Übersicht Radikale - Gerd Wischnewsky | Home

zkm Zeitschrift für
Klinische Medizin
ÜBERSICHT
Z. Klin. Med. 42 (1987) Heft 12, S. 1021 - 1024
Aus dem Zentralinstitut für Molekularbiologie (Direktor: OMR Prof. Dr. med. habil. G.
Pasternak) der Akademie der Wissenschaften der DDR, Berlin-Buch und dem VEB BerlinChemie
Eigenschaften und Nachweis von biologisch relevanten Radikalen
Von WERNER DAMERAU und GERD WISCHNEWSKY
Zusammenfassung
Freie Radikale können im lebenden Organismus durch endogene und exogene
Ausgangsverbindungen gebildet werden und spielen vielfach bei der Ausbildung
pathologischer Prozesse eine wichtige Rolle. Das gilt insbesondere für das
Superoxidradikal •O₂⁻ und seine Folgeprodukte •HO₂ und •OH. In der vorliegenden
Übersicht werden chemische und physikalische Eigenschaften dieser Radikale sowie sich
daraus ergebende Möglichkeiten für ihren spezifischen Nachweis beschrieben.
Z. Klin. Med. 42 (1987), 1021-1024
Sachwörter
Freie Radikale, Superoxidradikal, Superoxiddismutase, Radikalnachweis, ESRSpektroskopie
Summary
Free radicals are formed in living systems by many endogenic or exogenic compounds
and play often an important role in the formation of diseases. This is especially true for the
superoxide radical •O₂⁻ and ist products •HO₂ and •OH. In this overview chemical and
physical properties of oxygen-derived radicals as well as possibilities for their specific
detection are described.
Manuskripteingang: 24.November 1986
Manuskriptannahme: 9. Dezember 1986
Anschrift der Verfasser: Dr. sc. nat. Werner Damerau, Zentralinstitut für Molekularbiologie
der Akademie der Wissenschaften der DDR, Robert-Rössle-Straße 10, Berlin, DDR - 1115
Einleitung
Die Bedeutung von freien Radikalen für viele großtechnisch genutzte chemische
Reaktionen, so bei der Fabrikation von Polymeren oder in der Farbenindustrie, ist seit
Jahrzehnten bekannt. Untersuchungen an freien Radikalen blieben aber sehr lange eine
Domäne von Chemikern und Physikern. Mit der Entdeckung von freien Radikalen als
Intermediaten des Stoffwechsels und insbesondere seit der Entdeckung der
enzymatischen Bildung (Bray u. Mitarb. 1969 [1]) und des enzymatischen Abbaus von
Sauerstoffradikalen (McCord und Fridovich, 1969 [2]) ist zunehmend das Interesse von
Biochemikern und Biologen geweckt worden. Seit etwa 1980 ist eine zunehmende Anzahl
von Befunden hinsichtlich der Schlüsselrolle von freien Radikalen bei einer Reihe von
pathologischen Prozessen zu verzeichnen, so daß auch der klinische Mediziner mit dem
Problem der Entstehung und des Nachweises freier Radikale und deren therapeutischen
Kontrolle konfrontiert wird.
In Hinblick auf ein besseres Verständnis der Rolle freier Radikale im
Stoffwechselgeschehen wird im folgenden ein Überblick gegeben über Bildung,
Eigenschaften und Nachweis freier Radikale, wobei Sauerstoffradikale als aktivierte
Sauerstoffspezies besonders berücksichtigt werden.
Natur und Besonderheiten freier Radikale
Freie Radikale sind definitionsgemäß Verbindungen mit einem oder mehreren
ungepaarten Elektronen (3). Diese Besonderheit unterscheidet sie von der überwiegenden
Mehrzahl organischer und anorganischer Verbindungen. Gegenwärtig sind rund 8000 freie
Radikale beschrieben (4). Als Prototyp ist das Wasserstoffatom •H anzusehen, das aus
dem Wasserstoffmolekül H:H gebildet werden kann.
Eine Einteilung wird oft nach der Lokalisierung des ungepaarten Elektrons getroffen.
