Evolution III

Wiederholung
Praktikum 1/2
Typische Anwendungen für Dotplots
Vergleich einer Sequenz gegen sich selbst:
– Wiederholungen von Domänen
– Wiederholungen von Motiven (motifs) (low complexity)
– Gespiegelte Regionen (Palindrome) in Nukleinsäuren
Praktikum 1
BLAST
ANFRAGE (QUERY)
DATENBANK
Nukleotid
Protein
Nukleotid
blastn, tblastx
tblastn
Protein
blastx
blastp
Praktikum 1
Globales vs. Lokales Alignment
Ein globales Alignment überdeckt die gesamte Länge der
betroffenen Sequenzen
→ Der Needleman-Wunsch-Algorithmus findet das beste
globale Alignment zweier Sequenzen
Ein lokales Alignment überdeckt nur Teile der Sequenzen
→ Der Smith-Waterman-Algorithmus findet das beste
lokale Alignment zweier Sequenzen
QKESGPSSSYC
| ||| |
VQQESGLVRTTC
Globales
Alignment
ESG
|||
ESG
Lokales
Alignment
Praktikum 2
Substitutionsmatrizen, Berechnung von
Alignmentscores
Welche der folgenden Distanzmatrizen ist eine Ähnlichkeitsmatrix?
A
T
C
G
A
0
5
5
1
T
5
0
1
5
C
5
1
0
5
G
1
5
5
0
A
T
C
G
A
10
1
1
5
T
1
10
1
1
C
1
5
10
1
G
5
1
1
10
Berechnen Sie mit Hilfe dieser Substitutionsmatrix den Score für folgendes
Alignment:
TATCGGCGCG
TGCAGATAAG
Verwenden Sie nun als Scoringschema:
Match = 0, Mismatch = 1, Gap = 5
Praktikum 2
Needleman-Wunsch Algorithmus
Sequenz A: GGAATGG
Sequenz B: ATG
Scoring-Schema: Match = 0, Mismatch = 20, Gap = 25
Φ
A
T
G
Φ
0
25
50
75
G
25
20
45
50
G
50
45
40
45
A
75
50
65
60
A
100
75
70
85
T
125
100
75
90
G
150
125
100
75
G
175
150
125
100
●
●
Wie ist der Score des/der
optimalen Alignments?
Gibt es nur ein optimales
Alignment?
http://www.har.mrc.ac.uk/services/MPC/microarray/
Evolution von Genexpression
Evolutionsbiologie II für Bachelor-/Lehramtsstudierende
22. Februar 2016
Sonja Grath
[email protected]
Evolutionsbiologie 2
Gesamtplan
Vorlesungen/Praktika
Dozent
I
John Parsch
Molekulare Evolution
II Evolutionäre Bioinformatik I
Sonja Grath
III Molekulare Variabilität
Stephan Hutter
IV Evolutionäre Bioinformatik II
Sonja Grath
V Evolution von Genexpression Sonja Grath
VI Populationsgenetik
Katharina Böndel
Übersicht
1) Molekulare Grundlagen
2) Wie entstehen Genexpressionsunterschiede?
3) Wie häufig sind sie?
4) Wie können Expressionsunterschiede gemessen werden?
5) Wie wichtig ist Genexpression für adaptive Evolution?
6) 2 Beispiele
(a)Genexpression in Primaten
(b)Alkoholdehydrogenase in Drosophila
7) Hinweise zum Laborpraktikum
Molekulare Grundlagen
Ausgangspunkt: Eine Zelle
Bsp. Tierzelle
commons.wikimedia.org
Embryonalentwicklung
biokurs.de
http://research.fhcrc.org/parkhurst/en/embryo.html
Verschiedene Zelltypen
paradoja7.com
Unterschiede zwischen den Geschlechtern
(sexueller Dimorphismus)
→ Woher kommen derartige Unterschiede?
Molekulare Grundlage
DNA-Sequenz?
Beispiel: ♂ und ♀ teilen über 99.8% ihrer Genome! (siehe auch Vorlesung 1)
→ Gen-Expression
Zentrales „Dogma“ der Molekularbiologie
(Francis Crick – 1958, 1970)
Transkription
DNA
Translation
RNA
4 Nukleotide:
4 Nukleotide:
A, C, G, T
A, C, G, U
ATGGTAGCT…
AUGGUAGCU…
Genetischer Code
Nicht-überlappend, degeneriert
43 = 64 Triplets/Codons (inkl. START/STOP)
AUG GUA GCU … UAA
Start Val Ala … STOP
Protein
Protein
20 Aminosäuren
(as)
Genexpression
Genregulation
Chen and Rajewsky Nature Reviews Genetics 8, 93–103 (February 2007) | doi:10.1038/nrg1990
Wie entstehen Expressionsunterschiede?
cis vs. trans
cis
Änderung in der regulatorischen Sequenz (Promoter oder
Enhancer des Zielgens)
trans
Änderung in einem anderen, nicht verbundenen Gen (z.B.
