25 2015 Beiträge zur Transfusionsmedizin •Molekulare Diagnostik in der Immunhämatologie •Autologe Serumaugentropfen •Künstliche Sauerstoffträger •Erythrozytenkonzentrate aus Stammzellen •Neues aus der Rubrik „Was tun wir bei …?“ •Qualitätssicherung im Immunhämatologischen Labor Deutsches Rotes Kreuz DRK-Blutspendedienste •Mutspende 2015 Impressum Herausgeber: Die DRK-Blutspendedienste: DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen, Mannheim Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes, München DRK-Blutspendedienst Mecklenburg-Vorpommern, Neubrandenburg Blutspendedienst der Landesverbände des DRK Niedersachsen, Sachsen-Anhalt, Thüringen, Oldenburg und Bremen, Springe DRK-Blutspendedienst Nord-Ost, Dresden Inhalt Editorial 25/2015 Molekulare Diagnostik in der Immunhämatologie 3 4–21 PD Dr. med. Franz Wagner, Dr. rer. nat Andrea Döscher, Dr. med. Christof Jungbauer, Dr. phil. nat. Sofia Lejon Crottet, Dr. med. Angelika Reil, Dr. med. Christof Weinstock, PD Dr. med. Christoph Gassner, Prof. Dr. med. Peter Bugert, Dr. med. Christof Geisen Autologe Serumaugentropfen 22–26 Dr. med. Robert Deitenbeck, Dr. med. Uwe Sievert, Dr. med. Christian Halfwassen DRK-Blutspendedienst West, Ratingen (gemeinnützige GmbHs) Künstliche Sauerstoffträger 27–36 Dr. Katja Bettina Ferenz Redaktion (verantwortlich): Dr. med. Detlev Nagl, Augsburg Heinz Kapschak, Hagen Feithstraße 182, 58097 Hagen Tel.: 0 23 31/8 07-0 Fax: 0 23 31/88 13 26 Email: [email protected] Redaktion: Dr. med. Robert Deitenbeck, Hagen; Dr. Jörgen Erler, Baden-Baden; Christian Kohl, München; Dr. med. Markus M. Müller, Frankfurt/M.; Prof. Dr. med. Hubert Schrezenmeier, Ulm; Prof. Dr. med. Axel Seltsam, Springe; Dr. med. Wolfgang Stangenberg, Neubrandenburg; Prof. Dr. med. Torsten Tonn, Dresden; PD Dr. med. Thomas Zeiler, Breitscheid. Mit Autorennamen gekennzeichnete Fachartikel geben die Meinung des Autors wieder und müssen nicht unbedingt die Meinung der Redaktion und der Herausgeber widerspiegeln. Der Herausgeber der „hämotherapie“ haftet nicht für die Inhalte der Fachautoren. Die Fachinformationen entbinden den behandelnden Arzt nicht, sich weiterführend zu informieren. Erythrozytenkonzentrate aus Stammzellen Prof. Dr. med. Reinhard Henschler, Dr. med. Beat M. Frey Neues aus der Rubrik „Was tun wir bei …?“: Positive Eigenkontrolle und/oder positiver Direkter Coombstest: Was nun? deltacity.NET GmbH & Co. KG SIGMA-DRUCK GmbH www.deltacity.net 44–48 Manuela Krause Qualitätssicherung im Immunhämatologischen Labor 49–53 Brigitte Hoffmann Leserfragen Dokumentation von Transport und Lagerung von Gerinnungspräparaten 54–55 PD Dr. med. Thomas Zeiler Anwendung eines Dreiwegehahns 55–56 Prof. Dr. med. Robert Zimmermann Mutspende 2015 Realisation: 37–43 56–57 Christoph Metzelder Die Autoren 58–60 Auflagen: Gesamtauflage: 22.600 Ex. ISSN-Angaben auf der Rückseite Zitierweise: hämotherapie, 25/2015, Seite ... 25 2015 PD Dr. med. Andreas Buser PD Dr. med. Behrouz Mansouri Taleghani Chefarzt/Geschäftsführer Medizinischer Direktor Blutspende SRK Schweiz AG Stiftung Blutspendezentrum SRK beider Basel Leitender Arzt Hämatologie, Inselspital, Universitätsspital Bern SEHR GEEHRTE LESERINNEN UND LESER, LIEBE KOLLEGINNEN UND KOLLEGEN, was bevorzugen Sie bei Wissenserwerb und Wissensver- lichen an demjenigen des 47. Jahreskongresses in Dres- mittlung – trockene Paukerei auf einer einspurigen Ebe- den, der nicht nur wissenschaftlich ein extrem großer Er- ne oder einen lebendigen interdisziplinären Austausch? folg war. Besonders hervorheben dürfen wir die geplan- Eine recht rhetorische Frage – zugegeben. Und eigent- ten gemeinsamen Veranstaltungen mit der GTH und der lich jedem klar, was gemeint ist. Aber den Autoren die- DGHO sowie das Satellitensymposium des German Stem ses Editorials fällt es trotzdem nicht leicht, die notwen- Cell Network. Es freut uns zudem sehr, dass unsere Kolle- digen Ingredienzien eines „lebendigen interdisziplinären gen aus den Nachbarländern Ungarn und Italien zugesagt Austauschs“ kurz und knapp zu benennen – und sie er- haben, sich aktiv einzubringen – eine Gelegenheit zum di- heben deshalb auch keinen Anspruch auf Vollständig- rekten und persönlichen internationalen Austausch sowie keit. Als zentrale Punkte sehen wir beispielsweise einen ein weiterer „Blick über den Tellerrand“. interdisziplinären und interprofessionellen Austausch über Forschung und Entwicklung aber auch über operative An- Selbstverständlich werden die hervorragenden Weiter- wendung und tägliche Praxis. Dabei ist es klar hilfreich, bildungsformate für ärztliche und nicht-ärztliche Fach- die Forschungsergebnisse und Praxisempfehlungen ziel- personen weitergeführt und ausgebaut. Als ein Schwer- gruppenorientiert, griffig und anschaulich zu präsentieren. punkt sei beispielsweise das theoretische und praktische Operatorseminar für Apheresefachkräfte genannt. Wenn dies alles zusammentrifft, dann machen wir „den Unterschied“ in einer zeitgemäßen Wissensvermittlung. Wenn dann das Rahmenprogramm auch noch hilft, das knüpfen und damit in uns zu verankern, dann ist es genau Wir freuen uns sehr, dass es der Redaktion der „hämotherapie“ wieder einmal gelungen ist, rechtzeitig zum DGTI-Kongress die aktuelle Ausgabe der Zeitschrift das, was wir schon immer mit unserer jährlichen „DGTI“ fertig und für die Kongressmappen bereit zu stellen. Auch erreichen wollen. in diesem Heft sehen wir unsere oben genannten Postu- Erlernte mit positiven Eindrücken und Emotionen zu ver- late – interdisziplinärer und interprofessioneller Austausch Wir hoffen natürlich, dass wir in Basel hierfür in jeder Hin- über Forschung, Entwicklung, operative Anwendung und sicht die besten Voraussetzungen geschaffen haben. Das tägliche Praxis – beispielgebend verwirklicht. Viel Spaß Kongresszentrum liegt mitten in der Stadt und ist bequem beim Lesen! mit dem Zug (10 Minuten zu Fuß vom Badischen Bahnhof, DB), Auto oder Flugzeug zu erreichen. Die attraktiven und Wir freuen uns, dass wir Sie in Basel begrüßen dürfen! modernen Kongressräumlichkeiten haben sich bei zahlreichen nationalen und internationalen Kongressen bewährt und werden auch anlässlich der großen internationalen Messen wie ArtBasel und Basel World genutzt. Das Behrouz Mansouri Taleghani Format des „DGTI 2015 Basel“ orientiert sich im Wesent- Andreas Buser Herzlichst, 3 PD Dr. med. Franz Wagner, Dr. rer. nat Andrea Döscher, Dr. med. Christof Jungbauer, Dr. phil. nat. Sofia Lejon Crottet, Dr. med. Angelika Reil, Dr. med. Christof Weinstock, PD Dr. med. Christoph Gassner, Prof. Dr. med. Peter Bugert, Dr. med. Christof Geisen Molekulare Diagnostik in der Immunhämatologie Wenn die Serologie nicht mehr ausreicht Zusammenfassung Summary Die Molekulare Diagnostik ist heutzutage eine wichtige Ergänzung der sero- Nowadays, molecular diagnostic methods are an important complementat of logischen Diagnostik. Im Artikel wird ein Überblick über die Grundlagen der serologic diagnostic methods. In this manuscript, after an introductory survey Antigene gegeben und anschließend beispielhaft an Hand von Thrombozy- on the molecular basis of antigens is given, the significance of molecular me- ten- und Neutrophilenantigenbestimmung, Abklärung von erythrozytensero- thods is exemplified for determination of antigens of platelets and neutrophils, logischen Problemfällen, weak D Diagnostik zur Festlegung der Transfusions- analysis of serologic enigmas, analysis of weak D to determine the transfu- und Prophylaxestrategie, Pränataler Blutgruppenbestimmung aus dem Blut sion and prophylaxis strategy, prenatal antigen determination from maternal der Mutter, Testung D negativer Spender auf DEL mittels RHD PCR und Hoch- blood, testing of D negative donors for DEL by RHD PCR and high-throughput durchsatz-Genotypisierung von Blutspendern der aktuelle Stellenwert darge- genotyping of blood donors. In addition, current limitations of the methods stellt. Abschließend werden aktuelle Grenzen des Verfahrens aufgezeigt. are illustrated. EINLEITUNG ps genutzt. Häufig liegen bei den Blutgruppenallelen nur geringe Unterschiede in der DNA vor. Wenn nur ein ein- Blutzellen tragen unterschiedliche Strukturen auf ihrer zelnes Nukleotid verändert ist, spricht man von einem Ein- Oberfläche, die bei Übertragung von einem zum ande- zelnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymor- ren Organismus eine Immunisierung hervorrufen können phism, SNP). Aufgrund der Identifizierung eines Blutgrup- und deshalb als Alloantigene bezeichnet werden. Die Fol- pen-spezifischen SNP wird das entsprechende Antigen gen einer Immunisierung können unterschiedlich sein und (Phänotyp) vorhergesagt. Auch wenn in aller Regel die- reichen von der Ausbildung spezifischer Antikörper oh- se Vorhersage zutrifft, können in seltenen Einzelfällen zu- ne weitere Symptomatik bis hin zu akuten Abstoßungs- sätzliche Veränderungen in dem betreffenden Gen vor- reaktionen mit Zerstörung der antigentragenden Zellen. kommen, die falsch positive oder falsch negative Ergeb- Die Diagnostik im Zusammenhang mit solchen immuno- nisse und somit eine Diskrepanz zwischen Phänotyp und logischen Vorgängen besteht meist aus der Kombination Genotyp zur Folge haben können. einer immunologischen Bestimmung der Antikörperspezifität und einer serologischen und/oder molekulargene- Ein falsch negatives Ergebnis kommt beispielsweise zu tischen Bestimmung der Antigenkonstellationen. Insge- Stande, wenn auf der DNA in Nachbarschaft zu dem Blut- samt ist die Entwicklung moderner Laborverfahren für die gruppen-spezifischen SNP eine weitere, nicht bekannte genetische Bestimmung zahlreicher Antigensysteme von oder vom angewendeten Test nicht erfasste Genverän- Blutzellen weit vorangeschritten. Für die verschiedenen derung vorliegt. Hierdurch wird die Detektion des Blut- Fragestellungen und Anwendungen stehen eine Reihe gruppen-spezifischen SNP gestört. Falsch negative Ge- unterschiedliche Verfahren zur Verfügung. notypisierungsergebnisse sind insbesondere im Rahmen der Blutspendertypisierung oder der fetalen Blutgruppen- Bis vor etwa 20 Jahren wurden die erythrozytären Blut- 4 bestimmung klinisch relevant. Falsch positive Ergebnisse gruppen allein durch die Agglutination von Erythrozy- können entstehen, wenn beispielsweise durch eine zu- ten mit Antikörpern bekannter Spezifität bestimmt. Heu- sätzliche, bisher nicht bekannte, Grenzveränderung ein te gewinnen ergänzende molekularbiologische Methoden Stop-Codon eingeführt wird, so dass bei der Translati- der Blutgruppenbestimmung zunehmend an Bedeutung (Abbildung 1). Die Blutgruppenbestimmung auf DNA- on nur ein Proteinfragment oder kein Protein synthetisiert Basis wird insbesondere zur Vorhersage des Phänoty- Protein eingebaut werden, es liegt ein so genanntes Null- wird. Als Folge kann in die Erythrozytenmembran kein 25 2015 Allel vor. Null-Allele stellen für die Typisierung der Blutspender kein Risiko dar, sind aber bei der Typisierung des Patienten problematisch. Eine noch höhere Stufe der Genauigkeit ist mit der Sequenzierung des gesamten Gens zu erreichen. Aber auch in DNA-Bereichen außerhalb des A B D D C c E e Gens können Mutationen auftreten, die das Gen und damit die Expression des Proteins beeinflussen. Da diese zusätzlichen Genveränderungen ausgesprochen selten sind, verlässt man sich normalerweise auf die SNP-Bestimmung und sucht nur bei zusätzlichen unerwarteten Befunden nach seltenen Varianten, beispielsweise dann, wenn Antikörper unerwarteter Spezifität aufgedeckt werden. Die eher geringen Unsicherheiten der molekularbio- Abbildung 1: Blutgruppenbestimmung alt und neu logischen Vorhersage und deren Konsequenzen muss Seit über hundert Jahren wird die Agglutination immer noch erfolgreich zur man bei der spezifischen Befunderstellung kennen und Bestimmung der Blutgruppe genutzt (obere Bildhälfte). Heute steht ihr für berücksichtigen. Diskrepanzen zwischen Genotyp und Problemfälle mit der molekularen Typisierung ein kompetenter Partner zur Phänotyp sind immer verdächtig für das Vorliegen eines Seite (untere Bildhälfte). neuen Allels. Je besser eine ethnische Gruppe hinsichtlich der vorkommenden Allele durchtypisiert ist, desto ge- Die genetischen Veränderungen, denen Blutgruppen- nauer ist die Phänotyp-Vorhersage. Zwar ist für die Be- varianten zugrunde liegen, sind verschiedenster Art. Eine stimmung des Phänotyps nach wie vor die Serologie der Reihe von Blutgruppenvarianten kommt durch den Aus- Goldstandard, dennoch sind molekularbiologische Me- tausch einer einzelnen Base im codierenden Bereich des thoden zu Hilfsmitteln in der Transfusionsmedizin gewor- Gens zustande (Single Nucleotide Polymorphism, SNP). den, auf die kein größeres Labor mehr verzichten möchte. Der Basenaustausch hat den Einbau einer anderen Aminosäure in das Protein und damit eine veränderte antige- Im Folgenden werden zunächst die molekularen Mecha- ne Struktur zur Folge. Beispiele hierfür sind die Blutgrup- nismen der Entstehung von Blutgruppenantigenen näher penantigene Jka und Jkb (Abbildung 2). betrachtet und anschließend ein Überblick über aktuelle Anwendungen der molekularen Typisierung in der Im- Bei Polysaccharid-Antigenen wirkt sich die Veränderung munhämatologie gegeben. nicht unmittelbar auf das Antigen aus. Durch den Austausch einzelner oder mehrerer Nukleotide wird vielmehr die Substrat- oder Reaktionsspezifität des Enzyms ver- MOLEKULARE MECHANISMEN DER ENTSTEHUNG VON BLUTGRUPPENANTIGENEN UND PHÄNOTYPEN ändert, das die Synthese des Polysaccharidantigens bewerkstelligt. Als prominentes Beispiel seien die ABO-Blutgruppen genannt: Das Gen der Glykosyltransferase, welches das ABO-Antigen B erzeugt (kurz: B-Transferase), Von einem Blutgruppenantigen spricht man, wenn eine unterscheidet sich vom Gen der A-Transferase durch sie- Struktur der Erythrozytenoberfläche bei einem anderen ben Nukleotidaustausche. Drei davon sind stumm, vier Individuum die Bildung eines Antikörpers auslösen kann. führten zu einer Aminosäuresubstitution. Die so verän- Dies setzt voraus, dass das betroffene Individuum die- derte B-Transferase hat nun D-Galaktose als Substrat an- se Struktur nicht oder in veränderter Form besitzt. Einem stelle von N-Acetyl-Galaktosamin, statt Blutgruppe A wird solchen Polymorphismus liegen in der Regel Veränderun- Blutgruppe B aus der H-Substanz erzeugt. gen des korrespondierenden Gens zu Grunde. Die fehlende Expression eines Blutgruppenantigens (Null-Phänotyp) kann an einer Veränderung der Gensequenz liegen, Nukleotidaustausche in der Spleiß-Region können sich störend auf die Verknüpfung der Transkripte zur mRNA die beispielsweise ein vorzeitiges Stop-Codon eingeführt auswirken. Die daraus resultierende unvollständige mRNA hat. Es kann aber auch ein unverändertes Gen vorliegen, hat eine fehlerhafte Proteinsynthese zur Folge. Verände- dessen Expression durch andere Mechanismen gestört rungen in der Spleiß-Region können daher Ursache von ist. So verhindert der Austausch des Nukleotids Thymin Null-Phänotypen sein. So stört im RHD-Gen die Substitu- durch Cytosin an Position -67 im Promotorbereich des tion des Guanin durch ein Adenin an der ersten Position FY*B Alleles dessen Transkription und damit die Expres- im Intron 8 (IVS8 + 1G > A)1 die Spleißvorgänge so nach- sion des Fyb-Antigens auf den Erythrozyten. haltig, dass kein RhD-Protein exprimiert wird. 5 Der Verlust (Deletion) oder die Einfügung (Insertion) von Genkonversion wird durch Fehlpaarung von DNA-Strän- Nukleotiden verschiebt den Leserahmen. Durch die Ver- gen eine Sequenz des einen DNA-Stranges auf den zwei- änderung der Codons werden ab einer solchen Stelle an- ten übertragen. Die Allele der partial D-Phänotypen der dere Aminosäuren eingebaut oder es kommt zu einem Kategorie VI sind dafür ein Beispiel. Bei der Bildung einer vorzeitigen Stop-Codon mit Abbruch der Proteinsynthe- Haarnadel-Struktur der DNA kamen das RHD und RHCE se. Die Deletion des Guanin an Position 261 im Gen der Gen in unmittelbare Nachbarschaft, so dass korrespon- A-Transferase führt zu einem vorzeitigen Stop-Codon. dierende Exon-Abschnitte des RHCE Gens durch den Das resultierende Protein ist funktionslos und kann die H-Substanz nicht in das Antigen A umwandeln. Diese ge- Mechanismus der Genkonversion in das RHD-Gen eingebracht wurden (Abbildung 3). netische Variante (ABO*O.01.01) ist eine Ursache der Blutgruppe O. Die Deletion einer Sequenz von 17 Nukleotiden aus Exon 3 des Small Integral Membrane Protein 1 (SMIM1) ist Ursache des Vel-negativen Phänotyps. Rh D- ANWENDUNGSBEREICHE DER BLUTGRUPPEN-GENOTYPISIERUNG negative Afrikaner sind häufig Träger einer 37 Basenpaare großen Duplikation in Exon 4 des RHD-Allels (RHDΨ), Die Phänotyp-Vorhersage mittels molekularbiologischer die den Leserahmen verschiebt und ein vorzeitiges Stop- Methoden ist insbesondere nützlich für die Antikörperdia- bewirkt2. Die häufigste molekulare Ursache des gnostik und die Auswahl kompatibler Präparate zur Trans- Rh D-negativen Phänotyps ist jedoch die Deletion des fusion. Die Hämotherapie-Richtlinien schreiben im Rah- Codon RHD-Gens2. Gerbich-Phänotypen entstehen men von Schwangerschaften oder bei Bluttransfusionen durch Deletion ganzer Exone. Die Deletion von Exon 2 die Bestimmung erythrozytärer Alloantikörper vor. Wenn gesamten verursacht den Phänotyp GE:-2,3,4 (früher: Yus), das ein Antikörper nachgewiesen wird, ist die Spezifität des Fehlen von Exon 3 ist Ursache des Phänotyps GE:-2,-3,4 Antikörpers zu klären. Da normalerweise keine Alloanti- (früher: Ge). Typisch für den Lan-negativen Blutgruppen- körper gegen Antigene gebildet werden, die man selbst phänotyp ist das Vorliegen von Stop-Mutationen. Durch besitzt, kann die Phänotyp-Vorhersage die Antikörperdif- den Austausch einer einzelnen Base im entsprechenden Genabschnitt wird keine Aminosäure eingebaut, sondern ferenzierung unterstützen. Die molekularbiologische Phä- die Proteinsynthese wird unmittelbar gestoppt. notyp-Vorhersage wird insbesondere dann angewendet, wenn bei Vortransfusion des Patienten oder bei Vorliegen von Autoantikörpern die serologische Antigenbestim- Schließlich wurden noch Genkonversionen als Ursache mung kein verlässliches Ergebnis liefert. Für die Bestim- von Blutgruppenpolymorphismen beschrieben. Bei der mung einiger Antigene wie z. B. Dombrock stehen keine Intron Exon 1 JK*A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 838 Exon 8 ...GGACTCAGTCTTTCAGCCCCATTTGAGGACATCTACTTTG... GAC = Asparaginsäure(D) JK*B Exon 8 838 ...GGACTCAGTCTTTCAGCCCCATTTGAGAACATCTACTTTG... AAC = Asparagin(N) Abbildung 2: Nukleotidaustausch als Ursache eines Blutgruppenpolymorphismus. In Exon 8 des JK-Gens bewirkt der Nukleotidaustausch, dass anstelle der Asparaginsäure ein Asparagin in das Kidd-Protein eingebaut wird. Diese Veränderung am Protein unterscheidet die Blutgruppenantigene Jka und Jkb. 6 25 2015 Phänotypisierung Genotypisierung Welche Antigene sind Prinzipiell alle Antigene; Praktisch gibt es Eingeschränkt auf die Antigene, deren molekulare Basis zugänglich? nur für die wichtigsten 25 Antigene kom- bekannt ist, das sind etwa 300 Antigene. merzielle Typisierungsreagenzien in ausreichenden Mengen. Vorteile der Methode • Direktheit der • Antigene, für die keine kommerziellen Reagenzien Antigen-Antikörperreaktion • Nachweis der Genexpression verfügbar sind, werden für die Typisierung zugänglich. • Goldstandard für die Typisierung von weak D-Typen. • Screening von serologisch D-negativen Spendern auf potentielle minimale D-Expression. Nachteile der Methode Störung durch Autoantikörper • Indirekte Methode: ein bestimmter Genotyp wird für die Voraussage eines Phänotyps herangezogen. Kosten Standard In Abhängigkeit von der verwendeten Methode (in-house versus kommerzielle Assays) günstiger oder teurer als serologische Tests. Tabelle 1: Vor- und Nachteile von Phäno- und Genotypisierung im Vergleich geeigneten Seren zur Antigenbestimmung zur Verfügung ist somit Rh negativ. Bei Vätern von Risiko-Feten kann und für die Bestimmung seltener Blutgruppen sind Seren molekularbiologisch eine Zygotiebestimmung für RHD häufig nur im internationalen Austausch der Referenzla- vorgenommen werden, um die Wahrscheinlichkeit einer bore erhältlich. Hier stellt die Genotypisierung eine geeig- Problemschwangerschaft vorherzusagen. nete Alternative zur Identifikation geeigneter Spender dar. Serologie und molekulare Typisierung haben unterschiedIn Zukunft wird eine Massen-Genotypisierung von Spen- liche Vor- und Nachteile (Tabelle 1) und ergänzen sich da- derblutgruppen eine zunehmende Rolle spielen. Ziel her häufig hervorragend. Im Folgenden werden einige An- ist es einerseits, die Versorgung mit seltenen Blutgrup- wendungen näher dargestellt. pen zu verbessern und andererseits bezüglich „normaler Blutgruppen“ typisierte Spenden vorzuhalten. Eine Durchtypisierung von Spendern hinsichtlich der „normalen“ Allele erlaubt einen raschen Zugriff auf Präparate für Antikörper-Träger, auch bei schwierigen Antigenkonstel- MOLEKULARGENETIK IN DER THROMBOZYTEN- UND GRANULOZYTENDIAGNOSTIK lationen. Zudem ist es eher möglich, einen Patienten mit chronischer Transfusionsbedürftigkeit kompatibel bezüg- Alloantikörper gegen Thrombozyten und Granulozy- lich der klinisch wichtigsten Antigene zu versorgen. Dies ten können fetomaternale Inkompatibilitäten (Neonatale Alloimmunthrombozytenopenie = NAIT bzw. Neonatale gilt insbesondere für Patienten mit Thalassämie oder Sichelzellenanämie. Immunneutropenie = NIN) bedingen, Refraktärzustände gegen Transfusionen verursachen sowie schwere Trans- Die molekulare Blutgruppenbestimmung ist darüber hi- fusionsreaktionen (granulozytäre Antikörper => TRALI, naus ein wertvolles Hilfsmittel zur Identifizierung von thrombozytäre Antikörper => Posttransfusionspurpura) Schwangerschaften, bei denen ein Risiko für eine kind- auslösen. liche Erythroblastose besteht. Die Blutgruppengenotypisierung mit fetaler DNA aus Amnionzellen ist eine eta- Durch die Induktion einer Antikörperbildung wird eine blierte Methode. Zunehmend wird für die Vorhersage D positiver Feten auch kindliche DNA genutzt, die aus Struktur erst zum Antigen, daher steht am Beginn ei- dem Plasma D negativer Mütter isoliert werden kann. per/das Antiserum, also die Serologie. Anders als in der ner Antigentypisierung naturgemäß immer der Antikör- RhD ist das Blutgruppenprotein mit der weitaus höchsten erythrozytären Immunhämatologie sind aber zur Bestim- Immunogenität und für die fetale Erythroblastose immer mung der Thrombozyten (HPA)- und Granulozytenanti- noch der größte Risikofaktor. Etwa 15 % der deutschen gene (HNA) geeignete Typisierungsseren äußerst rar und Bevölkerung weist eine Deletion des RHD-Gens auf und schon gar nicht kommerziell erhältlich. Soweit die mo- 7 lekulare Grundlage eines Antigens bekannt ist, ist da- ses Antigen bilden Individuen, die HNA-2 nicht besitzen. her eine DNA-Typisierung der einfachere Weg der Anti- Das Fehlen von HNA-2 basiert auf einem Expressionsde- genbestimmung. Heute werden also mit Ausnahme des granulozytären Antigens HNA-2 sowohl HPA- als auch fekt, das Gen selbst ist auch bei HNA-2-negativen Individuen vorhanden5. Dieses Antigen ist daher einer PCR- HNA-Antigene routinemäßig mit molekularbiologischen Typisierung nicht zugänglich, sondern kann nur serolo- Methoden bestimmt. Molekularbiologisch liegen bei den gisch bestimmt werden. meisten HNA- und HPA-Antigenen singuläre Basenaustausche zugrunde, die beispielsweise durch eine PCR Bei HNA-1 ist die Situation relativ kompliziert. Bisher kennt mit sequenzspezifischen Primern (PCR-SSP) oder eine man vier Antigene, die von mindestens drei Allelen co- PCR mit anschließendem Restriktionsverdau (PCR-RFLP) diert werden5. Allerdings besteht keine eins-zu-eins-Be- nachgewiesen werden können. ziehung zwischen Allel und Antigen (siehe Tabelle 2). Beispielsweise wird HNA-1b von zwei Allelen codiert, HNA-1c Bei den Thrombozyten unterscheidet man derzeit nur von einem. Mit FCGR3B*02 codiert ein Allel für zwei 26 HPA-Antigene4. Klinisch relevant sind hauptsächlich Antigene5. Bei FCGR3B kann es zudem durch ungleiches die Antigene HPA-1 bis HPA-5 sowie HPA-15 (Tabelle 2). Crossing-over zur Gendeletion und Genduplikation kom- Bei den anderen HPA-Antigenen handelt es sich im We- men, so dass ein Individuum zwischen 0 und 4 Allele von sentlichen auch um biallele Systeme mit jeweils einem FCGR3B besitzen kann. Auf dem Gen FCGR3B gibt es sehr häufigen und einem sehr seltenen Allel, bei denen sechs Nukleotide, die für fünf Aminosäureaustausche co- sich aber bisher nur jeweils die seltene Variante als Anti- dieren, die wiederum für die Antigene verantwortlich sind. gen erwiesen hat (sogenannte Privatantigene). Die meis- FCGR3B*01 und FCGR3B*02 unterscheiden sich an fünf ten HPA-Antigene sind auf dem Glykoproteinkomplex IIb/ Nukleotidpositionen, FCGR3B*03 weicht um einen weite- IIIa lokalisiert. Antikörper gegen HPA-1a und HPA-5b sind ren Basenaustausch von FCGR3B*02 ab. Die derzeit an- mit 85 % bzw. 10 % der Fälle die häufigsten Auslöser ei- gewandte Typisierungstechnik (PCR-SSP) weist jeweils ner NAIT4, auch für eine PTP ist typischerweise Anti-HPA- ein oder zwei charakteristische Nukleotide pro Allel nach, 1a verantwortlich; anti-HPA-5b ist der häufigste HPA-An- was in den allermeisten Fällen ausreichend ist, um die für tikörper überhaupt. die HNA-1-Antigene charakteristischen Aminosäuren zu bestimmen. Der Nachweis aller fünf zu einem Allel ge- Bei den Granulozyten unterscheidet man derzeit fünf Antigen-Systeme (Tabelle 3)5. Im Gegensatz zur HPA-No- menklatur, die Antigen-basiert ist, ist die HNA-Nomenkla- hörenden polymorphen Nukleotide wird durch die Existenz des sehr ähnlichen Gens für den Fcγ-Rezeptor IIIa (FCGR3A) erschwert, dessen Amplifikation immer ausge- tur Protein-basiert, d. h. jeder