Analysen der beiden cis-regulierenden Sequenzelemente
translational control element (TCE) und
cytoplasmic polyadenylation element (CPE)
in der Drosophila-Spermatogenese
Dissertation zur Erlangung
des akademischen Grades einer
Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
im Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften
der Universität Kassel
vorgelegt von
Stefanie Bublak
Kassel, im Oktober 2015
Datum der Disputation: 16. Dezember 2015
Prüfungskommission:
Referentin: Prof. Dr. Mireille A. Schäfer
Koreferent: Prof. Dr. Raffael Schaffrath
Drittprüfer: Prof. Dr. Friedrich W. Herberg
Viertprüfer: Prof. Dr. Arno Müller
Danksagung
Mein besonderer Dank geht an erster Stelle an Frau Prof. Mireille A. Schäfer. Dies gilt sowohl für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes als auch für ihre unermüdliche Unterstützung bei der Planung und Umsetzung dieser Dissertation.
Ebenfalls danke ich Herrn Prof. Raffael Schaffrath für die Übernahme des Zweitgutachtens, sowie Prof. Friedrich W. Herberg für das Einverständnis als Drittprüfer an meiner
Disputation teilzunehmen. Herrn Prof. Arno Müller bin ich für die Zusage als Viertprüfer,
sowie eines Arbeitsplatzes während der letzten Züge meiner Dissertation überaus dankbar.
Ein großzügiges Dankeschön sei an die Mitarbeiter der Abteilung Entwicklungsbiologie
Christine Otto, Nicole Schleinschok und Tanja Wilhelm gerichtet, die mir einige experimentelle Unterstützung entgegengebracht haben. Auch Steffen Schröder danke ich für die
Unterstützung besonders zu Beginn meiner Promotion. Ich bin weiterhin meinen Praktikantinnen Karoline Pudelko und Sabrina Dörfler dankbar, die bei der Bearbeitung meines
Themas mitgewirkt haben. Ebenso danke ich den ehemaligen Diplomanden Dagny Müller,
Greta Gulbins, Maria Kriebel und Lars Hupfeld für eine wundervolle Labor- und Freizeit,
die offenen Ohren und die aufmunternde Atmosphäre.
An dieser Stelle möchte ich mich auch recht herzlich bei der Abteilung Zellbiologie bedanken. Insbesondere gilt dies für Prof. Markus Maniak und Harald Rühling für die hilfsbereite
Unterstützung zur Anfertigung der eindrucksvollen konfokalen Aufnahmen. Ebenso sei ein
Dank an Jessica Kornke und Peggy Paschke gerichtet, die mir fachlich und persönlich mit
konstruktiven Anregungen zur Seite standen. Dies gilt gleichermaßen für Doreen Meier,
Michael Friedrich und Isabelle Schuster aus der Abteilung Genetik, Carolin Wittmer aus
der Abteilung Zoologie, sowie Natascha Mumdey und Robin Lorenz aus der Abteilung
Biochemie für die hilfreichen Anmerkungen.
Besonders erwähnen möchte ich an dieser Stelle noch Katharina Schulze, dies seit fast
anderthalb Jahrzehnten meine treueste Gefährtin ist, sowie Carolin Wellmann, Nadja
Arens, Jutta Rippel und meinem Freund, die mir jederzeit und vor allem in der Endphase
dieser Arbeit aufmunternd zur Seite standen. Ein besonderes Danke geht auch an meine
Familie, insbesondere meinen Großeltern Mathilde und Werner Molle, sowie meinem Bruder Andreas. Ich bedanke mich auch recht herzlich bei den zahlreichen Korrekturlesern
Andreas Groß und Vladimir Gross, sowie einigen bereits oben erwähnten.
Verzeichnisse
I
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen und Symbole.......................................................................V
1. Zusammenfassung......................................................................................................... 1
2. Abstract........................................................................................................................... 3
3. Einleitung........................................................................................................................ 4
3.1. Spermatogenese in Drosophila melanogaster........................................................4
3.2. Translationskontrolle in der Drosophila-Spermatogenese......................................7
3.3. cis-wirkende Faktoren in RNP-Komplexen.............................................................7
3.3.1. Das translational control element (TCE).........................................................8
3.3.2. Das cytoplasmic polyadenylation element (CPE)..........................................10
3.3.3. Tob – ein Interaktionspartner von Orb2.........................................................12
3.4. Zielsetzung dieser Dissertation............................................................................13
4. Ergebnisse.................................................................................................................... 15
4.1. Aufreinigung von rekombinantem Orb2 und Bindungsanalysen an dem TCE......15
4.1.1. Einfluss diverser Parameter auf die Löslichkeit von rekombinantem Orb2....15
4.1.2. Konstruktion einer neuen Mst87F-EMSA-Sonde..........................................18
4.1.3. Bindungsanalysen mit Orb2 an dem TCE-enthaltenden mst87F (+1/+45)Transkript......................................................................................................19
4.1.4. Konstruktion einer neuen Mst98Ca-EMSA-Sonde........................................20
4.1.5. Orb2 bindet die TCE-Sequenz eines weiteren Mst(3)CGP-Genfamilienmitgliedes.......................................................................................................... 21
4.1.6. Hodenproteinextrakt von Orb2JO10 unterstützt nicht die Ausbildung der
Shiftkomplexe...............................................................................................22
4.1.7. Die mst87F- und mst98Ca-Transkripte interagieren spezifisch mit Orb2......23
4.1.8. mst87F und mst98Ca zeigen unterscheidbare Bindungseigenschaften........25
4.1.9. Bindungsanalysen weiterer Kandidaten des mst87F-RNP-Komplexes.........26
4.2. Weiterführende Analysen des mst87F-RNP-Komplexproteins CG3213...............27
4.2.1. Herstellung des CG3213-mCherry-Fusionsproteins.....................................28
4.2.2. Die Proteinverteilung ist nicht durch den Fluoreszenzmarker beeinflusst.....29
4.2.3. CG1898-eGFP kolokalisiert prämeiotisch partiell mit CG3213-mCherry.......30
4.2.4. Orb2-eGFP ist nur minimal zeitgleich mit CG3213-mCherry exprimiert........32
4.2.5. CG12470-eGFP kolokalisiert eindeutig mit CG3213-mCherry......................34
4.2.6. Die Partikel von CG3213-mCherry sind nicht mit membranösen Strukturen
assoziiert......................................................................................................36
4.2.7. CG3213 weist zwei dramatisch unterschiedliche Expressionsphasen auf....38
4.2.8. Quantifizierung der CG3213-RNA in Exuperantia-mutantem Hintergrund... .40
4.2.9. CG3213-Proteinverteilung in Exuperantia-mutantem Hintergrund................41
II
Verzeichnisse
4.3. Das cis-aktive Regulationselement CPE und seine Wirkung in den protaminmRNAs.................................................................................................................. 45
4.3.1. Das CPE interagiert mit den Drosophila-Proteinen Orb2 und CG3213.........45
4.3.2. Rekombinantes Orb2 bindet mit unterschiedlicher Effizienz an die protaminmRNAs......................................................................................................... 47
4.3.3. RNase H-Analysen liefern keine Hinweise auf eine sekundäre Polyadenylierung der protamin-Transkripte...................................................................49
4.3.4. Die subzelluläre Verteilung der beiden Orb2-Proteine ist verschieden..........51
4.4. Tob – ein möglicher Interaktionspartner von Orb2 in der Drosophila-Spermatogenese................................................................................................................. 55
4.4.1. Quantifizierung der beiden tob-Transkripte RA und RE................................55
4.4.2. Klonierung eines transkriptspezifischen Tob-mCherry-Fusionsproteins........57
4.4.3. Zeitliche und räumliche Expression von Tob-mCherry..................................58
4.4.4. Erste Hinweise, dass Tob in Spermatiden mitochondrial lokalisiert sein
könnte........................................................................................................... 59
4.4.5. Tob ist in der Drosophila-Spermatogenese nicht kernlokalisiert....................62
4.4.6. Tob kolokalisiert begrenzt mit dem großen Orb2 in den Spermatiden...........63
5. Diskussion.................................................................................................................... 67
5.1. Ist neben dem TCE auch der Mechanismus innerhalb der Genfamilie konserviert?.................................................................................................................... 67
5.2. Expressionscharakteristika der mst87F-RNP-Kandidaten....................................68
5.3. Auswirkung auf die mst87F-RNP-Modellvorstellung.............................................70
5.4. Zelluläre Lokalisierung des mst87F-Komplexes...................................................71
5.5. Orb2 und CG3213 binden die protamin-mRNAs mit unterschiedlicher Affinität....73
5.6. Sekundäre Polyadenylierung an protamin-mRNAs ist nicht mit RNaseH nachweisbar................................................................................................................. 74
5.7. Tob scheint in der Drosophila-Spermatogenese mitochondrial assoziiert.............74
5.8. Kann Tob mehrere Zielorte haben?......................................................................75
5.9. Tob kolokalisiert auch in der Drosophila-Spermatogenese mit Orb2....................76
6. Methoden...................................................................................................................... 78
6.1. Fliegenarbeiten....................................................................................................78
6.1.1. Aufzucht und Haltung von Drosophila...........................................................78
6.1.2. P-Element vermittelte Keimbahntransformation............................................79
6.1.3. Sammlung und Dechorionisierung von Embryonen......................................79
6.1.4. Vorbereitung und Injektion von Plasmid-DNA...............................................80
6.2. Etablierung neuer Drosophila-Stämme................................................................81
6.2.1. Balancer-Kreuzungen...................................................................................81
6.2.2. Kombinationsstämme...................................................................................81
6.2.3. Fertilitätstest.................................................................................................82
Verzeichnisse
III
6.3. Gal4/UAS-System................................................................................................82
6.4. Zytologische Techniken........................................................................................83
6.4.1. Präparation von Organen.............................................................................83
6.4.2. Mikroskopische Untersuchungen..................................................................83
6.4.3. Fixierung und Färbung von Organen und Geweben.....................................83
6.5. DNA-Techniken....................................................................................................85
6.5.1. Isolierung genomischer DNA aus Drosophila................................................85
6.5.2. Polymerase chain reaction (PCR)-Techniken................................................86
6.5.3. Phenol/Chloroform-Extraktion.......................................................................90
6.5.4. Salz-Alkohol-Fällung.....................................................................................90
6.5.5. Extraktion von DNA-Fragmenten und PCR-Produkten aus einem Agarosegel............................................................................................................. 90
6.5.6. Analytischer und präparativer Restriktionsverdau.........................................90
6.5.7. Elektrophoretische Größenauftrennung von DNA-Fragmenten in Agarosegelen......................................................................................................... 91
6.5.8. Konzentrationsbestimmung von DNA...........................................................92
6.6. Klonierungstechnische Methoden........................................................................92
6.6.1. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten und Vektoren............................92
6.6.2. Synthese von A-Überhängen........................................................................93
6.6.3. Blunt end-Generierung.................................................................................93
6.6.4. Ligation von DNA-Fragmenten.....................................................................93
6.6.5. Herstellung von kompetenten E.coli-Zellen...................................................94
6.6.6. Überprüfung der chemisch kompetenten NovaBlue GigaSinglesTM-Zellen....95
6.6.7. Transformation in kompetente E.coli-Zellen..................................................95
6.6.8. Selektionsmethoden.....................................................................................96
6.6.9. Präparation von Plasmid-DNA......................................................................98
6.6.10. Sequenzierung von Plasmid-DNA..............................................................99
6.7. RNA-Techniken..................................................................................................100
6.7.1. Isolierung von Poly(A)-mRNA aus Drosophila.............................................100
6.7.2. Isolierung von Gesamt-RNA mit Trizol®.......................................................101
6.7.3. Konzentrationsbestimmung von RNA.........................................................102
6.7.4. RNase H-Behandlung.................................................................................102
6.7.5. Elektrophoretische Auftrennung von RNA in denaturierenden Formaldehydgelen.....................................................................................................104
6.7.6. Northern-Transfer.......................................................................................104
6.7.7. In vitro-Transkription zur Herstellung von radioaktiven Sonden..................105
6.7.8. Northern-Hybridisierung..............................................................................109
6.7.9. Exposition von radioaktiven Signalen.........................................................109
IV
Verzeichnisse
6.7.10. Entfernung radioaktiver RNA-Sonden von einer Nylonmembranen..........110
6.7.11. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)..............................................110
6.8. Proteinbiochemische Techniken.........................................................................112
6.8.1. Überexpression von rekombinanten Proteinen in E.coli..............................112
6.8.2. Überprüfung der Proteinexpression (Zelllyse).............................................113
6.8.3. Aufreinigung bakteriell exprimierter Fusionsproteine...................................114
6.8.4. Isolierung von Hodenproteinextrakt.............................................................115
6.8.5. Konzentrationsbestimmung von Proteinlysaten..........................................116
6.8.6. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).................................117
6.8.7. Coomassie Brillant Blue-Färbung von PAA-Gelen......................................118
6.8.8. Western-Blot...............................................................................................118
6.8.9. Ponceau S-Färbung....................................................................................119
6.8.10. Immunologischer Nachweis von Proteinen...............................................119
7. Materialien.................................................................................................................. 121
7.1. Fliegenstämme...................................................................................................121
7.2. Online Datenbanken und PC-Software...............................................................122
7.3. Oligonukleotide..................................................................................................123
7.4. Geräte................................................................................................................ 125
7.5. Verbrauchsmaterialien........................................................................................126
7.6. Chemikalien.......................................................................................................128
7.7. Kitsysteme..........................................................................................................130
7.8. Enzyme und Enzympuffer..................................................................................131
7.9. Antikörper........................................................................................................... 131
7.10. Molekulargewichtstandards..............................................................................132
7.11. Kompetente E.coli-Bakterienstämme................................................................132
7.12. Plasmid-Vektoren.............................................................................................132
8. Anhang....................................................................................................................... 133
8.1. Analyse der Kandidaten CG3440 und CG3727..................................................133
8.1.1. RNA- und Protein-Expressionsanalysen des Gens CG3727......................133
8.1.2. RNA- und Protein-Expressionsanalysen des Gens CG34404....................136
8.2. Sequenzierungsergebnisse der Northern- und EMSA-Sonden..........................140
9. Referenzen................................................................................................................. 143
Eidesstattliche Erklärung..................................................................................................167
Verzeichnisse
V
Verzeichnis der Abkürzungen und Symbole
Nicht aufgeführte Abkürzungen und Symbole sind im Text an angemessener Stelle erklärt.
Symbol/Abkürzung
Bezeichnung
A
Ampere
amp
Ampicillin
APS
Ammoniumperoxodisulfat
AS
Aminosäure
BCIP
5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat
bw
brown
CaCl2
Calciumchlorid
cDNA
complementary DNA
C.elegans
Caenorhabditis elegans
CGP
Cystein-Glycin-Prolin
cm
Zentimeter
cn
cinnebar
Co-IP
Co-Immunopräzipitation
CPE
cytoplasmic polyadenylation element
CPEB
cytoplasmic polyadenylation element binding protein
CPSF
cleavage and polyadenylation specificity factor
Ct
cycle threshold
Cyo
Curly derivative of Oster
dATP
Desoxyadenosintriphosphat
DCDMS
Dichlordimethylsilan
DEPC
Diethylpyrocarbonat
dFMR1
fragile X mental retardation protein 1
dH2O
destilliertes Wasser
DIC
Differentialinterferenzkontrast
DMFA
Dimethylformamid
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
DTT
Dithiothreitol
E.coli
Escherichia coli
ed/eds
editor/s
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
eGFP
enhanced green fluorescent protein
eIF3/4C/4E/4G
eukaryotic translation initiation factors
EMSA
electrophoretic mobility shift assay
VI
Verzeichnisse
et al.
et alii
EtOH
Ethanol
Exu
Exuperantia
F1/2
Erste/zweite Filialgeneration
g
Gramm
G0
Generation 0
GFP
green fluorescent protein
Gla
Glazed
GST
Glutathion-S-Transferase
h
Stunde
HAc
Essigsäure
HCl
Salzsäure
HEPES
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HIS
Polyhistidin
ht
heterozygot
hm
homozygot
IC
investment cone
IPTG
Isopropyl-ß-D-thiogalactosid
J
Joule
KAc
Kaliumacetat
kan
Kanamycin
kb
Kilobase
KCl
Kaliumchlorid
K2HPO4
Dikaliumhydrogenphosphat
KOH
Kaliumhydroxid
l
Liter
LB
lysogeny broth
LCS
Leica Confocal Software
LiCl
Lithiumchlorid
LiDS
Lithiumdodecylsulfat
m
Milli
M
Molar
mg
Milligramm
MgCl2
Magnesiumchlorid
min
Minute
ml
Milliliter
mM
Millimolar
MOPS
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure
MPP
mitochondrial processing peptidase
mRNA
messenger RNA
ms
Millisekunde
Verzeichnisse
VII
Mst
male-specific transcript
NaAc
Natriumacetat
Na-Azid
Natriumazid
NaCl
Natriumchlorid
Na2CO3
Dinatriumcarbonat
Na2HPO4
Dinatriumhydrogenphosphat
NaOH
Natriumhydroxid
NBT
Nitroblau Tetrazoliumchlorid
NLS
nuclear localization signal
nm
Nanometer
NP-40
Nonident® P-40
ns
nicht signifikant
OD
optische Dichte
o/n
over night
ORF
open reading frame
P
Parentalgeneration
PAA
Polyacrylamid
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PABP
Poly(A)-Bindeproteine
PAP
Poly(A)-Polymerase
p-body
processing body
PBS
phosphate buffered saline
pBS KS
pBlueSkript KS
PCR
polymerase chain reaction
PDI
Proteindisulfidisomerase
Pfu
Pyrococcus furiosus
pg
Pikogramm
piRNA
PIWI-interacting RNA
PMFS
Phenylmethylsulfonylfluorid
Poe
Purity of essence
PP2A
Proteinphosphatase 2A
PVDF
Polyvinylidenfluorid
R
elektrischer Widerstand
RbCl
Rubidiumchlorid
rcf
relative centrifugal force
RNA
Ribonukleinsäure
RNP
Ribonukleoprotein
RNase
Ribonuklease
rpL9
ribosomal protein L9
rpm
revolutions per minute
RRM
RNA-recognition motif
VIII
Verzeichnisse
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
reverse transcription polymerase chain reaction
s
Sekunde
Sb
Stubble
S.cerevisae
Saccharomyces cerevisae
SD
stadard deviation
SDS
sodium dodecyl sulfate
Ser
Serrate
siRNA
small interfering RNA
SOB
super optimal broth
SOC
super optimal broth with catabolite repression
ssRNA
single strand RNA
STE
sodium chloride-Tris-EDTA
Taq
Thermus aquaticus
TBE
Tris-Borat-EDTA
TCE
translsational control element
TDCR
triple to double coincidence ratio
TE
Tris-EDTA
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TM
melting temperature
TOM
translocase of the outer mitochondrial membrane
TRITC
tetramethylrhodamine
tRNA
transfer RNA
U oder u
units
UAS
upstream activating sequence
u-body
uridine-rich body
UTR
untranslated region
V
Volt
VDRC
Vienna Drosophila Resource Center
Vol
Volumen
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
Gewicht pro Volumen
X-Gal
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid
ZNS
zentrales Nervensystem
ZF
Zinkfinger
µF
Mikrofarad
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
µM
Mikromolar
Ø
Durchmesser
°C
Grad Celsius
Verzeichnisse
IX
λ
Lambda
♂
Männchen/männlich
#
Nummer
%
Prozent
*
radioaktiv markiert oder signifikant
®
registrierte Marke
♀
Weibchen/weiblich
Zusammenfassung
1
1. Zusammenfassung
Ein essentieller Bestandteil in dem Mechanismus der Translationskontrolle sind RNA-Protein-Wechselwirkungen. Solche Interaktionen konnten in Translationssystemen an zwei
unabhängigen cis-regulierenden Elementen durch in vitro-Bindungsanalysen mit individuellen rekombinanten Proteinen dokumentiert werden.
Im Fall des translational control elements (TCE), welches ein konserviertes Sequenzelement in der Mst(3)CGP-Genfamilie darstellt, wird eine negative Translationskontrolle
durch die Bindung der Proteine CG3213, CG12470, CG1898, dFMR1, Exuperantia und
Orb2 an diese Sequenz vermittelt (Stinski, 2011). Neben den in Bindungsstudien positiv
getesteten Kandidaten dFMR1 und Orb2 (Stinski, 2011) wurde in der vorliegenden Dissertation CG3213 als weiterer direkter Bindungspartner an das TCE dokumentiert. Ein
Abgleich der genomweiten Zusammenstellung von Proteininteraktionen in der Datenbank
InterologFinder lieferte zwei weitere potentielle Kandidaten: CG34404 und CG3727. Allerdings schließen Northern-Analysen und das Proteinexpressionsmuster eine zentrale
Rolle in der Drosophila-Spermatogenese für diese nahezu aus. In Kolokalisationsstudien
einiger TCE-Komplex-Kandidaten mit CG3213 als Referenz konnten eindeutige Übereinstimmungen der Fluoreszenzmuster mit CG12470 in der postmeiotischen Phase beschrieben werden, wohingegen mit Orb2 (postmeiotisch) und CG1898 (prämeiotisch) nur
eine geringe Kolokalisation erkannt wurde. Punktstrukturen in den Verteilungsmustern
sowohl von CG3213 als auch von CG12470 ließen sich nicht mit ER- und mitochondrienspezifischen Markern korrelieren.
Im Anschluss der Meiose konnte eine deutliche Intensitätserhöhung des CG3213-Proteins
beobachtet werden, was eventuell durch eine veränderte Translationseffizienz zustande
kommen könnte. Exuperantia (Exu) stellt einen bekannten Regulator für eine Reihe von
translationskontrollierten mRNAs dar (Wang und Hazelrigg, 1994). Die Quantifizierungen
der CG3213-mRNA in exu-mutantem Hintergrund bestätigen, dass auch die Transkriptmenge der CG3213-mRNA durch Exu reguliert wird, was die obige Interpretation stützen
würde.
Für das zweite cis-regulierende Element, das cytoplasmic polyadenylation element (CPE),
konnte eine direkte Bindung mit dem CPEB-Homolog in Drosophila (Orb2) gezeigt werden, welches auch eine Komponente des mst87F-RNP-Komplexes ist. Ein vermuteter
Interaktionspartner dieses CPEBs ist Tob, weshalb die Verteilung beider Proteine in einem
Kombinationsstamm verglichen wurde. In dem teilweise übereinstimmenden Fluoreszenzmuster ist Tob an den distalen Spermatidenenden auffallend konzentriert. Das gesamte
Tob-Muster jedoch legt eine Verteilung in den Mitochondrien nahe, wie die MitoTracker ®-
2
Zusammenfassung
Färbung belegt. Somit wurde erstmals ein Mitglied der Tob/BTG-Genfamilie in der Drosophila-Spermatogenese mit Mitochondrien in Verbindung gebracht. Die Lokalisierung dieser Proteine ist bislang unklar, jedoch konnte eine Kernlokalisation trotz der N-terminalen
NLS-Sequenz mit Hilfe einer Kernfärbung ausgeschlossen werden.
Abstract
3
2. Abstract
RNA-protein interactions are crucial for translational control. Such interactions are investigated for two different cis-regulating elements by in vitro binding analyses using individual
recombinant proteins.
For the translational control element (TCE), which is a conserved element within the
Mst(3)CGP-gene family, translational control is permitted by binding of the proteins
CG3213, CG12470, CG1898, dFMR1, Exuperantia and Orb2 to this sequence. In addition
to the identified direct interaction partners dFMR1 and Orb2 (Stinski, 2011), a direct binding at the TCE sequence has also been demonstrated for CG3213. An alignment with a
wide assortment of protein interactions in the database InterologFinder resulted in two
new possible candidates: CG34404 and CG3727. However, Northern analyses as well as
the protein expression pattern of both candidates make them unlikely to have a central
role in Drosophila spermatogenesis. The fluorescent patterns of both CG3213 and
CG12470 fully coincide, whereas only a weak colocalization exists for Orb2 (postmeiotic)
and CG1898 (premeiotic). Aggregate structures in the expression patterns from CG3213
and CG12470 appear to be associated with membranous structures, but ER and mitochondrial markers do not correlate.
After meiosis, a drastic increase in the level of CG3213 protein is observed, which could
be explained by an upregulation of translational efficiency. Exuperantia (Exu) represents a
well known regulator of many premeiotically transcribed RNAs that are translationally controlled (Wang und Hazelrigg, 1994). The data show that the transcript level of the
CG3213-mRNA is also regulated by Exu, supporting the above interpretation.
For the second cis-regulating element, the cytoplasmic polyadenylation element (CPE), a
direct binding with Orb2, the CPEB-homolog in Drosophila – which is also involved in the
mst87F-RNP complex – is demonstrated. In colocalization studies of the CPEB and its
possible interaction partner Tob, a common fluorescent pattern at the distal end of the
spermatid bundles was observed. Additionally Tob shows an interesting distribution, which
can be shown by MitoTracker® staining to be of mitochondrial origin. These are the first
hints that a member of the Tob/BTG-gene family is associated with mitochondrial structures during the Drosophila spermatogenesis. In the literature it is under investigation
whether Tob proteins are present and functional in the nuclei of invertebrates, which
cannot be confirmed by nuclear staining in Drosophila spermatids.
4
Einleitung
3. Einleitung
Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist seit dem frühen 20. Jahrhundert ein beliebter
Modellorganismus für Untersuchungen von entwicklungsbiologischen und zellbiologischen
Prozessen. Seit der abgeschlossenen Sequenzierung des Drosophila-Genoms im Jahr
2000 wurden etwa 13.600 Gene identifiziert (zusammengefasst in Adams et al., 2000).
Diese Zahl konnte seitdem sogar auf 17.170 Gene erweitert werden, die insgesamt für
30.255 Proteine kodieren (Zusammenstellung in FlyBase, Version FB2015_04). Für eine
zeitlich und räumlich exakte Synthese dieser immensen Anzahl an Genprodukten sind
komplexe posttranskriptionelle Regulationsmechanismen erforderlich, die eine schnelle
Umsetzung der mRNA ermöglichen. Für Analysen von solchen translationskontrollierten
Signalwegen eignet sich die Spermatogenese von Drosophila besonders gut, da die einzelnen Stadien eindeutig erkennbar sind und Syntheseleistungen den Zellstadien entsprechend zugeordnet werden können. Gezielte Spermatogenesedefekte sind somit sowohl morphologisch als auch molekular gut zu analysieren. Die Konserviertheit der genetischen Kontrolle in unterschiedlichen Organismen erlaubt Übertragungen auch auf die
menschliche Spermatogenese und gibt den Untersuchungen medizinische Relevanz.
3.1. Spermatogenese in Drosophila melanogaster
Eine sexuelle Reproduktion von diploiden Organismen setzt die Bildung haploider Gameten beider Geschlechter voraus. In der männlichen Keimbahn werden dabei aus einer
Spermatogonie 64 hoch spezialisierte Spermien differenziert, was unter dem Prozess der
Spermatogenese zusammengefasst wird. Die Differenzierung findet innerhalb der paarig
angelegten Hodenschläuche statt, welche von außen mit Muskel- und Pigmentzellen umhüllt sind. Die einzelnen Spermatogenesestadien werden im Inneren von somatischen
Stützzellen begleitet, reifen von der apikalen Hodenschlauchspitze nach basal und sind
damit chronologisch im Testis angeordnet (Abb. 3-1). Die gesamte Spermatogenese umfasst bei Drosophila bei 25°C etwa 10 Tage und verläuft nach dem Schlupf zeitlebens kontinuierlich. Somit sind in adulten Männchen permanent alle Stadien der Keimzellentwicklung in einem adulten Wildtyp-Hoden präsent.
An der apikalen Spitze befindet sich der Hub, welcher durch zwei Stammzellpopulationen
charakterisiert ist (hellblau in Abb. 3-1). Die Keimzellentwicklung wird durch parallel verlaufende asymmetrische Teilungen von zwei somatischen (Zystenvorläuferzellen) und
einer Keimzell-Stammzelle eingeleitet. Während sich die Tochterzellen differenzieren, behalten die Mutterzellen Stammzellcharakter bei und garantieren zeitlebens eine Keimzellund Zystenzell-Produktion. Die somatischen Tochterzellen bilden zwei Zystenzellen, welche das diploide Spermatogonium umhüllen und so eine Zyste bilden (nicht abgebildet).
Einleitung
5
Die beiden Zystenzellen sind nach der Meiose in eine Kopf- und eine Schwanzzystenzelle
polarisiert. Innerhalb der Zyste durchläuft die gonadale Zelle drei Entwicklungsphasen
(Proliferation, Meiose und Differenzierung), bis schließlich 64 haploide Gameten (Spermatozoa) entstanden sind. Die Zellteilungen innerhalb einer Zyste verlaufen stets synchron
und die Keimzellen sind für den gesamten Entwicklungsprozess bis zur Individualisierung
durch inkomplette Zellteilungen (Zytokinese) miteinander verbunden (zusammengefasst in
Lindsley und Tokuyasu, 1980).
apikales Ende
basales Ende
Stammzellen
elongierte
Spermatiden
proximales Ende
distales Ende
Spermatogonien
elongierende
Spermatiden
Spermatozyten
Abbildung 3-1: Schematische Darstellung der Spermatogenesestadien in einem adulten Drosophila-Testis.
Die einzelnen Spermatogenesestadien sind chronologisch in dem Testis eines adulten Tiers arrangiert und farblich voneinander hervorgehoben. Die elongierten und polarisierten Spermatiden sind mit
dem proximalen Ende, an dem sich der der Nukleus befindet, im basalen Bereich des Hodens lokalisiert und das distale Ende ist nach der Elongation im apikalen Ende des Hodenschlauchs gelegen.
Modifiziert nach Xu et al., 2012.
Die erste Phase der Spermatogenese umfasst vier mitotische Teilungen der Spermatogonien (grün), sodass daraus 16 primäre Spermatozyten resultieren. Diese rundlichen
Zellen werden aufgrund einer hohen Transkriptionsaktivität in ihrem Volumen stark vergrößert (orange). Dieser Phase schließt sich die Reduktionsteilung (Meiose) an, welche in
zwei meiotische Teilungen gegliedert ist und 64 haploide Spermatiden liefern (rot). In dieser Entwicklungsperiode kommt die Transkriptionsaktivität zum Erliegen und das Zellvolumen wird verringert. Allerdings ist ein posttranskriptionelles Programm aktiviert, welches
6
Einleitung
die synthetisierten mRNAs stabilisiert und deren Translation bis zum gegebenen Zeitpunkt
reprimiert (Fuller et al., 1995). Im Anschluss an die meiotischen Zellteilungen erfolgt ein
umfangreicher Umbau der Zellmorphologie, welcher als Spermiogenese definiert ist und
etwa 5 Tage andauert (zusammengefasst in Lindsley und Tokuyasu, 1980). Während dieser Phase fusionieren beispielsweise die beiden Mitochondrienderivate (major und minor)
zu dem sogenannten Nebenkern, wobei dem Genprodukt von Fuzzy onion eine essentielle Funktion zugeschrieben wird (Fuller, 1993). In einer neueren Untersuchung konnten
aufgrund von Mutationen sowohl den beiden Proteinen Milton und Miro als auch den potentiellen Mikrotubuli-Linkern Nebbish und Fascetto eine wichtige Rolle für die Verlängerung des Spermatidenendes zugeschrieben werden (Noguchi et al., 2011).
Im Anschluss an die Meiose erfolgt eine Verlängerung der Spermatidenschwänze (Elongation), wobei gleichzeitig die Ausbildung des Flagellums stattfindet (Fuller, 1998). Dieses
verlängert sich nach apikal, wodurch sowohl die Zystenzellen als auch Spermien eine Polarität erhalten (Xu et al., 2014). Mittig des Flagellums ist das Axonem angeordnet, welches allseits von Membranen des Endoplasmatischen Retikulums (ERs) umgeben ist, die
die axonemale Scheide darstellen. Auch der Zellkern erfährt eine dramatische Änderung,
welche auf der starken Kompaktierung des Chromatins basiert. Dazu werden die DNAgebundenen Histone zunächst durch Transitionsproteine ausgetauscht und diese im Anschluss durch Protamine ersetzt. Der Zellkern hat dadurch seine runde Form in eine nadelförmige Struktur (vgl. Abb. 3-2) verändert (zusammengefasst in Rathke et al., 2007).
Der abschließende Prozess bei der Keimzelldifferenzierung ist die Individualisierung (Abb.
3-2), bei der die immer noch miteinander verbundenen Spermatiden voneinander separiert werden. Dazu müssen die bestehenden Zytoplasmabrücken geschlossen werden
und die einzelnen Spermien mit einer eigenen geschlossenen Membran umhüllt werden.
Dabei lagern sich um alle 64 Spermatidenkerne Aktin- und Myosinmoleküle an und bilden
zusammen eine charakteristische kegelartige Struktur aus, die sogenannten investment
cones (IC; Hicks et al., 1999). Dieser Komplex bewegt sich vom proximalen Ende (Kernregion) in distaler (Schwanzende) Richtung fort und streift überschüssiges Zytoplasmamaterial und Organellen in einer wachsenden Struktur (cystic bulge) über das Axonem ab.
Parallel wird auch die Zellmembran um die einzelnen Keimzellen remodelliert (Noguchi
und Miller, 2003). Dennoch sind die Spermien weiterhin in einem Spermatidenbündel
durch die zwei umhüllenden Zystenzellen angeordnet. Im Anschluss an die Individualisierung werden die einzelnen Spermien aufgeknäuelt, die Zystenzellen resorbiert und die
Spermien mit dem Zellkern voran in die Samenblase weitergeleitet.
Einleitung
7
Zellkern
Aktinkegel
Myosin VI
Zytoplasma und
Organellen
cystic bulge
Axonem
Schwanzende
Abbildung 3-2: Schematische Darstellung der Individualisierung der Spermatiden.
Die Individualisierung erfolgt am Ende der Spermiogenese und dient dazu, die durch Zytoplasmabrücken
verbundenen Spermatiden innerhalb eines Bündels in
individuelle Spermien zu trennen. Der lange Pfeil gibt
die Richtung (von proximal nach distal) an, in welcher
der cystic bulge die überschüssigen Zytoplasma- und
Organellenbestandteile abstreift. Modifiziert nach Isaji
et al., 2011.
3.2. Translationskontrolle in der Drosophila-Spermatogenese
Eine Voraussetzung für die Entstehung eines differenzierten Organismus ist die Koordination der Genexpression zu spezifischen Zeitpunkten und in bestimmten Geweben während der Entwicklung. Bereits Ende des 20. Jahrhunderts erkannten Forscher, dass in einigen Spezies die RNA-Synthese vieler Transkripte bereits in Embryonen stattfindet, deren Translation jedoch erst zu bestimmten Zeitpunkten in der Entwicklung erfolgt (zusammengefasst in Davidson, 1986). Eine Zusammenfassung neuerer Analysen mit Drosophila zeigt, dass der Mechanismus der Translationskontrolle auch zunehmend in diesem Modellorganismus analysiert wird (Wilhelm und Simbert, 2005). Dabei sind beispielsweise
translationsinitiierenden Faktoren wie das cytoplasmic polyadenylation element (CPE)
bekannt, welches bei der Verlängerung des Poly(A)-Endes aktiv ist, und den stem-loop
Faktoren, die unter anderem bei dem Transport und der Translation der oskar-mRNA involviert sind (Jambor et al., 2014). Auch in der Drosophila-Spermatogenese konnten für
einige Transkripte komplexe Faktoren beschrieben werden, die die prämeiotisch transkribierten RNAs mit diversen Proteinen kompaktieren und somit einen reprimierenden RNP
(Ribonukleoprotein)-Komplex bilden (Zusammenfassung in Preiss, 2000).
3.3. cis-wirkende Faktoren in RNP-Komplexen
Seit Ende des letzten Jahrhunderts wurden immer mehr cis-wirkende Faktoren in den 3'
und 5' untranslated regions (UTRs) von mRNAs entdeckt (Zusammenfassungen in Mignone et al., 2002; Jansen und Niessing, 2012). Durch diese Ribonukleoprotein (RNP)Verbindungen werden nicht nur die mRNA-Prozessierungen im Zellkern (Anbringen des
5'-Caps, das Spleißen, das Editing, Verlängerung des Poly(A)-Endes), sondern auch die
8
Einleitung
Stabilität, der Transport ins Zytoplasma und die Translation am Bestimmungsort dieser
Transkripte organisiert (Zusammenfassungen in Wilhelm und Simbert, 2005; Abaza und
Gebauer, 2012). Für die Translation konnten von einigen Arbeitsgruppen sowohl reprimierende als auch initiierende Komplexe dokumentiert werden. Die Basis für eine solche
Regulation wird durch spezifische Sequenzelemente und durch die Bindung von Interaktionspartnern beispielsweise über RRM (RNA-recognition motifs)-Domänen vermittelt. Modifikationen, wie Phosphorylierung an den Bindeproteinen, führen häufig zu Konformationsänderungen mit denen auch ihre inhibierende Wirkung in eine aktivierende Wirkung
wechselt. Beispiele für cis-regulierende Signale repräsentieren auch die beiden Sequenzelemente TCE (siehe 3.3.1.) und CPE (siehe 3.3.2.).
3.3.1. Das translational control element (TCE)
Die ersten Hinweise eines translationskontrollierenden Elements in der Drosophila-Spermatogenese wurden anhand des Gens Mst87F (male-specific transcript) erhalten (Kuhn
et al., 1988). Weiterführende Analysen konnten das cis-regulierende Element auf 12 Nukleotide einschränken (Schäfer et al., 1990). Gleichzeitig zeigten die Autoren, dass die
Einleitung der Translation von einer sekundären Polyadenylierung der betreffenden RNA
begleitet wird. Darüber hinaus konnte für das TCE zum ersten Mal eine duale Funktion
nachgewiesen werden, da es sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene
aktiv ist (Kempe et al., 1993).
Die Rolle der negativen Translationkontrolle verleiht dem translational control element
(TCE) seinen Namen (Schäfer et al., 1990). Durch Sequenzvergleiche konnte die Konsensussequenz (ACATCNAAATTT) auf 12 Nukleotide eingeschränkt werden und ist innerhalb
der Genfamilie im 5'UTR an Position +28 ab dem Transkriptionsstart konserviert (Zusammenfassung in Schäfer et al., 1995). Das beschriebene Element vermittelt negative
Translationskontrolle innerhalb der Drosophila-Spermatogenese in allen Mitgliedern der
Mst(3)CGP-Genfamilie. Alle resultierenden Proteine dieser Genfamilie besitzen eine große Anzahl an kurzen repetitiven Aminosäuremotiven aus Cystein, Glycin und Prolin
(CGP). Innerhalb dieser Familie sind die Proteine anhand der Verteilung dieser CGP-Motive und der Genstruktur (Intron-Exon-Sequenzen) in zwei Untergruppen unterscheidbar.
Fünf kleine Gene, zu denen das Mst87F zählt, besitzen ein Intron und kodieren ein Protein, bei dem die CGP-Motive über das gesamte Protein verteilt vorliegen. Im Gegensatz
dazu weisen die anderen beiden Gene (Mst98Ca und Mst98Cb) keine Introns auf und die
repetitiven Motive sind auf den C-Terminus konzentriert. Diese Proteine finden sich gleichermaßen in den outer dense fibres der Säuger-Spermien (Baccetti et al., 1973) und sind
dort für die Flexibilität des Spermienschwanzes wichtig (Haidl et al., 1991).
Einleitung
9
Eine neuere Studie konnte mittels Co-Immunopräzipitation (Co-IP) und anschließender
Massenspektrometrie einige Proteine identifizieren, die das Sequenzelement binden
(Stinski, 2011). Aufgrund einer Fülle von Analysen wurde schließlich ein Modell für die
Komplexbildung am TCE der mst87F-mRNA hergeleitet (Abb. 3-3).
Auf RNA-Ebene interagiert das TCE mit diversen Proteinen (trans-Faktoren), wodurch die
Translation verhindert wird. Erst nachdem die Spermatiden vollständig elongiert sind, findet die Synthese der Mst(3)-CGP-Proteine statt. Somit besitzt das TCE sowohl eine reprimierende (Abb. 3-3, A) als auch eine initiierende (Abb. 3-3, B) Konformation, die vermutlich durch Phosphorylierungen hervorgerufen wird. Durch diese Konformationsänderung
werden weitere Proteine rekrutiert oder dissoziieren aus dem Komplex. Die Translation
wird zeitgleich mit der sekundären Polyadenylierung der mst87F-mRNA eingeleitet, bevor
die Proteine am Ende der Spermatogenese synthetisiert werden können.
A
Translationsrepression
B
Translationsinitiation
Abbildung 3-3: Schematische Darstellung des dynamischen mst87F-RNP-Komplexes.
Exu (rosa), dFMR1 (blau), CG3213 (ocker), CG1898 (braun), CG12470 (türkis), Orb2 (hellgrün), Poe
(grün): Proteine des hypothetischen Regulationsmodells von mst87F (schwarze Linie), die die reprimierende (A) bzw. die aktivierende (B) Komplexformation repräsentieren. eIF4C/eIF4E/eIF4G: Eukaryotic translation initiation factors (grau). TCE: Translational control element (rot). P: Postulierte Phosphorylierungsstellen. Pacmen: Exonukleasen. PABP: Poly(A)-binding protein (grau). Schwarze Linie: mst87F-mRNA mit
RNA 7-methylguanosine cap am 5'UTR (schwarzer Halbkreis) und Poly(A)-Ende. Modifiziert nach Stinski,
2011.
Neben den eukaryotischen Initiationsfaktoren konnten an der mst87F-mRNA auch Proteine aus anderen translationskontrollierenden RNP-Komplexen identifiziert werden. Eine
direkte Wechselwirkung mit der TCE-Sequenz konnte mit dem RNA-Bindeprotein dFMR1
(fragile X mental retardation protein 1) gezeigt werden. In einer aktuellen Publikation wurde eine Interaktion zwischen dFMR1 und dem Argonautenprotein Aubergine gezeigt, wodurch die Autoren für dFMR1 eine zentrale Rolle in dem piRNA-Signalweg schlussfolgern
(Bozzetti et al., 2015). Für den Kandidaten Poe (Purity of essence) konnte gezeigt werden, dass er für die sekundäre Polyadenylierung der mst87F-RNA essentiell ist (Stinski,
10
Einleitung
2011). Von Exuperantia ist bereits seit längerer Zeit bekannt, dass es ein RNA-Bindeprotein repräsentiert, welches stabilisierende Wirkungen auf viele Transkripte ausübt (Wang
und Hazelrigg, 1994). Das letzte in Veröffentlichungen erwähnte Protein des mst87FRNP-Komplexes ist das Orb2. Zum einen konnte in der Untersuchung von Xu et al. (2012)
gezeigt werden, dass es für die Meiose in der Drosophila-Spermatogenese benötigt wird.
Zum anderen weisen die Autoren auch auf dessen bekannte stimulierende Wirkung in der
sekundären Polyadenylierung hin, die auch in anderen Untersuchungen erwähnt wird (Kelemann et al., 2007; Xu et al., 2014). Über die Kandidaten CG3213, CG12470 und
CG1898 sind in der Literatur bislang keine Hinweise auf deren Domänen und Funktionen
vorhanden und somit konnten sie in der Dissertation von Stinski (2011) erstmals als Interaktionspartner dokumentiert werden.
3.3.2. Das cytoplasmic polyadenylation element (CPE)
Schon seit geraumer Zeit wird in der Literatur die Stabilität der mRNA und die anschließende Einleitung der Translation mit dem cis-regulierenden Sequenzsignal cytoplasmic polyadenylation element (CPE) in Verbindung gebracht (Paris und Richter, 1990; Zusammenfassungen in Preiss, 2000; Richter, 2007). Das erste CPE-Element wurde in dem
3'UTR der g10-mRNA entdeckt, die in der Xenopus-Oozyte transkribiert wird (McGrew
und Richter, 1990). Dem folgte eine Dokumentation über einen interagierenden trans-Faktor an diese CPE-Sequenz, welcher als cytoplasmic polyadenylation element binding protein (CPEB) beschrieben wurde (McGrew und Richter, 1990). Aufgrund von Shift-Analysen wurde somit erstmals eine Interaktion zwischen einem CPE-Element und einem direkten Proteinbindepartner dokumentiert. Im Weiteren erkannten die Autoren einen Zusammenhang zwischen dieser RNA-Protein-Interaktion und der Verlängerung des Poly(A)-Endes, da eine Punktmutation innerhalb der CPE-Sequenz in der g10-mRNA keine Polyadenylierung des Poly(A)-Endes zuließ.
In vielen Organismen konnte ein Zusammenhang zwischen der Translationseffizienz und
einer sekundären Verlängerung des Poly(A)-Endes abgeleitet werden (Zusammenfassungen Preiss, 2000; Jacobson, 2009). Außerdem konnte bereits die Funktion des transagierenden Faktors detaillierter analysiert werden (Mendez und Richter, 2001; Wilhelm
und Simbert, 2005). Demnach hat das CPEB sowohl eine initiierende als auch eine reprimierende Wirkung, welche vom Phosphorylierungsstatus des CPEB-Proteins abhängt
(Abb. 3-4).
Einleitung
A
Translationsrepression
11
B
Translationsinitiation
Abbildung 3-4: Schematische Darstellung der CPEB-vermittelten Translationskontrolle.
Die Größenunterschiede bezüglich des 5'UTRs zwischen A und B sind von dem Zeichner nur aus darstellungstechnischen Gründen erfolgt und sind für die sekundäre Polyadenylierung bedeutungslos.
ORF: Open reading frame (hellrot). CPEB: CPE-binding protein (gelb). Maskin: CPEB und 4E-interagierendes Brückenprotein (blau). CPSF: Cleavage and polyadenylation specificity factor (lila). PAP: Poly(A)-Polymerase (rot). PABP: Poly(A)-binding protein (gelb). 4E/4G: Eukaryotic translation initiation factors (grün). 3:
Eukaryotic translation initiation factor 3 (blau). Cap: RNA 7-methylguanosine Kappe am 5'UTR (rosa).
UUUUAU: CPE-Konsensussequenz. AAUAAA: Hexanukleotid-Signal, welches für die 3'Prozessierung und
Polyadenylierung der prä-mRNA essentiell ist. P: Phosphorylierungsstelle. 40S: Ribosomale Untereinheit.
Modifiziert nach Mendez und Richter, 2001.
Der reprimierende Komplex (A) wird gebildet, wenn das CPEB durch seine RRM-Domäne
spezifisch an die uridin-reiche CPE-Sequenz gebunden hat. In unphosphoryliertem Zustand rekrutiert das CPEB den eIF4E-Bindepartner Maskin, wodurch die Translation verhindert wird. Im Anschluss einer Phosphorylierung (B) des CPEBs findet eine Konformationsänderung des Komplexes statt, woraufhin das CPEB zwei Enzyme, den cleavage
and polyadenylation specificity factor (CPSF) und die Poly(A)-Polymerase (PAP), an den
3'UTR rekurtiert. Letztere synthetisiert das verlängerte Poly(A)-Ende, welches mit einer
hohen Anzahl an Poly(A)-Bindeproteinen (PABP) korreliert. Diese PABPs binden das Poly(A)-Ende und das Cap-Bindeprotein eIF4G gleichzeitig, wodurch die beiden mRNA-Enden zu einer pseudozirkulären Struktur verbunden werden. Schließlich wird durch die Kooperation der beiden mRNA-Enden eine Verbindung hergestellt, wodurch die Translation
eingeleitet werden kann.
Anschließende Forschungen ergaben, dass es sich bei dem CPE-Element um eine hoch
konservierte Abfolge handelt, die mit RNA-Bindeproteinen kooperiert, welche üblicherweise zwei RRM-Domänen und eine Zinkfinger (ZF)-Domäne aufweisen (Zusammenfassungen in Mendez und Richter, 2001; Charlesworth et al., 2004). Dieser Mechanismus wurde
auch in weiteren Organismen von Wirbellosen (C.elegans, Drosophila) bis hin zu Vertebraten (Nagetiere, Menschen) identifiziert (Zusammenfassung in Charlesworth, 2004). In
Drosophila konnte im Jahr 1992 das Gen Orb als CPEB-Homolog beschrieben werden
(Lantz et al.), welches mit dem Xenopus-CPEB eine Sequenzhomologie von 62% aufweist (Zusammenfassung in Hake und Richter, 1994). Weiterhin wird diesem Gen eine
regulierende Rolle in der weiblichen Keimbahn zugeschrieben. Auch in der männlichen
12
Einleitung
Drosophila-Keimbahn wurde ein Gen entdeckt, welches für ein Protein mit zwei RRM-Domänen und einer ZF-Domäne kodiert. Aufgrund der Sequenzähnlichkeit zu Orb wurde
dieses Gen Orb2 (CG43782) genannt. In Drosophila wurde es bereits als eine Komponente des mst87F-Komplexes identifiziert (siehe 3.3.1.). In der Fruchtfliege existieren zwei
Orb2-Proteinvarianten (551 kDa und 704 kDa), die beide jeweils die zwei RRM-Domänen
und die ZF-Domäne beinhalten. Der Längenunterschied ist auf den N-Terminus begrenzt,
in dem bis heute keine funktionellen Domänen identifiziert wurden. In einer Dissertation
konnte ein direkter Zusammenhang zwischen dem Drosophila-Orb2 und der Translation
von Protaminen hergestellt werden, da in Orb2-mutanten Organen eine verfrühte Protamin-Expression erfolgt (Starck, 2007). Neuere Analysen deuten immer häufiger auf eine
essentielle Rolle von Orb2 in der männlichen Keimzellentwicklung hin. Durch weitere Untersuchungen von Orb2-mutanten Testes konnte diesem CPEB eine Bedeutung für die
Meiose, der Elongation der Flagellen und des korrekten Ablaufs der postmeiotischen Genexpression zugeschrieben werden (Xu et al., 2012). Ergänzend wurde in einer Publikation
Orb2 als ein wichtiger Regulator für die Polarisierung der Zystenzellen, welche die Spermatiden umhüllen, dokumentiert (Xu et al., 2014).
Dass es sich bei diesem CPEB um ein vielschichtiges Protein handelt, wird auch durch
parallele Untersuchungsreihen im Nervensystems verdeutlicht. Seit längerem belegen
diverse Studien, dass Orb2 auch Einfluss auf das Erinnerungsvermögen der Fruchtfliege
nimmt (Keleman et al., 2007; White-Grindley et al., 2014). Für die Voraussetzung einer
funktionsfähigen Langzeiterinnerung scheint der glutaminreiche N-Terminus der großen
Orb2-Variante entscheidend zu sein (Keleman et al., 2007). Im Weiteren wurde auch im
Nervensystem ein Orb2-Komplex dokumentiert, der die Proteinphosphatase 2A (PP2A),
den Transducer von Erb-B2 (Tob) und die Lim-Kinase beinhaltet. Während PP2A einen
unphosphorylierten und somit zugleich einen instabilen Zustand von Orb2 vermittelt, wird
durch die phosphorylierenden Faktoren Tob und LimK ein gegenteiliger Effekt auf das
CPEB ausgeübt. Das Zusammenspiel von Tob und Orb2 ist besonders gut im Nervensystem dokumentiert, wobei die Aktivität von Tob für ein stabiles Erinnerungsvermögen sorgt
(Robinson, 2014; White-Grindley et al., 2014). Somit konnte erstmals eine direkte Interaktion zwischen Orb2 und Tob belegt werden, die bereits aufgrund eines two-hybridscreens in Drosophila vermutet wurde (Giot et al., 2003).