Beispiele dafür sind:
C-Radikale •CH₃ (z.B. durch Bestrahlung von CH₃J)
CH₃•COOH (durch Oxidation von Ethanol)
N-Radikale •NH-NH₂
O-Radikale •OH (z.B. aus Fe²⁺ + H₂O₂)
S-Radikale •SO₂ (z.B. aus Na₂S₂O₄ + H₂O)
R-S• z.B. Oxidation von Thiolgruppen)
Weiter werden neben diesen neutralen Radikalen geladene Radikale unterschieden, d.h.
positiv geladene Radikalkationen (häufig bei der Oxidation polycyclischer aromatischer
Kohlenwasserstoffe) und Radikalanionen wie das durch Reduktion von O₂ entstehende
Superoxidradikalanion •O₂⁻ (im weiteren vereinfacht als O₂⁻ geschrieben).
Das ungepaarte Elektron in in solchen Radikalen besitzt die Neigung, durch Paarung mit
einem anderen ungepaarten Elektron eine stabile Elektronenkonfiguration auszubilden.
Hieraus erklärt sich die hohe Reaktivität und Instabilität vieler Radikale. Radikale müssen
jedoch nicht zwangsläufig instabil sein. Vielmehr wird ihre Stabilität beeinflußt durch a) den
Molekülaufbau des betreffenden Radikals, b) das Milieu, in dem sich das Radikal befindet.
Zu a): Die Stabilität wird erhöht, wenn wie in dem nachstehenden Radikal
(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)
eine elektronische Stabilisierung durch Doppelbindungen und Elektronenpaare auftritt oder
wenn wie in (CH₃)₃C-•N-C(CH₃)₃
↓
O
(Di-tert.-butylnitroxid)
eine räumliche Stabilisierung vorhanden ist (sterische Hinderung von Reaktionen an der
•NO-Gruppe durch die sperrigen tert.-Butylgruppen).
Zu b): Temperatur, Art des Lösungsmittels und pH sind die wichtigsten Milieufaktoren. so
kann die Lebensdauer von bei Zimmertemperatur kurzlebigen Radikalen durch "Einfrieren"
der Radikallösung beträchtlich erhöht werden, und die Lebensdauer von O₂⁻ kann bei
Verwendung von aprotischen Lösungsmitteln sogar viele Stunden betragen (5).
Trotz hoher Reaktivität vieler Radikale besitzen diese beträchtliche Selektivität. So reagiert
z.B. Dimethylsulfoxid mit •OH vornehmlich durch Angriff am Schwefelatom (6) nach
CH₃-SO-CH₃ + •OH → CH₃-SOO•, •CH₃.
Das letztere Beispiel zeigt auch, daß durch Radikale radikalische Folgeprodukte gebildet
und Radikalkettenreaktionen ausgelöst werden können.
Eine Besonderheit freier Radikale ist ihr Paramagnetismus, der durch den
Eigendrehimpuls (Spin) des ungepaarten Elektrons als folge der Erzeugung eines
magnetischen Feldes durch Bewegung eines elektrischen Feldes hervorgerufen wird. Bei
Spinpaarung der Elektronen, wie sie in "normalen" Molekülen erfolgt, ist dagegen kein
magnetisches Feld vorhanden, d,h, diese Moleküle sind diamagnetisch. Mit Hilfe
magnetischer Meßmethoden kann somit zwischen paramagnetischen und
diamagnetischen Molekülen unterschieden werden.
Methoden zum Nachweis freier Radikale
Zu unterscheiden sind indirekte Nachweise, die auf chemischen Reaktionen eines
betreffenden Radikals und dessen Identifizierung anhand der entstandenen Produkte
beruhen (chemisch-analytischer Nachweis), und direkter Nachweis mittels
physikochemischer Methoden. Dem direkten Nachweis wird häufig wegen der hohen
Empfindlichkeit der anwendbaren Techniken der Vorzug gegeben. Der direkte Nachweis
von Radikalen kann erfolgen
a) optisch über das UV/VIS-Absorptions- oder Ramanspektrum,
b) mit einer magnetischen Waage
c) mittels Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie.