Nummer im HNA-System schlossen werden muss. Eine solche „Allel-Typisierung“ liegt ein anderes Protein zugrunde, die antigenen Vari- erfordert eine Sequenzierung5. anten eines Proteins werden durch Buchstaben gekenn- Zellen vor. HNA-4 und HNA-5 liegen einfache Punktmu- Wie kann die Molekularbiologie die erythrozytenserologischen Untersuchungen bei Patienten unterstützen? tationen zugrunde, die mittels PCR-SSP gut nachweis- Bei prätransfusionellen Patientenabklärungen werden ge- bar sind. HNA-3 konnte bis 2009 nur serologisch und legentlich Diskrepanzen bzw. unklare Resultate bei der zeichnet. Die Antigene HNA-1 und -2 sind granulozytenspezifisch, HNA-3, -4 und -5 kommen auch auf anderen 8 auch nur eingeschränkt typisiert werden, da die moleku- Bestimmung von ABO, RhD, RhCE und weiteren Blut- lare Struktur des Antigens bis dahin noch unbekannt war. Anti-HNA-3a ist der häufigste HNA-Antikörper, somit gab gruppenantigenen beobachtet. Es kann sich dabei um es zumindest in spezialisierten Labors meist die Möglich- Isoagglutininbestimmung (ABO), Diskrepanzen zwischen Diskrepanzen handeln wie z. B. zwischen Antigen- und keit, zwischen HNA-3a-positiv und HNA-3a-negativ zu Phänotyp und Genotyp, oder unklare Resultate wegen unterscheiden. Heterozygote ließen sich aber nicht erken- Abschwächungen bei der Antigenbestimmung. Die Auf- nen. Anti-HNA-3b war zwar bei der Erstbeschreibung des klärung solcher Fälle ist meistens eine interdisziplinäre Antigensystems gefunden worden, stand aber später als Zusammenarbeit, die sowohl die Serologie als auch die Typisierungsserum nicht mehr zur Verfügung. Seit 2009 Molekularbiologie mit einschließt. In den letzten Jahren ist die molekulare Grundlage von HNA-3 aufgeklärt, auch wurden Hilfsmittel entwickelt, um diese Fälle einfacher hier handelt es sich um eine Punktmutation, die mittels abklären zu können. So kann z. B. die Abklärung beim PCR-SSP nachweisbar ist5. Somit ist auch die HNA-3- Vorliegen von Antikörpern gegen hochfrequente Antige- Typisierung außerhalb spezialisierter Labors möglich ge- ne (HFA) durch rekombinante Blutgruppenantigene und worden. HNA-2 ist ein Isoantigen. Antikörper gegen die- molekularbiologische Bestimmung (Genotypisierung) un- 25 2015 Antigen Synonym Lokalisation Allele Antigenfrequenz [%] HPA-1a Zwa, PlA1 GPIIIa ITGB3*176T 97,50 HPA-1b Zwb, PlA 2 ITGB3*176C 30,80 HPA-2a Kob GP1BA*482C 99,80 HPA-2b Koa, Siba GP1BA*482T 11,80 HPA-3a Baka, Leka ITGA2B*2621T 86,14 HPA-3b Bakb ITGA2B*2621G 62,92 HPA-4a Yukb, Pena ITGB3*506G > 99,90 HPA-4b Yuka, Penb ITGB3*506A < 0,10 HPA-5a Brb, Zavb ITGA2*1600G 98,79 HPA-5b Bra, ITGA2*1600A 20,65 HPA-15a Govb CD109*2108C 77,30 HPA-15b Gova CD109*2108A 74,87 GPIbα GPIIb GPIIIa GPIa Zava CD109 Tabelle 2: Klinisch relevante HPA-Antigene Antigen Lokalisation Allele Klinische Bedeutung Bemerkung HNA -1a FcγRIIIb = CD16b FCGR3B*01 NIN + TRALI Allele unterscheiden sich -1b FCGR3B*02 und *03 in mehreren Nukleotiden -1c FCGR3B*03 voneinander -1d FCGR3B*02 HNA-2 CD177 GP1BA*482C NIN + TRALI GP1BA*482T Isoantigen, Expressionsdefekt HNA-3a, -3b CTL2 SLC44A2*461G, *461A TRALI Punktmutation HNA-4a, -4b CD11b ITGAM*230G, *230A NIN Punktmutation HNA-5a, -5b(w) CD11a ITGAL*2372G, *2372C NIN Punktmutation Tabelle 3: HNA-Antigene terstützt werden. Mit folgenden Fallbeispielen aus dem angesetzt. Die Testergebnisse zeigen, dass es sich um Schweizerischen Referenzlabor wird das Zusammenspiel die ABO-Variante ABO*AEL.01 handelt. Der Genotyp ist von Serologie und Molekularbiologie erläutert. ABO*O.01.01/*AEL.01. Früher konnte diese Variante (Ael, el für Elution) nur mittels Adsorption-Elution detektiert Fallbeispiel 1 (ABO): Die Probe wird zur Abklärung auf- werden, heutzutage gilt die molekularbiologische Unter- grund fehlender Isoagglutinine gegen A1- und A2- Test- suchung als Gold-Standard. Patienten mit dieser ABO- erythrozyten eingesendet. Die Wiederholung der Antigen- Variante wird Blut der Gruppe O verabreicht. bestimmung der Antigene A- und B fällt negativ aus. Die Isoagglutininbestimmung gegen B-Testerythrozyten fällt Fallbeispiel 2 (RhE): Die folgende Probe wurde uns we- positiv aus, während die Isoagglutininbestimmung ge- gen einer Abschwächung bei der RhE- Antigenbestim- gen A1- und A2-Testerythrozyten negativ ist. Es könnte mung zugewiesen. Der Patient war positiv für die Anti- sich hier um eine A-Untergruppe handeln, die serologisch gene RhC, Rhc und Rhe. Die RhE-Antigenbestimmung nicht zu detektieren ist. DNA von der Probe wird extrahiert und ein ABO-Kit (ABO Type, BAGene, BAGHealthcare) zeigte mit einem monoklonalen Anti-E Antikörper (ID-Gel) ein abgeschwächtes Resultat, während das Resultat mit 9 RhesusBox A RhesusBox RHD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 C 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B RHCE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RHD*06.01, DVI Typ 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RHD*06.02, DVI Typ 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RHD*06.03, DVI Typ 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RHD*06.04, DVI Typ 4 Abbildung 3 Die Gene RHD und RHCE befinden sich in gegenläufiger Orientierung auf Chromosom 1 (A). Bei Duplikations- oder Reparaturvorgängen kann sich eine Haarnadelformation ausbilden, bei der die Gene nebeneinander zu liegen kommen (B). Liest die Polymerase streckenweise vom falschen DNA-Strang ab, werden dessen Sequenzen in den parallel gegenüberliegenden Strang eingebaut. Die Varianten des partial D Kategorie VI sind durch derartige Konversionsvorgänge entstanden (C). polyklonalen humanen Anti-E Antikörpern (ID-Gel) sogar Zur weiteren Abklärung wurden Testerythrozyten mit dem negativ ausgefallen ist. Weitere monoklonale Anti-E Anti- seltenen Phänotyp In(Lu) verwendet. Bei diesem Phäno- körper ergaben unterschiedliche Resultate. Diese Reakti- typ sind unter anderem alle Antigene im Lu-System so onen ließen auf eine RhE-Variante schließen. Aus diesem stark unterdrückt, dass der Phänotyp als Lu(a-b-) er- Grund wurde das RHCE-Gen sequenziert. Im Exon 3 scheint. Diese Zellen zeigten mit dem Patientenserum ne- sind drei Mutationen, 361A > T, 380C > T und 383A > G, gative Resultate. Des Weiteren konnten Antikörper gegen vorhanden, die bei der Allel-Variante RHCE*03.15.02 Lu6, Lu8 und Lu23 ausgeschlossen werden. Nur mit ei- (RHCE*cEJU) bekannt sind. Patienten mit dieser RhE-Va- ner Lu13 negativen Testzelle konnte ein negatives Resul- riante wird RhE-negatives Blut verabreicht. tat beobachtet werden. Zur Bestätigung eines Anti-Lu13 wurden die Exone 11 und 13 des LU-Gens sequenziert. Fallbeispiel 3 (Anti-Lu13): Die Probe wurde uns von ei- Die Sequenzierung zeigte die Mutationen, 1340C > T und nem regionalen Blutspendedienst mit dem Verdacht auf 1742A > T, die für die Allel-Variante LU*02.-13 bekannt sind. einen Antikörper gegen ein hochfrequentes Antigen zu- Da die klinische Relevanz dieses Antikörpers nicht ein- gewiesen. Die Blutgruppe und der Phänotyp des Patien- deutig ist (wenig bekannte Fälle), wird die Transfusion von ten war B Rhccddee. Der direkte Antihumanglobulintest Lu13 negativem Blut, wie z. B. Lu(a-b-)-Blut, empfohlen. mit polyvalentem Serum und mit Anti-IgG ergab ein negatives Resultat. Das Serum des Patienten reagierte positiv mit allen Testzellen im indirekten Antihumanglubulintest (IAT) und im Enzymtest mit Papain. Dagegen zeigte das Patientenserum im IAT mit Testzellen, die mit dem Enzym WEAK D-DIAGNOSTIK ZUR FESTLEGUNG DER TRANSFUSIONSUND PROPHYLAXESTRATEGIE Trypsin behandelt wurden, negative Resultate. Aufgrund 10 dieser Resultate kommen am ehesten Antikörper gegen Einen festen Stellenwert in der Diagnostik besitzt mitt- HFAs des Lutheran-Systems (Lu) in Betracht. Der am lerweile die Abklärung des D-Status von Personen mit häufigsten vorkommende Antikörper gegen ein HFA im Lu-System ist Anti-Lu(b). Der Patient ist jedoch Lu(a-b+). gen D Bestimmung mittels PCR. schwachen oder diskrepanten Reaktionen bei der Anti- 25 2015 Bei einem rein serologischen Vorgehen besteht das Pro- Typ 4; hier gibt es unterschiedliche Subtypen (siehe blem, dass eine ganze Reihe unterschiedlicher D Formen unten). bei der serologischen Untersuchung auffallend schwach • Partial D Formen mit geringer Antigendichte. Insgesamt reagiert: sind in der „RhesusBase“ über 100 Partial D Formen gelistet, von denen allerdings nicht alle eine niedrige • Die „häufigen“ weak D Typen Typ 1, Typ 2, Typ 3. Diese Antigendichte haben. weak D Typen sind vergleichsweise häufig, werden auf Grund ihrer noch einigermaßen hohen Antigendichte Die serologische Abklärung des „schwachen oder diskre- öfters D positiv transfundiert und trotzdem wurde bis- panten D“ endet spätestens mit dem Einsatz von Panels her noch keine Allo-Anti-D-Immunisierung nachge- unterschiedlicher monoklonaler Antikörper. Diese Panels wiesen. Die D positive Transfusion von Personen mit sind bei mehreren Herstellern erhältlich und gut geeig- weak D Typ 1, Typ 2 und Typ 3 gilt daher als sicher. net, die typischen Partial D wie D Kategorie IV, V, VI, VII, DHAR oder DFR zu erkennen. Eine Unterscheidung der • Weak D Typen, bei denen eine Anti-D-Immunisierung unterschiedlichen weak D Typen ist jedoch nicht möglich, b e o b a c h et w u rd e, w i e we a k D Ty p 11, Ty p 15, und selbst eine sichere Abtrennung mancher Partial D mit Typ 33. Hier ist es offensichtlich, dass eine D negativ niedriger Antigendichte (z. B. DHMi) ist oft kaum mach- Transfusionsstrategie gewählt werden muss. bar. Da Partial D nur eine Minderzahl der Proben zugrun- • Zahlreiche andere weak D Typen (Abbildung 4); in der de liegt, die mit den Anti-D schwach oder diskrepant re- „RhesusBase“ (http://www.rhesusbase.info) sind über agieren, bleibt bei der Mehrzahl der Proben nach serolo- 100 weak D Typen bzw. Subtypen gelistet. Bei die- gischer Abklärung nur die Aussage „Könnte ein häufiger sen Typen gibt es im Regelfall keine Information, ob weak D Typ sein – muss es aber nicht“. ihre Träger D positiv transfundiert werden können, da zwar einerseits keine Anti-D-Immunisierung beschrie- Mit molekularen Methoden ist es dagegen möglich, ganz ben wurde, sie aber andererseits so selten sind, dass gezielt auf die Polymorphismen (Veränderungen der Nu- man dies auch nicht erwarten kann, oder eine derart kleotidsequenz) zu testen, die bei den häufigen weak D niedrige Antigendichte besitzen, dass man davon aus- Typen verändert sind. Man muss somit nicht nach dem gehen muss, dass ihre Träger bisher stets D negati- Ausschlussprinzip arbeiten, sondern kann mit drei Tests ve Präparate erhalten haben. Ein Sonderfall ist weak D – dem Test auf weak D Typ 1, dem Test auf weak D Typ 2 286 32 53 11 2 72 94 110 75 131 154 169 134 226 188 238 207 283 257 352 264 307 370 333 389 Typ 2 Typ 3 Typ 1 Weak D Typ 5–11: max. 2 Proben je Typ Weak D Typ 3: 7 Proben Weak D Typ 2: 43 Proben Weak D Typ 4: 6 Proben Partial D: 2 Proben Weak D Typ 1: 95 Proben 417 Abbildung 4 Schematische Darstellung des RhD-Proteins und Aminosäurepositionen, in denen bei weak D Mutationen gefunden wurden. Positionen, an denen mehrere unterschiedliche Mutationen gefunden wurden, sind rot oder orange dargestellt, solche, an denen bisher nur eine Mutation entdeckt wurde, blau. Die hellblauen bzw. orangen Positionen sind die Positionen, die schon bei der Erstbeschreibung1 (Insert: Frequenz unter den damals untersuchten Proben) gefunden wurden. Die Position der Mutation bei den häufigsten weak D Typen 1, 2 und 3 ist gekennzeichnet. 11 und dem Test auf weak D Typ 3 – in über 90 % das Allel 2.Falls auf die molekulare Diagnostik verzichtet wird, wie des Patienten bestimmen und somit zu einer Aussa- soll dann weiter vorgegangen werden? Auf den ers- ge kommen. Das ist natürlich wesentlich befriedigender ten Blick erscheint hier eine D negative Versorgung als die serologisch zu erzielende Aussage. In der Pra- die sicherere Variante, sie impliziert jedoch einen un- xis enthalten die entsprechenden Kits zudem meist noch nötig hohen Verbrauch D negativer Präparate und un- Nachweisreaktionen für weitere wiederholt beobachtete nötige Gaben von Rhesusprophylaxen (falls man nicht weak D und Partial D mit geringer Antigendichte. In der ohnehin in diesem Fall stets die molekulare Abklärung großen Mehrzahl der Proben erhält man so durch relativ wählt). Aus diesem Grund sehen viele Empfehlungen geringen Aufwand ein eindeutiges Ergebnis. unter bestimmten Bedingungen (z. B. in den deutschen Richtlinien von 2010: eindeutig positive Reaktionen Insgesamt besteht zum Vorgehen international weitge- mit beiden Antikörpern) für diesen Fall eine D positive hender Konsensus (Abbildung 5). Lediglich drei, aller- Transfusionsstrategie vor. Dies impliziert jedoch, dass dings wesentliche Punkte, sind Gegenstand z. T. heftiger gelegentliche Anti-D-Immunisierungen in Kauf genom- Diskussionen: men werden, was besonders bei Frauen im gebärfähigen Alter unglücklich wäre. 1.Soll in jedem Fall eine molekulare Diagnostik durchgeführt werden, wenn abgeschwächte oder diskrepante Reaktionen auftreten? Hier reicht die Palette der Antworten von „in jedem Fall“7 über „bei Frauen vor der Menopause oder langfristigem Transfusionsbedarf“8 bis zu „eine Klärung ist anzustreben“. Letztlich ist es eine Frage nach Aufwand und Nutzen. Auch wenn die molekulare Untersuchung auf den ersten Blick teuer erscheint, zeigten Berechnungen, dass sich beispielsweise bei europäischen Frauen vor der Menopause durch den Wegfall unnötiger Rhesusprophylaxen die Versorgung kostengünstiger werden würde.9 12 3.Bei weak D Typ 4 ist die optimale Versorgungsstrategie umstritten. Bei weak D Typ 4.0 wurden ein(zelne) Fall/ Fälle von Anti-D-Immunisierung beobachtet, was ein Expertengremium bewog, sich nicht für eine D positive Transfusionsstrategie auszusprechen. Für weak D Typ 4.1 ist die Beweislage dagegen analog weak D Typ 1 bis 3: Es ist einigermaßen häufig (etwa 1 % aller Spender mit Rhesusformel ccD.ee), wird nahezu immer als D positiv bestimmt und entsprechend transfundiert und bisher wurde trotzdem noch nie eine AntiD-Immunisierung bei weak D Typ 4.1 beobachtet. Bei 25 2015 weak D Typ 4.2 ist es gerade umgekehrt: Personen mit det Antikörper gegen Rhesus-D-positive fetale Blutzellen. weak D Typ 4.2 können leicht gegen normales D immu- Diese Antikörper können durch die Plazenta in den kindli- nisiert werden und benötigen D negative Versorgung chen Kreislauf gelangen und sich dort mit Rhesus-D-po- und ggf. Rhesusprophylaxe. sitiven roten Blutkörperchen des Feten verbinden, die dadurch zerstört (hämolysiert) werden. Sind viele Antikörper Tendenziell dringen die in den letzten Jahren formulierten durch die Mutter gebildet worden, kann es zu einer mas- Empfehlungen auf eine molekulare Abklärung zumindest siven Hämolyse kommen, die dann eine schwere Blutar- bei Frauen im gebärfähigen Alter. mut des ungeborenen Kindes zur Folge hat. Die pränatale Bestimmung des fetalen Rhesusfaktors (oder ande- Pränatale Blutgruppenbestimmung aus dem Blut der Mutter Eine Blutgruppenunverträglichkeit zwischen rer Blutgruppen) ist daher von klinischer Bedeutung. Ziel der pränatalen Diagnostik ist neben der Bestimmung des einer Schweregrades der kindlichen Anämie auch die Analy- Schwangeren und dem ungeborenem Kind stellt eine se der fetalen Blutgruppe mittels molekulargenetischer schwerwiegende Komplikation innerhalb der Schwanger- Methoden. schaft dar. Möglich ist eine solche Unverträglichkeit für jedes Blutgruppensystem, über 90 % der Fälle betreffen Das Vorhandensein freier fetaler DNA im Plasma bzw. Se- allerdings das sogenannte Rhesus-D Merkmal. Liegt die rum von Schwangeren wurde bereits 1997 von Lo und Konstellation einer Rhesus-D-negativen Mutter und eines Mitarbeitern beschrieben10. Die Untersuchung dieser Rhesus-D-positiven Kindes vor, kommt es bei der Mutter DNA wird seitdem zunehmend als nicht-invasive Alter- zu einer Immunantwort. Der mütterliche Organismus bil- native zu bekannten Techniken wie Chorionzottenbiopsie, Untersuchung mit monoklonalen Anti-D Beide Anti-D +++ Beide Anti-D negativ Abgeschwächte/ Diskrepante Reaktionen 1 Keine molekulare Abklärung Molekulare Abklärung weak D Typ 1, 2, 3 2 weak D Typ 4.0 Typ 4.1 weak D Typ 4.2 andere Typen Partial D 3 D pos. Transfusionen D neg. Transfusionen Keine RhesusProphylaxe Benötigt RhesusProphylaxe Abbildung 5 Entscheidungsschema zur serologischen und molekularen D-Diagnostik. Dargestellt ist einerseits der aktuelle interantionale Konsens – molekulare Abklärung bei abgeschwächten/diskrepanten Reaktionen, D positive Transfusionsstrategie für weak D Typ 1, Typ 2 und Typ 3, D negative Transfusionsstrategie für Partial D und seltene weak D, – als auch die derzeit wesentlichen Kontroversen (siehe auch Text): 1: In welchen Fällen soll die molekulare Abklärung erfolgen, 2: Welche Transfusionsstrategie soll ohne molekulare Abklärung eingeleitet werden und 3: Wie soll bei weak D Typ 4.0 und Typ 4.1 vorgegangen werden. 13 Amnioszentese oder Cordozentese genutzt. Unabhängig Für die Bestimmung des Rhesus-D Merkmals bedeutet von der Technik, invasiv oder nicht-invasiv, unterscheidet dies, dass jede Rhesus-D positive Reaktion auf die Blut- sich die pränatale Blutgruppendiagnostik in einem Punkt gruppe des Feten hinweist, da die Mutter Rhesus-D ne- sehr deutlich von einer normalen Patientendiagnostik: gativ ist. Problematischer sind die Proben, in denen der während bei der Genotypisierung von Patienten meistens Fetus scheinbar Rhesus-D negativ ist. Hier sind Kontrol- die Ergebnisse einer serologischen Untersuchung vorlie- len notwendig, die das Vorhandensein fetaler DNA be- gen, sind diese Informationen bei einer pränatalen Unter- weisen. Für männliche Feten ist die gleichzeitige Verviel- suchung nicht vorhanden. Demzufolge ist eine Plausibili- fältigung Y-spezifischer DNA-Sequenzen (z. B. Y-AMEL) tätskontrolle der Ergebnisse nicht möglich. ausreichend, um mütterliche und fetale DNA zu unterscheiden. In Teil B der Abbildung 6 sind mögliche Ergeb- Die Vorgehensweise bei der nicht-invasiven pränatalen nisse einer Untersuchung auf das fetale Rhesus-D Merk- Blutgruppenbestimmung ist recht einfach: mit einer simp- mal dargestellt. Hier zeigt sich in der Teilabbildung 6B(d) len venösen Blutentnahme kann zellfreie DNA isoliert und ein negatives Ergebnis sowohl für das Rhesus-D Merk- durch den Einsatz eines PCR-Verfahrens vervielfältigt mal als auch für die Y-spezifischen Sequenzen. Es kann werden (Abbildung 6A). Grundsätzlich kann nur ein Blut- als Rhesus-D negativer, weiblicher Fetus interpretiert wer- gruppenmerkmal bestimmt werden, für das die Schwan- den, denkbar ist aber auch eine nicht ausreichende Men- gere selber negativ ist, da die isolierte zellfreie DNA ei- ge an fetaler DNA in der PCR bzw. ein technisches Ver- ne Mischung aus mütterlicher und fetaler DNA darstellt. sagen der Nachweismethode. Eine solche Probe kann A Zentrifugation 1.500-5.000 g 3.000-15.000 g 3.000 g mütterliches Blut 1 ml Plasma 3.000 g Extraktion freier Plasma DNA und PCR B 1.000 a b RHD und Y-AMEL pos Y-AMEL pos 1.000 E-1 1.000 E-2 1.000 E-3 RHD neg 1.000 E-4 RHD-negativ, männlich RHD-positiv, männlich 1.000 E-5 1.000 c d RHD pos 1.000 E-1 RHD und Y AMEL neg 1.000 E-2 1.000 E-3 Y-AMEL neg 1.000 E-4 nicht interpretierbar: RHD-negativ, weiblich? RHD-positiv, weiblich 1.000 E-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Abbildung 6A: A) Vorgehensweise zur Gewinnung zellfreier DNA und B) Nachweis des kindlichen Rhesus-D Merkmals mittels PCR. Die Interpretation der Ergebnisse ist in Grau unterlegt. 14 25 2015 nur durch weiterführende Untersuchungen interpretiert Anti-D im Verlauf von Schwangerschaften nicht mehr werden. Hierfür werden natürlich vorkommende Varian- durchbrechen. Aus dieser Erkenntnis leitet sich die For- ten auf dem menschlichen Erbgut als interne Kontrolle derung ab, transfusionsbedingte Anti-D-Immunisierun- genutzt. Das Muster der mütterlichen Varianten wird mit gen bei prämenopausalen Frauen so gut wie möglich zu dem des ungeborenen Kindes verglichen, ohne dass eine vermeiden. Voraussetzung dazu ist selbstverständlich, väterliche Blutprobe vorhanden sein muss. Jedes positive Signal aus der PCR der Plasma DNA, das nur beim Kind dass als D negativ deklarierte Präparate tatsächlich D negativ sind. nicht aber bei der Mutter zu finden ist, muss demnach vom Vater herrühren und folglich fetalen Ursprungs sein. Hier stellt sich die Frage, „wie wenig” D-Antigen noch immunogen sein kann. Kaum jemand bezweifelt, dass die In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass die Transfusion eines Erythrozytenpräparates mit weak D Ergebnisse einer fetalen Rhesus-D Genotypisierung aus oder DEL ein deutlich geringeres Anti-D-Immunisierungs- dem Plasma der Mutter sehr gut mit dem tatsächlichen risiko als die Transfusion eines typischen D positiven Prä- Phänotypen übereinstimmen. Durch die Einführung von parates verursacht. Es werden jedoch immer wieder Fäl- Kontrollen für das Vorhandensein fetaler DNA kann eine le von Anti-D-Immunisierung durch für D negativ gehal- sichere pränatale Rhesus-D Bestimmung des ungebore- tene weak D oder DEL Präparate berichtet. Dabei wurde nen Kindes durchgeführt werden, ohne dass hierfür eine zumindest ein Teil der verursachenden weak D Präparate Fruchtwasserpunktion nötig ist10–13. Dieses Vorgehen hat beim D Nachweis im indirekten Coombstest übersehen. zwei große Vorteile: 1.Eine Fruchtwasserpunktion wird der Pränatalmediziner erst ab der 15. Schwangerschaftswoche durchführen. Die Isolierung freier fetaler DNA aus dem Blut der Mutter ist aber schon ab der 11. Schwangerschaftswoche möglich, in einzelnen Fällen konnte die Blutgruppe bereits in der 9. Woche bestimmt werden. 2.Insbesondere in Fällen, in denen die Mutter bereits Antikörper aus vorangegangenen Schwangerschaften besitzt, ist die neue Methode von großem Vorteil. Durch die Fruchtwasserpunktion können vorhandene Antikörper so stimuliert werden, dass eine noch stärkere Produktion einsetzt, die das Wohlergehen des Feten massiv gefährdet. Die Antwort auf die Frage lautet daher „so wenig, dass es mit serologischen Methoden nicht mehr sicher erfasst werden kann“. Mit DEL bezeichnet man D-Varianten, bei denen sich das Antigen D nur mit Adsorption/Elution nachweisen lassen. DEL wurde anfangs für eine ganz vorwiegend im asiatischen Raum auftretende Besonderheit gehalten, mittlerweile ist jedoch klar, dass auch in Zentraleuropa die Frequenz unter scheinbar D negativen Blutspendern bei 1:350 bis 1:2.000 liegt14. Mittlerweile unterscheidet man über dreißig unterschiedliche Formen, wobei es jedoch bei einigen Formen nicht klar ist, ob sie nicht doch eher D negativ oder ein weak D sind. Typische Ursache sind Mutationen an Spleißstellen, die die Ausbildung eines normalen RhD-Proteins behindern. Besonders häufig ist DEL unter C positiven, serologisch D negativen Spendern. TESTUNG RHESUS D NEGATIVER BLUTSPENDER AUF SPUREN VON D-ANTIGEN MITTELS RHD PCR Der serologische Nachweis von DEL mittels Adsorption/ Elution ist extrem aufwändig und für das Routine-Spenderscreening nicht geeignet. Durch die RHD PCR der Unter den irregulären Antikörpern nimmt Anti-D eine Son- Blutspender ergibt sich hier ein völlig neuer Ansatz. Das derstellung ein, da es nach wie vor die häufigste Ursache RHD-Gen von Personen mit weak D oder DEL unter- eines schweren Morbus hämolyticus neonatorum/fetalis scheidet sich bei den meisten Formen nur in minimalen ist. Glücklicherweise existiert mit der Anti-D-Prophylaxe Details von dem RHD-Gen von „normal“ D positiven Per- eine effektive Methode der Primärprophylaxe, Verfahren sonen. Bei der Untersuchung mit den allermeisten RHD zur Sekundärprophylaxe haben dagegen das experimen- PCR Verfahren ist es daher praktisch nicht möglich, die- telle Stadium noch nicht verlassen. se Spender mit den „typischen“ D negativen Spendern (die kein RHD-Gen besitzen) zu verwechseln. Das Prob- Daraus ergibt sich die besondere Bedeutung der Vermei- lem besteht eher darin, D negative Spender, die ein inak- dung der Anti-D-Immunisierung: Wurde eine Patientin erst einmal beispielsweise durch eine Transfusion Anti-D im- Testung der Blutspender mittels RHD PCR ist somit die tives RHD-Gen besitzen, nicht für D positiv zu halten. Die munisiert, so kann auch eine korrekt gegebene Anti-D- ideale Ergänzung zur serologischen D Testung, um die Prophylaxe den Kreislauf zunehmender Boosterung des Sensitivitätslücke zu schließen. 