3.3.3. Tob – ein Interaktionspartner von Orb2
In der Literatur ist Tob der Tob/BTG-Genfamilie zugeordnet. Proteine dieser Gruppe weisen ein gemeinsames N-terminales Motiv auf, welches die Zellproliferation hemmt, wodurch diese Genfamilie auch als Antiproliferations-Protein-Familie bezeichnet wird. Das
Einleitung
13
Genom der Vertebraten (beispielsweise Mammalia, Aves und Amphibia) beinhaltet zwei
Tob-Gene, während in Invertebraten bislang nur ein Tob-verwandtes Gen annotiert wurde
(zusammengefasst in Jia und Meng, 2007).
In einer Dissertation (Starck, 2007) konnte erstmals gezeigt werden, dass das DrosophilaTob (CG9214) auch in der männlichen Keimbahn aktiv ist. Dies wird auch durch morphologische Befunde in Tob-antisense-Testes bestätigt, die zwar alle Keimzellstadien ausbilden, jedoch steril sind. Ein vergleichbares Ergebnis erzielte der Autor mit der Orb2-antisense-Linie. Im Weiteren konnte mittels in situ-Hybridisierung einer tob-Sonde auf Orb2mutante Testes eine Veränderung in der RNA-Lokalisierung von Tob dokumentiert werden, was auf ein Mitwirken von Orb2 bei der Lokalisierung oder der Stabilität der tobmRNA schließen lässt. Auch die beobachteten Fluoreszenzmuster in dieser Studie deuten
auf eine Koexpression in den Flagellen der elongierten Spermatiden hin. Dies ist zumindest für Tob überraschend, da es eine NLS (nuclear localization signal)-Sequenz besitzt.
Allerdings konnte die Lokalisierung dieser Proteine in Invertebraten bislang nicht geklärt
werden (Jia und Meng, 2007).
3.4. Zielsetzung dieser Dissertation
Basierend auf Protein- und RNA-Analysen konnte an dem TCE der mst87F-mRNA ein dynamischer translationkontrollierender RNP-Komplex in einem Modell dargestellt werden
(Stinski, 2011). Diese erste Zusammenstellung soll durch weiterführende Bindungsanalysen einzelner Kandidatenproteine bestätigt oder modifiziert werden. Hierfür wird das Protein Orb2 ausgewählt, welches an dem regulatorischen Element CPE bindet (zusammengefasst in Richter, 2007). Von diesem wurde bereits ein Expressionsklon hergestellt, jedoch konnte das Protein nicht in Lösung gebracht werden (Starck, 2007). Es gelang lediglich mit einem Orb2-Teilprotein eine Bindung an das TCE nachzuweisen (Stinski, 2011). In
der vorliegenden Studie sollen neue Bedingungen zur Aufreinigung des gesamten rekombinanten Orb2-Proteins getestet werden. Als zusätzliches Komplexprotein soll CG3213
unter den gleichen Bedingungen exprimiert werden, da es während des gesamten Regulationsprozesses vorhanden ist und damit für die reprimierende und aktivierende Funktion
essentiell sein könnte.
Es wird erwartet, dass die Komplexbildung innerhalb der gesamten Genfamilie konserviert
ist. Einzelne Komponenten könnten sich aber an unterschiedlichen Genmitgliedern anders
verhalten, beispielsweise zur individuellen Kontrolle des Aktivierungszeitpunktes. Dieser
Frage soll anhand von Bindungsstudien mit dem Orb2-Protein nachgegangen werden.
Von vielen enzymatischen Prozessen ist bekannt, dass sie in der Zelle in speziellen Organellen oder Strukturen wie den p-bodies ablaufen (Eulelio et al., 2007). Dies könnte auch
14
Einleitung
für die Translationskontrolle in der Spermatogenese der Fall sein, da sie dort in starkem
Ausmaß stattfindet. Eine Gegenüberstellung der Verteilung einzelner Proteine sollte dies
erkennen lassen. Hierzu muss die Fluoreszenz der beiden Proteine unterschiedlich sein.
Deswegen soll ein permanent präsentes Protein aus dem Komplex, beispielsweise
CG3213, mit RFP fusioniert werden, damit es für möglichst viele GFP-markierte Proteine
zum Vergleich herangezogen werden kann.
Aus der Literatur ist das Orb2-homologe CPEB als Bindeprotein am CPE bekannt. In einer vorangegangenen Dissertation wurde auch in Drosophila eine Wirkung von Orb2 auf
die protamin-mRNAs beobachtet, welche solche CPE-Sequenzen enthalten. Deswegen
soll das rekombinant hergestellte Orb2-Protein auch in Bindungsstudien mit diesen Transkripten untersucht werden. Dabei stellt sich vor allem die Frage, ob die Präsenz von einem, bzw. zweier solcher Elemente die Bindungseigenschaften beeinflusst.
Aus Untersuchungen Dritter ist eine Interaktion des CPEB mit Tob in Neuronen bekannt
(White-Grindley et al., 2014), welche generell bereits von Giot et al. (2003) vermutet wurde. Ein Einfluss von Orb2 auf die tob-mRNA-Lokalisierung während der Drosophila-Spermatogenese wurde bereits nachgewiesen (Starck, 2007). Ob darüber hinaus auch eine
Wechselwirkung auf Proteinebene stattfinden kann, soll zunächst in einer Kolokalisationsstudie überprüft werden.
Ergebnisse
15
4. Ergebnisse
Die identifizierten Proteine des mst87F-RNP-Komplexes wurden nach den bisherigen Ergebnissen in einem Modell angeordnet, das als Ausgangssituation angenommen wird
(vgl. Abb. 3-3; nach Stinski, 2011). Es stellt sich zunächst die Frage, ob noch weitere Proteine in dieser Ribonukleoprotein (RNP)-Formation integriert sein könnten. Eine Durchsuchung der systematischen, genomweiten Zusammenstellung über Proteininteraktionen
(InterologFinder) ergab zwei neue Kandidaten < CG34404 und CG3727 > die beide mit
bereits charakterisierten Proteinen aus dem Multiproteinkomplex wechselwirken sollen.
Aufgrund dieser Hinweise wurde sowohl das Verteilungsmuster der beiden neuen Proteine untersucht als auch das RNA-Expressionsmuster ermittelt (im Anhang 8.1.1. und
8.1.2.). Da diese Experimente keine Hinweise für eine Bedeutung in der Spermatogenese
zeigten, wurde der Fokus auf die bereits bekannten Kandidaten gelegt.
4.1. Aufreinigung von rekombinantem Orb2 und Bindungsanalysen an dem TCE
In anfänglichen Experimenten erwies sich die Aufreinigung des Orb2-Proteins (siehe Klon
198 von Starck (2007) in Abb. 4-1) als schwierig und es konnte lediglich die Isolierung eines Orb2-Teilproteins (Klon 1397, Stinski, 2011) realisiert werden. Mit diesem Proteinbereich, der alle RNA-Bindemotive enthält, gelang es eine Bindung an die TCE-enthaltende
mst87F-RNA zu dokumentieren (Stinski, 2011). Aufgrund der gesteigerten Expertise und
der generellen Bedeutung der Protein-Protein-Interaktion an dem TCE für die Translationskontrolle wurde die Aufreinigung des vollständigen rekombinanten Proteins erneut
aufgegriffen.
4.1.1. Einfluss diverser Parameter auf die Löslichkeit von rekombinantem Orb2
In verschiedenen Studien wurden Expressionsparameter (Expressionsvektoren, Bakterienstämme, IPTG-Konzentration für die Induktion, Expressionszeit und -temperatur) getestet, die leider keine Löslichkeit des rekombinanten Orb2-Proteins zur Folge hatten
(Starck, 2007; Stinski, 2011). Einige Testreihen bezogen sich dabei auf das Konstrukt 198
(Starck, 2007), welches den gesamten Leserahmen für das Orb2-Protein in dem Expressionsvektor pET-41a(+) enthält (Abb. 4-1).
Um auszuschließen, dass der GST-Tag die Löslichkeit dieses Fusionsproteins verhindert,
wurde die Orb2-Gensequenz aus dem Konstrukt 198 in den pET21a(+)-Vektor, welcher
nur einen HIS-Tag kodiert, umkloniert (Klon Orb2 in pET-21a(+), persönliche Mitteilung
von C. Otto). Das Protein konnte auch in einer neuen Versuchsreihe (Expressionszeit und
-temperatur) nicht in den Überstand gebracht werden. Schließlich lieferte die Publikation
der Arbeitsgruppe Frangioni und Neel von 1992 einen Hinweis zur Steigerung der Löslich-
16
Ergebnisse
keit durch Zugabe von Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine). In einer Abschlussarbeit der Abteilung konnte durch eine Aufreinigung mit anderen rekombinanten Proteinen (Exuperantia und dFMR1) dokumentiert werden, dass die Sarkosylkonzentration im Binde-Waschpuffer (B/W), sowie im Elutionspuffer 0,25% (w/v) nicht übersteigen darf, da das Protein
ansonsten für Shift-Experimente aufgrund der irreversiblen Denaturierung nicht einsetzbar
wäre (Grebe, 2013). Aufgrund dieser Erkenntnis wurden die Orb2-Fusionsproteine aus
den Klonen 198 (Eigenarbeit) und Orb2 in pET-21a(+) (Durchführung von C. Otto) in parallelen Testreihen in sarkosylhaltigen Lysepuffern über ihre HIS-Tags aufgereinigt. Nach
dieser Durchführung gelang es erstmals Erfolge in der Löslichkeit von rekombinantem
Orb2 zu dokumentieren. Dabei zeigte sich jedoch auch, dass Orb2 aus dem pET-41a(+)Vektor verhältnismäßig stärker in Lösung gebracht werden kann, weshalb dieses rekombinante Orb2-Protein für zukünftige Aufreinigungen verwendet wurde. Dennoch war die
Ausbeute des Proteins im Anschluss einer Aufreinigung sehr gering, weshalb weitere Bedingungen für eine optimale Isolierung getestet wurden.
T7 ATG
T MCS
GST
TAA
Orb2
6H S
1000
8H
2000
3000
Abbildung 4-1: Schematische Darstellung des Konstruktes Orb2 in pET-41a(+) (HS 198).
Der Leserahmen von Orb2 wurde mit dem Primer-Paar CP-ORF1/CP-ORF4 amplifiziert und über die angehängten Schnittstellen Sac I und Hind III gerichtet in den pET-41a(+) Vektor inseriert (Starck, 2007).
Das endogene Stopcodon wurde durch den reverse primer (CP-ORF4) deletiert. Es wird ein 109,8 kDa
großes Fusionsprotein (1018 Aminosäuren) exprimiert. Orb2 ist N-terminal mit einem GST-Tag
(25,6 kDA), einem 6-fachen HIS-Tag (0,84 kDa), einem S-Tag (1,75 kDa, 15 AS), sowie C-terminal mit
einem 8-fachen His-Tag (1,1 kDa) fusioniert.
T7: Promotor (weiß). ATG: Startcodon. GST: GST-Tag (grün). H: HIS-Tag (rosa). T: Thrombinschnittstelle.
S: S-Tag (gelb). MCS: Multiple cloning site (schwarz). ORF: Open reading frame (lila). TAA: Stopcodon.
Maßstabsbalken: Länge des Konstruktes in Basenpaaren (bp). Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Da der Klon 198 sowohl einen GST- als auch zwei HIS-Marker kodiert (Abb. 4-1), wurde
zunächst die Aufreinigungseffizienz dieser beiden Tags durch Anwendung der Kitsysteme
MagneGSTTM und MagneHISTM (Promega) nach Herstellerangaben in unabhängigen Testreihen ermittelt, wobei die GST-Partikel das Protein effizienter banden und erfolgreicher
isolierten (Daten nicht gezeigt). Dennoch blieb die Ausbeute sehr gering. Zur Steigerung
des Proteinanteils wurde der Zellaufschluss sowohl mit STE-Puffer (nach Frangioni und
Neel, 1992) als auch mit konventionellen Puffern (Lysepuffer und Binde-Waschpuffer aus
dem MagneGSTTM Purification System Kit) durchgeführt. Die Änderungen des pH-Wertes
Ergebnisse
17
und der Sarkosylkonzentration waren zusätzliche Bedingungen, die getestet wurden. Weiterhin wurden auch unterschiedliche Bakterienvolumina und verschiedene Salzkomponenten (NaCl, Glutathion) im Elutionspuffer kombiniert und die Proteinausbeute untereinander
verglichen. Die bisher zur Aufreinigung von rekombinantem Orb2 (aus dem Klon 198) getesteten Parameter, mit denen eine verwendbare Proteinmenge erzeugt wurde, sind in
Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Variierte Parameter für die Aufreinigung des rekombinanten Orb2-Fusionsproteins.
Aufgelistet sind die getesteten Parameter, wobei die effizientesten Bedingungen grau hervorgehoben wurden.
Getestete Parameter
Veränderte Bedingungen
Bakterienvolumina
Lysepuffer
1 ml
2 ml
15 ml
STE-Puffer
B/W (Kit)
Lysepuffer (Kit)
0,25%
0,5%
1%
7,6
8
9
100 mM
500 mM
500 mM
100 mM
50 mM
100 mM
Sarkosyl (w/v) im Lysepuffer
pH-Werte (Tris/HCl)
Elutionspuffer: Natriumchlorid
Glutathion
Als Beispiel für eine Orb2-Aufreinigung aus 1 ml Bakterienvolumen ist in Abbildung 4-2 eine Testreihe mit verschiedenen Natrium- und Glutathionkonzentrationen im Elutionspuffer
dokumentiert. Die Lyse erfolgte mit dem STE-Puffer (mit Tris/HCl; pH = 7,6). Die eingesetzten Sarkosylkonzentrationen betrugen im Lysepuffer 0,5% (w/v) und in den folgenden
Puffern (B/W und Elutionspuffer) 0,25% Sarkosyl (w/v).
M
kDa
A: 100 mM NaCl, 100 mM Glutathion
P
M L
D W1 W2 W3 E1 E2
B: 500 mM NaCl, 50 mM Glutathion
M P
/ D W1 W2 W3 E1 E2
C: 500 mM NaCl, 100 mM Glutathion
M P L D W1 W2 W3 E1 E2
170
130
100
70
55
40
35
*
*
Abbildung 4-2: SDS-PAGE der verschiedenen Fraktionen einer Aufreinigung von Orb2-Fusionsportein.
Getestet wurden verschiedene Natrium- und Glutathionkombinationen (A/B/C). Als Referenz wurden jeweils
2 µl Marker (peqGOLD prestained Protein ladder IV) aufgetragen (M). Probenvolumen (Lysat+SDS-AP, 1:1):
10 µl. Die Visualisierung erfolgte mittels Coomassie Brillant Blue R250-Färbung. Die schwarzen Pfeile (←)
deuten auf die Höhe des rekombinanten Orb2-Fusionsproteins (109,8 kDa). Die schwarzen Sterne (*) deuten
auf die unspezifischen Proteinbanden hin.
M: Marker; P: Pellet; L: Lysat; D: Durchfluss; W1-W3: Waschfraktionen; E1-E2: Elutionsfraktionen.
Ein Vergleich der Pellet- (P) und Lysatfraktionen (L) zeigt, dass die zur Lyse (0,5%) und
Aufreinigung (0,25%) eingesetzten Sarkosylmengen das 109,8 kDa große Orb2-Fusions-
18
Ergebnisse
protein nur gering in Lösung bringen (P und L in A/C). Dennoch zeigen die Elutionsfraktionen, dass der lösliche Proteinanteil für eine erfolgreiche Aufreinigung ausreichend ist
(← in A/B/C). Weiterhin ist ersichtlich, dass die Elution mit 50 mM Glutathion in Kombination mit 500 mM NaCl am ergiebigsten ist (B), da unter diesen Bedingungen nur sehr wenig unspezifische Proteinbanden in Höhe von ca. 37 kDa zu erkennen sind, während eine
Erhöhung beider Komponenten im Elutionspuffer zur Anreicherung der unspezifischen
Produkte in den Elutionsfraktionen führt (* in C). Mit diesen ermittelten Parametern wurde
das Orb2-Fusionsprotein für Bindungsanalysen mit diversen Transkripten aufgereinigt.
4.1.2. Konstruktion einer neuen Mst87F-EMSA-Sonde
In früheren Veröffentlichungen wurden Bindungen an TCE-enthaltenden Sequenzen innerhalb der Mst(3)CGP-Genfamilie erzeugt (Schäfer et al., 1990; Stinski, 2011). Basierend auf den Resultaten der Veröffentlichung von Kempe et al. (1993) wurde im Rahmen
der Arbeit von Stinski (2011) ein Konstrukt erzeugt, welches 52 Nukleotide der TCE-enthaltenden 5'UTR-Region des mst87F-Transkripts beinhaltet (-5/+47). Nach erfolgreichen
Bindungsexperimenten mit Orb2-Teilprotein soll nun in der vorliegenden Studie die endogene Transkriptsequenz auf exakt 45 Nukleotide (+1/+45) verkürzt werden (Abb. 4-3) und
mit dem gesamten Orb2-Protein in einem electrophoretic mobility shift assay (EMSA) auf
eine Bindung hin untersucht werden.
+1
T7
MCS
+45
Mst87F TCE
MCS
Sp6
Xho I
#465
50
#466
100
150
200
Abbildung 4-3: Schematische Darstellung der EMSA-Sonde Mst87F in pGEM®-T (SB 964).
Die Gensequenz von Position +1 bis +45 ab dem Transkriptionsstart wurde mit dem Primer-Paar #465/
#466 auf Plasmid-DNA (Klon 4549; Stinski, 2011) in einem Taq-Pfu-Mix amplifiziert und das Fragment in
den pGEM®-T-Vektor inseriert. Die Verifizierung erfolgte durch eine Sequenzierung mit dem T7 Primer
(#334). Nach Linearisierung mit der Endonuklease Xho I und Transkription mit T7-RNA-Polymerase entsteht ein sense-Volllängentranskript von 95 nt (MCS: 50 nt, Mst87F-Gensequenz: 45 nt).
T7: Promotor (weiß). MCS: Multiple cloning site (schwarz). Mst87F: Mst87F-Gensequenz ab Transkriptionsstart (+1 bis +45, grün). TCE: Translational control element (rot). Sp6: Promotor (weiß). Maßstabsbalken: Länge des Konstruktes in Nukleotiden (nt). Die Primer sind in Lage und Orientierung durch
schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern (#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Die TCE-Sequenz mit flankierenden Bereichen wurde mit den Primern Mst87F forward
(#465) und Mst87F reverse (#466) auf dem Konstrukt 4549, welches die Genabfolge -5
Ergebnisse
19
bis +47 enthält (Stinski, 2011), amplifiziert und in den pGEM ®-T- Vektor einkloniert (Klon
SB 964, Abb. 4-3). Eine Verifizierung des konstruierten Plasmides erfolgte durch eine Sequenzierung (siehe 8.2.). Zur Erstellung des sense-Transkriptes (EMSA-Sonde) wird das
generierte Plasmid mit der Endonuklease Xho I linearisiert und anschließend mit der T7RNA-Polymerase transkribiert. Die Restriktionsschnittstelle an dem reverse primer (#466)
wurde dabei so gewählt, dass die Linearisierung des hergestellten Plasmides exakt an
Position +45 der mst87F-Sequenz erfolgt und die letzte Base des 3'-Endes der endogenen Transkriptsequenz entspricht. Als sense-Volllängentranskript wird ein 95 nt langes Fragment erzeugt, welches insgesamt 50 Nukleotide Vektorsequenz (MCS) und die 45
Nukleotide aus der 5'UTR-Region von mst87F enthält.
4.1.3. Bindungsanalysen mit Orb2 an dem TCE-enthaltenden mst87F (+1/+45)Transkript
In einem EMSA-Experiment wurde die verkürzte mst87F-Transkriptsequenz (+1/+45) mit
aufgereinigtem Orb2 inkubiert (Abb. 4-4, Spur 2). Zum Vergleich wurde in die erste Gelspur das in vitro-Transkript (IVT) ohne Zugabe von Proteinextrakt aufgetragen. Zusätzlich
wurde die RNA in separaten Ansätzen mit Hodenproteinextrakt (HPE) aus der Wildtyppopulation OreR (Spur 3) und der Orb2JO10-Defizienzlinie (Spur 4) auf das Bindeverhalten hin
untersucht. Die mutante Linie jump out 10 (Orb2JO10) wurde durch die Remobilisierung eines P-Elementes, welches im Intron zwischen Exon 1 und Exon 1b vom Orb2-Gen liegt,
erzeugt. Diese Deletion führt in den Männchen zu Sterilität, während die Weibchen unbetroffen zu sein scheinen. Northern-Analysen zeigten, dass in dieser Defizienzlinie nur das
Kleinere orb2-Transkript synthetisiert wird. Dadurch wurde angenommen, dass die Abwesenheit des größeren Transkriptes für die Sterilität der Männchen verantwortlich ist
(Starck, 2007).
Auffällig bei der durchgeführten Interaktionsstudie ist, dass sich in allen Proben, denen
Proteinextrakt zugegeben wurde, zwei Komplexbanden aufgetrennt haben, wobei die
obere Bande jeweils die markantere darstellt. Bei den Ansätzen mit den Hodenproteinextrakten wurden die beiden Shifts auf gleicher Höhe aufgetrennt (↔ in Spuren 3/4). Diese
könnten den drei Komplexbanden aus früheren dokumentierten Veröffentlichungen entsprechen (Schäfer et al., 1995), allerdings unter der Voraussetzung, dass hier die Auftrennung der oberen beiden dokumentierten Banden weniger gut erfolgte und hier in einer
gemeinsamen intensiveren Bande abgebildet wurden. Ein direkter Vergleich der beiden
hier aufgetrennten Shiftkomplexe zwischen den beiden HPE-enthaltenden Proben lässt
keinen Unterschied in ihrem Bindungsverhalten erkennen.
20
Ergebnisse
IVT mst87F*
Orb2
HPE Orb2
1
2
3
4
+
+
+
+
+
JO10
HPE OreR
+
+
Abbildung 4-4: Bindungsanalyse von rekombinantem Orb2 und radioaktiv-markiertem mst87F* (+1/+45).
1 d, -80°C
Die Komponenten der Ansätze sind oberhalb der Spuren angegeben. Das Molekulargewicht des rekombinanten Orb2 beträgt
109,8 kDa. Für die Bindungen wurden 2 µg
rekombinantes Protein oder HPE aus 20
Testes eingesetzt. Das in vito-Transkript
(IVT) ist 95 nt lang. Die Komplexe wurden
elektrophoretisch in einem nativen PAA-Gel
aufgetrennt und die radioaktiven Signale
mittels Autoradiographie für 1 d bei -80°C
visualisiert.
Bei der Bindungsstudie mit dem Orb2-Protein und der mst87F (+1/+45)-Transkriptsequenz ist die Ausbildung von zwei Komplexen überraschend, da bei einem Interaktionsansatz von einer RNA und einem Protein nur eine Bande entstehen sollte. Möglicherweise
könnte der obere Shift (←) den RNA-Protein-Komplex darstellen, während der untere (◄)
auf unspezifische Bindungen in dem Elutionspuffer zurückzuführen ist. Dennoch konnte
mit diesem EMSA eine Interaktion der spezifischen Transkriptsequenz mit dem vollständigen rekombinanten Orb2 dokumentiert werden.
Im Weiteren eröffnet sich die Frage, ob diese Bindung bei allen Mitgliedern der
Mst(3)CGP-Genfamilie beobachtet werden kann. Hierfür bietet sich das Gen Mst98Ca an,
bei dem bereits in früheren Arbeiten Interaktionen mit anderen Kandidaten des mst87FRNP-Komplexes gezeigt werden konnten (Grebe, 2013).
4.1.4. Konstruktion einer neuen Mst98Ca-EMSA-Sonde
Um eine Vergleichbarkeit von eventuellen Shiftkomplexen innerhalb der Mst(3)-CGP-Genfamilie zu ermöglichen, wurde zur Herstellung der Mst98Ca-Sonde (Klon SB 972, Abb. 45) die gleiche Klonierungsstrategie wie für das Konstrukt SB 964 angewandt (siehe 4.1.2.)
und durch eine Sequenzierung kontrolliert (8.2 im Anhang). Für die Herstellung der
EMSA-Sonde wird das Konstrukt SB 972 mit der Endonuklease Xba I linearisiert und anschließend mit der T7-RNA-Polymerase transkribiert. Als Volllängentranskript entsteht ein
95 nt langes Fragment, welches 50 nt Vektorsequenz (MCS) und 45 Nukleotide Mst98Ca-
Ergebnisse
21
Gensequenz enthält.
+1
T7
MCS
+45
Mst98Ca TCE
MCS
Sp6
Xba I
#467
50
#468
100
150
200
Abbildung 4-5: Schematische Darstellung der EMSA-Sonde Mst98Ca in pGEM®-T (SB 972).
Die Gensequenz von Position +1 bis +45 ab dem Transkriptionsstart wurde mit dem Primer-Paar #467/
#468 auf Plasmid-DNA (Klon 293; Rubel, 2009) in einem Taq-Pfu-Mix amplifiziert und das Fragment in
den pGEM®-T-Vektor inseriert. Die Verifizierung erfolgte durch eine Sequenzierung mit dem T7 Primer
(#334). Nach Linearisierung mit der Endonuklease Xba I und Transkription mit T7-RNA-Polymerase entsteht ein sense-Volllängentranskript von 95 nt (MCS: 50 nt, Mst98Ca-Gensequenz: 45 nt).
T7: Promotor (weiß). MCS: Multiple cloning site (schwarz). Mst98Ca: Mst98Ca-Gensequenz ab Transkriptionsstart (+1 bis +45, blau). TCE: Translational control element (rot). Sp6: Promotor (weiß). Maßstabsbalken: Länge des Konstruktes in Nukleotiden. Die Primer sind in Lage und Orientierung durch
schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern (#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
4.1.5. Orb2 bindet die TCE-Sequenz eines weiteren Mst(3)CGP-Genfamilienmitgliedes
Angelehnt an die EMSA-Studie mit mst87F (siehe 4.1.3.) wird die folgende Bindungsanalyse mit mst98Ca-RNA gleichermaßen durchgeführt. Für eine bessere Vergleichbarkeit
der Ergebnisse wird hierfür Orb2-Proteinextrakt aus derselben Aufreinigungsfraktion wie
zuvor verwendet.
Im Vergleich zu dem freien radioaktiv-markierten mst98Ca-Transkript (Abb. 4-6, Spur 1)
haben sich in dem Ansatz mit rekombinantem Orb2, ähnlich wie bei mst87F, zwei Shifts
ausgebildet (←/◄ in Spur 2). Jedoch kann hier kein klarer Unterschied in der Intensität
dieser beiden Komplexbanden beobachtet werden. Die Inkubation mit Hodenproteinextrakt (HPE) aus OreR lieferte ebenfalls ein sehr ähnliches Bandenmuster, welches den
zuvor dokumentierten Shifts in 4.1.3. sehr ähnelt. Weiterhin ist in dem Exponat ersichtlich,
dass in dem Bindungsansatz mit dem HPE aus Orb2JO10 keine eindeutigen Shifts entstanden sind, wie sie zuvor bei der Inkubation des mst87F-Transkripts beschrieben wurden. Es ist allenfalls eine schwache Bande im Gel zu erahnen, die etwas tiefer aufgetrennt ist als in dem Ansatz mit OreR-HPE (↔ in Spuren 3/4).
22
Ergebnisse
1
2
3
4
IVT mst98Ca* +
+
+
+
Orb2
+
HPE Orb2JO10
HPE OreR
+
+
4 d, -80°C
Abbildung 4-6: Bindungsanalyse
von rekombinantem Orb2 und radioaktiv-markiertem mst98Ca* (+1/
+45).
Die Komponenten der Ansätze sind
oberhalb der Spuren angegeben.
Das Molekulargewicht des rekombinanten Orb2 beträgt 109,8 kDa. Für
die Bindungen wurden 2 µg rekombinantes Protein oder HPE aus 20
Testes eingesetzt. Das in vitro-Transkript (IVT) ist 95 nt lang. Die Komplexe wurden elektrophoretisch in einem
nativen PAA-Gel aufgetrennt und die
radioaktiven Signale mittels Autoradiographie für 4 d bei -80°C visualisiert.
4.1.6. Hodenproteinextrakt von Orb2JO10 unterstützt nicht die Ausbildung der Shiftkomplexe
Zur Verifizierung der Ergebnisse aus 4.1.3. und 4.1.5. wurden die beiden EMSA-Analysen
und die Aufreinigung von rekombinantem Orb2 erneut unter denselben Bedingungen wie
zuvor durchgeführt (Abb. 4-7). An beiden mst(3)CGP-Transkriptsequenzen wurden die
zwei bereits beobachteten Komplexbanden erneut ausgebildet (Spuren 2/6). Jedoch haben sich im Fall von mst87F die Verhältnisse der Shift-Intensitäten verlagert, sodass nun
beide Komplexe anscheinend die gleiche Menge radioaktives Transkript gebunden haben.
Diese experimentelle Variabilität ist bei der Interaktion mit HPE aus Orb2JO10 deutlicher zu
erkennen. Dort sind nur geringe Bandensignale zu erahnen (↔ in Spuren 3/7). Somit ist
das Resultat mit dem HPE aus Orb2JO10 in diesem Experiment konsistenter, was vermuten
lässt, dass dem Orb2 für die Ausbildung der charakteristischen Komplexe, wie sie bei der
Inkubation mit OreR-HPE entstehen, eine essentielle Rolle zukommt. Die Interaktionsanalysen mit OreR-HPE hingegen sind in diesem Experiment unauffällig und zeigt erneut die
bisher beobachteten Bandenmuster (↔ in Spuren 4/8).
In einem weiteren Transkriptionsansatz wurden zusätzlich nur die 50 Nukleotide aus der
MCS des pGEM®-T -Vektors transkribiert, welche auch Bestandteil der beiden eingesetzten Sonden SB 964 und SB 972 sind (siehe Abb. 4-3 und 4-5), und ebenfalls mit Orb2
inkubiert (Spur 10). Durch diese Kontrolle soll eine unspezifische Bindung von Orb2 an
die Vektorsequenz ausgeschlossen werden. Falls also in diesem Reaktionsansatz kein
Shift entsteht, ist es wahrscheinlich, dass die beobachteten Interaktionen im Fall der bei-
Ergebnisse
23
den 95 Nukleotide langen radioaktiv markierten RNAs (mst87F- und mst98Ca) mit den
spezifischen RNA-Sequenzen erfolgten.
IVT mst87F*
IVT mst98Ca*
1
2
3
4
+
+
+
+
5
6
7
8
+
+
+
10
+
IVT pGEM -T*
+
®
Orb2
HPE Orb2JO10
HPE OreR
9
+
+
+
+
+
+
+
1 d, -80°C
+
4 d, -80°C
o/n, -80°C
Abbildung 4-7: Bindungsanalysen von rekombinantem Orb2 und radioaktiv-markiertem mst87F*
(+1/+45) oder mst98Ca* (+1/+45).
Die Komponenten der Ansätze sind oberhalb der Spuren angegeben. Das Molekulargewicht des rekombinanten Orb2 beträgt 109,8 kDa. Für die Bindungen wurden 2 µg rekombinantes Protein oder HPE aus 20 Testes
eingesetzt. Die in vitro-Transkripte (IVT) sind 95 nt (mst87F*, mst98Ca*) und 50 nt (pGEM®-T*) lang. Die
Komplexe wurden elektrophoretisch in einem nativen PAA-Gel aufgetrennt und die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie für 1 d (mst87F*), 4 d (mst98Ca*) und o/n (pGEM®-T*) bei -80°C visualisiert.
Im Vergleich des freien pGEM®-T-Transkripts ist deutlich zu sehen, dass sich kein Shift an
dieser Sequenz ausgebildet hat. Auch eine längere Exposition von 4 Tagen lieferte keinen
Hinweis auf eine Interaktion mit Orb2 (Daten nicht gezeigt), wodurch die Shifts auf eine
Bindung zwischen den TCE-Sequenzen aus den in vitro-Transkripten mst87F und
mst98Ca mit dem Orb2 basieren.
4.1.7. Die mst87F- und mst98Ca-Transkripte interagieren spezifisch mit Orb2
Um die Spezifität der zuvor beobachteten Interaktion an dem TCE-Motiv zu prüfen, soll eine Kompetition mit nicht-radioaktiver Vektorsequenz als unspezifischem Kompetitor erfolgen. Um auszuschließen, dass dabei aufgrund der Transkriptlänge eine unspezifische
Bindung in dem in vitro-Ansatz provoziert wird, soll das nicht-markierte Transkript exakt
die gleiche Nukleotidanzahl aufweisen wie die radioaktiven RNAs (95 nt). Dazu eignet
24
Ergebnisse
sich beispielsweise der pBS II KS-Vektor. Nach einer Linearisierung mit Xho I und anschließender Transkription mit der T7-RNA-Polymerase wird eine RNA der gewünschten
Länge synthetisiert. Damit das endgültige EMSA-Reaktionsvolumen identisch sein konnte,
wurden von dem Kompetitor 10 parallele Reaktionen angesetzt. Anschließend wurde die
RNA aufgereinigt und ankonzentriert (siehe 6.7.7.). Ein zusätzlicher radioaktiver Ansatz
fungierte als Positivkontrolle der in vitro-Synthese und zur Orientierung, auf welcher Höhe
im Gel das Transkript ausgeschnitten werden muss. Die mst87F- und mst98Ca-Transkripte wurden schließlich mit 1-fachem, 5-fachem und 50-fachem Überschuss an Vektorsequenz kompetiert (Abb. 4-8).
IVT mst87F*
IVT mst98Ca*
Orb2
Kompetitor
(pBS II KS)
1
2
3
4
+
+
+
+
0
+
1x
+
5x
+
50x
36 h, -80°C
5
6
7
8
+
+
+
1x
+
+
5x
+
+
50x
0
36 h, -80°C
Abbildung 4-8: Bindungsanalyse von rekombinantem Orb2 und radioaktiv-markierten
mst87F* (+1/+45)- oder mst98Ca* (+1/+45)-Transkripten in Kombination mit unmarkiertem pBS II KS-Vektortranskript als Kompetitor.
Die Komponenten der Ansätze sind oberhalb der Spuren angegeben. Das Molekulargewicht des rekombinanten Orb2 beträgt 109,8 kDa. Für die Bindungen wurden 2 µg rekombinantes Protein eingesetzt. Die in vitro-Transkripte (IVT) sind alle 95 nt lang. Die Komplexe
wurden elektrophoretisch in einem nativen PAA-Gel aufgetrennt und die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie für jeweils 36 h bei -80°C visualisiert.
Neben den freien Transkripten (Spuren 1/5) wurde jeweils ein Reaktionsansatz mit radioaktiv-markiertem in vitro-Transkript (IVT) und rekombinantem Orb2 aufgetragen (Spuren
2/6), um den Effekt der Kompetition zu beurteilen. Die Komplexbildung ist hierbei in beiden Fällen ähnlich. Es haben sich bei beiden Versuchsreihen zwei Banden gebildet, wobei die obere (→) jeweils etwas mehr radioaktives IVT enthielt. Bei 5-fachem Überschuss
Ergebnisse
25
des Kompetitors ist in beiden Experimenten sehr wenig radioaktives IVT aus dem Komplex verdrängt, da die Bandenintensität nur sehr unwesentlich abnimmt (Spuren 3/7).
Durch die Anwesenheit der unmarkierten Transkriptsequenz in 50-fachem Überschuss
bilden sich die meisten Komplexe mit der unmarkierten Kompetitor-RNA (Spuren 4/8), und
es verbleibt wenig Radioaktivität an den Komplexpositionen (→/►). Da die Bindungen
insgesamt schwächer sind als in den Experimenten zuvor (siehe 4.1.3. und 4.1.5.), kann
keine eindeutige Aussage über die Affinität der RNA-Protein-Komponenten in den Komplexen getroffen werden. Es ist denkbar, dass die Bindungseffizienz variiert, da für jedes
Experiment eine neue Proteinaufreinigung erfolgte.
4.1.8. mst87F und mst98Ca zeigen unterscheidbare Bindungseigenschaften
Es stellt sich die Frage, ob rekombinantes Orb2 die TCE-Sequenzen in den unterschiedlichen RNAs verschieden stark bindet. Wäre dies der Fall, dann müsste beispielsweise
mst98Ca von mst87F schneller verdrängt werden als in umgekehrter Kompetition (Abb. 49).
IVT mst87F*
IVT mst98Ca*
Orb2
Kompetitor
(mst98Ca in 2-5
1
2
3
4
5
+
+
+
+
+
6
7
8
9
10
+
+
+
+
+
+
+
1x
5x
50x
+
+
+
+
+
+
0
1x
5x
50x
0
(mst87F in 7-10)
o/n, -80°C
4 d, -80°C
Abbildung 4-9: Analyse der Bindungsspezifität von rekombinantem Orb2 mit radioaktiv-markierten
mst87F* (+1/+45)- oder mst98Ca* (+1/+45)-Transkripten in Kombination mit unmarkierter mst87Foder mst98Ca-RNA als TCE-haltigem Kompetitor.
Die Komponenten der Ansätze sind oberhalb der Spuren angegeben. Das Molekulargewicht des rekombinanten Orb2 beträgt 109,8 kDa. Für die Bindungen wurden 2 µg rekombinantes Protein eingesetzt. Die in
vitro-Transkripte (IVT) sind alle 95 nt lang. Die Komplexe wurden elektrophoretisch in einem nativen PAAGel aufgetrennt und die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie für o/n (mst98Ca*) und 4 d (mst87F*)
bei jeweils -80°C visualisiert.
26
Ergebnisse
Der Abbildung 4-9 ist deutlich zu entnehmen, dass die nicht-kompetierten Bindungsansätze mit Orb2 (Spuren 2/7) jeweils eine dominante Komplexbildung zeigen. Im Vergleich
zu den vorherigen EMSA-Experimenten sind in diesem Fall keine Hinweise auf einen
zweiten Shift zu erkennen. Durch Zugabe des Kompetitors in gleicher Menge ist bereits
eine deutliche Verdrängung der markierten RNA zu beobachten (→ in Spuren 3/8), wobei
der Effekt bei mst98Ca deutlicher ausfällt. Dies suggeriert, dass die Bindung an der TCEenthaltenden mst87F-Sequenz stärker ist als an mst98Ca, da bereits bei einem Verhältnis
1:1 von radioaktiver zu nicht-markierter RNA der Komplex im Fall von mst98Ca drastischer aus der RNP-Formation verdrängt wird (Spuren 3/8). Weiterhin ist in beiden Fällen ersichtlich, dass sich durch Erhöhung der unspezifischen Vektorsequenz zunehmend die
radioaktive RNA in eine untere Bande (► in Spuren 4/5 und 9/10) verdrängen lässt. Möglicherweise ist diese Bande mit der unteren Bande des vorherigen Experimentes vergleichbar (vgl. Abb. 4-8), die sich nur ausbildet, wenn der effektivere Bindungspartner verdrängt wird.
4.1.9. Bindungsanalysen weiterer Kandidaten des mst87F-RNP-Komplexes
Neben dem zuvor analysierten Orb2 wurden noch weitere Proteine als Kandidaten für die
Komplexbildung am TCE identifiziert (Stinski, 2011). In einem EMSA werden daher als
weitere Beispiele CG3213 und Exuperantia als komplette Proteine auf eine Bindung mit
dem mst87F (+1/+45)-Transkript hin untersucht. Um die Allgemeingültigkeit der Ergebnisse zu prüfen, wird auch hier die Interaktion dieser Proteine parallel an das mst98Ca (+1/
+45) -Transkript studiert. Exuperantia wurde im Rahmen einer früheren Arbeit (Stinski,
2011) in den pET-21a(+)-Expressionsvektor einkloniert, während die Gensequenz von
CG3213 in den Expressionsvektor pET-41a(+) eingebracht wurde. Für beide rekombinanten Proteine wurde ein Protokoll zur Aufreinigung etabliert (persönliche Mitteilung von C.
Otto). Als Negativkontrolle soll der leere Expressionsvektor pET-41a(+) dienen. Dieser
wurde parallel mit den erstellten Expressionsklonen transformiert und aufgereinigt. Somit
soll sichergestellt werden, dass das Eluat des Vektors die selben Pufferbedingungen wie
die Elutionsfraktionen der rekombinanten Fusionsproteine aufweist. Diese Kontrolle dient
der Überprüfung, ob bei der Aufreinigung unspezifische Proteine aus den Bakterien an die
Beads binden und eventuell ein Hintergrundsignal erzeugen. Das Ergebnis dieser EMSAAnalyse ist in Form eines Autoradiogramms in Abbildung 4-10 dokumentiert.
Mit diesem EMSA konnte erneut im Vergleich zu den freien Transkripten (Spuren 1/6) eine
Interaktion von Orb2 an den beiden TCE-Transkripten gezeigt werden (Spuren 2/7), jedoch schwächer als in den Studien zuvor. Bei dem Ansatz mit Exuperantia wurde in beiden Fällen lediglich eine sehr schwache Bande aufgetrennt (Spuren 3/8), welche aller-
Ergebnisse
27
dings nicht als Interaktion, sondern als Hintergrundreaktion gedeutet wird. Auch Stinski
(2011) gelang es in ihrer Arbeit nicht, eine direkte Bindung von Exu an TCE-Sequenzen zu
demonstrieren.
IVT mst87F*
IVT mst98Ca*
Orb2
Exu
CG3213
pET-41a(+)
1
2
3
4
5
+
+
+
+
+
+
+
6
7
8
9
10
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2 h, -80°C
+
2 h, -80°C
Abbildung 4-10: Bindungsanalysen von rekombinantem Orb2, Exuperantia und CG3213 mit radioaktiv-markierten mst87F* (+1/+45)- oder mst98Ca* (+1/+45)-Transkripten.
Die Komponenten der Ansätze sind oberhalb der Spuren angegeben. Die Molekulargewichte der Fusionsproteine betragen für Orb2 109,8 kDa, für Exu 86,7 kDa und für CG3213 110,3 kDa. Für die Bindungen wurden jeweils 2 µg rekombinantes Protein eingesetzt. Die in vitro-Transkripte (IVT) sind alle
95 nt lang. Die Komplexe wurden elektrophoretisch in einem nativen PAA-Gel aufgetrennt und die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie für jeweils 2 h bei -80°C visualisiert.
Erstaunlicherweise hat das rekombinante CG3213-Protein das meiste radioaktive IVT gebunden (Spuren 4/9). Da in dem Ansatz mit mst87F kein ungebundenes Transkript mehr
vorliegt, könnte dort sogar eine stärkere Affinität vermutet werden. Bei der Interaktion mit
dem Proteinextrakt des Leervektors (Spuren 5/10) haben beide Transkripte Komponenten
aus den Elutionsfraktionen gebunden, die aber relativ gesehen jeweils deutlich schwächere Shifts ausgebildet haben. Der Anteil an freiem IVT weist nämlich eine ähnliche Intensität auf wie in der Analyse mit Exu. Diese Reaktionen werden als Hintergrundphänomene
betrachtet, die deutlich geringer sind und nur auftreten wenn kein spezifisches Bindeprotein angeboten wird.
4.2. Weiterführende Analysen des mst87F-RNP-Komplexproteins CG3213
Wenn, wie durch die Bindungsstudien suggeriert, CG3213 eine zentrale Funktion für die
RNA-Bindung hat, wäre es essentiell, die Interaktion dieses Proteins mit anderen Kandi-
28
Ergebnisse
daten aus dem regulatorischen mst87F-Komplex zu untersuchen. Das Protein CG3213
wurde in einer vorherigen Dissertation mit eGFP fusioniert und dessen Expressionsmuster
in allen Spermatogenesestadien von Drosophila beobachtet (Stinski, 2011). Da dieses
Protein in allen Keimzellstadien präsent ist, eignet es sich auch von dieser Seite als Referenz in Kolokalisationsstudien mit anderen Kandidaten des RNP-Komplexes. Damit die
Kolokalisation mit den etablierten eGFP-Konstrukten erfolgen kann, wurde CG3213 mit
dem rot fluoreszierenden Proteinmarker mCherry fusioniert.
4.2.1. Herstellung des CG3213-mCherry-Fusionsproteins
Für die Kolokalisationsanalysen wurde ein neues Konstrukt hergestellt, bei dem die Cterminale eGFP-Sequenz gegen mCherry ausgetauscht wurde. Das fertige Plasmid (SB
625, Abbildung 4-11) wurde in w1118-Embryonen injiziert und mittels P-Element vermittelter
Keimbahntransformation (siehe 6.6.2.) in das Drosophila-Genom integriert.
+1
5'
Promotor
+2.216
ORF CG3213
mCherry
Age I
#265
Bgl II
#264
1000
2000
3000
Abbildung 4-11: Schematische Darstellung des Konstruktes CG3213-mCherry (SB 625).
Der Promotor (975 bp) und der angrenzende Teil der CG3213-mRNA (2.216 bp bestehend aus 5'UTR
und ORF) wurden mit den angehängten Schnittstellen Bgl II und Age I aus dem Konstrukt KS 4244
(CG3213 in p{UAST}g) ausgeschnitten und gerichtet in den p{UAST}mCherry-Vektor einkloniert. Das
endogene Stopcodon wurde durch den reverse primer (#265) deletiert. Der geneigene 3'UTR wurde
nicht mitkloniert. Es wird ein 103,6 kDa großes Fusionsprotein translatiert.
Age I, Bgl II: Für die Klonierung verwendete Restriktionsschnittstellen. Promotor: Flankierender Bereich,
welcher vermutlich alle regulatorischen Elemente enthält (schwarze Linie). 5': 5' UTR (untranslated
region, schwarz). ORF: Open reading frame. mCherry: Rot fluoreszierendes Protein (711 bp, 26,7 kDa,
rot). Maßstabsbalken: Länge des Konstrukts in Basenpaaren. Die Primer sind in Lage und Orientierung
durch schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern (#) beschriftet. Graphik
erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Es wurden die folgenden sechs transgenen Fliegenlinien etabliert, deren Integrationen
den angegebenen Chromosomen zugeordnet werden konnten: 12.1 (X-Chromosom),
12.2, 27.3, 27.5 (2. Chromosom), 13.7, 32.3 (3. Chromosom). Das CG3213-mCherry-Proteinmuster wurde anhand der Linie 625-27.5 mit dem grünen CG3213-Expressionsmuster
unter dem konfokalen Mikroskop überprüft (Abb. 4-12). Bei beiden Fluoreszenzproteinen
ist das Signal in den zuvor beschriebenen Partikeln (Stinskt, 2011), welche entlang der
Flagellen lokalisiert sind (→) zu beobachten. Weiterhin ist gemeinsam, dass beide fluoreszenzmarkierten CG3213-Proteine in den prämeiotischen Stadien schwach exprimiert sind
Ergebnisse
29
(►) und in den postmeiotischen Spermatogenesestadien (→) eine drastische Erhöhung
des Signals aufweisen. Durch das nachgewiesene identische Verteilungsmuster können
die CG3213-mCherry-Linien für die Kolokalisationsstudien eingesetzt werden.
A
B
Abbildung 4-12: Vergleich der
Signale
der
eGFPund
mCherry-fusionierten CG3213Proteine.
CG3213-eGFP
CG3213-mCherry
A/B: CLSM-Aufnahmen der Linien 4244-14.2 (P{w+, CG3213eGFP}/Sb (A) und 625-27.5
(P{w+, CG3213-mCherry}/CyO
(B). Die Maßstabsbalken wurden
mit ImageJ berechnet und eingefügt.
4.2.2. Die Proteinverteilung ist nicht durch den Fluoreszenzmarker beeinflusst
Im Vorfeld der Kolokalisationskreuzungen soll zunächst überprüft werden, ob das Fluoreszenzmuster von CG3213-mCherry mit dem beschriebenen Muster von CG3213-eGFP
auch im selben Tier identisch ist. Damit zusammenhängend wird kontrolliert, ob die
mCherry-Fusion zur Aggregatbildung neigt. Im Weiteren soll überprüft werden, ob beide
fluoreszenzmarkierten CG3213-Proteine in den identischen Spermatidenbündeln lokalisiert sind und auch ob im Anschluss einer Kreuzung im selben Tier das gleiche Verteilungsmuster auftritt. Somit wird auch eine Veränderung des Expressionsmusters durch
den Integrationsort ausgeschlossen. Dazu wurden die Linien 4244-14.2 (w1118/Y; P{w+,
CG3213-eGFP}/Sb) und 625-27.5 (w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO) miteinander
gekreuzt und der daraus resultierende Genotyp w1118/Y; P{w+, CG3213-eGFP}/+; P{w+,
CG3213-mCherry}/+ unter dem Photomikroskop (Axiophot) betrachtet (Abb. 4-13).
CG3213-eGFP
CG3213-mCherry
Merge
20 µm
Abbildung 4-13: Vergleich von Expression und subzellulärer Verteilung der CG3213-eGFP und
CG3213-mCherry Fusionsproteine des Genotyps w1118/Y; P{w+, CG3213-eGFP}/+; P{w+, CG3213mCherry}/+.
A/A': Photomikroskop-Aufnahmen mit Axiophot von CG3213-GFP (2 s) und CG3213-mCherry (2 s). Der
Maßstabsbalken wurde mit ImageJ berechnet und eingefügt.
30
Ergebnisse
Der überlagerten CLSM-Aufnahme ist deutlich zu entnehmen, dass beide Fusionsproteine
in denselben Spermatidenbündeln lokalisiert sind. Darüber hinaus sind die punktförmigen
Strukturen (→) ebenfalls identisch lokalisiert. Da schließlich die Fusionsproteine aus unabhängigen Klonierungen, Injektionen und somit folglich auch aus verschiedenen Integrationen resultieren, ist davon auszugehen, dass es sich hierbei um das tatsächliche Expressionsmuster von CG3213 handelt. Eine methodisch bedingte Aggregation der beiden
Fluoreszenzmarker war somit auszuschließen und die etablierten CG3213-mCherry-Fliegenlinien wurden für die Kolokalisationsanalysen verwendet.
4.2.3. CG1898-eGFP kolokalisiert prämeiotisch partiell mit CG3213-mCherry
Für diese Studie wurden die Linien CG1898-eGFP-15.1 (w1118/Y; P{w+, CG3213-eGFP}/
CyO) und 625-13.7 (w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/Sb) miteinander gekreuzt und der
daraus resultierende Genotyp w1118/Y; P{w+, CG1898-eGFP}/+; P{w+, CG3213-mCherry}/+
unter dem Photomikroskop (Axiophot) und dem konfokalen Mikroskop betrachtet (Abb. 414).
A
B
C
apikales Ende
basales Ende
Stamm- D
zellen
elongierte
Spermatiden
E
Spermatogonien
DIC
100 µm
Merge
Spermatozyten
100 µm
D
CG1898-eGFP
CG3213-mCherry
Merge
elongierende Spermatiden
Ergebnisse
31
E
*
*
CG1898-eGFP
CG3213-mCherry
Merge
*
Abbildung 4-14: Expression und subzelluläre Lokalisierung der CG1898-eGFP und CG3213-mCherry
Fusionsproteine aus dem Kombinationsstamm w1118/Y; P{w+, CG1898-eGFP}/+; P{w+, CG3213mCherry}/+.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 20 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (5 s) und RFP (3 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit
der Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die darin schwarz umrahmten Ausschnitte markieren Regionen, aus denen CLSM-Aufnahmen (D/E) angefertigt wurden. Die Maßstabsbalken
der Fluoreszenzbilder wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
In der Überlagerung der Übersichtsaufnahme (B) ist das dominante Signal von CG3213mCherry in den elongierten Spermatiden deutlich zu beobachten. Die Expression des Proteins in den Spermatogonien und den primären Spermatozyten hingegen ist nur in der
konfokalen Aufnahme zu erkennen (D). Demgegenüber erscheint CG1898-eGFP im Testis
einheitlich stark exprimiert, den konfokalen Aufnahmen zufolge jedoch nur in den frühen
Keimzellen (E). Das Fluoreszenzsignal von CG1898-eGFP aus dem basalen Hodenschlauchbereich könnte auf somatische Zellen zurückzuführen sein und wird deswegen
nicht weiter betrachtet.
