Reinigung und Analytik

Reinigung und Analytik
1. Reinigung
RP-HPLC
2. Aminosäureanalytik
3. Sequenzierung
Edman-Abbau
Massenspektrometrie
-44-
Reinigung synthetischer Peptide
Typischer Synthesemaßstab
10 - 200 :mol (10mer Peptid: ca. 1 - 200 mg)
K Flüssigchromatographie
1. Ausschlusschromatographie (SEC)
•
Entsalzung (Kartusche)
•
niedriger Salzgehalt, flüchtige Puffer
•
entfernt effektiv: Salze, Scavenger, Schutzgruppen,
Lösungsmittel
aber nicht: Fehlsequenzen, partiell geschützte Peptide
•
hohe Wiederfindungsrate
•
niedrige Auflösung
•
geringe Kosten
•
relativ geringer apparativer Aufwand
•
auch auf größere Peptidmengen anwendbar
Anwendungsbeispiel
•
Peptide mit wenigen Fehlsequenzen
•
Probenvorbereitung für biologische Testsysteme falls
Reinheit ausreichend
•
Reinheit: ca. 70-80%
-45-
2. Ionenaustauschchromatographie (IEC)
Basische Peptide: Kationenaustauscher
Arginin, Histidin, Lysin und N-Terminus
Saure Peptide:
Anionenaustauscher
Asparagin- und Glutaminsäure, C-Terminus
Viele Peptide können über beide Ionenaustauscher getrennt
werden
Trennung durch Retention positiv oder negativ geladener
Gruppen an der stationären Phase
Vorteile:
•
Relativ hohe Auflösung
•
Für kurze und lange Peptide geeignet
•
Zur Reinigung von Phosphopeptiden
Nachteile:
•
Apparativer Aufwand (HPLC)
•
Gradienten (lange Trennzeit)
•
Teure Säulen (insbesondere für größere Mengen)
•
Peptide enthalten Salze
Problem: Peptidmenge schwierig bestimmbar
Meist folgt eine Entsalzung (z.B. SEC)
-46-
3. Umkehrphasen
Hydrophobe Wechselwirkung
Polare Peptide werden eventuell nicht retardiert
>6mer Peptide werden meist retardiert
Stationäre Phase: C18 (C8)
Eluenten: meist Wasser/Acetontril-Gradient
Elutionsreihenfolge: nach zunehmender Hydrophobizität
Zusatz von Ionenpaareagenzien:
Ionenpaar-Reagenzien
Säuren
•
Essigsäure, Ameisensäure
•
Trifluoressigsäure (TFA), Heptafluorobuttersäure (HFBA)
K Silika-Phasen: Si-OH nicht deprotoniert !
Basen (selten für Peptide)
•
Triethylamin (TEA)
•
Tetramethylammonium (TMA)
•
Tetrabutylammonium (TBA)
•
Triethylammoniumacetat (TEAA)
-47-
Konzept
1. Ionenpaar
Wird in Lsg. gebildet und bindet an stationäre Phase
+
SM
+ PM− ↔ ( S + P − ) M
Ionenpaar in Lösung
Wechselwirkung
(S + P− ) M ↔ (S + P− ) S
2. Dynamischer Ionenaustauscher
Ionenpaarreagenz bindet an stationäre Phase, Ionische Ww
Ionenpaarreagenz bindet:
PM− ↔ PS−
Ionische Wechselwirkung
+
SM
+ PS− ↔ ( S + P − ) S
-48-
RP-HPLC
Vorteile:
•
Hohe Auflösung (Typische Reinheit: 95% bis 98%)
•
Trennung nach Hydrophobizität (Schutzgruppen)
•
auch große Peptide werden eluiert
•
Problem: sehr hydrophobe Peptide (C4-Phase)
•
Fehlsequenzen werden abgetrennt (#30 Reste)
•
Gradient dem Trennproblem anpassen
•
Hohe Wiederfindungsrate
•
Flüchtige Eluenten (Lyovac, Speedvac)
Nachteile:
•
hoher apparativer Aufwand (HPLC, UV-Detektor)
•
teure Säulen
•
Acetonitril ist toxisch
Reinheitskontrolle:
•
oft mit RP-HPLC (nicht orthogonal!)