15 Mittlerweile hat eine ganze Reihe von Blutspendediens- durch kombinierte Antikörperspezifitäten gegen die übli- ten die RHD PCR in der einen oder anderen Form in das chen (polymorphen) Antigene zustande kommen (bei ei- Spenderscreening aufgenommen. Dabei gibt es im De- ner Kombination von Anti-C, -M, -Fya liegt die Prävalenz tail unterschiedliche Vorgehensweisen: Einige Blutspen- des verträglichen Bluttyps z. B. bei 2 %), oder es handelt dedienste konzentrieren sich auf Erstspender, was lo- sich um Antikörperspezifitäten gegen hochfrequente Anti- gistisch besonders einfach ist, andere haben auch ih- gene (HFA; der HFA-negative Typ ist dann per se ein „sel- re Altspender untersucht. Einige konzentrieren sich auf tener Bluttyp“). Spender mit „C“ oder „E“, da hier DEL besonders häufig Typ 4.3 zu entdecken. Führt man die RHD PCR zusätz- Wo liegen die Vorteile der genetischen Spendertypisierung? ist, andere testen auch ccddee Spender, um z.B: weak D lich zur „offiziell ausreichenden“ serologischen Testung Grundsätzlich ist egal, ob Spendertypisierungsprogram- im indirekten Coombstest durch, kann man ein sehr einfaches und billiges System benutzen, andererseits spart me serologisch oder molekularbiologisch durchgeführt werden. Die Routineparameter ABO, Rh-Phänotyp, Kell man die Kosten des indirekten Coombstests, wenn die sind Domänen der Serologie (bei Rh D, insbesondere bei RHD PCR so ausgelegt ist, dass sie ihn vollständig erset- Varianten, ist dies allerdings schon differenzierter zu be- zen kann. Dieser Ansatz wurde in der Schweiz übernom- trachten, siehe entsprechende Kapitel dieses Artikels), bei men, dort ist die RHD PCR der Blutspender mittlerweile der Typisierung eines erweiterten Spektrums von Antige- obligatorisch. nen ist man serologisch praktisch aber auf etwa 25 Anti- Nicht unerwähnt bleiben sollte der größte Nachteil der Verfügung stehen (siehe auch Tabelle 1). gene eingeschränkt, für die kommerzielle Reagenzien zur RHD PCR: es fallen auch D negative Spender auf, die ein inaktives RHD-Gen tragen, und die Abgrenzung dieser Molekularbiologisch gibt es diese Einschränkungen be- Spender von DEL kann sehr aufwändig werden, vor allem züglich Verfügbarkeit von Reagenzien nicht. Hier können wenn nicht eines der „häufigeren“ Formen inaktiver RHD- all jene Antigene typisiert werden, die molekular, respek- Gene vorliegt. Die Frequenz derartiger Spender ist ver- tive auf DNA- bzw. Allel-Ebene charakterisiert sind und gleichbar mit der Frequenz von DEL-Spendern. Diese auf- das ist derzeit bereits für etwa 300 Antigene der Fall. Aber wändigen Abklärungen haben damit nur wenig Auswir- nicht alle diese Antigene sind in der Praxis gleicherma- kung auf die Gesamtkosten der Spenderdiagnostik. ßen wichtig. Hochdurchsatz-Genotypisierung von Blutspendern Welche Antigene werden üblicherweise in Spendertypisierungsprogramme eingeschlossen? Warum müssen Blutspendedienste große Kohorten ihrer Spender auf ein weites Antigenspektrum typisieren? Spendertypisierungsprogramme schließen meistens die Rund zwei Prozent der Erythrozytenkonzentrate (EK) körper gebildet werden. Das sind jene Antigene, die typi- werden für die Versorgung von Patienten mit irregulären antierythrozytären Antikörpern benötigt. differenzierungspanels angeführt werden. Neben diesen wichtigsten Antigene des RH-, MNS-, Kell-, Kidd- und Duffy-Systems ein, gegen die in der Praxis häufig Antischerweise z. B. auch in den kommerziellen Antikörper„polymorphen“ Antigenen ist die Typisierung der Blut- Um diese Antikörperträger im Bedarfsfall rasch und ad- 16 spender bezüglich einiger hochfrequenter Antigene (HFA) äquat mit EKs versorgen zu können, müssen Blutspen- wichtig, um HFA-negative Sonderspender, also Men- dedienste einen Teil ihrer Spender, neben den routinemä- schen mit seltenen Bluttypen (Rare Blood), zu finden. Da- ßig bestimmten Antigenen ABO, Rh D, Kell und RhCcEe- bei decken die fünf HFA-Spezifitäten, k, Yta, Kpb, Vel und Phänotyp, auf etliche weitere Antigene insbesondere im Lub, zusammen rund drei Viertel der HFA-Antikörperprä- Kell-, Kidd-, Duffy- und MNS-Blutgruppensystem typisie- valenz bei Europäern ab. Die Suche ist aufwendig: um ei- ren. Nur eine große Anzahl typisierter Spender bzw. An- nen negativen Spender zu finden, müssen im Falle von Vel tigene in den Datenbanken garantiert, dass im Anlass- etwa 4.000, im Falle von Kpb etwa 10.000 Personen un- fall Antikörperträger rasch mit kompatiblem Blut versorgt tersucht werden. Insbesondere für die Suche nach Men- werden können. Je seltener der kompatible Bluttyp in der schen mit diesen seltenen Bluttypen sind kommerzielle Spenderpopulation vorkommt, desto aufwendiger wird serologische Reagenzien nicht in ausreichender Menge die Suche für die Blutspendedienste. Einerseits können verfügbar, hier bietet die genetische Spendertypisierung solche niedrigen Prävalenzen von passenden Bluttypen deutliche Vorteile. 25 2015 Population Getestete „D negative” Spender Gefundene DEL Frequenz DEL unter „D neg“ Dänemark 5.058 (4.932 Ergebnisse) 2* 1:2.029 Norddeutschland 46.756 76 1:615 Südwestdeutschland 46.133 47 1:982 Oberösterreich 23.330 66 1:353 Tabelle 4: Populationsstudien zu DEL in Zentraleuropa (modifiziert nach [14]) *Zuzüglich einem Spender mit RHD (IVS3+1G>A), der als D negativ charakterisiert wurde. DRK Springe SRK Bern SRK Zürich ÖRK Wien DRK Hagen Typisierte Spender 60.000 22.000 37.000 25.000 7.500 Eingeschlossene 16/4 20/6 46/13 35/12 22/7 M, N, S, s M, N, S, s, He, U* M, N, S, s M, N, S, s Antigene/davon HFA Antigene, M, N, S, s HFA sind Lua, Lub hervorgehoben Kpa, Kpb Fya, Fyb Jka, Lua, Lub K, k, Kpa, K, K mod , k, Kpb Fya, Fyb, FybWK , Fy0 Jkb Fya, Fyb, Kpa, FybWK , Kpb Fy0 Lua, Lub, K, k, Kpa, Jsa, K11, KEL17, Kpc Dia, Fya, Wra, Wrb Fyb, FybWK , Yta, Ytb, Jka, Jkb Yta, Ytb Jka, Jkb Coa*, Cob* Yta, Coa, Dia, *Statt Coa Ytb Kpb, Jka, Jkb ,Jkab, Jknull Dib, Cob Dib, Lua, Lub, Lu8, Lu14 Lu8, Lu14 Wra, Jsb Kpa, Kpb Fya, Fyb Fy0 Jka, Jkb Yta, Ytb Wrb Coa, Cob, AQP1-Def. Coa, Cob LWa, LWb Yta, Ytb Doa, Dob Doa, Ina, Inb Coa, Vel bei den letzten SC:1, SC:2 Ina, 15.000 Personen Doa, Dob Doa, Dob Vel getestet Vel, Velnull wurde Dob Cob Inb ABO D, C, c, E, e, Cw *teilweise Abdeckung Methode Multiplex-PCR; Multiplex-PCR; Multiplex-PCR; Multiplex-PCR; Multiplex-PCR; Kapillar-Gel- Kapillar-Gel- MALDI-TOF Gel-Elektrophorese MALDI-TOF Elektrophorese Elektrophorese High-throughput ++ ++ +++ + +++ Materialkosten 0,14 €/Antigen 0,3 €/Antigen k. A. 0,14 €/Antigen k. A. Tabelle 5: Genetische Spendertypisierung im deutschen Sprachraum Genetische Spendertypisierungsprogramme wendig, um derart große Spenderkollektive mit vertretbarem Aufwand durchtypisieren zu können. International haben bereits etliche Blutspendedienste genetische Spendertypisierungsprogramme implementiert. Die derzeit verwendeten Assays sind alle, allerdings in un- Im deutschen Sprachraum dominieren verschiedene terschiedlichem Maße, für eine Hoch-Durchsatz-Typisie- „in-house“-Verfahren (Tabelle 5), Eigenentwicklungen der Institute, die teilweise deutliche Kostenvorteile gegenüber rung geeignet, das bedeutet, dass pro Arbeitstag mit den Methoden bis mehrere tausend Antigene typisiert wer- den kommerziellen Tests, aber auch gegenüber der Phä- den können (z. B.: 96 Spender á 35 Antigene ergibt 3.360 notypisierung aufweisen. Diese Kosteneffizienz ist not- Typisierungsergebnisse). 17 Große Kollektive typisierter Spender sind die Methode der handelte. Vergleichbare Beobachtungen wurden auch im Wahl um ausreichend Sonderspender mit seltenen HFA- Blutgruppensystem MNSs gemacht. In der Tat sind diese negativen Bluttypen zu finden und für eine rasche und adäquate Versorgung von Antikörperträgern. „Genotypisierungs-Fehler“ also keine „eigentlichen Fehlbestimmungen“, sondern technisch korrekte Signale und gleichzeitig hoch spezifische Indikatoren für das Vorlie- Wie tauglich ist die genetische BlutgruppenBestimmung für die Routine-Nutzung? gen sehr seltener, meist neuer Blutgruppen-Varianten. Alle „Genotypisierungs-Fehler“ der oben erwähnten Studie Diskrepante Resultate zwischen der serologischen Blut- und auch der an 6.000 Blutspendern durchgeführte Se- gruppenbestimmung (Phänotyp) und der Genotypisie- ro/Geno-Vergleich am Blutgruppensystem MNSs (Manu- rung (Genotyp) fallen vor allem bei der Untersuchung skript in Vorbereitung), waren immer seltener, oder höchs- hoher Probenzahlen (Hochdurchsatz wenige 100 bis tens gleich selten, wie „serologische Fehler“. mehrere 1.000 Proben pro Tag) beinahe schon mit vorhersagbarer Regelmäßigkeit und in jedem Blutgruppen- Zusätzlich ist die vorläufige Konzentration der Technologie system an. Grundsätzlich sollten derartige Diskrepanzen im Hochdurchsatz auf Blutspender, nicht jedoch auf Emp- an frischen Zweitproben serologisch und genetisch über- fänger ausgerichtet. Empfänger, oder Patienten benöti- prüft werden. Diskrepanzen bleiben seltene Beobachtun- gen oft sehr detaillierte Analysen und sind zeitsensitiv. Bei gen mit z. B. 0 Kell, 1 Kpa, 3 Kidd und 32 (!) Duffy „Dis- Spendern hingegen, sind die vielgefürchteten Null-Allele, krepanzen“ beim Vergleich von Daten bezüglich 4.000 mit Ausnahme des ABO-Systems (!) ohne Bedeutung, da Blutspendern, die mittels Routine-Serologie und MAL- sie lediglich eine „Pseudo-Heterozygosität“ vorspiegeln DI-TOF MS basierender Genotypisierung untersucht wur- und somit bei Transfusion auf Heterozygote keine Immu- den15. Dabei stellte sich heraus, dass „serologische Feh- nisierung verursachen würden. Gegenwärtig werden in ler“ meistens auf (sehr) schwach exprimierte Antigen-Va- Zürich Spender mittels MALDI-TOF MS basierender Ge- rianten (28 der insgesamt 32 beobachteten Diskrepanzen notypisierung voruntersucht, und die, für die Versorgung waren schwach exprimierte Fybweak, auch bekannt als immunisierter Patienten interessanten Treffer, serologisch FyX), Übertragungsfehler und auf echte Fehlbestimmun- nachvalidiert. Bei diesem Vorgehen vereinigen sich die gen zurückzuführen waren, während es sich bei den ge- Vorteile beider Technologien, Serologie und Genetik, und netischen Fehlbestimmungen bisher ausnahmslos um liefern kostengünstig und in hoher Zahl, breit untersuchte neue genetische Allel-Varianten oder Allele, die für die Spender mit validen Blutgruppenbestimmungen. Gendiagnostik nicht explizit berücksichtigt worden waren, 18 25 2015 AUSBLICK: WELCHE PROBLEME STEHEN DEM ERSATZ DER SEROLOGISCHEN TESTUNG DURCH EINE GENOTYPISIERUNG NOCH IM WEG? Die nicht bekannten Varianten Wird eines Tages die Serologie vollständig den Rückzug funden werden. Weak D Typ 1.1 wurde nur in einer klei- Selbst wenn man alle bekannten Varianten in ein Testsystem packen würde, käme es immer wieder zu Fehlvorhersagen: Manche Varianten sind so selten oder regional so beschränkt, dass sie in den Validierungstudien nicht ge- antreten und durch eine molekulare Testung verdrängt? nen Region in Norddeutschland gefunden. In der Blut- Bei einigen „raren“ Antigenen ist dieser Zustand schon gruppenserologie kennen wir Phänotypen, die mit einer erreicht. Für die Gesamtheit der Erythrozytenserologie Frequenz von unter 1:100.000 auffallen. Das mag auf den müssen jedoch noch einige Probleme gelöst werden: ersten Blick vernachlässigbar erscheinen, aber was passiert, wenn wir bei einem Patienten molekular den Phäno- Das Geschwindigkeitsproblem typ „A“ bestimmen und in Wirklichkeit ist er „0“? Die serologische Bestimmung der AB0-Blutgruppe im Direktansatz dauert wenige Minuten, eine Genotypisierung Die nicht betrachteten Gene mit konventionellen Methoden über eine Stunde. Gerade Um beim A/0-Beispiel zu bleiben: Was hilft es uns, wenn für die Abklärung von Notfällen ist die Genotypisierung wir bei einem Patienten den Phänotyp „A“ vorhersagen, häufig noch nicht schnell genug, zumal sie in vielen Fällen und in Wirklichkeit handelt es sich um einen Patienten eine Weitergabe der Probe an ein anderes Labor bedingt. mit dem seltenen Bombay-Phänotyp? Dieser wird durch Die nicht getesteten Varianten AB0-Gen so intensiv untersuchen wie man will, das Er- Aktuelle Genotypisierungsverfahren beruhen meist auf gebnis ist immer falsch. Diese Abhängigkeiten sind weit der Untersuchung einiger weniger „diagnostischer“ Poly- verbreitet: Die Expression der Rhesusantigene hängt morphismen. Alle anderen Veränderungen im Gen wer- nicht nur von den Rhesusgenen, sondern auch vom den schlichtweg nicht beachtet. Für einige Gene sind aber RHAG (Rhesus-assoziiertes Glykoprotein) ab. Kell benö- Veränderungen im H-Gen ausgelöst, und man kann das hunderte Allelvarianten bekannt, von denen man viele nur tigt das KX-Protein, der LU(a-b-)-Phänotyp ist nicht durch findet, wenn man spezifisch auf sie untersucht. Beispiels- Veränderungen im Lutheran-Protein, sondern durch Mu- weise sind für RHD in der Rhesusbase über 50 D negati- tationen in einem Regulationsprotein bedingt. Will man ei- ve Allele gelistet, die man nur von „normalen“ D positiven ne vollständige Vorhersage, muss man alle diese Gene Allelen unterscheiden kann, wenn man auf die spezifische mit betrachten. Mutation in diesen Allelen (meist Stop-Codons, Spleißmutationen oder Verschiebungen des Leserahmens) Der Preis? untersucht. Hier liegt ein wesentliches Problem im Ver- Manch einer wird sich wundern, dass der Preis noch nicht gleich zur Serologie: Bei der Abarbeitung von Diskrepan- als Argument gegen eine generelle Genotypisierung auf- zen zwischen serologischer Untersuchung und molekula- geführt wurde. Das liegt daran, dass der Preis pro vorher- rer Vorhersage zeigt sich immer wieder, dass viele Fehler gesagtes Antigen bei paralleler Untersuchung sehr niedrig durch eine fehlerhafte Serologie bedingt sind. Die serolo- sein kann. Nicht umsonst wird die molekulare Vorhersage gischen Fehler treten aber typischerweise bei schwachen der Spenderantigene mittels Hochdurchsatz-Genotypi- Antigenen auf, und wenn ein schwaches Antigen überse- sierung breitflächig eingesetzt und nicht die serologische hen wird, hat es meist keine katastrophalen Folgen. Die Typisierung der Spender für alle denkbaren hochfrequen- molekularen Diskrepanzen betreffen dagegen durchaus ten Antigene. Betrachtet man alle denkbaren Antigene, ist voll ausgeprägte Antigene: Wird ein seltenes RHD-Allel daher oft die Genotypisierung das kostengünstigere Ver- beim Patienten nicht erkannt, so wird er als normal D po- fahren. Das gilt allerdings nicht für die „einfachen“ Anti- sitiv vorhergesagt, ist aber in Wirklichkeit D negativ. Da gene wie AB0 oder „normales“ D: Hier sind die serologi- in der Mehrzahl der Fälle die Diskrepanz dem Schema schen Kosten minimal und der molekulare Aufwand zur „Vorhersage Antigen positiv – Wirklichkeit Antigen nega- sicheren Vorhersage enorm. tiv“ folgt, ist diese Problematik besonders bei der Untersuchung von Patienten bedeutsam. Allerdings kann auch der umgekehrte Fall auftreten, wenn beispielsweise eine Next generation sequencing Licht am Ende des Tunnels? Mutation, die keine Auswirkung auf die serologische An- Ein prinzipieller Lösungsansatz zur Erkennung unerwar- tigenausprägung hat, die Bindung des entsprechenden teter Varianten und Einflussfaktoren liegt in der Sequenzi- Primers behindert: Hier ergibt sich die Kombination „Vor- erung großer Genomabschnitte oder am besten des ge- hersage Antigen negativ – Wirklichkeit Antigen positiv“. samten Genoms mit Hilfe von Hochdurchsatz-Verfahren 19 (Next-Generation-Sequencing, NGS). Sequenziert man Technologie sind die Sequenzierungslängen noch zu ge- alles, so kann man keine Mutation übersehen. Mit dem ring, um bei biallelen Systemen die inaktivierende Mutati- NGS stehen Verfahren zur Verfügung, die das prinzipiell on dem richtigen Allel zuzuordnen. Zudem erfordert eine bewältigen könnten. Bei optimaler Auslastung der Ana- sichere Antigenvorhersage die Kenntnis aller Zusammen- lysekapazität, d. h. möglichst viele Genabschnitte gleich- hänge, und es könnte durchaus passieren, dass man ei- zeitig bei vielen Individuen, ist eine umfangreiche Geno- nes Tages alle Informationen besitzt, sie aber nicht rich- typisierung kosteneffizent möglich. Im Vergleich zu her- tig interpretieren kann. Die Methoden werden jedoch von kömmlichen Sequenzierungsverfahren liegen die Kosten Jahr zu Jahr besser, und man sollte nicht vergessen, dass pro Kilobase DNA-Sequenz etwa um den Faktor 10.000 noch um das Jahr 2000 die Sequenzierung des gesam- niedriger. Jedoch bleiben auch beim NGS noch Proble- ten menschlichen Genoms eine Herausforderung war, me: Für einen Routineeinsatz in der Patientendiagnostik während man aktuell auf die Ergebnisse eines „1.000-Ge- sind die Analysezeiten noch zu lang und die Kosten für die nom-Projekts“ zurückgreifen kann. Analysen von Einzelproben sind noch zu hoch. Je nach Die Autoren PD Dr. med. Franz Wagner DRK-Blutspendedienst NSTOB gemeinnützige GmbH, Institut Springe Dr. med. Christof Weinstock DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gemeinnützige GmbH, Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm (IKT) Mitwirkung: Abschließende Zusammenstellung, weak D Diagnostik, Testung D negativer Blutspender, Ausblick Mitwirkung: Molekulare Mechanismen Dr. rer. nat Andrea Döscher DRK-Blutspendedienst NSTOB gemeinnützige GmbH, Institut Bremen-Oldenburg PD Dr. med. Christoph Gassner Regionale Blutspende Zürich, SRK, Abteilung für Molekulare Diagnostik und Forschung und Entwicklung (MOC), Zürich-Schlieren, Schweiz Mitwirkung: Pränatale Blutgruppenbestimmung aus dem Blut der Mutter Mitwirkung: Tauglichkeit der genetischen Blutgruppen-Bestimmung für die Routine-Nutzung Dr. med. Christof Jungbauer ÖRK Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Prof. Dr. med. Peter Bugert DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gemeinnützige GmbH, Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Mannheim Mitwirkung: Hochdurchsatz-Genotypisierung von Blutspendern Mitwirkung: Anwendungsbereiche Dr. phil. nat. Sofia Lejon Crottet Interregionale Blutspende SRK AG Mitwirkung: Analyse von Problemfällen Dr. med. Christof Geisen DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gemeinnützige GmbH, Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Frankfurt am Main Mitwirkung: Initiale Idee, Einleitung, Anwendungsbereiche Dr. med. Angelika Reil DRK-Blutspendedienst West gemeinnützige GmbH, Zentrum für Transfusionsmedizin Hagen, Labor für Leukozyten- und Thrombozytenimmunologie Die Literaturhinweise zu diesem Artikel finden Sie im Internet zum Download unter: www.drk-haemotherapie.de Mitwirkung: Thrombozyten- und Granulozytendiagnostik 20 25 2015 Welche Zentren führen genetische Typisierungen von Blutgruppenantigenen (Patienten, Spender, NIPD) durch? DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gemeinnützige GmbH Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Frankfurt am Main Sandhofstraße 1 60528 Frankfurt Dr. med. Christof Geisen Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie Mannheim Friedrich-Ebert-Straße 107 68167 Mannheim Prof. Peter Bugert Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm (IKT) Helmholtzstraße 10 89081 Ulm Dr. med. Christof Weinstock Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes gemeinnützige GmbH Institut München Herzog-Heinrich-Str. 4 80336 München Dr. med. Gabriele Fauchald DRK-Blutspendedienst Nord-Ost gemeinnützige GmbH Institut für Transfusionsmedizin Berlin Am Großen Wannsee 80 14109 Berlin Dr. med. Roland Karl Institut für Transfusionsmedizin Lütjensee Hamburger Straße 24 22952 Lütjensee Dr. med. Sabine Kraas Institut für Transfusionsmedizin Dresden Blasewitzer Straße 68/70 01307 Dresden Prof. Dr. med. Torsten Tonn DRK-Blutspendedienst NSTOB gemeinnützige GmbH Institut Dessau Altener Damm 50 06847 Dessau Dr. med. Hartmut Kroll Institut Bremen-Oldenburg Brandenburger Straße 21 26133 Oldenburg Dr. rer. nat Andrea Döscher Institut Springe Eldagsener Straße 38 31830 Springe PD Dr. med. Franz Wagner DRK-Blutspendedienst West gemeinnützige GmbH Zentrum für Transfusionsmedizin Hagen Labor für Immunhämatologie Feithstraße 182 58097 Hagen Dr. med. Burkhard Just Zentrum für Transfusionsmedizin Breitscheid Abteilung für Immunhämatologie und HLADiagnostik Linneper Weg 1 40885 Ratingen Dr. med. Gabriele Bringmann Zentrum für Transfusionsmedizin Bad Kreuznach Labor für Immunhämatologie und Thrombozytenimmunologie Burgweg 5–7 55543 Bad Kreuznach Dr. med. Andreas Opitz, PD Dr. Brigitte Flesch, Anastasia Karnot Medizinische Universität Wien Institut für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin Prof. Dieter Schwartz Paracelsus Medizinische Privatuniversität Salzburg Institut für Transfusionsmedizin Dr. med. Christoph Grabmer Österreichisches Rotes Kreuz Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Dr. med. Christof Jungbauer Universität Innsbruck Institut für Transfusionsmedizin und Immunologische Abteilung Prof. Harald Schennach Österreichisches Rotes Kreuz Blutzentrale Linz Prim. Dr. Christian Gabriel Labor für Leukozyten- und Thrombozytenimmunologie Feithstraße 182 58097 Hagen Dr. med. Angelika Reil Österreich Schweiz Blutspende Zürich PD Dr. med. Christoph Gassner Interregionale Blutspende SRK AG Dr. med. Christoph Niederhauser 21 Dr. med. Robert Deitenbeck, Dr. med. Uwe Sievert, Dr. med. Christian Halfwassen Autologe Serumaugentropfen Eine ungewöhnliche Form der Hämotherapie Zusammenfassung Summary Neben industriell hergestellten künstlichen Tränenersatzmitteln werden seit Apart from industrially produced artificial tears, patients with severe corneal etwa Anfang der 90er Jahre des zurückliegenden Jahrhunderts Patienten mit defects or chronic dry eye syndrome have been treated with great success schweren Hornhautdefekten oder chronisch trockenem Auge mit großem Er- with autologous serum eye-drops (ASE) since the early 1990s. The thera- folg mit autologen Serum-Augentropfen behandelt (ASA). Der Therapieeffekt peutic effect is based on epitheliotrophic substances present in the serum ist auf die im Serum vorhandenen epitheliotrophen Substanzen wie epithe- such as epithelial growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), lial growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), Fibronektin Fibronektin and others. For some years now, ASE can be produced in a closed und andere zurückzuführen. Seit einigen Jahren können ASA GMP-gerecht system according to GMP-guidelines under adherence to drug law and phar- unter Wahrung arzneimittelrechtlicher und pharmazeutischer Standards im maceutical standards. geschlossenen System hergestellt werden. Since the non-inferiority of ASE compared with industrially produced artificial Da die Nichtunterlegenheit von ASA gegenüber industriell hergestellten Tränenersatzmitteln bisher nicht eindeutig belegt ist, sind die Kostenträger tears could not be proved yet, health insurance providers are reluctant to bear nur schwer zu einer Kostenübernahme zu bewegen. Zudem gibt es bisher kein regard to dilution, storage length and storage temperature. Furthermore the standardisiertes Herstellungsverfahren mit Blick auf Verdünnung, Lagerdauer lack of measurable therapeutic effects such as abating pain and reduced und -temperatur. Dies sowie der schwierige Nachweis objektivierbarer Thera- foreign body sensation significantly restricts the use of these preparations pieerfolge wie Rückgang von Schmerzen und Fremdkörpergefühl schränkt die though they are well-tolerated and a subjective and perceptible improvement Verfügbarkeit dieser Präparate weiterhin deutlich ein, obwohl sie gut verträg- of the symptomology can be expected. the cost. Nevertheless, there is still no standardized production protocol with lich sind und subjektiv spürbare Besserung der Symptomatik erwarten lassen. EINLEITUNG in der Therapie ist die Substitution des fehlenden Tränenfilms mit künstlichen Tränenersatzmitteln. Empfohlen sind Die Tränenflüssigkeit schützt das gesunde Auge vor me- hier insbesondere konservierungsmittelfreie Tränener- chanischen, mikrobiologischen und sonstigen schäd- satzmittel. Als Wirkstoffe stehen hier unter anderem Hy- lichen Einflüssen und hat zudem eine nutritive Funktion aluronsäure, Povidon, Carmellose, Carbomer und Hypro- für die Hornhaut. Eine gleichmäßige Benetzung der Horn- mellose zur Verfügung. Eine starke Beschwerdesympto- hautoberfläche ist eine Voraussetzung für eine gute op- matik erfordert häufig eine stündliche oder halbstündliche tische Qualität der Hornhaut und damit für das scharfe Gabe von Tränenersatzmitteln. Als Unterstützung zu die- Sehen. Bei Patienten mit stark vermindertem Tränenfluss ser Tropftherapie kann bei stark trockenen Augen auch oder durch mechanische Ursachen bedingte Defekte der ein Verschluss der ableitenden Tränenwege z. B. mittels Hornhaut kann es zu schweren chronischen Veränderun- kleiner Silikon-Okkluder (Punctum-Plugs) die Therapie gen des Hornhaut- und Bindehautepithels kommen, die unterstützen. im schlimmsten Fall in die Erblindung münden. Bei Patienten mit chronisch trockenen Augen (Sicca-Syndrom) In extremen Fällen gehen die bei diesen Erkrankungen treten ohne Therapie häufig Beschwerden wie Druck- eintretenden Epitheldefekte nicht nur mit kaum erträgli- gefühl, starker Tränenfluss (reflektorisch), Brennen und chen Schmerzen einher, sondern bergen zudem ein ho- Fremdkörpergefühl auf. Bei sehr starker Ausprägung kön- hes Risiko für chronische Ulcerationen der Hornhaut, nen starke Schmerzzustände und Oberflächenverletzun- Hornhaut-Narben und damit eine dauerhafte Sehschärfe- gen der Hornhaut auftreten. Weltweit leiden zwischen 5 % Reduktion des betroffenen Auges. und 34 % der Menschen am trockenen Auge, wobei die Prävalenz mit dem Alter signifikant ansteigt1. Seit etwa Ende des 20. Jahrhunderts werden für die Behandlung von Patienten mit schweren Hornhautdefek- 22 Eine Übersicht zur Stufendiagnostik und Therapie findet ten oder chronisch trockenem Auge weltweit mit gro- sich in einer unlängst publizierten Übersicht1. Erste Wahl ßem Erfolg autologe Serumaugentropfen (ASA) einge- 25 2015 Bei folgenden Erkrankungen des vorderen Augenabschnittes können ASA indiziert sein: • Keratokonjunctivitis sicca (Syndrom des trockenen Auges) • Superiore limbale Keratokonjunctivitis • Persistierende Epitheldefekte Abbildung 1 Hornhautulkus bei schwerer neurotropher Keratopathie. Abbildung mit freundlicher Überlassung von Dr. med. Vinodh Kakkassery, • Hornhautulkus bei chronischer Polyarthritis und anderen Grunderkrankungen • Sjögren-Syndrom Universitäts-Augenklinik am Knappschaftskrankenhaus Bochum. • Neurotrophe Keratopathie (Abbildung 1) (Direktor: Professor Dr. med. Burkhard Dick) • Graft vs. Host Disease u. v. m. setzt. Die Wirkung beruht auf dem epitheliotrophen Effekt HERSTELLUNG verschiedener, im Serum vorkommender Substanzen wie z. B. epithelial growth factor (EGF), platelet derived Die Herstellung der ASA ist denkbar einfach. Nach Klä- growth factor (PDGF), Fibronektin, Vitamin A u. a. In Zell- rung aller formalen (z. B. Kostenübernahmeerklärung kulturexperimenten unterstützt das Serum die Prolifera- durch den Kostenträger) und medizinischen (Indikation? tion, Migration und den intrazellulären Stoffwechsel