Zusammenfassend kann eine Kolokalisation dieser beiden Proteine nur in prämeiotischen
Stadien beschrieben werden, was auch in der überlagerten Aufnahme in Abbildung 4-14 D
demonstriert ist. Es wurde weiterhin beobachtet, dass die beiden Proteine zytoplasmatisch lokalisiert sind, sich aber in ihrer Intensität voneinander unterscheiden. Aufgrund der
identischen Expression beider Proteine in den Spermatogonien (D) und primären Spermatozyten (Daten nicht gezeigt) ist eine Interaktion grundsätzlich möglich. Allerdings könnte
nur ein geringer Anteil CG1898 für die Interaktion in dem mst87F-RNP-Komplex involviert
sein und weitere Proteinanteile Funktionen in anderen Komplexen haben.
Durch die Überlagerung der CLSM-Bilder der mittleren Testis-Region, welche die elongierenden Spermatiden zeigen, ist erkennbar, dass CG3213-mCherry nicht in allen Spermatidenbündeln exprimiert ist (* in E). Es scheint, als würde zu Beginn der Elongation eine
verminderte Translationseffizienz vorliegen, oder die Haltbarkeit des Proteins bis zu diesem Spermatogenesestadium beeinträchtigt sein. Diese Beobachtung wird in 4.2.7. de-
32
Ergebnisse
taillierter analysiert.
4.2.4. Orb2-eGFP ist nur minimal zeitgleich mit CG3213-mCherry exprimiert
Für den Vergleich der Fluoreszenzmuster von Orb2-eGFP und CG3213-mCherry wurden
die transgenen Fliegenlinien 592-18.1 (w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP 4,5}/Sb) und 625-27.5
(w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO), miteinander gekreuzt und aus dem daraus resultierenden Kombinationsstamm der Genotyp w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO;
P{w+, Orb2-eGFP}/Sb fluoreszenzmikroskopisch betrachtet (Abb. 4-15).
A
C
B
apikales Ende
basales Ende
Stammzellen
F
elongierte
Spermatiden
D
DIC
100 µm
Merge
Spermatozyten
100 µm
D
Orb2 4,5-eGFP
CG3213-mCherry
Merge
CG3213-mCherry
Merge
E
Orb2 4,5-eGFP
E
Spermatogonien
elongierende Spermatiden
Ergebnisse
33
F
Orb2 4,5-eGFP
CG3213-mCherry
Merge
CG3213-mCherry
Merge
G
Orb2 4,5-eGFP
Abbildung 4-15: Expression und subzelluläre Lokalisierung der Orb2-eGFP und CG3213-mCherry
Fusionsproteine aus dem Kombinationsstamm w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO; P{w+, Orb2eGFP}/Sb.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 18 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (5 s) und RFP (2 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der
Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die schwarz umrahmten Ausschnitte
markieren Regionen, aus denen CLSM-Aufnahmen (D-G) angefertigt wurden, wobei die Samenblase (G) in
der Schemazeichnung nicht dargestellt ist. Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
Die überlagerten Übersichtsaufnahmen (B) zeigen, dass CG3213 vor allem in den Spermatidenbündeln deutlich intensiver exprimiert ist. Die zelluläre Verteilung sowohl von
CG3213 als auch von Orb2 ist bei dieser Vergrößerung nicht zu erkennen. Die konfokalen
Aufnahmen von Orb2-eGFP (D-G) dokumentieren, dass dieses Protein in allen Stadien
der Spermatogenese in der gleichen Intensität präsent ist. Allerdings scheint das Protein
nicht in allen Zellen einer Entwicklungsphase exprimiert. Zum Beispiel weisen nicht alle
sekundären Spermatozyten ein grünes Fluoreszenzsignal auf (D). Auch die postmeiotischen Zellen scheinen nicht alle das Protein zu exprimieren (E-G) und nur in einer ganz
geringen Anzahl an reifen Spermien scheint noch Orb2-eGFP lokalisiert (G). Zusammenfassend lässt sich für Orb2-eGFP eine Korrelation zwischen Verminderung der Proteinmenge und Fortschreiten der Spermatogenese beobachten. Für CG3213-mCherry scheint
das Expressionsmuster gegenläufig. Hier steigt die Intensität des Proteins nach der Meiose stark an. Auch in den Spermien ist viel Protein lokalisiert, wohingegen Orb2-eGFP in
diesem Stadium eher in den Epithelzellen des Hodenschlauchs und der Samenblase
exprimiert scheint als in den Keimzellen (F/G).
34
Ergebnisse
Insgesamt scheinen diese beiden Proteine nur in zwei kurzen Zeiträumen innerhalb der
Spermatogenese von Drosophila zu kolokalisieren: In den Spermatozyten (→ in D) und in
einem kleinen Teil der differenzierten Spermatiden im basalen Ende des Hodenschlauchs
(→ in F). Im Fall einer Interaktion dieser beiden Proteine in dem mst87F-Komplex wäre
somit nur ein geringer Proteinanteil an der Interaktion dieser beiden Proteine im gleichen
Prozess involviert.
4.2.5. CG12470-eGFP kolokalisiert eindeutig mit CG3213-mCherry
Zum Vergleich der Expressionsmuster von CG12470 und CG3213 wurden die transgenen
Fliegenlinien 625-27.3 (w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO) und 361-14.2 (w1118/Y;
P{w+, CG12470-eGFP}/Sb) miteinander gekreuzt und aus dem daraus resultierenden
Kombinationsstamm der Genotyp w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO; P{w+, 12470eGFP}/Sb unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet (Abb. 4-16).
Bereits bei schwacher Vergrößerung ist in der überlagerten Abbildung (B) zu erkennen,
dass beide Proteine stark in den elongierten Spermatiden exprimiert werden. Auch die
konfokalen Aufnahmen der apikalen Hodenschlauchspitze zeigen kein CG12470-eGFPFluoreszenzsignal (Daten nicht gezeigt). Das Protein scheint ausschließlich, wie bei
Stinski (2011) beobachtet, nach der Elongation der Spermatiden gebildet zu werden.
Im Weiteren sind in der apikalen Hodenschlauchspitze Ansammlungen beider Fluoreszenzproteine in kugelartigen Strukturen zu erkennen (► in B). Ein Vergleich mit der DICAufnahme (A) lässt vermuten, dass es sich hierbei um abgestreifte Proteine in den waste
bags handeln könnte. In einem wandernden cystic bulge (→ in B) ist in konfokalen Aufnahmen (D/D') deutlich zu sehen, dass sich mehr CG12470-eGFP-Protein als CG3213mCherry in dieser Struktur ansammelt. Zudem ist zu beobachten, dass innerhalb des
cystic bulge keine Kolokalisation der beiden Proteine erfolgt, sondern dass sie nacheinander von den Flagellen abgestreift werden und als getrennte Bereiche sichtbar bleiben.
Bei beiden Fluoreszenzproteinen ist in den Flagellen neben einer homogenen Verteilung
eine punktuelle Lokalisation zu beobachten. Bei stärkerer Vergrößerung (E) wird deutlich,
dass die Masse dieser punktförmigen Aggregate zu großen Teilen kolokalisiert (→ in E).
Die homogene Verteilung zeigt lediglich einen leichten quantitativen Unterschied zugunsten von CG12470.
Das hier beschriebene charakteristische Muster der Proteinverteilung wurde in allen Kolokalisationsexperimenten beobachtet. In Abhängigkeit der Fluoreszenz des Vergleichsproteins sind aber immer andere Strukturen im Fokus der mikroskopischen Analyse, was den
Eindruck von Unterschieden provoziert.
Ergebnisse
35
A
C
B
apikales Ende
basales Ende
Stammzellen
/E
D
Spermatogonien
elongierte
Spermatiden
DIC
100 µm
Merge
Spermatozyten
100 µm
elongierende Spermatiden
D
D'
CG12470-eGFP
CG3213-mCherry
Merge
CG3213-mCherry
Merge
CG3213-mCherry
Merge
D'
CG12470-eGFP
E
CG12470-eGFP
Abbildung 4-16: Expression und subzelluläre Lokalisierung der Fusionsproteine CG3213-mCherry
und CG12470-eGFP aus dem Kombinationsstamm w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO; P{w+,
CG12470-eGFP}/Sb.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 20 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (2 s) und RFP (2 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der
Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Der schwarz umrahmte Ausschnitt
markiert die Region, aus der CLSM-Aufnahmen (D/E) angefertigt wurden. Der weiß umrahmte Ausschnitt
markiert die Region, welche vergrößert dokumentiert wurde (D'). Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ
berechnet und eingefügt.
36
Ergebnisse
4.2.6. Die Partikel von CG3213-mCherry sind nicht mit membranösen Strukturen assoziiert
Die Verteilung der analysierten Fluoreszenzmuster des mst87F-RNP-Komplexes deutet
auf eine zytoplasmatische Verteilung hin, da kein Protein in den Zellkernen aller Spermatogenesestadien beobachtet werden konnte. Durch das beschriebene punktförmige Muster von CG3213 und CG12470 entlang der Flagellen eröffnet sich die Frage, ob diese Aggregate mit einer membranösen Struktur, wie beispielsweise dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) oder den Mitochondrienderivaten assoziiert sind. Zur Überprüfung einer ERLokalisation wurde die Fliegenlinie 625-27.3 (w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO) mit
der PDI (Proteindisulfidisomerase)-GFP exprimierenden Linie 74.1 (P{PDI::GFP}/Sb;
Bobinnec et al., 2003) gekreuzt. Die Aminosäureabfolge der PDI weist C-terminal eine
KDEL-Sequenz auf, wodurch sie am ER lokalisiert ist und somit als ein spezifischer Marker für diese Zellorganelle fungiert. Aus den Nachkommen dieser Kreuzung wurde ein
Kombinationsstamm etabliert, aus dem der Genotyp w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/
CyO; P{PDI::GFP}/Sb unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wurde (Abb. 4-17).
A
C
B
apikales Ende
basales Ende
Stammzellen
elongierte
Spermatiden
Spermatogonien
DIC
100 µm
Merge
Spermatozyten
100 µm
D
PDI::GFP
CG3213-mCherry
E
D
Merge
elongierende Spermatiden
Ergebnisse
37
E
PDI::GFP
CG3213-mCherry
Merge
Abbildung 4-17: Analyse einer Assoziation des Fusionsproteins CG3213-mCherry mit ER-Strukturen
aus dem Kombinationsstamm w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}/CyO; P{PDI::GFP}/Sb.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 20 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (2 s) und RFP (2 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit
der Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die schwarz umrahmten Ausschnitte markieren die Regionen, aus denen CLSM-Aufnahmen (D/E) angefertigt wurden. Die weiß umrahmte Region markiert eine Zyste (D). Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
Bereits die Übersichtsaufnahme der Testesgewebe lässt vermuten, dass eine Lokalisierung von CG3213-mCherry mit dem ER unwahrscheinlich ist (B). Bei näherer Betrachtung
der Strukturen durch konfokale Aufnahmen (D/E) ist deutlich festzustellen, dass sowohl in
den prämeiotischen (gestrichelte Umrandung in D) als auch in den postmeiotischen Zellen
(→ in E) keine Hinweise einer ER-Lokalisation von dem CG3213-mCherry-Protein zu erkennen sind. Somit scheinen die Partikel, welche sowohl für CG3213 als auch für
CG12470 charakteristisch sind, zwar im Zytoplasma lokalisiert, allerdings nicht mit ERStrukturen in Verbindung zu bringen.
Weitere membranöse Strukturen, mit denen diese Aggregate in Verbindung gebracht werden könnten, stellen die Mitochondrienderivate dar. Ein Vergleich der punktförmigen
Strukturen von CG3213 mit dem beobachteten Mitochondrien-Muster der Arbeitsgruppe
Noguchi et al. (2011), welches durch eine MitoTracker®-Färbung erzeugt wurde, lässt vermuten, dass der RNP-Komplex womöglich in diesen weniger kompakten Regionen dieser
Zellorganellen lokalisiert sein könnte. Um diese Vermutung zu überprüfen, wurde Testesgewebe der Fliegenlinie 4224-14.2 (P{w+, CG3213-eGFP}/Sb) einer MitoTracker®-Färbung
(siehe 6.4.3.) unterzogen und das Resultat fluoreszenzmikroskopisch dokumentiert (4-18).
Deutlich zu erkennen sind die punktförmigen Strukturen von CG3213, die auf eine Lokalisierung in den Mitochondrienstrukturen hin untersucht werden. Ebenfalls ersichtlich ist
das beschriebene Mitochondrien-Muster der elongierten Spermatidenbündel, welches sowohl kleine (→ in B) als auch gröberen Poren (► in B) aufweist. Jedoch zeigt die überlagerte Aufnahme, dass die punktartigen Aggregate von CG3213 nicht mit dem lochartigen
38
Ergebnisse
Muster in Verbindung gebracht werden können, sodass die CG3213-Partikel nicht in den
Poren der Mitochondrien lokalisiert scheinen. Somit können die Partikelstrukturen von
CG3213 < und indirekt auch von CG12470 aufgrund der überzeugenden Kolokalisation >
nicht mit den mitochondrialen Strukturen in Zusammenhang gebracht werden.
A
CG3213-eGFP
MitoTracker®
Merge
MitoTracker®
Merge
B
CG3213-eGFP
Abbildung 4-18: Analyse einer Assoziation des Fusionsproteins CG3213-mCherry mit mitochondrialen Strukturen aus der Linie w1118/Y; P{w+, CG3213-eGFP}/CyO nach einer MitoTracker®-Färbung.
A/B: CLSM-Aufnahmen aus der mittleren Hodenschlauchregion. Die Klammer ({) in A deutet auf eine waste
bag-Struktur hin. Die Pfeile (→/►) zeigen auf die beschriebenen lochartigen Muster in den Mitochondrien.
Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
4.2.7. CG3213 weist zwei dramatisch unterschiedliche Expressionsphasen auf
Wie bereits im Rahmen der vorliegenden Arbeit beschrieben wurde, sind bei der Analyse
des Expressionsmusters von CG3213 zwei drastisch voneinander abweichende Proteinintensitäten beobachtet worden (siehe 4.2.3. bis 4.2.5.). In der frühen Keimzellentwicklung
(Spermatogonien und Spermatozyten) ist lediglich eine geringe CG3213-Proteinmenge
erkennbar, wohingegen in den Flagellen der elongierten Spermatiden deutlich mehr Protein lokalisiert ist. Desweiteren ist im Rahmen der Kolokalisationsstudie aufgefallen, dass
nicht alle Spermatidenbündel das CG3213-Protein exprimieren. Dies ist besonders bei
dem Vergleich der Fluoreszenzmuster von CG3213-mCherry mit CG1898-eGFP (siehe
4.2.3.) und Orb2-eGFP (siehe 4.2.4.) beobachtet worden. Es stellt sich nun die Frage, ob
diese Hochregulierung auf eine effizientere Translation von dem CG3213-Transkript in der
späten Spermatogenese zurückzuführen ist, da in der frühen Spermatogenese zum Zeit-
Ergebnisse
39
punkt der RNA-Synthese nur wenig Protein hergestellt wird, jedoch nach dem Einstellen
der RNA-Synthese eine deutliche Intensitätserhöhung feststellbar ist. Dieser Effekt könnte
auf eine bisher noch nicht dokumentierte Translationskontrolle zurückzuführen sein. Der
Fokus ist zunächst auf die Stabilisierung der CG3213-RNA gerichtet. Dies wird mit Hilfe
der Exuperantia (Exu)-Mutante exu(DP3) getestet. In der Literatur ist bereits beschrieben,
dass in einem exu(DP3)-Hintergrund viele Transkripte degradiert sind, da die stabilisierende
Funktion in der Nullmutante von Exuperantia nicht mehr gegeben ist (Wang und Hazelrigg, 1994). Auch für die mst87F-RNA konnte deren Stabilität mit Exuperantia in Zusammenhang gebracht werden (Stinski, 2011). Nun soll überprüft werden, ob auch CG3213
einem solchen Einfluss unterliegt.
Die Exuperantia-Mutante DP3
Zur Validierung der oben beschriebenen These wurde eine Funktionsverlustmutante
(exu(DP3); Wang und Hazelrigg, 1994) verwendet, in der das Transkriptionsniveau vieler
translationskontrollierter RNAs minimiert wird. Dies ist auch morphologisch in exu(DP3)-Fliegen zu beobachten (Abb. 4-19, A/A').
AB
*
B
*
*
C
*
basales Ende
Stammzellen
A'
*
*
exu
(DP3)
homozygot
100 µm
exu
(DP3)
apikales Ende
heterozygot
elongierte
Spermatiden
Spermatogonien
*
100 µm
Spermatozyten
elongierende Spermatiden
A'
Abbildung 4-19: Morphologie von Testes aus hetero- und homozygoten exu(DP3)-Fliegen.
exu(DP3) homozygot
20 µm
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC
von einem homozygoten (A, 20 ms) und einem heterozygoten (B,
20 ms) exu(DP3)-mutanten Hoden im Vergleich zu einer schematischen Darstellung eines Wildtyp-Testis (C) mit der Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die farbigen Sterne
deuten die unterschiedlichen Keimzellstadien an, die der farbigen Beschriftung in C entsprechen. Der schwarz umrahmte Ausschnitt
markiert die Region, welche vergrößert dokumentiert wurde (A'). Die
Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
Ein Testis, welcher homozygot für die exu(DP3)-Mutante ist, bildet in der ganzen männlichen
Gonade nur prämeiotische Keimzellen aus (* in A). In diesem mutanten Organ gibt es keine Hinweise auf runde oder elongierende Spermatiden, während die Morphologie eines
Testis mit heterozygotem exu(DP3)-Hintergrund Wildtypsituation zeigt (B). Desweiteren ist
40
Ergebnisse
der mutante Hodenschlauch aufgrund der fehlenden elongierten Spermatiden nicht
schneckenartig aufgewunden und zudem in seiner Breite auf etwa das Doppelte ausgedehnt.
4.2.8. Quantifizierung der CG3213-RNA in Exuperantia-mutantem Hintergrund
Zur Überprüfung, ob die Menge des CG3213-Transkriptes durch Exuperantia beeinflusst
wird, wurde eine RNA-Quantifizierung mittels real time-PCR (qPCR) durchgeführt. Die
notwendigen Primer wurden mit der Internet-Software Primer 3 definiert. Abbildung 4-20
zeigt die Orientierung und Lokalisierung des Primer-Paares, mit dem der spezifische
Nachweis des CG3213-Transkripts erfolgte.
+1
Promotor
5'
+2.379
ORF CG3213
#544
1000
2000
3000
3'
#545
4000
Abbildung 4-20: Lage der CG3213-Primer, die zur Bestimmung des Expressionsniveaus definiert
wurden.
Die relative Quantifizierung von CG3213 erfolgte in qPCR-Reaktionen mit dem Primer-Paar #544/#545,
wodurch ein 196 bp langes PCR-Amplifikat resultiert.
Promotor: Flankierender Bereich (2.000 bp), welcher vermutlich alle regulatorischen Elemente enthält
(schwarze Linie). ORF CG3213: Open reading frame von CG3213. 5' und 3': Untranslated regions
(schwarz). Maßstabsbalken: Länge des Konstruktes in Basenpaaren (bp). Die Primer sind in Lage und
Orientierung durch schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern (#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Das Transkriptionsniveau von CG3213 wurde in der Wildtyppopulation OreR, in heterozygoten und homozygoten exu(DP3)-Mutanten ermittelt und jeweils zu dem RNA-Gehalt für
das housekeeping gene rpL9 in Bezug gesetzt. Dieses relative Verhältnis wurde für alle
drei Genotypen in Form eines Balkendiagramms dargestellt (Abb. 4-21). Damit auch die
Abweichungen der Wildtyppopulation OreR ermittelt werden konnten, wurden aus dieser
Linie jeweils zwei mRNA-Isolierungen durchgeführt und zur Bildung eines normalisierten
Wertes verwendet.
Ein Vergleich zwischen dem relativen RNA-Gehalt aus Testesgewebe der Linie OreR und
heterozygoten exu(DP3) zeigt, dass das CG3213-RNA-Niveau in den heterozygoten Fliegen
nicht verringert, sondern etwas erhöht ist. Diese Differenz wird jedoch auf Messungenauigkeiten zurückgeführt und ist vermutlich nicht aufgrund der Mutante entstanden. Der regulatorische Effekt ist deutlich in den männlichen Gonaden der homozygoten exu(DP3)Fliegen zu erkennen. Dort ist eine signifikante Abweichung der RNA-Menge im Vergleich
Ergebnisse
41
zum Wildtyp (OreR) zu erkennen, wohingegen die Signale der heterozygoten Mutanten
keine signifikante Abweichung ergeben. In den exu(DP3)-homozygoten Organen liegt der relative RNA-Gehalt von 0,02 nur gering über Null. Da aus der Literatur bekannt ist, dass
auch ein geringes RNA-Level ausreicht, damit eine detektierbare Proteinmenge exprimiert
wird, soll dies auch für CG3213 in hetero- und homozygotem exu(DP3)-Hintergrund fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden.
Abbildung 4-21: Relative Quantifizierung
der mRNA-Expression von CG3213 in
homo- und heterozygotem exu(DP3)-Hintergrund.
relative Expression zu rpL9
*
ns
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
OreR
exu(DP3) ht
exu(DP3) hm
Der Nachweis der CG3213-Transkripte erfolgte mit dem Primer-Paar #544/#545. Die
Signale wurden gegen rpL9 mit dem PrimerPaar #404/#405 referenziert und relativ zur
OreR-Wildtyppopulation dargestellt. Als
template wurde Gesamt-RNA aus Hoden mit
Trizol® nach 6.7.2. aufgereinigt. Für jede
Reaktion wurde 1 ng/µl Gesamt-RNA eingesetzt.
Biologische Replikate: n = 3. Fehlerbalken: mean with SD. Gepaarter t-Test: p (OreR/exu(DP3) ht) =
0,2129 (nicht signifikant: ns). p (OreR/exu(DP3) hm) = 0,0426 (signifikant: *). ht: heterozygot. hm: homozygot. Graphik erstellt mit Excel.
4.2.9. CG3213-Proteinverteilung in Exuperantia-mutantem Hintergrund
Das Ergebnis der qPCR deutet auf ein dramatisch verringertes CG3213-Transkriptlevel im
exu(DP3)-Hintergrund hin. Da in der Literatur bereits gezeigt wurde, dass ein geringes RNALevel nicht mit einer geringen Translation einhergehen muss (Pfurr, 2012), soll nun die
Proteinexpression in den exu(DP3) hetero- und homozygoten Fliegen analysiert werden. Dazu wurde die transgene Linie 4244-14.2 (P {w+, CG3213-eGFP}/Sb; Stinski, 2011) mit der
exu(DP3)-Linie (Wang und Hazelrigg, 1994) gekreuzt und heterozygote Nachkommen mit
dem Genotyp w1118/Y; exu(DP3)/CyO; P{w+, CG3213-GFP}/Sb fluoreszenzmikroskopisch
analysiert (Abb. 4-22).
In der Übersichtsfluoreszenzaufnahme (B) ist das starke Signal der elongierten Spermatiden deutlich zu erkennen. Die CLSM-Aufnahmen zeigen schließlich das Fusionsprotein
in allen prä- und postmeiotischen Spermatogenesestadien. Zudem entspricht die zytoplassmatische Lokalisierung des Proteins in allen Keimzellstadien ebenfalls der bereits
beschriebenen Situation (→ in D/E). So ist CG3213 in den runden Spermatiden homogen
im Zytoplasma verteilt (► in E). Weiterhin ist eine starke Fluoreszenz in den Flagellen der
elongierten Spermatiden zu erkennen (D-F). Bei stärkerer Vergrößerung ist neben der
gleichmäßigen Verteilung auch die zusätzliche punktförmige Anhäufung von CG3213eGFP entlang der Flagellen zu beobachten (→ in F').
42
Ergebnisse
A
C
B
apikales Ende
basales Ende
Stammzellen
elongierte
Spermatiden
Spermatogonien
DIC
D
100 µm
CG3213-eGFP
E
E
F
D
/G
Spermatozyten
100 µm
elongierende Spermatiden
E'
E'
F
G
G'
G'
Abbildung 4-22: Expression und subzelluläre Lokalisierung des CG3213-eGFP Fusionsproteins in
heterozygotem exu(DP3)-Hintergrund (Wildtypsituation) mit dem Genotyp w1118/Y; exu(DP3)/CyO; P{w+,
CG3213-eGFP}/Sb.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 20 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (2 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der Anordnung
der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die schwarz umrahmten Ausschnitte markieren
Regionen, aus denen CLSM-Aufnahmen (D-G) angefertigt wurden. Die weiß umrahmten Ausschnitte markieren Regionen, welche vergrößert dokumentiert wurden (E'/G'). Die weißen Pfeile deuten auf die homogene zytoplasmatische Verteilung von CG3213-eGFP in den Spermatiden 1. Ordnung (D/E') und die zusätzliche Ansammlung in den Flagellen der elongierten Spermatiden (F) hin. Die Pfeilspitze zeigt auf die homogene Verteilung des Fusionsproteins in den Spermatozyten 2. Ordnung. Die Maßstabsbalken wurden mit
ImageJ berechnet und eingefügt.
Insgesamt entspricht somit das CG3213-eGFP Verteilungsmuster der Wildtypsituation,
wie sie bereits beschrieben wurde, da das Fluoreszenzverteilungsmuster in den heterozygoten Nachkommen dieses Kombinationsstamms keinen Unterschied zu dem der
CG3213-eGFP (4244-14.2) Ausgangslinie aufweist (Stinski, 2011). Eine völlig andere
Situation ist in den Gonaden der homozygoten exu(DP3)-Tiere zu beobachten, welche in
Abbildung 4-23 dargestellt ist. Bereits die 10-fach stärker belichtete Übersichtsaufnahme
Ergebnisse
43
(B) zeigt deutlich, dass kein CG3213-eGFP-Fluoreszenzprotein detektiert wird. Auch detailliertere Aufnahmen mit dem CLSM zeigen in dem gesamten Testis keine grüne Fluoreszenz (Daten nicht gezeigt).
A
C
B
apikales Ende
basales Ende
Stammzellen
elongierte
Spermatiden
Spermatogonien
exu(DP3) homozygot
100 µm
exu(DP3) homozygot
100 µm
Spermatozyten
elongierende Spermatiden
Abbildung 4-23: Expression und subzelluläre Lokalisierung des CG3213-eGFP Fusionsproteins in
homozygotem exu(DP3)-Hintergrund mit dem Genotyp w1118/Y; exu(DP3)/exu(DP3); P{w+, CG3213-eGFP}/
P{w+, CG3213-eGFP}.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 18 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (20 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ
berechnet und eingefügt.
Auffällig sind jedoch im basalen Bereich des Hodenschlauchs punktförmige, gelbe fluoreszierende Strukturen (gestrichelte Umrandung in B), welche allerdings aufgrund der Färbung als Degradationsprodukte eingestuft wurden. Im Folgenden soll dennoch experimentell gezeigt werden, dass das Protein in Gonaden aus exu(DP3)-Testes nicht exprimiert wird
und nicht nur eine Fehllokalisation vorliegt. Dieser Nachweis erfolgte mittels eines Western-Blots. Für diesen Immunonachweis wurden Hodenproteinextrakte aus heterozygoten
und homozygoten exu(DP3)-Männchen des Kombinationsstammes w1118/Y; exu(DP3)/CyO;
P{w+, CG3213-eGFP}/Sb hergestellt. Das eGFP-Signal des 103,8 kDa großen Moleküls
wurde mit einem primären anti-GFP-Antikörper gebunden und mit einem alkalischen
Phosphatase gekoppelten Sekundärantikörper detektiert. Als Negativkontrolle wurde Hodenproteinextrakt (HPE) aus der Wildtyppopulation OreR und als Positivkontrolle wurde
gleicher Extrakt aus der Linie CG3213-eGFP (4244-14-2) hergestellt. Das Ergebnis des
Western-Blots ist in Abbildung 4-24 dargestellt. Zum Vergleich der Aufreinigungseffizienz
der Hodenproteinextrakte wurde das Kontroll-PAA-Gel neben dem Blot dargestellt.
Der HPE aus den homozygoten exu(DP3)-Mutanten weist im Vergleich zu den anderen
Linien ein abweichendes Bandenmuster auf. Beispielsweise entsteht auf Höhe von
170 kDa eine neue Proteinbande (*), während im Bereich zwischen 40 kDa und 55 kDa
einige Banden schwächer sind oder gänzlich fehlen ({). Diese Abweichungen sind zu er-
44
Ergebnisse
warten, wenn Exu wirklich eine große Anzahl von RNAs beeinflusst und damit die Protein-
Marker
OreR
CG3213-GFP
homozygot
exu(DP3)/+ ;
CG3213-GFP/+
exu(DP3)/exu(DP3);
CG3213-GFP/
CG3213-GFP
Marker
OreR
CG3213-GFP
homozygot
exu(DP3)/+ ;
CG3213-GFP/+
exu(DP3)/exu(DP3);
CG3213-GFP/
CG3213-GFP
synthese vieler Gene verändert.
kDa
170
130
*
100
70
55
{
40
35
25
Gel
Blot
15
Abbildung 4-24: Western-Blot-Analyse des CG3213-eGFP-Fusionsproteins in
exu(DP3)-Hintergrund.
Die Hodenproteinextrakte wurden jeweils aus 50 Testes hergestellt. Als Referenz wurden
für das Blot- und Kontrollgel jeweils 2 µl Proteinmarker (peqGOLD prestained Protein
ladder IV) aufgetragen. Gel: PAA-Kontrollgel. Probenvolumen: 5 µl (Lysat+SDS-AP, 1:1).
Die Visualisierung erfolgte mittels Coomassie Brillant Blue R250-Färbung. Blot: Western-Blot-Membran. Probenvolumen: 35 µl (Lysat+SDS-AP, 1:1). Nachweis des CG3213eGFP Fusionsproteins (103,8 kDa) mit primärem anti GFP-Antikörper aus Kaninchen
(0,5 mg/ml; 1:5.000 eingesetzt; Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur) und sekundärem Antikörper gegen Kaninchen (alkaline Phosphatase gekoppelt; 0,5 mg/ml; 1:5.000
eingesetzt; Inkubation 2 h bei Raumtemperatur). Färbung: 83 min.
Nach der Farbreaktion ist im Blot deutlich zu erkennen, dass das eGFP-Fusionsprotein
sowohl in der Positivkontrolle, als auch in den Organen der heterozygoten exu(DP3)-Mutante exprimiert ist. Auffällig dabei ist, dass das Fusionsprotein etwa 20 kDa zu hoch im
Gel aufgetrennt wurde. Dieser Effekt ist vermutlich auf eine Hohe Anzahl an gebundenen
SDS-Molekülen zurückzuführen. In den homozygoten Organen hingegen ist kein Signal
zu erkennen. Somit deuten sowohl die Ergebnisse der Fluoreszenzmikroskopie (s.o.) als
auch die Analysen des Western-Blots darauf hin, dass das geringe CG3213-RNA-Level
nicht ausreicht, um eine nachweisbare Proteinmenge zu exprimieren. Damit scheint auch
CG3213 dem stabilisierenden Einfluss von Exu zu unterliegen.
Ergebnisse
45
4.3. Das cis-aktive Regulationselement CPE und seine Wirkung in den protaminmRNAs
Bisher wurde die Frage nach der Regulation der Genfamilie und der Allgemeingültigkeit
der darin beobachteten Phänomene untersucht. Im Weiteren wird die Frage behandelt, ob
einzelne transgene Faktoren in verschiedenen Regulationsmechanismen mitwirken können. Ein sehr wahrscheinlicher Kandidat hierfür ist beispielsweise das Drosophila-Protein
Orb2, von dem bisher eine Bindung an das TCE gezeigt wurde (Stinski, 2011) und von
dem in anderen Systemen ein Zusammenhang mit dem CPE vermutet wird (Starck,
2007). Zusätzlich ist die Frage interessant, ob das Vorhandensein von ein bzw. zwei CPESequenzen in den protamin-RNAs die Qualität einer möglichen Proteininteraktion beeinflusst.
4.3.1. Das CPE interagiert mit den Drosophila-Proteinen Orb2 und CG3213
Das Drosophila-Homolog Orb2 ist der CPEB (cytoplasmic polyadenylation element binding protein)-Familie zugeordnet. Mitglieder dieser Genfamilie binden sogenannte CPE
(cytoplasmic polyadenylation element)-Domänen und sind an der Regulation des Translationszeitpunktes dieser RNAs beteiligt (zusammengefasst in Richter, 2007). Ganz entsprechend wird in der Drosophila-Spermatogenese der Zeitpunkt der Translation von
protamin A und B durch das Protein Orb2 reguliert oder zumindest mitreguliert (Starck,
2007). Basierend auf dieser Hypothese, soll eine direkte Bindung von rekombinantem
Orb2 an CPE-enthaltende Plasmidsequenzen (Klone Protamin A und Protamin B in Abb.
4-25) untersucht werden.
A
+49
T7
MCS
+148
CPE
Spe I
50
Cla I
#38
100
+47
T7
protamin A
#37
B
MCS
+145
CPE
protamin B
CPE
Spe I
Cla I
#40
#39
50
100
150
Abbildung 4-25: Schematische Darstellung der Konstrukte Protamin A (BH11) und Protamin B
(BH10).
A: Die Protamin A-Gensequenz wurde ab dem Transkriptionsstart von Position +49 bis +148 mit dem
Primer-Paar #37/#38 auf cDNA amplifiziert und in den pBS II SK-Vektor inseriert (Klon BH11; Heydenreich, 2008). Nach Linearisierung mit Cla I und Transkription mit T7-RNA-Polymerase entsteht ein
sense-Volllängentranskript von 112 nt (MCS: 13 nt, Protamin A-Gensequenz: 99 nt).
B: Die Protamin B-Gensequenz wurde ab dem Transkriptionsstart von Position +47 bis +145 mit dem
Primer-Paar #39/#40 auf genomischer DNA amplifiziert und in den pBS II SK-Vektor inseriert (Klon
BH10; Heydenreich, 2008). Nach Linearisierung mit Cla I und Transkription mit T7-RNA-Polymerase
entsteht ein sense-Volllängentranskript von 143 nt (MCS: 45 nt, Protamin B-Gensequenz: 98 nt).
T7: Promotor (weiß). MCS: Multiple cloning site (schwarz). Protamin A: 5'UTR-Transkriptsequenz (+49/
+148, gelb). Protamin B: 5'UTR-Transkriptsequenz (+47/+145, orange). CPE: Cytoplasmic polyadenylation element (rot). Maßstabsbalken: Länge der Konstrukte in Nukleotiden (nt). Die Primer sind in Lage
und Orientierung durch schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern (#)
beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
46
Ergebnisse
Im gleichen Zug wurden auch die beiden Proteine Exuperantia (Exu) und CG3213 auf eine Interaktion mit den protamin-Transkripten getestet, da von ihnen translationskontrollierende Funktionen vermutet werden. Exuperantia wurde im Rahmen einer früheren Arbeit
(Stinski, 2011) in den pET-21a(+)-Expressionsvektor einkloniert, wodurch es nur mit einem HIS-Tag fusioniert ist. Insgesamt wird ein 86,7 kDa großes Fusionsprotein exprimiert.
Ein Protokoll zur Proteinaufreinigung mit dem MagneHIS TM Purification System Kit wurde
von C. Otto etabliert (persönliche Mitteilung). Das rekombinante CG3213 hingegen weist
einen C- und N-terminalen HIS-Tag sowie einen C-terminalen GST-Tag auf, da es in den
Expressionsvektor pET-41a(+) inseriert wurde. In einer Testreihe wurden die optimalen
Parameter für eine effiziente Aufreinigung des 110,3 kDa großen rekombinanten Proteins
von C. Otto ermittelt (persönliche Mitteilung). Zur Sondenherstellung wurden die beiden
Klone 10 und 11 (Heydenreich, 2008) wie in Abbildung 4-25 beschrieben vorbereitet. Das
Ergebnis des EMSA ist in Abbildung 4-26 in Form eines Autoradiogramms dargestellt.
IVT protamin A*
IVT protamin B*
Orb2
Exu
CG3213
1
2
3
4
+
+
+
+
+
+
5
6
7
8
+
+
+
+
+
+
+
2 h, -80°C
+
2 h, -80°C
Abbildung 4-26: Bindungsanalysen von rekombinantem Orb2, Exuperantia und CG3213 mit radioaktiv-markierten protamin A* (+49/+148)- und protamin B* (+47/+145)-Transkripten.
Die Komponenten der Ansätze sind oberhalb der Spuren angegeben. Für die Bindungen wurden jeweils 2 µg Proteinextrakt eingesetzt. Die Molekulargewichte der Fusionsproteine betragen für Orb2
109,8 kDa, für Exu 86,7 kDa und für CG3213 110,3 kDa. Die in vitro-Transkripte (IVT) wurden bei 30°C
synthetisiert und sind 112 nt (protamin A*) und 143 nt (protamin B*) lang. Die Komplexe wurden elektrophoretisch in einem nativen PAA-Gel aufgetrennt und die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie jeweils für 2 h bei -80°C visualisiert.
Ergebnisse
47
Bei der Inkubation beider Transkripte mit Orb2 ist in beiden Fällen eine Interaktion mit den
CPE-enthaltenden protamin-Sequenzen zu beobachten (Spuren 1/2 und 5/6). Es sind jeweils zwei Komplexbanden entstanden, wobei die untere die dominantere repräsentiert
(►). Im Fall von protamin B, welches zwei CPE-Sequenzen aufweist (vgl. Abb. 4-25), ist
die obere Bande (→) etwas stärker als bei protamin A. Im Weiteren ist ersichtlich, dass
bei protamin B fast das gesamte IVT-Material in dem Komplex gebunden hat, wohingegen
bei protamin A sichtbar mehr freies IVT zurück bleibt. Für Exuperantia kann keine Bindung
an die getesteten 5'UTR-Sequenzen dokumentiert werden. Es ist in beiden Fällen
lediglich eine sehr schwache Bande auf Höhe des kleineren Komplexes zu erkennen, was
möglicherweise auf Hintergrundreaktionen zurückzuführen ist (Spuren 3/7). Anders verhält
es sich mit CG3213. Dort kann eine starke Interaktion mit beiden CPE-enthaltenden Sequenzen gezeigt werden. An beiden RNAs haben sich zwei Komplexe ausgebildet. Bei
protamin A sind beide von etwa gleicher Intensität, sodass die RNP-Aggregate circa die
gleiche Menge freies IVT gebunden haben müssten (Spur 4). In der Interaktionsanalyse
mit protamin B hingegen gibt der obere Shift ein deutlich intensiveres Signal (Spur 8).
Folglich hat das Transkript mit zwei CPE-Domänen mehr freies radioaktiv-markiertes IVT
in dem oberen Shift gebunden.
4.3.2. Rekombinantes Orb2 bindet mit unterschiedlicher Effizienz an die protaminmRNAs
In dem folgenden Kompetitionsshift-Assay wurde radioaktiv-markiertes protamin A durch
unmarkiertes protamin B kompetiert. Das Experiment soll Aufschluss über die Bindungsaffinität von Orb2 an den beiden RNA-Sequenzen liefern (Abb. 4-27). Um den Effekt besser beurteilen zu können, wurde auch ein normaler Reaktionsansatz ohne den Kompetitor
mit aufgetragen.
In dem Autoradiogramm ist ersichtlich, dass sich zwei Shiftkomplexe gebildet haben, wobei der untere (►) insgesamt ein stärkeres Signal darstellt. Der obere (→) ist im Vergleich
zu den vorherigen Analysen etwas stärker ausgeprägt (siehe Abb. 4-26). Auch ist zu erkennen, dass hier kein freies radioaktives Transkript tiefer im Gel zurück bleibt. Das gesamte IVT scheint durch die Proteininteraktion gebunden zu sein. Durch die Kompetition
mit unmarkiertem protamin B ist bereits bei einem 1-fachen Überschuss des Kompetitors
(Spur 3) eine Intensitätsverringerung der beiden Banden zu erkennen. Wird die Konzentration des Kompetitors weiter erhöht, so wird auch die untere Bande zunehmend verdrängt und eine deutliche Signalerhöhung auf Höhe des freien Transkripts erzeugt. Zusammenfassend konnte somit die obere Bande schneller verdrängt werden, wohingegen
die untere Bande auch durch einen 50-fachen Überschuss an unmarkiertem protamin B
(Spur 5) nicht völlig aufzulösen ist.
48
Ergebnisse
1
2
3
4
5
+
+
+
+
+
Orb2
+
+
+
+
Kompetitor
(protamin B)
0
1x
10x
50x
IVT protamin A*
4 h, -80°C
Abbildung 4-27: Analyse der
Bindungsaffinität von rekombinantem Orb2 mit radioaktivmarkierten protamin A* (+48/
+148)- und unmarkierten protamin B (+47/+145)-Transkripten
als Kompetitor.
Die Komponenten der Ansätze
sind oberhalb der Spuren angegeben. Das Molekulargewicht
des Orb2-Fusionsproteins beträgt 109,8 kDa. Für die Bindungen wurden jeweils 2 µg Proteinextrakt eingesetzt. Die in vitroTranskripte (IVT) wurden bei
30°C synthetisiert und sind
112 nt (protamin A*) und 143 nt
(protamin B) lang. Die Komplexe
wurden elektrophoretisch in einem nativen PAA-Gel aufgetrennt
und die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie für 4 h bei
-80°C visualisiert.
Zur besseren Einschätzung von Unterschieden wird das reziproke Experiment durchgeführt, in dem neben radioaktiv-markiertem protamin B auch protamin A als unmarkierter
Kompetitor zugesetzt wurde (Abb. 4-28). Ist das rekombinante Protein anwesend < wie
hier beispielsweise Orb2 > so ist fast das gesamte freie Transkript in den RNP-Komplex
gebunden (Spur 3). Die Kompetition von protamin B mit unmarkiertem protamin A zeigt
deutlich, dass der gesamte untere Komplex verdrängt wurde. Bereits ein Verhältnis der
beiden RNAs von 1:1 (Spur 4) ist ausreichend, um einen dramatischen Effekt in der Bindungsaffinität zu erkennen. Bei einem 10-fachen Überschuss an nicht-markiertem protamin A ist bereits nahezu das gesamte radioaktiv-markierte Transkript von dem Komplex
abgelöst. Im direkten Vergleich mit dem zuvor vorgestellten Ergebnis (siehe Abb. 4-27)
deutet die Kompetition darauf hin, dass rekombinantes Orb2 spezifischer an das protamin A-Transkript bindet.
Als Negativkontrolle für die EMSA-Studie wurde der pET-41a(+)-Vektor in den E.coliStamm BL21(DE3) transformiert und parallel mit der Kultur für das rekombinante Protein
bearbeitet. Diese Kontrolle dient der Überprüfung, ob Proteine bei der Aufreinigung unspezifisch an die Beads binden, und eventuell dann ein vermeintliches Komplexsignal erzeugen. In der Kontrolle (Abb. 4-28, Spur 1) ist ein schwaches Signal auf Höhe der unteren Komplexbande, wie sie bei der Interaktion des Transkripts mit Orb2 entsteht (Spur 3),
zu erkennen. Die Intensität des Signals bleibt jedoch hinter dem einer normalen Komplexbildung zurück und entspricht eher der Intensität in Spur 4.
Ergebnisse
IVT protamin B*
49
1
2
3
4
5
6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
0
1x
10x
50x
Orb2
pET-41a(+)
Kompetitor
(protamin A)
+
3 h, -80°C
Abbildung 4-28: Analyse der
Bindungsaffinität von rekombinantem Orb2 mit radioaktivmarkierten protamin B* (+48/
+148)- und unmarkiertem protamin A (+47/+145)-Transkript
als Kompetitor.
Die Komponenten der Ansätze
sind oberhalb der Spuren angegeben. Das Molekulargewicht
des Orb2-Fusionsproteins beträgt 109,8 kDa. Für die Bindungen
wurden jeweils 2 µg Proteinextrakt eingesetzt. Die in vitroTranskripte (IVT) wurden bei
30°C synthetisiert und sind
112 nt (protamin A) und 143 nt
(protamin B*) lang. Die Komplexe wurden elektrophoretisch in
einem nativen PAA-Gel aufgetrennt und die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie
für 4 h bei -80°C visualisiert. Die
Abbildung basiert auf einem Gel,
wobei eine Spur für die Dokumentation ausgeschnitten wurde.
Da Orb2 an die CPEs bindet, stellt sich nun die Frage, welche Funktion es in dem vermuteten regulatorischen Komplex übernimmt. Die Untersuchungen an Xenopus und anderen Systemen legen einen Einfluss auf das Poly(A)-Ende nahe. Daher wird zunächst
ein solcher Zusammenhang bei den Drosophila-protaminen getestet.
4.3.3. RNase H-Analysen liefern keine Hinweise auf eine sekundäre Polyadenylierung der protamin-Transkripte
Mit dieser Methode werden die protamin-Transkripte auf einen möglichen Polyadenylierungseffekt durch Orb2 hin untersucht. Dazu wird mRNA aus Orb2JO10-Fliegen (vgl. 4.1.3.)
isoliert und wie oben beschrieben einer RNase-H-Behandlung unterzogen. Als Referenz
wird gleichermaßen mRNA aus der Wildtyppopulation OreR behandelt. Für den transkriptspezifischen Nachweis der protamine wird zur Sondenherstellung das Plasmid 2581
(Starck, 2007) mit Spe I linearisiert und mit der T7-RNA-Polymerase ein 537 nt (inklusive
MCS-Sequenzen) langer antisense-Strang synthetisiert. Durch eine Sequenzierung des
Plasmids (8.2) konnte ermittelt werden, dass das Konstrukt in Sp6-Orientierung in dem
pGEM®T-Vektor enthalten ist und die Transkriptpositionen +142/+573 abdeckt. Anhand
dieser RNA-Sequenz kann jedoch nicht zwischen den beiden protamin-Varianten A oder
B unterschieden werden. Als Beladungskontrolle wird die RNA von rpL9 (housekeeping
gene) nachgewiesen. Für die Herstellung dieser Sonde wird das Plasmid rpL9 (Schmidt et
al., 1996) mit Sac II linearisiert und mit der T3-RNA-Polymerase transkribiert. Das Ergebnis des RNase H-Experiments ist in Abbildung 4-29 dargestellt.
kb
64-
10
rb
2 JO
10
+
O
JO
rb
2
-O
O
re
R
+
-O
re
R
O
rb
2 JO
B
+
O
re
R
-O
rb
2 JO
+
r
re
R
-O
M
ar
ke
A
10
Ergebnisse
10
-
50
kb
protamin*
0,7 0,6 -
322 d, -80°C
1,5 10,5 -
rpL9*
0,8 -
0,2 2 d, -80°C
Abbildung 4-29: RNase H Northern-Analyse zum Nachweis der sekundären Polyadenylierung von
protamin in der Defizienzlinie Orb2JO10.
A: Auf das RNA-Gel wurden 2 µl Marker (RiboRulerTM High Range RNA Ladder) als Referenz und unbehandelte (-) neben behandelte (+) mRNA-Extrakte aus jeweils 55 Testes der Linien OreR und Orb2JO10
aufgetragen. B: Die transkriptspezifischen Nachweise erfolgten nacheinander auf dem Filter SB 15 mit
den radioaktiven Sonden protamin* (+142/+573) und rpL9*. Die protamin*-Sonde wurde bei 30°C synthetisiert, rpL9* bei 37°C. Die radioaktiven Signale wurden mittels Autoradiographie jeweils für 2 d bei -80°C
visualisiert.
Die prominenten Transkripte, die in dem Gel sichtbar sind (← in A) resultieren aus einem
internen Poly(A)-Segment in der eukaryotischen 18S und der mitochondrialen 16S rRNA,
die bei der Isolierung ebenfalls an die Beads binden.
Der Abbildung 4-29 B ist zu entnehmen, dass die RNase H-Behandlung und somit das
Entfernen des Poly(A)-Endes erfolgreich war, da im Vergleich der nicht-behandelten (-)
und behandelten (+) Wildtyp-RNA (OreR) sowohl nach der Hybridisierung mit der protamin*-, als auch mit der rpL9*-Sonde jeweils eine kürzere RNA detektiert wurde. Somit
können im direkten Vergleich mit den beiden Proben die Poly(A)-Längen für rpL9 von
etwa 50 nt und für protamin von etwa 100 nt ermittelt werden.
Betrachtet man jetzt die Signale für rpL9* so findet sich die Längenreduktion sowohl bei
OreR als auch bei Orb2JO10 in gleicher Höhe. Daraus ist zu folgern, dass es sich um die
normale Poly(A)-Verlängerung bei der Synthese im Zellkern handelt. Das Ausmaß der
sekundären Polyadenylierung, sofern es für die getesteten Transkripte existiert, ist für die
protamin-RNA leider aufgrund des fehlenden Signals in der unbehandelten OreR-Probe
nicht ersichtlich. Um das Ergebnis eventuell doch noch zu erhalten, wurde ein weiterer
Filter mit den Sonden hybridisiert. Zum Vergleich wurde die mst87F-RNA in die Untersuchung einbezogen (Abb. 4-30).
51
O
rb
2
+
rb
2 JO
-O
+
-O
re
R
O
re
R
10
JO
10
Ergebnisse
kb
0,7 -
protamin*
0,6 8 d, -80°C
0,5 0,4 -
mst87F*
5 d, -80°C
0,8 0,7 -
rpL9*
5 d, -80°C
Abbildung 4-30: RNase H Northern-Analyse zum Nachweis der sekundären Polyadenylierung von protamin und mst87F in
der Defizienzlinie Orb2JO10.
Der von Starck (2007) erzeugte Filter HS22
wurde nacheinander mit den radioaktiven
Sonden protamin* (+142/+573) mst87F*
(Kuhn et al., 1988) und rpL9* (Schmidt et al.,
1996) hybridisiert. Die protamin*-Sonde wurde bei 30°C synthetisiert, alle anderen bei
37°C. Die Expositionszeiten betragen 8 d
(protamin*), 5 d (mst87F*; rpL9*) bei jeweils
-80°C.
Hier zeigt sich der erwartete Effekt für mst87F. Die unbehandelte Probe in Orb2JO10 zeigt
ein heterogenes Signal (}), was durch beide Polyadenylierungsschritte zustande kommt
und in einer homogenen Bande von kürzerer Länge nach der RNase H-Behandlung resultiert (←). Für die sekundäre Polyadenylierung von mst87F ist Orb2 demnach nicht essentiell. Aber auch in diesem Experiment ist die sekundäre Polyadenylierung der protamin-Transkripte nicht nachweisbar.
4.3.4. Die subzelluläre Verteilung der beiden Orb2-Proteine ist verschieden
Der oben erwähnten Mutante Orb2JO10 fehlt selektiv das längere Orb2-Protein und zeichnet sich durch komplette Sterilität aus. Dies könnte bedeuten, dass den Proteinvarianten
unterschiedliche Funktionen in der Spermatogenese zukommen, die sich eventuell auch
in einer unterschiedlichen Verteilung beider Proteine zeigen.
