Layer-by-Layer-Polyelektrolytbeschichtungen für die kontrollierte

Layer-by-Layer-Polyelektrolytbeschichtungen für die kontrollierte Zelladhäsion
Biomedizinische Wissenschaften; Labor Biomaterialien; Sommersemester 2015
Saskia Alber, Carolin Drees, Stefanie Schwaiger
Einführung
Zelladhäsion:
Zellen in Geweben und Organen stehen in engem Zell-Zell- bzw.
Zell-Matrix-Kontakt. Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein
komplexes Geflecht aus Makromolekülen zu denen
Faserproteine und Proteoglykane gehören. Ohne Verankerung
an der ECM, neigen viele Zellen zur Apoptose. Im Körper
eingesetzte Biomaterialien stellen sich der Aufgabe, einen
geeigneten Zell-Biomaterial-Kontakt zu erzielen und die Zellen
nicht zu schädigen, sondern ggf. deren Wachstum zu fördern.
Layer-by-Layer-Technik:
Das Layer-by-Layer-Verfahren ist ein Beschichtungsverfahren, bei
welchem entgegengesetzt geladene kationische bzw. anionische
Polyelektrolyte auf ein Substrat aufgetragen werden. Die Anzahl
der Beschichtungszyklen und Ionenbedingungen in der Lösung
bestimmen hierbei die Schichtdicke des Polymerfilms. Aufgrund
der Entropiezunahme und elektrostatischer Selbstorganisation
(ESA) entsteht ein stabiles monomolekulares Schichtsystem.
Abbildung 1: Molekulare Darstellung der Beschichtungen
Ziel ist es mit Hyaluronsäure und Poly-L-Lysin modifizierte PSS (Polystyrolsulfonat) /PAH (Polyallylamin-Hydrochlorid)
LbL-Beschichtungen herzustellen und dessen Biokompatibilität anhand von
HUVEC´s (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) zu untersuchen.
Materialien und Methoden
Layer-by-Layer-Verfahren und Charakterisierungs-Methoden:
Die Polyelektrolytbeschichtungen wurden mittels Tauchverfahren auf zwei Mikrotiterplatten
(Abbildung 2), 12 Polystyrolplättchen und 8 Wafer-Plättchen aufgetragen. Dabei sind PSS und
Poly-L-Lysin die Polyanionen und PAH und Hyaluronsäure die Polykationen. Mittels
Kontaktwinkelmessung wurde dessen Benetzbarkeit ermittelt und durch die Ellipsometrie
wurde die Schichtdicke der Beschichtungen bestimmt.
Abbildung 2: Makroskopische Übersicht des Tauchverfahrens
Abbildung 3:
Beschichtungsmuster
Biokompatibilität und Charakterisierung-Methoden der HUVEC´s:
Zur Ermittlung der Biokompatibilität wurden die HUVEC´s
auf den beschichteten Mikrotiterplatten ausgesät. Die
Biokompatibilität der Beschichtungen wurde untersucht
mittels mikroskopischer Betrachtungen, einem Resazurintest
und einem Glucose-Test. Hierbei wurde die
Stoffwechselaktivität der HUVEC´s ermittelt und anhand der
mikroskopischen Betrachtungen könnte das Proliferations-,
Adhäsions-, Differenzierungsverhalten und die Morphologie
der Zellen auf den unterschiedlichen Beschichtungen
betrachtet werden.
Abbildung 4: Resazurin Testprinzip
Ergebnisse
Schichtdicke in nm
Physikalische Charakterisierung der Polyelektrolyt-Beschichtungen:
Kontaktwinkelmessung:
Durch die Kontaktwinkelmessung hat sich
gezeigt, dass die PSS/PAH-Beschichtung die
am hydrophobsten ist, da hier der Kontaktwinkel im Mittel 80,6° betrug, darauf folgte
die Poly-L-Lysin-Beschichtung mit 78,6° und
am hydrophilsten war die mit Hyaluronsäure
Modifizierte Beschichtung mit einem Kontaktwinkel von 33,7°. Als Vergleichswert diente
der Kontaktwinkel der unbeschichteten
Plättchen mit 63,3° im Mittel.
Ellipsometrie-Messung:
Wie graphisch dargestellt (Abbildung 8) zeigte
Ellipsometrie-Messergebnisse
sich durch die Schichtdickenmessung mittels
16
Ellipsometer, dass die PSS/PAH-Wafer mit
13,43
14
11,56
11,18
12
einer mittleren Schichtdicke von 13,43 nm
10
die größte Schichtdicke besaßen. Die mit
8
PSS/PAH₆
6
Hyaluronsäure beschichteten Wafer folgten
PSS/PAH₅,₅ + Hyaluronsäure
4
PSS/PAH₆ + Poly-L-Lysin
mit einer Schichtdicke von 11,56 nm. Die
2
0
dünnste Polyelektrolytschicht von 11,18 nm
PSS/PAH₆
PSS/PAH₅,₅ + PSS/PAH₆ + PolyHyaluronsäure
L-Lysin
Wurde auf den Wafern gemessen, die mit
Beschichtungsvarianten
Poly-L-Lysin beschichtet wurden.
Zellbiologische Untersuchungen der HUVEC´s:
Resazurin-Test:
Die Zellen aus den unbeschichteten Wells zeigten die
höchste Stoffwechselaktivität. Die Zellen in den
beschichteten Wells waren weniger aktiv.
Mikroskopische Betrachtungen:
Anhand der Konfluenz und Morphologie der HUVEC´s
zeigte sich bei der mikroskopischen Betrachtung, dass
die Zellen auf den unbeschichteten Wells am besten
proliferierten und adhärierten.
Glukose-Test:
In den unbeschichteten Wells wurde am
meisten Glucose verbraucht und die Zellen
zeigten die größte Viabilität und Konfluenz.
Bei den anderen Beschichtungen ist die
Abnahme der Glucose ebenfalls gut
ersichtlich jedoch deutlich geringer.
Abbildung 8: Graphische Darstellung der
Ellipsometrie-Messergebnisse
Abbildung 9: Graphische Darstellung der
Resazurin-Messergebnisse
Abbildung 14: Graphische Darstellung der
Glucose-Messergebnisse
Diskussion
Die bessere Adhäsion durch Verwendung natürlicher Polyelektrolyte konnte in diesem Projekt leider nicht erreicht werden. Jedoch zeigte sich für die mit Poly-L-Lysin modifizierte Oberfläche eine ähnlich
positive Zellviabilität wie bei den PSS/PAH-beschichteten Materialien. Hyaluronsäure als Polyelektrolytbeschichtung erwies sich als ungeeignet da diese die geringste Zellviabilität und Beschichtungsdicke
aufwies. Dies ist vermutlich auf die gute Wasserlöslichkeit zurückzuführen und somit erfüllt Hyaluronsäure nicht die geeigneten Eigenschaften für eine stabile Polyelektrolytschicht. Um aussagekräftigere
Daten zu erhalten sollten die Versuche mehrmals wiederholt werden. Zudem könnte durch Anwendung mehrerer Beschichtungsverfahren, z.B. dem Spray-Verfahren, das Auftragen der Polyelektrolyte
ggf. optimiert werden.
Quellen:
Labor Biomaterialien; Projektbericht
http://www.pharmacelsus.de/uploads/RTEmagicC_Resazurin.jpg.jpg

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