hu- Patient geeignet für das Spendeverfahren?) Vorausset- maner Hornhautepithelzellen besser als konservierte zungen vereinbart der Patient mit dem zuständigen trans- oder unkonservierte Fertigarzneimittel2. Eigenserum för- fusionsmedizinischen Zentrum einen Termin für die Eigen- dert zudem auch die Differenzierung von Hornhaut- und blutspende. Nach entsprechender Aufklärung und Vor- Bindehautepithelzellen3. bereitung spendet der Patient ggf. in Abhängigkeit von seinem Hämatokrit bis zu 500 ml Vollblut. Während der Wurden in früheren Jahren durch die Ophtalmologen auf- Spende wird er selbstverständlich ärztlich überwacht. wändige Präparationen unter Reinraumbedingungen her- Anders als bei der herkömmlichen homologen oder auto- gestellt, steht in jüngster Zeit ein geschlossenes System logen Blutspende wird bei diesem Verfahren Vollblut ohne zur Verfügung, welches Durchführung der Spende und Antikoagulans entnommen. Ca. 30 – 60 Minuten nach der anschließende Portionierung in Ophtiolen mittels steri- Eigenblutspende kann der Patient – sofern es sein allge- ler Konnexion im geschlossenen System und damit die meiner Gesundheitszustand zulässt – sich auf den Weg Herstellung eines nicht konservierten, temperatursensi- nach Hause machen. blen, biologischen Blutprodukts unter Wahrung arzneimittelrechtlicher und pharmazeutischer Standards er- Parallel zur Herstellung erfolgt die Testung der Proben aus laubt. Dieses geschlossene Ophtiolensystem (TF12 oder der Vollblutspende wie bei jeder homologen Spende auf TF36) wurde in jüngster Zeit von der Fa. Meise Medizin- Abwesenheit von Krankheitserregern (Hepatitis B, Hepa- technik GmbH in Schalksmühle in enger Zusammenar- titis C, HIV 1/2, Lues), zusätzlich erfolgt aus einem Aliquot beit mit dem Zentrum für Transfusionsmedizin und Hä- einer jeden Spende eine Sterilkontrolle. Eine Freigabe zur motherapie des Universitätsklinikums Gießen entwickelt. Anwendung kann nur bei infektionsserologisch unauffäl- Selbstverständlich entspricht die Herstellung sämtlichen ligen Spenden erfolgen, nicht zuletzt, da diese Präpara- pharmazeutischen Standards nach den internationalen te im Regelfall im Rahmen der häuslichen Selbstanwen- GMP-Vorgaben (GMP = „good manufacturing practice“) dung eingesetzt werden und Familienmitglieder oder an- und unterliegt nicht nur standardisierten Inprozesskon- dere Haushaltsangehörige ebenfalls sicher vor durch Blut trollen, sondern auch der regelmäßigen Überwachung übertragbaren Infektionskrankheiten geschützt werden durch die zuständigen Aufsichtsbehörden. Als autologes müssen (z. B. im Falle akzidentieller Fehlanwendung). Blutprodukt sind die ASA von der Zulassungspflicht ausgenommen, jedoch ist für die Entnahme und Präparati- Nach vollständiger Gerinnung des Vollblutes wird dieses on eine Herstellungserlaubnis nach § 13 Arzneimittelge- zentrifugiert und der Überstand nach erneuter Zentrifuga- setz4,5 erforderlich. tion in einen speziellen Beutel des geschlossenen Entnah- 23 Leider gibt es bisher kein standardisiertes Herstellungsverfahren mit Blick auf Verdünnungsgrad, Lagerdauer und -temperatur und andere Kenngrößen von autologen Serumaugentropfen, weshalb die in der Literatur berichteten Herstellungsmethoden ebenso differieren wie Daten zur Anwendungsbeobachtung. So wird z. B. in Deutschland überwiegend ein unverdünntes Produkt eingesetzt, wenngleich es Hinweise darauf gibt, dass eine Verdünnung auf 20 % insbesondere das antiproliferativ wirksame TFG-β derart verdünnt, dass die Konzentration dieses, aber auch der übrigen wirksamen Zytokine an die Abbildung 2 physiologische Konzentration der Tränenflüssigkeit an- Aliquotierung in Ophtiolen passt7. Eine Verdünnung mit NaCl 0,9 % oder BSS auf 12,5–25 % Serumanteil ermöglicht nachweislich eine ad- mesystems überführt. An diesen Beutel wird dann mittels äquate Zellproliferation3. steriler Konnexion ein geschlossenes 12er oder 36er-Ophtiolensystem angeschweißt. Anschließend wird das Serum dem hydrostatischen Druck folgend nach dem Prin- VERTRIEB zip der kommunizierenden Röhren aus dem Beutel in die Ophtiolen aliquotiert. Eine Ophtiole enthält ca. 1,5–2,0 ml Leider stellt der Vertrieb dieser Produkte aufgrund der Eigenserum. Insgesamt können maximal bis zu 144 Oph- Regelungen des deutschen Arzneimittelrechtes eine be- tiolen aus einer Vollblutspende hergestellt werden, wo- sondere Herausforderung dar. Nach § 47 Arzneimittelge- bei ein gewisses Volumen für die Sterilkontrollen und die Qualitätskontrollen benötigt wird. Die Ophtiolen werden vor Auslieferung in geeignete Umverpackungen konfek- ambulanten Behandlung nur an (öffentliche) Apotheken tioniert. Eine Ophtiole entspricht hierbei einer Tagesdo- Herstellungserlaubnis des Pharmazeutischen Unterneh- setz dürfen die konfektionierten Ophtiolen im Rahmen der abgegeben werden4. Diese geben die Präparate je nach sis. Jede einzelne Ophtiole wird ebenso wie die jeweilige mers in tiefgefrorenem oder aufgetautem Zustand direkt Umverpackung EDV-gestützt etikettiert. Da ein gewisses an den Patienten weiter, der die Präparate zu Hause in ei- Volumen für die notwendigen Sterilitäts- und Qualitäts- nem handelsüblichen Kühlschrank oder Tiefkühlfach auf- kontrollen benötigt wird, liegt die Reichweite einer derarti- bewahrt und tagesbezogen anbricht und verbraucht. gen Präparation mit unverdünnten ASA bei maximal etwa 3 Monaten. Dann muss der Patient zur nächsten Entnah- Die einzuhaltenden Anwendungsempfehlungen erhält me vorstellig werden. der Patient zuvor vom verschreibenden Ophtalmologen. Die komplexe Schnittstellenproblematik beschreibt das Die Lagerung der Gesamtcharge erfolgt bis zur Abgabe Schema in Abbildung 4. an die Apotheke des Patienten bei -20 °C und kälter für bis zu 180 Tage. Die Lagerung der aufgetauten Präparate ist Leider ist die direkte Abgabe der Präparate an den Pa- abhängig von den vom jeweiligen Hersteller eingereichten tienten durch den Hersteller vom Arzneimittelgesetz un- Haltbarkeitsdaten bei der lokalen Überwachungsbehörde. tersagt. Hier sollte im Interesse der Patienten und zur Vereinfachung der Logistik möglichst eine Ausnahmeregelung mit den zuständigen Behörden oder gar eine Änderung oder Ergänzung der entsprechenden Regelungen des Arzneimittelgesetzes erwirkt werden, welche eine Direktabgabe an den Patienten in Analogie zur Praxis bei Gerinnungspräparaten ermöglicht6. ANWENDUNG UND THERAPIEERFOLG In einem jüngst publizierten Cochrane-Review wur- 24 Abbildung 3 de die Effektivität und Sicherheit autologer Serumau- Versandfertige konfektionierte Opthiolen gentropfen bewertet7. Hier standen lediglich vier klei- 25 2015 Kostenträger Re ze pt 7 ert mi äru ng , In dik ati on ss tel lun g, or inf 10 Augenklinik beantragt Kostenübernahme 1 Au fkl me ah ern üb ten os K er üb stellt Apothekenleistung und Produktkosten in Rechnung 2 4 informiert über Spende und Auslieferung Patient 6 de en Sp ng aru me inb ah ere ern üb ten os inv rK be tü ier Au sg ab eE nd pr od wä uk t hlt Ko a u ste s, nü üb be er rn gib ah t R me e erk zep lär t un un d g rm Te orm inf 9 5 Apotheke 8 übersendet „Auftrag für die Entnahme von Eigenblut“ 3 5 Blutspendedienst liefert Endprodukt, stellt Rechnung lagert Bestände Abbildung 4 Schnittstellen zwischen Patient, Augenklinik, Krankenkasse, Apotheke und Blutspendedienst nere, unizentrische randomisierte kontrollierte Studien zur Auswertung zur Verfügung8,9,10,11. Im Ergebnis ka- men die Autoren zu der Schlussfolgerung, dass die Be- In Ermangelung großer randomisierter und kontrollierter klinischen Studien, welche die handlung mit 20 %igen autologen Serumaugentropfen Nichtunterlegenheit dieser Prä- zwar bei kurzfristiger Anwendung subjektive Linderung parationsform gegenüber an- bringt, insbesondere eine objektivierbare Verbesserung deren, kommerziell erhältlichen der Hornhautoberfläche der behandelten Patienten hin- Tränenersatztherapeutika bele- gegen nicht nachweisbar war. Die in diesen Studien nicht gen, ist es nur äußerst schwer nachweisbare Wirksamkeit liegt jedoch im Wesentlichen und nur im Einzelfall unter ge- an den schwer messbaren Therapieerfolgen einer The- nauester Schilderung der Prog- rapie mit Tränenersatzmitteln. Insbesondere Schmerzen nose des Einzelfalles möglich, und Fremdkörpergefühl sind nicht objektiv messbar. In die Kostenträger der betroffe- den Studien verwendete objektive Parameter würden ei- nen Patienten zu einer Kosten- ne Heilung der Erkrankung erfordern. Seltenere Kompli- übernahme für diese recht teu- kationen erfordern sehr hohe Fallzahlen und lange Nach- re Therapie zu bewegen. beobachtungszeiträume. Für unverdünnte Augentropfen liegen vergleichbare Erkenntnisse nicht vor, sondern allenfalls in Form von Kasuistiken6 oder kleineren Untersu- Abbildung 5 Jenseits dessen stellt die Anwendung autologer Gebrauchsfertige Ophtiole Serum- chungen auf Basis von Umfragen. In einer jüngst publi- augentropfen bei vielen Patienten mitunter die letzte zierten Befragung von 26 behandelten Patienten wurde in mögliche Therapieform dar13. In zahlreichen ophtalmo- 53,8 %–91,7 % der Befragten ein signifikanter Rückgang logischen Zentren in Deutschland werden diese Präpa- des Fremdkörpergefühls oder brennender Schmerzen rate mittlerweile empfohlen. In Deutschland haben zwi- angegeben12. Den individuellen Zugewinn an Lebensqua- schenzeitlich unter anderem die DRK-Blutspendezentren lität belegt eindrucksvoll die abgedruckte Schilderung ei- in Chemnitz, Frankfurt/Main und Hagen sowie verschie- ner mit autologen Serumaugentropfen behandelten Pati- dene universitäre transfusionsmedizinische Einrichtungen entin, leider jedoch ebenso eindrucksvoll ihren bisher ver- eine behördliche Herstellungserlaubnis zur Produktion geblichen Kampf um Kostenerstattung für diese Therapie. von ASA aus autologen Vollblutspenden. 25 AUSBLICK Die Autoren Dr. med. Robert Deitenbeck DRK-Blutspendedienst West gGmbH Zentrum für Transfusionsmedizin Hagen Feithstraße 182 58097 Hagen Es erscheint dringend geboten, die Herstellungsmethodik zu standardisieren. Völlig ungeklärt ist beispielsweise die Frage, ob das Präparat im Rahmen der Präparation filtriert werden sollte. Auch ist wissenschaftlich bisher nicht hinreichend belegt, ob unverdünnte den verdünnten autologen Serumaugentropfen unterlegen sind. Die Frage des idealen Verdünnungsgrades ist ebenfalls noch ungeklärt. Dr. med. Uwe Sievert DRK-Blutspendedienst Nord-Ost gGmbH Institut für Transfusionsmedizin Chemnitz Zeisigwaldstr. 103 09130 Chemnitz Mit Blick auf Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials müsste prospektiv geprüft werden, ob nicht auch Plasma statt Serum verwendet werden könnte, ggf. nach Rekalzifizierung14. Damit böte sich die Plasmapherese als Spendemöglichkeit an, womit Reichweite und damit Kosten der Dr. med. Christian Halfwassen Universitätsklinikum Essen (AöR) Klinik für Erkrankungen des vorderen Augenabschnittes Hufelandstraße 55 45147 Essen Präparate erheblich gesenkt werden könnten. In jüngster Zeit wird auch über den Einsatz von autologem plättchenreichen Plasma berichtet15,16. Schließlich wäre – unter der Annahme einer Arzneimittelzulassung, die allerdings eine randomisierte und kontrollierte klinische Studie voraussetzt – auch die Verwendung von homologem AB-Serum denkbar, womit die Verfügbarkeit des Präparates nahezu Die Literaturhinweise zu diesem Artikel finden Sie im Internet zum Download unter: www.drk-haemotherapie.de unbegrenzt wäre. Bis zu einer breiten Anwendung dieses sehr vielversprechenden Präparates ist also noch ein langer Weg zu beschreiten. Sehr geehrter Herr Dr. med. Sievert, im Folgenden schildere ich Ihnen meine Erfahrungen mit den Serum-Augentropfen: Im Sommer 2004 bekam ich erste Probleme mit meinen Augen, Tränenfluss, müde schwere Augen, Schlieren, Brennen und Schmerzen. Im Laufe eines Jahres wurden ergebnislos einige pharmazeutische Augentropfen ausgetestet. Der Zustand meiner Augen verschlechterte sich mehr und mehr, hinzu kam eine Blepharitis. Mein behandelnder Augenarzt resignierte und gab mir eine Überweisung zur Augenklinik der Charité. Dort stellte man eine schwere Keratokonjunktivitis sicca fest, Schirmertest 0 %, sowie schwere Blepharitis. Anschließend wurde auch hier ohne Erfolg mit weiteren konventionellen Augentropfen therapiert, bis schließlich als letzter Ausweg das Eigenblutserum angeboten wurde. Bis dahin waren die Symptome immer unerträglicher geworden, ich bekam eine Depression, die behandelt werden musste. Diese quälenden Schmerzen möchte ich nie wieder erleben. Seit Oktober 2005 werde ich nun mit autologen Serum-Augentropfen behandelt, die Besserung folgte allmählich und seit Jahren ist der Zustand stabil und erträglich – das bedeutet für mich Lebensqualität. Inzwischen erfolgt die Herstellung der Serum-Augentropfen in einem logistisch komplizierten und teuren Herstellungsprozess im Institut für Transfusionsmedizin Chemnitz. Die Kosten für diesen Weg sind enorm hoch und für die Patienten nicht tragbar. Seit drei Jahren kämpfe ich bei der Krankenkasse um Kostenübernahme, die Krankenkasse weigert sich. Ich habe mehrere Widersprüche eingereicht, alle wurden abgelehnt, immer mit dem Hinweis, ich solle doch Mittel der pharmazeutischen Industrie nehmen. Meine Verzweiflung ist groß und ich finde es empörend, dass die Krankenkassen bei nachweisbar sehr guten Behandlungserfolgen eine Kostenübernahme ablehnen. Ich weiß von sehr vielen Patienten, dass sie auf diese Behandlung angewiesen sind, lebenslang, auch weil damit Komplikationen/chirurgische Eingriffe vermieden werden können. Mit sehr herzlichen Grüßen Barbara Immanns 26 25 2015 Dr. Katja Bettina Ferenz Künstliche Sauerstoffträger Wie lange müssen wir noch warten? Zusammenfassung Summary Momentan ist kein künstlicher Sauerstoffträger in Westeuropa zugelassen. In Western Europe no artificial oxygen carrier has been approved yet. Howev- Die prinzipielle Funktionalität verschiedener Präparate ist allerdings unbestrit- er, the general concept of artificial oxygen carriers is beyond dispute. In other ten; in Ländern wie z. B. Russland oder Mexiko stehen den Ärzten bereits countries such as Russia or Mexico, such substances are available for clinical zugelassene Präparate zur Verfügung. Aufgrund der vielversprechenden prä- use. The existence of promising preclinical and clinical pipelines yields hope klinischen sowie klinischen Pipeline besteht die Hoffnung, dass in absehbarer that artificial oxygen carriers will provide an additional treatment in the near Zeit auch im westeuropäischen Raum künstliche Sauerstoffträger eine neue future in Western Europe, too. Behandlungsoption darstellen werden. ZIELSETZUNG dukte normalerweise erst in der Klinik transfundiert, obwohl es bereits Hinweise gibt, dass einige Patientengrup- Dieser Review gibt einen Überblick über die Notwendig- pen von einer möglichst frühen Transfusion noch auf dem keit sowie den aktuellen Entwicklungsstand künstlicher Weg vom Unfallort in die Klinik profitieren7. Aus all diesen Sauerstoffträger. Die bisher wichtigsten Entwicklungen Gründen hat inzwischen in vielen Kliniken ein generelles auf diesem Gebiet mit besonderem Fokus auf klinisch be- Umdenken im Umgang mit Blutprodukten stattgefunden reits getesteten Präparaten, die sich aktuell in klinischen und Blutsparmaßnahmen, wie die Anwendung restriktive- Studien befinden, werden im Folgenden erläutert. Die rer Transfusionstrigger3 oder etwas umfassender „patient Herstellung von Erythrozyten aus Stammzellen wird in ei- blood management“, finden Einzug in viele Häuser1; aller- nem separaten Artikel dieser Ausgabe der hämotherapie dings ist ihr Potenzial in Europa noch längst nicht ausge- näher beleuchtet. schöpft8. Trotz solcher Maßnahmen wird der Bedarf an Blutprodukten aufgrund des demografischen Wandels in unserer Bevölkerung innerhalb der nächsten 5–10 Jahre EINLEITUNG wieder zunehmen5,9,10. Blutprodukte sind aus der modernen Medizin nicht mehr Nach wie vor machen allogene EKs dabei den größten wegzudenken. Allerdings sind sie nicht unbegrenzt ver- Anteil aus; allein 2013 wurden in Deutschland über 4 Milli- fügbar und geraten immer wieder wegen möglicher Infek- onen EKs transfundiert11. Sicherlich auch deswegen, weil tionsrisiken und Immunmodulationen in die Diskussion1-3. eine funktionierende Sauerstoffversorgung des Gewe- Keimreduktionsmaßnahmen sind zwar in Europa weit ver- bes bzw. ein Abtransport von Kohlenstoffdioxid (CO2 ) aus breitet und etablieren sich immer mehr auch in den USA, dem Gewebe nicht nur bei Patienten mit Anämie oder im in Entwicklungsländern fehlt für solche Maßnahmen aber hämorrhagischen Schock3,12,13, sondern auch in vielen nicht nur das Geld sondern auch die Infrastruktur4. Zu- weiteren Situationen, wie z. B. Sichelzellkrisen, während dem bergen auch bisher unbekannte Infektionskrankhei- Operationen mit hohem Blutverlust oder wenn Blut nicht ten selbst in entwickelten Ländern nach wie vor ein Rest- in großen Mengen verfügbar ist (z. B. Katastrophensze- risiko. Außerdem verändern sich Blutprodukte wie z. B. narien, Kriegseinsätze) eine entscheidende Rolle spielt14. Erythrozytenkonzentrate (EKs) während ihrer Lagerung, wobei die Auswirkungen auf den Patienten nach wie vor In all diesen Situationen wären künstliche Sauerstoffträ- umstritten sind und die optimalen Lagerbedingungen so- ger in plasmaähnlichen Trägerlösungen eine sehr interes- wie die maximal zulässige Lagerdauer immer wieder an sante Alternative. Die Ansprüche an das perfekte Bluter- neue Erkenntnisse angepasst werden5,6. Aufgrund dieser satzmittel sind jedoch hoch14: Lagerungsproblematik (Dauer, Temperatur) sowie dem zeitaufwändigen „matching“ werden klassische Blutpro- 27 • Funktionalität: Gewährleistung einer zu Vollblut äquiva- HBOCs lenten Versorgung mit O2 sowie des Abtransports von CO2 • Herstellung vollsynthetisch und in großen Mengen (kein Infektionsrisiko, Unabhängigkeit von der Spendenbereitschaft der Bevölkerung, Anwendung Blutgruppen-unabhängig) Kühlketten in Entwicklungsländern Hämoglobin ist nicht uninteressant, insbesondere wegen seiner guten Verfügbarkeit. Allerdings befindet sich hu- Katastrophen- und Kriegsgebieten, Produktion im Vo- manes bzw. bovines Hämoglobin nicht grundlos inner- raus möglich, Infusion ohne Auftauen oder Aufwärmen) halb von Erythrozyten: wenig Nebenwirkungen (keine Immunreaktionen, keine Vasokonstriktion, keine chronische Toxizität) • Ohne die schützende Hülle des Erythrozyten zerfällt Hämoglobin in αβ-Dimere, die in hohen Konzentrationen die Nierentubuli verstopfen und zu Nierenversagen Bisher wurden in der Entwicklung künstlicher Sauerstoffträger im Wesentlichen zwei grundsätzlich verschiedene Ansätze verfolgt: Zum einen die Entwicklung von Sauerstoffträgern auf Hämoglobin-Basis („hemoglobin-based oxygen carriers“, HBOCs), zum anderen die Entwicklung von Sauerstoffträgern auf Perfluorcarbonbasis („perfluorocarbon-based oxygen carriers“, PFCOCs). Beide Substanzklassen ermöglichen den Gastransport auf völlig unterschiedliche Weise. Während HBOCs genau wie natürliches Hämoglobin Sauerstoff (O2 ) koordinativ binden, löst sich dieser in PFCOCs physikalisch und linear, abhängig vom jeweiligen Gaspartialdruck (siehe Abbildung 1). O2-Gehalt (ml/dl) nes Hämoglobin synthetisch nachzubilden; dieser Ansatz und • lange Zirkulation im Gefäßsystem (lange Wirkdauer) bei führen15. • Hämoglobinmoleküle haben ohne die zusätzli- che Diffusionsbarriere eine zu hohe Affinität zu Stickstoffmonoxid (NO) und erreichen aufgrund ihrer geringen Größe die Zwischenräume der Endothelzellen. Dort fangen sie entstehendes NO ab16. Dies kann zu Vasokonstriktion (Folge: systemische und pulmonale Hypertension) sowie zu verstärkter Gerinnung (Folge: Myokardinfarkt) führen, da NO seine Funktion als Thrombozytenaggregationshemmer/-Inhibitor nicht mehr wahrnehmen kann17,18. • Hämoglobin ist als Sauerstofftransporter (nicht als Sauerstoffspeicher) 25 konzipiert; seine Affinität zu Sauerstoff lässt sich durch Interaktion mit Molekülen wie z. B. 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BPG) regulieren und 20 somit genau auf die unterschiedlichen Anforderungen in der Lunge bzw. der Peripherie abstimmen. Außerhalb 15 eines Erythrozyten sind die Konzentrationen von 2,3BPG zu niedrig, um die Sauerstoffaffinität zu senken19. 10 Frei im Blut vorliegendes Hämoglobin wirkt daher eher als Sauerstoffspeicher. 5 Fazit: Soll aus Erythrozyten isoliertes Hämoglobin als 0 100 200 300 400 500 pO2 (mmHg) Blut berechnet Perftoran Oxygent Plasma berechnet Abbildung 1 Darstellung des Sauerstoffgehalts in Abhängigkeit des Sauerstoffpar- künstlicher Sauerstoffträger verwendet werden, muss dieses entweder mit einer künstlichen Membran umgeben werden oder es müssen chemische Veränderungen am Hämoglobinmolekül vorgenommen werden. Strategien, aus Vollblut isoliertes Hämoglobin doch nutzen zu können20,21 tialdrucks. Während Blut die typische sigmoidale Bindungskurve aufweist, Um die Dissoziation des Hämoglobintetramers zu un- löst sich Sauerstoff in Plasma und PFCOCs (Perftoran und Oxygent) terbinden, eignet sich intramolekulares crosslinking proportional zum Gaspartialdruck. Während Blut schon bei Luftatmung (100 mmHg) nahezu vollständig mit Sauerstoff gesättigt ist, ist bei PFCOCs eine Sauerstoffbeatmung (500 mmHg) notwendig, um einen relevanten Sauerstoffgehalt zu erreichen. Daten modifiziert nach59. 28 Bei der Entwicklung künstlicher Sauerstoffträger liegt es nahe, Hämoglobin aus Blut zu isolieren bzw. humawird schon seit den 60er Jahren verfolgt13. Auch bovines • lange Lagerungszeiten ohne Kühlung (Unabhängigkeit von Zu Grunde liegende Idee und zu Grunde liegende Probleme mit Reagenzien wie z. B. Acetaldehyd, Formaldehyd, Pyridoxalphosphat oder Diaspirin. Das Abfangen von NO lässt sich durch Synthese größerer Moleküle, die nicht mehr in die Endothelzellzwischenräume wandern können, 25 2015 verhindern. Dies wird durch intermolekulares crosslinking, den zusätzlichen Vorteil, weitere Stoffe wie z. B. Enzyme also eine Polymerisation von Hämoglobinmolekülen, z. B. (Catalase, Superoxiddismutase), Antioxidantien (Gluthati- mit Glutaraldehyd oder o-Raffinose, erreicht; eine Pegy- on, Ascorbinsäure) oder 2,3-BPG mit einzukapseln15,22. lierung (Konjugation mit Polyethylenglykol) hat den gleimisch einstellen; z. B. durch crosslinking mit Pyridoxal- Strategien, andere Quellen als Vollblut für Hämoglobin zu erschließen chen Effekt. Auch die Sauerstoffaffinität lässt sich chephosphat, Diaspirin oder Inositolhexaphosphat, welche Seit den 80er Jahren existieren Bestrebungen, humanes die Wirkung von 2,3-BPG nachahmen. Alle angesproche- Hämoglobin rekombinant in E.coli herzustellen (rHb2.0, nen Methoden werden bei Centis und Vermette oder auch Optro23). Inzwischen ist sehr genau bekannt, welche Scurtu et al. detailliert beschrieben15,19. Allerdings ist die Funktionen die einzelnen Untereinheiten/Bausteine von Sauerstoffaffinität bei freiem Hämoglobin durch kovalente Hämoglobin haben und wo welche Moleküle mit welcher Bindung der beschriebenen Moleküle unveränderbar und Funktion binden. Durch rationale Mutagenese wurde ver- kann sich nicht, wie es physiologisch der Fall wäre, durch sucht, an diesen Stellschrauben zu drehen, um Proble- An- und Abdissoziation von 2,3 BPG an die jeweilige Si- men wie z. B. dem Zerfall in Dimere, dem Abfangen von tuation (Lunge/Peripherie) anpassen. Die Festlegung der NO oder dem Sauerstofftransportverhalten zu begegnen. Sauerstoffaffinität ist daher immer eine Gratwanderung: Letztendlich war jedoch bis heute keines der rekombinan- zu hohe Affinität nimmt Hämoglobin die Funktion als Sau- ten Hämoglobine erfolgreich: Sobald eine Eigenschaft ge- erstofftransporter; zu niedrige Affinität könnte eine lokale netisch optimiert worden war, verschlechterte sich eine Überversorgung mit O2 induzieren, weil das Hämoglobin andere durch eben diese Mutation23. seinen O2 zu schnell ins Gewebe abgibt. Das ist für das lokal betroffene Gewebe ungünstig (Bildung von Sauer- Als Alternative zu Wirbeltierhämoglobin wird seit einiger stoffradikalen, oxidativer Stress) und fördert eine Hyper- Zeit Ringelwurmhämoglobin aus dem Wattwurm (Areni- oxie-induzierte Vasokonstriktion, die bereits bestehen- cola marina, HEMOXYcarrier24) oder dem Regenwurm de, vasokonstriktive Effekte weiter verstärkt. Um der phy- (Lumbricus terrestris, LtEc25) erforscht. Die Struktur von siologischen Situation etwas näher zu kommen, besteht HEMOXYcarrier unterscheidet sich stark von humanem auch die Möglichkeit, Hämoglobin einzukapseln, z. B. in Hämoglobin. Das 3,6 Megadalton große Molekül kann Polymerkapseln19. Der Ein- 156 Moleküle O2 gleichzeitig transportieren. Obwohl es schluss in eine künstliche Erythrozytenmembran löst Pro- auch unter physiologischen Bedingungen nicht von einer Liposomen oder abbaubaren bleme wie den Zerfall in die nierentoxischen Dimere oder Membran umgeben ist, fängt es, aufgrund seiner enor- die zu hohe Affinität zu O2 und NO. Dieser Ansatz bietet men Größe, kein NO in den Endothelzellzwischenräumen 29 ab, und besitzt zudem eine natürliche Superoxiddismu- Gruppe der Eisenbasierten Sauerstoffträger, eine Un- tase-ähnliche Aktivität24. Auch andere Nebenwirkungen tergruppe der HBOCs. Natürliche oder synthetisch her- ausbleiben26. gestellte Häm-Bausteine gibt es mittlerweile z. B. einge- wie Immunreaktionen sollen in Säugetieren bettet in die Membran von Phospholipidvesikeln (Hb-Ve- Strategien, nur die für die Sauerstoffbindung essenziellen Bausteine des Hämoglobins zu nutzen/nachzubauen einer Hülle aus Humanalbumin (PEG-HSA-FeXP)29 oder Wird ganz isoliert nur die direkte Bindestelle von O2 im nen Bindetaschen von pegyliertem Humanalbumin (PEG- Hämoglobin betrachtet, reduziert sich das Molekül auf rHSA-Häm, PEG-HSA-FeP)27. sicles)27, in Cyclodextrinen (Hemo-CD)28, umgeben