Zu a): Das Prinzip des optischen Nachweises ist allgemein bekannt und UV/VISSpektrometersind leicht zugänglich. So lassen sich z.B. O₂⁻-Radikale in Wasser bei λmax = 245 nm messen (7). Probleme ergeben sich allerdings, wenn wegen
Kurzlebigkeit der Radikale kurzzeit-spektroskopische Messungen erforderlich werden. In
diesem Falle wird vielfach versucht, Indizien für die Bildung von Radikalen über die
optische Messung ihrer Folgeprodukte zu erhalten. Ein typisches Beispiel dafür ist der
Thiobarbitursäure-Test zur Charakterisierung der Fettsäureperoxidation. Eine kritische
Diskussion dieses Nachweises ist in (7) zu finden. Ein genereller Nachteil der UV/VISSpektroskopie ist, daß sie an die optische Transparenz des zu untersuchenden Systems
gebunden ist und die optische Absorption aller bei der untersuchten Wellenlänge
absorbierenden Moleküle mißt. In komplexen biologischen Systemen wird dadurch ein
Radikalnachweis unmöglich.
Zu b): Die magnetische Waage besitzt den Vorteil hoher Meßgenauigkeit, ist aber wenig
empfindlich (Grenzkonzentration etwa 1 mM) und nicht auf kurzlebige Radikale
anwendbar.
Zu c): Die Methode der Wahl für den Nachweis von Radikalen ist die ESR-Spektroskopie
(8,9), die ausschließlich auf paramagnetische Spezies anspricht, nicht auf optische
Durchlässigkeit der Probe angewiesen ist, keine Beeinträchtigung des untersuchten
Systems verursacht und eine hohe Empfindlichkeit aufweist (Grenzkonzentration 10⁻⁸ M).
Probevolumina sind mit 100-200 µl gering.
Abb. Prinzip des elektronenspinresonanzspektroskopischen Nachweises von freien Radikalen
Das ESR-Prinzip ist in der Abbildung skizziert. Ein ungepaartes Elektron verhält sich
wegen seines Elektronenspins wie ein kleiner Magnet. Wird die Probe in ein Magnetfeld H₀
eingebracht, so erfolgt Ausrichtung dieser ungeordneten Elementarmagnete parallel oder
antiparallel zur H₀-Richtung. Durch elektromagnetische Strahlung geeigneter Energie E = hν wird unter Energieabsorption eine Umordnung der ausgerichteten Teilchen erreicht.
Im Experiment wird bei gleichbleibender Wellenlänge (in der Praxis zumeist etwa 3 cm)
das Magnetfeld H₀ geändert, bis Energieabsorption erfolgt und ein Absorptionsspektrum
erscheint, das zur besseren Auflösung von Spektrendetails gewöhnlich in der 1. Ableitung
aufgezeichnet wird. Enthält ein Radikal in der Nähe des ungepaarten Elektrons Atomkerne
mit einem Kernspin ungleich Null (z.B. H, N. P, Cl), so werden durch diese Kernspins
zusätzlich zu H₀ geringe Felder induziert, die zu einer Strukturierung (Hyperfeinstruktur
Hfs)des Absorptionsspektrums führen. Diese Hfs läßt die Identifizierung von Atomkernen
in einem nachgewiesenen Radikal und damit die Aufklärung der Radikalstruktur zu.
Insgesamt können mit der ESR folgende Informationen erhalten werden:
- Vorhandensein von Radikalen
- Radikalkonzentration
- Art und Struktur der Radikale
- Bildungs- und -Zerfallskinetik von Radikalen
- Umgebung eines Radikals (z.B. Hydrophobizität der Umgebung)
- Beweglichkeit eines Radikals (Rotationsdiffusion, laterale Diffusion).
Die ESR-Messung kurzlebiger Radikale kann durch Anwendung von Kurzzeit-, Durchflußund Spin trap- Techniken erreicht werden. Bei biologischen Systemen einschließlich
intakten Zellen hat sich die Spin trap-Technik bewährt (10, 11). Sie beruht auf dem Einfang
kurzlebiger Radikale durch diamagnetische Nitrosoverbindungen und Bildung eines
langlebigeren paramagnetischen Addukts, das mittels ESR identifiziert werden kann, z.B.
