Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxin A: Suche nach einem wirksamen Antagonisten Ochratoxine sind eine Gruppe von Mykotoxinen (Pilzgifte) verschiedener, in der Natur weit verbreiteter Schimmelpilz-Arten (z.B. Aspergillus- und Penicillium-Familie wie A. ochraceus oder P. verrucosum). Ochratoxin A (OTA) ist das häufigste und wichtigste aller Ochratoxine. OTA wird meistens schon während des Pflanzenwachstums gebildet, spätestens jedoch während der Lagerung. Es kommt hauptsächlich in Getreide, Hülsenfrüchten, Kaffee, Bier, Traubensaft, Rosinen und Wein, Kakaoprodukten, Nüssen und Gewürzen vor. Ochratoxin A verursacht Nierenerkrankungen und wirkt bei Ratten und Mäusen karzinogen. de.wikipedia.org Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxine Google:328’000 Einträge Aspergillus alutaceus Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxin A: Vorkommen envirocancer.cornell.edu Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxin A: Wirkungen Ochratoxine stellen in vielen Gebieten Europas, Nordamerikas, Asiens und Afrika ein ernsthaftes Gesundheitsproblem für Mensch und Tier dar. Ochratoxine führen zu Krebs, Mutagenizität und chronischen Nierenschädigungen. Letzteres wird mit der Balcan Endemic Nephropathy, einem häufig tödlichen Nierenversagen, das in gewissen Regionen des Balkans (→ Karte) auftritt, in Verbindung gebracht. Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxin A und B: pKa und Toxizität Ochratoxin A: pKa = 3.66 und 6.89 Monoanion (pH = 7.4): 23.6% Dianion (pH = 7.4): 76.4% Ochratoxin B: pKa = 3.66 und 7.87 Der –I-Effekt des Cl in der para-Position erhöht die Azidität der phenolischen Hydroxylgruppe Monoanion (pH = 7.4): 74.7% Dianion (pH = 7.4): 25.3% Ochratoxin A ist 10 mal giftiger als Ochratoxin B Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxin A: Targets und Wirkmechanismen Phenylalanin-Teil Isocoumarin-Teil • Nephrotoxisch • Kanzerogen • Teratogen, genotoxisch, immunosuppresiv • Stört den Glukose-Metabolismuns und die Blutkoagulation • Hemmung von Phenylalanin-metabolisierenden Enzymen (Phenylalanin-tRNASynthetase, Phenylalanin-Hydroxylase, Phenylalanin-Transferase) • Erhöht Lipid-Peroxidation • Hemmt die mitochondriale Produktion von ATP Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Target 1: Phenylalanin-tRNA-Synthetase 1. Phe + ATP Phe–AMP + PPi 2. Phe–AMP + tRNAPhe tRNAPhe–Phe + AMP Phe-tRNA-Synthetase: 777 AS + 38 BP, Auflösung = 3.3 Å, R-Wert = 0.287 Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Phe–AMP wird in Phe-tRNA-Synthetase durch Salz- und Wasserstoffbrücken sowie hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung 2D-Trugschluss: Phe–AMP und Ochratoxin A können in der aktiven Stelle von Phe-tRNA-Synthetase nicht analog binden Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Target 2: Phenylalanin-Hydroxylase Ochratoxin A bindet (in silico) nur schwach and Phenylalanin-Hydroxylase. Die Carboxylgruppe bindet in der zweiten Koordinationssphäre des FeII und kann keine Salzbrücke eingehen. Die abgeschätzte Bindungsaffinität (50–100 µM) vermag die Toxizität von Ochratoxin A bei weitem nicht zu erklären. Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Target 3: Carboxypeptidase A Ochratoxin A kann sehr wohl an Carboxypeptidase binden: Die Carbonylgruppe koordiniert ans Zink, die Carboxylgruppe kann eine Salzbrücke ausbilden. Die abgeschätzte Bindungsaffinität von 1 µM vermag die extreme Gifitigkeit von Ochratoxin A allerdings auch nicht erklären. Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Target 4: Serum Albumin (HSA) Funktion: • Transport von kaum löslichen Verbindungen (Fettsäuren, Bilirubin) • Kontrolle des osmotischen Druckes • Regulierung des Plasma-pH’s Mindestens 6 Bindungsstellen: • Metallionen • Vier für Fettsäuren • Zwei für kleine organische Moleküle: 1. Diazepam-Bindungsstelle 2. Warfarin-Bindungsstelle (Bild) Warfarin Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Bindung von Arzneistoffen an Serumalbumin Bindungsstelle Endogene Liganden Arzneistoffe Ionen Ni2+, Hg2+, Ag+, Cu2+ FA-1 Hämin, Bilirubin Azapropazon*, Indomethacin* FA-3/4 Thyroxin-4 Acidothymid, Clofibrat, Diazepam, Diflunisal, Digitoxin, Halothan, Ibuprofen, Indoxylsulfat, Propofol, Urofansäure* FA-5 Thyroxin-2 Thyroxin-3 Oxyphenbutazon*, Propofol* FA-2 FA-6 Diflusinal*, Halothan*, Ibuprofen* FA-7 Thyroxin-1 Zucker D-Glukose Thyroxin-5 ! Aspirin, Azapropazon, Diiodslicylsäure, Diflusinal*, Indomethacin, Indoxylsulfat*, Iodopamid, Oxyphenbutazon, Phenylbutazon, Triiodbenzoesäure, Urofansäure, Warfarin Iodipamid* FA = Bindungsstelle für Fettsäure (fatty acid); fett = alternativer Name der Bindungsstelle; * zweiter Bindungsmodus Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Bindung von Ochratoxin A an Serumalbumin Serumalbumin mit gebundenem Warfarin (und co-kristallisierten Fettsäuren) Serumalbumin mit gebundenem Bilirubin Modeling: Ochratoxin A kann in Serumalbumin sowohl an die Bindungsstelle von Warfarin als auch von Bilirubin binden. • Warfarin-Bindungsstelle: Bilirubin und OcA können im Serumalbumin koexistieren. Warum aber ist OcA dann so toxisch? • Bilirubin-Bindungsstelle: Ki [Bilirubin] = 1–10 nM, Ki [OcA] ≈ 1 µM → kleines “Modelingfenster” (Faktor 100–1000) Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Hypothese für einen Ochratoxin A – Antagonisten Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Hypothese für einen Ochratoxin A – Antagonisten Anforderungen an einen wirksamen Ochratoxin A – Antagonisten • stärker binden als OcA (1 µM) • schwächer binden als Bilirubin (1–10 nM) • keine andere Bioaktivität aufweisen • vernünftige Halbwertszeit in vivo ☞ könnte alle toxischen Effekte reduzieren Problem: Kleine Modeling-Fenster = 100–1000 in K (2.6–3.9 kcal/mol) “Belohnung”: – Linderung unsäglichen Leidens (Mensch + Tier) – Nobelpreis ? Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Andere Zielproteine für Ochratoxin A – VirtualToxLab Zielprotein Monoanion Dianion Rezeptoren: Androgen Aryl hydrocarbon Estrogen α Estrogen β Glucocorticoid hERG Liver X Mineralocorticoid PPARγ Progesteron Thyroid α Thyroid β 170 nM – 12 µM 7.0 µM 120 nM – – 590 nM 8.6 µM 15 nM 6.7 µM 2.4 µM – – – – 4.3 µM – – 75 µM 1.6 µM – 4.1 µM 26 µM Enzyme: CYP450 1A2 CYP450 2C9 CYP450 2D6 CYP450 3A4 15 µM 67 nM 1.1 µM 950 nM – 46 µM – 6.1 µM Toxisches Potential 0.560 0.325 Bindung von OcA an den Progesteron-Rezeptor (Affinität = 15 nM) Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxin A-Antagonist Aspartam ☞ Baudrimont et al., Arch. Toxicol. 1997, 71, 290–298 Ochratoxin A Aspartam Ochratoxin A + Aspartam überlagert Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015 Molecular Modeling: Computergestützte Verfahren in der modernen Arzneistoffentwicklung Ochratoxin A-Antagonist — A. Grandel Masterarbeit Universität Basel, 2014 Bindung von Antagonist A19 an die Warfarin-Bindungsstelle von HSA; ToxPot = 0.405 Angelo Vedani — Departement Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Basel, 2015
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