von auch gebunden an die natürlicherweise bereits vorhande- den Häm-Baustein (Porphyrinring mit einem zentralen Eisenatom). Aufgrund dieser Überlegung entstand die HBOCs: die aktuelle präklinische Pipeline Viele Präparate befinden sich noch im präklinischen Entwicklungszustand. Einige Präparate waren bereits in Tiermodellen erfolgreich, so dass zu erwarten ist, dass sie in absehbarer Zeit in die klinische Erprobung gelangen: Präparate ohne synthetische Erythrozytenmembran, weitere Details siehe13 Präparate mit synthetischer Erythrozytenmembran • HEMOXYcarrier, LtEc: freies, unverändertes Hämo- • Hb-Vesicles: Liposomen aus Phospholipiden gefüllt mit humanem Hämoglobin36 globin aus Watt- bzw. Regenwurm • im Mausmodell zeigte HEMOXYcarrier keine • Im Rattenmodell unkontrollierter hämorrhagischer Nebenwirkungen und versorgte hypoxisches Gewebe mit O2 26, LtEc bewies im Hämodilutionsmodell im Hamster gute Sauerstofftransport- Hämoglobin, Inositolhexaphosphat, Nicotin- amidadenindinukleotid, Glukose, Adenin und Inosin39 Hypertension25 • Austausch von 86 % des Blutvolumens im • Oxyvita: Rinderhämoglobin, zero-linked (= ohne physiologisch schlecht verträglichen Linker wie z. B. Glutaraldehyd, stattdessen verlinkt über Carboxylauch • Neo Red Cells: Liposomen gefüllt mit humanem eigenschaften und verursachte keine Lysyl-Reste)30, Schock erfolgreich37,38 carboxyliert erhältlich (setzt Kohlenstoffmonoxid (CO) frei, dieses soll anti-inflammatorisch und anti-vasokonstriktiv wirken) • positive Ergebnisse im schweren hämorrhagischen Schock der Ratte31 • Vitalheme (PNPH): pegyliertes Rinderhämoglobin, NO-Moleküle kovalent gebunden (dadurch Superoxiddismutase-ähnliche Aktivität)32, auch carboxyliert erhältlich • im Mausmodell hämorrhagischer Schock plus Schädel-Hirn-Trauma neuroprotektiv33 Kaninchenmodell erfolgreich39 • Entwicklung momentan zugunsten der Weiterentwicklung von LEH pausiert40 • LEH: Liposomen aus spezieller Lipidkomposition, teilweise pegyliert, gefüllt mit humanem Hämoglobin und Inositolhexaphosphat41,42 • Protektiv bei Gehirnischämie an Ratten und Nichtprimaten41,43 • Hemoglobin-Particles: Rinderhämoglobin ummantelt mit einer Membran aus Humanalbumin, quervernetzt mit Glutaraldehyd44 • Im Rattenmodell wurde der Austausch von 20 % des Blutvolumens gegen Hemoglobin-Particles gut vertragen45 • Artificial Red Cells: mit Glutaraldehyd polymerisiertes Rinderhämoglobin verlinkt mit Superoxiddismutase, Catalase und Carboanhydrase34 • Im Rattenmodell hämorrhagischer Schock erfolgreicher Abtransport von CO2 aus dem Gewebe12,35 30 25 2015 HBOCs in klinischen Studien ten im distributiven (septischen) Schock mit systemisch Einige wenige HBOCs wurden und werden bereits in klini- inflammatorischem Syndrom wurde wegen zu wenig ein- schen Studien getestet. Obwohl das Konzept des Sauer- geschlossenen Patienten (aufgrund unpassenden Studi- stofftransports prinzipiell funktionierte, wurden viele Stu- endesigns) abgebrochen, obwohl die mit PHP behandel- dien aufgrund von Nebenwirkungen der Präparate oder ten Patienten weniger Vasopressorverbrauch sowie mehr finanzieller Probleme der Sponsoren abgebrochen18,46. beatmungsfreie Tage und einen insgesamt kürzeren Auf- Häufig stellte sich im Nachhinein heraus, dass die ver- enthalt auf der Intensivstation aufwiesen als die Kontroll- meintlichen Nebenwirkungen doch nicht direkt durch das gruppe. Die bis zu diesem Zeitpunkt eingeschlossenen HBOC selbst verursacht worden waren. Patienten wurden als Phase-II-Studie ausgewertet, wobei die Patientenzahl nicht ausreichte, um Effekte auf Mortali- Präparate, die bereits in klinischen Studien getestet wurden zunächst in direktem Zusammenhang mit PHP gemelde- tät oder andere wichtige Endpunkte festzumachen53. Die Diese Präparate wurden zwar in klinischen Studien getes- ten Myokardinfarkte wurden nach Studienabbruch von ei- tet, ihre Entwicklung/Produktion wurde aber inzwischen nem unabhängigen Kardiologenteam als nicht PHP-asso- eingestellt bzw. der Entwicklungsstand ist unklar: ziiert bewertet53. Hemolink MP4-OX Hemolink ist ein mit Raffinose verlinktes, polymerisier- Im Gegensatz zur früheren Formulierung (Hemospan) tes, humanes Hämoglobin. Es gelangte bis in eine Pha- enthält MP4-OX nur noch 4 g/dl Maleimid- und PEG-mo- se-II-Studie zur Wirksamkeit und Sicherheit von Hemolink difiziertes humanes Hämoglobin; eine Konzentration, die bei Patienten, die sich erstmalig einer Koronararterienby- ohne Kombination mit Blut nicht mehr zum Überleben pass-Operation unterzogen (NCT00038454). Aufgrund ausreicht. Daher wird MP4-OX auch als „Blutexpander“ der in klinischen Studien beobachteten Herztoxizität wur- (hyperonkotisches Kolloid) oder Sauerstofftherapeutikum de die Entwicklung eingestellt (letztes Studienupdate in bezeichnet, welches die Versorgung speziell von schlecht 2005)47. Hemassist (DCLHb) Bei Hemassist handelt es sich um ein mit Diaspirin verlinktes (diaspirin crosslinked (DCL)), humanes Hämoglobin. Zwei Studien (USA/Europa) an Patienten mit traumatisch-hämorrhagischem Schock mussten 1998 vorzeitig abgebrochen werden. In der US-Studie war die 28-Tages-Sterblichkeit (wahrscheinlich bedingt durch verstärkten Blutverlust verursacht durch Hypertension47) in der Hemassist-Gruppe um das 3-fache erhöht48; in der zeitgleich im europäischen Raum laufenden Studie konnte kein Benefit unter der Behandlung mit Hemassist beobachtet werden49. Ein ebenfalls höheres Todesrisiko unter Hemassist wurde in Studien bei Schlaganfällen sowie verschiedenen Operationen beobachtet, so dass die Produktion von Hemassist eingestellt wurde50. In einer Neuauswertung der genannten Trauma-Studien in 2010 konnte weder eine schlechtere Perfusion noch ein Vasopressoreffekt direkt mit der Anwendung von Hemassist korreliert werden51,52. PHP PHP ist ein Polyoxyethylen-konjugiertes und pyridoxiliertes humanes Hämoglobin, welches zudem mit Catalase und Superoxiddismutase assoziiert ist. PHP wurde durch die Phoenix-Studie bekannt50. Diese, als Phase III konzipierte Studie zur Sicherheit und Wirksamkeit an Patien- 31 zugänglichen oder unterversorgten Gewebebereichen si- MP4-CO bei Patienten mit Sichelzellanämie wurde ab- chern soll50. Eine Phase-IIb-Studie (an der auch mehrere geschlossen (NCT01356485), die folgende Phase-II-Stu- Kliniken in Deutschland beteiligt waren) zur Sicherheit und die zur Behandlung von vaso-okklusiver Sichelzellkrise Wirksamkeit an Patienten mit Laktatazidose, verursacht (NCT01925001) wurde, genau wie die erwähnte Phase- durch hämorrhagischen Schock, wurde abgeschlossen IIc-Studie zu MP4-OX, noch vor Einschluss von Patien- (NCT01262196). Aufgrund der bei anderen HBOCs auf- ten aufgrund von Geschäftsaufgabe durch den Sponsor getretenen Nebenwirkungen zwang die Food and Drug zurückgezogen. Administration (FDA) den Sponsor, weitere Studien zunächst an „low-risk“ Patienten und nicht der eigentlichen Polyheme Zielgruppe durchzuführen. So entstanden Phase-III-Stu- Bei Polyheme handelt es sich um ein mit Pyridoxalphos- dien zur Verhinderung bzw. zur Behandlung von Hypoten- phat verlinktes und mit Glutaraldehyd polymerisiertes hu- sion unter Spinalanästhesie, bei Patienten, die eine totale manes Hämoglobin. Polyheme hatte in vorangegange- Endoprothese der Hüfte implantiert bekamen. Hier zeigte nen Phase-II-Studien gezeigt, dass es, bei guter Verträg- MP4-OX keine nennenswerten Komplikationen, verkürzte lichkeit, die Notwendigkeit von EK-Transfusionen nach erfolgreich die Hypotension-Episoden und reduzierte den einer Operation oder einem Trauma reduziert und auch Vasopressorverbrauch50. Eine folgende Phase-IIc-Stu- die Organdysfunktion sowie die immuninflammatorische die an einem besser passenden Patientenkollektiv mit der Antwort nach hämorrhagischem Schock vermindert50. Eine Phase-III-Studie an Patienten im hämorrhagischen Indikation hämorrhagischer Schock (NCT01973504) ist noch vor dem ersten Patienteneinschluss zurückgezogen Schock bot durch die Einbeziehung der Erstversorgung worden, weil der Sponsor seine Geschäfte eingestellt hat. des Patienten am Unfallort ein Studiendesign, das ge- MP4-CO, ebenfalls eine Weiterentwicklung von He- stoffträger abgestimmt war. In dieser „pre-hospital“-Infu- nau auf einen möglichen Einsatzort künstlicher Sauermospan, enthält CO und soll dadurch antientzündlich und sionsphase wurde entweder Polyheme oder kristalloide antiapoptotisch wirken50. Eine Studie zur Sicherheit von Volumenersatzlösung verabreicht, im Krankenhaus angekommen erhielt die Kristalloidgruppe EKs, die Polyheme-Gruppe zunächst weiter Polyheme und erst wenn nötig EKs. In der Polyheme-Gruppe wurden mehr (schwere) Nebenwirkungen berichtet, insbesondere Fälle von Myokardinfarkt54. In einer nachträglichen Auswertung durch ein unabhängiges Expertenkomitee konnten weder der Zusammenhang zwischen Polyheme und Myokardinfarkt noch unter Polyheme signifikant häufiger auftretende (schwere) Nebenwirkungen bestätigt werden50. Dennoch erteilte die FDA (aufgrund des nicht signifikanten Trends zu vermehrt auftretenden Nebenwirkungen unter Polyheme) keine Zulassung; die Firma stellte daraufhin die Entwicklung von Polyheme ein50. Aktuelle klinische Pipeline Diese Präparate befinden sich aktuell in klinischen Studien, so dass hier eine tatsächliche Option auf Zulassung in absehbarer Zeit besteht. Hemopure Hemopure besteht aus mit Glutaraldehyd polymerisiertem Rinderhämoglobin. Im Gegensatz zu seinem veterinärmedizinischen Pendant Oxyglobin ist Hemopure sehr stark gereinigt und enthält nur noch 2 % Tetramere, welche für den hypertensiven Effekt verantwortlich gemacht werden47. Hemopure ist das einzige HBOC, das bereits zugelassen ist; bisher allerdings nur in Südafrika und Russland, da die FDA eine große Studie an chirurgischen 32 25 2015 Patienten aufgrund von Sicherheitsbedenken abbrach55. Perspektive HBOCs Insbesondere Effekte auf das kardiovaskuläre System Unter den HBOC basierten künstlichen Sauerstoffträgern (z. B. Myokardinfarkt oder Hypertension) führen immer ist bisher nur Hemopure in Russland und Südafrika zu- wieder zu schlechten Studienergebnissen, obwohl die gelassen. Aufgrund langjähriger Erfahrung mit verschie- prinzipielle Wirksamkeit von Hemopure unbestritten ist18. densten HBOCS ist ihre Funktionalität allerdings unbe- Um eine Zulassung auch in anderen Ländern erwirken zu stritten; lediglich das Nutzen/Risiko-Verhältnis ist derzeit können, wurden die hämodynamischen Effekte von He- für viele Zulassungsbehörden nicht akzeptabel. Daher mopure erneut systematisch untersucht (Phase-II-Studie werden nach wie vor neue HBOCs entwickelt oder be- (mit deutscher Beteiligung) an Patienten mit akutem Ko- reits bekannte Präparate systematisch neu untersucht ronarsyndrom, die eine perkutane, koronare Intervention (auch unter Beteiligung von Zentren in Deutschland oder erhielten)56. Nur bei einem Patienten konnte eine schwere der USA). Insbesondere Präparate aus der aktuellen kli- Nebenwirkung (Hypertension) direkt mit der Anwendung nischen Pipeline haben Chancen, in absehbarer Zeit eine von Hemopure korreliert werden, außerdem wurden der Zulassung zu erreichen. koronare Blutfluss und der linksventrikuläre „stroke work index“ nicht beeinflusst56. Aktuell läuft in den USA eine „expanded access“ Studie zur Behandlung von lebensbe- PFCOCs drohlicher Anämie (NCT01881503). Hemo Tech Zu Grunde liegende Idee und zu Grunde liegende Probleme Hemo Tech enthält Rinderhämoglobin, welches mit Perfluorcarbone (PFCs) sind synthetische, vollständig ha- ringoffenem ATP und Adenosin verlinkt und mit Gluta- logenierte Kohlenstoffverbindungen (linear, (poly)cyclisch). thion konjugiert wurde. ATP soll die Dissoziation in Dimere Meist sind die Wasserstoffatome durch Fluor ersetzt, aber unterbinden, Adenosin eine Vasokonstriktion und Entzün- auch andere Halogene wie Brom oder Chlor kommen vor. dung verhindern und zudem die Polymerisation fördern. Wegen der sehr hohen Kohlenstoff-Fluor-Bindungsener- Glutathion soll die Extravasation ins Gewebe blocken, gie sind PFCs chemisch und metabolisch inert; d. h. sie die glomeruläre Filtrationsrate durch Absenken des iso- bilden keine toxischen Metabolite. PFCs sind weder hyd- elektrischen Punkts erniedrigen und das Hämoglobin vor ro- noch lipophil und nicht mischbar mit wässrigen Flüs- NO und reaktiven Spezies abschirmen. Beim klinischen sigkeiten wie Blut. Da sie aber eine geringe Löslichkeit in „proof of concept“ wurden im Kongo drei Kinder mit Si- Lipiden aufweisen, werden sie zur intravenösen Anwen- chelzellanämie erfolgreich behandelt57. Andere Indikatio- dung als Emulsionen formuliert. Die Formulierung einer nen wie z. B. Hirntrauma oder Schlaganfall wurden bisher sterilen, bei Raumtemperatur stabilen, homogenen Emul- nur in vitro untersucht57. sion mit einer Tröpfchengröße zwischen 0,1–0,2 µm, die Sanguinate vial. Molekulare Diffusion (Oswaldreifung) führt unter die- für die parenterale Anwendung geeignet ist, ist nicht triSanguinate ist ein pegyliertes, bovines Carboxy-Hämo- sen Bedingungen schnell zur Tröpfchenvergößerung. Der globin, das CO freisetzt. Dieses soll anti-entzündlich, anti- Zusatz geringer Konzentrationen von PFCs mit höherem apoptotisch und anti-vasokonstriktiv wirken. Eine Phase- Molekulargewicht (aber längerer Organretentionszeit) als I-Studie wurde ohne Komplikationen abgeschlossen (im das primär für den Sauerstofftransport ausgewählte PFC Rahmen dieser Studie wurde eine Zeugin-Jehovas mit sowie die Verwendung von Oberflächenspannung redu- Sichelzellanämie erfolgreich behandelt)58. Weil die Pha- zierenden Emulgatoren wirken diesem Problem entge- se-Ib-Studie in Panama und Kolumbien bei Patienten mit gen59. Synthetische Emulgatoren wie z. B. Pluronic F-68 Sichelzellanämie (NCT01848925) im Dezember 2014 er- weisen bei schlechter Verträglichkeit sehr gute stabilisie- folgreich abgeschlossen werden konnte, wurde die noch rende Eigenschaften auf60. Neuere Präparate arbeiten laufende Phase-I-Studie in Israel (NCT01847222) im Ja- daher mit einer Kombination aus den etwas schlechter nuar 2015 beendet. Derzeit läuft in den USA eine Phase- stabilisierenden (aber besser verträglichen) Phospholipi- II-Studie zur Sicherheit und Wirksamkeit von Sanguina- den, z. B. aus Eigelb, und hochmolekularen PFCs wie z. B. te an Patienten mit erhöhtem Risiko einer verspätet auf- Perfluordecylbromid (CF3 (CF2 )10 Br), Perfluortributylamin tretenden Gehirnischämie nach Subarachnoidalblutung (N(CF2 CF2 CF2 CF3 )3 ) oder Perfluormethylcyclohexylpipe- (NCT02323685). Eine Phase-I-Studie bei chronischer ridin (C12 F22 N)60. Niereninsuffizienz (NCT02437422) und eine Phase-II-Studie bei Patienten mit Sichelzellanämie und vaso-okklusi- Aufgrund ihres hohen Lösungsvermögens für Gase eig- ver Krise (NCT02411708) sind geplant. nen sich PFCs besonders gut für den Transport respira- 33 torischer Gase. Diese lösen sich physikalisch basierend Anämiepatienten letztendlich nicht verbesserte65. Anfang auf dem Henry´schen Gesetz in Abhängigkeit vom jewei- der 90er Jahre wurde Fluosol-DA unter einer anderen In- ligen Gaspartialdruck (siehe Abbildung 1)59,61. Physiolo- dikation (Verbesserung der Sauerstoffversorgung sowie gisch relevante Sauerstoffkonzentrationen werden aller- der Perfusion der Koronararterien bei Koronarangioplas- dings erst bei Sauerstoffbeatmung erreicht. Im Gegen- tie) in den USA, Europa und Japan zugelassen47,64,66. satz zum Hämoglobin tritt bei PFCs keine Sättigung ein, Nur wenige Jahre später wurde das Produkt wieder vom so dass die Sauerstoffkonzentration im Blut in Druckkam- Markt genommen, weil Stabilitätsprobleme der Emulsion mern linear weiter erhöht werden kann. Abgesehen von sowie sehr lange Organretentionszeiten (begründet durch O2 lösen sich in PFCs auch andere Gase wie z. B. CO2 , Perfluotributylamin) auftraten und die Lagerung bei -20 °C welches daher aus dem Gewebe abtransportiert werden bzw. das langsame Auftauen vor Verwendung des Pro- kann62. dukts nicht sehr praktikabel waren65. Seit 1994 ist die Ähnliches gilt auch für hohe CO-Konzentrationen, z. B. bei Rauchgasvergiftungen63. Produktion von Fluosol-DA eingestellt64. Nicht alle PFCs sind für den parenteralen Einsatz als Fluosol-43 (Oxypherol) künstliche Sauerstoffträger geeignet. Hier spielen nicht 20 % Perfluortributylamin, Pluronic F-68 nur die Löslichkeiten respiratorischer Gase eine Rolle, sondern auch Parameter wie Verweilzeit im Gefäßsys- Die Kombination aus Perfluortibutylamin sowie Pluro- tem, Emulgierbarkeit und Organretentionszeit59. Nach nic F-68 resultierte in einer sehr stabilen Emulsion. Auf- Phagozytose der Emulsionströpfchen diffundieren PFCs grund extrem langer Organretentionszeiten verweigerte zurück ins Blut und werden, assoziiert an Lipoproteinen, die FDA aber die Zulassung und seine Entwicklung wur- zur Lunge transportiert, wo sie (wenn sie einen entspre- de eingestellt66. chend hohen Dampfdruck besitzen) unverändert ausgeatmet werden64. Die häufigsten medizinisch verwendeten Oxyfluor PFCs sind Perfluordecalin (C10 F18 ), Perfluoroctylbromid 78 % Perfluordichloroctan, Eigelb-Phospholipide, Distelöl (CF3 (CF2 )7 Br), Perfluordichloroctan (C8 Cl2 F16 ) und Perfluortertbutylcyclohexan (C10 F20 ). Auch natürliche Emulgatoren wie Eigelb-Phospholipide sind in hohen Konzentrationen im Blut toxisch. Daher PFCOCs in klinischen Studien wurde hier versucht, die Konzentration von Eigelb-Phos- Eine erwähnenswerte präklinische Pipeline existiert der- pholipiden durch den Zusatz von Distelöl zu erniedrigen67. zeit im Bereich der PFCOCs nicht. Allerdings wurden aber Zwei Dosiseskalationsstudien (Phase Ia und Ib) wurden einige wenige PFCOCs bereits in klinischen Studien ge- abgeschlossen67. Darauffolgende Phase-I/II-Studien in testet. Ähnlich wie bei den HBOCs wurden viele Studien den USA und Europa zur Sicherheit und Wirksamkeit von abgebrochen, obwohl die Funktionalität von PFCOCs un- Oxyfluor an Patienten, die einen kardiopulmonalen By- bestritten ist. Anders als bei den HBOCs spielten hier aber pass- bzw. einen Koronararterienbypass bekamen, wur- häufig nicht nur tatsächliche Nebenwirkungen der Präpa- den freiwillig durch den Sponsor beendet bzw. bis heu- rate oder finanzielle Probleme der Sponsoren eine Rol- te pausiert; die amerikanische Studie aufgrund zu niedri- le. Stattdessen waren oft z. B. unpassende Studienpro- ger Patienteneinschlussquoten (bedingt durch Verlegung tokolle oder schlechte Schulung des beteiligten Personals von risikoarmen Herzoperationen in ein Nachbarkranken- im Umgang mit PFCOCs selbst oder Begleitmaßnahmen haus), die europäische Studie aufgrund des Wegbruchs wie z. B. der fachgerechten Hämodilution (in diesem Kon- der Finanzierung67. Oxyfluor wird heute nur noch in vitro text eine profunde, intraoperative, normovolämische Hä- in der Mikroskopie verwendet66. modilution (A-ANH)) ursächlich. Oxygent Fluosol-DA 58 % Perfluoroctylbromid, 2 % Perfluordecyl- 14 % Perfluordecalin, 6 % Perfluortributylamin, Pluronic bromid, Eigelb-Phospholipide F-68, Eigelb-Phospholipide Oxygent schnitt in verschiedenen Phase-II-Studien z. B. Bereits 1983 sollte Fluosol-DA zur Behandlung von An- 34 an Patienten mit orthopädischen oder herzchirurgischen ämiepatienten in den USA zugelassen werden. Fluosol- Eingriffen (meist in Kombination mit Hämodilution) posi- DA scheiterte damals nicht aufgrund von Nebenwirkun- tiv ab66,68. Herz-Kreislauf-assoziierte Nebenwirkungen gen oder mangelnder Funktionalität, sondern an seiner traten unter Oxygent nicht häufiger als in den jeweiligen kurzen Verweilzeit im Gefäßsystem, die das Outcome der Kontrollgruppen auf68. In einer unverblindeten, europäi- 25 2015 schen Phase-III-Studie an Patienten mit chirurgischen sikofaktoren in den Studiengruppen als wahrscheinliche (aber nicht herzchirurgischen) Eingriffen wurde Oxygent Ursache angesehen47,66,68. Aufgrund dieser Erfahrungen in Kombination mit Hämodilution eingesetzt. Patienten in legte der Sponsor der europäischen Zulassungsbehör- der Oxygent-Gruppe wurden seltener transfundiert und de (EMA) ein neues Studienprotokoll (keine Hämodiluti- benötigten (wenn transfundiert wurde) weniger EKs als on, nur allgemeinchirurgische Patienten) vor. Hier sollten die Kontrollgruppe68,69. Die unter Oxygent häufiger auf- entweder Oxygent oder EKs erst bei Erreichen des Trans- tretenden, schweren Nebenwirkungen (z. B. postope- fusionstriggers gegeben werden. Dieses Studienprotokoll rativer Ileus) bezogen sich alle auf das Verdauungssys- wurde nicht genehmigt, weil die EMA einen direkten Ver- tem. Das data safety monitoring board stellte fest, dass gleich zwischen einem künstlichen Sauerstoffträger und eben diese Ereignisse in der Kontrollgruppe untypisch Spenderblut aus technischen Gründen (z. B. Studienpo- selten berichtet worden waren und vermutete eine Beein- wer) als nicht durchführbar einordnete68. Eine 2005 ver- flussung des beteiligten Studienpersonals (Hawthorne- öffentliche Studie, in der speziell die Gehirndurchblutung Effekt)69. Die in der Oxygent-Gruppe nicht immer fach- unter Oxygent an herzchirurgischen Patienten untersucht gerecht durchgeführte Hämodilution wurde als eine der worden war, berichtete von mehr neurologischen Kom- Hauptursachen für die häufiger beobachteten Nebenwir- plikationen wie z. B. cerebralen Emboli unter Oxgent, die kungen unter Oxygent ausgemacht68. Die parallel in den ein höheres Schlaganfallrisiko erklären könnten70. Aller- USA und Kanada laufende, unverblindete Phase-III-Stu- dings wurden cerebrale Emboli in dieser Studie mit einem die an einem herzchirurgischen Patientenkollektiv wurde transcranialen Doppler-Ultraschall detektiert, was auf- 2001 aufgrund von vermehrt auftretenden Schlaganfäl- grund der Tatsache, dass PFCs auch als Ultraschallkon- len unter Oxygent vom Sponsor abgebrochen47,68. Ähn- trastmittel zugelassen sind und klinisch eingesetzt wer- lich wie in der europäischen Studie waren schwere, uner- den, berechtigterweise in Frage zu stellen ist71. Die Ent- wünschte Ereignisse (in diesem Fall die Schlaganfallrate wicklung des amerikanischen Oxygents wurde zunächst und die Mortalität) im Kontrollkollektiv untypisch niedrig. In einer nachträglichen post-hoc Analyse konnten die von einem chinesischen Sponsor weitergeführt64,66, allerdings ist der momentane Entwicklungsstand unklar47. Schlaganfälle nicht direkt mit dem Einsatz von Oxygent Oxygent scheint zumindest für präklinische Studien ver- korreliert werden. Vielmehr wurde wieder eine nicht fach- fügbar zu sein72. Derzeit laufen aber im amerikanischen gerecht durchgeführte Hämodilution sowie ungleiche Ri- und europäischen Raum keine klinischen Studien. 