In einer früheren Arbeit wurde bereits die Verteilung von Orb2 anhand einer eGFP-Fusion
in Testis adulter Fliegen beschrieben (Starck, 2007). Da es sich dabei allerdings um Übersichtsaufnahmen von dem Photomikroskop (Axiophot) handelte, ist die subzelluläre Verteilung nicht eindeutig dokumentiert. Dies wird im Folgenden durch CLSM-Aufnahmen von
Hoden der Fliegenlinie 592-18.1 (w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP 4,5}/Sb) ergänzt. Anschließend wird das Expressionsmuster von dem größeren Orb2 (74,5 kDa) mit dem
kleineren Orb2-Protein (59 kDa) anhand der Linie 919-28.1 (w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP
3,7}/Sb) verglichen.
Für das große (74,5 kDa) Orb2 kann eine Lokalisierung in allen Keimzellstadien der Drosophila-Spermatogenese bestätigt werden (Abb. 4-31). Schon in der Übersichtsaufnahme
(B) ist zu erkennen, dass die distalen Enden der Spermatidenbündel in einer wolkenar-
52
Ergebnisse
tigen Struktur enden (→ in B). In der vergrößerten CLSM-Aufnahme eines anderen Testis
(→ in D) kann diese Morphologie erneut beobachtet werden, was auch den Beobachtungen der Publikation Xu et al. (2014) gleicht. In dieser Auflösung scheinen nicht nur die Axoneme Fluorezenz abzugeben wie es bei den Proteinen zuvor dokumentiert wurde
(CG3213-mCherry, CG12470-eGFP), sondern das große Orb2 scheint auch in axonemumgebenden Flagellenstrukturen lokalisiert. Weiterhin ist auffällig, dass die Fluoreszenz
nicht in jedem Spermatidenbündel zu erkennen ist (E). Einige scheinen zu dem fixierten
Zeitpunkt gänzlich frei von Fluoreszenz zu sein, während andere deutlich das Fusionsprotein enthalten. Allerdings ist das Protein nicht in den ganzen Bündeln exprimiert, es deutet
eher darauf hin, dass es nur transient in den Flagellen benötigt wird, wodurch dieses wellenartige Expressionsmuster entsteht. Eine weitere Auffälligkeit dieses Fluoreszenzmusters ist in einer vergrößerten Aufnahme eines partiell fluoreszierenden Bündels zu erkennen (F/F'). In den distalen Enden der Spermatiden scheint deutlich mehr Protein lokalisiert, da diese besonders intensiv fluoreszieren. Auch in den prämeiotischen Spermatozyten ist bereits in der Übersichtsaufnahme deutlich zu sehen, dass nicht alle Regionen
der frühen Keimzellstadien fluoreszieren. Ein Vergleich mit der DIC-Aufnahme (A) lässt
vermuten, dass nicht alle Spermatogonien das Protein gleichermaßen stark exprimieren.
Weiterhin setzt sich dieses Muster bis zu den reifen Spermien fort. Richtung Samenblase
erscheint die Fluoreszenz der Bündel bzw- Spermien zunehmend schwächer (G). In der
Samenblase angekommen, zeigen nur sehr wenige Spermien Fluoreszenz, was bereits
bei der Kolokalisation mit CG3213-mCherry beobachtet wurde.
A
B
C
apikales Ende
basales Ende
Stamm- D
zellen
Spermatogonien
DIC
100 µm
Orb2 4,5-eGFP
100 µm
elongierte
Spermatiden
/H
E
Spermatozyten
F
G
elongierende Spermatiden
Ergebnisse
D
53
E
F
F'
G
H
F'
Abbildung 4-31: Zelluläre Verteilung des größeren Orb2-eGFP-Fusionsproteins aus der Linie 59218.1 w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP 4,5}/Sb.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 10 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (1 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die schwarz umrahmten Ausschnitte (in C)
markieren Regionen, aus denen CLSM-Aufnahmen (D-H) angefertigt wurden. D–F: CLSM-Aufnahmen
unterschiedlicher Regionen im Testis. Der weiß umrahmte Ausschnitt in F markiert die Region, welche
vergrößert dokumentiert wurde (F'). Die Samenblase (H) ist in der Schemazeichnung nicht dargestellt. Die
Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
Im Vergleich zu dem größeren Orb2 (Abb. 4-31) ist das kleinere (Abb. 4-32) weniger homogen im Zytoplasma verteilt, was sich bereits in der Hodenschlauchspitze zeigt (D).
Auch auffällig ist eine massive Anhäufung des Fusionsproteins in den waste bags (E), das
bei dem größeren Orb2 nicht beobachtet wurde. Die Fluoreszenz in den Spermatidenbündeln hingegen scheint bei dieser Proteinvariante einheitlicher. So ist das wellenartige Expressionsmuster in den Spermatidenbündeln nicht mehr so stark ausgebildet. Auch die
Anhäufung in den distalen Enden ist nicht mehr zu beobachten. Es scheint hier eher
durchgehend in den elongierten Stadien lokalisiert (F/G). Aber auch in diesem Fall ist das
Protein nicht in allen Bündeln vorhanden ({ in G). Nach basal scheint die Intensität der
Orb2-exprimierenden Bündel nicht wie bei dem großen Orb2 abzunehmen, sodass einige
Bündel kurz vor der Samenblase noch sehr intensiv fluoreszieren (H). Auch in der Samenblase selber scheint das kürzere Orb2 Protein im Vergleich zu dem größeren mehr lokalisiert (I). Allerdings nicht nur in den Keimzellen (► in I), sondern auch vermehrt in den
Epithelzellen der Samenblase (→ in I).
54
Ergebnisse
A
B
C
apikales Ende
basales Ende
Stamm- D
zellen
H
E
Spermatogonien
DIC
80 µm
Orb2 3,7-eGFP
F
Spermatozyten
80 µm
D
E
F
G
H
I
elongierte
SpermaG
tiden
elongierende Spermatiden
Abbildung 4-32: Zelluläre Verteilung des kürzeren Orb2-eGFP-Fusionsproteins aus der Linie 91928.1 w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP 3,7}/Sb.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit OptiGrid® structured light illumination. DIC mit 10 ms
(A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (9 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die schwarz umrahmten
Ausschnitte markieren Regionen, aus denen CLSM-Aufnahmen (D-I) angefertigt wurden, wobei die
Samenblase (I) in der Schemazeichnung nicht dargestellt ist. Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt
Da eine Differenz in der Verteilung der beiden Proteine besteht (siehe oben), könnte es
tatsächlich wichtig sein, eine Kolokalisation mit anderen regulierenden Kandidaten des
mst87F-RNP-Komplexes getrennt für die beiden Orb2-Proteine zu überprüfen. Jedoch
muss dazu eine neue Fusion mit mCherry erfolgen und die Konstrukte erneut in Fliegen
injiziert werden. Dies kann leider nicht im zeitlichen Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgen.
Ergebnisse
55
4.4. Tob – ein möglicher Interaktionspartner von Orb2 in der Drosophila-Spermatogenese
In der Analyse von Giot et al. (2003) wurde das Protein Tob als Interaktionspartner von
Orb2 identifiziert. Im Nervensystem von Drosophila konnte eine solche Interaktion tatsächlich gezeigt werden (White-Grindley et al., 2014). Es liegt daher nahe, dies auch für
die Spermatogenese zu überprüfen.
Frühere Fusionskonstrukte (Starck, 2007) ergaben ein relativ schwaches Signal. Ein Vergleich der Genomsequenz von Tob aus der damaligen FlyBase-Version (Dmel Release
5.2) mit der derzeit aktuellsten Version (Fb2015_04) ergibt, dass 5.194 Basenpaare vor
der ehemaligen 5'UTR ergänzt wurden. Dadurch sind nun insgesamt vier tob-Transkripte
bekannt (RA: 3,6 kb, RC:7,8 kb, RE: 3,3 kb und RF: 4,6 kb), welche drei unterschiedliche
Polypeptide (PA und PF: 564 AS, PC: 536 AS und PE: 533 AS) kodieren. Da die neue
Tob-Gensequenz zusätzliche Promotor- und 5'UTR-Sequenzen aufweist, müsste das vorher beobachtete Expressionsmuster von einem artifiziellen Transkriptionsstart herrühren
und damit nicht das Tob-typische Expressionsmuster wiederspiegeln. Also musste die
Transkriptsequenz mit dem neu definierten Transkriptionsstart erneut in einen P-ElementVektor einkloniert und das Konstrukt mittels P-Element vermittelter Keimbahntransformation (siehe 6.1.2.) in das Drosophila-Genom integriert werden. Zum Vergleich mit den existierenden Orb2-eGFP-Konstrukten wurde dabei die Fusion mit mCherry vorgenommen.
Da nur die in Hoden exprimierten Transkripte relevant sind, wird der Fokus auf eine hodenspezifische RNA gelegt. Es konnte in einem Northern-Experiment ein testisspezifisches tob-Signal von 3,1 kb Länge detektiert werden (Starck, 2007), welches dem aktuellen
RA (3,6 kb)- oder RE (3,3 kb)-Transkript entsprechen könnte.
4.4.1. Quantifizierung der beiden tob-Transkripte RA und RE
Im Folgenden soll mittels qPCR festgestellt werden, welches der beiden tob-Transkripte
häufiger in den männlichen Gonaden transkribiert wird und damit höchstwahrscheinlich
die beobachtete RNA von 3,1 kb Länge darstellt. Für die Quantifizierung werden jeweils
transkriptspezifische 5'UTR- Regionen für tob-RA und tob-RE ermittelt und darin entsprechende Primer definiert. Die Position der qPCR-Amplifikate ist in Abbildung 4-33
graphisch dargestellt.
56
Ergebnisse
+3.639
+1
Tob-RA
Promotor
5'
#501
Intron
5'
ORF 3'
#502
+1
Tob-RE
+3.304
5'
Promotor
#503
2500
Intron
ORF 3'
#504
5000
7500
10000
12500
Abbildung 4-33: Lokalisierung der tob-RA und tob-RE spezifischen qPCR-Nachweissequenzen.
Die qPCR-Nachweissequenzen für tob-RA (lila) und tob-RE (türkis) befinden sich jeweils im 5'UTR der
entsprechenden mRNA. Der Nachweis für RA erfolgt mit dem Primer-Paar #501/#502 und liefert ein
177 bp langes PCR-Produkt. RE wird mit dem Primer-Paar #503/#504 detektiert und ergibt ein 108 bp
langes PCR-Produkt.
Promotor: Flankierender Bereich, welcher vermutlich alle regulatorischen Elemente enthält (schwarze
Linie). 5' und 3': Untranslated regions (schwarz). Intron: RNA-Sequenzen, die bei der Prozessierung aus
dem precursor-Transkript geschnitten werden (weiß). ORF: Open reading frame (blau). +1: Transkriptionsstart. Maßstabsbalken: Länge der Gensequenz in Basenpaaren. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Als template für die qPCR-Reaktion wurde mRNA mittels oligo(dT)-Beads (siehe 6.7.1.)
aus Hoden des Wildtypstamms OreR aufgereinigt. Die qPCR erfolgte wie in 6.5.2. beschrieben. Die ermittelten Tob-Signale wurden gegen das housekeeping gene rpL9 verrechnet und im relativen Verhältnis zueinander in Form eines Balkendiagramms (Abb. 4-
relative Expression zu rpL9
34) graphisch dargestellt.
Abbildung 4-34: Relative Quantifizierung der mRNA-Expression von tob-RA
und tob-RE.
*
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
tob-RA
tob-RE
Der Nachweis für tob-RA erfolgte mit dem
Primer-Paar #501/#502 und für tob-RE mit
#503/#504. Die Signale wurden gegen
rpL9 mit dem Primer-Paar #404/#405 referenziert und im relativen Verhältnis zueinander dargestellt. Als template wurde Gesamt-RNA aus Hoden mit Trizol® nach
6.7.2. aufgereinigt. Für jede Reaktion wurde 1 ng/µl Gesamt-RNA eingesetzt.
Biologische Replikate: n = 3. Fehlerbalken: mean with SD. Gepaarter t-Test: p (tob-RA/tob-RE) = 0,0273
(signifikant: *). Graphik erstellt mit Excel.
Das Resultat der qPCR zeigt deutlich, dass das tob-RA -Transkript in den männlichen
Drosophila-Gonaden deutlich signifikanter im Vergleich zu tob-RE vorliegt. In Erwartung,
dass diese mRNA die relevantere darstellen sollte, wurde die Sequenz von tob-RA für die
Klonierung verwendet.
Ergebnisse
57
4.4.2. Klonierung eines transkriptspezifischen Tob-mCherry-Fusionsproteins
Das neue Tob-PA-mCherry-Fusionsprotein wurde wie folgt hergestellt: Der Promotor
(2.000 bp) und der Anfang des 5'UTRs (306 bp) wurden mit dem Primer-Paar #508/#509
auf genomischer DNA amplifiziert und das Produkt zum Sequenzieren in den PBS II KS
inseriert (Konstrukt SB 1348). Die restliche 5'UTR-Sequenz und der gesamte ORF von
Tob-RA (2.527 bp) wurden auf dem cDNA-Klon LD04013, der die RNA-Struktur von tobRA kodiert, amplifiziert und in den Zwischenvektor PBS II SK (Konstrukt CO 8 von C.
Otto) einkloniert. Aufgrund der cDNA-Sequenzen werden die alternativen Transkriptionsstarts für tob-RC, -RE und -RF ausgeschlossen, die sich im Intron von Tob-RA befinden.
Anschließend wurde der ORF über die Schnittstellen aus dem Vektor CO 8 ausgeschnitten und gerichtet zu dem Promotor in Konstrukt SB 1348 ligiert (Konstrukt CO 3 von C.
Otto: Promotor und ORF in pBS II KS). Im Folgenden wurde das gesamte Promotor-ORFFragment von Tob-RA über die angehängten Schnittstellen Bgl II und Sac II aus dem Konstrukt CO 3 (Tob Promotor und ORF in PBS II SK) ausgeschnitten und gerichtet in den
vorbereiteten p{UAST}mCherry einkloniert (Konstrukt SB 1402; Abb. 4-35). Das endogene
Stopcodon wurde durch den reverse primer (#511) deletiert. Der geneigene 3'UTR wurde
nicht einkloniert. Nach der Translation resultiert ein 84,5 kDa großes Fusionsprotein.
+1
+2.833
5'
Promotor
ORF Tob-RA
Nhe I
Spe I
Bgl II
#508
1000
#510
2000
mCherry
Sac II
#509
3000
4000
#511
5000
Abbildung 4-35: Schematische Darstellung des Konstruktes Tob-mCherry (SB 1402).
Bgl II, Nhe I, Spe I, Sac II: Für die Klonierung verwendete Restriktionsschnittstellen. Promotor: Flankierender Bereich (2.000 bp), welcher vermutlich alle regulatorischen Elemente enthält (schwarze Linie). 5':
Untranslated region (schwarz). ORF: Open reading frame (blau). mCherry: Rot fluoreszierendes Protein
(711 bp, 26,7 kDa, rot). Maßstabsbalken: Länge des Konstruktes in Basenpaaren. Die Primer sind in
Lage und Orientierung durch schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern
(#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Nachdem der P-Element-Vektor mittels Keimbahntransformation (siehe 6.1.2..) in das
Drosophila-Genom integriert wurde, konnten die Fliegenlinien 1402-2.1 und 1402-2.9
(w1118/Y; P{w+, Tob-mcherry}/CyO), bei denen das P-Element auf dem 2. Chromosom integriert ist und das Tob-mCherry-Fusionsprotein exprimiert wird, etabliert werden.
58
Ergebnisse
4.4.3. Zeitliche und räumliche Expression von Tob-mCherry
Das Fluoreszenzmuster von Tob wurde in beiden etablierten Fliegenstämmen (1402-2.1
und 2.9) mikroskopisch untersucht und miteinander verglichen. Die beobachtete Intensität
der Fluoreszenz ist bei beiden Stämmen identisch. Auch ein Vergleich der zellulären Lokalisation des Fusionproteins lässt keine Unterschiede in der Proteinexpression beider
Fliegenlinien zu erkennen (Daten nicht gezeigt). Für alle weiteren mikroskopischen und
kreuzungsgenetischen Experimente wurde der Fliegenstamm 1402-2.9 (P{w+, TobmCherry}/CyO) ausgewählt.
Bereits die Übersichtsaufnahme (Abb. 4-36 B) zeigt, dass die Hodenschlauchspitze komplett frei von Fluoreszenz ist. Auch in konfokalen Aufnahmen dieser Region ist kein Protein in den Spermatogonien und Spermatozyten zu detektieren (Daten nicht gezeigt).
Somit scheint für Tob eine Expression in den elongierten Spermatiden charakteristisch zu
sein. Desweiteren ist im direkten Vergleich der DIC und Fluoreszenzaufnahmen (A/B) zu
erkennen, dass Tob < anders als bei CG3213-eGFP (Stinski, 2011) > in allen Spermatidenbündeln des Hodens lokalisiert ist. In den distalen Spermatiden erscheint das Fluoreszenzsignal besonders intensiv ({ in B). Bei stärkerer Vergrößerung konnte in dieser
Region in manchen Organen eine ringförmige, manchmal auch U-förmige Verdickung
beobachtet werden ({ in D). Bei der Mehrzahl der analysierten Gonaden hingegen sind
rundgeformte, blind endende Bündel aufgefallen, die überwiegend parallel zueinander
angeordnet sind (→ in E).
Ähnlich wie bei Orb2 (siehe 4.3.4.) ist auch das Tob-Protein nicht in den Axonemen lokalisiert, sondern es füllt eher die gesamten Spermatidenschwänze aus ({ in E). In einem
nochmals vergrößerten Ausschnitt sind deutlich aufgelockerte Regionen zu erkennen, die
lochartige Strukturen hinterlassen. Dieses Muster erweckt den Eindruck, dass die Bündel
mit einer perforierten Membran umhüllt sind. Ein direkter Vergleich mit CLSM-Aufnahmen
von MitoTracker® gefärbten Spermatiden in der Publikation von Noguchi et al. (2011) lässt
vermuten, dass es sich bei dem hier beschriebenen Muster um mitochondrielle Strukturen
handeln könnte.
Am basalen Ende des Hodenschlauchs vor dem Eintritt in die Samenblase wurden großflächige, ovale Strukturen beobachtet ({ in F'), die beim Durchfokussieren des Präparates
als aufgeknäulte Spermatidenbündel identifiziert werden konnten. Desweiteren sind vereinzelte punktförmige Strukturen in dieser Region lokalisiert (→ in F''), deren Morphologie
zum jetzigen Zeitpunkt nicht zugeordnet werden kann.
Ergebnisse
59
A
C
B
apikales Ende
basales Ende
F
Stammzellen
D/E
Spermatogonien
DIC
100 µm
D
F
F'
Tob-mCherry
Spermatozyten
100 µm
E
E'
F'
F''
elongierte
Spermatiden
elongierende Spermatiden
F''
15 µm
Abbildung 4-36: Zelluläre Verteilung des Tob-mCherry-Fusionsproteins aus der Linie 1402-2.9 w1118/Y;
P{w+, Tob-mCherry}/CyO.
A/B: Übersichtsaufnahmen eines Drosophila-Testis mit Axiophot. DIC mit 10 ms (A) und Fluoreszenzaufnahme (B) mit GFP (1 s) im Vergleich zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der Anordnung
der Spermatogenesestadien (Xu et al., 2012, modifiziert). Die schwarz umrahmten Ausschnitte markieren
Regionen, aus denen CLSM-Aufnahmen (D-F) angefertigt wurden. Die weiß umrahmten Ausschnitte
markieren Regionen, welche vergrößert dokumentiert wurden (E'/F'/F''). Die Maßstabsbalken wurden mit
ImageJ berechnet und eingefügt.
4.4.4. Erste Hinweise, dass Tob in Spermatiden mitochondrial lokalisiert sein
könnte
In der Literatur wurden Tob-Proteine bisher im Zytoplasma oder in Zellkernen beobachtet
(zusammengefasst in Yoshida et al., 1998 und White-Grindley et al., 2014), jedoch sind
nicht mit Zellorganellen in Zusammenhang gebracht worden. Um die Vermutung einer
mitochondrialen Lokalisation zu festigen, wurden Testes der Wildtyppopulation OreR einer
Gewebsfärbung mit MitoTracker® unterzogen und die Muster wurden miteinander verglichen. Zur Unterstützung dieser These wurden im gleichen Zug auch Testes einer Tob-anti-
60
Ergebnisse
sense-Linie (10.3 Starck, 2007) gleichermaßen untersucht. Im Vorfeld der Färbung wurden die Tob-antisense-Männchen einem Fertilitätstest (vgl. 6.2.3.) unterzogen, um sicherzustellen, dass der mutante Effekt noch erhalten ist. Aus dem Fertilitätstest geht hervor,
dass im Vergleich zum Wildtyp nur noch 40% der Tob-antisense-Männchen Nachkommen
zeugen können, weshalb einige Testes dieser Linie im Anschluss der MitoTracker ®-Färbung auf einen morphologischen Defekt hin untersucht werden mussten (Abb. 4-37).
B
A
D
Kopf
N
B
A
OreR
MitoTracker®
OreR
MitoTracker®
C
C'
C'
M
Schwanz
CM
AB
Tob-AS
MitoTracker®
Tob-AS
MitoTracker®
Abbildung 4-37: CLSM-Aufnahmen von Testes des Wildtypstamms OreR und der Tob-antisenseLinie 10.3 nach einer MitoTracker®-Färbung.
A/B: Aufnahmen eines OreR-Testis. In den Spermatozyten der apikalen Hodenregion (A) sind deutlich
Kern- (►)- und Nebenkern- (←)-Strukturen voneinander differenziert. Die elongierten Spermatidenbündel
zeigen ein lochartiges (←) Muster (B). C/C': Aufnahme eines Tob-antisense-Testis aus der mittleren Hodenschlauchregion. Die Klammer ({) rahmt eine Kern- (links) und Nebenkern- (rechts) Struktur ein. Der weiß
umrahmte Ausschnitt markiert die Region, welche vergrößert dokumentiert wurde (C'). Die Maßstabsbalken
wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt. D: Aufbau einer elongierten Drosophila-Spermatide. Der Kopf
enthält den Nukleus (N, schwarz). Das Flagellum beginnt ab dem Basalkörper (B, grau) und nach distal
folgen die Flagellenkomponenten entlang der Longitudinalachse. Anordnung der membranösen Flagellenstrukturen von innen nach außen: Axonem (A, grün), Mitochondrien (M, schwarz), zytoplasmatische Mikrotubuli (CM, rot), Aktinbündel (AB, blau). Modifiziert nach Noguchi et al., 2011.
In der apikalen Hodenschlauchspitze des OreR-Testis (Abb. 4-37, A) können die Zell- (►)und Nebenkern (←)-Strukturen deutlich voneinander unterschieden werden, was suggeriert, dass die MitoTracker®-Färbung erfolgreich war. In den Spermatidenbündeln sind
deutliche lochartige Strukturen zu erkennen (← in B), welche der Dokumentation der
Arbeitsgruppe Noguchi et al. (2011) sehr ähneln und wobei es sich wahrscheinlich um das
mitochondriale Muster handelt. Anhand der Bündel ist auch zu erkennen, dass zwar ein-
Ergebnisse
61
zelne fadenförmige Strukturen vorhanden sind, diese aber nicht so deutlich voneinander
abgegrenzt erscheinen, wie beispielsweise bei dem Expressionsmuster von CG3213 (vgl.
4.2.5.). Dieses Phänomen könnte mit dem typischen Aufbau der Flagellen von Insektenspermien (Abb. 4-37, D) zusammenhängen. Da das Axonem mittig in der Flagelle angeordnet ist und die beiden Mitochondrienderivate rundherum das Axonem umgeben, erscheint die Fluoreszenz dieser riesigen Zellorganellen verbreitert.
Im Vergleich zu dem Mitochondrienmuster des Wildtyps scheint das Signal in der Tob-antisense-Linie diffus und aufgelockert (C). Darüber hinaus sind auch in der vergrößerten
Aufnahme die Lochstrukturen nur sehr vereinzelt zu erahnen (C'), was auf eine veränderte
Morphologie hindeutet. Dies unterstützt die obige Interpretation und assoziiert Tob zum
ersten Mal mit den Mitochondrien im Gegensatz zu der bisher in der Literatur dokumentierten zytoplasmatischen Verteilung oder der Kernlokalisation (Yoshida et al., 1998).
Basierend auf diesem Ergebnis wird im Folgenden ein Screening der Peptidstruktur nach
einer mitochondrialen Target-Sequenz mit der Datenbank MitoFates (Fukasawa et al.,
2015) durchgeführt. Zusätzlich wird auch nach der bereits dokumentierten NLS (nuclear
localization signal)-Sequenz (Yoshida et al., 1998) im N-terminalen Bereich gesucht. Dieser Screen des 564 Aminosäure (AS) langen Peptids erfolgte mit der Datenbank NLS
Mapper (Kosugi et al., 2009) (Motive in Abb. 4-38 dargestellt).
NH2
Tob-PA
100
200
300
COOH
400
500
Abbildung 4-38: Schematische Darstellung der identifizierten Signalsequenzen in der Peptidabfolge von Tob-PA.
Tob-PA besteht aus insgesamt 564 AS (blau). Die vorhergesagte MPP-Schnittstelle befindet sich an Position 57, wodurch 57 AS abgespalten würden (rot). Das TOM20 Erkennungsmotiv befindet sich an der
Position 68-72 (schwarz). Die NLS weist 36 AS auf und erstreckt sich von Position 102 bis 137 (grün).
AS: Aminosäuren. NH2: N-Terminus. COOH: C-Terminus. Maßstabsbalken: Länge des Peptids in AS. Graphik erstellt mit OpenOffice 4.3.1.
Der Mitochondrien-Screen ergab N-terminal an Position 57 eine mitochondrial processing
peptidase (MPP)-Schnittstelle. Darüber hinaus wurde eine Wahrscheinlichkeit für den Export zu den Mitochondrien von 52% vorhergesagt und eine TOM20-Erkennungssequenz
an Position 68-72 erkannt. Im Weiteren konnte auch die NLS-Lokalisationssequenz von
insgesamt 36 Aminosäuren (Position 102 – 137) bestätigt werden. Die Lokalisierung der
beiden gefundenen Motive ist in Abbildung 4-38 schematisch dargestellt. Dieses Ergebnis
suggeriert, dass Tob möglicherweise zwei Zielsequenzen aufweist. In einer Literatur-
62
Ergebnisse
recherche konnten Hinweise auf solche Dual-Targes gefunden werden (zusammengefasst
in Karniely und Pines, 2005; Dinur-Mills et al., 2008).
Da das Drosophila-Tob auch eine NLS-Sequenz besitzt soll im Folgenden überprüft werden, ob ein Zusammenhang mit den Zellkernen in der Drosophila-Spermatogenese aufgezeigt werden kann und somit auch für Tob erste Hinweise einer Dual-Lokalisation dokumentiert werden können.
4.4.5. Tob ist in der Drosophila-Spermatogenese nicht kernlokalisiert
Um diese Theorie einer möglichen Dual-Lokalisation in der Keimbahnentwicklung näher
zu untersuchen, werden Testes der Tob-mCherry-Linie 1402-2.9 (P{w+, Tob-mCherry}/
CyO) einer Hoechst 33258-Färbung unterzogen, die durch eine DNA-Färbung die Lage
der Kerne zeigt (Abb. 4-39).
A
B
C
apikales Ende
D/E
A/B
OreR
Hoechst 33258
20 µm
elongierte
Spermatiden
basales
Ende
elongierende Spermatiden
Linie 1402-2.9
Tob-mCherry
Merge
50 µm
Linie 1402-2.9
Tob-mCherry
Merge
20 µm
OreR
1118
WHoechst
, Hoechst
33258
20 µm
D
Linie 1402-2.9
Hoechst 33258
E
Linie 1402-2.9
Hoechst 33258
Abbildung 4-39: Fluoreszenzaufnahmen mit OptiGrid ® von Testes des Wildtypstamms OreR und der
Tob-mCherry-Linie 1402-2.9 (P{w+, Tob-mCherry}/CyO) nach einer Hoechst 33258-Färbung.
Fluoreszenzaufnahmen des Wildtyps OreR (A/B) und der Tob-mCherry-Linie 1402-2.9 (D/E) im Vergleich
zu einer schematischen Darstellung des Testis (C) mit der Anordnung der Spermatogenesestadien (Xu et
al., 2012, modifiziert). Die schwarz umrahmten Ausschnitte markieren Regionen, aus denen Fluoreszenzaufnahmen (A/B/D/E) angefertigt wurden. Die Pfeile (→) deuten auf die Regionen der Zellkerne hin. Die
Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
Ergebnisse
63
Die Hoechst 33258-Färbung war sowohl beim Wildtyp als auch bei der Tob-mCherry-Linie
erfolgreich, da in beiden Fällen die nadelförmigen Spermatidenkerne, welche sich parallel
in den Spermatidenbündeln anordnen, zu erkennen sind (← in A/B/D/E). Eine Überlagerung der Hoechst 33258- und RFP-Bilder aus den Tob-mCherry-Organen (D/E) schließt
eine Kernlokalisierung des Tob-mCherry-Proteins aus. Auch eine Farbänderung der
Hoechst-Bilder in grün und anschließender Überlagerung verändert das Ergebnis nicht.
Die Kerne zeigen lediglich sehr geringe Tob-mCherry-Fluoreszenz.
4.4.6. Tob kolokalisiert begrenzt mit dem großen Orb2 in den Spermatiden
Zur weiteren Charakterisierung von Tob wurde ein Fliegenkombinationsstamm analysiert,
welcher Tob-mCherry und Orb2-eGFP gleichzeitig exprimiert. Konfokale Aufnahmen von
Testes dieser Linie sollen zeigen, ob die beobachteten Expressionsmuster der beiden Fusionsproteine (siehe 4.3.4.und 4.4.3.) miteinander übereinstimmen. Zur schnellstmöglichen Analyse dieser Hypothese wurden die beiden Fliegenlinien 592-18.1 (w1118/Y; P{w+,
Orb2-eGFP 4,5/Sb}) und 1402-2.9 (w1118/Y; P{w+, Tob-mCherry/CyO} miteinander gekreuzt
und der daraus resultierende Genotyp w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP/Sb}/+; P{w+, TobmCherry}/+ mikroskopiert (Abb. 4-40).
Während Orb2 in der gesamten Spermatogenese exprimiert wird (◄ in A/A') ist Tob nur in
den elongierten Keimzellstadien vorhanden. Dadurch wird auch der zeitliche Rahmen für
eine Kolokalisation stark eingegrenzt. Dennoch kann ein gemeinsamer Expressionsort der
beiden Fluoreszenzproteine in den distalen Enden der Spermatiden erkannt werden, welche in der Hodenschlauchspitze arrangiert sind (→ in A). In der Vergrößerung eines solchen Spermatidenendes ist in der überlagerten Aufnahme (A') ersichtlich, dass anscheinend beide Proteine ein lochartiges Muster ausbilden, welches zuvor als MitochondrienMuster beschrieben wurde (vgl. Abb. 4-37). Weiter basal hingegen ist in den elongierten
Bündeln jeweils nur eines der beiden Fusionsproteine vorhanden, weshalb dort keine gemeinsamen Lokalisationsorte beobachtet werden konnten (Abb. 4-40, A/B/C).
A
A'
Orb2 4,5-eGFP
Tob-mCherry
Merge
64
Ergebnisse
A'
Orb2 4,5-eGFP
Tob-mCherry
Merge
Tob-mCherry
Merge
Tob-mCherry
Merge
B
Orb2 4,5-eGFP
C
Orb2 4,5-eGFP
Abbildung 4-40: Expression und subzelluläre Lokalisierung der Fusionsproteine Tob-mCherry und
Orb2-eGFP aus dem Kombinationsstamm w1118/Y; P{w+, Tob-mCherry/CyO}; P{w+, Orb2-eGFP 4,5}/Sb.
A-C: CLSM-Aufnahmen unterschiedlicher Regionen im Testis. Der weiß umrahmte Ausschnitt markiert die
Region, welche vergrößert dokumentiert wurde (A'). Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und
eingefügt.
Im Weiteren wird das Tob-Muster mit dem des kleineren Orb2-Proteins verglichen. Für
diese Analyse wurden die beiden Ausgangsstämme 1402-2.9 (w1118/Y; P{w+, Tob-mCherry/
CyO}) und 919-28.1 (w1118/Y; P{w+, Orb2 3,7-eGFP/Sb} miteinander gekreuzt und die daraus resultierenden Nachkommen mit dem Genotyp w1118/Y; P{w+, Tob-mCherry}/+; P{w+,
Orb2 3,7-eGFP}/+ konfokal mikroskopiert (Abb. 4-41).
Bereits eine schwache Vergrößerung des Organs ist ausreichend, um ein drastisch abweichendes Expressionsmuster von dem kleinen Orb2 zu erkennen. Die wellenartigen Lokalisationsphasen in den distalen Spermatidenenden (vgl. Abb. 4-31, A/A') scheinen nicht
Ergebnisse
65
vorhanden zu sein. In den analysierten Organen konnten keine eindeutigen Hinweise
einer Kolokalisation der beiden Proteine beobachtet werden. Auch an distalen Enden
(Abb. 4-41, ←in A) ist nur das Tob-mCherry-Signal zu erkennen.
A
Orb2 3,7-eGFP
Tob-mCherry
Merge
Tob-mCherry
Merge
B
Orb2 3,7-eGFP
Abbildung 4-41: Expression und subzelluläre Lokalisierung der Fusionsproteine Tob-mCherry und
Orb2-eGFP aus dem Kombinationsstamm w1118/Y; P{w+, Tob-mCherry}/CyO; P{w+, Orb2-eGFP
3,7}/Sb.
A/B: CLSM-Aufnahmen unterschiedlicher Regionen im Testis. Die Maßstabsbalken wurden mit ImageJ berechnet und eingefügt.
Im Gegensatz zu dem größeren Orb2-Protein, fehlen außerdem die lochartigen Muster,
die auf mitochondriale Lokalisation hindeuten könnten. Als zusätzliche Absicherung wurden beide Orb2-Proteinvarianten analog wie Tob auf NLS- und Mitochondrien-Lokalisierungssequenzen hin untersucht. Innerhalb der 704 aminosäurelangen Proteinsequenz des
größeren Orb2 konnte wie auch in Tob mit der Datenbank MitoFates (Fukasawa et al.,
2015) eine Schnittstelle für die mitochondrial processing peptidase (MPP) an Position 68
gefunden werden. Jedoch ist nur eine 16%-ige Wahrscheinlichkeit für den Export in die
Mitochondrien vorhergesagt. Weiterhin wurde, anders als bei Tob, in dieser Proteinvariante kein TOM20-Erkennungsmotiv gefunden. Für das kleinere Orb2-Protein wurde innerhalb der 551-Aminosäuresequenz eine MPP-Schnittstelle an Position 71 gefunden und
ein TOM20-Motiv, aber ein Export in die Mitochondrien mit einer Wahrscheinlichkeit von
0,5% nahezu ausgeschlossen. Der Screen bezüglich der NLS-Sequenz erfolgte mit der
66
Ergebnisse
Datenbank NLS-Mapper (Kosugi et al., 2009) und war für beide Orb2-Varianten negativ.
Diskussion
67
5. Diskussion
5.1. Ist neben dem TCE auch der Mechanismus innerhalb der Genfamilie konserviert?
Alle Mitglieder der Genfamilie Mst(3)CGP (male-specific transcript) enthalten das 12 Nukleotid lange translational control element (TCE) an identischer Position (+28/+39; Schäfer et al., 1990). Dieses cis-regulierende Element vermittelt negative Translationskontrolle
an allen Genmitgliedern dieser Familie. Der generelle Mechanismus der Translationskontrolle, also das Kompaktieren der mRNAs mit diversen Proteinen, ist für alle gleich. Jedoch stellt sich die Frage, ob die einzelnen Schritte auch bei allen Genen innerhalb dieser
Familie identisch ablaufen. Die Repression erfolgt für alle sieben Gene höchst wahrscheinlich zeitgleich, nämlich prämeiotisch. Aber es ist denkbar, dass die Transkripte der
verschiedenen Genmitglieder zu individuellen Zeiten aktiviert werden. Es müssten also
bestimmte Faktoren dazu führen, dass andere Protein-Protein-Wechselwirkungen erfolgen und die reprimierende Formation selektiv für die einzelnen Transkripte in einen translationsaktivierenden RNP-Komplex wechseln kann. Solche Signale könnten beispielsweise durch Phosphorylierung, Affinitätsänderung von Proteinen und Änderungen der Menge
bestimmter Proteine ausgelöst werden.
Um die Zusammensetzung des mst87F-RNP-Komplexes fortführend zu charakterisieren,
wurden Bindungsstudien mit den einzelnen rekombinanten Proteinen Exuperantia, Orb2
und CG3213 durchgeführt. Dabei ergab sich, dass Orb2 stabiler an mst87F bindet als an
mst98Ca, was besonders in der spezifischen Kompetition deutlich wird (siehe Abb. 4-9).
So ist durch Zugabe nicht-markierter mst87F-mRNA der Komplex an der radioaktiven
mst98Ca-mRNA schneller verdrängt worden. Im umgekehrten Fall war deutlich mehr
nicht-markierte mst98Ca-RNA nötig, um einen Verdrängungseffekt an dem mst87F-Komplex auszulösen (siehe Abb. 4-9). CG3213 bindet in beiden Fällen die Transkripte sehr
viel effizienter. Im Fall von mst87F ist gar kein freies IVT übrig geblieben (siehe Abb. 410), während bei mst98Ca eine schwache Bande auf Höhe des IVT nachweisbar bleibt.
Diese Proteinbindungen mit unterschiedlicher Effizienz könnten auf die oben erwähnte individuelle zeitliche Regulation hindeuten. Sollte der Komplex von mst98Ca schneller dissoziieren, könnte diese RNA zu einem früheren Zeitpunkt als mst87F translatiert werden.
Im Fall von Exuperantia (Exu) konnte weder an mst87F noch an mst98Ca eine Bindung
nachgewiesen werden, was auch schon Stinski (2011) beobachtete. Jedoch wurde in der
vorliegenden Arbeit das Exu-Protein gleichermaßen wie die anderen beiden über Expressionsklone synthetisiert und nicht wie bei Stinski mittels eines in vitro-Translationssynthese-Kits. Somit hatten alle Proteine die gleiche Qualität für das Experiment. Im Verlauf der
Experimente wurde immer deutlicher, dass die Aufreinigungen der rekombinanten Prote-
68
Diskussion
ine unterschiedlich erfolgreich waren. Vergleichsweise verlief die Aufreinigung von Exu
deutlich unkomplizierter. Das Protein ließ sich bei einer Temperatur von 16°C über Nacht
herstellen und war bereits ohne Zugabe von Detergenzien zu 50% von alleine löslich. Bei
der Präzipitation genügte eine geringe Konzentration von 0,25% Sarkosyl, um es restlos
in den Überstand zu bekommen (persönliche Mitteilung, C. Otto). Orb2 und CG3213
betreffend war dagegen die Zugabe von Detergenzien wie Sarkosyl unerlässlich, um eine
ausreichende Proteinmenge in Lösung zu bekommen. Orb2 erwies sich von allen
getesteten Proteinvarianten am schwierigsten. Aufgrund der denaturierenden Wirkung,
welche in Bindungsstudien auch die RNA-Proteininteraktionen hemmen würde, konnte die
Endkonzentration von Sarkosyl 0,25% nicht überschreiten. Auch Änderungen der Expressionszeit, -temperatur und verschiedene Lysepuffer erhöhten den löslichen Proteinanteil
nicht wesentlich. Insgesamt war die Aufreinigungseffizienz von Orb2 sehr variabel. In einigen Elutionsfraktionen konnte das Protein auch nicht effizient von den Beads gelöst
werden und musste verworfen werden.
Abschließend ist zu überlegen, ob die erhaltenen Resultate bezüglich der Bindungen an
die beiden mst(3)CGP-RNAs deutlicher ausfallen könnten. Ein Hinweis für die Unbeständigkeit ist, dass in manchen EMSA-Experimenten der RNP-Komplex in zwei Banden aufgetrennt wird (siehe Abb. 4-4 und 4-9). Dieser Effekt könnte möglicherweise minimiert
werden, wenn die rekombinanten Proteine in Insektenzellen exprimiert werden würden.
Womöglich sind Modifikationen notwendig, um die Proteine von alleine in Lösung zu
bringen, welche in den E.coli-Zellen nicht erfolgen. Die Aktivität der Proteine scheint jedoch nicht durch die Synthese in den Bakterien beeinträchtigt zu sein, da eindeutige Bindungen dokumentiert wurden. Allerdings war die Qualität des aufgereinigten Proteins besonders im Fall von Orb2 sehr variabel.
Mit dieser Experimentserie wird zunächst die Frage gestellt, welche individuellen Proteine
alleine an das TCE binden können. Hierbei werden überraschend unterschiedliche Bindungsstärken beobachtet, was darauf hindeutet, dass manche Proteine erst in Kombination mit anderen Proteinen richtig im Komplex verankert werden können. Eine schwächere
Bindung eines Kandidatenproteins könnte somit zeigen, dass ein Interaktionspartner fehlt,
um die Bindung zu festigen.
5.2. Expressionscharakteristika der mst87F-RNP-Kandidaten
Auf Basis der Fluoreszenzbilder aus der Kolokalisationsstudie kann folgendes Proteinexpressionsmuster für die Kandidaten CG1898, CG3213, CG12470 und Orb2 des mst87FRNA-Komplexes entworfen werden (Abb. 5-1).
Diskussion
69
Repression
Aktivierung
Proteinintensität
(dimensionslos)
CG1898
CG12470
Orb2
CG3213
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tage
Abbildung 5-1: Schematische Darstellung der Proteinexpression von CG3213, CG1898, CG12470
und Orb2 während der Drosophila-Spermatogenese.
Die Repression der mst87F-mRNA erfolgt etwa acht Tage lang von Beginn der Spermatogenese. Die
Aktivierung der Translation erfolgt im Anschluss der Elongation. Dieser dynamische Prozess wird unter
anderem durch die Kandidatenproteine CG3213 (ocker), CG1898 (braun), CG21470 (türkis) und Orb2
(hellgrün) vermittelt. CG3213 ist in der prämeiotischen Phase nur sehr schwach vorhanden und nach
der Meiose hochreguliert. CG1898 ist nur prämeiotisch nachweisbar, während CG12470 nur postmeiotisch vorhanden ist. Das große Orb2 ist während des gesamten Prozesses in allen Stadien präsent,
allerdings schwächt die Intensität während der Spermatogenese ab. Die Verlaufskurven entsprechen
den relativen Proteinmengen. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
In den Spermatozyten sind CG1898, CG3213 und Orb2 exprimiert, wobei diese Zellen ein
sehr geringes CG3213-Proteinlevel haben. Die Fluoreszenzdaten von CG1898 und
CG3213 (siehe Abb. 4-14) zeigen aufgrund der schwachen CG3213-Signale keine direkte
Kolokalisation. Dennoch sind beide Proteine zytoplasmatisch in denselben Zellen lokalisiert. Sollten diese beiden Proteine wechselwirken, so wäre es denkbar, dass nur ein geringer Anteil für diese Interaktion beansprucht wird. Ähnlich verhält es sich mit Orb2 und
CG3213 (siehe Abb. 4-15). In manchen prämeiotischen Zysten (vgl. 4-15 und 5-1) zeigen
die Keimzellen viel Orb2-Protein, während in anderen Zysten ein ähnlich schwaches Signal wie von CG3213 vorliegt. Nur in zwei kurzen Phasen konnten Signale beider Proteine beobachtet werden. Zum einen in den Spermatozyten (Abb. 4-15, D), wobei die Fluoreszenz von CG3213 sehr schwach zu erkennen ist und dadurch keine eindeutige Kolokalisation gezeigt wurde, und zum anderen in den Spermatiden im basalen Hodenschlauchbereich (Abb. 4-15, F). So wäre auch hier im Fall einer Interaktion nur ein geringer Proteinanteil in dem mst87F-RNP-Komplex involviert. Möglich wäre auch, dass die beobachteten Muster den dynamischen Wechsel der reprimierenden Form in den aktivierenden
70
Diskussion
Komplex repräsentieren.
Eine eindeutige Kolokalisation hingegen konnte zwischen CG3213 und CG12470 in den
elongierten Spermatiden erkannt werden. Beeindruckenderweise sind beide Muster sowohl in den Axonemen entlang der gesamten Flagellen als auch in den Partikeln übereinstimmend. Eine Interaktion oder ein Einlagern in bestimmte Aggregatstrukturen dieser beiden Proteine scheint daher wahrscheinlich.
Diese klar unterscheidbaren Expressionsphasen könnten in verschiedenen Regulationsmodellen eingebunden sein. Einerseits könnte die drastische Steigerung des CG3213Proteins dazu führen, dass der entstandene „Überschuss“ diverse Kandidaten aus der
reprimierenden Formation bindet und diese somit nicht mehr in dem Komplex involviert
wären, sondern an CG3213-Aggregate gebunden frei im Zytoplasma vorliegen. Durch
dieses „Wegfangen“ bestimmter Proteine aus dem Komplex würden Bindestellen für neue
Kandidaten frei. Eine andere Interpretation für das unterschiedliche CG3213-Proteinlevel
ist, dass es sich um ein generelles regulatorisches Protein handelt, welches in unterschiedlichen Signalwegen involviert ist. Jedoch kann momentan aufgrund der negativen
Datenbankanalyse keine Vorhersage für eine biologische Funktion dieses Proteins getätigt werden.
5.3. Auswirkung auf die mst87F-RNP-Modellvorstellung
Die ermittelten Resultate aus den Fluoreszenz- und EMSA-Experimenten als auch einer
Datenbankrecherche suggerieren ein abgewandeltes Regulationsmodell für den mst87FRNP-Komplex. Die Daten von Stinski (2011) haben eindeutig gezeigt, dass Exuperantia
auf die Stabilität der mst87F-mRNA Einfluss hat, wodurch es möglicherweise an die CapStruktur bindet. Das könnte erklären, weshalb keine direkte Bindung an die getestete
mst87F-Sequenz dokumentiert wurde. Lediglich in Kombination mit dFMR1 kann Exuperantia das Transkript binden (Stinski, 2011; S. Schröder, persönliche Mitteilung). Für
dFMR1 konnten Wechselwirkungen mit mst87F gezeigt werden (Stinski, 2011; S. Schröder, persönliche Mitteilung).
Mit rekombinantem Orb2 wurde eine Interaktion mit der Transkriptsequenz (+1/+45) beobachtet, jedoch deutlich schwächer als mit rekombinantem CG3213. Möglicherweise ist
bei dieser Wechselwirkung noch ein weiterer Bindepartner nötig, um CG3213 durch eine
stabile Bindung in den Komplex zu integrieren. Für den Kandidat CG12470 liegen keine in
vitro-Daten vor, weshalb diesbezüglich Datenbankrecherchen durchgeführt wurden. In
DroID wird für CG12470 eine Interaktion mit dFMR1 vorhergesagt. Die Fluoreszenzanalyse zeigt deutlich, dass das Protein nur postmeiotisch in den Spermatidenbündeln exprimiert ist. Daher scheint es in der aktivierenden Formation involviert zu sein. Auch mit
Diskussion
71
CG1898 wurden keine Experimente für in vitro-Bindungen durchgeführt. Allerdings ergaben die Suchen mit DroID und InterologFinder keine Hinweise auf Wechselwirkungen mit
bestätigten Kandidaten des mst87F-RNP-Komplexes. Die Fluoreszenzbilder suggerieren,
dass das Protein nur bis zu den Spermatozyten nachweisbar ist, weshalb es in die
reprimierende Formation eingeordnet wird. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde das
mst87F-Regulationsmodell < wie in der folgenden Abbildung 5-2 dargestellt > aktualisiert.
A
Translationsrepression
B
Translationsinitiation
Abbildung 5-2: Schematische Darstellung des dynamischen mst87F-RNP-Komplexes.
Exu (rosa), dFMR1 (blau), CG3213 (ocker), CG1898 (braun), CG12470 (türkis), Orb2 (hellgrün): Proteine
des hypothetischen Regulationsmodells von mst87F (schwarze Linie), die die reprimierende (A) bzw. die
aktivierende (B) Komplexformation repräsentieren. eIF4C/eIF4G/eIF4E: Eukaryotic translation initiation
factors (grau). TCE: Translational control element (rot). Poe: Purity of essence (grün) ist an der
sekundären Polyadenylierung beteiligt (Stinski, 2011). P: Postulierte Phosphorylierungsstellen. Pacmen:
Exonukleasen. PABP: Poly(A)-binding protein (grau). Schwarze Linie: mst87F-mRNA mit RNA 7-Methylguanosin-Cap am 5'UTR (schwarzer Halbkreis) und Poly(A)-Ende. Graphik modifiziert nach Stinski (2011)
mit Photoshop 5.0.
5.4. Zelluläre Lokalisierung des mst87F-Komplexes
Basierend auf den MitoTracker®- und PDI-Mustern können Assoziationen mit dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) und den Mitochondrienderivaten ausgeschlossen werden.
Dennoch könnten die markanten punktartigen Strukturen von CG3213 und auch
CG12470 auf eine Ansammlung in speziellen Aggregaten innerhalb des Zytoplasmas
schließen lassen und weitere Aggregate können innerhalb dieser abgetrennten Bereiche
angereichert vorliegen. Dabei könnte es sich um Zusammenschlüsse handeln, in denen
mRNAs und Proteine konzentriert vorliegen und sowohl Prozessierungen der mRNAs
vornehmen, sowie Einfluss auf die Translation durch Degradation oder silencing ausüben
(Chuma et al., 2009, Moser et al., 2010). Solche Aggregate bilden beispielsweise sogenannte processing bodies (p-bodies). Diese zytoplasmatischen p-bodies enthalten einige
Komponenten, die für mRNA-Degradation und RNA-silencing essentiell sind (beispielsweise für siRNA-Signalweg; Zusammenfassung in Liu und Gall, 2007). u-bodies bilden
ebenfalls eine Aggregatform, die im Zytoplasma von Drosophila-Schwesterzellen in der
72
Diskussion
Oogenese beobachtet wurden. Sie unterscheiden sich von den p-bodies in Größe, Form
und Verteilung. u-bodies sind eigenständige, kugelförmige Strukturen, während p-bodies
verschiedene Formen ausbilden können und oftmals große irreguläre Aggregate im
Zytoplasma formen (Zusammenfassung in Liu und Gall, 2007).
Eine weitere bereits dokumentierte Aggregatform stellen die cajal bodies dar. Diese haben
möglicherweise eine Rolle in der Biogenese des RNA-Prozessierungskomplexes (Berengues et al., 2005). Allerdings sind diese Ausbildungen zellkernlokalisiert und für die Strukturen von CG3213 und CG12470 irrelevant. Eine weitere Aggregatform konnte bislang auf
Keimzellen begrenzt werden, die germinal granules. Diese wurden sowohl in der Oogenese als auch der Spermatogenese beobachtet. Dabei handelt es sich um RNP (RNA und
Protein enthaltende)-reiche zytoplasmatische Strukturen. Diese werden von keiner Membran begrenzt und sind dadurch amorph. Diese Struktur wird in zwei Gruppen unterschieden, den chromatoid bodies und dem intermitochondrial cement, welche sich in ihrer zellulären Lokalisierung und ihrem zeitlichen Auftreten voneinander unterscheiden.