Eluent, Ionenpaarreagenz, stat. Phase variieren
•
Massenspektrometrie (Fehlsequenzen (Deletion) und
partiell geschützte Peptide können identifiziert werden)
•
Ionenaustauschchromatographie
•
Kapillarelektrophorese (selten)
-49-
Aminosäureanalyse: Saure Hydrolyse
Moore (1963)
•
6 mol/L HCl, 110/C, 24 h unter Ausschluss von Sauerstoff
Kompromiss zwischen Freisetzung und Stabilität der
Aminosäuren
•
Ile-Val, Val-Val, Ile-Ile Bindungen sehr stabil (bis zu 96 h)
•
10-40% Verlust an Serin, Threonin und Methionin
•
50-100% Verlust an Cystein, Tryptophan,
Phosphoaminosäuren
•
Hydrolyse von Asparagin und Glutamin (Asp, Glu)
Bei der Hydrolyse werden am leichtesten Kontaminationen
eingebracht:
•
Oberflächen, Gefäße, Lösungsmittel
Gasphasenhydrolyse:
•
Reduktion der Verunreinigungen
•
sensitivere Analysetechnik
•
Standardbedingungen: 4 h bei 145/C oder 1,5 h bei 165/C
Sauerstoffausschluss (evakuieren + Stickstoff einleiten)
•
reduziert Verluste von Methionin und Tryptophan durch
Oxidation
•
Zusatz von Antioxidantien: 1% Phenol, 0,5%
Thioglykolsäure, 0,1% 2-Mercaptoethanol
Mikrowellenhydrolyse: Hydrolysezeit von wenigen Minuten!
-50-
Aminosäure-Derivatisierung
Ideales Derivatisierungsreagenz
•
reagiert mit primären und sekundären Aminen
•
quantitative reproduzierbare Reaktion
•
nur ein Reaktionsprodukt pro Aminosäure
•
sensitive Detektion (Absorption, Fluoreszenz)
•
Reagenz soll Analytik nicht stören
•
„milde” Reaktionsbedingungen
Nachsäulenderivatisierung
•
Trennung der freien Aminosäuren (Ionenaustauscher)
•
Derivatisierung nach der Säule aber vor dem Detektor
-51-
Ninhydrin
•
Reaktionsschleife, 120/C
•
Detektion bei 570 nm (Nachweisgrenze: 50 pmol)
•
Prolin ergibt ein gelbliches Produkt (440 nm)
•
Identifizierung über die Retentionszeit
•
Ionenaustauscher (Salz- und pH-Gradient kombiniert)
A. Bildung der Schiffschen Base
O
O
OH
OH
R
R
-2 H2O
+ H2N
CO2H
H
N
pH 8-9
O
Ninhydrin
H
O
OH
B. Decarboxylierung
R
-CO2
N
Aldimin
H
+H+
O
OH
C. Hydrolyse
+H2O
NH2
O
O
O
+ Ninhydrin
N
-H2O,
CO2H
-H+
O
O
Ruhemanns Violett
-52-
+
O
R
H
ortho-Phthaldialdehyd (OPA)
•
reagiert nur mit primären Aldehyden
•
fluoreszierendes Isoindol-Derivat
Anregung 330 nm, Emission 460 nm
UV-Absorption bei 330 nm
•
Raumtemperatur; pH 9,5; Reaktionszeit: wenige Minuten
•
Sekundäre Amine reagieren nicht
•
Nachweisgrenze 50 pmol (Fluoreszenz)
O
S
H
H
+
R
NH2
+
R'
SH
-2 H2O
R'
N
O
Vorsäulenderivatisierung:
K RP-HPLC
•
polare Aminosäuren werden deutlich hydrophober
•
kurze Trennzeiten (15 min)
•
höhere Sensitivität durch Chromo- und Fluorophore
•
Nachweisgrenzen: Fluoreszenz > 50 fmol (UV > 10 pmol)
•
meist vollständig automatisiert
•
2-Mercaptoethanol, Ethanthiol, 3-Mercaptopropionsäure
•
je nach Thiol unterschiedliche Hydrophobizität und
Stabilität
-53-
R
Phenylisothiocyanat (PITC)
•
reagiert mit primären und sekundären Aminen
•
alkalische Bedingungen, Reaktionszeit 20 min
•
Phenylthiocarbamoylderivate der Aminosäuren sind relativ
stabil
•
in RPC keine störenden Nebenprodukte der Aminosäuren
•
Detektion bei 254 nm
•
Nachweisgrenze: 1 pmol (UV)
R
N
C
S
+
H2N
R
CO2H
H
N
H
C
S
CO2H
N
H
H
Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-chlorid
•
reagiert sehr schnell mit primären und sekundären Aminen
•
Absorption bei 260 nm
•
Fluoreszenz bei 310 nm (Anregung: 260 nm)
•
Detektionsgrenze: 50 fmol (Fluoreszenz)
-54-
Enantiomere
Chirale Reagenzien
•
Enantiomerenanalyse
•
chirale Reagenzien: Bildung von Diastereomeren
(+)-1-(9-Fluorenyl)-ethylchlorformiat (FLEC)
•
Reaktion ähnlich wie Fmoc
•
Bedingungen: Boratpuffer pH 6,8; Raumtemperatur;
wenige Minuten
•
RP-HPLC (C8 oder C18-Phasen)
•
Detektion bei 254 nm (UV-Absorption) oder
Fluoreszenz bei 315 nm (Anregung: 260 nm)
Chirale stationäre Phasen
•
diastereomere Komplexe zwischen chiraler stationärer
Phase und Aminosäure-Derivat
Problem:
Racemisierung der Aminosäuren bei saurer Hydrolyse (1-5%)
-55-
Quantifizierung
Nullwertanalyse
Hintergrund in Lösungsmittel, Gefäßen usw. abziehen
Analyse ohne Probe
Interne Standards
Norleucin, $-Alanin in definierter Menge der Probe zusetzen
korrigiert Verluste der einzelnen Analyseschritte
Korrekturfaktoren
unvollständige Hydrolyse
hydrophobe Aminosäuren, Val-Val, Leu-Leu, Ile-Ile usw.