35 SCHLUSSFOLGERUNGEN Oxycyte 60 % Perfluortertbutylcyclohexan Noch immer ist in Westeuropa kein künstlicher SauerstoffEine 2005 begonnene Phase-II-Studie (NCT00174980) träger zur Anwendung am Menschen zugelassen, obwohl an Patienten mit schwerer Schädelfraktur wurde in die prinzipielle Funktionalität sowohl von HBOCs als auch 2008 abgeschlossen. Die 2009 gestartete Phase-II-Stu- von PFCOCs offensichtlich ist. Häufig standen finanziel- die (NCT00908063) zur Sicherheit und Wirksamkeit von le Probleme der Sponsoren oder fälschlicherweise dem Oxycyte bei Patienten mit schwerem Schädel-Hirn-Trau- Studienpräparat zugeordnete, unerwünschte Ereignis- ma wurde im September 2014 durch den Sponsor been- se einem erfolgreichen Abschluss der klinischen Studie det; die bisher eingeschlossenen Patienten sollen noch entgegen. Tatsächliche Nebenwirkungen der Präparate ausgewertet werden73. Nachdem deutlich geworden war, spielten meist nur eine untergeordnete Rolle. Deswegen dass die Studie aufgrund niedriger Patienteneinschluss- bewerteten die Behörden anderer Länder das Nutzen-/ quoten nicht in einem sinnvollen Zeitrahmen abgeschlos- Risikoprofil solcher Präparate teilweise auch anders und sen werden kann, entschied sich der Sponsor, ein ande- ermöglichten die Zulassung von Hemopure (HBOC) bzw. res Produkt aus seinem Portfolio zu fördern73. Perftoran (PFCOC). Aufgrund der zu erwartenden Knappheit von Blutprodukten in den kommenden Jahren sowie Perftoran immer wieder diskutierter, transfusionsassoziierter Ne- 14 % Perfluordecalin 6 % Perfluormethylcyclohexylpiperi- benwirkungen, brauchen aber auch wir solche künstli- din, Proxanol 268, Eigelb-Phospholipide chen Sauerstoffträger. Um den hier entstehenden Bedarf decken zu können, werden bis heute ständig neue künst- Perftoran ist das einzige bereits zugelassene PFCOC; al- liche Sauerstoffträger (aktuell primär HBOCs) entwickelt. lerdings nur in Russland, der Ukraine, Kasachstan, Kirgis- Allerdings hat sich der Fokus innerhalb der letzten Jah- tan und Mexiko66,74. Hauptindikationsgebiete sind akute re deutlich verändert. War es früher das Ziel, herkömmli- Blutverluste und die Oxygenierung spezifischer Gewebe, che Blutprodukte vollständig zu ersetzen, ist die Idee heu- z. B. bei Koronargefäßerkrankungen, Ischämien der Ext- te eher, den Ärzten eine zusätzliche Behandlungsoption, remitäten oder des Gehirns, aber auch akute und chroni- insbesondere in der Notfallmedizin, zu bieten, um nur be- sche Anämie oder Wundheilung sind Einsatzbereiche von grenzt verfügbare Blutprodukte effizient an ausgewählten Perftoran75. Perftoran ist generell gut verträglich. Bisher Patienten einsetzen zu können. Mit dem vorzeitigen Ende berichtete Nebenwirkungen wie transienter Juckreiz, Hy- der Phase-II-Studie von Oxygent im September 2014, ist perämie, Schwindel, Nierenschmerzen, Hypotension oder das vielversprechendste PFCOC aus der klinischen Pipe- Lungenprobleme treten nicht sehr häufig auf75. Allerdings line weggebrochen. Da sich im Gegensatz zu den HBOCs ist Perftoran auch gekühlt nur 1 Monat haltbar und weist derzeit keine weiteren PFCOCs in klinischen Studien be- durch den Zusatz von Perfluormethylcyclohexylpiperidin finden, ruhen alle Hoffnungen nun auf den HBOCs. Diese eine sehr lange Organretentionszeit von 90 Tagen auf66. sind, aufgrund der vielversprechenden klinischen Pipeline, Unter anderem deswegen ist Perftoran bisher weder in nicht unberechtigt, doch auch hier wird es sicherlich noch Europa noch den USA zugelassen. einige Jahre bis zur Zulassung dauern. Perspektive PFCOCs Eine relevante präklinische Pipeline neuer PFCOCS existiert derzeit nicht. Zudem befindet sich momentan kein ein- Die Autorin ziges neues Präparat in einer klinischen Studie. Lediglich mit Perftoran werden derzeit klinische Studien durchgeführt, allerdings nur in Ländern, in denen Perftoran bereits zugelassen ist. Studien mit dem vielversprechendsten Dr. Katja Bettina Ferenz Universitätsklinikum Essen Institut für Physiologische Chemie Vertreter dieser Substanzklasse, Oxycyte, wurden Ende 2014 eingestellt. Aktuell besteht keine Aussicht, dass in naher Zukunft ein neues PFCOC zugelassen wird. Die Literaturhinweise zu diesem Artikel finden Sie im Internet zum Download unter: www.drk-haemotherapie.de 36 25 2015 Prof. Dr. med. Reinhard Henschler, Dr. med. Beat M. Frey Erythrozytenkonzentrate aus Stammzellen Eine Vision soll wahr werden: Erythrozyten aus der Retorte Zusammenfassung Summary Die Vision, aus Stammzellkulturen eine Blutversorgung mit Erythrozytenkon- The vision of a blood supply by culture-expanded red cells (RBCs) is moving zentraten zu ermöglichen, rückt in den Bereich der Machbarkeit. In Kultur closer to reality. Culture-expanded blood cells might help to overcome risks erzeugte Erythrozyten könnten z. B. helfen, Versorgungslücken bei Pandemi- in blood supply in cases of pandemia, increase infection safety, and could en zu schließen und die Infektionssicherheit zu vergrößern. Auch enthalten help to improve the situation in allo-sensitized chronically transfused patients. sie, anders als konventionelle EK, ausschließlich junge Erythrozyten. Mögliche Also, expanded red cells are young, other than donated RBCs with an average weitere Qualitätsverbesserungen liegen bei chronisch transfundierten Patien- age of 50–60 days. Expression of alternative hemoglobin forms such as HbF ten mit anti-erythrozytären Antikörpern, die z. B. mit autologen expandierten could be useful e. g. for intrauterine transfusions. The greatest challenge in EK versorgt werden könnten. Auch birgt die gezielte Expression bestimmter the field is currently the adaptation of the expansion process to large scale Hämoglobine (z. B. Hämoglobin F) neue Möglichkeiten in der Optimierung der production. Sauerstoffversorgung für bestimmte Patienten. Eine große Herausforderung stellt derzeit noch die technische Lösung der Expansion im großen Massstab im Bioreaktor dar. EINFÜHRUNG • Die rote Blutzellbildung in vitro gelingt wesentlich besser in serumfreien Medien als in Anwesenheit von Serum. Forschung und Entwicklung der Biologie der blutbildenden Stammzellen gingen vor allem aus der weltweit initiierten Strahlenforschung im Gefolge des zweiten Weltkriegs hervor. Nachdem in den 1950er und 1960er Jahren die Existenz transplantierbarer blutbildender Stammzellen • Die Entfernung der Kerne („Enukleation“) aus den Vorstufen ist ein kritischer Schritt, der durch Makrophagen (Fresszellen) oder sog. Stromazellen bewerkstelligt werden kann. mit Hilfe der Knochenmark-Transplantation im Tiermodell • Auch noch nicht ganz reife Zellen (z. B. Normoblasten) belegt werden konnte, waren es vor allem die Studien von sind effizient transfundierbar und reifen in Tiermodellen Pike und Robinson (1970)1 und weiteren, die erstmals das in vivo zu funktionsfähigen Erythrozyten aus. Wachstum und die Differenzierung blutbildender Zellen aus Stammzellen in vitro ermöglicht haben. Nachdem das Diese wichtigen Ergebnisse bildeten die Voraussetzung Erythropoetin als einer der ersten in diesen Systemen effi- für weitere große Anstrengungen, die Vision der Erzeu- zienten Kolonie-stimulierenden Faktoren (CSF) identifiziert gung von Erythrozyten im Reagenzglas Wirklichkeit wer- und rekombinant hergestellt wurde, gelang es Anfang der den zu lassen – also von Erythrozytenkonzentraten (EK), 1990er Jahre mit Hilfe neu entdeckter, mit den CSFs sy- die ständig verfügbar sind, die sicher sind, steril, und ex- nergistisch wirkender Faktoren wie dem Stammzellfaktor tensiv serologisch und molekular charakterisiert. (SCF), aus einer einzigen Stamm- oder Vorläuferzelle der Erythropoese über 100.000 Tochterzellen in Kultur zu er- Die vorliegende Übersicht möchte die bisher zurückge- zeugen. Seither beschäftigen sich weltweit mehrere For- legten Meilensteine auf diesem Weg beschreiben und die schungsgruppen mit der weiteren Verbesserung von Be- noch bestehenden Herausforderungen und auch die po- dingungen für die Proliferation und Differenzierung eryth- tentiellen Einschränkungen auf diesem Weg darstellen. rozytären Zellen aus Stamm- oder Vorläuferzellen. Hierzu zählen unter anderen diejenigen von Professor Giovanni Ganz bewusst möchten wir zuvor auch die vielen neu- Migliaccio am Istituto Superiore di Sanitá in Rom und von Professor Luc Douay am Hospital St. Antoine in Paris. solche Präparate gegenüber der Versorgung von Trans- en Möglichkeiten ins Zentrum der Betrachtung stellen, die fusionsempfängern mit herkömmlichen EK bieten soll- Wichtige Fortschritte dieser Arbeiten waren vor allem fol- ten. Diese bilden sicherlich bereits jetzt einen wesentli- gende Entwicklungen und Erkenntnisse: chen treibenden Faktor in der Verwirklichung der Vision 37 einer sich immer stärker entwickelnden Versorgung mit len als infektiologisch sicheres Ausgangsmaterial dienen. aus Stammzellen erzeugten EK. Des Weiteren könnten die derzeit bestehenden demographischen Entwicklungen zu Schwierigkeiten oder Rückgängen in der Senderrekrutierung führen. Hinzu kommt, NEUE MÖGLICHKEITEN IN DER VERSORGUNG VON TRANSFUSIONSEMPFÄNGERN MIT EK dass eine ausreichende Blutversorgung in großen Teilen der Welt auf dem konventionellen Wege heute nicht sichergestellt ist. In Bezug auf alle diese Punkte bergen in vitro hergestellte EK ein signifikantes Weiterentwick- In vitro erzeugte EK zur Verringerung von Risiken in der Blutversorgung bedenken, dass insbesondere bei weiterhin steigendem lungspotential für die Hämotherapie. Letztlich ist auch zu Da in vitro erzeugte EK (und weitere Blutkomponenten) Aufwand in der Rekrutierung von freiwilligen Blutspen- unabhängig von der kontinuierlichen Blutspendetätigkeit dern neuartige Blutprodukte, die in vitro nach Bedarf aus hergestellt werden können, ist zu erwarten, dass poten- Stammzellen produziert werden können, erhebliche logis- tiellen einschneidenden Unterbrechungen der Blutversor- tische Vorteile in der Blutversorgung aufweisen können gungskette durch massive Spendersperren (z. B. Pande- und am Ende der Entwicklung mit einiger Sicherheit auch mien, grössere Epidemien) durch die in vitro Expansion ökonomisch konkurrenzfähig sein dürften. entgegengewirkt werden kann. So können nicht infizierte gespendete, tiefgefrorene Stammzellen aus der Zeit vor Weitere zu erwartende Innovationen und Verbesserungs- einer Epidemie als Grundbaustein der EK Versorgung die- möglichkeiten durch eine Einführung der Versorgung mit nen. Alternativ könnten von negativ getesteten Spendern in vitro aus Stammzellen expandierten EK sind (siehe Stammzellen, oder z. B. reprogrammierte somatische Zel- auch Tabelle 1): Weiterentwicklungsmöglichkeit Umsetzung in der Versorgung Verringerung von Risiken in der Blutversorgung Versorgung z. B. bei Pandemien mit hohen Spenderausschlussraten Verlängerung der Lebensdauer der transfundierten • Reduktion der Zahl der nötigen EK Transfusionen Erythrozyten bei chronisch substituierten Patienten • Reduktion der Eisenüberladung Flexibler anpassbare Vorräte von EKs für Patien- statt Einbestellung speziell typisierter Spender vermehrt Versorgung aus vorpro- ten mit Antikörpern mit hochfrequent exprimierten duzierten EK, bei sehr seltenen Phänotpyen tiefgefrorene EK, ansonsten Versor- Antigenen gung z. B. über 1-2 Produktionszentren für Europa Autologe EK aus Stammzellen • zur Versorgung chronisch transfusionsbedürftiger vorsensibilisierter Patienten, aus einer Stammzellentnahme • Vermeidung der Sensibilisierung und evtl. Hämolysen EK mit alternativen Hämoglobinen z. B. HbF exprimierende EK zur intrauterinen Transfusion Versorgung der Bevölkerung mit steigender ethni- in Regionen mit erhöhtem Anteil von Migranten aus anderen Erdteilen: Produk- scher Diversität tion von Erythrozyten aus Stammzellen aus ethnisch diversen Spenderrepertoirs (immunologisch relevante Phänotypen) Vereinfachte Logistik der Grundversorgung mit EK bei Komplettversorgung eines Gebietes mit expandierten EK z. B. Vorhaltung/bedarfsgerechte Produktion von EK aus 11 Stammzelllinien zur Gesamtversorgung Globale Verbesserung des Zugangs zu EK und weite- bei ökonomischer Produktion und akzeptablen Preisen: vermehrter Zugang zu ren Blutkomponenten Blut für bedürftige Patienten in Regionen ohne konventionelle Blutversorgung Tabelle 1: Möglichkeiten der Verbesserung der Versorgung durch in vitro expandierte EK. 38 25 2015 Verlängerung der Lebensdauer von Erythrozyten Peyrard et al.3 kalkuliert, dass > 99 % aller Patienten, inklusive solcher, die bereits gegen erythrozytäre Antigene im- Nach der Erwartung und allen bisher vorliegenden Da- munisiert sind, mit expandierten Erythrozyten aus 3 ver- ten werden in den EK-Kulturen praktisch ausschliesslich schiedenen Stammzelllinien versorgt werden könnten. Sie frische Erythrozyten erzeugt, die also keine Alterungser- errechneten anhand der Daten von über 16.000 sensibi- scheinungen aufweisen. Im Gegensatz hierzu sind in Blut- lisierten Patienten der französischen Hämovigilanzdatei, spenden gewonnene Erythrozyten natürlicherweise im dass mit EK aus 15 Klonen die Versorgung der Patienten Schnitt 50-60 Tage alt. Durch die höhere Lebenserwar- in Frankreich zu 100 % abgedeckt werden könnte. tung der transfundierten Erythrozyten ist ein länger an- lebenszeit in vitro erzeugte Erythrozyten nach Transfusion Flexibel anpassbare Vorräte von EKs für Patienten mit Antikörpern mit hochfrequent exprimierten Antigenen besitzen. Die erste Anwendung in vitro mit traditionel- In den Fällen von Patienten, die sog. hochfrequente eryth- len Kulturmethoden expandierten Erythrozyten am Men- rozytäre Antigene nicht exprimieren und durch Vortrans- haltender Effekt der Transfusionen zu erwarten. Bis heute ist jedoch nicht geklärt, welche durchschnittliche Über- 20112, zeigte ein mit Ery- fusionen gegen ein solches Antigen Antikörper erworben throzyten aus konventionellen EK vergleichbares Über- haben, wie anti-k anti-Vel oder anti-Ge, gestaltet sich die leben dieser in vitro aus Nabelschnurblut-Stammzellen Versorgung mit EK teilweise schwierig oder sehr schwie- generierten radioaktiv markierten Erythrozyten. Dies be- rig. In Zukunft könnten solche Patienten mit vorgelager- schen von ca. 2 ml EK, publiziert legte zunächst die in dieser Hinsicht international gefor- ten (z. B. kryokonservierten) aus Stammzellen oder repro- derte Minimalanforderung an die pharmazeutische Quali- grammierten somatischen Zellen (iPS)-abgeleiteten EK tät. In der weiteren Entwicklung ist zu erwarten, dass die entsprechend kompatibler Stammzellspender versorgt durchschnittlichen in vivo Überlebenszeiten in vitro gene- werden. Alternativ könnten, wenn die Zeit es erlaubt, in- rierter Erythrozyten bei einem unter optimalen Bedingun- dividuell aus Stammzell-Eigenspenden hergestellte EK für gen hergestellten klinischen Präparat länger sein werden. die Versorgung in Frage kommen (siehe unten). Durch die Gabe unverbrauchter junger Erythrozyten sollenten, durch die zu erwartende geringere Zahl notwen- Versorgungsmöglichkeiten für chronisch transfusionsbedürftige Patienten diger Transfusionen auch eine Verringerung der Zahl der Patienten mit chronischem Transfusionsbedarf erhalten notwendigen Transfusionen, und auch Eisenüberladung derzeit nach Möglichkeit weitergehend oder weitgehend erreicht werden. auf erythrozytäre Antigenmuster ausgetestete EK, um die te, vor allem bei chronisch substitutionsbedürftigen Pati- potentielle – und bei einigen Patienten klinisch bedrohEin Mechanismus der physiologischen Elimination von liche – Bildung multipler Antikörper gegen erythrozytäre Erythrozyten beinhaltet die Interaktion des „signal regu- Antigene möglichst zu vermeiden oder zu kontrollieren. lating protein (SIRP)-1 alpha“-Moleküls auf Phagozyten Für dieses Patientenkollektiv bieten sich expandierte EK mit dem auf Erythrozyten exprimierten CD47 Rezeptor3. Durch genetische Manipulation könnte auch versucht als Alternative in besonderer Weise an. Gewissermassen das Idealpräparat, um die Immunisierung auf einem Mini- werden, die Expressionsstärke des CD47 Rezeptors zu mum bzw. Null zu halten, dürften in immunologischer Hin- erhöhen, und die Überlebenszeit transfundierter Erythro- sicht autologe EK darstellen. Homologe Spender kom- zyten ggf. zu verlängern. Besonders bei chronisch Trans- men vermutlich ebenfalls in Frage, da sie in Bezug auf die fundierten könnte so der allfälligen Eisenüberladung ggf. Übereinstimmung der relevanten erythrozytären Antige- entgegengewirkt werden. ne weitgehend vorcharakterisiert werden können, und die Exposition der Empfänger mit neuen Antigenen durch die Vereinfachte Logistik der Grundversorgung mit EK enge Vorauswahl vermutlich in weit engeren Grenzen gehalten werden kann als derzeit. Für mögliche Sensibilisierungen der Empfänger werden sprechenden Varianten verantwortlich gemacht. Für die Ausstattung expandierter EK mit alternativen Hämoglobinen Allgemeinheit der zu versorgenden Patienten kann daher Vor allem für chronisch transfusionsbedürftige Patien- eine Versorgung mit EK etwa der Blutgruppe 0, Rh D ne- ten könnte die Ausstattung der in jüngster Zeit erst ent- gativ (z. B. 0 cc..ee K-), sicherlich nicht ausreichend sein. wickelten Verfahren zur Erzeugung von EK aus pluripoten- Für den Fall der Versorgung eines Gesamt-Patientenkol- ten und embryonalen Stammzellen mit fötalem Hämoglo- lektivs ausschliesslich mit ex vivo expandierten EK haben bin (HbF) von Bedeutung sein. Die schnellere Aufnahme eine Vielzahl von erythrozytären Antigenen und ihre ent- 39 von Sauerstoff und die langsamere Sauerstoffabgabe genüber der herkömmlichen Versorgung mit EK aus Blut- könnten genutzt werden, um die therapeutische Effizi- spenden eröffnet eine zusätzliche Versorgungslinie mit enz der EK z. B. bei Intensivpatienten oder Patienten mit Kultur-expandierten Erythrozyten sicherlich auch bessere Lungenschäden und vermindertem Sauerstoffaustausch Abdeckungen von Patienten jeweiliger ethnischer Minori- zu erhöhen. Im Rahmen von „genetic engineering“ wä- täten im Versorgungsgebiet. re auch denkbar, weitere, ggf. genetisch alterierte Hämoglobine mit gewünschten therapeutischen Eigenschaften in den EK zu exprimieren und zum klinischen Einsatz zu Globale Verbesserung des Zugangs zu EK und weiteren Blutkomponenten Selbstverständlich hat die veränderte Logistik der Versor- bringen. gung im Falle von aus Stammzellen expandierten, durch Versorgung der Bevölkerung mit steigender ethnischer Diversität Blutspendedienste oder komplett industriell hergestellten EKs erhebliche Konsequenzen für den Zugang zu Die zunehmende Migration und der dadurch bedingten Blutprodukten sich entwickelnder Länder. In vielen die- wachsenden ethnischen Divergenzen in der heutigen Be- ser Regionen existieren bis heute keine oder kaum Blut- völkerung, sowohl in den sogenannten klassischen In- spendedienste, oder es gelingt den existierenden Diens- dustrieländern, aber auch in Schwellenländern und den ten nur ungenügend, ausreichend Spender zu rekrutie- weiter entwicklungsbedürftigen Regionen der Erde, stel- ren um qualitativ und quantitativ ausreichend und für alle len die klinische Immunhämatologie vor zunehmende und zugängliche Blutprodukte anzubieten. Wenn es gelingt, besondere Herausforderungen in Bezug auf Sensibilisie- die Herstellung ex vivo expandierter EK und evtl. Throm- rungen durch auf Erythrozyten exprimierte Antigene. Ge- bozytenkonzentrate technisch und ökonomisch in den A Stammzelle, Frühe Vorläuferzelle Polychromat. Erythroblast Retikulozyt Orthochromat. Erythroblast Pro-Erythroblast Erythrozyt B Vermehrungsfaktor* Panzenböck et al., 1998 SCF, IGF-1, EPO 15 % FBS EPO Transferrin, Dexamethason 0,5 – 1× 103 Insulin Neildez-Nyuyen et al., 2002 Serumfrei SCL, IGF-1, EPO FLT3L, SCF, TPO IGF-1, EPO 2,2 × 104 Lymphozyten-kond. Medium, Transferrin, FeSO4 , FeNO3 , Insulin, Hydrocortison Giarratana et al., 2005 Serumfrei EPO IL-3, SCF, EPO 1,2 × 105 Stromalayer aus Fibrolasten Lymphozyten-kond. Med., Transferrin, FeSO4 , FeNO3 , Insulin Fujimi et al., 2008 Serumfrei IL-3, SCF, TPO SCF, IL-3, EPO hTERT experimierende Fibrobl. Makrophagen-Kokult Plasmanat, Adenin 3,3 × 106 Stromalayer-Support Abbildung 1 Erythrozytäre Differenzierung aus hämatopoetischen Stammzellen. (A) Morphologische Differenzierungsreihe, (B) Meilensteine in der Entwicklung von Kulturbedingungen zur Ausreifung kernloser erythrozytärer Zellen aus humanen Stammzellen. Die Zeitachse verläuft von links nach rechts und umfasst jeweils ca. 18–24 Tage (nicht maßstäblich). Der Vermehrungsfaktor pro eingesetzter aus CB-SC hat sich in 10 Jahren um 3 Log Stufen verbessert. Plasmanat und Adenin sind Zusätze, die reife Erythrozyten stabilisieren. Übernommen und angepasst aus6. 40 25 2015 Griff zu bekommen, könnten die Voraussetzungen für ei- Einzelketten sicher. Der Zusatz von Stoffen wie Adenin, nen besseren Zugang zu Blutprodukten in vielen Län- das reife Erythrozyten stabilisiert, ist ebenfalls ein Schritt dern entscheiden verbessert werden. Selbstverständ- auf dem Weg zu einem fein abgestimmten Prozess, der lich ist klar, dass zunächst mit relativ hohen Kosten für eine möglichst synchrone und effiziente Proliferation der die neuen Blutprodukte gerechnet werden muss. Den- Stammzellkulturen und eine koordinierte Differenzierung noch wagen wir zu spekulieren, dass sowohl die Häufig- zu möglichst reifen Erythrozyten darstellt. Diese Proto- keit der Anwendung von Blutkomponenten, und die ein- kolle ermöglichen bis dato, in statischen Kultursyste- zusparenden Kosten der Spenderrekrutierung, Entnahme men, pro eingesetzter Stamm- oder Progenitorzelle bis und konventionellen Bereitstellung, die dem gegenüber- zu 3 × 10E6 Tochterzellen zu erzeugen. stehen, letztlich die weltweite Durchsetzung der artefiziell hergestellten Blutpräparate begünstigen sollten. Obwohl Stammzellquelle als Vergleich vielleicht nur bedingt geeignet, sollte die Ent- Eine weitere Frage ist, welche Stammzellen für die Gene- wicklung z. B. beim rekombinanten Gerinnungsfaktor VIII rierung von EK geeigneten Ausgangszellen darstellen. Bis- und anderen ähnlichen Plasmaprodukten den Weg hier- her wurden im Wesentlichen sog. Periphere Blutstamm- zu und die prinzipielle Entwicklungsmöglichkeit aufzeigen. zellen (PBSC), Nabelschnurblut-Stammzellen (CB-SC), induzierte pluripotente Zellen (iPS Zellen) oder embryonale STAND DER TECHNISCHEN UND KLINISCHEN UMSETZUNG Stammzellen (ESC) auf ihr erythropoetisches Differenzierungpotential untersucht, und kommen als Stammzellquelle in Frage (Tabelle 2). Während bei den PBSC oder CB-SC rechnerisch pro Stammzelle ca. 10E5–10E7 rei- Kulturprotokolle fe Erythrozyten oder erythrozytäre Zellen generiert wer- Der Differenzierungsverlauf von der hämatopoetischen den konnten, ist der Expansionsfaktor bei den pluripoten- Stammzelle oder von primitiven Progenitorzellen bis zum ten Zellen wesentlich höher, da sie in Kultur ja bereits als reifen Erythrozyten, sowie Beispiele für wesentliche Fak- Stammzellen über viele Generationen vermehrt werden toren auf diesem Weg sind in Abbildung 1 dargestellt. können, bevor mit einer entsprechend größeren Zahl von Hieraus geht hervor, dass Stammzellen zunächst durch Stamm- und evtl. Progenitorzellen dann die Differenzie- Stammzellfaktor und FLT3 Ligand (FL) und sog. kolonie- rung eingeleitet werden kann. Für die Generierung eines stimulierenden Faktoren zur Proliferation angeregt wer- EK (es enthält ca. 2 × 10E12 Erythrozyten) müssen in der den können. Ein weiterer nützlicher Faktor ist der Insu- Größenordnung von 10E6 bis 10E7 adulte oder aus Na- linartige Wachstumsfaktor (IGF)-1. Beim Erythropoetin, belschnurblut gewonnene hämatopoetische Stammzel- das ursprünglich bereits in frühen Phasen den Differen- len (HSC) eingesetzt werden. Anhand der bekannten Zah- zierungskulturen zugesetzt wurde, wurde später erkannt, len von z. B. CD34+ Zellen, die pro Patient z. B. nach Mo- dass es erst in mittleren und späteren Reifungsphasen bilisierung mit G-CSF gewonnen werden können, könnte notwendig ist. Eine wichtige Rolle vor allem beim Enuk- hier absehbar lediglich eine endliche Zahl Präparate (im leationsprozess (d. h. dem Ausstoss der Zellkerne) spie- Bereich von wahrscheinlich ca. 2–20 EK/Spende) gene- len Stromazellen, entweder in Form von Makrophagen riert werden. Die ersten im Menschen transfundierten und oder von Stromazellinien (Abbildung 1). Mit Eisen bela- auf ihre Überlebensfähigkeit hin 2010 getesteten ex vivo denes Transferrin stellt die Bildung intakten Hämoglobins generierten Erythrozyten stammten aus peripherem Blut2. aus den in den kernhaltigen Vorstufen synthetisierten Hb- Stammzellart Quelle Zahl Erythrozyten/ Ausgangszelle PBSC Peripheres Blut ≈ 10E5 CB-SC Nabelschnurvene ≈ 10E6–10E7 iPS Zellen Viele Gewebe, auch Blut und Nabelschnur ESC* Embryonen Nach Bedarf adjustierbar, da als Stammzellen expandierbar Tabelle 2: Stammzellarten als Ausgangszellen für die in vitro Generierung von EK * in Deutschand beschränkt auf wenige Linien, Sondergenehmigungen erforderlich 41 Auf zwei Wegen könnte die derzeit endliche Proliferations- bereits in den letzten 20 Jahren getätigten Entwicklungen kapazität der PBSC und CB-SC in den Kulturen erweitert für das „Scale-Up“ der Produktion z. B. rekombinanter werden: Zum einen durch eine sogenannte Reprogram- Proteine aus Säugerzelllinien müssen auf die Erythropoe- mierung von HSC, zum anderen durch die Generierung se angepasst werden5. Minimal müssten 5 × 10E7/ml Zel- von immortalisierten HSC- oder Progenitorzelllinien. Zu len als End-Zelldichte erreicht werden (entsprechend 30 beidem gibt es erste grundlegende Arbeiten: Eine japa- Litern pro EK), die verwendeten Reaktorsysteme dürften nische Arbeitsgruppe beschrieb z. B. eine immortalisierte eine etwa 10fach höhere Zelldichte zulassen, unter ent- erythrozytäre Vorläuferzelllinie, die einerseits undifferen- sprechender Perfusion5. Die Reaktoren müssen eine gute ziert proliferieren kann, andererseits gezielt zu Erythrozy- Versorgung mit Eisen (z. B. über humanes Transferrin) und ten ausdifferenziert werden kann. Auch die erfolgreiche sauerstoffarmem Medium zulassen. Mit Hilfe von Mess- Reprogrammierung von adulten PBSC oder CB-SC und sonden und Erfassung von Feedback-Parametern muss ihre anschließende Ausdifferenzierung zu reifen Blutzel- eine sowohl quantitativ und qualitativ zielsicher gesteuer- len wurde gezeigt. te Expansion ermöglicht werden. Derzeit sind u. a. sogenannte Hohlfaser („hollow-fiber“) Reaktorsysteme in der 42 Etablierung, Robustheit und Ökonomie der Produktion im pharmazeutischen Maßstab. Versuchsphase, die sowohl die kontinuierliche Durchflu- Hier liegt derzeit die wohl größte Herausforderung in der die Anordnung in mehreren sukzessiv in der Reihenfolge klinischen Entwicklung von in vitro aus Stammzellen ex- der Zellreifung zu besiedelnden Kompartimenten. Insbe- tung mit Kulturmedium ermöglichen. Sie erlauben auch pandierten EK. Der Einsatz speziell adaptierter Bioreak- sondere für die kritischen Phasen des Eiseneinbaus und torsysteme ist ein Schlüssel auf dem Weg zur Bewältigung der Enukleation müssen vermutlich besondere Struktu- der Generierung großer Zellmengen. In der klassischen, ren mit sog. Nischen, entsprechend der kleinsten Einheit zweidimensionalen (2-D) Kultur werden Zelldichten bis et- der Hämatopoese im Knochenmark, dem „Hämaton“ zur wa 3 × 10E6/ml erreicht. Für ein EK mit 2 × 10E12 Zellen Verfügung stehen. Besondere Herausforderungen dürf- entspricht das einem Kulturvolumen von 600 Litern! Die ten hierbei auch die evtl. nötige Freisetzung von Progeni- 25 2015 torzellen aus einem Progenitor-generierenden Komparti- renen Zellen aus nur ein oder zwei Zentren erfolgen, und ment und ihre Ansiedlung und Weiterentwicklung in sog. die Machbarkeit der Verfahren zudem weiter etablieren „erythropoetischen Inseln“ oder geeigneter ähnlicher Ele- helfen. Stufenweise könnten weitere Versorgungen eta- mente sein. Gegenwärtig ist die Entwicklung der Erythro- bliert werden, z. B. die Versorgung mit autologen EK für poese in Bioreaktoren in einigen in der pharmazeutischen multipel allo-sensibilisierte multitransfundierte Patienten. Industrie angesiedelten Projekten angesiedelt. Von deren In weiteren Schritten könnte allmählich eine weitere Ver- Fortschritt dringt derzeit wenig an die Öffentlichkeit. sorgung bis hin evtl. zur probeweisen oder dauerhaften Flächenversorgung etabliert werden. Parameter für die pharmazeutische Qualität Aus Stammzellen erzeugte Erythrozyten wurden, zusätz- Es ist daher Aufgabe der Versorger von Blutprodukten lich zu den bei konventionellen EK etablierten Qualitäts- und der im Feld der Hämotherapie Tätigen, sich auf die- parametern, bezüglich weiterer Parameter charakterisiert. sem sehr wichtigen Gebiet auf dem Laufenden zu hal- Hierzu zählen die Deformierbarkeit, der Gehalt wichtiger ten, und sich bei den Schritten zur Umsetzung in die Pati- katalytischer Enzyme wie 2,3-Diphosphoglycerat-Syn- entenversorgung frühzeitig und intensiv zu beteiligen. Die thase (Biphosphoglycerat-Mutase), die Kapazität des Hämoglobins in den Erythrozyten, Sauerstoff zu binden gute interdisziplinäre Zusammenarbeit und die fruchtba- und freizugeben, die Vollständigkeit der Enukleation, der ders“ ist sicherlich als Grundlage für diese – für unse- Retikulozytengehalt, und die Expression der Blutgrup- re Patienten vielversprechende – Neuentwicklung eines penantigene. Selbstverständlich müssen die Parameter substantiellen Teils der Hämotherapie eine unabdingba- einer endgültigen pharmazeutischen Qualitätskontrolle im re Voraussetzung. re gemeinsame Entwicklung aller hier tätigen „Stakehol- Rahmen von Zulassungsverfahren, z. B. bei der European Medicines Agency (EMA) jeweils noch etabliert werden. ZU ERWARTENDE WEITERE KLINISCHE ENTWICKLUNG UND AUSBLICK 2011 wurde mit der ersten Transfusion in Menschen und der Ermittlung einer akzeptablen Überlebensrate von noch in klassischen Kultursystemen ein sehr wichtiger Parameter für die weitere klinische Entwicklung erstmals etabliert. Die Autoren erwarten, dass aufgrund der engen Abstimmung mit den Behörden z. B. in Frankreich bei Vorliegen pharmazeutisch ausreichend qualifizierter ganzer EK aus Stammzellen eine erste Phase-I-Pilotstudie durchführbar ist. Natürlich muss auch auf evtl. negative Auswirklungen und Nebenwirkungen ex vivo erzeugter EK geachtet werden. Hierzu könnten die nicht abgeschal- Die Autoren Prof. Dr. med. Reinhard Henschler Blutspende Zürich Rütistrasse 19 8952 Schlieren Tel. 058 272 51 17 / 51 27 Fax 044 731 90 12 [email protected] tete Expression nicht erwünschter Gene und Genprodukte auf den erzeugten Erythrozyten gehören. Der Erfolg und die Zeit bis zu ersten klinischen Anwendungen hängen sicher wesentlich von der Entwicklung von Bioreaktor-Verfahren ab. Für die weitere klinische Entwicklung sind verschiedene Szenarien denkbar: Zunächst könnte eine Teilversorgung z. B. für Patienten, für die sehr schwer kompatible Spender rekrutiert werden können (s. o.), europaweit z. B. bereits mit ca. 20 Präpa- Dr. med. Beat M. Frey Blutspende Zürich Rütistrasse 19 8952 Schlieren Tel. 058 272 51 17 / 51 27 Fax 044 731 90 12 [email protected] Die Literaturhinweise zu diesem Artikel finden Sie im Internet zum Download unter: www.drk-haemotherapie.de raten pro Jahr über die Rare Donor Banken mit tiefgefro- 43 Manuela Krause Neues aus der Rubrik „Was tun wir bei …?