Chromatoid bodies sind deutlich im Zytoplasma von haploiden Spermatiden ausgebildet
und vergrößern sich merklich im Anschluss an die Meiose. Der intermitochondrial cement
wurde zwischen mitochondrialen Klustern in Typ-A-Spermatogonien beobachtet. In Typ-B
Spermatozyten sind diese Körperchen auf ultrastruktureller Ebene nicht mehr detektierbar, jedoch wachsen sie auf unerklärliche Weise ab dem Midpachytänstadium der Spermatozyten deutlich an (Chuma et al., 2009). Leider können demnach auch diese Strukturen nicht mit den beobachteten Partikeln in CG3213 und CG12470 in Verbindung gebracht
werden, da die Partikel des mst87F-Komplexes erst in den elongierten Spermatiden auftreten, aber die beiden Formen der chromatoid bodies nur in Spermatozyten beobachtet
wurden. Zumindest sind keine Aufzeichnungen über elongierte Spermatiden vorhanden.
Dieses Resultat führte zu einer abweichenden Recherche. Vergleiche der Fluoreszenzmuster deuten darauf hin, dass es sich um testisspezifische Proteasome (Zhong und Belote, 2007; Kniepert und Groettrup, 2014) handeln könnte, welche der Caspase-9 (Arama
et al., 2003) erstaunlich ähneln (Abb. 5-3). Um diese Vermutung zu überprüfen, könnte
eine weitere Kolokalisationsstudie mit CG12470 erfolgen, oder eine Färbung der Caspase
Dronc in einem CG3213-mCherry-Testis hilfreich sein.
Diskussion
73
A
Dronc
B
20 µm
CG12470-eGFP
CG3213-mCherry
Abbildung 5-3: Vergleich der
Fluoreszenzmuster von CG3213,
CG12470 und Caspase-9.
A: Expression eines ApoptoseKomplexes (modifiziert nach Arama, 2003). Der Nachweis erfolgte
mit einem Dronc-Antikörper (grün).
B: Merge-CLSM-Aufnahme von
CG12470 (grün) und CG3213
(rot). Die Pfeile → deuten auf elongierte Spermatidenbündel hin, die
Pfeilspitzen ► deuten auf die cystic bulges hin. Maßstabsbalken mit
ImageJ berechnet und eingefügt.
5.5. Orb2 und CG3213 binden die protamin-mRNAs mit unterschiedlicher Affinität
Die beiden Kompetitionsexperimente (siehe Abb. 4-27, 4-28) belegen, dass protamin A
der affinere Bindepartner für Orb2 zu sein scheint. Die EMSA-Experimente suggerieren
auch, dass in den in vitro-Bindungsanalysen die Häufigkeit der CPE-Sequenzen innerhalb
eines protamin-Transkripts keine Auswirkungen auf die Bindungseigenschaften hat, da
protamin A affiner zu sein scheint, aber im Gegensatz zu protamin B nur ein CPE-Motiv
aufweist. Allerdings zeigt die erste Bindungsstudie den gegenteiligen Effekt (siehe Abb. 426). Dort ist die gesamte Menge protamin B mit Orb2 in einem Komplex gebunden. Diese
Unregelmäßigkeiten zeigen die Sensibilität des Experimentes und die Schwierigkeit einer
einheitlichen Orb2-Aufreinigung. Beeindruckenderweise konnte mit rekombinantem
CG3213 in beiden Fällen eine Wechselwirkung mit den CPE-enthaltenden Sequenzen
dokumentiert werden. In beiden Fällen wurden zwei Banden aufgetrennt, wobei im Fall
von protamin B der obere Komplex deutlich mehr Transkript gebunden hat als der untere.
Über die Affinität von Orb2 zu den beiden RNA-Sequenzen kann keine Aussage getroffen
werden. Diese müsste in Kompetitionsexperimenten ermittelt werden.
Mit den erzielten Resultaten kann leider kein hypothetisches Regulationsmodell erstellt
werden. Im Weiteren ist auch die Rolle von Exuperantia in diesem CPE-Komplex von Interesse. Da es sich bei den protaminen um translationskontrollierte mRNAs handelt, ist es
wahrscheinlich, dass Exuperantia auch eine stabilisierende Funktion auf diese RNAs ausübt. In der Bindungsstudie konnte keine direkte Bindung nachgewiesen werden, aber dies
ist keine Voraussetzung für eine Funktion in dem Komplex. Exu könnte auch über ProteinProtein-Wechselwirkungen in dem Komplex integriert werden. Um auf anderem Weg eine
Bedeutung von Exuperantia für die protamine nachzuweisen, könnte ein Northern-Experiment durchgeführt werden, mit mRNA aus Testesgewebe von Wildtyp-Fliegen und hetero-, sowie homozygoten exu(DP3)-Hoden. Sollte Exuperantia auch an den beiden protaminmRNAs Stabilität vermitteln, so wäre in den homozygoten Geweben eine drastische Re-
74
Diskussion
duzierung des RNA-Gehaltes oder sogar ein gänzliches Fehlen der Transkripte die Folge.
5.6. Sekundäre Polyadenylierung an protamin-mRNAs ist nicht mit RNaseH nachweisbar
In dem RNaseH-Experiment konnte kein direkter Zusammenhang zwischen Orb2 und der
sekundären Polyadenylierung der protamin-Transkripte hergestellt werden. Leider fehlen
bei beiden Experimenten die Signale aus den Wildtyp-Extrakten (siehe Abb. 4-29 und 430). Anhand der erhaltenen protamin-Signale können zudem keine Hinweise einer sekundären Polyadenylierung erkannt werden, wie es bei mst87F der Fall ist. Dort ist deutlich das Banden-Signal in einem heterogenen Muster in den unbehandelten Proben zu erkennen (siehe Abb. 4-30), welches zu größeren Mengen hin schwächer wird. Bei protamin hingegen ist ein heterogenes Signal unterhalb der Bande (siehe Abb. 4-29) zu beobachten, das auf Degradationsprodukte zurückgeführt wird. Dass es sich dabei um Transkripte handelt, die sich in dem Polyadenylierungsprozess befinden, ist unwahrscheinlich,
da der RNA-Extrakt alle Zellen der Spermatogenese enthält und die sekundäre Polyadenylierung nicht zu Beginn der Spermatogenese erfolgt. Somit müsste wie bei mst87F eine
dickere untere Banden und darüber längere Transkripte aufgrund des unterschiedlichen
Polyadenylierungsstatus aufgetrennt worden sein.
Die Bindungsexperimente zeigen auch, dass die Proteine zur Translationskontrolle in verschiedenen Komplexen benutzt werden, da sie mit unterschiedlichen cis-Elementen (TCE
und CPE) interagieren. Man kann somit annehmen, dass dies auch Auswirkungen auf die
Komplexbildung hat, was mit einer individuellen Bindungsstärke einhergeht. Möglicherweise resultiert dies aus der Interaktion mit verschiedenen Protein-Bindungspartnern. Das
Vorhandensein der CPE-Sequenzen setzt nicht voraus, dass die Regulation identisch mit
der von mst87F ablaufen muss. Das bedeutet, dass die Translationsinitiierung der protamin-RNAs nicht mit einer sekundären Polyadenylierung einhergehen muss. Darüber hinaus unterliegt die Aktivierung der protamin-RNAs anderen zeitlichen Anforderungen: Die
Translation der protamin-Trnaskripte erfolgt vor der Aktivierung der mst(3)CGP-Transkripte (Blümer et al., 2002), sodass sich ein direkter Vergleich mit dem mst87F-Komplex nicht
anbietet.
5.7. Tob scheint in der Drosophila-Spermatogenese mitochondrial assoziiert
Tob-Proteine wurden sowohl in einigen Vertebraten (Mensch, Huhn, Maus, Frosch,
Lanzettfischchen) als auch in vielen Invertebraten (Fadenwurm, Fruchtfliege) identifiziert.
Unterschiedlich ist, dass in vielen Säugern zwei Gen-Unterfamilien dokumentiert sind. Da
in Fischen bislang nur ein Tob-Mitglied gefunden wurde, haben Autoren vermutet, dass
die zweite Untergruppe aufgrund einer Genduplikation entstanden ist (zusammengefasst
Diskussion
75
in Jia und Meng, 2007). Ein Abgleich mit der aktuellen Flybase-Datenbank ergibt, dass aktuell drei unterschiedliche Tob-Proteine in Drosophila exprimiert werden, die von einem
Gen synthetisiert werden und somit derselben Unterfamilie angehören.
Die zelluläre Lokalisierung der Tob-Proteine ist noch stark diskutiert. Bekannt ist, dass Tob
innerhalb der oben erwähnten Taxa sowohl im Zytoplasma als auch in Zellkernen beobachtet wurde. Jedoch korreliert die Wahrscheinlichkeit einer Zellkernlokalisierung mit
ansteigendem Tob-Proteinlevel. Auf zellulärer Ebene wurden diese Proteine auch an den
dendritischen Enden von Neuronen im postsynaptischen Spalt beobachtet (White-Grindley et al, 2014). Allerdings sind bislang keine Assoziationen mit Zellorganellen publiziert.
In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein Tob-Protein mit den beiden riesigen Mitochondrienderivaten in Zusammenhang gebracht werden, was aufgrund der MitoTracker ®Färbung von Tob-defizienten Testes angenommen wird. Diese mutanten Organe bilden
das charakteristische Muster nicht mehr aus, was auf eine strukturierende Funktion innerhalb der Mitochondrienderivate schließen lässt. Das Resultat unterstützt die Beobachtungen in der Dissertation von Starck (2007), dass die Tob-antisense-Männchen zwar alle
Spermatogenesestadien enthalten, aber die Spermien keine Motilität aufweisen. Hierfür
könnten verschiedene Ursachen verantwortlich sein. Es sind bereits diverse Mutationen
beschrieben, die Einfluss auf die Ausbildung der Mitochondrienderivate ausüben, wodurch
das Wachstum und die Beweglichkeit der Spermien stark eingeschränkt, bzw. verhindert
wird (Noguchi et al., 2011). Da die Tob-mutanten Organe alle Stadien vollständig ausgebildet haben, aber die MitoTracker®-Färbung eine abnormale Mitochondrienstruktur aufzeigt,
könnte ein Effekt in der Elastizität oder der Schlagfähigkeit der Spermienschwänze resultieren.
5.8. Kann Tob mehrere Zielorte haben?
Der Screen der Tob-Proteinsequenz lieferte die bereits in der Literatur beschriebene NLSSequenz und zusätzlich eine Schnittstelle für eine mitochondrial processing peptidase
(MPP), sowie ein TOM20-Lokalisierungsmotiv. Weiterhin stellt sich aufgrund der mikroskopischen Analysen < welche eine Kernlokalisation verneinen, jedoch die Mitochondrienlokalisation begünstigen > und der Datenbankrecherchen die Frage, ob es sich bei Tob um
ein Protein handelt, welches mehrere Zielorte haben könnte. In der Literatur sind bereits
mehrere Beispiele dokumentiert, in denen ein Isoprotein mehrere Targetsequenzen beinhaltet. Abhängig von dem Phosphorylierungsstatus können somit zellspezifisch die einzelnen Lokalisierungssequenzen aktiviert oder maskiert werden (zusammengefasst in
Karniely und Pines, 2005). In der Drosophila-Spermatogenese ist Don Juan (DJ) als ein
Beispiel einer mitochondrialen und einer Zellkern-Lokalisation dokumentiert (Santel et al.,
1998). Die Autoren beschreiben ein DJ-Verteilungsmuster, welches dem von CG3213 und
76
Diskussion
CG12470 auffallend ähnelt. Weiterhin glauben die Autoren, dass die punktartigen Strukturen entlang der Flagellen durch Assoziationen mit den beiden Mitochondrienderivaten
(major und minor) zu erklären sind. Allerdings konnte anhand der MitoTracker®-Färbung in
der vorliegenden Arbeit ein Zusammenhang mit den Mitochondrien bezüglich dieser Muster für CG3213 und CG12470 gänzlich ausgeschlossen werden.
Um diese Frage für Tob in der Spermatogenese zu beantworten, müssten weitere Analysen erfolgen. Es kann ausgeschlossen werden, dass die C-terminal fusionierte mCherrySequenz ausschlaggebend für diese Lokalisation ist, da andere Proteine, die gleichermaßen mit dem mCherry fusioniert wurden ein anderes Verteilungsmuster zeigen. Um die
vermutete Lokalisierung zu bestätigen könnte die mutmaßliche Target-Sequenz deletiert
werden und das Fluoreszenzmuster des veränderten Proteins erneut analysiert werden.
Ein weiteres Experiment könnte eine spezifische Aufreinigung der Mitochondrienmembran
darstellen. Nach der Isolierung könnte die Membranfraktion in einem Western-Blot mit
einem mCherry-Antikörper untersucht werden, ob sich das Fusionsprotein im Vergleich zu
einem nicht mitochondrial-lokalisierten Protein in dieser Fraktion befindet.
5.9. Tob kolokalisiert auch in der Drosophila-Spermatogenese mit Orb2
Eine Interaktion zwischen Tob und Orb2, welches seit geraumer Zeit aufgrund eines twohybrid-screens vermutet wurde (Giot et al, 2003), konnte in aktuellen Publikationen im
Zentralen Nervensystem (ZNS) beobachtet werden (Robinson 2014, White-Grindley et al,
2014). Damit zusammenhängend wurde seit geraumer Zeit die Funktion von Tob in den
Neuronen diskutiert (Yoshida et al., 1998; Jia und Meng, 2007; White-Grindley, 2014). In
der Drosophila-Spermatogenese konnte der Einfluss von Orb2 auf die tob-mRNA gezeigt
werden (Starck, 2007), welche entweder eine Stabilisierung oder eine Lokalisation bewirkt. In beiden Fällen wäre eine Reduktion des lokalisierten mRNA-Pools zu beobachten.
Protein-Wechselwirkungen zwischen den beiden Kandidaten sind bislang in der Spermatogenese jedoch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten nun auch die ProteinProtein-Interaktionen in den distalen Spermatidenenden dokumentiert werden (siehe Abb.
4-40). Es wäre denkbar, dass Orb2 auf die tob-mRNA eine stabilisierende Wirkung ausübt, was dem Ergebnis der in situ-Hybridisierung von Starck (2007) entsprechen würde.
Die Wechselwirkung auf Proteinebene könnte sich auf regulatorische Funktionen beziehen oder Modifizierungen der Spermatiden betreffen. Zumindest hat es den Anschein, da
die Kolokalisation nur an den distalen Enden beobachtet wurde, dass es sich um polarisierende oder fortschreitende Individualisierungen handeln könnte. Eine solche Rolle
innerhalb der Spermatogenese konnte dem Orb2 auch in der Publikation von Xu et al.
(2014) zugeschrieben werden. Weiterhin ist Orb2 in der Literatur mit dem Langzeiterinnerungsvermögen im zentralen Nervensystem (ZNS) in Verbindung gebracht worden (Robin-
Diskussion
77
son, 2014; White-Grindley, 2014), welche ebenfalls stark polarisierte Zelltypen repräsentieren. Es wäre denkbar, dass Orb2 eine essentielle Komponente innerhalb eines grundlegenden polarisierenden Prinzips darstellt, welches in unterschiedlichen Signalwegen zur
Anwendung kommt. Basierend auf der fehlenden Kolokalisation zwischen Tob und dem
kleineren Orb2 (siehe Abb. 4-41) und im Weiteren der Beobachtung von Starck (2007),
dass Mutanten der kleinen Proteinvariante keinen Spermatogenesedefekt provozieren,
scheint das kleine Orb2 für die männliche Keimzellentwicklung weniger entscheidend zu
sein. Allerdings konnte eine Mutante, der die große Orb2-Variante fehlt, durch Überexpression der kleinen Orb2-Variante gerettet werden (Starck, 2007). Zur eindeutigen Aufklärung der Frage nach einer polarisierenden Funktion von Orb2 müssen weitere Experimente erfolgen. Solche Analysen gestalten sich aufgrund der Heterogenität der einzelnen
Stadien schwierig. Die einzige Möglichkeit einer solchen Untersuchung wäre eine Kultivierung einzelner Zysten, wie sie in der Publikation von Awe und Renkawitz-Pohl (2010)
beschrieben wurde.
Um eine direkte Proteininteraktion der beiden Kandidaten in vivo zu zeigen, könnte eine
Co-Immunopräzipitation (Co-IP) mit anschließender Massenspektrometrie hilfreich sein.
Da sowohl Orb2 als auch Tob in vielen Geweben exprimiert werden, wäre eine solche
Analyse nur an isoliertem Testes-Gewebe möglich. Eine Interaktion von Orb2-Protein und
tob-mRNA wurde bereits von Starck (2007) vermutet. Um diese Annahme experimentell
zu bestätigen, könnte im Anschluss einer Co-IP mit Orb2 als Anker eine RT-PCR mit Tobspezifischen Primern auf die Eluatfraktion durchgeführt werden.
78
Methoden
6. Methoden
6.1. Fliegenarbeiten
6.1.1. Aufzucht und Haltung von Drosophila
Die Haltung der Drosophila-Fliegenstämme erfolgt bei 16°C bzw. 24°C in speziellen Kühlzellen (LW 600 DIN). Die Tiere selbst werden in Drosophila-Zuchtgefäßen gehalten, welche mit Caeprenstopfen verschlossen sind. Für eine Massenaufzucht werden die Fliegen
in größeren Flaschen (102 mm x Ø 48 mm) vermehrt, die gewöhnliche Haltung hingegen
erfolgt in kleineren Kulturröhrchen (82 mm x Ø 36 mm). Um die etablierten Fliegenlinien in
einem guten Zustand zu erhalten und um einem Milbenbefall vorzubeugen, werden sie
zweimal wöchentlich auf neue Gefäße umgesetzt. Da der Entwicklungszyklus der Fliegen
bei 24°C 10 Tage beträgt, wird somit gleichzeitig einem Vermischen der Elterngeneration
mit der F1-Generation vorgebeugt. Die Kulturgefäße sind jeweils zu einem Viertel mit einem speziell für die Drosophila-Haltung geeignetem Nährmedium befüllt (Röhrchen 25 ml,
Flaschen 50 ml), welches wöchentlich frisch gekocht wird. Die Lagerung der vorrätigen
Zuchtgefäße erfolgt bei 4°C im Standkühlschrank (GSS 3126 Premium frost-free). Unmittelbar vor dem Umsetzen der Tiere auf neue Gefäße wird der Nährbrei zusätzlich mit
Trockenhefe bestreut, was eine Stimulation der Eiablage bewirkt.
Fliegennährmedium für 50 Zuchtflaschen (Hess, 1976):
82 g Zuckerrübensirup
77 g Maismehl
41 g Malzextrakt
18 g Bierhefe
10 g Sojamehl
9 g Agar-Agar
2 g Nipagin
1,65 l H2O
5 ml Propionsäure
Fliegenröhrchen, die älter als 21 Tage sind, werden entsorgt, da nach Ablaufen der doppelten Generationszeit die Gefäße sowohl F1-, als auch F2-Tiere enthalten. Um dies zu
vermeiden werden die Gefäße 3 Wochen nach dem Aufsetzen der Fliegen für 4 Stunden
bei 65°C im Wärmeschrank erhitzt und anschließend die Gefäße rückstandslos gesäubert. Nach einer anschließenden Reinigung in der Spülmaschine (Multitronic G7783)
können die Gefäße erneut mit frischem Fliegenbrei befüllt und bis zur Verwendung kühl
gelagert werden (s.o.).
Methoden
79
6.1.2. P-Element vermittelte Keimbahntransformation
(Spradling und Rubin, 1982; Rubin und Spradling, 1982)
Mit Hilfe der P-Element-Mutagenese können Gene in das Fliegengenom integriert und
somit analysiert werden. Dies wird durch modifizierte Transformationsvektoren < einem
konstruierten P-Element-Vektor und einem Helferplasmid als Transposasequelle > realisiert. Der P-Element-Vektor alleine ist nicht in der Lage in das Genom zu inserieren, da er
kein intaktes Transposasegen mehr besitzt. Die Transposase wird durch das Helferplasmid (pUChsΔ2-3) geliefert, welches selber aufgrund einer Deletion des 3'-Endes nicht im
Genom integrieren kann und durch spätere Zellteilungen zunehmend ausgedünnt wird.
Die Integration des P-Element-Konstruktes erfolgt zufällig. Durch sogenannte Kartierungskreuzungen mit Balancer-Chromosomen kann das Chromosom bestimmt werden, in welches das transgene P-Element im Anschluss einer erfolgreichen Mikroinjektion integriert
ist (siehe 6.1.2.).
6.1.3. Sammlung und Dechorionisierung von Embryonen
Im Vorfeld einer Mikroinjektion werden Fliegen des Stammes w1118 in frische Zuchtflaschen
überführt und für eine Woche bei Raumtemperatur (RT) angefüttert. Am Injektionstag werden die Tiere schließlich in leere perforierte Drosophila-Gefäße umgeschüttelt und umgedreht auf Apfelsaftagarplatten aufgesetzt. Um eine Stimulation der Eiablage zu bewirken,
werden die Platten zuvor mittig mit etwas cremig angerührter Hefepaste (Trockenhefe und
dH2O) bestrichen. Die Agarplatten werden regelmäßig in 15-minütigen Intervallen gewechselt und die darauf abgelegten Embryonen unmittelbar mit einem Skalpell geerntet. Die
ersten drei Embryo-Chargen müssen verworfen werden, da diese von den Weibchen zurückgehaltene Eier enthalten können, welche für eine effiziente Keimbahntransformation
zu weit im Entwicklungszyklus fortgeschritten sind.
Dem Absammeln folgt eine einminütige Dechorionisierung in 50% Klorixlösung. Ein anschließender Spülschritt mit dH2O stoppt die Reaktion. Mit Hilfe einer Präpariernadel werden die Embryonen unter Kontrolle eines binokularen Mikroskops (Stemi 2000) nebeneinander in gleicher Orientierung auf einem länglich zugeschnittenen Agarblock arrangiert.
Anschließend werden sie auf Deckgläschen (22 x 22 mm) aufgenommen, welche im Vorfeld mit Flüssigkleber (Paketklebeband in n-Heptan) bestrichen werden. Dem folgt ein 3iminütiger Trocknungsprozess unter zirkulierender warmer Luft (Kaltlichtquelle KL 1500
LCD), um den Innendruck der Embryonen für die folgende Injektion zu reduzieren. Zur
Prävention einer Dehydration werden die Embryonen bis zur Injektion mit Öl (Voltalef®
10S) überschichtet. Die DNA wird posterior in die Embryonen injiziert, wo sich etwa
15 min nach der Befruchtung die Polzellen differenzieren, aus denen sich wiederum
80
Methoden
später die Urkeimzellen entwickeln.
Apfelsaftagarplatten für 30 Stück, Ø 5 cm
(Wieschaus und Nüsslein-Volhard, 1986, modifiziert):
7,2 g Agar-Agar in 200 ml dH2O aufkochen
3,2 g Saccharose in 67 ml Apfelsaft unter Rühren auflösen
 beides mischen und direkt luftblasenfrei in die Petrischalen gießen
6.1.4. Vorbereitung und Injektion von Plasmid-DNA
Für eine effiziente Transformation in die Drosophila-Keimbahn werden zunächst die DNA
vom P-Element-Konstrukt und vom Helferplasmid mittels einer Maxipräparation (siehe
6.6.9.) gewonnen. Für den Injektionsmix werden 25 µg P-Element-Vektor-DNA mit 5 µg
des Helferplasmids in insgesamt 100 µl dH2O Endvolumen vermischt und einer Phenol/
Chloroform-Extraktion (siehe 6.5.3.) unterzogen. Eine anschließende Salz-Alkohol-Fällung
(siehe 6.5.4.) erfolgt mit 1/5 Vol 5 M NaCl und 2 Vol 100% EtOH. Nach kurzem Invertieren
wird die Nukleinsäure für 3 min bei -80°C oder über Nacht bei -20°C gefällt. Ein anschließender Zentrifugationsschritt für 15 min bei 11.000 rcf und 4°C pelletiert die DNA,
welche zweimal in 170 µl 70% EtOH für jeweils 10 min bei 4°C und 11.000 rcf gewaschen
wird. Das Nukleinsäurepellet wird schließlich in 50 µl dH2O gelöst und bei -20°C bis zum
Injektionstag gelagert.
Unmittelbar vor der Injektion wird die DNA erneut für 30 min bei 11.000 rcf und 4°C zentrifugiert, um eventuelle Verunreinigungen in der DNA-Lösung zu sedimentieren. Nach der
Zentrifugation werden von der Oberfläche 10 µl Plasmid-DNA in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zum Beladen der Injektionsnadel auf Eis gelagert. Die Nadel wird
aus einer Glaskapillare (Ø 1 mm) mit einem Mikropipettenzieher (Pul-1, WPI) hergestellt
und mittels eines Kapillarenschleifgerätes (Typ 462, Bachofer) schräg aufgeschliffen. Die
Nadel wird schließlich mit 5 µl des vorbereiteten Injektionsmixes mittels einer speziellen
Pipettenspitze (20 µl Microloader®) beladen und in den Microinjektor (5246 FemtoJet®,
Eppendorf) eingespannt. Die mit Öl (Voltalef® 10S) überschichteten Embryonen (siehe
6.1.3.) werden unter einem Mikroskop (Axio Lab. A1, Zeiss) platziert, bevor die Mikroinjektion in den posterioren Embryobereich erfolgt.
Im Anschluss werden die behandelten Embryonen in ein kleines Einmal-Wiegeschälchen
(41 mm x 41 mm) überführt und mit dem Voltalef® 3S Öl überschichtet. Die Wiegeschälchen werden in einer quadratischen Petrischale gelagert, deren Boden mit angefeuchtetem Blottingpapier belegt ist (Feuchtkammer) und bis zum Schlüpfen der Larven im Kühlkabinett bei 16°C inkubiert. Nach etwa zwei Tagen können die ersten Larven gesammelt
und auf ein frisches Röhrchen mit angerührter Hefepaste (Trockenhefe und dH 2O) umge-
Methoden
81
setzt werden. Ab dem 10. Tag nach der Mikroinjektion erfolgt der Schlupf der adulten Fliegen. Die chromosomale Zuordnung des Integrationsortes erfolgt wie in 6.2.1. beschrieben
durch Balancer-Kreuzungen.
6.2. Etablierung neuer Drosophila-Stämme
6.2.1. Balancer-Kreuzungen
Zur Etablierung von transgenen Fliegenlinien nach einer erfolgreichen Keimbahntransformation (siehe 6.1.2.) werden die neu integrierten Transgene mit einem entsprechenden
Balancer kombiniert. Hierzu werden die G0-Tiere nach dem Schlupf (etwa 10 Tage nach
der Mikroinjektion) direkt in kleine Fliegenröhrchen vereinzelt und mit w1118-Männchen oder
-Jungfrauen des jeweils anderen Geschlechts verpaart. Da der P-Element-Vektor das
Wildtypgen mini white+ (P{w+}) als genetischen Marker enthält, ist eine erfolgreiche PElement-Transformation an rotäugigen Nachkommen in der F 1-Generation zu erkennen.
Diese rotäugigen Nachkommen werden erneut in Röhrchen vereinzelt und mit w1118Fliegen verpaart. Nach Vermehrung der transgenen Tiere kann schließlich die BalancerKreuzung erfolgen.
In der vorliegenden Arbeit wurden P-Element-Integrationen mit Hilfe von Balancer-Chromosomen < für das X-Chromosom (FM6/Y), das 2. (w1118/Y; CyO/Gla) und 3. Chromosom
(w1118/Y; TM3 Sb/TM3 Ser) > den Chromosomen zugeordnet. Die Erhaltung der etablierten
Stämme erfolgt in heterozygotem Zustand, damit die Linien schneller für weitere kreuzungsgenetische Experimente eingesetzt werden können. Durch die Kombination mit
einem Balancer-Chromosom, welches durch multiple Inversionen entstanden ist, werden
Rekombinationen lethal. Somit können auch rezessiv lethale Mutationen als stabile
Stocks etabliert werden.
6.2.2. Kombinationsstämme
Zu Beginn von Kreuzungsexperimenten und Kartierungskreuzungen werden jungfräuliche
Weibchen mit etwa der doppelten Anzahl an Männchen in einem Drosophila-Zuchtgefäß
verpaart. Um dazu Jungfrauen zu sammeln, werden am frühen Morgen aus den Zuchtgefäßen mit schlupfbereiten Puppen alle adulten Tiere entfernt. Da die Befruchtungsfähigkeit
der Männchen bei 24°C erst 6 Stunden nach dem Schlupf eintritt, sind alle weiblichen Tiere, die während dieser Zeit schlüpfen, jungfräulich und können für Kreuzungen verwendet
werden.
82
Methoden
6.2.3. Fertilitätstest
Im Vorfeld von machen Experimenten muss mittels eines Fertilitätstests überprüft werden,
ob der mutante Effekt noch erhalten ist. Es werden dazu fünf Tiere des zu testenden
Stammes mit zwei Tieren des anderen Geschlechts eines neutralen Stammes verpaart.
Als Positivkontrolle wird dies gleichermaßen für Fliegen des Wildtypstamms (beispielsweise OreR) durchgeführt. Die Tiere werden in zwei Wochen insgesamt vier Mal umgeschüttelt und die F1-Generation ausgezählt.
6.3. Gal4/UAS-System
(Brand und Perrimon, 1993)
Für eine selektive Aktivierung bestimmter Gene in spezifischen Organen bzw. Geweben
wird das aus der Hefe stammende Gal4/UAS-System verwendet. Zur Umsetzung des Experiments werden zwei transgene Ausgangsfliegenlinien (Treiber- und Effektorlinie) benötigt. Die Treiberlinie enthält den selektiven Promotor, welcher dem Gal4-Gen vorgeschaltet
ist und so letztendlich die Aktivierung des Zielgens in bestimmten Geweben initiiert. Das
zu untersuchende Gen ist in der Effektorlinie der upstream activating sequence (UAS)
nachgeschaltet. Es kann zur Analyse mit fluoreszierenden Proteinen, dem LacZ-Gen oder
auch mit RNAi-Sequenzen kombiniert werden. Beide Ausgangslinien können durch P-Element-Mutagenese hergestellt werden. Nach der Kreuzung beider Ausgangslinien untereinander kann der Gal4-Transkriptionsfaktor an die aus der Effektorlinie stammende UAS
binden und schließlich in der F1-Generation die zellspezifische Expression des nachgeschalteten Zielgens einleiten (Abb. 6-1).
P:
Treiberlinie
Promotor
X
Gal4
F1:
Effektorlinie
UAS
XZielgen
UAS
Zielgen
Gal4/UAS-Linie
Promotor
Gal4
Abbildung 6-1: Schematische Darstellung des Gal4/UAS-Systems.
P: Parentalgeneration. F1: Filialgeneration 1. Promotor (dunkelgrau): Gewebsspezifischer
Promotor. Gal4 (rot): Gen Gal4. UAS (blau): Upstream activating sequence. Zielgen
(grün): Zu analysierendes Gen. Pentagon (rot): Transkriptionsfaktor Gal4. Graphik erstellt
mit OpenOffice 3.4.1.
Methoden
83
6.4. Zytologische Techniken
6.4.1. Präparation von Organen
Im Vorfeld von mikroskopischen Untersuchungen der Zellmorphologie und zur Herstellung
von Hodenproteinextrakten (siehe 6.8.4.) werden die entsprechenden Organe in 1x PBSPuffer in schwarzen Blockschälchen (40 x 40 mm) präpariert und schließlich in einen
Tropfen des selben Puffers auf einen Objektträger überführt. Das Deckgläschen (22 x
22 mm) wird vor dem Auflegen an den Ecken mit wenig Knetmasse versetzt, um einem
mechanischen Zerdrücken der Organe vorzubeugen.
6.4.2. Mikroskopische Untersuchungen
Die Differentialinterferenzkontrast (DIC)- und Fluoreszenzmikroskopie erfolgte mit dem
Photomikroskop (Axiophot) der Firma Zeiss. Mit Hilfe verschiedener UV-Filter können mit
diesem Mikroskop Verteilungsmuster von unterschiedlichen fluoreszenzmarkierten Proteinen (GFP oder mCherry) charakterisiert werden. Darüber hinaus ist das Mikroskop auch
mit weiteren Filtern für Phalloidin und Hoechst ausgestattet (siehe Tabelle 2), was eine
Analyse der spezifisch angefärbten Zellstrukturen ermöglicht.
Tabelle 2: Angaben der UV-Filter für das Photomikroskop (Axiophot) der Firma Zeiss.
Aufgelistet sind unterschiedliche UV-Filter für fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen.
Filter Set Extinktion
Strahlenleiter Emission Fluorophor
02
G 265
FT 295
LP 420
Hoechst 33258
09
BP 450-490
FT 510
LP 520
GFP
15
BP 546
FT 580
LP 590
mCherry (RFP), Phalloidin, MitoTracker®
Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstellten Kolokalisationsaufnahmen sowie detailliertere Aufnahmen bestimmter Fluoreszenzmuster wurden mit einem konfokalen Mikroskop (CLSM TCS SP2, Leica) erstellt und mittels der kompatiblen Leica Confocal Software
(LCS) bearbeitet. Die Maßstabsbalken aller mikroskopisch aufgenommenen Bilder wurden mit der Software ImageJ nachträglich berechnet und eingefügt.
6.4.3. Fixierung und Färbung von Organen und Geweben
Im Vorfeld einer Gewebe- bzw. Organfärbung erfolgt zur Vermeidung von Degradation eine Fixierung der Materialien. Für jede Färbereaktion werden jeweils 30 Gonaden in
1x PBS präpariert und anschließend in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt, welches mit
1 ml 4% Formaldehyd (gelöst in 1x PBS) befüllt ist. Die Fixierungsreaktion erfolgt für
30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Drehrad. Dem schließen sich drei 10-minütige
Spülschritte mit je 1 ml PBT an, bevor die gewünschte Färbereaktion erfolgen kann.
84
Methoden
PBS-Puffer (1x):
PBT:
140 mM NaCl (8,18 g/l)
10 mM NaH2PO4 (1,56 g/l)
 gelöst in dH2O
 pH auf 7,4 mit 5 M NaOH einstellen
 autoklavieren
0,1% Triton® X-100 (v/v) in 1x PBS
 gelöst in dH2O
 immer frisch ansetzen
TRITC-Phalloidin-Färbung/Hoechst 33258-Färbung
Phalloidin ist ein Gift des grünen Knollenblätterpilzes (Amanita phalloides), welches filamentöses Aktin bindet. In der Spermatogenese können somit beispielsweise die Individualisierungskomplexe mikroskopisch analysiert werden. Der Farbstoff Hoechst 33258
hingegen interkaliert in doppelsträngige DNA, wodurch Zellkerne identifiziert werden
können. Beide Färbungen können in Einzelfärbungen oder wahlweise auch hintereinander
an denselben Organen erfolgen, wodurch sowohl Zellkernlokalisierung als auch Ausbildung der Individualisierungskomplexe in Kombination untersucht werden können. Im
Anschluss an Präparation, Fixierung und Spülung der Organe (siehe 6.4.3.) erfolgt
schließlich im Dunkeln die entsprechende Färbereaktion.
TRITC-Phalloidin-Lösung: 1 µg/ml in 1x PBS (10 µl Stocklösung (100 µg/ml) auf 1 ml 1x PBS)
Hoechst 33258-Lösung: 1 µg/ml in 1x PBS (10 µl Stocklösung (100 µg/ml) auf 1 ml 1x PBS)
Die Inkubationszeit für beide Färbelösungen beträgt 1,5 h auf dem Drehrad im Dunkeln.
Werden allerdings Organe gefärbt, die zusätzlich ein Fluoreszenz-Reporterkonstrukt exprimieren (GFP oder RFP), muss die Färbereaktion auf 5 Minuten verkürzt werden, um
einer Degradation des Fluoreszenzproteins vorzubeugen. Nach der Färbung folgen zwei
10-minütige Waschschritte in jeweils 1 ml PBT, bevor die Organe in 1x PBS oder wahlweise in 1x PBS/Glycerin (1:1) mikroskopiert werden können. Durch letztere können die
Präparate einige Tage bei 4°C im Dunkeln gelagert werden.
MitoTracker®-Färbung
Der MitoTracker® ist ein zelldurchlässiger Farbstoff, welcher passiv durch die Plasmamembran diffundiert und in den Mitochondrien akkumuliert. Nachdem der nichtfluoreszierende
Ausgangsfarbstoff zunächst in eine atmungsaktive Zelle eingedrungen ist, oxidiert die
Substanz und wird in die Mitochondrien angesammelt. Dort reagiert der oxidierte Farbstoff
mit Thiolen von Peptidstrukturen und bildet ein aldehyd-fixierbares fluoreszierendes Konjugat.
MitoTracker®-Lösung: 100 nM in 1x PBS (1 µl 1 mM Stocklösung (50 µg in 94,1 µl DMSO) auf
10 ml 1x PBS)
Die Färbung erfolgt im Anschluss einer Fixierung (s.o.) für 10 min auf dem Drehrad im
Dunkeln (Endkonzentration: 100 nM). Optional kann eine Fixierung des Färbezustands für
Methoden
85
15 min in 1 ml Methanol bei -20°C erfolgen. Anschließend wird die Färbung mit drei 10minütigen Spülschritten in 1x PBS abgeschlossen. Die mikroskopische Untersuchung wird
wie oben beschrieben durchgeführt.
6.5. DNA-Techniken
6.5.1. Isolierung genomischer DNA aus Drosophila
(Rasmusson et al., 1994)
Für eine Isolierung genomischer DNA aus Drosophila werden zunächst 150 adulte Tiere in
2 ml Isolierungspuffer im „Dounce“-Homogenisator mechanisch aufgeschlossen. Das Homogenat wird in 15 ml fassende silikonisierte „Corex“-Zentrifugenröhrchen überführt und
für 20 min im Wasserbad (GFL®) bei 65°C inkubiert. Nachdem die Lösung auf Eis bis auf
Raumtemperatur abgekühlt ist, werden 0,8 ml 5 M Kaliumacetat zur Fällung der Proteine
zugegeben und das Gemisch für 15 min auf Eis inkubiert. Eine folgende Zentrifugation
(SorvallTM LynxTM 6000, Rotor: F-20, Thermo Scientific) für 2 min bei 11.000 rcf und 4°C
pelletiert die Proteine. Die gelöste DNA wird mit dem Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und durch Zugabe des halben Volumens Isopropanol gefällt. Eine folgende 15-minütige Zentrifugation bei 11.000 rcf und 4°C pelletiert die ausgefallene Nukleinsäure. Um die zuvor zugeführten Salze aus dem Ansatz zu minimieren, wird das DNAPellet in 5 ml 70% EtOH gewaschen (Zentrifugation wie zuvor). Der Überstand wird vorsichtig abpipettiert und die pelletierte DNA luftgetrocknet. Für die folgenden Schritte wird
die Nukleinsäure in 200 µl TE-4 gelöst und in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Um eventuelle RNA-Verunreinigungen zu minimieren, wird der Reaktionsansatz mit
0,5 µl RNase A (10 mg/ml) versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von
einem halben Volumen 7,5 M Ammoniumacetat (100 µl) und anschließend dem zweifachen Volumen 96% EtOH (600 µl) wird bei -80°C für 20 min die reine DNA ausgefällt. Eine
anschließende Zentrifugation (Zentrifuge 5418R, Eppendorf) für 15 min bei 11.000 rcf und
4°C pelletiert die DNA erneut. Der Überstand wird abgezogen und die Nukleinsäure in
170 µl 70% EtOH für 10 min bei 11.000 rcf und 4°C gewaschen. Nachdem die genomische DNA luftgetrocknet ist, wird sie in 200 µl TE-4 aufgenommen. Abschließend wird ein
Aliquot der isolierten DNA (1 µl) über ein 0,5% Agarosegel aufgetrennt und sowohl die
Konzentration bestimmt als auch die Qualität über den als Referenz verwendeten
λ DNA/HindIII Standard (0,1 µg/µl, Thermo Scientific) nach 6.5.8. verifiziert.
86
Methoden
Isolierungspuffer:
TE-4:
100 mM Tris/HCl; pH 9,0
100 mM Na2EDTA
1% SDS (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
100 mM Na2EDTA
10 mM Tris/HCl; pH 8,0
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
RNase A-Stocklösung:
10 mg/ml RNase A lösen in:
15 mM NaCl und
10 mMTris/HCl; pH 7,5
 gelöst in dH2O
 15 min bei 100°C im Wasserbad kochen
 langsam auf RT abkühlen
 Aliquots bei -20°C lagern
6.5.2. Polymerase chain reaction (PCR)-Techniken
Polymerase chain reaction (PCR)
(Mullis et al., 1986)
Diese in vitro-Methode dient der selektiven Amplifikation eines definierten DNA-Abschnitts
und wurde erstmals 1986 von Dr. Kary B. Mullis beschrieben. Das Prinzip der Polymerasekettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction; PCR) basiert auf einem dreistufigen
zyklischen Verfahren. Während der ersten Phase jedes Zyklus werden zwischen 92°C
und 95°C die Doppelstränge der DNA thermisch voneinander getrennt (Denaturierung).
Durch Senken der Temperatur (46°C bis 65°C) lagern sich flankierende Oligonukleotide
(Primer) an ihre komplementären Sequenzabschnitte der DNA an. Dieser Vorgang wird
als primer annealing bezeichnet und ist abhängig von der Temperatur, der gewählten Oligonukleotidabfolge und der Salzkonzentration im Reaktionsansatz. Ein Zyklus wird mit
dem Vorgang der primer extension beendet, bei dem eine thermostabile DNA-Polymerase
die Verlängerung der Oligonukleotide bewirkt. Mit der Einleitung eines neuen Zyklus erfolgt eine exponentielle Vervielfältigung der spezifischen DNA-Sequenz.
Die PCR-Reaktionen für die vorliegende Arbeit wurden in Thermocyclern der Firma Biometra durchgeführt. Für die in vitro-DNA-Synthese wurden verschiedene hitzestabile
DNA-Polymerasen verwendet, welche sich in ihrer Syntheseleistung, der Fehlerrate und
dem Generieren unterschiedlicher Fragmentenden voneinander unterscheiden. Darüber
hinaus weisen einige kommerziell erhältliche DNA-Polymerasen wie die Pfu- und Phusion-Polymerase neben der 5' → 3' Syntheseaktivität auch eine 3' → 5' Exonukleaseaktivität (proof reading) auf. Mithilfe dieser Korrekturfunktion können fehlerhafte Basenpaarungen während der in vitro-Replikation korrigiert werden.
Methoden
87
Die Wahl der DNA-Polymerasen ist u.a. von der weiteren Verwendung der PCR-Produkte
abhängig. Northern-Sonden wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit mit der Taq-Polymerase synthetisiert. DNA-Amplifikationen für blunt end-Klonierungen wurden mit der
Pfu-Polymerase oder der synthetisch hergestellten Phusion-Polymerase erzeugt. Um
PCR-Produkte in den pGEM®-T-Vektor zu inserieren, wurden im Anschluss an die Synthese A-Überhänge am 3'-Ende mit der Taq-Polymerase generiert. Sowohl die Reaktionsansätze als auch das Temperaturprogramm aller PCR-Reaktionen im Rahmen der vorliegenden Studie richteten sich immer nach den Angaben der Hersteller. Die annealing- Temperatur für die Primer wurde mit der Datenbank OligoCalc ermittelt. Als Beispiel wird die Zusammensetzung eines typischen Reaktionsansatzes mit der Taq-Polymerase aufgeführt:
x µl
template-DNA (10 pg – 1 µg in dH2O)
5 µl
10 x Taq Puffer + KCl (Thermo Scientific)
5 µl
dNTP-Mix (100 mM)
1 µl
forward primer (10 µM)
1 µl
reverse primer (10 µM)
0-2 µl
1 µl
ad 50 µl
MgCl2 (25 mM, Thermo Scientific)
Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)
mit dH2O
Das zugehörige Temperaturprogramm für die Taq-Polymerase setzt sich wie folgt zusammen:
Initial denaturation
Denaturation
Annealing
94°C
94°C
TM-3°C
2 min
30 s
30 s
Extension
72°C
1 kb/min
Final extension
72°C
10 min
(1x)
(30-35x)
(1x)
Reverse Transkriptase-PCR
Die mittels der Reverse Transkriptase (RT)-PCR (engl.: reverse transcription polymerase
chain reaction) in vitro gebildete DNA-Kopie der prozessierten mRNA wird synthetisiert,
um beispielsweise copy DNAs (cDNAs) für anschließende Klonierungen zu generieren,
genspezifische mRNAs nachzuweisen, oder um das Transkriptionslevel einer mRNA
durch anschließende qPCR zu quantifizieren. Die Übersetzung von mRNA in cDNA erfolgt
dabei durch die Reverse Transkriptase. Als Matrize für die RNA-abhängige DNA-Polymerase diente, abhängig von der weiteren Verwendung, isolierte mRNA (siehe 6.7.1.) oder
Gesamt-RNA (siehe 6.7.2.). Die Elution der RNA erfolgte hierbei stets in 20 µl DEPC-
88
Methoden
dH2O. Die Zugabe von 0,5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl, RiboLock, Thermo Scientific)
schützt die aufgereinigte mRNA vor enzymatischem Abbau. Vor der cDNA-Synthese
müssen noch eventuelle DNA-Kontaminationen durch einen DNase-Verdau verhindert
werden. Dazu werden 2 µl RQ1 DNase (1 U/µl, Thermo Scientific) und 2,5 µl 10x DNasePuffer dem Ansatz zugegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37°C wird die
RQ1 DNase für 10 min bei 65°C hitzeinaktiviert. Um das Enzym und den Puffer für die
anschließende RT-Reaktion zu entfernen, wird die RNA mit 25 µl 5 M Ammoniumacetat
für 15 min auf Eis gefällt. Nach dem Pelletieren (15 min bei 11.000 rcf und 4°C) wird die
RNA mit 170 µl 70% EtOH gewaschen (10 min bei 11.000 rcf und 4°C). Das RNA-Pellet
wird anschließend in 19,5 µl dH2O und 0,5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl, RiboLock, Thermo
Scientific) aufgenommen. Für die cDNA-Synthese können wahlweise genspezifische Primer, random Hexanukleotide oder oligo(dT)-Primer verwendet werden. Alle cDNA-Synthesen für die vorliegende Arbeit erfolgten mit dem DyNamoTM cDNA Synthese Kit (F-470S,
Thermo Scientific) nach Anleitung des Herstellers:
x µl
10 µl
1 µg template-mRNA (Angaben im Text)
2x RT Puffer mit dNTP-Mix und 5 mM MgCl2 (Kit)
1 µl
forward primer (100 mM)
1 µl
reverse primer (100 mM)
2 µl
M-MuLV RNase H+ reverse transcriptase (Kit)
ad 20 µl
mit RNase freiem dH2O (Kit)
Die cDNA-Synthese findet unter folgenden Konditionen statt:
Extension
25°C
10 min nicht bei genspezifischen Primern
cDNA synthesis
37°C
30 min
Termination
85°C
5 min
qRT-PCR
Die Quantifizierung des Expressionslevels von bestimmten RNAs erfolgt mittels quantitative real time-PCR (qRT-PCR). Für die im Rahmen der vorliegenden Arbeit hergestellten
Reaktionsansätze wurde das „SensiFASTTM SYBR NO-ROX One-Step Kit“ (Bioline) verwendet, wobei das Reaktionsvolumen auf 15 µl verringert wurde.
Für jede Reaktion wurden drei technische Triplikate hergestellt, welche das identische
Primer-Paar und template beinhalten. Für die biologischen Replikate wurden sowohl die
RNA-Isolierung als auch die qRT-PCR-Reaktion wiederholt. Die Ansätze werden für die
Analyse in eine qPCR-Mikrotiterplatte (Framestar 96 ®, 4titude®) pipettiert und mit einer
Methoden
89
Schutzfolie (qPCR adhesive clear seal, 4titude®) luftdicht abgeschlossen. Ein qRT-PCRReaktionsansatz von 15 µl setzt sich wie folgt zusammen:
7,5 µl
2,85 µl
2x SensiFASTTM-Puffer (Kit)
DEPC-dH2O (Kit)
0,6 µl
forward primer (10 µM)
0,6 µl
reverse primer (10 µM)
0,15 µl
0,3 µl
3 µl
Reverse Transcriptase (Kit)
RNase Inhibitor (Kit)
template (Angaben im Text)
Die Primer für qPCR-Reaktionen werden mit der Onlinesoftware „Primer 3“ berechnet. Die
Annealingtemperatur beträgt dabei immer 60°C. Als template wird RNA eingesetzt und
dem Reaktionsansatz Reverse Transcriptase zugefügt, die dann im Vorfeld des Amplifikationszyklus cDNA synthetisiert. Abhängig vom Assay kann mRNA (10 ng pro Reaktion,
siehe 6.7.1.) oder Gesamt-RNA (1 pg bis 1 µg pro Reaktion, siehe 6.7.2.) eingesetzt werden. Als nicht transkriptionsreguliertes housekeeping gene diente für jeden Assay im
Rahmen der vorliegenden Arbeit rpL9 als Referenzgen, welches mit dem Primer-Paar
#404/#405 nachgewiesen wird. Die qPCR-Reaktionen finden im Mastercycler® ep realplex
(Eppendorf) mit dem folgenden Programm statt:
cDNA synthesis
45°C
10 min
(1x)
Initial denaturation
95°C
2 min
(1x)
Denaturation
95°C
30 s
Annealing
60°C
30 s
Extension
72°C
20 s
Final extension
72°C
10 min
(1x)
Melting curve
95°C
60°C
95°C
15 s
20 min
15 s
(1x)
(40x)
Die Detektion der spezifischen Amplifikate erfolgt durch den Fluoreszenzfarbstoff SYBR
Green, welcher in die DNA interkaliert und folglich fluoresziert. Das vom Gerät erfasste
Fluoreszenzsignal wird im Anschluss an das Experiment als cycle threshold (Ct)-Wert
ausgegeben. Dieser Wert stellt die erste vom Gerät gemessene exponentielle Vervielfältigung des spezifischen Transkripts dar, was bedeutet, dass sich das Fluoreszenzsignal
ab diesem Ct-Wert deutlich vom Hintergrund abhebt. Die gemessenen Signale für die zu
untersuchenden Gene werden mit rpL9-Signalen normalisiert und abschließend das relative Expressionslevel mit der ΔΔCt-Methode (Ratio = 2(-ΔΔCt); Pfaffl, 2001) ermittelt.
90
Methoden
6.5.3. Phenol/Chloroform-Extraktion
Um Nukleinsäuren von Enzymen zu reinigen, wird eine Phenol/Chloroform-Extraktion
durchgeführt. Die Lösung wird dazu mit 1 Vol Phenol/Chloroform (1:1) versetzt und gevortext. Durch Zentrifugation für 10 min bei 11.000 rcf und RT findet eine Phasentrennung
statt. Die obere (wässrige) Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die darin enthaltene DNA durch eine Salz-Alkohol-Präzipitation (siehe 6.5.4.) aufkonzentriert.
Schließlich erfolgt eine Quantifizierung mittels eines 0,7% Agarosegels (siehe 6.5.8.).
6.5.4. Salz-Alkohol-Fällung
Nach vielen enzymatischen Reaktionen in Puffersystemen muss die Nukleinsäure für weitere Analysen von den Salzen aufgereinigt oder auch ankonzentriert werden. Dies wird
durch eine Salz-Alkohol-Präzipitation ermöglicht. Dazu wird der Ansatz mit TE -4 auf ein
Gesamtvolumen von 200 µl aufgefüllt. Die DNA wird dann mit 1/20 Vol 5 M NaCl (10 µl)
und 2 Vol 96% EtOH (420 µl) für 30 min bei -80°C gefällt. Nach der Pelletierung der DNA
für 10 min bei 11.000 rcf und 4°C wird die Nukleinsäure mit 175 µl 70% EtOH gewaschen
(Zentrifugation wie zuvor). Nach kurzem Lufttrocknen erfolgt das Lösen des DNA-Pellets
in einem entsprechenden Volumen dH2O.