Hydrolyse bei 24, 48 und 72 h, Extrapolation auf 100 h
Zerstörung der Aminosäuren
Serin, Threonin, Tryptophan usw.
Hydrolyse bei 24, 48 und 72 h, Extrapolation auf 0 h
Unvollständige Derivatisierung
Mehrere Peaks pro Aminosäure (z.B. Cystein)
-56-
Probleme - Randbedingungen
Aminosäure
Effekte
Saure Hydrolyse
Glu, Ser, Gly
Kontaminationen in Lösungsmitteln, Gefäßen
Thr, Ser
langsam zerstört
Trp, Cys, Asn,
Gln
Nahezu komplett zerstört
Tyr, Met
Werden oxidiert
Val, Ile, Leu
hydrophobe Bindungen hydrolysieren
langsam
Vorsäulenderivatisierung
Pro
Geringe Ausbeute, schlecht zu quantifizieren
Nachsäulenderivatisierung
Asp, Glu
Sehr starke Signale, schwer zu quantifizieren
Oft Nebenprodukte
Allgemein
Matrixeffekte stören die Quantifizierung
-57-
Eigenschaften wichtiger Reagenzien
Reagenz
Detektion
Nachweisgrenze
Analysezeit
Reaktion
Ninhydrin
UV 570 nm,
50 pmol
80 min
prim./sek. Amine
10 pmol
30 min
prim./sek. Amine
90 min
prim. Amine
440 nm
PITC
UV 245 nm
Fluorescamin
Fluoreszenz
390 nm/475 nm
Dabsyl-Cl
UV 436 nm
1 pmol
30 min
prim./sek. Amine
OPA
UV 360 nm
10 pmol
30 min
prim. Amine
Fluoreszenz
50 fmol
30 min
prim./sek. Amine
330 nm/460 nm
Fmoc
Fluoreszenz
50 fmol
266 nm/305 nm
-58-
Edman-Sequenzierung
Reaktion:
Abbau der jeweils N-terminalen Aminosäure
Kopplung
R
C
N
S
+
H2N
Peptid
N
H
Me3N
Phenylisothiocyanat (PITC)
C
S
CO2H
N
H
H
Spaltung
H
N
H
N
R
NH2
H
N
TFA
R'
N
R
O
S
S
NH
R'
+
O
Konvertierung
H
N
O
N
R
S
O
TFA
R
N
H2O
S
N
H
Phenylthiohydantoin (PTH)
Zyklische Reaktionsführung
Reaktor: Kopplung + Spaltung
Konvertierung separat (danach RP-HPLC Analytik)
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O
Edman-Abbau: Prinzip
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Auswertung
Wiederfindungsrate
-61-
Beispiel
-62-
Beispiel
-63-
Geräte-Aufbau
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Edman-Abbau: Probleme
Einige Aminosäuren werden partiell zerstört
(Von Position abhängig)
Serin bis zu 80% (Dehydratisierung)
Threonin bis zu 50% (Dehydratisierung)
Cystein nahezu quantitativ (Derivatisierung)
Tryptophan etwa 30% bis 100% (nach vielen Zyklen)
Arginin und Histidin werden nicht quantitativ aus dem Reaktor
transferiert (Polarität)
Peptidbindung zu Prolin (Iminosäure) wird nicht quantitativ
gespalten
Hydrolyse von Proteinketten:
Peptidbindung
% Spaltung pro Zyklus
X-Ser-X
0,1-0,15%
X-Ser-Thr
0,35%
X-Thr-X
0,25-0,5%
X-Asp-Pro
?
X-Asp-X
0,02%
Andere
<0,02%
-65-
Massenspektrometrie (MS)
Schonende Ionisierungsmethoden
Elektrospray-Ionisierung (ESI-MS)
auch RPC-ESI-Kopplung (on-line) möglich
geringer Probendurchsatz
Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI-MS)
hoher Probendurchsatz
automatisierbar
Bestätigung des Molekulargewichts
fehlende Aminosäure und geschützte Peptide identifizieren
Analyse der RP-HPLC Fraktionen nach Reinigung
Massendifferenz > 50
Bestätigung der Sequenz
Tandemmassenspektrometrie
•
Peptidkette wird an Peptidbindung gebrochen
•
jede Peptidbindung kann brechen
•
Der Massenabstand zweier benachbarter Signale
entspricht der Masse einer Aminosäure
Inkrementmasse: Aminosäure - H2O
K Masterstudiengang: Modul Massenspektrometrie
-66-

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