Transkriptionsfaktoren), welche die Genexpression des
Zielgens beeinflusst
Cheung & Spielman, 2009
→ Wie können wir diese beiden Möglichkeiten unterscheiden?
Evolutionary changes in cis and trans gene regulation
Wittkopp et al. (2004)
Kreuzung:
♂/♀
D. melanogaster
➔
♂/♀
x
D. simulans
Vergleich der Expressionsstärken in Genen der Eltern und der F1Hybriden
Methode: Pyrosequenzierung
●
●
Sehr sensitiv
Expression von 2 Allelen in einem heterozygoten Individuum kann
unterschieden werden
Evolutionary changes in cis and trans gene regulation
Wittkopp et al. (2004)
Erwartung:
cis
Beide Allele sollten unterschiedlich transkribiert werden in den Hybriden
und den Expressionsunterschieden zwischen den Eltern entsprechen
trans
Beide Allele sollten gleich exprimiert werden in den Hybriden (→
gleicher Pool an Transkriptionsfaktoren)
Ergebnis:
Test von 29 Genen mit unterschiedlicher Expression zwischen den
beiden parentalen Arten
●
●
28 (97%) zeigten Expressionsunterschiede in den Hybriden (cis)
Für 50% dieser Gene waren diese Unterschiede ausschließlich
durch cis-Änderungen erklärbar
Evolutionary changes in cis and trans gene regulation
Wittkopp et al. (2004)
Expression quantitative trait loci (eQTL)
●
●
●
Zusammenhang zwischen DNA-Polymorphismen und
Expressionsunterschieden
Kombination von Transkriptomdaten und Genotyping
SNPs (= Single Nucleotide Polymorphisms), welche mit
Genexpression korrelieren, heißen eQTL
Wolen & Miles, 2012
Wie häufig sind Expressionsunterschiede?
Bsp.: Geschlechtsspezifische Genexpression
Wie viele geschlechtsspezifische Gene gibt es?
Absolute Anzahl hängt von verschiedenen Faktoren ab:
➔ Art und Gewebe
➔ Experimentelle Methode
➔ Grad der Replikation
➔ Statistische Kriterien zur Definition von Expressionsunterschieden
In jedem Fall: Anzahl nicht unbedeutend!
Beispiele:
D. melanogaster, ganze Fliegen:
~57% der Gene zeigen geschlechtsspezifische
Expression
→ Mehrheit: exprimiert in reproduktiven Geweben
(Ovarien, Hoden)
M. musculus, somatische Gewebe (Yang et al. 2006):
> 10,000 Gene mit geschlechtsspezifischer Expression
Ursprung geschlechtsspezifischer Gene
➔
➔
➔
➔
➔
➔
➔
Sexueller Antagonismus an einem Lokus
Sexueller Antagonismus + Genduplikation
Duplikation geschlechtsspezifischer Gene
Retrotransposition
de novo
Tandem-Duplikation
'Zufall'
Gene duplication
Fitness trade-offs:
sexually antagonistic mutation
en.wikipedia.org
Ellegren & Parsch, 2007
Gen-Duplikation und die Entstehung eines
neuen geschlechtsspezifischen Genes
Beispiel: janus/ocnus
Ellegren & Parsch (2007)
Wie können Expressionsunterschiede
gemessen werden?
Methodenübersicht
2 Möglichkeiten:
1) Quantifizierung der Menge an mRNA
Real-time quantitative PCR (RT-qPCR)
Northern Blots
Microarrays
Next-Generation-Sequencing (RNA-Seq)
2) Quantifizierung der Proteinmenge
Immunologische Verfahren (z.B. Western Blot)
Massenspektrometrie
Photometrische Messungen (z.B. Bradford, Lowry)
➔
Laborpraktikum
Quantifizierung der Menge an mRNA
Microarrays
Beispiel:
Geschlechtsspezifische Expression
♂
Sample 1
♀
Sample 2
Quantifizierung der Menge an mRNA
Next-Generation Sequencing
MacLean et al., 2009
Ein typisches RNA-Seq Experiment
2 Schritte:
a) Gewinnung der Daten
b) Analyse der Daten
Martin & Wang, 2011
Vergleich Microarray – RNA-Seq
wikipedia
Harrison et al. (2011)
Quantifizierung der Proteinmenge
Lowry Protein Assay
labome.com
●
●
●
●
Cu2+-Ionen bilden mit Peptidbindungen einen quadratisch-planaren, blauvioletten
Komplex
Reduktion der Cu2+-Ionen durch bestimmte AS-Reste (v.a. Tyr und Trp)
Cu2+-Ionen dienen als Reduktionsmittel für Molybdän- und Wolframat-Ionen
(enthalten im Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagens, kurz: Folin-Phenol)
Entstehendes Molybdänblau kann im Photometer bei 750nm gemessen werden
Beispiel: Messung Gesamtproteinmenge in Drosophila
➔siehe Praktikum – Experiment 1
Wie wichtig sind Unterschiede in
Genexpression für adaptive Evolution?