TE-4:
100 mM Na2EDTA
10 mM Tris/HCl; pH 8,0
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
6.5.5. Extraktion von DNA-Fragmenten und PCR-Produkten aus einem Agarosegel
Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen nach einer restriktionsenzymatischen Spaltung oder nach PCR-Reaktionen erfolgt mit dem NucleoSpin® Gel and PCR
Clean-up Kit (Macherey-Nagel). Die Durchführung wurde stets nach Herstellerangaben
vollzogen. Im Anschluss an die Aufreinigung wird die DNA in 10 µl dH2O aufgenommen
und die Konzentration mittels eines Agarosegels (siehe 6.5.8.) bestimmt.
6.5.6. Analytischer und präparativer Restriktionsverdau
Hydrolytische Spaltungen von DNA erfolgen mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen vom
Typ II. Enzyme dieser Klasse schneiden DNA innerhalb einer bestimmten Erkennungssequenz (Palindrom). Die Reaktion erfolgt in 1x Puffer, wobei sich die Pufferwahl nach den
Ansprüchen des entsprechenden Enzyms richtet. Die Inkubationszeit bei 37°C im Wärmeschrank variiert je nach eingesetzter DNA-Menge von 1 bis 4 Stunden. Falls für eine Analyse mehrere Endonukleasen mit unterschiedlichen Pufferanforderungen verwendet wer-
Methoden
91
den, müssen die Spaltungen nacheinander erfolgen. Zwischen den Reaktionsansätzen
wird die DNA mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und Alkoholpräzipitation (siehe 6.5.3.
und 6.5.4.) aufgereinigt.
Für analytische Restriktionsexperimente, wie beispielsweise die Überprüfung der Effizienz
einer Ligation, wird 1 µg DNA im Gesamtvolumen von 20 µl inkubiert. Bei präparativen
Verdauen hingegen, die zur Herstellung von Northern- und EMSA-Sonden genutzt werden, müssen mehrere Mikrogramm DNA in einem größeren Volumen (50 µl-100 µl Reaktionsansatz) verdaut werden. Die Verifizierung und eventuelle Aufreinigung von DNAFragmenten erfolgt über Gelelektrophorese (siehe 6.5.7.).
6.5.7. Elektrophoretische Größenauftrennung von DNA-Fragmenten in Agarosegelen
Die Gelelektrophorese stellt ein biochemisches Trennverfahren von Molekülen in einer
Agarose-Gelmatrix dar. Dieses wird z.B. zur Verifizierung von Restriktionsanalysen, PCRProdukten, Fragmentisolierungen und zur Quantifizierung von genomischer oder PlasmidDNA eingesetzt. Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgt in einer horizontalen Elektrophoresekammer unter Verwendung eines Puffersystems. Die negativ geladene DNA wandert im elektrischen Gleichstromfeld in Richtung Anode. Ihre elektrophoretische Mobilität
ist dabei abhängig von der Fragmentlänge und der Agarosekonzentration im Gel. Unterschiedliche Molekülgrößen, die in einem definierten Zeitabschnitt eine bestimmte Strecke
zurücklegen, werden in verschiedene Fraktionen aufgetrennt (zusammengefasst in Westermeier, 1990). Für eine exakte Bestimmung der Fragmentlängen wird als Referenz ein
Molekulargewichtsstandard mit definierten Dimensionen auf das Gel mit aufgetragen.
Konzentrationsbestimmungen werden mit einem 0,7% Agarosegel (w/v), alle anderen
Verifizierungen mit einem 1% Gel (w/v; Porengröße:150 nm) durchgeführt. Die entsprechende Menge Agarose wird in 1x TBE-Puffer in der Mikrowelle aufgekocht. Um die Nukleinsäuren für die spätere Dokumentation im Gel sichtbar zu machen, werden der Gellösung
0,5 µg/ml Ethidiumbromid zugeführt. Die Elektrophorese erfolgt für kleine Gele (8,2 cm x
7,0 cm) bei einer Stromstärke von 45 mA und für große Gele (13,8 cm x 12,0 cm) bei
65 mA. Die Laufzeit ist abhängig von Prozentigkeit und Dicke der Gele, des Puffervolumens, sowie von den aufzutrennenden Fragmentlängen und variiert zwischen 45 und
75 min. Als Laufpuffer wird 1x TBE-Puffer verwendet. Vor dem Gelauftrag wird die DNA
mit 1/4 Volumen 4x DNA-Auftragspuffer versetzt. Wahlweise kann dem Probenpuffer 0,1%
Bromphenolblau (w/v) als Farbstoff zugemischt werden, um den Fortschritt der Elektrophorese einfacher zu verfolgen.
92
Methoden
TBE-Puffer (10x):
DNA-Auftragspuffer (4x):
890 mM Tris (108 g/l)
890 mM Borsäure (55 g/l)
25 mM Na2EDTA (18,6 g/l)
 gelöst in dH2O
 pH auf 8,2 mit 10% HCl einstellen
50% Glycerin (w/v)
2,5x TBE
0,1 M Na2EDTA
0,1% Bromphenolblau (w/v)
➢ gelöst in dH2O
6.5.8. Konzentrationsbestimmung von DNA
mittels Agarosegel
Für die Bestimmung von DNA-Konzentrationen in Lösungen wird 1 µl DNA-haltige Lösung
mit dH2O auf ein Endvolumen von 9 µl aufgefüllt, mit 3 µl 4x DNA-Auftragspuffer vermischt
und auf ein 0,7% Agarosegel aufgetragen. Zum Vergleich wird das Gel zusätzlich mit
2,5 µl λ DNA/HindIII Marker (0,1 µg/µl) als Referenz beladen. Die Elektrophorese erfolgt
wie in 6.5.7. beschrieben.
mittels NanoDrop 1000
Konzentrationsbestimmungen von doppelstängiger DNA können wahlweise mit dem
NanoDrop 1000 Spektralphotometer in Kombination mit der kompatiblen Software V3.7
(Thermo Scientific) erfolgen. Das Gerät basiert auf einer photometrischen Messmethode,
wodurch eine höhere Genauigkeit als mit einem Agarosegel (s.o.) erzielt wird. Die Messung der optischen Dichte (OD) für Nukleinsäuren erfolgt bei einer Wellenlänge von
λ=260 nm, was dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren entspricht. Die gemessene
Konzentration wird auf Grundlage des Lambert-Beer'schen Gesetzes berechnet und
schließlich in [ng/µl] angezeigt.
Vor dem Beladen der Messoberfläche mit der eigentlichen Probe wird < abhängig in welche Lösung die DNA aufgenommen wurde > dH2O, DEPC-dH2O oder TE-4 pipettiert und
das Gerät kalibriert (blank Taste). Nach jeder Messung muss der Messzylinder mit einem
weichen Fasertuch gereinigt und beim Wechseln der Probe mit dH 2O gespült werden. Zur
Quantifizierung werden pro Messung 2 µl DNA-haltige Lösung auf den Messsockel pipettiert.
6.6. Klonierungstechnische Methoden
6.6.1. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten und Vektoren
Für Klonierungsexperimente müssen oftmals Vektoren mittels Restriktionsendonukleasen
linearisiert werden. Zur Vermeidung von Religationen der kompatiblen Enden werden die
5'-Phosphatgruppen durch eine thermosensitive alkalische Phosphatase (FastAP TM,
1 u/µl, Thermo Scientific) abgespalten. Die Reaktion erfolgt für 10 min bei 37°C mit 1/10
Vol 10x Fast APTM Puffer. Nach der Katalyse wird das Enzym bei 75°C für 5 min hitzeinak-
Methoden
93
tiviert. Für anschließende Ligationen wird die DNA mittels Phenol/Chloroform-Extraktion
und Alkoholpräzipitation (siehe 6.5.3.und 6.5.4.) aufgereinigt. Die Bestimmung der Konzentration erfolgt mittels eines Agarosegels (siehe 6.5.8.).
6.6.2. Synthese von A-Überhängen
PCR-Produkte, die von der Pfu- oder Phusion-Polymerase generiert wurden, schließen
mit glatten Enden (blunt end) ab. Für Ligationen in den pGEM®-T Vektor müssen daher AÜberhänge synthetisiert werden. Zu dem PCR-Ansatz (50 µl) werden dazu 0,2 µl TaqPolymerase (1 U/µl, Thermo Scientific), 0,3 µl MgCl2 (25 mM), 0,5 µl dATP (2,5 mM) und
5,5 µl (1/10 Vol) 10x Taq-Puffer (mit KCl), zugegeben. Die Reaktion findet bei 72°C für
20 min im Heizblock statt. Für die anschließende Ligation wird die DNA mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und Alkoholpräzipitation (siehe 6.5.3. und 6.5.4.) aufgereinigt.
Die Konzentration wird durch ein Agarosegel nach 6.5.8. ermittelt.
6.6.3. Blunt end-Generierung
(Sambrook et al., 1989)
Um eine erfolgreiche Ligation von sticky end-DNA-Fragmenten in blunt end-Vektoren zu
ermöglichen, müssen an den einzubringenden Sequenzabschnitten ebenfalls glatte DNAEnden generiert werden. Um diese Situation zu gewährleisten, wird die Synthese- bzw.
Exonukleaseaktivität des Klenow-Fragments verwendet. Dieses Enzym ist in der Lage,
sowohl 5'-Überhänge aufzufüllen, als auch 3'-Überhänge abzubauen. Die Reaktion findet
für 30 min im 37°C-Inkubator statt. Für die anschließende Ligation wird die Nukleinsäure
mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und Alkoholpräzipitation (siehe 6.5.3. und 6.5.4.)
aufgereinigt. Die Konzentration wird mittels eines Agarosegels nach 6.5.8. ermittelt.
6.6.4. Ligation von DNA-Fragmenten
Die DNA-Ligase kann doppelsträngige DNA durch Bildung von Phosphodiesterbindungen
zwischen dem 5'-Phosphat und dem 3'-Hydroxylende verknüpfen. Von den zu verknüpfenden DNA-Fragmenten (Vektor und Insert) wird das äquimolare Verhältnis berechnet, wobei schließlich das Insert in dreifachem Überschuss eingesetzt wird. Die Gesamtmenge
an DNA für eine Reaktion beträgt 50 ng. Für die Katalyse werden 1 µl T4 DNA-Ligase
(5 Weiss U/µl, Thermo Scientific) und 1/10 Vol 10x Ligationspuffer in 10 µl Gesamtvolumen eingesetzt und für 2 Stunden bei RT oder wahlweise über Nacht bei 16°C inkubiert.
94
Methoden
6.6.5. Herstellung von kompetenten E.coli-Zellen
NovaBlue GigaSinglesTM
(Sambrook et al., 1989)
Für die Erzeugung von chemisch kompetenten Bakterienzellen (NovaBlue GigaSinglesTM)
werden 10 ml LB-Medium mit einer Einzelkolonie von einer frisch bewachsenen LB-Platte
angeimpft und die Zellen über Nacht bei 120 rpm und 37°C im Schüttelschrank (Thermoshake, Gerhardt) vermehrt. Am darauffolgenden Tag werden 2 ml dieser Vorkultur zu
200 ml frischem LB-Medium in einen 1 l Erlenmeyerkolben überführt. Die Bakterienkultur
wird bei 37°C geschüttelt, bis eine Zelldichte von OD550 = 0,5 bis 0,7 erreicht ist. Die Zellen
werden dann für 15 min auf Eiswasser abgekühlt und anschließend für 5 min bei 2.700 rcf
und 4°C pelletiert (SorvallTM LynxTM 6000, Rotor: F-20, Thermo Scientific). Nach dem vollständigen Entfernen des Überstands wird das Bakterienpellet in 1/3 Vol RF I-Medium des
Ausgangsvolumens resuspendiert. Nach einer weiteren 15-minütigen Inkubation auf Eis
werden die Zellen erneut wie zuvor pelletiert. Das überstandslose Bakterienpellet wird nun
in 1/15 Vol vom Ausgangsvolumen in RF II-Medium resuspendiert. Während die Zellen für
15 min auf Eis inkubieren, werden sie in 100 µl Aliquots aufgeteilt, in Flüssigstickstoff
schockgefroren und schließlich bei -80°C zur Dauerlagerung aufbewahrt.
RF I-Medium:
RF II-Medium:
100 mM RbCl
100 mM MgCl2
100 mM CaCl2
30 mM KAc; pH 7,5
15% Glycerin (w/v)
 gelöst in dH2O
 pH auf 5,8 mit 10% HAc einstellen
 sterilfiltrieren
 Lösung frisch herstellen
10 mM RbCl
10 mM MOPS
10 mM CaCl2
15% Glycerin (w/v)
 gelöst in dH2O
 pH auf 6,8 mit 5 M NaOH einstellen
 sterilfiltrieren
 Lösung frisch herstellen
LB-Medium (1 l):
10 g Trypton
10 g NaCl
5 g Hefeextrakt
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
BL21(DE3)
Für die Erzeugung von elektrokompetenten BL21(DE3)-Zellen werden 25 ml SOB-Medium mit einer Einzelkolonie einer frisch bewachsenen LB-Platte angeimpft. Diese Vorkultur
wird über Nacht im Schüttelschrank (Thermoshake, Gerhardt) bei 120 rpm und 37°C inkubiert. Am darauffolgenden Tag werden 250 ml frisches SOB-Medium in einen 1 l Erlenmeyerkolben überführt und mit den 25 ml Vorkultur vom Vortag angeimpft. Die Bakterien-
Methoden
95
kultur wird solange bei 120 rpm im Schüttelschrank bei 37°C inkubiert, bis sie eine OD550
von 0,5 bis 0,7 erreicht hat. Die Zellen werden dann bei 2.700 rcf (Zentrifuge SorvallTM
LynxTM 6000, Rotor: F-20, Thermo Scientific) und 4°C für 15 min pelletiert. Alle weiteren
Schritte erfolgen, wenn möglich, auf Eis. Nach dem restlosen Abziehen des Überstands,
werden die Bakterien in 2 ml 10% Glycerin (w/v) resuspendiert und diese Suspension wird
auf 10 ml Gesamtvolumen mit 10% Glycerin (w/v) aufgefüllt. Nach erneutem Pelletieren
für 15 min bei 2.700 rcf und 4°C wird der Überstand zum größten Teil abgezogen (etwa
9 ml) und die Bakterien im verbleibenden Überstandsrest resuspendiert. Von dieser Suspension werden je 3 µl Zellen in 1 ml frischem 10% Glycerin (w/v) verdünnt und die OD 550
gemessen. Eine optimale Zelldichte liegt zwischen 0,6 und 0,75. Dies entspricht 200 –
250 OD550 U/ml. Sollte der Wert unter der OD550 liegen, muss eine erneute Zentrifugation
für 10 min bei 2.700 rcf und 4°C erfolgen, um die Zellen in weniger Überstandsrest zu resuspendieren. Falls der OD550-Wert von 0,75 überschritten wurde, kann die Suspension
mit 10% Glycerin (w/v) verdünnt werden. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgt in
50 µl Aliquots bei -80°C im Gefrierschrank, nachdem sie in Flüssigstickstoff schockgefroren wurden.
SOB-Medium (1 l):
20 g Trypton
5 g Hefeextrakt
0,5 g NaCl
0,01 l 1M MgCl2
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
6.6.6. Überprüfung der chemisch kompetenten NovaBlue GigaSinglesTM-Zellen
Die Transformationseffizienz dieser Bakterienzellen wird ermittelt, indem eine definierte
Plasmidmenge (0,1 ng pBS II KS-Vektor) in die Bakterien transformiert (siehe 6.6.7.) wird.
Die Suspension wird dann auf drei LBamp-Platten in unterschiedlichen Volumina (50 µl,
100 µl und 200 µl) ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 37°C im Wärmeschrank über
Nacht werden die Kolonien der Platte mit 50 µl Zellsuspension ausgezählt. Eine Multiplikation mit 200.000 ergibt die Kolonienzahl pro µg DNA. Eine ausreichende Kompetenz
der Zellen wird erzielt, wenn das Produkt einen Wert zwischen 1x 10 6 und 1x 107 Kolonien
ergibt.
6.6.7. Transformation in kompetente E.coli-Zellen
NovaBlue GigaSinglesTM
Die Bakterien werden aus dem Gefrierschrank von -80°C auf Eis aufgetaut. Nach der Zugabe des Ligationsansatzes (50 ng DNA in 10 µl, siehe 6.6.4.) oder 1 µl Plasmid-DNA bei
96
Methoden
einer Re-Transformation wird die Suspension durch vorsichtiges Pipettieren gemischt. In
einer 5-minütigen Inkubationszeit auf Eis lagert sich die Plasmid-DNA an die Bakterienzellwand an. Durch einen folgenden Hitzeschock bei 42°C für exakt 30 s werden die modifizierten Plasmide in die Zellen transformiert. Anschließend werden die Bakterien für
2 min auf Eis abgekühlt und schließlich in 250 µl SOC-Medium aufgenommen. Nach
40 min Inkubationszeit im Schüttler bei 37°C und 120 rpm (Thermoshake, Gerhardt) werden 25 µl und 250 µl Zellen auf antibiotikaversetzten LB-Platten (50 µg/ml) ausplattiert
und diese über Nacht bei 37°C im Wärmeschrank inkubiert. Für eine Re-Transformation
hingegen ist keine Antibiotikum-Selektion notwendig.
SOC-Medium (1 l):
LBamp/kan-Medium:
20 g Trypton
5 g Hefeextrakt
0,58 g NaCl
0,19 g KCl
10 ml 2 M Glucose (nach Autoklavieren)
5 ml 2 M MgCl2
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
1 ml 50 mg/ml Antibiotikum in 1 l
autoklaviertes LB-Medium geben
(Endkonzentration: 50 µg/ml)
BL21(DE3)
Für eine effiziente Elektroporation mit kompetenten Zellen muss die Plasmid-DNA salzfrei
sein. Daher wird die Nukleinsäure nach der Plasmidpräparation in dH2O aufgenommen
oder es wird im Vorfeld eine Salz-Alkohol-Präzipitation (siehe 6.5.4.) durchgeführt.
Die Bakterienzellen sowie die Elektroporationsküvette werden zunächst auf Eis inkubiert.
Zu den aufgetauten Zellen wird 1 µl salzfreie Plasmid-DNA oder ein Ligationsansatz (siehe 6.6.4.) pipettiert und die Suspension vorsichtig gemischt. Nach dem Überführen der
Elektroporationsküvette in den Elektroporator (Easyject Optima, Peqlab) wird der Impuls
(1800 V, 15 µF und 335 R) ausgelöst. Anschließend wird die Küvette wieder auf Eis abgekühlt und die transformierten Zellen in 1 ml SOC-Medium aufgenommen. Die Suspension
wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und vor dem Ausplattieren 60 min im 37°C
Schüttler bei 120 rpm (Thermoshake, Gerhardt) inkubiert. Es werden jeweils 25 µl und
250 µl der Zellsuspension auf antibiotikaversetzte LB-Platten (50 µg/ml) ausplattiert und
diese über Nacht bei 37°C im Wärmeschrank bebrütet.
6.6.8. Selektionsmethoden
Antibiotikum-Selektion
Die Plasmide, die für Klonierungen im Rahmen der vorliegenden Studie verwendet wurden, beinhalten ein bestimmtes Antibiotikum-Resistenzgen, um die transformierten Zellen
Methoden
97
zu selektieren. Für diese Auslese werden die Antibiotika Kanamycin (kan) oder Ampicillin
(amp) sowohl in der LB-Flüssigkultur (Endkonzentration: 50 µg/ml) als auch auf der LBAgarplatte (Endkonzentration: 50 µg/ml) des entsprechenden Antibiotikums eingesetzt.
Die untransformierten Bakterien sterben bei der Kultivierung ab, da sie keine Resistenz
für das entsprechende Antibiotikum ausprägen.
Blau-weiß-Selektion
Um die Ligationseffizienz zu überprüfen, dient neben der Antibiotikum-Selektion auch die
Blau-weiß-Selektion als systematische Identifikationsmethode. Die für Klonierungen eingesetzten Bakterienstämme exprimieren nur das C-terminale ω-Fragment der ß-Galaktosidase. Die transgenen Bakterien hingegen können durch das eingebrachte Plasmid auch
das N-terminale α-Fragment des Enzyms exprimieren und somit eine funktionsfähige ßGalaktosidase zusammensetzen. Die Expression des α-Fragmentes wird durch Zugabe
von Isopropyl-ß-D-thiogalactosid (IPTG) induziert. In Anwesenheit des Substrates 5-Brom4-chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid (X-Gal) hydrolysiert die ß-Galaktosidase X-Gal zu
Galactose und einem Derivat des Indols, welches durch den Luftsauerstoff zu einem blauen Indigo-Farbstoff oxidiert. Bakterienkolonien, die das transformierte Plasmid aufgenommen haben, zeigen somit eine Blaufärbung.
In den Leserahmen des LacZ-Gens, welches für das Teilfragment der ß-Galaktosidase kodiert, ist ein Polylinker eingebracht. Durch die Insertion eines bestimmten DNA-Fragmentes (Insert) in den Polylinker wird der offene Leserahmen (ORF) des LacZ-Gens unterbrochen und keine intakte ß-Galaktosidase gebildet. Diese transgenen Bakterien können
somit das Substrat X-Gal nicht hydrolysieren und zeigen keine Blaufärbung. Die weißen
Bakterienkolonien haben somit das modifizierte Plasmid aufgenommen und können für
weitere Experimente genutzt werden.
Für die Selektion werden die gentechnisch modifizierten Zellen mit 50 µl 2% X-Gal (w/v) in
Dimethylformamid (DFMA) und 20 µl 100 mM IPTG in dH2O auf Antibiotikum versetzte
LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C im Wärmeschrank inkubiert.
Kolonie-PCR
Die Kolonie-PCR stellt eine Methode zur sicheren Identifizierung von gentechnisch modifizierten Bakterienkolonien dar, welche ein transgenes Plasmid mit einem inserierten DNAFragment in einer bestimmten Orientierung aufgenommen haben sollen. Die Orientierung
des Inserts ist beispielsweise eine grundlegende Voraussetzung für die Erstellung von
strangspezifischen-Sonden (siehe 6.7.7.). Diese selektive Ermittlung wird durch flankierende Primer ermöglicht, wobei einer an die Vektorsequenz hybridisiert und der gegenläufige Primer an die Insert-Sequenz. Für eine Kolonie-PCR-Reaktion wird ausschließlich die
98
Methoden
Taq-DNA-Polymerase (1 U/µl, Thermo Scientific) in einem halben Volumen des StandardReaktionsansatzes (siehe 6.5.2.) verwendet. Als template dient die Plasmid-DNA der
E.coli-Zellen. Diese werden von einer bewachsenen LB amp/kan-Platte mittels einer sterilen
Pipettenspitze aufgenommen und der vorbereitete Reaktionsansatz damit beimpft. Durch
die 10-minütige Initialdenaturierung des Temperaturprogramms für die Taq-Polymerase
werden die Zellen thermisch aufgeschlossen und somit die Plasmid-DNA für das Enzym
zugänglich gemacht. Im Anschluss an die PCR werden 5 µl Aliquots vom Reaktionsansatz
auf ein 1% Agarosegel aufgetragen und die positiven Klone über Gelelektrophorese identifiziert.
6.6.9. Präparation von Plasmid-DNA
Die in den transgenen Bakterien hergestellte Menge an Plasmid-DNA ist u.a. abhängig
von dem Bakterienstamm, der Größe des transformierten Plasmids und dem Volumen der
Bakterienvorkultur. Die Extraktion der in den Bakterien amplifizierten Plasmid-DNA kann in
unterschiedlichen Dimensionen erfolgen, wobei die Menge der aufzureinigenden DNA mit
dem eingesetzten Volumen der Bakterienvorkultur korreliert. Es wird dabei zwischen Mini-, Midi-, Maxi-, Mega-, und Gigapräparation unterschieden. Für die Analysen der vorliegenden Studie wurden ausschließlich Mini-, Midi- und Maxipräparationen durchgeführt.
Erstere dienen dem Identifizieren von positiven Klonen nach einer Transformation. Midipräparationen erfolgen für Sequenzierungsproben und klonierungstechnische Plasmidmengen. Für die P-Element vermittelte Keimbahntransformation (siehe 6.1.2.), wozu
größere DNA-Mengen von besonderer Reinheit in die Embryonen injiziert werden, und für
Plasmidlinearisierungen als Vorbereitung der DNA für in vitro-Transkriptionen dienen
Maxipräparationen.
Das Animpfen der entsprechenden Vorkulturen erfolgt entweder durch eine einzelne Bakterienkolonie oder wahlweise durch einen Tropfen einer bereits vorhandenen Vorkultur.
Präparationsmethode
Volumen der Vorkultur
aufzureinigendes Volumen
Minipräparation
2 ml
1,5 ml
Midipräparation
10 ml
2 ml
Maxipräparation
25 ml
25 ml
Für eine Minipräparation werden 1,5 ml Vorkultur in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt und für 4 min bei 2.700 rcf und Raumtemperatur pelletiert. Der Kulturüberstand
wird verworfen und die Zellen in 200 µl Minilösung I durch Vortexen resuspendiert. Die
direkte Zugabe von 200 µl Minilösung II bewirkt die Lyse der Zellen. Nach 5 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur werden 150 µl Minilösung III zu dem Lysat pipettiert und die
Methoden
99
Suspension wird zweimal invertiert. Nach einer weiteren 5-minütigen Inkubation auf Eis
sind die Proteine in der Lösung ausgefallen. Die folgende Zentrifugation (10 min bei
11.000 rcf und RT) sedimentiert sie. Der DNA-haltige Überstand wird in ein neues 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt und mit 500 µl Isopropanol gefällt. Nach 2x Invertieren wird die
Nukleinsäure ohne Inkubationszeit bei 11.000 rcf und RT für 10 min pelletiert. Nach dem
vollständigen Entfernen des Überstands wird das DNA-Pellet luftgetrocknet und
schließlich in 30 µl dH2O aufgenommen.
Minilösung I:
Minilösung II:
50 mM Tris/HCl; pH 8,0
10 mM Na2EDTA
100 µg/ml RNase A (v/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
0,2 M NaOH
1% SDS (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
Minilösung III:
3 M KAc
 gelöst in dH2O
 pH auf 5,5 mit 10% HAc einstellen
 autoklavieren
Die Plasdmidmidipräparationen wurden im Rahmen der vorliegenden Studie mit dem Nucleo Spin® Plasmid Kit (Macherey-Nagel) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Nachdem die extrahierte DNA in 50 µl dH2O aufgenommen wurde, erfolgte eine
Konzentrationsbestimmung nach 6.5.8.. Maxipräparationen hingegen erfolgten mit dem
Kit NucleoBond® Xtra Midi (Macherey-Nagel), ebenfalls nach Angaben des Herstellers.
Die DNA wurde hierbei in 100 µl dH2O aufgenommen und die DNA gleichermaßen wie in
6.5.8. beschrieben quantifiziert.
6.6.10. Sequenzierung von Plasmid-DNA
(Sanger et al., 1977)
Alle Sequenzierreaktionen im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden von der Firma
GATC durchgeführt. Die Reaktion basiert auf der von Sanger beschriebenen Sequenziermethode. Für die Quantifizierung werden 5 µl aufgereinigte Plasmid-DNA (80 bis
100 ng/µl, nach 6.6.9.) mit 5 µl Primer mit einer Konzentration von 5 µM (5 pmol/µl) in
einem 1,5 ml Reaktionsgefäß gemischt und mit einem LIGHTrun-Barcode-Etikett beklebt.
Die Ergebnisse werden am nächsten Werktag in Form eines Chromatogramms online zur
Verfügung gestellt. Die Daten können mit der Software Chromas MFC Application gelesen
und anschließend mit den Programmen Microsoft Word, ClustalW 2.0, Reverse Complement und Flybase ausgewertet werden.
100
Methoden
6.7. RNA-Techniken
6.7.1. Isolierung von Poly(A)-mRNA aus Drosophila
Für die vorliegende Arbeit wurde für Northern-Analysen, cDNA-Synthesen und qPCR-Reaktionen messenger RNA (mRNA) über das 3'-Poly(A)-Ende mittels magnetischen Dynabeads® (oligo(dT)-Partikel, Novagen®) aus verschiedenen Entwicklungsstadien der Fliege
(ganzen Tieren, Karkassen, Köpfen und oder den Gonaden) isoliert. Zur mRNA-Isolierung
von einer Probe wurden immer 30 männliche und 15 weibliche adulte Tiere, 50 männliche
und 25 weibliche Gonaden und etwa 300 µl Embryonen (im Reaktionsgefäß abgeschätzt)
verwendet. Die Gewinnung der Embryonen erfolgt auf Apfelsaftagarplatten (siehe 6.1.3.),
welche in 30-minütigen Intervallen gewechselt werden. Die Embryonen werden dann auf
den Apfelsaftplatten für einen entsprechenden Zeitraum bei 24°C bebrütet.
Vor der Präparation werden 200 µl der magnetischen Dynabeads® in 200 µl Lyse-Bindepuffer äquilibriert. Dazu werden die Partikel im magnetischen Halter am Gefäßrand ankonzentriert und der Überstand durch Lyse-Bindepuffer ersetzt. Die Beads werden erneut
im magnetischen Halter ankonzentriert und bis zum Beladen der RNA-haltigen Proben auf
Eis gelagert. Für die Isolierung werden die Tiere/Organe auf Eis in 200 µl Lyse-Bindepuffer im 1,5 ml Reaktionsgefäß gesammelt. Nach dem mechanischen Zerkleinern der Proben mit einem Pistill werden weitere 200 µl Lyse-Bindepuffer zum Lysat zugegeben. Die
RNA wird durch Zentrifugieren für 1 min bei 11.000 rcf und 4°C von den Zellresten getrennt. Der RNA-haltige Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit
den äquilibrierten Beads vermischt. Durch eine 5-minütige Inkubationszeit bei RT im
Schüttler wird die mRNA an den magnetischen Beads immobilisiert. Anschließend werden
die Partikel für 5 min im Halter ankonzentriert und der Überstand verworfen. Die mRNA
wird nun zweimal mit jeweils 200 µl Waschpuffer mit LiDS gewaschen und einmal mit
Waschpuffer ohne LiDS. Dazu werden die Partikel jeweils ankonzentriert und in neuem
Puffer resuspendiert.
Die Elution erfolgt für 2 min bei 65°C auf dem Heizblock in einem Volumen von 20 µl
DEPC-dH2O oder EDTA. Hierbei wird die mRNA thermisch von den Beads abgelöst. Bei
Verwendung der mRNA für eine cDNA-Synthese oder qPCR-Reaktion erfolgt die Elution
in DEPC-dH2O. Soll die mRNA im Anschluss an die Aufreinigung für Northern-Analysen
auf ein Formaldehydgel aufgetragen werden, erfolgt die Elution in 20 µl 2 mM Na2EDTA.
Die Beads werden nach der Isolierung in 200 µl Regenerierungslösung aufgenommen
und bis zur Regenerierung bei 4°C gelagert.
Methoden
101
Lyse-Bindepuffer:
Waschpuffer mit LiDS:
500 mM LiCl
100 mM Tris/HCl; pH 8,0
10 mM Na2EDTA
5 mM DTT (nach Autoklavieren)
1% LiDS (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
150 mM LiCl
10 mM Tris/HCl; pH 8,0
1 mM Na2EDTA
0,1% LiDS (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
DEPC-dH2O:
0,2% DEPC (v/v)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
Regenerierung der oligo(dT)-Beads
Die oligo(dT)-haltigen Dynabeads® werden insgesamt dreimal für eine mRNA-Isolierung
verwendet. Um zu garantieren, dass keine restliche mRNA von den vorherigen Aufreinigungen an den Beads zurückgeblieben ist, werden diese durch thermische Denaturierung
von den Partikeln gelöst und anschließend mit NaOH hydrolysiert.
Die Aufbereitung beginnt mit dem Überführen der Partikel in ein neues Reaktionsgefäß
und einer Inkubation für 2 min bei 65°C auf dem Heizblock. Im Anschluss werden die
Beads im magnetischen Halter ankonzentriert und der Überstand entfernt. Dem folgt ein
doppelter Waschschritt ohne Inkubationszeiten in jeweils 200 µl Regenerierungslösung.
Die Beads werden nach den Waschfraktionen in 200 µl Lagerpuffer aufgenommen und
wie zuvor ankonzentriert. Der Überstand wird entfernt und der Waschschritt mit Lagerpuffer dreimal wiederholt. Der pH-Wert der Partikel sollte bei etwa 8,0 liegen. Falls dies
nicht gegeben ist, müssen weitere Waschschritte in Lagerpuffer erfolgen, bis der pH-Wert
erreicht wurde. Die Aufbewahrung der regenerierten Beads erfolgt schließlich bei 4°C.
Lagerpuffer:
Regenerierungslösung:
250 mM Tris/HCl; pH 8,0
20 mM Na2EDTA
0,1% Tween-20 (w/v, nach Autoklavieren)
0,02% Na-Azid (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
100 mM NaOH
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
6.7.2. Isolierung von Gesamt-RNA mit Trizol®
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde für einige qPCR-Reaktionen als template Gesamt-RNA mittels Trizol® isoliert. Für eine Probe werden dazu 30 adulte Tiere oder Hoden
aus 50 Männchen verwendet. Die Präparation der Organe erfolgt in 1x PBS, welches di-
102
Methoden
rekt vor der Isolierung abgezogen wird. Die Organe oder Tiere werden schließlich mit einem Pistill in 250 µl Trizol® im 1,5 ml Reaktionsgefäß gemörsert und anschließend weitere
250 µl Trizol® dem Gemisch zugefügt. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur folgt eine Zentrifugation für 1 min bei 12.000 rcf und 4°C. Die obere, wässrige
Phase wird in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 200 µl Chloroform für
15 s kräftig von Hand geschüttelt. Nach einer 2-minütigen Inkubation des Gemischs bei
Raumtemperatur folgt eine Zentrifugation für 15 min bei 12.000 rcf und 4°C. Der obere,
wässrige Überstand wird mit 500 µl Isopropanol versetzt und die darin gelöste RNA durch
eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur ausgefällt. Dem folgt eine Pelletierung
der Nukleinsäure (für 10 min bei 12.000 rcf und 4°C) und ein anschließender Spülschritt in
1 ml 75% EtOH (2 s vortexen und für 5 min bei 12.000 rcf und 4°C zentrifugieren). Der
Überstand wird verworfen und das Pellet schließlich in 20 µl DEPC-dH2O aufgenommen.
Zum Lösen der Nukleinsäure kann diese für maximal 15 min bei 65°C auf dem Heizblock
inkubiert werden.
Um eventueller DNA-Kontamination vorzubeugen, wurde im Anschluss an die Aufreinigung der Gesamt-RNA ein DNase-Verdau durchgeführt. Dazu wird die RNA-haltige Lösung mit 2 µl RQ1 DNase (1 U/µl, Thermo Scientific) und 10 µl 10x DNase Puffer versetzt
und der Reaktionsansatz mit dH2O auf 100 µl aufgefüllt. Im Anschluss an die Inkubation
erfolgt eine erneute Fällung der Nukleinsäure durch Zugabe von 500 µl dH2O und 500 µl
Isopropanol und eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Die Pelletierung der
RNA erfolgt für 10 min bei 12.000 rcf und 4°C. Nach dem finalen Waschschritt in 1 ml
75% EtOH (2 s vortexen und zentrifugieren für 5 min bei 12.000 rcf und 4°C) findet die
Quantifizierung der aufgereinigten RNA mittels NanoDrop 1000 (siehe 6.7.3. und 6.5.8.)
statt.
6.7.3. Konzentrationsbestimmung von RNA
mittels NanoDrop 1000
Die Konzentration von mRNA und Gesamt-RNA wird mittels NanoDrop 1000 ermittelt,
wenn die isolierte Nukleinsäure als template für qPCR-Reaktionen eingesetzt werden soll.
Die Durchführung entspricht der Konzentrationsbestimmung von Plasmid-DNA (siehe
6.5.8.).
6.7.4. RNase H-Behandlung
Diese Methode kann zur Analyse von Polyadenylierungseffekten an mRNAs genutzt werden. Die RNase H ist eine Ribonuklease, welche RNA/DNA-Hybride erkennt und darin
spezifisch die RNA schneidet. Nach einer Inkubation einer mRNA mit einem oligo(dT)-
Methoden
103
Primer hybridisiert dieser an das Poly(A)-Ende und das Enzym kann den RNA-DNA-Duplex erkennen und schneiden. Für ein Experiment werden immer eine behandelte und
eine unbehandelte Probe gleichermaßen hergestellt (siehe 6.7.1.), wobei die Elution mit
DEPC-dH2O anstelle von EDTA-halitger Lösung erfolgt. Anschließend werden diese beiden RNA-Proben vermischt und wieder auf zwei identische Ansätze aufgeteilt. Die Reaktionsansätze setzten sich aus folgenden Komponenten zusammen:
RNase HReaktionsansatz
Kontrollansatz
Reagenz
20 µl
20 µl
mRNA-Eluat in DEPC-dH2O (Angaben im Text)
10 µl
10 µl
5 x RNase H-Puffer (s.u.)
20 µl
0 µl
poly d(T)12-18-Primer (100 µM, Carl Roth)
2 µl
2 µl
RNase H (5 U/µl, Epicentre®)
0 µl
20 µl
DEPC-dH2O
Beide Reaktionsansätze werden parallel wie folgt behandelt: Nach einer Inkubation für
30 min bei 37°C wird die Reaktion durch eine zweiminütige Inkubation auf Eis gestoppt.
Der Ansatz wird mit DEPC-dH2O auf 200 µl Gesamtvolumen aufgefüllt und 1 Vol Phenol/Chloroform zugegeben. Nach einer Zentrifugation (10 min, 11.000 rcf, RT) wird der
RNA-haltige Überstand mit 80 µl 7,5 M Ammoniumacetat und 600 µl 100% EtOH für
30 min bei -80°C gefällt. Nach einer Pelletierung für weitere 30 min bei 11.000 rcf und 4°C
wird die Nukleinsäure in 170 µl 70% EtOH gewaschen (Zentrifugation wie zuvor). Nach
kurzem Lufttrocknen wird die aufgereinigte RNA in 20 µl DEPC-dH2O aufgenommen, in
einem denaturierenden RNA-Gel fraktioniert (siehe 6.7.5.) und durch einen Northern-Blot
(siehe 6.7.6.) auf einer Nylonmembran gekoppelt. Durch eine Hybridisierung mit einer
radioaktiven Sonde (siehe 6.7.8.) kann somit in der behandelten RNA-Probe die reine
Transkriptlänge detektiert werden, während in der nicht-behandelten Spur die vollständig
polyadenylierte Sequenz markiert wird.
RNase H-Puffer (5x):
500 mM KCl
100 mM Tris/HCl; pH 7,5
50 mM MgCl2
5 mM DTT (nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
104
Methoden
6.7.5. Elektrophoretische Auftrennung von RNA in denaturierenden Formaldehydgelen
Um isolierte RNA auf einem Formaldehydgel ihrer Länge nach aufzutrennen, muss vor
dem Gellauf zur Vermeidung von RNA-Sekundärstrukturen eine Probenvorbereitung erfolgen. Dazu wird die RNA mit 20 µl deionisiertem Formamid, 8 µl 37% Formaldehyd, 6 µl
10x MOPS-Puffer und 2 µl Ethidiumbromid (500 µg/ml dH2O) gemischt. Parallel dazu werden als Referenz 2 µl des Standards „RiboRulerTM High Range RNA Ladder“ (0,48 µg/µl)
mit 18 µl DEPC-dH2O vermischt und wie die 20 µl isolierte mRNA gleichermaßen vorbereitet. Vor dem Gelauftrag werden alle Proben für 5 min bei 65°C denaturiert, auf Eis abgekühlt und schließlich mit 6 µl 6x RNA-Load versetzt.
MOPS-Puffer (10x):
RNA-Auftragspuffer (6x):
200 mM 3-Morpholinopropansulfonsäure
50 mM Natriumacetat
10 mM Na2EDTA
 gelöst in dH2O
 pH auf 7,0 mit 5 M NaOH einstellen
 autoklavieren
70% Glycerin (w/v)
0,1% Bromphenolblau (w/v)
0,1% Xylencyanol FF (w/v)
 gelöst in dH2O
Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt in einer horizontalen Gelkammer, die eine Zirkulation des Puffers ermöglicht. In einem 1,5% Agarosegel, welches durch Zugabe von
Formaldehyd denaturierend auf die RNA-Sekundärstrukturen wirkt, können die RNA-Moleküle anhand ihrer Größe aufgetrennt werden. Für 100 ml 1,5% Gellösung werden 1,5 g
Agarose (w/v) in 85 ml dH2O und 10 ml 10x MOPS-Puffer im Erlenmeyerkolben in der Mikrowelle aufgekocht. Zuvor muss die Füllhöhe an der Gefäßwand markiert werden, um
verdampftes Wasser nach dem Aufkochen wieder aufzufüllen. Nachdem die Lösung auf
70°C abgekühlt ist, werden 5 ml 37% Formaldehyd zugegeben und der gesamte Ansatz
vorsichtig geschwenkt. Die Gellösung wird sofort unter Vermeidung von Blasenbildung in
die Gelkammer gegossen. Nach dem Abkühlen des Gels wird es mit 1x MOPS-Puffer
überschichtet. Der Gellauf erfolgt für etwa 2,5 h bei konstanten 120 V in 1x MOPS-Puffer.
6.7.6. Northern-Transfer
Im Anschluss einer elektrophoretischen Auftrennung von RNA wird sie durch einen Northern-Blot (Abbildung 6-2) auf eine Nylonmembran transferiert. Damit die RNA störungsfrei durch Kapillarkräfte vom Gel auf die Membran überführt werden kann, muss die Konstruktion luftblasenfrei sein. Der Blot erfolgt über Nacht bei Raumtemperatur und kann am
folgenden Vormittag abgebaut werden. Schließlich wird die RNA wie unten beschrieben
auf dem Filter immobilisiert.
Methoden
105
Abbildung 6-2: Schematische Darstellung eines Northern-Blots.
Für die Blot-Konstruktion wird eine Transferwanne etwa 2 cm hoch mit 20x SSPE-Puffer befüllt. Auf die
Wanne wird eine Glasplatte platziert und darauf geachtet, dass die Platte nur seitlich auf der Wanne
aufliegt. Zwei in Gelbreite zugeschnittene Blottingpapiere werden mit 20x SSPE-Puffer getränkt und
blasenfrei über die Glasplatte gelegt. Die Papiere müssen nach oben und unten über die Platte hinaus in
die Transferwanne ragen und in den SSPE-Puffer eintauchen. Auf die Blottingpapiere wird das Formaldehydgel arrangiert und die Nylonmembran in Gelbreite darauf aufgelegt. Schließlich folgen zwei weitere Lagen Blottingpapiere, ebenfalls in der Breite des Gels, und ein Stapel saugfähiger Papierhandtücher. Die in Gelbeite zugeschnittenen Blottingpapiere, welche in den Puffer ragen, werden Parafilm ®
abgedeckt, um den Kapillarsog durch das Gel zu leiten. Zur Beschwerung wird dem Blot-Aufbau ein Gewicht von etwa 1 kg aufgesetzt. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
SSPE-Puffer (20x):
3,6 M NaCl (420 g/l)
0,2 M NaH2PO4 (62,4 g/l)
20 mM Na2EDTA (14,9 g/l)
 gelöst in dH2O
 pH auf 7,7 mit 5 M NaOH einstellen
 autoklavieren
Immobilisierung von RNA auf einer Nylonmembran
Die transferierte mRNA wird nach dem Blotten durch UV-crosslinking auf der Nylonmembran (HybondTM-N+, GE Healthcare) fixiert. Der Filter wird dazu mit der RNA nach oben in
den Stratalinker 2400 eingelegt und das crosslinking bei 254 nm und 1200 J eingeleitet.
Anschließend kann der Filter bis zur Hybridisierungsreaktion in Frischhaltefolie eingeschlagen und bei 4°C gelagert oder direkt vorhybridisiert (siehe 6.7.8.) werden.
6.7.7. In vitro-Transkription zur Herstellung von radioaktiven Sonden
(Zinn et al., 1983; Krieg und Melton, 1984; Melton et al., 1984)
für Northern-Analysen
Um mRNA spezifisch in verschiedenen Geweben, Entwicklungsstadien oder Geschlech-
106
Methoden
tern von Drosophila nachzuweisen, wurden für die vorliegende Arbeit radioaktiv markierte
antisense-Transkripte synthetisiert und diese auf Northern-Membranen hybridisiert (siehe
6.7.8.). Als template wird linearisierte Plasmid-DNA verwendet, welche wie in 6.5.6. beschrieben restriktionsenzymatisch gespalten und nach Protokoll 6.5.3. und 6.5.4. aufgereinigt wird. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt mittels eines Agarosegels (siehe
6.5.8.). Ein Reaktionsansatz für die in vitro-Synthese setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen:
x µl
linearisierte Plasmid-DNA (1 µg in dH2O)
4 µl
5 x Transkriptionspuffer (Thermo Scientific)
3 µl
ACG-Mix (je 3,3 mM, Carl Roth)
2 µl
0,1 M DTT (gelöst in dH2O)
1 µl
RNase Inhibitor (40 U/µl, Thermo Scientific)
1 µl
UTP (200 µm, Carl Roth)
1 µl
α-32P-UTP (10 µCi/µl, Hartmann Analytic)
1 µl
RNA-Polymerase (20 u/µl, Thermo Scientific)
ad 20 µl
mit DEPC-dH2O
Die Transkription erfolgt für 1,5 h bei 37°C auf dem Heizblock. Das template wird durch
Zugabe von 1 µl RQ1 DNase (1 U/µl, Thermo Scientific) in 15 min bei 37°C verdaut. Die
Reaktion wird durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion gestoppt. Dazu wird der Ansatz
zur Einleitung der Fällung mit 20 µl tRNA (1 mg/ml) versetzt, mit DEPC-dH2O auf 200 µl
aufgefüllt und mit dem selben Volumen Phenol/Chloroform durch Vortexen vermischt.
Eine folgende Zentrifugation für 2 min bei 11.000 rcf und Raumtemperatur trennt die
wässrige von der organischen Phase. Die obere, wässrige Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die RNA mit 80 µl 7,5 M Ammoniumacetat und 600 µl 96% EtOH
bei -20°C für 30 min oder bei -80°C für 15 min gefällt. Durch Zentrifugation für 15 min bei
11.000 rcf und 4°C pelletiert die RNA. Nach einem Waschschritt in 170 µl 70% EtOH (Zentrifugation wie zuvor) wird die RNA luftgetrocknet und anschließend in 100 µl TE-4 aufgenommen. Die Sonde wird zusammen mit der Hybridisierungslösung (5 ml) in einer 20 ml
Szintillationsmessflasche vermischt und die Intensität der radioaktiven Sonde anhand des
Flüssigszintillationszählers Hidex 300 SL bestimmt. Die Messung basiert auf der TDCR
(Triple to Double Coincidence Ratio)-Methode (Wanke et al., 2012), welche die durch ßZerfall ausgelöste Intensität der Tscherenkow-Strahlung bestimmt. Die Radioaktivität wird
schließlich in CPM (counts per minute) angegeben. Für Hybridisierungen wurden nur Sonden eingesetzt, deren CPM-Wert höher als 1 x 106 war. Zur Bestimmung der Hintergrundstrahlung wird eine identische Lösung angesetzt, wobei die 100 µl Sondenlösung durch
reines TE-4 ersetzt werden. Das Messvolumen darf dabei 5 ml nicht unterschreiten, da der
Methoden
107
Flüssigkeitsspiegel ansonsten außerhalb des Messbereichs vom Gerät liegt.
für EMSA-Analysen
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sense-“Volllängentranskripte“ zum Nachweis
von RNA-bindenden Proteinen synthetisiert und in einem electrophoretic mobility shift
assay (EMSA, siehe 6.7.11.) eingesetzt. Die Transkription von radioaktiven EMSA-Sonden entspricht der Northern-Transkriptsynthese (s.o. für Northern-Analysen). Für Kompetitionsexperimente hingegen wird zusätzlich die 10-fache Menge des nicht-radioaktiven
Kompetitors benötigt, welche nach folgendem Pipettierschema in 10 parallelen Reaktionen hergestellt wurde:
x µl
linearisierte Plasmid-DNA (1 µg in dH2O)
4 µl
5 x Transkriptionspuffer (Thermo Scientific)
4 µl
ACGU-Mix (je 2,5 mM, Carl Roth)
2 µl
0,1 M DTT (gelöst in dH2O)
1 µl
RNase Inhibitor (40 U/µl, Thermo Scientific)
1 µl
RNA-Polymerase (20 u/µl, Thermo Scientific)
ad 20 µl
mit DEPC-dH2O
Die Fällung von radioaktiven und nicht-markierten Transkripten, welche für einen EMSA
eingesetzt werden, wird nach folgendem Protokoll realisiert: Nach der 90-minütigen Synthese auf dem Heizblock bei 37°C wird das DNA-template mit 1 µl RQ1 DNAse (1 U/µl,
Thermo scientific) für 15 min bei 37°C enzymatisch gespalten. Die Ribonukleinsäure wird
dann mit 20 µl tRNA (1 mg/ml), 300 µl Ammoniumacetat (1 M) und 1 Vol Phenol/Chloroform gemischt. Anschließendes Vortexen und Zentrifugieren bei 11.000 rcf und Raumtemperatur für 2 min trennt die organische von der wässrigen Phase. Die RNA in der oberen
(wässrigen) Phase wird durch 3 Vol 100% EtOH für 15 min bei -80°C oder für 30 min bei
-20°C gefällt. Ein Zentrifugationsschritt für 15 min bei 11.000 rcf und 4°C pelletiert die
Nukleinsäure. Anschließend wird sie in 170 µl 70% EtOH für 10 min bei 11.000 rcf und
4°C gewaschen und kann dann bei 42°C auf dem Heizblock getrocknet werden. Die RNA
wird abschließend aus allen zehn Gefäßen nacheinander in dieselben 10 µl RNAAuftragspuffer aufgenommen und somit ankonzentriert. Unmittelbar vor dem Gelauftrag
auf ein PAA-Gel wird die Probe für 3 min bei 95°C denaturiert und auf Eis abgekühlt.
RNA-Auftragspuffer:
80% Formamid
2 mM Na2EDTA; pH 8,0
0,1% Xylencyanol FF (w/v)
0,1% Bromphenolblau (w/v)
 gelöst in dH2O
108
Methoden
Vor dem Montieren der Gießapparatur wird die obere Platte mit 10 ml Chloroform und
200 µl Dichlordimethylsilan behandelt. Dazu wird die Lösung auf der gesamten Glasfläche
gleichmäßig verteilt und für 10 min bei Raumtemperatur unter dem Abzug inkubiert. Nach
einem 3-minütigen Wässerungsschritt unter fließendem Leitungswasser wird die Platte mit
einem Zellstofftuch vorsichtig trocken getupft. Die untere Bindeplatte hingegen bleibt unbehandelt.
