Biofilme

Entwicklung von Reinigungsmitteln zur
Entfernung von Biofilmen
Kooperationsprojekt mit:
Gefördert durch:
Dr. Urs Rosenberg
SGSV Biel, 18.06.2015
Biofilme
  Strukturierte Gemeinschaften von Mikroorganismen auf
Oberflächen oder an Grenzflächen.
  Selbstproduzierte Matrix aus extrazellulären polymeren
Substanzen (EPS) bestehend aus Polysacchariden,
Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren und anderen
Verbindungen.
  Biofilm-assozierte Mikroorganismen bis zu 1000-fach
weniger empfindlich gegen antimikrobielle Wirkstoffe
als deren planktonische Form.
1
Endoskope und Infektionen
Kovaleva et al. 2013
2
Biofilm in Endoskopkanälen
REM-Aufnahmen zweier unterschiedlicher Luft-/Wasserkanäle mit Biofilm:
(a) Konfluente Schmutz-Biofilm-Schicht (niedrige Auflösung).
(b) Mehrlagiger Biofilm bestehend aus gesund erscheinenden Zellen umgeben und
überlagert von amorph erscheinender EPS (hohe Auflösung)
Pajkos et al. 2004
3
Reinigungsmodelle
1.  Screening-Methoden zum Austesten einer grösseren
Anzahl von Formulierungen und Parameter sowie
unterschiedlicher Nachweismethoden
Mikrotiterplatten
2.  Aufwändigere Methoden näher bei der realen Anwendung
Fliesszelle
Endoskopkanäle (EN ISO TS 15883-5)
4
Biofilme in Mikrotiterplatten
  96-well Polystyrol-Mikrotiterplatten mit flachem Boden
  Aufzucht Biofilm: Vorkultur verdünnen auf 0.2 OD in 30%
TSB + 0.25% Glucose. 200 L / well inkubieren bei 33 °C
unter Schütteln bei 40 rpm während 24 Stunden.
  Erscheinungsbild Biofilm (Crystal Violet Färbung):
P. aeruginosa
5
S. aureus
Vorgehen Reinigungsexp. MT-P
 
 
 
 
 
 
 