(CH₃)₃C-NO + •CH₃ → (CH₃)₃C-•N-CH₃
↓
O
In biologischen Systemen verwendete Spintraps sind
Bildung von Radikalen in biologischen Systemen
Radikale können im Organismus aus einer Vielzahl von Verbindungen entstehen (7,
12-15). Als Beispiele sind zu nennen endogene Ausgangsverbindungen
- Hydrochinone, Chinone → Semichinonradikale
- Vitamin C → Ascorbatradikale
- Vitamin E → Tocopherylradikale
- Tyrosinderivate
→ Melanin
- Lipide (z.B. Arachidonsäure)
→ Lipidperoxyradikale
- Metallionen wie Fe²⁺ + H₂O₂
→ •OH
- Xanthinoxydase (XOD)/Xanthin → •O₂⁻
- NADPH-oxidase → •O₂⁻
- Hämoglobin
→ •O₂⁻
- Peroxidasen
→ Substratradikale
exogene Ausgangsverbindungen
- Nitrit
→ •O₂⁻
→ •O₂⁻
- verschiedene Arzneimittel
→ •O₂⁻
- Psoralenderivate einschließlich versch. Antibiotika
- Tetrachlorkohlenstoff
→ CCl₃O•₂
- Paraquat
- hyperbarer Sauerstoff
→ •O₂⁻
Hinzu kommen physikalische Noxen wie UV- und Röntgenstrahlung.
Bei vielen physiologischen Prozessen, so in der Elektronentransportkette von
Mitochondrien (12) und in der Phagozytose (17) tritt O₂⁻ auf. Nach Fridovich (18) werden
etwa 5 % des aufgenommenen Sauerstoffs in O₂⁻ umgewandelt. O₂⁻ ist somit als
natürliches Stoffwechselprodukt von O₂ anzusehen. Die Gleichgewichtskonzentrationen im
Organismus sind allerdings gering (in der Leber 10⁻¹² - 10⁻¹¹ M O₂⁻ [19] im Vergleich zu 10⁻⁹
- 10⁻⁷ M H₂O₂ [20]). O₂⁻-Überschuß kann bei Entgleisungen des aeroben Stoffwechsels oder
als Unglücksfall (Einnahme O₂⁻-generierender Verbindungen) auftreten und durch
Folgeprodukte des O₂⁻ zu Schädigungen führen (7, 13, 21-23). Eine Reihe von Krankheiten
wird mit erhöhter O₂⁻-Produktion in Zusammenhang gebracht (24-27). Dementsprechend
sind Konzepte zur Prevention oder Therapie bestimmter Erkrankungen mittels
Superoxiddismutase (SOD) in der Diskussion (28). SOD, ein Cu²⁺-haltiges Enzym, zersetzt
O₂⁻ zu H₂O₂ und O₂ (2). SOD wird bei Entzündungsprozessen bereits therapeutisch
angewendet (28-30), und es gibt Ansätze für den Einsatz von SOD-Mimetika (31-34).
Sauerstoffradikale als aktivierte Sauerstoffspezies
Molekularer Sauerstoff ist an sich reaktionsträge und bedarf vielfach einer Aktivierung.
Aktivierte Sauerstoffspezies sind O₂⁻ und seine protonierte Form •HO₂, •OH und
Peroxyradikale R-OO• sowie Wasserstoffperoxid H₂O₂ und Singulettsauerstoff ¹O₂. Alle
diese Spezies sind leicht ineinander überführbar, so daß sie in komplexen Systemen
häufig nebeneinander vorliegen und ein spezifischer Nachweis dringend erwünscht ist.
Das Superoxidradikal O₂⁻, das in Modellsystemen relativ leicht herstellbar ist (35), erweist
sich nicht als so "super", wie es seine Bezeichnung vermuten lassen könnte. O₂⁻ ist eine
schwache Base (O₂⁻ + H⁺ → HO₂•, pKₐ 4,7), so daß das Verhältnis O₂⁻ / HO₂• bei pH 6,8
etwa 100 : 1 beträgt (7). O₂⁻ ist ein sehr schwaches Oxidationsmittel und kann z.B. NADH
nicht oxidieren (im Gegensatz zu HO₂•). O₂⁻ ist dagegen ein Reduktionsmittel, z.B.
gegenüber Fe³⁺. Auch kann O₂⁻ durch Protonenentzug reagieren und beispielsweise aus
Tocopherol radikalische Folgeprodukte bilden.