Zur Auftrennung des längendefinierten Transkripts wird ein 15% Polyacrylamidgel (PAAGel) hergestellt, welches mit Harnstoff versetzt ist und eine Dicke von 1 mm aufweist. Die
Komponenten werden bis auf 10% APS und TEMED gemischt und mittels einer Wasserstrahlpumpe (Glasmikrofaserfilter, Porengröße: 0,7 µm, Ø 47 mm, VWR®) entgast. Nach
Zugabe von APS und TEMED muss das Gel schnell gegossen werden, damit es nicht zu
früh polymerisiert. Vor dem eigentlichen Gellauf wird ein Vorlauf des Gels für 30 min bei
20 mA durchgeführt, um nicht polymerisiertes Acrylamid in der Gelmatrix zu entfernen. Die
Auftrennung der RNA erfolgt über das Elektrophoresesystem für vertikale Gele (Hoefer
Inc) bei 25 mA für etwa 1,5 bis 2 h in vorgekühltem (Kühleinheit Haake) 1x TBE als Laufpuffer.
15% Polyacrylamidgel (PAA-Gel):
20% PAA-Stammlösung (39:1)/8 M
Harnstoff (1 l):
18,75 ml Stammlösung (20% PAA-Stammlösung)
3,75 ml dH2O
485 g Harnstoff
2,5 ml 10x TBE-Puffer
197 g Acrylamid
150 µl 10% APS (w/v, nach Entgasen)
5 g N,N'-Methylen-Bis-Acrylamid
42,5 µl TEMED (nach Entgasen)
 gelöst in dH2O
Im Anschluss an den Gellauf wird die Repelplatte entfernt, das Harnstoffgel auf der Bindeplatte in Frischhaltefolie faltenfrei eingeschlagen und gegen einen Röntgenfilm in einer
speziellen EMSA-Röntgenkassette mit entsprechender Tiefe für 20 min bei RT exponiert.
Der Film wird für 5 min in Entwicklerflüssigkeit inkubiert, mit Leitungswasser gespült und
schließlich 5 min in Fixierlösung haltbar gemacht. Nachdem der Film getrocknet ist, kann
dieser als Vorlage unter das Polyacrylamidgel gelegt und die entsprechende Region des
Volllängentranskriptes mit einer Rasierklinge ausgeschnitten werden. Das Gelstück wird in
ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und über Nacht in 360 µl Elutionspuffer auf dem
Drehrad inkubiert, um die RNA aus dem Gel zu lösen.
Elutionspuffer:
500 mM Ammoniumacetat
10 mM Magnesiumacetat
1 mM Na2EDTA
0,1% SDS (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
Methoden
109
6.7.8. Northern-Hybridisierung
Vor der Hybridisierung erfolgt eine Absättigung der unspezifischen Bindungsstellen der
Northern-Membran. Dazu wird der Filter in ein Hybridisierungsröhrchen (Biometra) überführt und für 2 bis 4 h bei 62°C im Hybridisierungsofen (OV2 mit Rotisserie, Biometra) unter Rotation (6 rpm) in 20 ml Vorhybridisierungslösung inkubiert. Anschließend wird die
Lösung entfernt und durch 5 ml Hybridisierungslösung mit der radioaktiven Sonde ersetzt.
Nach einer Inkubationszeit von 24 bis 72 h bei 62°C und 6 rpm im Hybridisierungsofen
wird die radioaktive Lösung in eine 20 ml Szintillationsmessflasche überführt und bei
-20°C gelagert, bis die Radioaktivität abgeklungen ist. Die Membran wird einmal in
Waschlösung I für 30 min und zweimal in Waschlösung II für jeweils 20 min zu den vorherigen Bedingungen inkubiert. Dies verhindert Hintergrundsignale auf dem späteren
Röntgenfilm, da ungebundene, unspezifische radioaktive Komponenten von der Membran
gespült werden. Anschließend kann eine Exposition (s.u.) erfolgen.
Vorhybridisierungslösung (20 ml):
Hybridisierungslösung (5 ml):
10% SDS (w/v, nach Autoklavieren)
0,5 M NaPO4; pH 6,5
 gelöst in DEPC-dH2O
5x SSPE
500 mM deionisiertes Formamid
50 mM NaPO4; pH 6,5
100 µl radioaktive Sonde in TE-4
 gelöst in DEPC-dH2O
Waschlösung I:
Waschlösung II:
2x SSPE
0,2% SDS (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in DEPC-dH2O
 autoklavieren
0,1x SSPE
0,2% SDS (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in DEPC-dH2O
 autoklavieren
NaPO4:
1 M NaH2PO4 zu 1 M Na2HPO4 geben, bis pH 6,5 erreicht ist
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
6.7.9. Exposition von radioaktiven Signalen
Der Nachweis von hybridisierten in vitro-Transkripten auf Nylonmembranen oder von
RNA-Bindungsstudien im Anschluss eines EMSAs wird auf einem Röntgenfilm durch die
Detektion von radioaktiven Zerfällen realisiert. Die Exposition erfolgt entweder bei RT oder
bei -80°C in einer lichtundurchlässigen Kassette (Typ G/GR-Kassette). Die Temperatur
und die Dauer der Exposition sind dabei abhängig von der Intensität der radioaktiven
Sonde. Bei schwächeren Transkripten ist die Exposition bei -80°C effektiver, da das Si-
110
Methoden
gnal durch den amplifying screen verstärkt wird (Laskey und Milis, 1977).
Für den Nachweis radioaktiver Hybride werden die hybridisierten Membranen nach den
Waschfraktionen (s.o.) faltenfrei in Frischhaltefolie eingeschlossen. Alle folgenden Arbeitsschritte finden in einer Dunkelkammer statt. Zunächst wird ein Röntgenfilm in eine
Entwicklungskassette auf den amplifying screen aufgelegt und die eingeschlagene Membran mit der RNA-gebundenen Seite nach unten auf dem Film positioniert. Die untere
Kante des Filters schließt dabei bündig mit dem Röntgenfilm ab. Durch den radioaktiven
Zerfall des Phosphorisotops α-32P wird Licht freigesetzt, was den Röntgenfilm lokal belichtet. Nach der Exposition folgt die Entwicklung des Röntgenfilms mit einer 5-minütigen
Inkubation in Entwicklerlösung (Röntgen-Wetzel). Diese wird nach der Reaktion mit Leitungswasser abgespült und ein Nachdunkeln des Films durch eine 5-minütige Inkubation
in Fixierlösung (Röntgen-Wetzel) verhindert. Nach einem abschließenden Spülschritt mit
Leitungswasser kann die Auswertung des Filmes erfolgen.
6.7.10. Entfernung radioaktiver RNA-Sonden von einer Nylonmembranen
Für einige Northern-Analysen müssen Membranen mit mehreren radioaktiven Sonden der
gleichen Transkriptlänge nacheinander hybridisiert werden. Damit die gebundenen Transkripte von der Membran gelöst werden können und somit eine Überlagerung der Signale
ausgeschlossen werden kann, werden die Filter für 2 h im Hybridisierungsofen bei 65°C in
Stripping buffer inkubiert. Der Puffer wird anschließend entfernt und eine Vorhybridisierung der Membran für 2 h bei 42°C durchgeführt. Die folgende Hybridisierung wird wie
zuvor beschrieben durchgeführt.
Stripping buffer:
Denhardt's-Lösung (100x):
5 mM Tris/HCl; pH 8,0
2 mM Na2HPO4
0,1x Denhardt's-Lösung
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
2% Ficoll
2% Polyvinylpyrrolidon (PVP)
2% Rinderserumalbumin (BSA)
 gelöst in dH2O
6.7.11. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
(Konarska und Sharp, 1986)
Dieses Experiment dient dem Nachweis der Komplexbildung mit DNA- oder RNA-bindenden Proteinen an einem spezifischen sense-Transkript. Im Anschluss an die Bindungsreaktion wird der Ansatz in einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisch
aufgetrennt. RNA-Protein-Komplexe weisen eine geringere elektrophoretische Mobilität
auf und werden durch langsameres Laufverhalten im Gel von den freien Transkripten getrennt, welche sich weiter oben im Gel ansammeln.
Methoden
111
Nach der Elution des in vitro-Volllängentranskriptes (IVT) über Nacht wird der gesamte
Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die RNA mit 20 µl tRNA (1 mg/ml)
und 500 µl Phenol/Chloroform nach Vortexen und Zentrifugieren für 2 min bei 11.000 rcf
und RT aufgereinigt. Die Fällung erfolgt durch Zugabe von 30 µl Natriumacetat (3 M) und
990 µl 100% EtOH für 20 min bei -80°C oder 2 h bei -20°C. Durch Zentrifugieren (20 min
bei 11.000 rcf und 4°C) wird die RNA pelletiert. Nach einem Waschschritt in 170 µl 70%
EtOH (Zentrifugation wie zuvor) wird das Transkript bei 42°C auf dem Heizblock getrocknet und schließlich in 10 µl dH2O aufgenommen. Anschließend wird es für 3 min bei 95°C
denaturiert und bis zur Bindungsreaktion auf Eis gelagert.
Für den Bindungsansatz wird die Proteinlösung (rekombinant hergestelltes und aufgereinigtes Protein oder Hodenproteinextrakt, siehe 6.8.3. und 6.8.4.) mit 3 µl Bindungspuffer,
0,5 µl RNase Inhibitor, 0,5 µl tRNA (1 mg/ml), 0,3 µl Heparin (100 mg/ml) und DEPC-dH2O
(auf 20 µl auffüllen) vermischt und für 10 min bei RT präinkubiert. Anschließend wird das
radioaktive Transkript gleichermaßen auf alle Bindungsansätze verteilt. Bei Kompetitionsexperimenten hingegen enthält jeder Reaktionsansatz 1 µl radioaktives Transkript, welches als letzte Komponente dem Ansatz beigemischt wird, damit die Transkriptverhältnisse nicht verfälscht werden. Die eigentliche Bindungsreaktion erfolgt schließlich für 20 min
bei RT und wird durch Zugabe des gleichen Volumens vom Bindungsansatz mit EMSA
Auftragspuffer gestoppt.
EMSA Bindungspuffer:
EMSA Auftragspuffer:
80 mM NaCl
10 mM MgCl2
10 mM Tris/HCl; pH 7,9
8% Glycerin (w/v)
 gelöst in dH2O
70% Glycerin (w/v)
0,25x TBE
0,1% Bromphenolblau (w/v)
 gelöst in dH2O
Nach der Reaktion wurden die Ansätze in einer nativen PAA-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und die Signale durch Autoradiographie in Form eines Autoradiogramms dokumentiert. Falls eine Interaktion zwischen dem getesteten Protein und dem Transkript besteht,
resultiert ein RNA-Protein-Komplex mit einem höheren Molekulargewicht, welcher die
Gelmatrix langsamer durchläuft als das ungebundene Transkript und somit einen Shift
repräsentiert.
Für den Gellauf werden die Proben in ein 1,5 mm dickes, 4%-iges Polyacrylamidgel (PAAGel) aufgetragen. Zur Herstellung des Gels wird die Lösung wie das 15% PAA-Gel mittels
einer Wasserstrahlpumpe und dem Glasmikrofaserfilter (Porengröße: 0,7 µm, Ø 47 mm,
VWR®) entgast und anschließend der Lösung APS und TEMED zugegeben. Vor dem eigentlichen Gellauf findet auch bei diesem Gel eine Präelektrophorese für 30 min bei
112
Methoden
20 mA statt, bevor der eigentliche Gellauf für etwa 2,5 h bei 25 mA in 6°C vorgekühltem
(Kühleinheit Haake) 0,25x TBE folgt. Nach der elektrophoretischen Auftrennung kann die
Repelplatte abgenommen werden und das gallertartige Gel, welches an der Bindeplatte
haftet, faltenfrei in Frischhaltefolie eingewickelt und gegen einen Röntgenfilm in einer
EMSA-Röntgenkassette bei -80°C exponiert werden (siehe 6.7.8.). Die Expositionszeit
kann von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen variieren.
4% Polyacrylamidgel:
20% PAA-Stammlösung (60:1) (100 ml):
29 ml dH2O
10 ml Stammlösung (20% PAA (60:1)
10 ml 50% Glycerin (w/v)
1,3 ml 10x TBE-Puffer
300 µl 10% APS (w/v, nach Entgasen)
85 µl TEMED (nach Entgasen)
19,7 g Acrylamid
0,3 g N,N'-Methylen-Bis-Acrylamid
 gelöst in dH2O
6.8. Proteinbiochemische Techniken
6.8.1. Überexpression von rekombinanten Proteinen in E.coli
Die Gensequenz des im Rahmen der vorliegenden Dissertation für Bindungsstudien verwendeten Proteins Orb2 wurde bereits im Rahmen vorheriger Studien der Arbeitsgruppe
in die Vektoren pET-21a(+) und pET-41a(+) inseriert (Starck, 2007). Das kodierte Fusionsprotein kann nach einer erfolgreichen Transformation in E.coli-Zellen (siehe 6.6.7.)
rekombinant exprimiert werden. Abhängig vom pET-Vektor enthält es dann einen HISund/oder GST-Tag, über den das entsprechende Fusionsprotein aus den Bakterienzellen
aufgereinigt werden kann. Die Expression des modifizierten Proteins wird durch Zugabe
von IPTG eingeleitet. Dieser Signalstoff bindet den Repressor, wodurch sich dessen Konformation ändert und dieser darauf hin vom Operator dissoziiert. Die T7-RNA-Polymerase
kann nun an den freigewordenen Promotor binden und die Transkription der einklonierten
Gensequenz einleiten.
Als Vorbereitung für die Induktion der Proteinexpression werden 10 ml LB-Medium mit
dem entsprechenden Antibiotikum mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht
im Schüttelinkubator (Thermoshake, Gerhardt) bei 37°C und 120 rpm inkubiert. Am folgenden Tag werden zweimal 1 ml dieser Bakteriensuspension bei 2.700 rcf und 4°C für
5 min in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen pelletiert. Nach dem Verwerfen des Überstandes werden die Pellets jeweils in 1 ml frischem, mit Antibiotikum versetztem LB-Medium (50 µg/ml) resuspendiert. Diese Lösung wird im Weiteren mit 9 ml des gleichen Mediums im Erlenmeyerkolben verdünnt. Die transgenen Bakterien vermehren sich im Schüttelinkubator bei 37°C und 120 rpm, bis sie eine OD550 von 0,5 bis 0,7 erreicht haben. Um
die Induktion einzuleiten, werden die Kulturen mit frischem Medium auf 15 ml Endvolumen
Methoden
113
aufgefüllt, aber nur eine mit IPTG (Endkonzentration: 1 mM) versehen. Als Kontrolle dient
die zweite, identisch angezogene Kultur, welche nicht induziert wird.
Die Expression erfolgt im Schüttelinkubator, wobei Dauer und Temperatur der Synthese
für jedes Fusionsprotein individuell sind und durch eine vorherige Testreihe ermittelt werden müssen. Im Anschluss an die Expression werden die Bakterienkulturen auf Eis abgekühlt und in 1 ml Aliquots bei 2.700 rcf und 4°C für 5 min pelletiert. Die Lagerung bis zur
Aufreinigung erfolgt bei -20°C.
6.8.2. Überprüfung der Proteinexpression (Zelllyse)
Die Kontrolle der Proteinexpression beginnt mit dem Zellaufschluss der Bakterien. Um
dies zu erleichtern, werden die pelletierten Zellen nach der Expression für mindestens
30 min bei -20°C eingefroren. Die Bakterienpellets werden dann von -20°C auf Eis aufgetaut. Nach einer Resuspension in 100 µl STE-Lysepuffer folgt eine 15-minütige Inkubation
auf Eis. In einer Testreihe wurde ermittelt, dass durch Zugabe von Detergenzien (z.B. Sarkosyl) die Löslichkeit der rekombinanten Proteine erhöht werden kann (nach Frangioni
und Neel, 1992). Um das für die vorliegende Arbeit untersuchte Protein Orb2 in Lösung zu
bringen, ist eine Sarkosylkonzentration von 0,5% im Lysepuffer und 0,25% in allen anderen Pufferlösungen notwendig.
Eine doppelte Ultraschallbehandlung von 2x 20 s erhöht die Effizienz des Zellaufschlusses (Dörfler, 2013). Die anschließende Zentrifugation für 5 min bei 11.000 rcf und 4°C
trennt die Bakterienbestandteile vom Fusionsprotein und anderen löslichen Bakterienproteinen. Der Überstand wird in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und für die folgende Isolierung auf Eis oder für längere Zeit bei -20°C gelagert. Das Pellet wird in 100 µl
STE-Lysepuffer resuspendiert. Es wird auf EDTA in dem Puffer verzichtet, da dies die Bindung an die entsprechenden Beads beeinträchtigen kann. Von allen Fraktionen werden
5 µl Aliquots abgenommen und für eine SDS-Page (siehe 6.8.6.) vorbereitet.
STE-Lysepuffer:
500 mM NaCl
10 mM Tris/HCl; pH 8,0
 gelöst in dH2O
 frisch zugeben:
1 mM Proteaseinhibitor Cocktail P8849
0,5 mg/ml Lysozym
1 µl RQ1 DNase (1 u/µl)
0,25% Sarkosyl (w/v, in STE)
114
Methoden
6.8.3. Aufreinigung bakteriell exprimierter Fusionsproteine
Nach der Zelllyse können die modifizierten Proteine über ihren angehängten Tag aufgereinigt werden. Die Isolierung erfolgt, abhängig von dem Tag, entweder mit dem MagneGSTTM (Promega) oder dem MagneHISTM Purfication System Kit (Promega). Aus allen
Fraktionen werden 5 µl-Aliquots abgenommen und im Anschluss an die Aufreinigung für
eine SDS-PAGE (siehe 6.8.6.) vorbereitet.
MagneGSTTM Purfication System
Das in E.coli rekombinant erzeugte Protein Orb2 aus dem Klon Orb2 in pET-41a(+) von
Starck (2007) wird über den fusionierten GST(Glutathion-S-Transferase)-Tag aufgereinigt.
Im Vorfeld der Isolierung werden je Probe 300 µl MagneGST-Beads in 500 µl BindeWaschpuffer äquilibriert. Die Partikel werden dazu im magnetischen Halter ankonzentriert
und der Überstand vollständig entfernt. Nach Zugabe des Binde-Waschpuffers werden die
Beads in der Lösung resuspendiert und erneut ankonzentriert. Der nun entfernte Überstand kann verworfen werden und die Partikel in 200 µl frischem Binde-Waschpuffer aufgenommen werden. Das Lysat (siehe 6.8.2.) wird mit der Suspension der vorbereiteten
Beads vermischt und der gesamte Ansatz für 1 bis 2 Stunden bei 4°C auf dem Drehrad
inkubiert. Das Endvolumen sollte 300 µl Puffer-Lysat-Gemisch nicht überschreiten.
Nach der Inkubation werden die Beads im Halter erneut konzentriert und der Überstand
(Durchfluss = D) abgenommen. Im Folgenden werden drei Waschschritte (W1 - W3)
durchgeführt, wobei die Partikel jeweils in 250 µl Binde-Waschpuffer resuspendiert und
anschließend ankonzentriert werden. Der Elutionsschritt (E) erfolgt in 50 µl Elutionspuffer
für 15 min bei 4°C auf dem Drehrad. Hierbei konkurriert das enthaltene Glutathion mit
dem GST-Tag des Fusionsproteins, wodurch das Fusionsprotein von den Beads gelöst
wird. Der Elutionsvorgang kann bis zu dreimal wiederholt werden (E1 - E3). Die Beads
einer Proteinaufreinigung werden im Anschluss an die Aufreinigung in 300 µl BindeWaschpuffer (entspricht Ausgangsvolumen, s.o.) bei 4°C gelagert und können für insgesamt 4 Aufreinigungen verwendet werden. Die Dauerlagerung des Proteinextraktes erfolgt
bei -80°C.
Binde-Waschpuffer:
Elutionspuffer:
140 mM NaCl
10 mM KCl
4,2 mM Na2HPO4
2 mM K2HPO4
0,25% Sarkosyl (w/v)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
500 mM NaCl
50 mM Glutathion; pH 7,0 – 8,0
50 mM Tris/HCl; pH 8,1
0,25% Sarkosyl (w/v)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
Methoden
115
MagneHISTM Purfication System
Das rekombinant in E.coli exprimierte Protein Orb2, welches vom Klon Orb2 in pET21a(+) (Starck, 2007) resultiert, wird über den fusionierten Polyhistidin (His)-Tag aufgereinigt. Für eine Aufreinigung werden 300 µl Beads in 500 µl Bindepuffer äquilibriert. Die weitere Durchführung entspricht dem Protokoll des MagneGST TM Purfication Systems, mit
Ausnahme der Puffer-Volumina und Pufferzusammensetzung (s.u.). Die Proteinbindung
erfolgt in 600 µl Bindepuffer-Lysat-Gemisch. Für die anschließenden drei Waschfraktionen
werden jeweils 500 µl Waschpuffer verwendet. Die abschließende Elution erfolgt in 50 µl
Elutionspuffer, wobei sie ebenso wie bei der magneGST-Aufreinigung (s.o.) bis zu dreimal
wiederholt werden kann. Das Imidazol wird im Elutionspuffer im Überschuss zugegeben,
wodurch es mit dem Polyhistidin-Tag konkurriert und das rekombinante Fusionsprotein
schließlich von den Beads mobilisiert. Für weitere Aufreinigungen können die Beads einer
Probe in 300 µl Bindepuffer (Ausgangsvolumen, s.o.) bei 4°C gelagert werden.
Bindepuffer:
Waschpuffer:
500 mM NaCl
500 mM NaCl
100 mM HEPES-KOH; pH 8,0
100 mM HEPES-KOH; pH 8,0
10 mM Imidazol
20 mM Imidazol
0,25% Sarkosyl (w/v, nach Autoklavieren)
0,25% Sarkosyl (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
 autoklavieren
 Lösung frisch herstellen
 Lösung frisch herstellen
Elutionspuffer:
HEPES-KOH pH 8,0:
500 mM NaCl
500 mM Imidazol
100 mM HEPES-KOH; pH 8,0
0,25% Sarkosyl (w/v, nach Autoklavieren)
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
 Lösung frisch herstellen
1 M HEPES
 gelöst in dH2O
 pH mit 10 M KOH einstellen
 autoklavieren
6.8.4. Isolierung von Hodenproteinextrakt
(Kempe et al., 1993)
Als Positivkontrolle für die Bindungsstudien in einem EMSA und bei immunologischen
Nachweisen in einem Western-Blot als Negativkontrolle wird sogenannter Gesamtproteinextrakt aus Gonaden adulter männlicher Fliegen des Stammes Oregon R hergestellt. Für
einen Reaktionsansatz in einem EMSA werden Proteine aus 20 Testes, für einen Western-Blot hingegen aus 50 Testes in 1x PBS-Puffer im 1,5 ml Reaktionsgefäß auf Eis gesammelt. Nach einer 5-minütigen Zentrifugation bei 5.500 rcf und 4°C wird der Überstand
116
Methoden
abgezogen und die Organe in 10 µl Proteinextraktionspuffer aufgenommen. Dem folgen
das Schockfrieren in Flüssigstickstoff und der mechanische Zellaufschluss mittels eines
Pistills. Für eine effizientere Lyse wird der Ansatz zweimal für jeweils 20 s einer Ultraschallbehandlung auf Eis unterzogen. Ein anschließender Zentrifugationsschritt bei
11.000 rcf und 4°C für 15 min trennt den proteinhaltigen Überstand von den Zellbestandteilen. Der Überstand wird in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gelagert. Das Pellet wird erneut in 10 µl Proteinextraktionspuffer resuspendiert und wie zuvor
mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Beide Überstände werden vereint und bei
-80°C in Flüssigstickstoff schockgefroren. Die Dauerlagerung des Hodenproteinextraktes
(20 µl Gesamtvolumen aus 20 bzw. 50 Testes) erfolgt bei -80°C. Für die weitere Verwendung in einem Western-Blot wird der Proteinextrakt 1:1 mit SDS-AP vermischt und
schließlich bis zur SDS-PAGE (siehe 6.8.6.) bei -20°C gelagert.
Proteinextraktionspuffer:
PBS-Puffer (10x):
100 mM HEPES-KOH; pH 8,0
1400 mM NaCl
50 mM KCl
100 mM Na2HPO4
1 mM Na2EDTA
 gelöst in dH2O
1 mM PMFS in Isopropanol, frisch zugeben
 pH auf 7,4 mit 5 M NaOH einstellen
1 µg/ml Pepstatin in Methanol, frisch zugeben  autoklavieren
0,5 µg/µl Leupeptin in dH2O, frisch zugeben
20% (w/v) Glycerin
1% NP-40 (v/v)
 gelöst in dH2O
6.8.5. Konzentrationsbestimmung von Proteinlysaten
mittels NanoDrop 1000
Konzentrationsbestimmungen von proteinhaltigen Lösungen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit mit dem Spektralphotometer NanoDrop 1000 in Kombination mit der
kompatiblen Software V3.7 (Thermo Scientific) vorgenommen. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wird in der Maske dafür das Modul Protein A280 ausgewählt. Die Quantifizierung basiert wie bei dem Bradford Assay ebenfalls auf photometrischen Messungen.
Zur Berechnung der Proteinkonzentration in Lösung muss im Vorfeld der Extinktionskoeffizient (Protein extinction coefficient calculator), sowie das molekulare Gewicht des zu
quantifizierenden Polypeptids ermittelt und in die Maske eingegeben werden. Für jeden
Messschritt werden 2 µl Lösung benötigt. Zum Kalibrieren des Gerätes wird der entsprechende Elutionspuffer des jeweiligen rekombinanten Proteins verwendet. Der Proteingehalt wird schließlich in [mg/ml] angegeben.
Methoden
117
6.8.6. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
(Laemmli, 1970)
Die Fraktionierung von proteinhaltigen Proben durch ein Polyacrylamid (PAA)-Gel erfolgt
in einer vertikalen Gelelektrophorese (Elektrophoresesystem Mini Protean®3 vertikal). Die
Proteine werden vor dem Gelauftrag mit dem gleichen Volumen SDS-Protein-Auftragspuffer vermischt und bei 95°C thermisch denaturiert. Das im Puffer enthaltene SDS bindet an
die Peptidketten und überdeckt deren Eigenladung, um einen einheitlichen Gellauf der
verschiedenen Peptide zu ermöglichen. Das ß-Mercaptoethanol im Puffer reduziert die
Disulfidbrücken der Proteine und verhindert somit Sekundärstrukturen. Die Proteine können nun aufgrund einer einheitlichen Ladung und der Reduzierung von Proteinfaltungen
ausschließlich anhand ihrer Molekülmasse im Gel fraktioniert werden.
Das obere Drittel des PAA-Gels besteht aus einem 5% Sammelgel und die unteren 2/3
der Laufstrecke aus einem 10% Trenngel. Letzteres wird zwischen die Glasplatten pipettiert und anschließend mit 1 ml Isopropanol überschichtet. Dadurch wird eine glatte
Oberfläche geschaffen und durch den Luftabschluss die Polymerisierung des Gels eingeleitet. Nach dem Aushärten wird der Alkohol restlos entfernt und das Sammelgel bis zur
oberen Kante gegossen, bevor der Kamm positioniert wird. Vor dem Gelauftrag wird die
proteinhaltige Lösung mit gleichem Volumen 2x SDS-Protein-Auftragspuffer einschließlich
5% (v/v) ß-Mercaptoethanol versetzt und für 3 min bei 95°C denaturiert. Anschließend
werden die Proben auf Eis abgekühlt. Das maximale Volumen der Geltaschen umfasst
40 µl. Als Referenz werden 2 µl vom prestained peqGOLD Protein-Marker IV (Peqlab) mit
aufgetragen. Die Auftrennung erfolgt für etwa 90 min bei konstanten 200 V und 40 mA für
jedes PAA-Gel in 1x SDS-PAA-Laufpuffer.
Trenngel (10%, 10 ml):
Sammelgel (5%, 5 ml):
4,1 ml dH2O
3,3 ml Acrylamidlösung 30% +
0,8% Bisacrylamid
2,5 ml Trenngelpuffer; pH 8,8
0,1 ml 10% SDS (w/v)
 entgasen
50 µl 10% APS (w/v)
5 µl TEMED
2,85 ml dH2O
1,25 ml Trenngelpuffer; pH 8,8
0,85 ml Acrylamidlösung 30% +
0,8% Bisacrylamid
0,05 ml 10% SDS (w/v)
 entgasen
25 µl 10% APS (w/v)
5 µl TEMED
Trenngelpuffer:
Sammelgelpuffer:
1,5 M Tris/HCl; pH 8,8
 gelöst in dH2O
0,5 M Tris/HCl; pH 6,8
 gelöst in dH2O
118
Methoden
SDS-Protein-Auftragspuffer (2x):
SDS-PAA-Laufpuffer (10x):
62 mM Sammelgelpuffer; pH 6,8
25% Glycerin (w/v)
5% ß-Mercaptoethanol (v/v, frisch zugeben)
2% SDS (w/v)
0,1% Bromphenolblau (w/v)
 gelöst in dH2O
0,192 M Glycin (w/v, 144 g/l)
0,025 M Tris-HCl (w/v, 30,3 g/l)
1% SDS (w/v, 10 g/l)
 gelöst in dH2O
 pH auf 8,3 mit 10% HCl einstellen
6.8.7. Coomassie Brillant Blue-Färbung von PAA-Gelen
(Chrambach et al., 1967)
Bevor die Färbung eingeleitet wird, kann das Gel für etwa eine Minute in heißem dH 2O
geschwenkt werden. Somit wird SDS aus dem Gel gewaschen, wodurch weniger Hintergrundfärbung zurück bleibt. Für die unspezifische Coomassie-Färbung wird das Gel in
einer Plastikwanne mit Deckel in der Färbelösung unter Schwenken (Wippschüttler WS5,
18 Bewegungen/min) inkubiert. Nach einer Stunde wird die Färbelösung gegen Entfärber
ausgetauscht und dieser mehrfach gewechselt werden, bis die Proteinbanden gut zu erkennen sind und der Hintergrund des Gels klar ist.
Coomassie-Färbelösung:
Coomassie-Entfärbelösung:
50% Methanol (v/v)
10% Essigsäure (v/v)
0,05% Coomassie Brillant Blue R250 (w/v)
➢ gelöst in dH2O
30% Methanol (v/v)
10% Essigsäure (v/v)
➢ gelöst in dH2O
6.8.8. Western-Blot
Für einen spezifischen Nachweis von Proteinen wird im Anschluss an die SDS-PAGE ein
Western-Blot durchgeführt. Dabei werden die Proteine mittels eines Elektroblots auf eine
Trägermembran transferiert. Zur Dokumentation der SDS-PAGE wird zusätzlich zum BlotGel ein Kontrollgel angefertigt, worauf ein Aliquot der zu untersuchenden Proteinproben
aufgetragen wird. Für jede zu untersuchende Fliegenlinie werden 50 Testes in 1x PBS
präpariert und schließlich die Proteine in 20 µl Proteinextraktionspuffer aufgenommen
(siehe 6.8.4.). Das Eluat wird vor der SDS-PAGE mit 20 µl SDS-Protein-Auftragspuffer
(Verhältnis 1:1) gemischt. Von dem Proteingemisch werden 35 µl für das Blot-Gel und 5 µl
für ein PAA-Kontrollgel aufgetragen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Semidry-Verfahren angewandt. Im Vorfeld
werden dafür 4 Blottingpapiere allseits 0,5 cm größer als das PAA-Gel zugeschnitten.
Desweiteren wird die Membran (Nitrozellulosemembran, Bindekapazität: 90 µg/cm2, Sigma-Aldrich) in Gelgröße ausgeschnitten. Alle Komponenten werden in Transferpuffer getränkt und in folgender Reihenfolge zwischen die Plattenelektroden der Blotapparatur
Methoden
119
(FastblotTM B33/B34, Biometra) mittig ausgerichtet: Der Aufbau beginnt mit dem Auflegen
von 2 Lagen Blottingpapier auf die Anode, gefolgt von der Membran, dem PAA-Gel und
abschließend 2 weiteren Blottingpapieren. Alle Papierlagen können mit einer 25 ml Glaspipette glatt gerollt werden, um Luftblasen zu vermeiden und einen gleichmäßigen Transfer zu ermöglichen. Nach dem Auflegen der Kathode und dem Beschweren der Apparatur
mit 1 kg wird die Spannung angelegt, welche sich aus der Membrangröße errechnet (X
cm² Membran x 5 = X mA). Im Anschluss des Elektroblots kann das Gel zur Überprüfung
der Transfereffizienz mittels Coomassie Brillant Blue-Färbung (siehe 6.8.7.) angefärbt
werden. Die Membran kann bei Bedarf einer reversiblen Ponceau S-Färbung (siehe
6.8.9.), oder direkt nach dem Blot dem immunologischen Nachweis unterzogen werden.
Transferpuffer:
SDS-Protein-Auftragspuffer (2x):
48 mM Tris (5,81 g/l)
39 mM Glycin (2,93 g/l)
20% Methanol (v/v)
0,0375% SDS (w/v: 0,375 g/l)
 gelöst in dH2O
 pH auf 8,2 – 8,4 einstellen
62 mM Sammelgelpuffer; pH 6,8
25% Glycerin (w/v)
5% ß-Mercaptoethanol (v/v, frisch zugeben)
2% SDS (w/v)
0,1% Bromphenolblau (w/v)
 gelöst in dH2O
6.8.9. Ponceau S-Färbung
Die Effizienz des Western-Blots kann vor dem Immunnachweis von spezifischen Proteinen mit einer Ponceau S-Färbung überprüft werden. Diese Färbemethode ist reversibel
und stört die folgenden Analysen nicht.
Die Membran wird eine Minute in Ponceau S-Färbelösung schwenkend inkubiert. Die Lösung wird anschließend recycelt und gegen 10% Essigsäure ausgetauscht. Unter stetigem Schwenken entfärbt die Membran direkt. Wenn sich die Proteinbanden deutlich vom
Hintergrund abheben, kann das Ergebnis fotographisch dokumentiert werden und die
Membran mit mehrfachem Spülen in dH2O rückstandslos entfärbt werden.
Ponceau S-Färbelösung:
0,1% Ponceau S (w/v) in 5% Essigsäure (v/v)
 gelöst in dH2O
6.8.10. Immunologischer Nachweis von Proteinen
(Blake et al., 1984)
In der vorliegenden Dissertation wurden mit dieser Methode GFP- und GST-fusionierte
Proteine detektiert. Die Nachweisreaktion beginnt mit der Inkubation von primären und
sekundären Antikörpern (AK) und wird durch eine abschließende Färbereaktion beendet.
120
Methoden
Alle Inkubationsschritte erfolgen, wenn keine anderen Angaben beschrieben sind, in 30 ml
Lösung bei Raumtemperatur auf dem Wippschüttler (WS5, 18 Bewegungen/min, Edmund
Bühler). Zur Abdeckung von freien, unspezifischen Bindungsstellen wird die Membran vor
der ersten Inkubation in zwei 5-minütigen Intervallen in 1x PBS und dann 30 min in
Blockierlösung gewaschen. Der primäre AK Anti-GFP (Abcam®) wird 1:5.000 und der primäre AK Anti-GST (Carl Roth) wird 1:1000 in Blockierlösung (Endkonzentration jeweils:
0,1 µg/ml) für 1 Stunde oder über Nacht auf der Membran inkubiert. Dem folgen drei 5minütige Waschschritte in 1x PBS und eine mindestens zweistündige Inkubation des
sekundären Antikörpers (Anti Kaninchen IgG, alkalische Phosphatase gekoppelt, SigmaAldrich), der ebenfalls 1:5.000 in Blockierlösung verdünnt wird (Endkonzentration:
0,16 µg/ml). Abschließend folgen zwei Waschschritte in 1x PBS und ein finaler in Carbonatpuffer. Beide Antikörperlösungen können bei -20°C gelagert und bis zu viermal verwendet werden.
Blockierlösung:
5% Milchpulver (w/v)
➢ gelöst in 1x PBS
In der folgenden Färbereaktion setzt die alkalische Phosphatase (AP) die zugefügten
Substrate NBT und BCIP zu einem blauen Indigo-Farbstoff um, wodurch die GFP-markierten Proteinbanden sichtbar werden. Die Inkubation kann von 5 min bis zu einer Stunde variieren und muss ohne Schwenken im Dunkeln erfolgen. Nach Entstehung einer geeigneten Banden-Intensität wird die Reaktion durch Spülen mit dH 2O gestoppt und ein
Nachdunkeln der Signale verhindert.
NBT-Lösung:
BCIP-Lösung:
93,73 mM NBT (75 mg/ml)
 gelöst in 1 ml 70% DMFA
168,1 mM BCIP (50 mg/ml)
 gelöst in 1 ml 100% DMFA
Carbonatpuffer:
NBT/BCIP-Färbelösung:
0,1 M Na2CO3 (10,599 g/l)
 pH mit HCl auf 10,2 einstellen
 gelöst in dH2O
 autoklavieren
112 µl BCIP-Lösung
60 µl NBT-Lösung
 gelöst in 30 ml 0,1 M Carbonatpuffer
 frisch ansetzen
Materialien
121
7. Materialien
7.1. Fliegenstämme
Vorhandene Fliegenstämme
OreR
Wildtypstamm der Population Oregon R.
w1118/Y
Weißäugige Mutante mit einer Mutation im white-Gen.
w1118/Y; CyO/Gla
Fliegenstamm, mit einer Kombination zweier unterschiedlicher BalancerChromosomen für das 2. Chromosom, welches einmal mit der dominanten
Mutation Curly derivative of Oster (CyO) und einmal mit der dominanten
Mutation Glazed (Gla) versehen ist. Jede der Mutationen ist homozygot
letal.
w1118/Y; TM3 Sb/TM3 Ser
Fliegenstamm, mit einer Kombination zweier unterschiedlicher BalancerChromosomen für das 3. Chromosom, welches einmal mit der dominanten
Mutation Stubble (Sb) und einmal mit der dominanten Mutation Serrate
(Ser) versehen ist. Jede der Mutationen ist homozygot letal.
FM6/Y
Fliegenstamm mit einem dominanten Markergen (Bar) und Balancer-Chromosom für das X-Chromosom (white, yellow).
exu(DP3) cn bw/SM1 CyO
Röntgenstrahlen-induzierte Mutation für Exuperantia (exu(DP3)), die dem
Balancer-Chromosom, second multiple 1 (SM1) versehen ist, dessen do
minanter Marker Curly derivative of Oster (CyO) ist. Die zwei Mutationen
cinaba (cn) und brown (bw) führen bei einer Doppelmutation (cn bw/cn
bw) zu weißäugigen Fliegen, da diese Mutationen den Einbau beider Au
genpigmente verhindert (Wang und Hazelrigg, 1994).
Orb2JO10/Sb
Remobilisierungslinie (P{Orb2}), die mit dem Balancer-Chromosom Stubble (Sb) kombiniert ist (Starck, 2007).
PDI::GFP/Sb
Transgene Linie 74.1 (P{PTT-GA}PDIGFP), bei der das PDI-Intron durch
gene tracking intern das GFP trägt. Das Fusionskonstrukt ist mit der dominanten Balancer-Mutation Stubble (Sb) für das 3. Chromosom kombiniert
(Bobinnec et al., 2003).
4244-14.2/Sb
CG3213-eGFP-Fusionslinie (w1118/Y; P{w+,CG3213-eGFP}) mit einer Integration auf Chromosom 3, sodass sie mit einem Balancer-Chromosom mit
der dominanten Mutation Stubble (Sb) kombiniert ist (Stinski, 2011).
361-14.2/Sb
CG12470-eGFP-Fusionslinie (w1118/Y; P{w+, CG12470-eGFP}) mit einer Integration auf Chromosom 3, sodass sie mit einem Balancer-Chromosom
mit der dominanten Mutation Stubble (Sb) kombiniert ist (Stinski, 2011).
CG1898-15.1/CyO
CG1898-eGFP-Fusionslinie (w1118/Y; P{w+, CG1898-eGFP}) mit einer Integration auf Chromosom 2, sodass sie mit einem Balancer-Chromosom mit
der dominanten Mutation Curly derivate of Oster (CyO) kombiniert ist
(Stinski, 2011).
919-28.1/Sb
Orb2-eGFP-Fusionslinie (w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP 3,7}), bei der das kleine Orb2-Konstrukt (3,7 kb) auf dem 3. Chromosom integriert ist, welches
mit dem Balancer-Chromosom mit der dominanten Mutation Stubble (Sb)
kombiniert ist (Starck, 2007).
592-26.1/CyO
Orb2-eGFP-Fusionslinie (w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP 4,5}), bei der das große Orb2-Konstrukt (4,5 kb) auf Chromosom 2 integriert ist, welches mit
dem Balancer-Chromosom mit der dominanten Mutation Curly derivative
of Oster (CyO) kombiniert ist (Starck, 2007).
122
Materialien
592-18.1/Sb
Identisches Konstrukt (w1118/Y; P{w+, Orb2-eGFP 4,5}), aber auf dem 3.
Chromosom integriert, welches dadurch mit dem Balancer-Chromosom
mit der dominanten Mutation Stubble (Sb) kombiniert ist (Starck, 2007).
1458-10.3
Tob-antisense-Linie (w1118/Y; P{w+, Tob-antisense}), welche bereits heterozygot zu sterilen Männchen führt (Starck, 2007).
Etablierte Integrationsstämme
625-27.3/CyO
625-27.5/CyO
CG3213-mCherry-Fusionslinie (w1118/Y; P{w+, CG3213-mCherry}) mit einer
Integration auf dem 2. Chromosom, welches mit dem Balancer-Chromosom mit der dominanten Mutation Curly derivate of Oster (CyO) kombiniert
ist.
625-13.7/Sb
625-32.2/Sb
Identisches Konstrukt, aber auf dem 3. Chromosom integriert, sodass es
mit dem Balancer-Chromosom mit der dominanten Mutation Stubble (Sb)
kombiniert ist.
1402-2.9/CyO
Tob-mCherry-Fusionslinie (w1118/Y; P{w+, Tob-mCherry}), mit einer Integration auf dem 2. Chromosom, welches mit dem Balancer-Chromosom mit
der dominanten Mutation Curly derivative of Oster (CyO) kombiniert ist.
7.2. Online Datenbanken und PC-Software
Online Datenbanken
ClustalW 2.0:
Alignmentprogramm für DNA- und Proteinsequenzen
(EMBL-EBI, 2015)
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
DroID
Vorhersagen für Proteinwechselwirkungen
(Yu et al., 2008; Murali et al., 2011)
http://www.droidb.org/
Double Digest Calculator:
Ermittelt geeignete Reaktionspuffer für Doppeldau-Reaktionen
(New England Biolabs®)
https://www.neb.com/sitecore/content/nebsg/home/tools-and-resources/interactive-tools/double-digest-finder
ExPASy:
Bioinformatisches Ressourcenportal (Gasteiger et al., 2003)
http://web.expasy.org/translate/
FlyBase:
Drosophilidae-Datenbank, Version FB2015_04
(dos Santos et al., 2015)
http://flybase.org/
InterologFinder:
Vorhersagen für Proteinwechselwirkungen (Wiles et al., 2010)
http://www.interologfinder.org/simpleIfWS
MitoFates
Vorhersagen von Mitochondirenlokalisationssequenzen
(Fukasawa et al., 2015)
http://mitf.cbrc.jp/MitoFates/cgi-bin/top.cgi
NLS Mapper
Vorhersagen von Kernlokalisationssequenzen
(Kosugi et al., 2009)
http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi
OligoCalc:
Berechnet Annealingtemperaturen von Oligonukleotiden
(Kibbe, 2007)
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
Primer 3:
Definiert Primer für qPCRs (Rozen und Skaletsky, 2000)
http://primer3plus.com/web_3.0.0/primer3web_input.htm
Protein extinction coefficient calculator:
Extinktionskoeffizientenrechner
(Untergrasser et al., 2012; Koressaar, 2007)
http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm
Materialien
123
PubMed:
Literaturdatenbank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Reverse Complement:
Konvertiert DNA-Sequenzen (Stothard, 2000)
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
Webcutter 2.0:
Vorhersagen für Restriktionsschnittstellen (Heimann, 1997)
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2
PC-Software
Analysis Soft Imaging System (Olympus)
Chromas Lite MFC Application (Informer technologies, Inc.)
Excel 2007 (Microsoft)
ImageJ (Schindelin et al., 2012)
Leica Confocal Software (LCS)
NanoDrop V3.7 (NanoDrop thechnologies, Inc.)
OpenOffice 3.4.1 (Apache)
Photoshop 5.0 Limited Edition (Adobe)
Realplex (Eppendorf)
7.3. Oligonukleotide
Tabelle 3: Oligonukleotide, die für qPCR-Reaktionen, Klonierungen und Sequenzierungen verwendet
wurden.
In der folgenden Tabelle sind alle Primer aufgelistet, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendet wurden und/oder in früheren Veröffentlichungen zur Herstellung von verwendeten Konstrukten benötigt wurden.
Die Primernummern (#), soweit vorhanden, repräsentieren die zugewiesene Primer-Stocknummer der Abteilung Zoologie/Entwicklungsbiologie der Universität Kassel. Die fett hervorgehobenen Buchstaben markieren
die Erkennungssequenz der Restriktionsschnittstellen. Die Schnittpositionen der Endonukleasen sind durch ↓
gekennzeichnet.