“ Positive Eigenkontrolle und/oder positiver Direkter Coombstest: Was nun? Zusammenfassung Summary Die Ursachen eines positiven Direkten Coombstestes (DCT) bzw. einer po- The reasons for a positive direct Coombstest (DCT) or a positive autocontrol sitiven Eigenkontrolle sind vielfältig: sie reichen von physiologischer Immun- are diverse. They range from the physiological binding of immunoglobulin or globulin- oder Komplement-Anlagerung über erkrankungs- und medikamen- complement to phenomena caused by diseases or drugs to clinically relevant tenbedingte Phänomene bis hin zu klinisch relevanten Alloantikörpern nach alloantibodies in the wake of transfusion. Transfusionen. The magnitude of the response of the DCT must not be a decision criterion Als Entscheidungskriterium für eine weitere Abklärung darf nicht die Reakti- for further evaluation. onsstärke des positiven DCT dienen. A positive DCT is of no diagnostic relevance if not corroborated by clinical or Auch hat ein alleiniger positiver DCT keine diagnostische Bedeutung, solange anamnestic evidence or additional laboratory tests (for hemolysis). er nicht durch klinische und anamnestische Informationen oder zusätzliche The most important issue concerning a positive DCT is if the patient has been labormedizinische Untersuchungen (Hämolyseparameter) vervollständigt ist. transfused during the last 3–4 weeks up to 3 months at the most or if he Die wichtigste Frage bei einem positiven DCT ist, ob der Patient in den letzten shows signs of hemolysis. If so, then a further evaluation in the laboratory per 3–4 Wochen bis maximal 3 Monaten transfundiert wurde oder ob er Hämo- elution with subsequent antibody differentiation is necessary. lysezeichen aufweist? Wenn ja, dann ist eine labormedizinische Abklärung in Form einer Elution mit anschließender Antikörperdifferenzierung erforderlich. Als Referenzlabor und Ansprechpartner für unsere Kun- ? Zunächst darf man sich erst einmal freuen, denn es könn- den (Kliniken) werden wir täglich mit den unterschiedlichs- te viel schlimmer aussehen – wenn nämlich alles positiv ten Problemen der einsendenden Labore konfrontiert. wäre! Eine Frage taucht aber immer wieder auf und scheint Aber Scherz beiseite! Ich möchte mich im Folgenden der wirklich landauf, landab Diskussionen auszulösen: obigen Fragestellung annehmen und diese Thematik von verschiedenen Seiten beleuchten. „Was tun wir bei positiver Eigenkontrolle bzw. positivem Direkten Coombstest und gleichzeitig negativem AKS und negativer Kreuzprobe? Weiter abklären?“ Zuerst ein paar Begriffserklärungen: • Die Eigenkontrolle, die hier gemeint ist, wird normalerweise bei der Kreuzprobe und/oder dem Antikörpersuchtest (AKS) im indirekten Coombstest (ICT) mitgeführt; sie setzt sich zusammen aus Patientenserum und Patientenerythrozyten. • Für den direkten Coombstest, der nun im Anschluss oft durchgeführt wird oder manchmal routinemäßig bereits mitläuft, setzt man nur die Patientenerythrozyten ein (möglichst Erythrozytensuspension aus gewaschenem EDTA- oder Citratblut verwenden, um eine „in vitro-Anlagerung“ zu verhindern!). Fall 1: negativer AKS mit positiver Eigenkontrolle Abbildung 1 44 25 2015 • Der direkte Coombstest (DCT; oft auch als DAT Dies bedeutet, dass nicht jeder positive DCT eine kli- (Direkter Antiglobulintest) bezeichnet) dient zum Nach- nische Relevanz (z. B. in Form einer verkürzten Überle- weis einer „in vivo Beladung“ der Erythrozyten mit: benszeit der Erythrozyten) besitzt! Bei 1 % der Blutspen- • Immunglobulinen der und ca. 10 % aller hospitalisierten Patienten ist der • Komplement DCT positiv! • oder beidem Weitere Ursachen für einen positiven DCT sind Erkrankungen und/oder Therapien (Medikamente): • Bei der Elution, die zur Abklärung des positiven DCT durchgeführt wird, werden die Antikörper von den Patientenerythrozyten abgesprengt und anschließend differenziert. • Unspezifische Bindung von Antikörpern an die Erythrozyten bei Erkrankungen mit erhöhtem Immunglobulinspiegel: • Plasmozytom DIE URSACHEN, WARUM EIGENKONTROLLE BZW. DIREKTER COOMBSTEST ISOLIERT POSITIV SEIN KÖNNEN, SIND VIELFÄLTIG • Morbus Waldenström • Sichelzellanämie • ß-Thalassämie • Nierenerkrankungen • Multiple Myelome Ein Problem stellen die hoch sensitiven Nachweisme- • Autoimmunerkrankungen thoden dar, die auf der einen Seite ja erwünscht sind, • Leberzirrhose um niedrigtitrige Antikörper zu detektieren. Andererseits überschneiden sich aber die Normbereiche mit den Nachweisgrenzen auf Gelkarten (oder in der Capturetechnik) wie folgend dargestellt: Normbereich (Kleinste Mengen IgG und C3d sind immer auf den Erythrozyten vorhanden, sozusagen physiologisch): • 5–100 Moleküle IgG/Erythrozyt • 5–500 Moleküle C3d/Erythrozyt Nachweisgrenze auf Gelkarten: • Hochdosierte Therapie mit Immunglobulinen • Adsorbtionsveränderung Membran gegenüber der Erythrozyten- körpereigenen Proteinen (IgG, Komplement), z. B. bei Cephalosporintherapie • Krankheitsbedingt unspezifische Komplement- Aktivierung, z. B. durch Bakterien bei Sepsis • Chimärische Antikörper nach Knochenmark- bzw. Stammzell- oder Organtransplantation – „Empfänger gegen Spender“ oder umgekehrt • Passiver Transfer von Antikörpern bei Gabe von Blutprodukten, z. B. Isoagglutinine/Isohämolysine bei • 100–500 Moleküle IgG/Erythrozyt • 400–1.100 Moleküle C3d/Erythrozyt der Transfusion von plasmahaltigen Thrombozytenkonzentraten (minorinkompatible Transfusion) • Medikamentenbedingte Anlagerung von IgG (dieses Phänomen tritt sehr häufig auf, weshalb man den Zusammenhang noch näher erklären sollte): Das Medikament lagert sich am Erythrozyten an und bildet eine Art Antigen (Neo-Antigen), worauf das Immunsystem nun reagiert und Antikörper gegen dieses fremde Antigen produziert. Die Antikörper sind in diesem Fall nicht gegen Blutgruppenantigene gerichtet, sondern direkt gegen das Medikament, sodass man nach der Antikörperabsprengung im Eluat keine erythrozytären Antikörper nachweisen kann! Fall 1: positiver DCT Gelkarte mit monospezifischen Antiseren Abbildung 2 • Medikamente können allerdings auch die Bildung von Auto-Antikörpern auslösen bzw. begünstigen. Man geht davon aus, dass hier die Supressorzellen unterdrückt werden und so Auto-Antikörper gegen die 45 eigenen Blutgruppen-Antigene (meist Rh-Merkmale) sen Fällen ist der DCT oft nur schwach positiv, da ja gebildet werden (beispielsweise Auto-Anti-e). Dieses nur die transfundierten, AK-beladenen, aber noch nicht Phänomen kann sich je nach IgG-Subtyp und Stärke abgebauten Spendererythrozyten reagieren. Gerade der Beladung in einer autoimmunhämolytischen Anämie bei den gefährlichen transfusionsrelevanten Kidd- (AIHA) äußern! Antikörpern, die dafür bekannt sind, schnell unter die Nachweisgrenze zu rutschen, kann das Bild nach ei- Womit wir nun bei den meiner Ansicht nach wirklich rele- ner Boosterung durchaus mal so aussehen, wie es die vanten und eine Abklärung erfordernden Ursachen eines Abbildungen 3 und 4 zeigen. Oder es ist sogar nur positiven DCT angekommen wären: C3d positiv und trotzdem können wir dann mit Hilfe einer Elution den Antikörper nachweisen, der sich mo- • Autoimmunhämolytische durch mentan nur auf den transfundierten, im Kreislauf zirku- Wärme-Auto-Antikörper oder Kälte-Auto-Antikörper. lierenden, Erythrozyten befindet und im Serum noch Hier dient die Abklärung meist zur Diagnosestellung nicht bestimmen lässt! Anämie (AIHA) bzw. -Sicherung. Bei der Abklärung findet man mitunter eine Spezifität des Auto-Antikörpers (z. B. AutoAnti-e). In den meisten Fällen haben Wärme-AutoAntikörper aber eine breite Spezifität (gerichtet gegen die „Rh-Grundsubstanz“) und reagieren somit mit allen Testzellen! • Alloantikörper (IgG) im mütterlichen Blut, die die Plazenta passieren, an den fötalen Erythrozyten binden und so einen MHN auslösen können. Vor einer Transfusion des Neugeborenen ist unbedingt abzuklären, warum der DCT positiv ist. Dazu kann man auch eine Antikörperdifferenzierung mit dem mütterlichen Serum durchführen, wenn man von dem Neugeborenen zu wenig Blut für eine Elution hat. Achtung: auch eine Rh-Prophylaxe verursacht meist einen schwach positiven DCT beim Neugeborenen, der nicht weiter abgeklärt werden muss, wenn die Information über die durchgeführte Prophylaxe gesichert ist und bei der Mutter keine Alloantikörper bekannt sind. • Alloantikörper im Plasma eines Empfängers, die mit den Erythrozyten-Antigenen des transfundierten Blutes reagieren und dadurch hämolytische Transfusionsreaktionen verursachen können. In die- Fall 2: Schwach positive Eigenkontrolle mit negativem AKS nach Antikörper-Boosterung Abbildung 3 46 NTSCHEIDUNGSKRITERIUM E REAKTIONSSTÄRKE? Ob die positive Eigenkontrolle bzw. der positive DCT weiter abgeklärt werden sollte, darf also nicht von der Reaktionsstärke abhängen, sondern vielmehr muss die Anamnese des Patienten im Vordergrund stehen! Denn, wie oben beschrieben, verbirgt sich hinter schwach positiven Reaktionen nicht selten ein geboostertes AntiJk(a) (Anti-Kidd a). Oder, die Entscheidung für eine weitere Abklärung davon abhängig zu machen, ob es sich um eine IgG- od. C3d –Anlagerung handelt, kann genau in diesem Fall falsch sein, denn ein niedrigtitriger Kidd-AK zeigt sich manchmal nur über die Komplementaktivierung! Fragestellung bei positiver Eigenkontrolle bzw. positivem direkten Coombstest: Wurde der Patient kürzlich transfundiert? • Zeitrahmen: in den letzten 3–4 Wochen, max. 3 Monaten! Fall 2: Schwach positiver DCT durch IgG-Beladung nach Antikörper-Boosterung Abbildung 4 25 2015 Wenn Ja, sind weitere Abklärungen notwendig (Elution) enten mit einem bereits bekannten, abgeklärten positiven • Nach erstmaliger Transfusion können AK in der DCT, die regelmäßig transfundiert werden (z. B. in der On- Nun stellt sich noch die Frage: Was machen wir bei Pati- Regel frühestens nach 1–2 Wochen (meist etwa nach 4 Wochen) nachgewiesen werden. • Nach vorangegangen Transfusionen oder Schwangerschaften können die AK durch eine erneute Immunisierung bereits schon nach zwei Tagen auftreten = sog. Boostereffekt! Wenn der Titer so angestiegen ist, dass die freien Antikörper im Serum nachgewiesen werden können, ist „die Gefahr gebannt“1 und man kann kompatible (= Antigen-negative) Erythrozytenkonzentrate bereitstellen. Kritisch für die immunhämatologische Laboruntersuchung sind freilich die ersten Tage nach der Boosterung, da sich die anfangs noch wenigen Antikörper an die Antigen-positiven Erythrozyten binden und der Antikörpersuchtest und kologie) und somit unter die Rubrik „vortransfundiert“ fallen? Ist hier der DCT jedes Mal erneut abzuklären? Das würde in manchen Fällen bedeuten, alle 2–3 Tage eine Elution mit anschließender Differenzierung durchzuführen. Das kann nicht sinnvoll sein und verbietet sich in der heutigen von Sparmaßnahmen geprägten Zeit ohnehin! Wir haben in unserem Labor aufgrund langjähriger Erfahrung folgende Vorgehensweise festgelegt: Sofern sich die Untersuchungsergebnisse von AKS und Kreuzprobe nicht verändern, also negativ bleiben, und auch die Reaktionsstärke des DCT nicht groß variiert, klären wir den DCT nach ca. 3 Monaten erneut ab. Natürlich sollte man hier immer die Hämolyseparameter im Blick haben. die Kreuzprobe daher negativ ausfallen. Hier geben nur eine positive Eigenkontrolle und ein positiver DCT den Hinweis, dass sich „etwas entwickelt“. KÖNNEN UNS DIE HÄMOTHERAPIERICHTLINIEN HELFEN? Sollten die Informationen über stattgefundene oder fehlende Vortransfusionen (Transfusionsanamnese) nur Bei immunhämatologischen Fragestellungen sucht man schwer abrufbar sein (Patient nicht ansprechbar, war vor- gerne und oft Rat und Hilfe im Abschnitt „Blutgrup- her in einer anderen Klinik etc.), dann könnten folgende penserologische Untersuchungen bei Patienten“ der Laborwerte (bzw. deren Dynamik) einen Hinweis auf Richtlinien2. hämolytische Ereignisse geben: Die Ausführungen zum direkten Coombstest (4.2.5.7.2 Di- • Hb erniedrigt bzw. gefallen rekter AHG-Test) sind allerdings recht knapp gefasst und • HCT erniedrigt bzw. gefallen helfen meist nicht viel weiter: • Bilirubin erhöht bzw. gestiegen • LDH erhöht bzw. gestiegen • Haptoglobin erniedrigt bzw. gefallen • Retikulozytenzahl erhöht bzw. gestiegen Zugegebenermaßen sind die Fälle sehr selten, bei denen der geboosterte Antikörper nur auf den transfundierten „Der direkte AHG-Test dient dem Nachweis von Antikörpern und Komplementfaktoren, die sich in vivo an die Probanden-Erythrozyten gebunden haben (z. B. Auto- Medikamente, die einen positiven DCT verursachen können Alpha-Methyldopa Erythromycin Penicilline Aldomet Fluoracil Probenezid Carbimazol Ibuprofen Procainamid abklären sollte. Chinin Insulin Rifampicin In den allermeisten Fällen allerdings laufen die Abklärun- Cephalosporine Levodopa Streptomycin gen ins Leere, da es sich entweder um physiologische Cisplatin Metamizol Sulfonamide Diclofenac Methadon Tetracycline Doxepin Methotrexat … Erythrozyten zu finden und nicht im Plasma/Serum des Patienten nachweisbar ist. Aber sie kommen eben vor und sind einer der Hauptgründe, warum man die isoliert positive Eigenkontrolle bzw. den positiven DCT überhaupt Anlagerungen (s. Normbereiche und Nachweisgrenze) oder um krankheits-bzw. medikamentenbedingte Phänomene handelt (wie bereits beschrieben)! Tabelle 1 zeigt einige der Medikamente auf, die für einen positiven DCT verantwortlich sein können. Tabelle 1 47 antikörper, Antikörper der Mutter bei Morbus haemolyti- In diesem Fall war nun wirklich „alles möglich“ und der po- cus neonatorum, Alloantikörper gegen Erythrozyten bei sitive DCT des Kindes konnte folgende Ursachen haben: Transfusionsreaktionen). Der direkte AHG-Test sollte mit mindestens zwei verschiedenen polyspezifischen AHGReagenzien durchgeführt werden. Bei positivem Ausfall sind weitere Untersuchungen zur Klärung durchzuführen.“ Ich würde mir wünschen, dass in der nächsten Gesamt- • Klinisch relevante Alloantikörper der Mutter z. B. Anti-c, Anti-e, Anti-Fy(a), Anti-Jk(a) … • Isohämolysine der Mutter (immunes Anti-A und/oder Anti-B) novelle der Richtlinien, die wohl für 2016 zu erwarten ist, • Rhesusprophylaxe die Ausführungen zum DCT etwas modifiziert bzw. erwei- • Rhesusprophylaxe, Alloantikörper und Isohämolysine tert werden. So sollte statt der Festlegung auf zwei verschiedene polyspezifische Reagenzien auch die Option Ohne eine Abklärung des DCT oder einer Antikörper- für den Einsatz monospezifischer Antiseren offen gelas- differenzierung aus dem mütterlichen Serum darf hier sen werden. nicht einfach ein Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rh negativ ccddee bestellt werden. Auch die Formulierung „weitere Untersuchungen zur Abklärung“ sollte überdacht werden. Die Ansicht ist näm- Der positive DCT des Kindes könnte ja auf Antikör- lich weit verbreitet, dass die Richtlinien hier weitere labortechnische Untersuchungen fordern oder empfeh- per der Mutter mit der Spezifität Anti-c zurückzuführen sein – dann wäre die Konstellation „ccddee“ eben nicht Untersuchungsgang – wie oben von mir dargestellt – un- kompatibel. Und wenn bei der Mutter beispielsweise ein Anti-Fy(a) vorliegen würde, müsste man unbedingt ein bedingt und oftmals vorrangig die anamnestische Abklä- entsprechend Antigen-negatives Erythrozytenkonzentrat rung, die nicht selten weitere aufwendige Laboruntersu- (Fy (a) negativ) zur Verfügung stellen. len. Tatsächlich aber gehört zu dem sich anschließenden chungen unnötig erscheinen lässt. In der gleichen Nacht (gegen Mitternacht!) wollte jene KliWünschenswert wäre auch, wenn auf die von mir darge- nik aber die positive Eigenkontrolle eines älteren ortho- stellte Problematik der Patienten mit dauerhaft positiven pädischen Patienten abklären lassen, bevor dieser am DCT eingegangen würde. Hier sollte richtlinienseitig der nächsten Tag zur OP (TEP) anstand! Dieser Patient hat- Spielraum gegeben (und damit auch durch die Richtlinien te keine Vortransfusionen erhalten und zeigte auch sonst als „Instanz“ gestützt) werden, Einzelfallentscheidungen keine Auffälligkeiten in Bezug auf Hämolysezeichen. Hier zu treffen, wie häufig der positive DCT immer wieder ab- war meines Erachtens nach eine Abklärung überflüssig geklärt werden muss. (zumindest aber fragwürdig, und schon gar nicht so pressant, dass man den „Nachtdienst“ beschäftigen müsste). Der positive DCT war mit Sicherheit durch die Medikati- ABSCHLIESSEND EIN FALLBEISPIEL ZU DIESER THEMATIK: on (Schmerzmittel) verursacht. Die Liste der Medikamente, die einen positiven DCT verursachen können, ist mittlerweile sehr lang und wächst stetig weiter! Eine Klinik ließ bei einem transfusionsbedürftigen Neugeborenen den positiven DCT nicht abklären und orderte ohne Vorbefunde der Mutter beim Blutspendedienst ein Erythrozytenkonzentrat der Blutgruppe 0 Rh negativ ccddee („das geht ja bekanntlich immer…“). Niemand Die Autorin (weder das anfordernde Kliniklabor noch der Blutspendedienst) hatte zum Zeitpunkt der Bestellung Informationen über die Blutgruppe oder evtl. vorhandene Alloantikörper der Mutter und die Blutgruppe des Kindes! Manuela Krause Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes Institut für Transfusionsmedizin Augsburg Westheimer Straße 80 86156 Augsburg [email protected] Die Literaturhinweise zu diesem Artikel finden Sie im Internet zum Download unter: www.drk-haemotherapie.de 48 25 2015 Brigitte Hoffmann Qualitätssicherung im Immunhämatologischen Labor Ursachen von Abweichungen und Maßnahmen zur Prävention Zusammenfassung Summary In der Transfusionsmedizin liegen großer Nutzen und großer Schaden eng In transfusion medicine great benefit and great harm are closely together. So beieinander. Deswegen wird hier höchste Qualität und Sicherheit gefordert. the top quality and security is demanded here. In the immunohaematological Im Immunhämatologischen Labor, als einem Glied der gesamten Transfu- lab, as a limb of the complete transfusion chain, numerous measures already sionskette, werden bereits zahlreiche Maßnahmen zur Qualitätskontrolle be- carried out to the high-class control with regard to methodology and work züglich Methodik und Arbeitsablauf durchgeführt. Dies allein ist jedoch nicht routine. Nevertheless, this alone is not sufficient to minimize risks and to avoid ausreichend, um Gefahren zu minimieren und mögliche Fehler zu vermeiden. possible errors. Rather the complete process must be considered. All persons Vielmehr muss der gesamte Ablauf betrachtet werden. Alle Personen, die in involved in the transfusion process must take responsibility for their actions in den Transfusionsprozess involviert sind, müssen Verantwortung für ihr Han- order to avoid potential errors. deln übernehmen, um potentielle Fehler zu vermeiden. EINFLUSSGRÖSSEN VON FEHLERN IM LABOR EINFÜHRUNG Die Qualitätssicherung im Immunhämatologischen Labor mit den dazugehörigen Kontrollen und der aufwendigen Von der Anforderung der Testung bis zur endgültigen Dokumentation, insbesondere am manuellen Arbeits- Berichterstattung der Ergebnisse kann jeder Feh- platz, mag sich zunächst lästig und übersteigert darstel- ler, der theoretisch möglich ist, irgendwann tatsächlich len. Doch niemand möchte an einer Fehltransfusion mit vorkommen. ihren fatalen Folgen ursächlich beteiligt sein. Bei der Sicherheit von Vene zu Vene liegt die Qualitätssicherung nicht nur in der Verantwortung einer Person oder einer Abteilung. Qualität ist hier „Everybodys Business!“ Alle Personen, die in den Transfusionsprozess involviert ! Die Folgen können tödlich sein! Sie können vermieden werden! Was müssen wir tun? sind, müssen Verantwortung für ihr Handeln übernehmen, um potentielle Fehler zu vermeiden. Gerade auch die Bei entstandenen Fehlern oder besser ausgedrückt Ab Schnittstellen vor und nach dem Immunhämatologischen weichungen bzw. Vorkommen unerwarteter Ereignisse Labor müssen besonders kritisch betrachtet werden. muss man verdeutlichen: Blutspende Bluttransfusion Blutabnahme Patient Probeneingang im Labor Konservenverarbeitung Transportwege Ausgabe aus Blutdepot Immunhämatologisches Labor Transportwege in Klinik Transfusionsvorbereitung Bedside-Test, Überwachung 49 Es geht nicht um persönliche Schuldzuweisungen, sondern um die Sicherheit und das Wohlbefinden des Patienten! Fehlerhäufigkeit steigt auch stark an, wenn die Mitarbeiter unzureichend ausgebildet, gestresst oder übermüdet sind, wie dies z. B. bei Überlastung durch Personal- Bei einer offenen Fehlerkultur, mangel entstehen kann. Aber auch Gedankenlosigkeit und Nichtbeachtung der Vorgaben spielen hier eine Rolle. ohne Befürchtung von Sank- So sind Verschreiben, Vertippen, Vergessen, Verwech- tionen, müssen entstandene seln die häufigsten Ursachen für fehlerhafte Ergebnisse. Fehler nicht vertuscht werden Für einfache Routineuntersuchungen ist die Zeit der MTA und man hat die Chance, aus einem entstandenen Fehler viel zu kostbar. Diese Tätigkeiten werden durch Automaten effizienter ausgeführt. Zahlreiche In-Prozess-Kontrol- zu lernen, damit er nicht ein len gewährleisten dabei Sicherheit für jeden Arbeitsschritt. zweites Mal vorkommt. Mit entsprechender EDV-Unterstützung werden PatienDer Faktor „Inadäquate so- tendaten, Ergebnisse und Chargenbezeichnungen fehler- ziale Interaktion“ wirkt dabei frei dokumentiert. in besonderem Maße kritisch mit anderen Einflussgrößen zusammen. Übergabe und Weitergabe von Informationen in der Transfusionsmedizin sind überlebensnotwendig! Aber das ist einfacher gesagt als getan. Ein weiteres wichtiges Augenmerk gilt der Qualifizierung der zuständigen Mitarbeiter. Es entscheiden zunehmend die Klinikverwaltungen, welches Personal wie und wo möglichst kostengünstig eingesetzt werden kann. Missverständnisse aller Art (Koordinationsschwierigkei- So kommt es nicht selten vor, dass z. B. MTAs, die sonst ten, Kompetenzdifferenzen, Sprachbarrieren) sind oft tagsüber ausschließlich in der Klinischen Chemie einge- Ursachen für Fehler oder Fehlverhalten! Eine eindeutige setzt sind, nachts das Blutdepot mit abdecken müssen. Kommunikation sollte daher rechtzeitig, verständlich und Es sind dann nur geringe Kenntnisse vorhanden und eine möglichst schriftlich erfolgen. aufgetretene Schwierigkeit wird irgendwie gelöst. Blutgruppenserologie ist eine der MTA vorbehaltene Tätigkeit. So steht es im MTA-Gesetz. Aber inzwischen ist, so wie in der gesamten Medizin, das Wissen so umfangreich geworden, dass Spezialisierungen nötig sind. Institutionen, die dieses Wissen vermitteln, sind dünn gesät und werden zunehmend weniger. Unzureichende Schulung oder Ausbildung ist ein Risiko und in der heutigen Zeit des effizienten Gesundheitssystems ein weiterer krankmachender Faktor. In TFG und Richtlinien heißt es: Der transfundierende Arzt muss besonders sachkun- 50 Mit zu den häufigsten Abweichungen gehören Konzen- dig sein. Jedoch bedingt durch den gravierenderen Ärz- trationsfehler. Die volle Aufmerksamkeit auf die gerade temangel, auch in den Kliniken, kann man sich immer we- ausgeführte Tätigkeit zu lenken, ist bei dem heute übli- niger auf das nötige Spezialwissen „Transfusionsmedizin“ chen „Multitasking“ im Labor oft nicht mehr möglich. Die der diensthabenden Ärzte verlassen. 25 2015 Ein Support seitens der Blutspendedienste ist deshalb ein wichtiges Sicherheitstool für diensthabende MTAs, Ärzte Richtlinien heißen zwar „Richtlinien“, haben aber Gesetzescharakter, wenn es zu rechtlichen Auseinander- und letztendlich für Patienten. Dies gilt vor allen Dingen setzungen kommen sollte. am Abend, in der Nacht und an den Wochenenden. ! Doch für manch einen bleibt das ganze Qualitätsmanagement-System ein Dorf mit vielen Q´s und so ist es „Wer mit Anerkennung knausert, spart am falschen Ort.