6
Absaugen des Mediums
1 x waschen mit 300 L 0.9% NaCl
Zugabe von 300 L Reinigerlösung (1% in WSH)
40 min Inkubation bei 25 °C ohne Schütteln
Reinigerlösung absaugen
3 x waschen mit 300 L 0.9% NaCl
Anwendung einer Nachweismethode
Potentielle Nachweismethoden
  Gesamte Biomasse (Bakterien und EPS)
Crystal Violet (CV)
Safranin Red
Congo Red
  Gesamte Bakterien (lebende und tote)
SYTO 9
Acridine Orange
  Lebende Bakterien
SYTO 9 / Propidium Iodide
BacTiter-GloTM assay (ATP)
Turbidity Threshold (vermehrungsfähige)
7
  Protein
CBQCA
NanoOrange
SYPRO Ruby
FITC
  Polysaccharide
Calcofluor White
ConA-FITC
Dubois
Methoden - Vor- und Nachteile
In der Mikrotiterplatte
8
Nachweismethoden / Aussagen
  Crystal Violet
Färbung gesamte Biomasse (Bakterien und EPS)
Biofilmabreicherung ohne Differenzierung EPS/Bakterien.
  BacTiter-GloTM
Differenzielle Färbung lebender Bakterien
Bakterienreduktion und –abtötung ohne Differenzierung.
  Turbidity Threshold
Bakterienwachstum (OD595)
Bakterienreduktion und –abtötung ohne Differenzierung.
9
P. aeruginosa / S. aureus
Crystal Violet (CV) Färbung
Optische Dichte
Optische Dichte
S. aureus
10
!
P. aeruginosa
!
Inkubationszeit
Rückstand [% von NaCl]
P. aeruginosa (CV-Färbung)
11
Inkubationstemperatur
Rückstand [% von NaCl]
P. aeruginosa (CV-Färbung)
12
Wachstum (Turbidity Threshold)
0.7
0.6
OD 595 nm
0.5
13
0.4
14
NaCl
0.3
PosK
1.E+08
0.2
1.E+07
1.E+06
120
270
420
570
Zeit [min]
720
870
Anzahl Zellen
0.1
0
min
RF 1.48 log
RF 1.84 log
1.E+05
1.E+04
1020
1.E+03
RF 5.98 log
1.E+02
1.E+01
1.E+00
13
13
14
NaCl
PosK
Produkte im Test
14
TOSI-Reinigung
1% in Stadtwasser von ca. 16°d bei RT (ca. 22°C)
R1-m
gespült
60 min
45 min
30 min
15 min
0 min
15
R3-m
DR-m
NP-m
R6-o
PosK
WPO
P. aeruginosa vs. S. aureus
Mikrotiterplatte, Biofilmreduktion 40 min statisch, CV-Färbung
120.0
287
107.4
99.6
Rückstand [% von NaCl]
100.0
134
100.0
100.0
95.8
86.6 84.1
80.0
74.0
65.0
60.0
51.4
44.7
35.9
40.0
30.1
21.0
20.0
7.4
19.9
15.7
11.0
5.6
2.2
0.0
R1-m
R2-m
R3-m
R4-m
DR-m
NP-m
P.aeruginosa
16
R5-o
R6-o
S.aureus
NaCl
PosK
WPO
Lebende Zellen (P. aeruginosa)
Mikrotiterplatte, 40 min statisch, BacTiter-GloTM
Rückstand Lebende Zellen [% von NaCl]
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
R1-m
-20.00
17
R2-m
R3-m
R4-m
DR-m
NP-m
R5-o
R6-o
NaCl
PosK
WPO
Reduktion Biofilm / lebende Zellen
Rückstand Gesamtbiomasse vs. Zellen [% von NaCl]
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
R1-m
R2-m
R3-m
R4-m
DR-m
NP-m
-40.00
-60.00
-80.00
-100.00
-120.00
Crystal Violet
18
R5-o
-20.00
BacTiter-Glo
R6-o
NaCl
PosK
WPO
Fliesszelle mit OCT-Visualisierung
OTC = Optische Köhärenztomographie, ein Untersuchungsverfahren, bei dem Licht
geringer Köhärenzlänge mit Hilfe eines Inferometers zur Entfernungsmessung
streuender Materialien eingesetzt wird. Das Untersuchungsobjekt wird punktweise
abgetastet. Haupteinsatzgebiet ist die Medizin (Wikipedia).
  Miniaturisierte Fliesszelle 120x2x1 mm (LxBxH)
  Heterothropher Abwasserbiofilm (Quelle:
Belebtschlammüberstand) 24h im Fed-Batch Betrieb
gezüchtet.
  Gespült mit 0.9% NaCl
  Reinigungsversuche im Durchflussbetrieb (16 ml/min)
  NP-m und PosK getestet
19
OCT-Visualisierung
3D-Aufnahmen
(3x2x1 mm) nach
NaCl-Spülung