Nr
Name
Sequenz (5' → 3')
TM
#447 T3 Promotor
ATTAACCCTCACTAA AG
38,74°C
#334 T7 Promotor
TAATACGACTCACTATAGGG
46,43°C
#434 Sp6 Promotor
CTATTTAGGTGACACTATAG
43,23°C
rpL9-1
GGTGAAGGCCCGTGTGGTGAC
56,90°C
rpL9-2
CGTGGACTGCTGGATGAGGG
56,76°C
#404 rpL9 qPCR for
GTACAAGATGCGTGCTGTGT
58,85°C
#405 rpL9 qPCR rev
TCCACACGACGGATGTACTT
58,75°C
CP-ORF1 (Orb2 Exp. for)
AAGAGCT↓CATGGACTCGCTCAAGTTACC
CP-ORF4 (Orb2 Exp. rev)
GGTCCCCTTTCGCTGGTGT
Sac I
51,77°C
53,99°C
#501 Tob-RA 5'UTR qPCR for
AAAT↓CTAGAGACATCCGAGCACATATACCC
Xba I
52,23°C
#502 Tob-RA 5'UTR qPCR rev
TTTGAGCT↓CCGGTGCAGTTTGCTGATG
Sac I
51,85°C
#503 Tob-RE 5'UTR qPCR for
AAAT↓CTAGAGAAAGAAGGCTGCAAAGC
Xba I
49,61°C
#504 Tob-RE 5'UTR qPCR rev
TTTGAGCT↓CCACGTTATATTGTGCATTCG
Sac I
48,91°C
#508 Tob-RA Promotor for
AAAAGATC↓TTGTCTTTGTATAACATTGGTTCC
Bgl II
49,10°C
#509 Tob-RA Promotor rev
AAAA↓CTAGTATGCTATTGTTTTACTTTTGCG
Spe I
50,37°C
#510 Tob-RA ORF for
AAAG↓CTAGCTGGTACAACTGGGGTATTTTATAC
Nhe I
50,14°C
#511 Tob-RA ORF rev
TTCCGG↓CCGTTGGCAACCAATAGTTGCTG
Sac II
52,42°C
#264 CG3213 sense
AAA↓GATCTCTGGGACTACAGTGGTTCC
Bgl II
49,76°C
124
Materialien
#256 CG3213 antisense
A↓CCGGTGGGCATTGACGGGGAAGCA
Age I
55,21°C
#542 CG3213 Expression for
AAAAAG↓AATTCATGGCGAAGAACACAGAGT
Eco RI
49,70°C
#543 CG3213 Expression rev
AAAAAC↓TCGAGGCACTTGACGGGGAAGCA
Xho I
52,60°C
#544 CG3213 qPCR for
CAAACGAATCGAACAGCAGA
56,77°C
#545 CG3213 qPCR rev
GACCACCACCAGTTTCGTCT
59,89°C
Exuperantia Expression for
AAACCGC↓GGATGGTTGCCGATAACATCGATGC
Sst II
56,77°C
Exuperantia Expression rev
TTTA↓CTAGTTTAGTTGGAGGCCGTGATGGCCA
Spe I
59,52°C
#260 CG12470 for
A↓GATCTGATGTCGACGTTATACGGC
Bgl II
50,63°C
#261 CG12470 rev
A↓CCGGTGGAGCGAATCGCATGCATTTTG
Age I
57,71°C
#262 CG1898 for
A↓GATCTGAGCTCCTTGTTTGGCACAC
Bgl II
53,16°C
#263 CG1898 rev
A↓CCGGTGGGCGGATCTTGGTGACCATTC
Age I
56,46°C
#465 Mst87F for
AAAGAGCT↓CATTATTATTTGTCCTTTCGG
Sac I
44,17°C
#466 Mst87F rev
AAAC↓TCGAGACGACAAATTTTGATGTG
Xho I
44,75°C
#467 Mst98Ca for
AAAGAGCT↓CATTCAGTTTCCTGTTTCGC
Sac I
48,26°C
#468 Mst98Ca rev
AAAT↓CTAGACTGTTCAATTTGGAAGTTATT
Xba I
46,76°C
#37
Protamin A for
AAA↓CTAGTGTCTTATTTTTATGCTCTTCTTA
Spe I
55,04°C
#38
Protamin A rev
AAAT↓CGATCGTAGAAAATTTTTACAAACTCT
Cla I
55,68°C
#39
Protamin B for
AAA↓CTAGTCTTATTTTTATGATCTTCTTAAAAA
Spe I
53,12°C
#40
Protamin B rev
AAAT↓CGATCGTAGAAAATTTTTACAAACTCC
Cla I
55,83°C
#427 CG3727 Promotor for
AAAC↓TCGAGTTCGACTAGAGTATACTTTAAGTTA
Xho I
50,33°C
#428 CG3727 Promotor rev
TTTAGG↓TTCCGATTGACCACGACCAGG
Aat I
51,56°C
#429 CG3727 ORF for
TTTAGG↓CCTCTATCGCCTTCCGCACAT
Aat I
52,51°C
#442 CG3727 ORF II
ATCGTGAAGATGCTTCACTTAC
52,21°C
#443 CG3727 ORF III
GACAATTTCTCCGCGCTA AC
52,76°C
#444 CG3727 ORF IV
TCGGCTATGACATTGACTTTG
51,88°C
#445 CG3727 ORF V
ACACATAACCAA ACCATCAAAGAC
51,57°C
#446 CG3727 ORF VI
GCA AGA ACGAGCGCTAC
51,38°C
#430 CG3727 ORF rev
TTTA↓CCGGTGCCGTGCCATTGGCCTTCG
Age I
53,15°C
#431 CG3727 3'UTR for
AAAG↓CTAGCGCAGGTCCAGGACTGGA
Nhe I
50,13°C
#432 CG3727 3'UTR rev
AAAG↓CTAGCTATGTGCACATGTACGGTATGT
Nhe I
51,57°C
#433 CG3727 3'UTR-lang rev
TTTG↓CTAGCTCTAACCAGAAGCATCTCCA
Nhe I
50,89°C
#410 CG34404 Promotor for
ACAG↓AATTCTGACCCACCCTTACAGACCTCG
Eco RI
55,03°C
#441 CG34404 Promotor II for
TGCATGAACGTGTGAAGATCC
#392 CG34404 Promotor rev
AAAGAT↓ATCGAGTGTGTGAGAGTGTGTTTATGC
Eco RV 54,63°C
#393 CG34404 ORF for
AAAGAT↓ATCTTATTTCTGGGTATACATTTTCTGATAAGA
Eco RV 54,42°C
#435 CG34404 ORF II for
AGATGCGTGTGGAAGGCT
52,74°C
#436 CG34404 ORF III for
TCCAGTCCGAGATTTCCACC
52,56°C
#411 CG34404 ORF rev
ACAA↓CCGGTGCCAGAGTAGTCTCAGGAACATGGTTA
Age I
55,05°C
#395 CG34404 3’UTR for
TTTT↓CTAGAGAAACGCATGACGACCTTCCA
Xba I
55,12°C
#396 CG34404 3’UTR rev
AAAT↓CTAGAGTGAATTTTATCGAGTTTTAGTAGACG
Xba I
54,20°C
#403 CG34404 3' qPCR rev
AAATGCCATGCGACTTAATTGCA
53,11°C
58,83°C
Materialien
125
7.4. Geräte
Analysewaage CP64
Sartorius
Brutschrank
Memmert
Dosisleistungsmonitor LB 123 D-H10
Berthold Technologies
Drehrad
Schütt biotech
Dual-Timer Oregon Scientific TR118 Jumbo Display
Carl Roth
Einhängethermostad U3
Julabo
Elektroporator Easyject Optima
Peqlab
Elektrophoresekammer horizontal Maxi
Peqlab
Elektrophoresekammer horizontal Mini
Peqlab
Elektrophoresesystem Mini Protean 3 vertikal
Biorad
Elektrophoresesystem vertical slab gel unit SE-600
Hoefer Inc
Fastblot
Biometra
®
TM
B33/B34
Flüssigszintillationszählers Hidex 300 SL
Lablogic
Homogenisator Sonoplus HD 2070
Eppendorf
Hybridisierungsofen OV2 mit Rotisserie
Biometra
Kapillarenschleifgerät 462
Bachofer
Kaltlichtquelle KL 1500 LCD
Schott
Kontaminationsmonitor LB 124 B (Xenon) für ß-γ-Messung
Berthold Technologies
Kühleinheit (Wasserbad Haake K15, Zirkulationsbad Haake DC1)
Schütt biotech
Kühlzelle LW 600 DIN
Viessmann
Magnetrührer MR 3001 und 3002
Heidolph
Microinjektor 5246 FemtoJet
Eppendorf
Minizentrifuge PicoFuge
TM
®
HF-120
Mikropipettenzieher Pul-1
Stratagene®
WPI, Sarasota (FL)
Mikroskope:
Axiophot Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop
Zeiss
Binokulares Mikroskop S6 E
Leica
Binokulares Mikroskop Stemi 2000
Zeiss
konfokales Mikroskop CLSM TCS SP2
Leica
Mikroskop Axio Lab.A1
Zeiss
OptiGrid structured light illumination
Zeiss
®
Mikrowelle KOR6105
Daewoo
Nanodrop 1000
Thermo Scientific
Photometer UV 160A
Shimadzu
Pipettierhilfe accu-jet pro Brand
VWR®
Powersupply Phero stab 500
Biotec Fischer
Powersupply PowerPacTM Basic
Biorad
Schüttelgerät Reax top
Heidolph
Standautoklav Systec V-150
Eppendorf
Standgefrierschrank GSS 3126 Premium (-20°C)
Liebherr
Standkühlschrank GSS 3126 Premium frost-free (4 - 7°C)
Liebherr
Sterilbank Holten Laminair HV Mini PCR
Thermo Scientific
®
Thermocycler:
Mastercycler® ep realplex
Eppendorf
126
Materialien
TPersonal
Biometra
Thermocycler Personal Cycler
Biometra
Thermocycler Personal Gradienten-PCR
Biometra
Thermoshake
Gerhardt
Tiefkühlschrank Herafreeze (-80°C)
Thermo Scientific
Umlaufschüttelmaschine Incudriver R
Schütt biotec
UV Crosslinker Stratalinker 2400
Stratagene®
UV Transilluminator N-90 M
Intas
Waage PB300
Mettler
Wärmeschrank
Memmert
Wasserbad 6A
Julabo
Wasserbad 1008
GFL®
Wasserstrahlpumpe
Carl Roth
Wippschüttler WS5
Edmund Bühler
Thermodrucker P-91 DW
Intas
Thermomixer 5436
Eppendorf
TV Zoom Lens S6X11
Rainbow/Hama
UV-Filter Sets 02, 09, 15
Zeiss
®
Zentrifugen:
5417R (4°C)
Eppendorf
5418R (4°C)
Eppendorf
Biofuge 13-R (4°C)
Heraeus
EBA 12 (RT)
Hettich
Sorvall
TM
Lynx
TM
6000, Rotor: F-20 (4°C)
Thermo Scientific
7.5. Verbrauchsmaterialien
Papierwaren
Chromatographiepapier (3 mm) WhatmanTM
Sigma-Aldrich
Faltenfilter 615 (Ø 210 mm)
Macherey Nagel
Glasmikrofaserfilter, Porengröße: 0,7 µm, Ø 47 mm
VWR®
Labortücher Labsolute®
Th. Geyer
Nitrozellulosemembran Whatman
Nylonmembran Hybond -N
TM
Steril-Indikatorband Indair
TM
Protran BA83 (Porengröße: 0,2 µm)
®
+
TM
Sigma-Aldrich
GE Healthcare (GB)
Carl Roth
Tape-Markierband Roti (verschiedene Farben)
Carl Roth
Thermodruckpapier K65-HM
Intas
®
Glaswaren
Bechergläser (20 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l) Schott
Carl Roth
Blockschälchen schwarz (40 x 40 mm)
MBM
Corex-Zentrifugenröhrchen (15 ml, 50 ml)
Sartorius
Deckgläschen (22 x 22 mm)
Carl Roth
Drigalskispatel
Glaswerkstatt, Uni Kassel
Dounce Homogenisator
Thermo Scientific
Materialien
127
Erlenmeyerkolben (10 ml, 20 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml, 2 l) Schott
Carl Roth
Glasflaschen (50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml, 1 l) Schott
Carl Roth
Glaskapillare aus Sodaklarglas, Ø 1 mm
Hilgenberg
Glaspipetten (2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)
Hirschmann®
Glasplatten Mini Protean®3
Biorad
Glasplatten 18 x 16 cm für Hoefer SE-600
Hoefer Inc
Hybridisierungsflaschen
Biometra
Objektträger Labsolute (76 x 26 mm)
Th. Geyer
Reagenzgläser
Carl Roth
®
®
Spacerplatten Mini Protean 3
Biorad
®
Vakuumeinheit zum Entgasen:
Glasbasis für 47 mm Vacuumfilter Millipore® XX1004733
Capitol Sciientific
Glastrichter Millipore XX1004704 (300 ml)
Capitol Sciientific
Aluminiumklemmfeder Millipore XX1004703
Capitol Sciientific
®
®
Plastikwaren
Drosophila-Zuchtgefäße:
Flaschen (102 mm x Ø 48 mm)
Greiner Bio-One
Röhrchen (82 mm x Ø 36 mm)
Greiner Bio-One
Einmal-Kanülen Neolus 0,9 x 40 mm
Terumo®
Einmal-Spritzen Norm-Ject® (1 ml, 5 ml, 20 ml)
Eppendorf
Einmal-Wiegeschälchen Rotilabo (41 x41 mm, 89 x 89 mm)
Carl Roth
Einweg-Pasteurpipetten graduiert (3,2 ml)
Carl Roth
Frischhaltefolie
Edeka
Küvetten (10 x 12 x 45 mm; Schichtdicke x Breite x Höhe)
Sarstedt
Messzylinder (25 ml, 100 ml, 500 ml, 1 l) Rotilabo®
Carl Roth
®
Mikropistill
Eppendorf
Mikrotiterplatte für qPCR-Reaktionen (Framestar 96 )
®
4titude®, Wotton, Surrey (UK)
Petrischalen:
groß (120 x 20 mm)
Sarstedt
klein (92 x 16 mm)
Sarstedt
quadratisch (120 x 120 x 19 mm)
Sarstedt
Pipettenspitzen Typ G (10 µl)
Biozym
Pipettenspitzen (100 µl, 1000 µl)
Sarstedt
Pipettenspitzen Microloader (20 µl)
Eppendorf
Pulvertrichter
Carl Roth
Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml)
Eppendorf
Schlauchfolie (300 mm breit)
Th. Geyer
Schutzfolie für qPCR-Mikrotiterplatten (qPCR adhesive clear seal)
4titude®, Wotton, Surrey (UK)
Szintillationsmessflaschen (20 ml)
Carl Roth
Spritzenfilter PVDF steril (Porengröße 0,22 µm)
Carl Roth
Zentrifugenröhrchen (25 ml)
Sarstedt
®
Sonstiges
Caeprenstopfen
Greiner Bio-One
Elektroporationsküvetten
Eurogentec
128
Materialien
Magnetrührstäbchen
VWR®
Multipipette® Plus
Eppendorf
Nitrilhandschuhe Xceed® Microlfex®
Sigma-Aldrich
Konzentrator für magnetische Partikel Dynal MPC -E
Thermo Scientific
Parafilm M
Carl Roth
®
®
Präpariernadeln
Präzisionspinzette Dumont
Carl Roth
®
Carl Roth
Pinzetten aus Federstahl
Carl Roth
Rasierklingen
Wilkinson
Röntgenkassette Typ G/GR-Kassette
Rego
Röntgenfilme, blauempfindlich, 18 x 24 cm
Röntgen-Wetzel
7.6. Chemikalien
Acrylamidlösung 30% + 0,8% Bisacrylamid (37,5:1)
Carl Roth
Acrylamid Pulver > 99%
Sigma-Aldrich
Agarose, LE
Biozym
Agar-Agar, Kobe I
Carl Roth
Ammoniumacetat > 97%
Carl Roth
Ammoniumpersulfat (APS) > 98%
Carl Roth
Ampicillin (amp)/Penicillin G Potassium Salz > 98%
Sigma-Aldrich
Aktivkohle
Carl Roth
Apfelsaft (Milder Apfel) 100%
Edeka
Bierhefe
Bäko Weser-Ems
BisBenzimid H (Hoechst 33258) > 98%
Sigma-Aldrich
Borsäure > 99,8%
Carl Roth
5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP)
BioTech, W-Deutschland
Bromphenolblau
Merck
Calciumchlorid (CaCl) > 99,5%
Merck
Chloroform > 99%
Carl Roth
Coomassie Brillant Blue R250
Sigma-Aldrich
Dichlordimethylsilan (DCDMS) > 99%
Fluka
Diethylpyroarbonat (DEPC) > 97%
Carl Roth
Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) > 99%
Merck
Dimethylformamid (DFMA) > 99,8%
Merck
Dimethylsulfoxid (DMSO) > 99,9%
Thermo Scientific
Dithiothreitol (DTT) > 99,5%
AppliChem
Dynabeads oligo(dT)-Partikel
Novagen®
Entwicklerlösung
Röntgen-Wetzel
Essigsäure (HAc) > 100%
Carl Roth
Ethanol (EtOH), vergällt
Carl Roth
Ethanol (EtOH), absolut > 99,5%
Carl Roth
Ethidiumbromid > 98%
Carl Roth
Ethylendiamintetraessigsäure (Na2EDTA) > 99%
Carl Roth
Ficoll Type 400
Sigma-Aldrich
Fixierlösung
Röntgen-Wetzel
®
Materialien
129
Formaldehyd 37%
Carl Roth
Formamid, deionisiert > 99,5%
Carl Roth
Glucose (α-D(+)) > 99%
Carl Roth
Glycerin > 98%
Carl Roth
Glycin > 99%
Carl Roth
Harnstoff > 99,5%
Carl Roth
Hefeextrakt
Carl Roth
HEPES > 99,5%
AppliChem
Imidazol > 99%
Carl Roth
Immersionsöl 518
Zeiss
Isopropanol/2-Propanol AnalaR > 99,9%
VWR®
Isopropyl-ß-D-thiogalactosid (IPTG) > 99%
AppliChem
Kaliumacetat (KAc) > 99%
Carl Roth
Kaliumchlorid (KCl) > 99,5%
Carl Roth
Kaliumhydroxid (KOH), Plätzchen > 85%
AppliChem
Kanamycin (kan) Monosulfat > 98,5%
Affymetrix, Santa Clara (CA)
Klorixlösung 100%
DanKlorix
Leupeptin > 96,5%
AppliChem
Lithiumchlorid (LiCl) > 99%
Sigma-Aldrich
Lithiumdodecylsulfat (LiDS) > 99%
ICN Biomedicals
Lysozym from chicken egg white > 100.000 u/mg
Serva
Magnesiumchlorid (MgCl2) > 99%
Carl Roth
Magnesiumchloridlösung (MgCl2) 25 mM
Thermo Scientific
Maismehl
Bäko Weser-Ems
Malzextrakt
Bäko Weser-Ems
ß-Mercaptoethanol > 98%
Sigma-Aldrich
Methanol > 99,9%
Carl Roth
N,N'-Methylen-Bis-Acrylamid > 98%
Carl Roth
Milchpulver
Carl Roth
®
MitoTracker Red CMX Ros
Cell singaling (über NEB)
3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) > 99%
Carl Roth
Natriumacetat (NaAc) > 99,5%
Carl Roth
Natriumazid (Na-Azid) > 99,5%
Sigma-Aldrich
Natriumcarbonat > 99,5%
Carl Roth
Natriumchlorid (NaCl) > 99,5%
Carl Roth
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) > 98%
Carl Roth
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) > 99,5%
Carl Roth
Natriumhydroxid (NaOH) Plätzchen > 98%
Sigma-Aldrich
n-Heptan > 99%
Carl Roth
Nipagin (Methyl-p-Hydroxybenzoat)
Macherey Nagel
Nitroblau Tetrazoliumchlorid (NBT)
Boehringer
Nonident P-40 (NP 40)
Fluka
®
®
Nukleotide:
Desoxiribonukleotide (dNTPs) > 98%
Carl Roth
Ribonukleotide (NTPs) > 98%
Carl Roth
130
Materialien
[α-32P] UTP SRP-210 (110 Tbq/mmol, 10 µCi/µl)
Hartmann Analytic
Öl 3S Voltalef (elf atochem)
VWR®
Öl 10S Voltalef® (elf atochem)
VWR®
Pepstatin > 90%
Sigma-Aldrich
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate
Sigma-Aldrich
Phenol Roti
Carl Roth
®
®
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) > 98%
Sigma-Aldrich
poly d(T)12-18 -Primer
Carl Roth
Polyethylenglycol (PEG) 4.000 > 50%
Thermo Scientific
Polyvinylpyrrolidon (PVP)
Sigma-Aldrich
Ponceau S (C.I. 27195)
Carl Roth
Propionsäure > 99,5%
Carl Roth
Proteaseinhibitor Cocktail P8849
Sigma-Aldrich
Puffer Kalibrierlösung (pH-Werte: 6,86; 4,01; 9,18)
Th. Geyer
RNase A (90 U/mg)
Carl Roth
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µl)
Thermo Scientific
Rinderserumalbumin (BSA) > 99,5%
Sigma-Aldrich
Rubidiumchlorid (RbCl) > 99,5%
Carl Roth
Saccharose (α-D(+)) > 99,5%
Carl Roth
Salzsäure (HCl), rauchend > 37%
Carl Roth
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine) > 97%
Sigma-Aldrich
Sodium dodecyl sulfate (SDS) > 99,5%
Carl Roth
Sojamehl
Bäko Weser-Ems
Spermidin > 98%
Carl Roth
Stickstoff, flüssig > 99,5%
Messer Griesheim
Streptavidin, immobilisiert an Agarose CL-4B
Fluka
TEMED > 99%
Carl Roth
Tetracycline
Serva
Tris > 99,9%
Carl Roth
tRNA aus S.cerevisiae
Sigma-Aldrich
®
Triton X-100
Sigma-Aldrich
Trizol
®
Ambion
Trockenhefe Fermipan
Backmittel-Zusatzstoffe.de
Trypton/Pepton aus Casein
Carl Roth
Tween® 20
Sigma-Aldrich
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid)
Carl Roth
Xylencyanol FF
Fluka
Zuckerrübensirup
Bäko Weser-Ems
7.7. Kitsysteme
DyNamo cDNA Synthese Kit for qRT-PCR (F-470S)
Thermo Scientific
MagneGST
Promega
MagneHIS
TM
TM
Protein Purfication System (V8600)
Protein Purfication System (V8500)
Promega
NucleoSpin® Plasmid Kit
Macherey-Nagel
NucleoBond® Xtra Midi
Macherey-Nagel
Materialien
131
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
Macherey-Nagel
Plasmid-Midi Kit (25) (12143)
Qiagen®
SensiFASTTM SYBR NO-ROX One-Step Kit (BIO-72001)
Bioline
7.8. Enzyme und Enzympuffer
Enzyme
alkaline Phosphatase (FastAPTM, 1 u/µl)
Thermo Scientific
Klenow-Fragment (10 u/µl)
Thermo Scientific
pfu-DNA-Polymerase (2,5 U/µl)
Thermo Scientific
Phusion-DNA-Polymerase (2 U/µl)
RNase H, thermostabile Hybridase
Thermo Scientific
TM
(5 U/µl)
Epicentre®
Restriktionsenzyme (10 u/µl)
Thermo Scientific
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µl)
Thermo Scientific
RQ1 DNase (1 U/µl)
Thermo Scientific
Sp6 RNA-Polymerase (20 U/µl)
Thermo Scientific
T3 RNA-Polymerase (20 U/µl)
Thermo Scientific
T4 DNA-Ligase (5 Weiss U/µl)
Thermo Scientific
T7 RNA-Polymerase (20 U/µl)
Thermo Scientific
Taq-DNA-Polymerase (1 U/µl)
Thermo Scientific
Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)
Thermo Scientific
Enzympuffer
Puffer B + BSA (10x)
Thermo Scientific
Puffer Eco 521 (10x)
Thermo Scientific
Puffer EcoR I (10x)
Thermo Scientific
Puffer G + BSA (10x)
Thermo Scientific
Puffer O + BSA (10x)
Thermo Scientific
Puffer R + BSA (10x)
Thermo Scientific
Puffer Tango + BSA (10x)
Thermo Scientific
DNase Puffer (für RQ1 DNase) + MgCl2 (10x)
Thermo Scientific
Fast AP
Thermo Scientific
TM
Puffer (10x)
Klenow-Fragment Reaction Puffer (10x)
Thermo Scientific
Pfu-Puffer (10x)
Thermo Scientific
Phusion GC Reaktion Puffer (5x)
Finnzymes
Taq-Puffer + KCl (10x)
Thermo Scientific
T4 DNA-Ligase-Puffer (10x)
Thermo Scientific
Transkriptionspuffer (5x)
Thermo Scientific
7.9. Antikörper
Anti-GFP ab6556 (aus Kaninchen, polyklonal zu GFP; 0,5 mg/ml)
Abcam®
Anti-Rabbit IgG A8025 (aus Ziege, AP-gekoppelt; 0,8 mg/ml)
Sigma-Aldrich
132
Materialien
7.10. Molekulargewichtstandards
GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder
Thermo Scientific
GeneRuler 100 bp DNA Ladder
Thermo Scientific
λ DNA/HindIII Ladder
Thermo Scientific
RiboRuler
Thermo Scientific
TM
TM
High Range RNA Ladder
peqGOLD Protein-Marker IV, Prestained
Peqlab
7.11. Kompetente E.coli-Bakterienstämme
NovaBlue GigaSinglesTM
Novagen®
BL21(DE3)
Novagen®
7.12. Plasmid-Vektoren
pGEM®-T
3.000 bp
Promega
pBlueSkript II KS +/+
2.961 bp
Stratagene
pBlueSkript II SK +/+
2.961 bp
Stratagene
p{UAST}green
9.671 bp
Renner, 2001
p{UAST}mCherry
9.662 bp
Schäfer, 2008
pUChsΔ2-3 (Turbo)
7.500 bp
University of California,
Berkeley
pET-21a(+)
5.443 bp
Novagen®
pET-41a(+)
5.933 bp
Novagen®
Anhang
133
8. Anhang
8.1. Analyse der Kandidaten CG3440 und CG3727
Basierend auf einem Vergleich mit der genomweiten Datenbank InterologFinder wurden
die Gene CG34404 und CG3727 als hypothetische Interaktionspartner mit trans-Faktoren
des mst87F-RNP-Komplexes identifiziert (persönliche Mitteilung, F. Kappelt). Für beide
neuen Kandidaten wird eine Bindung an CG12470 vorhergesagt und für CG3727 ist eine
weitere Interaktion mit dFMR1 postuliert. Sowohl für CG34404 als auch für CG3727 sollen
das RNA-Expressionsmuster und das Proteinmuster in der Spermatogenese ermittelt werden.
8.1.1. RNA- und Protein-Expressionsanalysen des Gens CG3727
Das Gen CG3727 (Dock) wird auf dem L-Arm des zweiten Chromosoms von den beiden
Genen CG3862 und Drongo flankiert. Die Verifizierung des Gens basiert auf 66 cDNAKlonen, in denen vier unterschiedliche Transkripte (3.735 nt, 3.618 nt, 3.583 nt, 2.825 nt)
gefunden wurden, welche jeweils ein spezifisches Protein liefern. Bezüglich der Proteinfunktionen sind bisher nur Bindefunktionen beschrieben. Beispielsweise konnte durch das
yeast two-hybrid system eine Interaktion mit Tyrosin-phosphorylierten Proteinen dokumentiert werden, die durch eine SH2 (Src homology 2)-Domäne und drei SH3-Domänen
in der Dock-Sequenz vermittelt wird (Clemens et al., 1996). Die Abwesenheit dieses Proteins verursacht in Drosophila-Axonen den Phänotyp dreadlock, welcher namensgebend
für Dock ist. Aufgrund dieser Mutante konnte dem Protein eine Funktion in der axonalen
Leitung zugeordnet werden (Garrity et al., 1996). Von den verwendeten cDNAs (s.o.)
stammen drei aus dem Hodengewebe (FlyBase), wodurch eine Expression in der männlichen Keimbahn wahrscheinlich ist.
Zur Analyse der RNA-Expression wurde ein Northern-Filter (KP 2 in 8-2, B) hergestellt,
welcher mRNA-Proben (8-2, A) aus Embryonen und sowohl ♀ als auch ♂ Köpfe, Karkassen und Gonaden enthält (Pudelko, 2013). Die Hybridisierung erfolgte mit der radioaktiven
Sonde CG3727* (Abb. 8-1; Pudelko, 2013).
Abbildung 8-1: Schematische Darstelllung der Sonde CG3727 (KP 9).
T7
CG3727
MCS
Nhe I
Not I
#432
#432
200
400
Die 3'UTR-Sequenz von CG3727 wurde mit
dem Primer-Paar #432/#431 amplifiziert
und in den pGEM®-T-Vektor einkloniert
(Klon KP 9; Pudelko, 2013). Die Verifizierung erfolgte durch eine Sequenzierung
(siehe 8.2.) mit dem T7 Primer (#334).
Nach Linearisierung mit der Endonuklease
Not I und Transkription mit T7-RNA-Polymerase entsteht ein sense-Volllängentranskript von 493 nt (MCS: 50 nt, 3'UTR
CG3727: 433 nt).
134
Anhang
T7: Promotor (weiß). MCS: Multiple cloning site (schwarz). CG3737:3'UTR (rot). Maßstabsbalken: Länge
des Konstruktes in Nukleotiden (nt). Die Primer sind in Lage und Orientierung durch schwarze Pfeile
dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern (#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice
3.4.1.
Als Referenz wurde der Filter (8-2, B) auch mit der Sonde rpL9* hybridisiert. Die
CG3727*-Sonde zeigt zwei deutliche Signale in den Embryo- und Ovarien-Spuren auf der
Höhe von 3,4 und 2,8 kb. Im direkten Vergleich ist in der ♀ Gonaden-Spur auffällig, dass
die kürzere Bande ein stärkeres Signal liefert. Das längere Transkript bei 3,4 kb Länge
wird zusätzlich zu den Embryonen und Ovarien auch in den Köpfen beider Geschlechter
detektiert, jedoch in einer viel geringeren Intensität. In den Karkassen wurde als einzige
Gewebsprobe überhaupt kein CG3727-Transkript erkannt und in den Hoden wurden lediglich zwei schwächere Signale bei 1,8 und 1,4 kb Länge detektiert, welche nicht mit den
in FlyBase angegebenen Daten (3.735 nt, 3.618 nt, 3.583 nt, 2.825 nt) übereinstimmen.
en en
n n
n
ss ass
ne ade ade fe fe
a
o
y n
n
p
p
rk rk
br Go Go Kö Kö Ka Ka
m
E ♂ ♀ ♂
♀ ♂ ♀
B
M
ar
ke
r
A
kb
64321,5 1-
kb
en en
n
n
n
ss ass
ne ade ade fe fe
a
o
y
n
n
p
rk rk
p
br Go Go Kö Kö Ka Ka
m
♀ ♂ ♀
♂ ♀ ♂
E
CG3727*
3,4 2,8 1,8 1,4 7 d, -80°C
0,5 -
rpL9*
0,8 4 h, RT
Abbildung 8-2: Northern-Analyse zum Nachweis des CG3727-Transkripts in Drosophila-Embryonen und verschiedenen Geweben.
A: Auf das RNA-Gel wurden 2 µl Marker (RiboRulerTM High Range RNA Ladder) als Referenz und mRNAExtrakte aus 150 Testes, 80 Ovarien und jeweils aus ♀ und ♂ Köpfen (200) und Karkassen (85) der Linie
OreR aufgetragen. B: Die transkriptspezifischen Nachweise erfolgten nacheinander auf dem Filter KP 2
mit den radioaktiven Sonden CG3727* und rpL9*. Die radioaktiven Signale wurden mittels Autoradiographie für 7 d (CG3727*) und 2 d (rpL9*) bei jeweils -80°C visualisiert.
Zur Ergänzung der Ergebnisse des Northern-Experiments wurde die CG3727-Gensequenz in den P-Element-Vektor p{UAST}g einkloniert und das offene Leseraster mit dem
eGFP fusioniert. Die Klonierung erfolgte in mehreren Schritten, da die Gensequenz für
eine PCR-Reaktion zu lang war und der 3'UTR separat C-terminal des eGFPs in den
Vektor eingebracht wurde. Alle PCR-Reaktionen erfolgten mit einem Taq-Pfu-Mix auf genomischer DNA, wodurch die gesamte Gensequenz, welche aller vier Transkripte um-
Anhang
135
fasst, in den Vektor eingebracht wurde. Durch alternatives Spleißen werden folglich alle
vier Transkripte in der Fliege transkribiert. Der Promotor wurde mit dem Primer-Paar
#427/#428 amplifiziert und das 1598 bp lange Produkt zum Sequenzieren in den
pGEM®T-Vektor eingebracht (Klon KP 57; Pudelko, 2013). Nach dem gleichen Verfahren
wurde mit dem ORF (5.958 bp inklusive 5'UTR) vorgegangen, nachdem die PCR mit dem
Primer-Paar #429/#430 erfolgte (Klon SB 743). Im Anschluss an die Sequenzierungen
wurde der Promotor aus dem Konstrukt KP 57 mit Aat I und Apa I ausgeschnitten und gerichtet zu dem passend linearisiertem ORF in das Plasmid SB 743 ligiert (Klon SB 812).
Der 3'UTR wurde mit dem Primer-Paar #431/#432 erzeugt und ebenfalls für eine Sequenzierung in den pGEM®T-Vektor inseriert (Klon KP 16). Dieser musste für die eGFP-Fusion
zuerst in den p{UAST}g-Vektor ligiert werden, aufgrund einer internen Xba I-Schnittstelle.
Nachdem der p{UAST}g-Vektor mit Xba I linearisiert vorlag, konnte das 3'UTR-Fragment
vor der Ligation mit dem Restriktionsenzym Neh I geschnitten und über die kompatiblen
Enden in den p{UAST}g eingebracht werden. Mittels Kolonie-PCR wurde die korrekte
Orientierung des Fragmentes überprüft (Daten nicht gezeigt). Zuletzt wurde dieses Plasmid (Klon KP 16) mit Xho I und Age I linearisiert und der Promotor mit dem ORF über die
gleichen Restriktionsenzyme aus dem Klon SB 812 ausgeschnitten und gerichtet zu dem
3'UTR in den Endvektor eingebracht. Das Endkonstrukt (SB 911 in Abb. 8-3) wurde mittels
Keimbahntransformation auf dem X-Chromosom integriert und die Fliegenstämme 91114.1 bis 14.9 etabliert.
+1
5'
Promotor
Xho I
ORF CG3727
#428
#431
#430
#429
2000
3'
Age I Nhe I
Aat I
#427
eGFP
4000
6000
Nhe I
#432
8000
Abbildung 8-3: Summarische Darstellung des Konstruktes CG3727-eGFP (SB 911).
Xho I, Aat I, Age I, Nhe I: Für die Klonierung verwendete Restriktionsschnittstellen. Promotor: Flankierender Bereich (1.598 bp), welcher vermutlich alle regulatorischen Elemente enthält (schwarze Linie). 5': Untranslated region (schwarz schraffiert). ORF: Open reading frame (rot). Das geneigene Stopcodon wurde
durch den reverse-Primer (#430) deletiert. eGFP: Enhanced green fluorescent protein (852 bp, 26,9 kDa,
grün). 3': Untranslated region (schwarz). Maßstabsbalken: Länge des Konstruktes in Basenpaaren. Die
Primer sind in Lage und Orientierung durch schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden
Primer-Nummern (#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Von allen etablierten Fliegenlinien wurden jeweils weibliche und männliche Gonaden präpariert und unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Leider konnte bei keinem Organ
136
Anhang
eine grüne Fluoreszenz beobachtet werden, sodass die Experimente eingestellt wurden.
8.1.2. RNA- und Protein-Expressionsanalysen des Gens CG34404
Das Gen CG34404 ist bei Drosophila auf dem Arm 3R lokalisiert und kodiert für drei
Transkripte (2.890 nt, 2.635 nt, 2.702 nt), die jeweils ein unterschiedliches Protein liefern.
Diese Annotierung basiert auf insgesamt 22 cDNA-Klonen. Das Protein ist bislang sehr
unauffällig. Es ist lediglich eine PDZ-Domäne namens usher syndrome type-1C proteinbinding protein 1 bekannt. In Drosophila wurde Discs large als eines der ersten Gene
identifiziert, welches PDZ-Domänen beinhaltet. In jüngerer Zeit wurde in einer Zusammenstellung der bisher dokumentierten Daten über PDZ-Domänen dem discs large eine
Funktion in der Polarität der Epithelzellen und anderen Prozessen wie asymmetrischen
Zellteilungen zugeschrieben (Roberts et al., 2012). Zur Überprüfung, ob auch die PDZDomäne des Gens CG34404 eine solche Rolle in der Drosophila-Spermatogenese hat,
muss zunächst das RNA- und Protein-Expressionsmuster innerhalb der Keimzellentwicklung charakterisiert werden.
Zur Bestimmung des RNA-Expressionsmusters wurde eine Northern-Analyse durchgeführt. Dazu wurde ein RNA-Filter hergestellt, der mRNA-Extrakte aus Embryonen und
jeweils ♀ und ♂ Köpfen, Karkassen und Gonaden aufweist. Für die Hybridisierung wurde
eine Sonde hergestellt, die die 3'UTR-Sequenzen aller drei Transkripte detektiert (Konstrukt SB 18; Abb. 8-4, A). Zur Erstellung des Plasmids wurde die 3'UTR-Sequenz
(511 bp) mit dem Primer-Paar #395/#396 vervielfältigt und in den pGEM®T-Vektor eingebracht. Nach einer Linearisierung mit dem Restriktionsenzym Apa I und anschließender
Transkription mit der Sp6-RNA-Polymerase wird ein 642 nt langes antisense-Transkript
synthetisiert. Leider konnten keine Signale nach der Hybridisierung auf dem Filter (SB 4)
detektiert werden. Um eine verringerte Syntheseleistung durch die Polymerase auszuschließen, wurde die Orientierung des Inserts geändert, indem es über die beidseitig angehängte Schnittstelle Xba I aus dem Vektor ausgeschnitten und direkt wieder inseriert
wurde. Die Linearisierung des neuen Plasmids (Klon SB 341 in Abb. 8-4, B) erfolgte nun
mit Spe I und die antisense-Sonde (585 nt) wurde anschließend mit der T7-RNA-Polymerase hergestellt. Unglücklicherweise blieb auch diese Hybridisierung auf der Membran SB
4 erfolglos (Daten nicht gezeigt), weshalb ein identischer Filter angefertigt wurde (SB 5),
um die beiden Sonden zu testen. Ein letzter Versuch doch noch eine Aussage über die
RNA-Menge in den Embryonen und den verschiedenen Geweben adulter Fliegen treffen
zu können, wurde eine letzte Sonde hergestellt (Klon SB 530 in Abb. 8-4, C). Da die bisherigen Synthesen auf der gesamten 3'UTR-Sequenz in dem pGEM ®T-Vektor basierten,
wurden nun die ersten 112 bp des 3'UTRs aus dem Klon SB 341 mit den Schnittstellen
Anhang
137
Bam HI und Apa I ausgeschnitten, wodurch auch ein Teil der MCS des pGEM ®T-Vektors
mitgeschnitten wurde und gerichtet in den pBS II KS-Vektor eingebracht (Klon SB 530)
wurde. Somit soll zum einen die Bindespezifität durch eine kürzere RNA-Länge ermöglicht
werden und zum anderen einer verringerte Syntheseleistung aufgrund des pGEM ®TVektors vorgebeugt werden. Dieses Plasmid wurde für die in vitro-Transkription mit der
Endonuklease Nco I linearisiert. Die Transkription mit der T7-RNA-Polymerase erzeugte
eine 168 nt lange antisense-RNA.
A
Bam HI Apa I
Sp6
T7
CG34404
MCS
Xba I Bam HI
Xba I
#395
#396
200
B
CG34404
MCS
Xba I
#396
200
400
C
Spe I
#395
400
Abbildung 8-4: Schematische Darstellung der
drei CG34404-Sonden.
T7
CG34404
MCS
MCS
Bam HI
100
Xba I Apa I
#396
200
A: Konstrukt SB 18. Der 3'UTR ist in T7-Orientierung in den pGEM®T-Vektor eingebracht (Sequenzierungsergebnis siehe 8.2.). B: Konstrukt SB
341. Der 3'UTR ist in Sp6-Orientierung in den
pGEM®T-Vektor eingebracht. C: Die ersten 112 nt
des 3'UTRs und ein Teil der MCS sind aus dem
Plasmid SB 341 (B) ausgeschnitten und in den pBS
II KS-Vektor in T3-Orientierung einkloniert.
Xba I, Bam HI, Spe I, Apa I: Zur Klonierung und Linearisierung verwendete Restriktionsschnittstellen.
Sp6, T7: Promotoren (weiß). MCS: Multiple cloning site (pGEM®T-Vektor in schwarz, pBS II KS-Vektor in
grau). CG34404: 3'UTR-Sequenz (blau). Maßstabsbalken: Länge der Konstrukte in Nukleotiden. Die Primer sind in Lage und Orientierung durch schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden PrimerNummern (#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Leider führte die Hybridisierung mit der verkürzten 3'UTR-Sequenz zu einer Vielzahl an
Signalen (Abb. 8-5), die nicht den in FlyBase angegebenen RNA-Längen (2.890 nt,
2.635 nt, 2.702 nt), falls diese denn stimmen, entsprechen. In dem weiblichen KarkassenExtrakt wurde eine RNA auf Höhe von 4,6 kb detektiert, was über 2.000 Nukleotide mehr
sind als die bekannten RNAs. Ein Polyadenylierungseffekt in diesem Ausmaß erscheint
unwahrscheinlich, wodurch diese Reaktion als unspezifische Bindung angenommen wird.
Auch die Banden von 2,4 kb und kürzerer Längen in den Embryo-, ♂ Karkassen- und
allen weiblichen Proben sind zu kurz, um die CG34404-Transkripte zu repräsentieren.
Aufgrund der deutlichen Bandenausbildung nach der Hybridisierung mit der rpL9*-Sonde
als Referenz, kann eine Degradation der RNA-Extrakte ausgeschlossen werden. Somit
konnten alle drei getesteten CG34404*-Sonden keine Rückschlüsse auf das RNA-Expressionsmuster der angegebenen Transkripte zulassen.
138
Anhang
♀
kb
kb
10 643-
4,6 -
21,5 -
n
n
de
a
on
G
Kö
pf
Ka e
rk
as
se
♂
n
se den
s
a
a
p
rk on
Kö ka G
♂
♂ ♂
fe
♀
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B
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♀
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G
ar
ke
Em r
br
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ne
n
♂
ka
rk
as
se
n
♀
Kö
♀ pfe
Ka
rk
as
se
n
M
A
♀
CG34404*
2,4 -
11 d, -80°C
0,5 -
rpL9*
0,8 3 d, -80°C
Abbildung 8-5: Northern-Analyse zum Nachweis des CG34404-Transkripts in Drosophila-Embryonen und verschiedenen Geweben.
A: Auf das RNA-Gel wurden 2 µl Marker (RiboRulerTM High Range RNA Ladder) als Referenz und mRNAExtrakte aus 150 Testes, 50 Ovarien und jeweils aus ♀ ♂ Köpfen (150) und Karkassen (50) der Linie
OreR aufgetragen. B: Die transkriptspezifischen Nachweise erfolgten nacheinander auf dem Filter SB 5
mit den radioaktiven Sonden CG34404* und rpL9*. Die radioaktiven Signale wurden mittels
Autoradiographie für 1 d (CG34404*) und 3 d (rpL9*) bei jeweils -80°C visualisiert.
Basierend auf der Tatsache, dass dieses Gen bislang keiner detaillierten Charakterisierung unterliegt, die die in FlyBase angegebenen Transkriptlängen bestätigen könnte, wird
dennoch ein eGFP-Fusionskonstrukt erstellt und das Proteinmuster untersucht. Für die
Klonierung erfolgten alle PCR-Reaktionen in einem Taq-Pfu-Mix auf genomischer DNA.
Dadurch wurde die gesamte CG34404-Gensequenz, inklusive Introns, bei der Klonierung
beachtet und alle auf dieser Sequenz basierten alternativ gespleißten mRNAs werden in
der Fliege hergestellt. Für die Herstellung des Plasmides wurde zuerst der 3'UTR mit
Xba I aus dem Klon SB18 ausgeschnitten und in den vorbereiteten p{UAST}g-Vektor eingebracht. Die korrekte Orientierung wurde mit einer Koline-PCR überprüft. Der Promotor
und der ORF (inklusive 5'UTR-Sequenzen) wurden jeweils in den pGEM ®T-Vektor
einkloniert (Klone SB 499 und SB 721) und sequenziert. Beide Inserts mussten in T3Orientierung in den Vektoren vorliegen, um später korrekt miteinander fusioniert zu
werden. Der Promotor wurde nach der Verifizierung mit Eco RV und Not I aus dem Klon
721 ausgeschnitten und in den gleichermaßen linearisierten Plasmid SB 499 gerichtet mit
dem ORF über die Schnittstelle Eco RV fusioniert (Klon SB 783). Das geneigene
Stopcodon wurde durch den reverse-Primer (#394) deletiert. Schließlich konnte das
Promotor-ORF-Fragment aus dem Klon SB 783 mit Eco RV und Not I isoliert werden und
gerichtet in den Endvektor zu dem 3'UTR eingebracht werden (Klon SB 868 in Abb. 8-6).
Anhang
139
+1
5'
Promotor
ORF CG34404
Age I
Eco RV
Eco RI
#410
#392
2000
3'
Xba I Xba I
#395
#394
#393
1000
eGFP
3000
4000
#396
5000
Abbildung 8-6: Summarische Darstellung des Konstruktes CG34404-eGFP (SB 868).
Eco RI, Eco RV, Age I, Xba I: Für die Klonierung verwendete Restriktionsschnittstellen. Promotor: Flankierender Bereich (2.000 bp), welcher vermutlich alle regulatorischen Elemente enthält (schwarze Linie). 5':
Untranslated region (schwarz schraffiert). ORF: Open reading frame (rot). Das geneigene Stopcodon
wurde durch den reverse-Primer (#394) deletiert. eGFP: Enhanced green fluorescent protein (852 bp,
26,9 kDa, grün). 3': Untranslated region (schwarz). Maßstabsbalken: Länge des Konstruktes in Basenpaaren. Die Primer sind in Lage und Orientierung durch schwarze Pfeile dargestellt und mit den entsprechenden Primer-Nummern (#) beschriftet. Graphik erstellt mit OpenOffice 3.4.1.
Nach erfolgreicher Keimbahntransformation konnten einige Fliegenlinien erzeugt werden,
aus denen jeweils die männlichen und weiblichen Gonaden unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wurden. Bedauerlicherweise konnte in keinem Testes ein Fluoreszenzmuster entdeckt werden. Lediglich in den dorsalen Anhängen eines Embryos, welcher aus
einem weiblichen Tier der Linie 868-9.5 entnommen wurde, konnte ein grünes Fluoreszenzsignal beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Da diese Struktur nicht mit der
Spermatogenese zusammenhängt, wurde die Expression des CG34404-Proteins nicht
weiter analysiert.
140
Anhang
8.2. Sequenzierungsergebnisse der Northern- und EMSA-Sonden
Das Konstrukt SB 964 (EMSA-Sonde Mst87F in pGEM®-T) wurde mit dem T7-Primer
(#334) sequenziert. Das Alignment erfolgte mit ClustalW 2.0. Die unterstrichenen Sequenzen repräsentieren das Primer-Paar #465/#466. Die fett hervorgehobenen Basen
sind das TCE.
Mst87F-FlyBase
Sequenzierung
-TTTATTATTATTTGTCCTTTCGGCCTGAACACATCAAAATTTGTCGTCT
TTTTATTATTATTTGTCCTTTCGGCCTGAACACATCAAAATTTGTCGTCT
*************************************************
50
Mst87F-FlyBase
Sequenzierung
CGAGTTTA-TCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGC
CGAGTTTAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGC
******** *****************************************
100
Das Konstrukt SB 972 (EMSA-Sonde Mst98Ca in pGEM®-T) wurde mit dem T7-Primer
(#334) sequenziert. Das Alignment erfolgte mit ClustalW 2.0. Die unterstrichenen Sequenzen repräsentieren das Primer-Paar #467/#468. Die fett hervorgehobenen Basen
sind das TCE.
Mst98Ca-FlyBase
Sequenzierung
T-ATATTCAGTTTCCTGTTTCGCTCCGAATAACTTCCAAATTGAACAGTC
TTATATTCAGTTTCCTGTTTCGCTCCGAATAACTTCCAAATTGAACAGTC
* ************************************************
50
Mst98Ca-FlyBase
Sequenzierung
TAGATTTA-TCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGC
TAGATTTAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGC
******** *****************************************
100
Das Konstrukt HS 2581 (Northern-Sonde Protamin in pGEM®-T) wurde mit dem T7-Primer
(#334) sequenziert. Das Alignment erfolgte mit ClustalW 2.0. Die Sonden-Sequenz umfasst für beide Protamin-Varianten den gesamten ORF.
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
ATGAGTTCAAATAATGTAAATGAGTGCAAGAGCCTGTGGAATGGCATAATTTCCATTTCT 60
ATGAGTTCAAATAATGTAAATGAGTGCAAGAGCCTGTGGAATGGCATAATTTCCATTTCT 60
************************************************************
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
GCAAAAGATGAAAGTCCTAAAGGTCTCACTGAAATGTGTAATCATCCAAAGAGGAGAGCA 120
GCAAAAGATGAAAGTCCTAAAGGTCTCACTGAAATGTGTAATCATCCAAAGAGGAGAGCA 120
************************************************************
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
CCGCCCAAATGTAAGCCAATGAAGTCCTGTGCAAAGCCGCGCCGAAAGGCAGCCTGTGCC 180
CCGCCCAAATGTAAGCCAATGAAGTCCTGTGCAAAGCCGCGCCGAAAGGCAGCCTGTGCC 180
************************************************************
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
AAGGCGACTCGGCCCAAGGTCAAGTGTGCACCGAGTCAGAAGTGCAGCAAGCAGGGACCT 240
AAGGCGACTCGGCCCAAGGTCAAGTGTGCACCGAGTCAGAAGTGCAGCAAGCAGGGACCT 240
************************************************************
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
GTCACTAACAACGCCTATTTGAATTTCGTGCGTTTCTTCCGAAAGAAGCACTGTGACTTG 300
GTCACTAACAACGCCTATTTGAATTTCGTGCGTTTCTTCCGAAAGAAGCACTGTGACTTG 300
************************************************************
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
AAGCCGCAGGAATTAATTGCAGAGGCCGCTAAAGCGTGGGCCGAGCTCCCGGAGCATAGA 360
AAGCCGCAGGAATTAATTGCAGAGGCCGCTAAAGCGTGGGCCGAGCTCCCGGAGCATAGA 360
************************************************************
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
AAGGATAGATACCGCCGGATGGTACGTATTTTTTTTTTATATTATGAAGACTATTAATTT 420
AAGGATAGATACCGCCGGATGGTACGTATTTTTTTTTTATATTATGAAGACTATTAATTT 420
************************************************************
Anhang
Protamin-FlyBase
Sequenzierung
141
GTCCTTTCAGGCATGCAAGGTCACCACCAGTGAACGCCACAAGCGCCGACGGATTTGCA 479
GTCCTTTCAGGCATGCAAGGTCACCACCAGTGAACGCCACAAGCGCCGACGGATTTGCA 479
***********************************************************
Das Konstrukt KP 9 (Northern-Sonde CG3727 in pGEM®-T) wurde mit dem T7-Primer
(#334) sequenziert. Das Alignment erfolgte mit ClustalW 2.0. Die unterstrichenen Sequenzen repräsentieren das Primer-Paar #431/#432.
CG3727-FlyBase
Sequenzierung
------------------------------TTTGCTAGCTATGTGCACATGTACGGTATG 30
GTGGCAGTCCAGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTCTATGTGCACATGTACGGTATG 60
**********************
CG3727-FlyBase
Sequenzierung
TAAATATGTAATGTATTGCATGTTGACATCTAGATTTGCTCAAATTGAATCGAATGCAAT 90
TAAATATGTAATGTATTGCATGTTGACATCTAGATTTGCTCAAATTGAATCGAATGCAAT 120
************************************************************
CG3727-FlyBase
Sequenzierung
GATGAGTTCTTGAGTTTCTCGTTCCTCGTTAACATAGCCAATGCGGTAATTAAGCGTTAA 150
GATGAGTTCTTGAGTTTCTCGTTCCTCGTTAACATAGCCAATGCGGTAATTAAGCGTTAA 180
************************************************************
CG3727-FlyBase
Sequenzierung
TTTAGTTAATTCAATTATATAAAAGTACAAAAAGGTCCTTTGGCCGTGGCTATACGTACG 210
TTTAGTTAATTCAATTATATAAAAGTACAAAAAGGTCCTTTGGCCGTGGCTATATGTACG 240
****************************************************** *****
CG3727-FlyBase
Sequenzierung
GGTCGCGTTGAACCAACCGATCTATATACACACGCTGGTCTGATCTAATCCAAAACTGAG 270
GGTCGCGTTGAACCAACCGATCTATATACACACGCTGATCTGATCTAATCCAAAACTGAG 300
************************************* **********************
CG3727-FlyBase
Sequenzierung
TCCATAATTAAATATCCAAACCGAACTATATTGAACTACACGTCGCGCTGAGCTGAGCTG 330
TCCATAATTAAATATCCAAACCGAACTATATTGAACTACACGTCGCGCTGAGCTGAGCTG 360
************************************************************
CG3727-FlyBase
Sequenzierung
CCTACAAGTTAGCCTTGGTATATCTTTGTGTTGCATATGTGTGTTGTTGAATACGGGTAA 390
CCTACAAGTTAGCCTTGGTATATCTTTGTGTTGCATATGTGTGTTGTTGAATACGGGTAA 420
************************************************************
CG3727-Sonde
Sequenzierung
TATGAATGCTGAGATTTCTCTGCTCCAGTCCTGGACCTGCGCTAGCTTT----------- 439
TATGAATTCTGAGATTTCTCTGCTCCAGTCCTGGACCTGCGCTAGCTTTAATCACTAGTG 480
******* *****************************************
Das Konstrukt SB 18 (Northern-Sonde CG34404 in pGEM®-T) wurde mit dem T7-Primer
(#334) sequenziert. Das Alignment erfolgte mit ClustalW 2.0. Die unterstrichenen Sequenzen repräsentieren das Primer-Paar #395/#396.
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
--------------------------------------------------GAAACGCATG 10
AAATGCGAGTCGCATGCTCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTAAATCTAGAGAAACGCATG 60
**********
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
ACGACCTTCCAGGAGGACTGAGCAACTGGGCGTGGAGCGGGCGCGCTTGTCACATATCCC 70
ACGACCTTCCAGGAGGACTGAGCAACTGGGCGTGGAGCGGGCGCGCTTGTCACATATCCC 120
************************************************************
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
GCAAAAGATCTTTCCCTCTCGATCATATCGCTTATTTTACCTTTAATGCAATGACCACCC 130
GCAAAAGATCTTTCCCTCTCGATCATATCGCTTATTTTACCTTTAATGCAATGACCACCC 180
************************************************************
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
GCCCAGCAGTCGCCGTGGATCCGCCATGACCAAGACAGTATCACGAATGTGCCATGCGAC 190
GCCCAGCAGTCGCCGTGGATCCGCCATGACCAAGACAGTATCACGAATGTGCCATGCGAC 240
************************************************************
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
TTAATTGCAGTCGGCTGGGGCTTGGGCGGTGTCCCTGCCTCGCAGATAAGGCTGCAGTAA 250
TTAATTGCAGTCGGCTGGGGCTTGGGCGGTGTCCCTGCCTCGCAGATAAGGCTGCAGTAA 300
************************************************************
142
Anhang
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
CTACATACTCAAATACATACATATTCAGAGGTGCCATGAGCAAGGCTCCACCAACCTATC 310
CTACATACTCAAATACATACATATTCAGAGGTGCCATGAGCAAGGCTCCACCAACCTATC 360
************************************************************
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
CATAGATCCGTGGGATTGGAGCATCCGTCTATGGGCCACAAGCAATTACATATACACACA 370
CATAGATCCGTGGGATTGGAGCATCCGTCTATGGGCCACAAGCAATTACATATACACACA 420
************************************************************
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
TACGAATAGACAAACTAAGGAGTTATTCAAGACGCATACACGGGATCCTATATTTATACA 430
TACGAATAGACAAACTAAGGAGTTATTCAAGACGCATACACGGGATCCTATATTTATACA 480
************************************************************
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
ATGTATTCGCATTTTGCTTGTTATATGATTCAATATGTATTTAAAACTGTACAAAATATA 490
ATGTATTCGCATTTTGCTTGTTATATGATTCAATATGTATTTAAAACTGTACAAAATATA 540
************************************************************
CG34404-FlyBase
Sequenzierung
AAACGTCTACTAAAACTCGAT--------------------------------------- 511
AAACGTCTACTAAAACTCGATAAAATTCACTCTAGAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGG 600
*********************
Referenzen
143
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Titel „Analysen der
beiden cis-regulierenden Sequenzelemente translational control element (TCE) und cytoplasmic polyadenylation element (CPE) in der Drosophila-Spermatogenese“ selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe Dritter angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Dies gilt auch für Zeichnungen, Skizzen und bildliche Darstellungen. Dritte
waren an der inhaltlich-materiellen Erstellung der Dissertation nicht beteiligt. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden.
Kassel, im Oktober 2015
Stefanie Bublak

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