. Protein interactions with corroding
metal surfaces: Comparison of Mg and Fe. Faraday Discussions, Article in Press
Konferenzbeiträge
2011
Euro BioMat 2011, Jena - Wagener, V; Virtanen, S. Tailoring Magnesium Corrosion by Protein Coating -P
Biometals 2011, Quebec – Wagener, V; Turhan, CM; Deleanu, FS; Virtanen, S. Tailoring
Magnesium Corrosion by Protein Coating - O

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