Die kurze Lebensdauer ist von O₂⁻ in Wasser ist durch seine Dismutation zu erklären:
2 O₂⁻ + 2 H⁺ → H₂O₂ + O₂
Diese Gleichung verweist auf die pH-Abhängigkeit der Reaktion (bei pH 7 ist
k = 5•10⁵ M⁻¹s⁻¹, bei pH 11 k = 10² M⁻¹s⁻¹) und impliziert, daß jedes wäßrige O₂⁻generierende System notwendigerweise H₂O₂ produziert. H₂O₂ stellt selbst ein Zellgift dar
und bildet mit oxidierbaren Metallionen nach Art der FENTON-Reaktion (Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + OH• + OH⁻) sehr reaktive •OH-Radikale. Als weiteres reaktives
Agens kann ¹O₂ aus der Reaktion von H₂O₂ mit O₂⁻ gebildet werden (36). Abhängig vom
Substrat ist die Reaktivität für diese Spezies •OH > ¹O₂ > O₂⁻.
Die Tabelle faßt einige Methoden zum Nachweis von O₂⁻ zusammen (nach [37]). Alle
genannten Methoden haben Vorzüge und Nachteile. So spricht der häufig verwendete
Cytochrom c-Test auf O₂⁻ als Reduktionsmittel an, so daß andere Reduktionsmittel wie
Ascorbat stören (37). Der Spin trap DMPO gestattet anhand der ESR-Spektren eine
zuverlässige Unterscheidung zwischen O₂⁻, HO₂• und •OH (38, 39). Ein Nachteil ist hier
jedoch der sehr langsame Einfang von O₂⁻ (O₂⁻ kann sich durch schnellere
Konkurrenzreaktionen dem Einfang durch DMPO entziehen) sowie der Zerfall von DMPO-O₂⁻ in DMPO-OH in wäßriger Lösung, wodurch ein Einfang von •OH vorgetäuscht
werden kann (11). Eine Kombination verschiedener Methoden ist daher angebracht.
Tabelle Methoden zum Nachweis von O₂⁻ (nach [37])
Methode
Geschwindigkeitskonstante
[M⁻¹s⁻¹] _______________________________________________________
Spin trapping mit DMPO 10
(bei O₂⁻)
6,6•10³
(bei HO₂•)
~ 10⁹
(bei •OH)
Adrenochrom
5,6•10⁴
Cytochrom c 6•10⁶
Formazan-Bildung aus Nitroblautetrazoliumchlorid
SOD
Lumineszenz
Anionenbildung aus C(NO₂)₄
2•10⁹
_______________________________________________________
Schlußbemerkungen
Gegenwärtig ist ein enorm gewachsenes Interesse an der biologischen Rolle von freien
Radikalen und besonders von Sauerstoffradikalen zu verzeichnen. Das wird durch eine
zunehmende Anzahl von Publikationen in biochemischen und medizinischen Zeitschriften
belegt (vgl. auch [7, 12, 13, 17, 23, 40, 41]). Gestiegen ist dadurch auch das Interesse an
spezifischen Nachweismethoden und Modellsystemen, die insbesondere in Hinblick auf
die Erprobung des therapeutischen Einsatzes von Radikalfängern und Radikaldismutierenden Verbindungen an Bedeutung gewinnen werden.
Literatur kann beim Verfasser angefordert werden.
Резюме
В живом организме свободные радикалы могут обрадоваться эндогенными и
экзогенными исходными соединениями и нередко играют важную роль при
образовании патологических процессов. Это действительно особенно для
радикала переписи •O₂⁻ и его следящих продуктов HO₂• и •OH. В настоящем обзоре
описываются химические и физические свойства этих радикалов и связанные с
этим возможности для их специфического выявления.
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