Evolution eines Phänotyps
„Phänotypen werden durch Gene bestimmt und daher wird
die Mehrzahl vererbbarer Änderungen in Phänotypen durch
Änderungen in der DNA der Gene verursacht.“
Ist das wirklich so? Zu einfach?
Komplexer Zusammenhang zwischen Gen und Phänotyp:
Verschiedene Arten von Molekülen, Signalen, Interaktionen...
Phänotypischer Evolution liegen viele Mechanismen zugrunde
Strukturelle Veränderungen:
Veränderungen in der
kodierenden DNA-Sequenz
Regulatorische Veränderungen:
Veränderungen in der Menge des
produzierten Proteins
Veränderung in Expression kann zu phänotypischen
Unterschieden und Adaption führen
Fellfarbe in Sandmäusen
The developmental role of agouti in color pattern evolution
Manceau et al., Science 2011; 331:1062-5
Pigmentierung in Drosophila
Schnabelform in Darwin-Finken
Stepwise modification of a modular enhancer underlies
adaptation in a Drosophila population
Rebeiz et al., Science 2009; 326:1663-7
The calmodulin pathway and evolution of elongated beak
morphology in Darwin's finches
Abzhanov et al., Nature 2006; 442:563-7
Veränderung in Expression kann zu phänotypischen
Unterschieden und Adaption führen
Bisher:
Änderungen im Phänotyp durch Änderung der Genexpression eines einzigen
Lokus mit großem Effekt (QTL-Analysen, candidate gene approaches)
→ Was ist mit komplexen Phänotypen?
Beispiel:
Verschiedene Kasten in Feuerameisen
Evolution of gene expression in fire ants: the effects of
developemental stage, caste and species
Ometto et al., Mol Biol Evol 2010; 19:1200-11
→ Vergleichende Genexpressionsanalysen (comparative transcriptomics)
und Modelle zur Evolution von Genexpression
Neutrale oder adaptive Evolution?
Harrison et al. (2011)
Anwendung der neutralen Theorie genetischer Evolution (Kimura):
Arten von Selektion können bestimmt werden durch die Berechnung des Verhältnisses
von Expressionsvariation innerhalb und zwischen Populationen
I. Variation innerhalb Populationen < Divergenz zwischen Populationen
→ positive Selektion
II. Variation innerhalb und zwischen Populationen klein
→ negative Selektion
III. Variation innerhalb Populationen  Divergenz zwischen Populationen
→ genetische Drift
Genexpression in Primaten
Expressionsunterschiede in Geweben
zwischen Mensch und Schimpanse
Khaitovich et al. (2006)
Negative Selektion ist stärker für Gene, die in
mehreren Geweben exprimiert werden
Khaitovich et al. (2006)
Positive Selektion?
Alkoholdehydrogenase in Drosophila
Das Adh-Gen in Drosophila
●
●
●
●
●
Eines der bekanntesten und am besten
untersuchten Gene in Drosophila
ADH-Enzym degradiert und detoxifiziert
Alkohole, z.B. Ethanol
Unter den 2% der am höchsten
exprimierten Gene
Mehr als 500 bekannte Allele (z.B. F/SAllel)
5 annotierte Transkripte und Polypeptide
Polymorphismen beeinflussen Enzymaktivität
1) Polymorphismus in der codierenden Region des Adh-Gens
● Fast/Slow-Allel: ADH-F und ADH-S
● Aminosäureunterschied im 3. Exon und Nukleotid-Position
1490: ADH-F(Threonin)/ADH-S(Lysin)
● verändert Enzymaktivität
2) Deletion in der 3'-UTR (untranslated region) des Adh-Gens
● 8-bp-Sequenz
● Deletion führt zu Erhöhung der ADH-Aktivität um den Faktor 2
● Verändert Transkriptmenge
Parsch et al., 2000
Polymorphismen beeinflussen Enzymaktivität
Parsch et al., 2000
Exkurs: Codon Usage Bias
Genetischer Code
Codon Usage Bias
Synonyme Codons werden
unterschiedlich häufig verwendet
Beispiel:
Leucin
UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
E. coli:
CUG ~90%
Yeast:
UUG ~90%
Wie kann Codon Bias erklärt werden?
