Liposomale Wirkstoffträgersysteme Vom Konzept bis zur klinischen Anwendung Ruth Prassl 10. Thüringer Biomaterial – Kolloquium 17. September 2015 1 Drug Delivery Systeme - Wirkstoffträger Wozu überhaupt Wirkstoffträger ? Schutz des Wirkstoffes vor enzymatischen Abbau Erhöhung der Löslichkeit des Wirkstoffes Geschützter Transport an den Wirkort und gezielte Freisetzung des Wirkstoffes vor Ort (targeted drug delivery) Erwartete Vorteile: Reduktion der verabreichten Wirkstoffmenge Reduktion der Toxizität von Wirkstoffen Reduktion unerwünschter Nebenwirkungen Langzeitwirkung durch verlangsamte Freisetzung (Retardeffekt) 2 Drug Delivery Systeme - Wirkstoffträger Herausforderungen: Biologische Verträglichkeit Beladbarkeit des Wirkstoffträgers Lagerungsstabilität Stabilität im Körper, Aufnahme von den Zellen Inhalativ Freisetzung des Wirkstoffes Reproduzierbarkeit im Herstellungsverfahren Up-scaling (Herstellung großer Mengen) Oral Regulatorische Hürden Kosten ……… Alternative Darreichungsformen zu Injektionen 3 Nanotechnologie Platform für Wirkstoffträger Liposomen Albumin Flüssigkristalle Nano-Kapsel Mizellen HS Nano-Kugeln S S S S SH Thiomere Protikel - Peptide ..... und viele mehr 4 Geschichte – Liposomen als Wirkstoffträger 1965 1970 Alec Bangham (1921-2010) Gregory Gregoriadis Liposomal Doxorubicin FDA approved 1995 1990 Danilo Lasic Demetrios Papahadjopoulos Yechezkel „Chezy“ Barenholz 5 Liposomen als Wirkstoffträgersysteme Warum Liposomen ? Phospholipid Moleküle Liposomen sind modulare selbstassemblierende Systeme amphiphil Hydrophile Kopfgruppe H2O Hydrophobe Ketten “plain“ Liposomen LUVMLV Large Multi Unilamellar Lamellar Vesicles Vesicles Wirkstoffe Kontrastmittel Zielfindungsmoleküle Signalgebende Moleküle Polymer Oberflächen6 Sterisch stabilisierte Liposomen Polymer Ummantelung Phospholipide: Phosphatidylcholine – Lecithin (EggPC, SoyPC, POPC, DPPC…) Phosphatidylethanolamin (DPPE, DOPE…..) Kationische oder anionische Phospholipide (DOTMA/DOTAP/DC-Chol oder PS/PA/PG…) CholesterinDSPE-PEG 2000 „Stealth Liposome“ PEGyliertes Phosphatidylethanolamin Wirkstoffbeladung(3-5 mol % DSPE – PEG2000) & „targeting“ 7 Funktionalisierte sterisch sterisch--stabilisierte Liposomen Wirkstoffe Signalgebende Gruppen Radionuklide : 111In, 68Ga MRI : Gd3+, Ironoxid- NPs Fluoreszenz Marker : e.g. Atto655 Regulatorische Peptide, Proteine oder Antikörper Zielmoleküle Passives Targeting EPR Effekt „enhanced permeation and retention“ Aktives Targeting Endothel Blutgefäß Basalmembran Marker Moleküle Gesundes Gewebe Erkranktes Gewebe: Tumor, atherosklerotischer Plaque…. Tumor Gewebe 8 Zellulärere Aufnahme von Liposomen Spezifische oder unspezifische Absorption Caveolin Clathrin Endosom Fusion Endozytose Lysosom Zytoplasma Lipidaustausch Pinozytose 9 Polymer Coating: Thiomer gecoatete Liposomen Kopplung von thiolierten Polymeren an funktionalisierte Liposomen CH2OH O H O H OH H H SH O O NH O O O N H N O P O O + Na H R1 R2 O O O O O thioliertes Chitosan maleimide-funktionalisiertes Phospholipid Orale Applikation: - verbesserte mucoadhäsive Eigenschaften erhöhen die orale Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen 10 Gradauer et al, J. Control.Release (2014) Herstellungsmethoden von Liposomen Lipide, funktionalisierte Lipide Markermoleküle Liposomen unterschiedlicher Größe in Puffer Hydratation Abdampfen & Vortex N2-Strom Lipidmischungen in organischen Lösungsmittel Chloroform/Methanol Beladung / Labelling Trockener Lipidfilm Vakuumtrocknung Homogenisieren - Beschallen Dispersion Suspension Freeze/thaw Größenextrusion Membranfilter mit definierter