Vor
Nach 10 min Behandlung mit PosK
(NaOH, NaOCl, EDTA, SDS je 1%)
Zeitaufgelöste Aufnahme von 2D-Schnitten (xz-Ebenen)
entlang der Fliessrichtung (x-Richtung)
20
Endoskop-Dummy Test
EN ISO/TS 15883-5:2005 Anhang F
  2 m Endoskopkanal 4 mm füllen mit 10 ml P. aeruginosaÜbernacht-Kultur.
  Biofilmanzucht während 72 h / 30°C. Rezirkulation
(40 mL/min) mit definierter Zugabe von Wachstumsmedium.
  Schlauch mit 0.9% NaCl während 1 min bei 20 ml/min
spülen
  Verwendung von 30 cm langen Stücken für die
Reinigungsversuche statisch oder mit Durchfluss
200 ml/min bzw. 4 ml/min (Desinfektion)
  Analyse OD595nm, KBE, Zucker-Nachweis nach Dubois,
Proteinnachweis nach Lowry
21
Reinigung - Experimentelles Setup
$"$$
!(
3 70=@
3 972
3 8
22
3 8@"
3  $"0/
3 9772
3 <28<
!(
3 70=@
3 972
3 8
#% 3  *6
297
3 ;2
3 8<
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3 972
3 8
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3 <$(
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3 <
Analysen
' #$ 4'"5
"('#"
4$"5
:7A
!
8<7A 897A
:7A
:7A
897A
897A
1
)"+$ 4" $5
23
Reinigung statisch vs. Durchfluss
Bakterienreduktion: statisch = ohne Pumpe; Flow 1, 2, 3 = Pumpe mit 200 mL/min
1.00E+09
0.8
1.00E+08
1.6
1.00E+07
2.5
2.1
RF log10
1.00E+06
Statisch / 40 min
1.00E+05
Flow 1 / 15 min
Flow 2 / 15 min
1.00E+04
Flow 3 / 15 min
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
WSH
24
R1-m
NP-m
Reinigung im Durchfluss: Dauer
Reduktion Protein, Zucker: 5, 15 min, 200 mL/min
NP-m erfüllt
Anforderung von EN
ISO/TS 15883-5:2005
Anhang F
25
Reinigung im Durchfluss 15 min
26
Vergleich mit CV-Färbung
CV-Färbung in Mikrotiterplatten (statisch)
(MTP)
Durchfluss
27
Rest-Biofilm im Mikroskop 4x
CYTO 9-Färbung (Nukleinsäuren)
WSH
28
NP-m
R2-m
250
m
250
m
250
m
250
m
250
m
250
m
R3-m
R1-m
R6-o
Rest-Biofilm im Mikroskop 20x
WSH
R2-m
25 m
25 m
25 m
25 m
25 m
25 m
R3-m
29
NP-m
R1-m
R6-o
Mit vs. ohne Desinfektion
Reinigung 15 min, 200 mL/min Desinfektion 15 min, 4 mL/min
30
Mit / ohne Desinfektion
Desinfektionsmittel: deconex® HLD PA (Peressigsäure)
WSH vor
250
m
WSH nach
250
m
31
WSH vor
25 m
WSH nach
25 m
NP-m vor
25 m
NP-m nach
25 m
Zusammenfassung
  Unterschiedliche Nachweismethoden für verschiedene Phasen einer
Produktentwicklung notwendig.
  Resultate von MT-Screening-Methoden im Wesentlichen kongruent
mit aufwändigeren Dummy-Tests.
  S. aureus Biofilm weniger widerstandsfähig als P. aeruginosa Biofilm,
insbesondere gegenüber enzymatischen Reinigern.
  Dezinfizierende Reiniger bzw. Reiniger mit Desinfektionswirkstoffen
zeigen allgemein keine gute Reinigungsleistung, weder gegen Biofilm
noch gegen Blut. Bes. schlechte Ergebnisse beim S. aureus Biofilm.
  Nur eine gute Reinigung garantiert den Erfolg der anschliessenden
Desinfektion. Gilt ganz besonders im Fall von Biofilm.
  Ein Produkt zur manuellen (Vor-)Reinigung mit guten
Reinigungseigenschaften gegen Biofilm und gegen Blut wurde im
Rahmen des Projekts entwickelt.
32
Vielen Dank für Ihr Interesse !
Das Team
Dr. Qun Ren, Empa
Stefan Mauerhofer, Borer
Dr. Philipp Stiefel, Empa
Dr. Urs Rosenberg, Borer
Stefanie Altenried, Empa
Jana Schneider, Empa
33
40 ml/min
1 ml/min

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