1) “Neutrales Model”
● Bei Neutralität sollten alle Codons einer Familie mit
gleicher Wahrscheinlichkeit genutzt werden
● Codon Bias wird erklärt durch einen Bias in der
Mutation hin zu G und C Nukleotiden
2) “Selektionsmodel”
● Natürliche Selektion bevorzugt Codons, welche die
Effizienz und Genauigkeit der Translation optimieren
● Anpassung an den tRNA-Pool und die häufigsten
tRNAs
Das Adh-Allel und die Leucin-Codon-Familie
Leucin wird durch 6
Codons codiert
“unpreferred codons”
“preferred codons”
Fall 1: Einführung von nicht-bevorzugten
Codons
Carlini & Stephan (2003)
●
●
Einführung von nicht-bevorzugten synonymen Leu-Codons in
Adh-Gen
Messung der Enzymaktivität
→
4 Allele: Wildtyp, 3 transgene Konstrukte mit 1, 6 bzw.
10 nicht-bevorzugten Leu-Codons
Fall 2: Einführung von bevorzugten Codons
Hense et al. (2010)
→ Erhöhte Enzymaktivität in Larven
Hinweise zum Laborpraktikum
Übersicht
Experiment 1 – ADH-Aktivität in Drosophila
1) Proteinextraktion
2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge
3) Photometrische Messung der Enzymaktivität
Experiment 2 – Bgal-Aktivität in Drosophila
1) Proteinextraktion
2) Bgal-Test
Experiment 1
Alkoholdehydrogenase (ADH, E.C. 1.1.1.1)
Allgemeine Reaktion:
R-CH2OH + NAD+ ↔ R-CHO + NADH + H+
Beispiel:
Im Praktikum:
Wir verwenden als Substrat für die Oxidation Isopropanol (2-Propanol),
das durch die Reaktion zu Aceton (Propanon) umgesetzt wird.
Experiment 1
ADH-Aktivität in Drosophila
1) Proteinextraktion
2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge
(a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA)
(b) Messung der eigentlichen Proben
(c) Berechnung und Darstellung der Gesamtproteinmenge
3) Photometrische Messung der Enzymaktivität
(a) Messung der Enzymaktivität
(b) Bestimmung der Regressionsgeraden
(c) Berechnung der ADH-Enzymaktivität
Erklärung im
Praktikum
→ Die Messung der ADH-Aktivität ist eine quantitative Messung
Experiment 1
ADH-Aktivität in Drosophila
1) Proteinextraktion
2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge
(a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA)
Beispiel:
BSA
BSA (mg/ml)
Extinktion BSA
0
0
0
5
0,0125
0,067
0,35
10
0,025
0,194
0,30
15
0,0375
0,292
20
0,05
0,347
25
0,0625
0,39
BSA-Eichkurve
0,45
Extinktion BSA
0,40
f(x) = 6,6x + 0,01
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
BSA (mg/ml)
0,05
0,06
0,07
Experiment 1
ADH-Aktivität in Drosophila
1) Proteinextraktion
2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge
(a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA)
(b) Messung der eigentlichen Proben
(c) Berechnung und Darstellung der Gesamtproteinmenge
Beispiel:
Proben
Extinktion
Proteinmenge der
verdünnten Proben
Gesamtproteinmenge
(-)
0,264
0,039
0,777
(+)
0,563
0,083
1,658
S
0,327
0,048
0,962
S-Δ
0,372
0,055
1,096
F
0,344
0,051
1,014
F-Δ
0,323
0,048
0,952
Experiment 1
ADH-Aktivität in Drosophila
1) Proteinextraktion
2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge
(a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA)
(b) Messung der eigentlichen Proben
(c) Berechnung und Darstellung der Gesamtproteinmenge
Beispiel:
Gesamtproteinmenge
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
(-)
(+)
S
S-Δ
F
F-Δ
Experiment 2
β-Galaktosidase (Bgal, E.C. 3.2.1.23)
Allgemeine Reaktion:
Katalyse der Hydrolyse von β-Galaktosiden in Monosaccharide
Beispiel:
Hydrolyse von o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid (ONPG,
farblos) in Galaktose und o-Nitrophenol (gelb)
Experiment 2
β-Galaktosidase in Drosophila
β-Galaktosidase kommt in Drosophila nicht natürlich vor!
→Kann mit transgenen Methoden in Drosophila eingebracht werden
und ist dort ein wichtiges Reporter-Gen
Das lac-Operon in Escherichia coli:
Experiment 2
β-Galaktosidase-Assay
(-)-Kontrolle (+)-Kontrolle
farblos
?
Gelbfärbung
→ Die Messung der ADH-Aktivität ist eine qualitative Messung

Download Report