Porengröße z.B. sequentiell 400 nm, 200 nm, 100 nm Filter 11 Herstellungsmethoden von Liposomen Reversed phase separation, Ethanolinjektion .... Mikrofluidics - schnelles Mischen Einschrittsynthese Flussraten 2-12 ml/min Scale-up NanoAssemblr 12 Reinigung und Charakterisierung von Liposomen Reinigung : Liposome Suspension Dialyse Zentrifugation Chromatographische Methoden Charakterisierung : Chemische Charakterisierung Lipid Zusammensetzung / Lipid Integrität Dünnschichtchromatographie Lipidquantifizierung Enzymatische Assays, Anorganischer Phosphor Wirkstoff / Markerkonzentation HPLC/MS, Fluoreszenz Elektrophoresen …. 13 Biophysikalische Charakterisierung Größenmessung – Photonenkorrelationsspektroskopie Dynamische Lichtstreuung (Malvern Instruments) Oberflächenladung – Zetapotential Morphologie – Elektronenmikroskopische Methoden Morphologie / Form – Röntgenkleinwinkelstreuung (Small Angle X-ray Scattering, SAXS) Thermisches Verhalten – Differentielle Mikrokalorimetie (Differential Scanning Calorimetry, DSC) TEM 10000 1.5 (arb. units) I (arb. units) 8000 6000 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -40 -30 -20 -10 0 4000 10 20 30 40 DSC z (Å) 2000 0 SAXS 0.0 0.1 0.2 0.3 -1 q (Å ) 0.4 0.5 14 Nanopartikel Tracking Analyse - NTA Mikroskop Brown´sche Bewegung + Lichtstreuung Nanopartikel streuen das Laserlicht Nanopartikel in Lösung Laserstrahl (ca. 50 µm Durchmesser) Glas Metalloberfläche 15 Malvern Instruments Pharmazeutische Entwicklung Stabilität, Beladungseffizienz, Freisetzungsverhalten, Wirkung ……. Zellkultur, Biologische Barrieren, Proteincorona, zelluläre Aufnahme ….. Gezielte Freisetzung des Wirkstoffes pH sensitive Lipide Temperaturerhöhung Photoaktivierung Ultraschall Präklinische Validierung – geeignetes Tiermodell 16 hoch Krebs bakterielle Infektionen kardiovaskuläre Krankheiten Autoimmunerkrankungen mittel Wahrscheinlichkeit für Realisierung Anwendungbereiche & Umsetzung virale Infektionen Stoffwechsel krankheiten Alzheimer hoch mittel Potential Baumgartner und Jäckli, 2007 Teilweise in klinischer Phase und erste Produkte schon ambis Markt Therapiepotential und Realisierungswahrscheinlichkeiten 2020 17 Liposomale Produkte am Markt OH AmBisome ® (Gilead Sciences), Albelcet®(ELAN) : Pilzinfektion Membran interkaliertes Amphotericin B SUV, lyophilisiert Lipide : H-SPC (hydrogenated Soy PC), Cholesterin, DSPG O NH 2 O OH H O HO OH OH OH OH CO2H O OH O OH OH DaunoXome® (Gilead Sciences) : Krebstherapie enkapsuliertes Daunorubicin SUV, wässrige Suspension Lipide : DSPC, cholesterol Doxil® (ALZA), Caelix® (Janssen-Cilag), Myocet® (Enzon) : Krebstherapie enkapsuliertes Doxorubicin LUV, wässrige Suspension – Blutstabilität 4 Tage Lipide : MPEG-DSPE, H-SPC, Cholesterin Ammonium-gradient Wirkstoffeinbau http://www.nanopharmaceuticals.org/Liposomes.html 18 Bozzuto G., Molinari, A., (2015), Int.J.Nanomedicine 19 Bozzuto G., Molinari, A., (2015), Int.J.Nanomedicine 20 2015 21 Nanomedizin von „bench „bench to bedside bedside““ Vom Labor zur Klinik bis zum Market rechnet man mit 10-16 Jahren Clinical Phase IV Observation after approval Basic Research Drug screening, galenics Approval market PreclinicaL Studies in vitro in vivo animal Clinical Phase III Tolerance, large group of patients Clinical Phase I Tolerance, healthy individuals Clinical Phase II Tolerance, small group of patients Search /Optimization of a drug Preclinical Phase Nanomedicine Start-ups Clinical Phase I Clinical Phase II Clinical Phase III Pharmaceutical Industry Marketing Production 22 Acknowledgements 23
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