Diss. ETH No 23061 Critical Assessment of the ceRNA Hypothesis: Quantitative and Functional Analysis of the Relationship between miRNAs, Target Abundances and Gene Expression A dissertation submitted to ETH ZÜRICH for the degree of Doctor of Sciences of ETH Zürich (Dr. sc. ETH Zürich) presented by RÉMY CLAUDE DENZLER Master of Science in Microbiology and Immunology ETH Zürich born April 13th , 1985 citizen of Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Markus Stoffel, examiner Prof. Jonathan Hall, co-examiner Prof. Constance Ciaudo, co-examiner 2015 v Summary microRNAs (miRNAs) are ∼22 nucleotide (nt) small noncoding RNAs that play an important role in many biological processes by regulating messenger RNA stability and translation through base pairing to its 30 untranslated region. Since miRNAs were discovered, it was evident that their levels are crucial in defining the magnitude target genes are repressed. Later studies have pointed out that the number of binding sites present in the transcriptome (target abundance) may also affect the activity of miRNAs. Consistent with this concept, the expression of high-site-containing RNAs was found to titrate miRNAs away from other targets, thereby reducing the activity of a miRNA. These observations were extended by the notion that miRNA target sites found naturally in cells can act as competing endogenous RNA (ceRNA) and regulate other site-containing transcripts by increasing or decreasing the miRNA activity, as its expression changes. The ceRNA hypothesis is controversial as it is difficult to imagine how expression changes of individual transcripts can affect all binding sites found transcriptome-wide. Consideration of this hypothesis would benefit from knowing the quantitative relationship between a miRNA and its endogenous target sites. We experimentally assessed the ceRNA hypothesis by expressing defined amounts of competing target sites and measuring the corresponding influence on miRNA-mediated regulation. By quantifying the number of competing binding sites that are necessary to affect miRNA activity, we evaluated the susceptibility to ceRNA-mediated gene regulation and the apparent cellular target abundance of different primary hepatocyte and embryonic stem cell miRNAs. We found that for the majority of miRNA families the binding sites are in stoichiometric excess over their respective miRNA. We further unveiled that overexpression of individual ceRNAs have to be unphysiologically high and approach ∼10 – 40% of a miRNA’s target abundance before they exert a detectable effect on miRNA activity. While miRNA abundance had a large influence on the magnitude of ceRNA-regulated gene expression, the number of binding sites necessary to detect a ceRNA-mediated gene regulation was independent of miRNA levels. vi When we examined genes that contributed the most miRNA binding sites to all sites found transcriptome-wide, we found that only a few genes contributed 5 – 20% to total target abundance and hence would have the potential to influence miRNA activity through changing their expression levels. We also analyzed how target abundance of hepatocytes changes in response to metabolic stress or insulin stimuli. We observed that global target site abundance was not altered sufficiently in response to these physiological and pathological stresses to affect miRNA-mediated repression. Together, our data imply that a ceRNA effect, mediated through a single miRNA family in a physiological or disease setting of the liver, is unlikely. We also evaluated the influence base pairing complementarity (6-, 7-, or 8-nt) of binding site has on ceRNA-mediated gene regulation. We found that 7 nt and 6 nt sites, respectively are 30% and 45% less effective in competing for miRNA compared to a 8 nt site. While weak sites (6 nt) have been described to only be negligibly repressed by miRNA, our data show that they contribute meaningfully to cellular target abundance. In contrast, high binding site complementarity influences miRNA activity predominantly through degradation rather than competition. Finally, we investigated whether closely spaced binding sites of two different miRNA families could cooperatively reduce miRNA activity and hence increase the likeliness of ceRNA-mediated gene regulation. We found that transcripts containing two miRNA binding sites that are less than 58 nucleotides apart can cooperatively sequester miRNA of both miRNA families. Our data suggests that strongly regulated ceRNA containing closely spaced binding sites targeted by active miRNA can potentially enhance the probability of ceRNA-induced changes in gene expression. In summary, our results provide a critical assessment of the ceRNA hypothesis by quantitative evaluation of the stoichiometric relationship between miRNA and target abundance, target site spacing and affinity requirements for ceRNA-mediated gene regulation. vii Zusammenfassung Mikro-RNAs (miRNAs) sind ∼22 Nukleotid (nt) kurze, nicht Protein kodierende Ribonukleinsäuren (RNA), die viele wichtige biologischen Prozesse beeinflussen indem sie die Genexpression regulieren. miRNAs erkennen und binden kurze, spezifische Nukleotidsequenzen in der 3’-untranslatierten Region von Boten-RNAs (mRNAs), wodurch sie deren Stabilität und Translation regulieren. Seitdem miRNAs entdeckt wurden, war es offensichtlich, dass ihre Konzentrationen entscheidend dazu beitragen in welchem Ausmass Zielgene reprimiert werden. Spätere Studien haben darauf hingewiesen, dass die Zahl der im Transkriptom vorhanden Bindungsstellen (Bindungsstellen-Menge) auch die Aktivität der miRNAs beeinflussen kann. In Übereinstimmung mit diesem Konzept kann die Expression von Transkripten, die viele Bindungsstellen enthalten, miRNAs von anderen Zielen wegtitrieren und dadurch die Aktivität dieser miRNA reduzieren. Diese Beobachtungen wurden durch die Annahme ergänzt, dass Zielgene, die natürlich in Zellen vorkommen, als konkurrierende endogenen RNAs ( competing endogenous RNAs“, oder ceR” ” NA“) agieren und andere Bindungsstellen-enthaltende Transkripte regulieren können indem sie mittels Expressionsveränderungen die miRNA Aktivität erhöhen oder verringern. Da es schwierig ist, sich vorzustellen wie die Expressionsänderung einzelner Transkripte alle Bindungsstellen im Transkriptom beeinflussen kann, ist die ceRNA Hypothese umstritten. Die Annahme dieser Hypothese würde davon profitieren die quantitative Beziehung zwischen miRNA und ihrer endogenen Bindnungsstellen zu kennen. In dieser Doktorarbeit wurde die ceRNA Hypothese experimentell untersucht, indem definierte Mengen an konkurrierenden Bindungsstellen exprimiert und deren entsprechenden Einfluss auf die miRNA-vermittelte Regulierung gemessen wurde. Durch die Quantifizierung der Anzahl konkurrierender Bindungsstellen, welche erforderlich sind um miRNA-Aktivität zu beeinflussen, haben wir die Anfälligkeit für ceRNA-vermittelte Genregulation sowie die scheinbare zelluläre Bindungsstellen-Menge von unterschiedlichen miRNAs in primären Hepatozyten und embryonalen Stammzellen er- viii mittelt. Wir haben nachgewiesen, dass für die Mehrzahl der miRNA Familien die jeweiligen Bindungsstellen im stöchiometrischen Überschuss vorhanden sind. Wir haben ausserdem gezeigt, dass die Überexpression von einzelnen ceRNAs unphysiologisch hoch sein muss und sich an ∼10% bis 40% der Bindungsstellen-Menge annähern muss, bevor sie eine nachweisbare Wirkung auf die miRNA-Aktivität ausüben kann. Während die miRNA Konzentration einen grossen Einfluss auf das Ausmass der ceRNA-regulierten Genexpression hat, ist die Anzahl von Bindungsstellen die erforderlich waren um eine ceRNA vermittelte Genregulation zu messen unabhängig von der miRNA Abundanz. Wenn wir Gene untersuchten, die prozentual am meisten miRNA-Bindungsstellen beisteuerten, stellten wir fest, dass nur wenige Gene 5%–20% zur Bindungsstellen-Menge beitragen und somit das Potenzial besitzen, miRNA-Aktivität durch Veränderung ihres Expressionsniveaus zu beeinflussen. Wir untersuchten auch, wie sich die Bindungsstellen-Menge in Hepatozyten als Reaktion auf metabolischen Stress oder Insulin Stimuli veränderte. Wir beobachteten, dass sich die globale Bindungsstellen-Menge als Reaktion auf diese physiologischen und pathologischen Belastungen nicht ausreichend veränderten, um miRNA-vermittelte Repression zu beeinflussen. Zusammengefasst zeigen unsere Daten, dass ein ceRNA Effekt, der durch eine einzelne miRNA-Familie in einem physiologischen oder pathologischen Kontext der Leber vermittelt wird, unwahrscheinlich ist. Wir untersuchten auch welchen Einfluss die Basenpaarungskomplementarität (6-, 7- oder 8-nt) der Bindungsstelle auf eine ceRNA-vermittelte Genregulation hat. Es zeigte sich, dass 7 nt und 6 nt Bindungsstellen jeweils 30% und 45% weniger effektiv um miRNA konkurrieren als eine 8 nt Zielsequenz. Während schwache Bindungsstellen (6 nt) nur unwesentlich von der miRNA reprimiert werden, zeigen unsere Daten, dass diese bedeutsam zur zellulären Bindungsstellen-Menge beitragen. Im Gegensatz dazu beeinflusst eine hohe Bindungsstellenkomplementarität die miRNA-Aktivität nicht durch Konkurrieren um die miRNA sondern hauptsächlich durch ihren Abbau. ix Schließlich untersuchten wir, ob nahe beieinander gelegene Bindungsstellen von zwei verschiedenen miRNA Familien kooperativ die miRNA-Aktivität reduzieren und dadurch die Wahrscheinlichkeit einer ceRNA-vermittelten Genregulation erhöhen können. Wir ermittelten, dass Transkripte, die zwei miRNA-Bindungsstellen, die weniger als 58 Nukleotide voneinander entfernt sind, kooperativ die miRNA beider miRNA Familien binden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass stark regulierte ceRNA, die nahe beieinander gelegene Bindungsstellen enthält, die durch aktive miRNA reprimiert werden, potenziell die Wahrscheinlichkeit einer ceRNA induzierten Veränderungen in der Genexpression erhöhen können. Durch quantitative Auswertung der stöchiometrischen Beziehung zwischen miRNA und der Bindungsstellen-Menge, sowie der Zielsequenz Abstandsund Affinitätsanforderungen für ceRNA-vermittelte Genregulation, liefern unsere Ergebnisse eine kritische Beurteilung der ceRNA Hypothese.
© Copyright 2024 ExpyDoc