“ auch nicht verwunderlich, wenn man die Begrifflichkeiten durcheinander bringt. All diese Gesetze und Richtlinien sind kein Garant und er- Anerkennung braucht jedermann! Mangelnde Wert- setzen nicht die wichtigste Voraussetzung für gute Qua- schätzung wirkt sich auf Mitarbeiter ziemlich demotivie- lität: Gut ausgebildete, motivierte Mitarbeiter in allen rend aus. Und wenn die Motivation sinkt, steigt das Feh- Funktionen und in ausreichender Anzahl! lerrisiko! Dieser sog. „softskill“ wirkt sich nicht nur qualitätsmindernd aus, wenn z. B. nur noch nach Vorschrift Die Mindestanforderungen zur Qualitätssicherung für gearbeitet wird und Augenmaß und gesunder Menschen- das Immunhämatologische Labor sind im Kapitel 4 der verstand außen vor bleiben, sondern es kann für den Trä- „Hämotherapie-Richtlinien“ und im Speziellen Teil B 2 ger der Einrichtung richtig teuer werden, wenn Mitarbeiter „Qualitative laboratoriumsmedizinische langsamer und ohne Engagement ihre Arbeit verrichten, Untersuchungen“ beschrieben. Demzufolge ist es verpflichtend, alle gleichgültig handeln oder öfter als nötig krank sind. Qualitätsmerkmale des Labors in einem Qualitätsmanagement-Handbuch zusammen zu fassen. In der Transfusionsmedizin liegen großer Nutzen und großer Schaden eng beieinander. Deswegen ist hier höchste Qualität und Sicherheit gefragt. An einer Externen Qualitätskontrolle in Form des sog. Ringversuches muss demgemäß 4-mal jährlich teil genommen werden. Die hier durchzuführenden Tests richten sich nach dem jeweiligen Untersuchungsumfang des Im Bestreben nach einem gut funktionierenden Quali- Labors. Hierbei wird die Materialienqualität, die Metho- tätsmanagement-System wurden zahlreiche Regularien, deneffizienz und das Fachwissen der Mitarbeiter über- wie TFG, AMWHV, MPG, AMG, Leitlinien zur Therapie mit prüft. Der für das Labor verantwortliche Arzt muss das Blutkomponenten, EU-Guidelines, MTA-Gesetz usw. auf- Bestehen bzw. Teilnahme des RV bei der Ärztekammer gestellt, die u. a. Verantwortlichkeiten und Qualifikationen oder Kassenärztlichen Vereinigung melden. Sollte wegen festlegen. eines unrichtigen Testergebnisses kein Zertifikat erteilt worden sein, so hat man die Verpflichtung, die Unrichtig- Zu den hier bedeutendsten Regelwerken gehören die keit zu klären und zu beheben, sowie diesen Vorgang zu Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandtei- protokollieren! len und zur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie), die Richtlinien der Bundesärztekammer zur Quali- Die gesetzlichen Vorgaben zur Einhaltung der Internen tätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchun- Qualitätskontrolle sind in den RiliBÄK und Rili zur Hä- gen und die Regeln der Guten Herstellungspraxis (GMP). motherapie verhältnismäßig kurz abgehandelt. Diesen zufolge sollen die ABO-Merkmale, die Rhesusformel mit bekannten Blutgruppen, sowie der Direkte Anti-Humanglobulintest mit zwei verschiedenen polyspezifischen AHG-Reagenzien nach Angaben der Reagenzienhersteller, wenigstens wöchentlich bzw. bei Chargenwechsel überprüft werden. Für weitere Antigenaustestungen, wie z. B. Kell, Duffy, Kidd usw., ist wie beim Rhesus-System ein zweites Antiserum (bzw. Klon) erforderlich. Negative 51 und positive Kontrollen sollen mitgeführt werden, wobei Die Sensitivität und Spezifität des Antikörpersuchtestes sich der Einsatz einer Zelle mit schwacher Antigenausprä- ist arbeitstäglich mit einem geeigneten Serum bekannter gung (heterozygot) für die Positivkontrolle empfiehlt. Antikörperspezifität von schwacher Reaktivität zu kontrollieren. Diese Kontrolle ist bei jeder verwendeten Technik Die verwendeten Chemikalien, Lösungen, Supplemen- und in jedem Nachweismilieu durchzuführen. te, Enzyme, Plasmen und Testzellen sind wöchentlich auf ihre Beschaffenheit, insbesondere auf Hämolyse, Schlierenbildung und Trübung zu überprüfen. Entsprechende Kontrollkits für die interne Qualitätskontrolle werden von nahezu allen Reagenzienherstellern angeboten. Die Positivkontrolle für den Antikörpersuch- Das Erkennen von patientenspezifischen Störfaktoren wie test (meist ein Anti-D) muss entsprechend verdünnt wer- Pseudoagglutinationen, Mischfeldagglutinationen, Auto- den, um eine schwach positive Reaktion zu erhalten. Eine Antikörper oder Spontanhämolyse sollte eine Selbstver- Standardisierung stellt sich schwierig dar, da auch die un- ständlichkeit sein. terschiedliche D-Antigenausprägung der Erythrozyten zu Abweichungen führt. Mit einem schwach reagierendem Die Ergebnisangaben der Qualitätskontrolle sollen folgen- Anti-Fy(a) Kontrollserum kann eine Enzymkontamination de Daten enthalten: Hersteller der verwendeten staatlich z. B. der AKS-Zellen überprüft werden. zugelassenen Testseren und Reagenzien, Verfallsdatum, Chargen-Nr. und Klon, sowie die Reaktionsstärke (1 bis 4). Bei der Antikörperidentifizierung lassen sich keine festen, immer gültigen Regeln aufstellen. Ein eingeschlage- Für alle Dokumente der internen und externen Qualitäts- ! ner Weg kann zum Ziel oder in die Irre führen. Deshalb kontrolle gilt eine Aufbewahrungsfrist von 5 Jahren. Hierzu bedarf es hier zur Ergebnisfindung neben reichlichem gehören auch die Hygieneprotokolle und Temperaturauf- Wissen auch vieler Erfahrung. Damit ein Zufallsbefund zeichnungen. Ein sauberer und ordentlicher Arbeitsplatz ausgeschlossen werden kann, ist es notwendig, den oder ist die Grundbedingung der Guten Herstellungspraxis. die detektierten Antikörper über mindestens zwei weitere positive und negative Testzellen abzusichern. Auch die dazugehörige Antigenbestimmung gibt Aufschluss über „Tue, was aufgeschrieben ist. Schreibe auf, was getan ist. Was nicht aufgeschrieben ist, ist nicht getan.“ die gefundenen Antikörper. Im Befundbericht ist die Relevanz der Antiköper für eine Transfusion oder Schwangerschaft anzugeben. Damit klinisch relevante Antikörper auch im Falle eines Titerabfalls unterhalb der Nachweisbarkeitsgrenze berücksichtigt werden können, ist der betreffenden Person ein Notfallpass auszustellen. Jeder Teil des Equipments wie z. B. Inkubatoren, Waschzentrifugen, Reagenzien-Kühl- und Gefrierschrän- Für alle Methoden gilt es nach dem neuesten Stand der ke, Pipetten, Timer, Thermometer usw. muss auf Funktio- Wissenschaft und Technik zu arbeiten. Zum Nachweis nalität überprüft werden. Alle Ereignisse sind in einem sog. von Antikörpern ist der indirekte Antihumanglobulintest Gerätebuch festzuhalten. Geräte, insbesondere Automa- (oder vergleichbare Methoden wie z. B. ein Festphasen- ten, sind an jedem Arbeitsplatz auf ihre Funktionstüchtig- Immuno-Assay) vorgeschrieben. Generell gilt es die Ar- keit zu überprüfen. Hierbei sind Kontrollen bzw. Validie- beitsanleitungen einschließlich dazugehöriger Qualitäts- rungen bei Neuinstallationen, nach Reparaturen, bei Pro- kontrollen der Diagnostika-Hersteller zu beachten. blemen und regelmäßig durchzuführen. Die Freigabe zum Wiedereinsatz erfolgt durch eine verantwortliche Person. Eine Validierung eigener Arbeitsweisen ist unumgänglich, Zur Qualitätskontrolle gehören auch die Überwachung abgewichen wird. wenn aus praktikablen Gründen von diesen Vorschriften der Transportbedingungen von Blutpräparaten, sowie eine Depotoptimierung. Die Lagerung der Blutkomponen- Die häufigste Ursache eines schweren hämolytischen ten bedarf einer kontinuierlichen Temperaturaufzeichnung. Transfusionszwischenfalls ist die Verwechslung von Patient, Blutprobe oder Blutkonserve. Daher ist die Identität Achtung! Bei häufiger und zu langer Verweildauer des Patienten, der Blutprobe und der Konserve an meh- (z. B. RT > 30 min) der Erykonzentrate während der Labor- reren Stellen zu sichern! arbeiten riskiert man ein Keimwachstum innerhalb des Arzneimittels. 52 Die Probenidentifikation beim Eingang ins Labor ist 25 2015 deshalb mit besonderer Sorgfalt zu prüfen. Was nützt ei- Wenn Blutprodukte aus dem Blutdepot ausgegeben wer- ne perfekt bestimmte Blutgruppe, wenn der „falsche Pa- den, ist eine nochmalige Überprüfung von Patientendaten, tient im Röhrchen“ ist? Deshalb ist hier neben dem doku- Begleitpapieren und des Blutpräparats auf Unversehrtheit mentierten Eingangszeitpunkt ein Vergleich von Begleit- oder Hämolysezeichen dringend erforderlich. papieren und Probenröhrchen wichtig. Ein Heranziehen von Vorbefunden gibt zusätzliche Sicherheit. Jedes immunhämatologisch arbeitende Labor sollte neben der Einhaltung der in den Richtlinien niedergelegten Standards die eigenen speziellen Begebenheiten berücksichtigen und die individuellen Regeln daraufhin erweitern. Dies ist in Arbeitsanleitungen (SOPs) festzulegen, zu schulen und deren Einhaltung ist z. B. mittels Selbstinspektionen zu überprüfen. Werden Abweichungen festgestellt, sollen diese ausgewertet und korrigierende sowie präventive Maßnahmen folgen. Die Anforderung für Blutprodukte entspricht einem ärztlichen Rezept. Sie muss vollständig ausgefüllt, von der ab- Selbstverständlich ist die Teilnahme an der Transfusions- nehmenden Person unterschrieben und mit dem Entnah- kommission, genauso wie an regelmäßig stattfindenden medatum, das die Gültigkeit der Kreuzprobe limitiert, ver- Besprechungen und angebotenen Fortbildungsveranstal- sehen sein. tungen. Durch ein multidisziplinäres Audit, das sich auch außerhalb des Labors über Transportwege, Station, OP, Der anfordernde Arzt haftet für die Identität der Blut- Notaufnahme erstreckt, erhält man Einsicht in den ge- probe! Für alle immunhämatologischen Untersuchungs- samten Transfusionsprozess. aufträge sind bedeutende anamnestische Angaben notwendig. Dies betrifft die Diagnose, aktuelle Medikation, Vortransfusionen, Schwangerschaften, Rh-Prophylaxe, Um bestmögliche Qualität auch in Notfallsituationen sicher zu stellen, soll ein entsprechender Katastrophen- Z. n. Knochenmark-/Stammzell-Transplantation, Vorbe- Plan aufgestellt und regelmäßig eingeübt werden. funde bezüglich der Blutgruppe und irregulärer Antikörper. Es würde den Rahmen sprengen, hier alle zweckmäßiZur Durchführung aller Teste gehört eine lückenlose und gen Maßnahmen zur Qualitätskontrolle im Detail zu be- GMP-gerechte Dokumentation aller Untersuchungser- schreiben. Jedes Labor muss für sich entscheiden, wel- gebnisse im Labor. Die Aufbewahrungsfrist beträgt je che zusätzlichen Kontrollen sinnvoll sind. Generell ist nach Dokument bis zu 30 Jahren. festzustellen, dass Qualitätssicherung kein statischer Zustand ist. Denn, wie es so schön heißt, man befindet Die Kontrolle aller Daten nach Abschluss immunhämatologischer Untersuchungen, durch eine zweite qualifizierte Person, das sog. 4-AugenPrinzip, ist von enormer Wichtigkeit! sich hier in einem kontinuierlichen Verbesserungsprozess, wobei Augenmaß und gesunder Menschenverstand eine wichtige Rolle spielen. Die Autorin Brigitte Hoffmann Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes gemeinnützige GmbH Institut für Transfusionsmedizin Augsburg Westheimer Straße 80 86156 Augsburg [email protected] Die Literaturhinweise zu diesem Artikel finden Sie im Internet zum Download unter: www.drk-haemotherapie.de 53 Dokumentation von Transport und Lagerung von Gerinnungspräparaten LESERFRAGE: Sehr geehrte Damen und Herren, ich bin externer Qualitätsbeauftrag- PPSB, ATIII, Fibrinogen o.Ä. in einem Zwischenlager nah an den mög- ter für Hämotherapie für 2 Krankenhäuser. In den Transfusionskom- lichen Patienten. missionen kommt immer wieder die Frage nach der korrekten Dokumentation auf. In den Richtlinien steht unter „4.3.10 Dokumentation“: Im Fall eines empfängerseitigen Lookbacks sind dann nur das Applikationsdatum und Uhrzeit sowie die Chargennummer des Plas- „Die Annahme nach Transport [ ... ] sind lückenlos zu dokumentieren“ maderivates bekannt. Transport/Annahme/Zeitpunkt können jedoch Dies betrifft ja sicherlich auch Plasmaderivate aus der Apotheke oder nicht eindeutig zurückverfolgt werden, da mehrere dieser Blutproduk- dem Labor. Diese haben jedoch nur eine Chargennummer – Eine in- te auf Station aus unterschiedlichen Lieferungen (der Apotheke) die- dividuelle eineindeutige Nummer wie bei einer Blutkonserve wird nicht selbe Chargennummer haben. Somit kann 4.3.10 nicht vollständig er- vergeben. Zwar dürfen diese Blutprodukte auf Station nicht auf Vor- füllt werden. rat vorgehalten werden, ohne dass diese für einen bestimmten Patienten bestimmt wären. Jedoch finden sich auf Intensivstationen häufig Welches praktische Vorgehen können Sie empfehlen? ANTWORT: teren Dokumentation zu verwenden. Mir ist nur ein EDVSystem bekannt, dass diese Möglichkeit bietet. Sehr geehrter Herr Kollege, in Ihrer Anfrage über die Dokumentation von Transport und Lagerung von Gerinnungs- Für die Etablierung sinnvoller, einfacher und praktika- präparaten greifen Sie ein Problem auf, dass auch mir bei bler Lösungen in den Krankenhäusern lohnt es sich je- Audits in Krankenhäusern immer wieder unterkommt. Im doch (wie eigentlich immer) den sachlichen Hintergrund, Gegensatz zu den Blutkomponenten (Erythrozytenkon- der in den Richtlinien unter 4.3.10 genannten Festlegun- zentraten, Thrombozytenkonzentraten und therapeuti- gen anzusehen. Es geht hier darum, den dokumentierten schen Plasmen), bei denen jeder einzelne Beutel seine Nachweis zu führen, dass Blutprodukte und Blutkompo- eigene Chargennummer hat, tragen bei Gerinnungsfak- nenten ordentlich und sachgemäß gelagert und transpor- toren und Plasmaderivaten oft hunderte gleichartiger Pro- tiert wurden. Meines Erachtens ist es dabei nicht zwin- dukte dieselbe Chargennummer. Dies ist für Medikamen- gend erforderlich künstliche (Sub-) Chargennummern te, die in größeren Gebinden hergestellt werden üblich. zu schaffen. Ich habe in einigen Häusern sehr gute Do- Daher lässt sich die von den Blutkomponenten gewohn- kumentationen gefunden, die sich sowohl in Papierform, te und etablierte Technik der absolut individuellen Doku- als auch elektronisch an dem uns allseits aus der Kran- mentation des Transportes, der Annahme und der Lage- kenhauspraxis bekannten „BTM-Buch“ orientieren. Hier rung jedes einzelnen Beutels nicht so ohne Weiteres auf wird bei Übernahme mehrerer Produkte ein und dersel- diese industriell hergestellten Produkte übertragen. ben Charge die Übernahme der einzelnen Gebinde und deren Menge in den Bestand dokumentiert mit Zeitpunkt 54 Wollte man den Anspruch der absolut individuellen Dokumentation für jedes einzelne Produkt, auch für die- der Übernahme. Bei Ausgabe einzelner Produkte dieses se industriell hergestellten Produkte realisieren, dann blie- Chargennummer und Patient hergestellt. Die Dokumenta- be hier nur die Möglichkeit seitens der versorgenden Apo- tion der Annahme nach Transport und der Lagerungsbe- theke, oder bei Übernahme der Produkte durch das De- dingungen erfolgt damit natürlich für eine gewisse Anzahl pot, zusätzlich zu den vorhandenen, nicht eindeutigen einzelner Produkte gemeinsam, gleichwohl kann aber Chargennummern, selbst generierte Chargennummern dann bei Zweifeln an der ordnungsgemäßen Lagerung für die Einzelprodukte zu verteilen und diese bei der wei- und Transport auf diese Gesamtdokumentation zurück- Gebindes wird dann eine eindeutige Zuordnung zwischen 25 2015 gegriffen werden. Wichtig ist in diesem Zusammenhang Eine Regelung auf dieser Basis wird aus meiner Sicht den allerdings, dass für den Fall, dass zu unterschiedlichen Anforderungen der Richtlinien, wie sie unter Punkt 4.3.10 Zeitpunkten Präparate mit gleicher Chargennummer an- ausgeführt sind, gerecht werden. geliefert werden, eine saubere Logistik im Bezug auf First-in, First-out sichergestellt ist. Freundliche Grüße PD Dr. med. Thomas Zeiler Anwendung eines Dreiwegehahns LESERFRAGE: 4.3.4 Aufgaben des transfundierenden Arztes Der transfundierende Arzt hat sich über die Aufklärung und Einwilligung des Patienten vor Einleitung der Transfusion zu versichern (s. Abschn. 4.3.10). Die Einleitung der Transfusion erfolgt durch den Arzt, bei mehreren zeitlich unmittelbar nacheinander transfundierten Blutkomponenten werden die Einzelheiten im Qualitätssicherungssystem unter Beachtung der Abschnitte 4.3.2 und 4.3.2.1 festgelegt. Nun wurde die Frage aufgeworfen, ob es machbar ist, dass zwei anderen Konserve beaufsichtigt. Dann würde er sich entfernen, die Konserven über einen Dreiwegehahn angeschlossen werden, der Bedside-Test gemacht wird, und dann der transfundierende Arzt zu- die Pflege würde über den Dreiwegehahn den Konservenwechsel nächst einen kleinen Teil der einen und dann einen kleinen Teil der vornehmen. ANTWORT: Transfusion würde aber nicht „unbeaufsichtigt“ erfolgen, weitere Transfusion würde dann also unbeaufsichtigt erfolgen und denn es ist ja in den Hämotherapie-Richtlinien gefordert, Die nach Abschnitt 4.3.4 im QM-System festzulegenden dass für eine geeignete weitere Überwachung zu sorgen Einzelheiten der Transfusionseinleitung bei mehreren zeitlich unmittelbar nacheinander transfundierten Blutkom- ist. Auch wenn dieser Wortlaut – übrigens sinnvollerweise – Interpretationsspielraum lässt, kann es nicht sein, dass ponenten können nichts anderes beinhalten, als dass der „die weitere Transfusion ... dann also unbeaufsichtigt erfol- gewählte Weg garantieren muss, dass die Transfusion je- gen“ würde. Mindestens muss die zuständige Pflegekraft der einzelnen Blutkomponente durch den Arzt eingelei- die zeitliche Kapazität haben, regelmäßig nach dem Pa- tet wird, weil die Transfusionseinleitung in Deutschland tienten zu sehen. Der zuständige transfundierende Arzt schon immer eine nicht delegationsfähige Arztaufgabe muss außerdem unverzüglich erreichbar sein. war und ist. Dabei sind auch die Anforderungen an die Identitätssicherung und den Bedside-Test je Transfusi- Die Bestimmung, dass die transfundierende ärztliche Per- onsserie zu beachten. Die Einleitung der Transfusion einer son die Transfusion von Blutkomponenten persönlich ein- Blutkomponente ist also generell nicht delegierbar, son- zuleiten hat, bezieht sich auf die Durchführung der bio- dern nur die Fortführung der Transfusion. logischen Verträglichkeitsprüfung, auch Oehleckerprobe genannt, die ergänzend zur serologischen Verträglich- In der Praxis kann dieses Problem tatsächlich dadurch keitsprüfung durchgeführt werden muss. Diese Verträg- gelöst werden, dass nach Durchführung des Bedside- lichkeitsprüfung geht auf den Chirurgen Oehlecker und Tests zwei Konserven über einen Dreiwegehahn ange- die Zeit der Direkttransfusion von Spendern auf Empfän- schlossen werden und der transfundierende Arzt zu- ger zurück; sie besteht in der raschen Übertragung von nächst einen kleinen Teil der einen und dann einen klei- 10–20 ml Blut, die bei Unverträglichkeit im AB0-System nen Teil der anderen Konserve transfundiert und dabei innerhalb weniger Minuten zu Gesichtsrötung, Unruhe den Patienten auf Unverträglichkeitsreaktionen beob- und Übelkeit führt. Treten diese Symptome auf, ist die achtet. Dann würde sich der Arzt entfernen. Die weitere Transfusion selbstverständlich sofort abzubrechen, da 55 sich ansonsten rasch eine ausgeprägte Schocksympto- Christoph Metzelder matik einstellen würde. Nicht nur die Überprüfung der zu applizierenden Blutkomponenten gehört zu den wesentlichen transfusionsvorbereitenden Aufgaben, die nicht delegierbar sind, son- Mutspende 2015 MIT BLUT SPENDEN MUT SPENDEN. dern auch diese biologische Sicherheitsprüfung. Sie und nur sie ist der Grund dafür, warum der Arzt die Transfu- Das Motivieren der Menschen in Deutschland für die Blut- sion von Blutkomponenten persönlich einzuleiten hat. Es spende ist eine der zentralen Aufgaben der Blutspende- gibt keinen Grund, hier irgendwelche Unterschiede zwi- dienste des Deutschen Roten Kreuzes. Gleichzeitig ist es schen der ersten und jeder nachfolgenden Konserve zu aber auch eine der größten Herausforderungen: Rund sehen. Die Einleitung der Transfusion einer Blutkompo- um die Uhr und 365 Tage im Jahr müssen Patienten in nente ist also generell nicht delegierbar, sondern nur die Deutschland mit Blutpräparaten versorgt werden, sodass Fortführung der Transfusion. der Bedarf an Blutspenden nie ausbleibt. In der Praxis wird dieses Problem gelegentlich dadurch Um diesem Auftrag gerecht werden zu können, müs- gelöst, dass mehrere Blutkomponenten über ein Mehr- sen die Blutspendedienste des DRK regelmäßig aus der weg-Infusionssystem verbunden werden und zunächst kleine Teilvolumina aller Blutkomponenten, deren Transfusion geplant ist, appliziert werden. Damit ist die Transfusion all dieser Blutkomponenten eingeleitet und die Fortführung wird dann an das Pflegepersonal delegiert. Wenn- mutspende.de gleich dies sachlich nicht zu beanstanden ist, stellt sich doch die Frage, wozu solche Konstruktionen notwendig sein sollen. Sie werden letztlich immer auf eine Personalknappheit zurückzuführen sein, die das haftungsrechtliche Problem nach sich zieht, wie die Patientensicherheit gewährleistet ist, wenn im Verlauf der Transfusionsfortführung unerwünschte Reaktionen auftreten. Deshalb muss an dieser Stelle abschließend darauf hingewiesen werden, dass zwar die Fortführung und die Überwachung der Transfusion delegierbar sind, keinesfalls jedoch die ärztliche Verantwortung für diese Prozesse. Diese ist grundsätzlich nicht delegierbar. Eben aus diesem Grund kann man die Leseranfrage auch nicht präziser und befriedigender beantworten. Die Regelung der nach Abschnitt 4.3.4 im QM-System festzulegenden Einzelheiten der Transfusionseinleitung bei mehreren zeitlich unmittelbar nacheinander transfundierten Blutkomponenten muss unbedingt die organisatorischen, personellen und technischen Besonderheiten der eigenen Einrichtung berücksichtigen, um den richtigen Weg zwischen Personalknappheit, angestrebter organisatorischer Erleichterung, Patientensicherheit und Haftungsrecht zu finden. Freundliche Grüße Prof. Dr. med. Robert Zimmermann 56 25 2015 MIT BLUT MUT Masse der Werbetreibenden heraustreten und in das Be- te Gesichter. Mittlerweile ist es zum Standard g eworden, wusstsein der Zielgruppe vordringen. Täglich prasseln etwa 10.000 Werbebotschaften auf jeden Deutschen ein, dass mit Hilfe von bekannten Persönlichkeiten aus den aus der jede einzelne versucht herauszustechen. In die- schauer gewonnen wird und im Optimalfall die Marken- sem Kommunikationskampf um die Währung „Aufmerk- attribute der Personen auf die Marke übertragen werden. samkeit“ konkurrieren die Blutspendedienste mit sämtli- Hierbei spielt insbesondere die Authentizität eine große verschiedensten Branchen die Aufmerksamkeit der Zu- chen Werbetreibenden in Deutschland – vor allem aber Rolle. Gerade die jüngere Zielgruppe bewertet Prominen- mit Hilfsorganisationen und Projekten, die ebenso den te durchaus reflektiert und sieht es nicht gerne, wenn ein Anreiz „Gutes tun“ bzw. „Menschen in Not helfen“ befrie- Promi „wild“ für Marken aus allen Umfeldern wirbt, die im digen. Erschwerend kommt hinzu, dass oftmals die Bar- schlimmsten Fall nicht einmal zu ihm oder ihr passen. rieren für eine Unterstützung der Hilfsorganisationen sehr viel niedriger liegen als bei denen einer Blutspende, die Ein positiv aufgeladenes Umfeld, in dem Marken gerne statt einer Online-Überweisung immer einen Aufwand mit Prominenten werben, ist der Sport. Gerade Jugendli- von circa einer Stunde mit sich bringt. che identifizieren sich leicht mit Sportlern und in Deutsch- Die Aufmerksamkeit der Zielgruppe kann durch positive mehr Strahlkraft entfacht. Im letzten Jahr nutzten die Blut- Auffälligkeiten gewonnen werden – z. B. durch prominen- spendedienste des DRK genau dieses Umfeld, um mit land insbesondere mit Fußballern, wodurch die Werbung Fußballprofis aus der Bundesliga auf die Thematik „Blutspenden“ aufmerksam zu machen. Unterstützt von: Mit einer Award-Idee der Hamburger Werbeagentur Jung von Matt, in der Julian Draxler und weitere Größen der Bundesliga aus dem Bereich des Blutspendedienstes West, Gesichter einer deutschlandweiten Kampagne wurden, konnte eine PR-Welle losgetreten und deutsch- SPENDEN SPENDEN. landweit auf die Thematik aufmerksam gemacht werden. Die Idee hinter den blutspendenden Fußballprofis: Mit einer Blutspende geben die Profis zusätzlich eine Portion Kampfgeist, Siegeswille und Kraft an die Patienten weiter – die Blutspende wird also gleichzeitig zur Mutspende. Um diesen Erfolg noch auszubauen, wurde die Mutspende-Kampagne in diesem Jahr auf ganz Deutschland ausgeweitet. Mit Fußballern wie Clemens Fritz (Werder Bremen), Alexander Meier (Eintracht Frankfurt) oder KlaasJan Huntelaar (FC Schalke 04) aus den Einzugsgebieten der regionalen Blutspendedienste, wurde bewusst Nähe erzeugt, welche die Identifikation der potentiellen Blutspender mit den Mutspendern erhöht. Auf einem gemeinsamen Mannschaftsfoto treten die Spieler und Patienten als „Mutspende-Elf“ auf und sagen der Blutarmut den Kampf an. Alle Kampagnenmotive sowie der PR-Film sind unter www.mutspende.de zu finden. Der Autor Christoph Metzelder Ehemaliger Fußballprofi Geschäftsführer Jung von Matt/sports und Sky-Experte 57 Die Autoren Prof. Dr. Peter Bugert Jahrgang 1964, ist Molekularbiologe und leitet seit März 2000 das molekularbiologische Labor am Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie Mannheim des DRK-Blutspendedienstes Baden-Württemberg - Hessen gemeinnützige GmbH. Nach seinem Biologie-Studium in Würzburg und Heidelberg war er zunächst am Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung in Heidelberg tätig um seine Promotion im Bereich molekulare Bakteriologie anzufertigen. Es folgten 5 Jahre als Postdoc in Heidelberg mit Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der molekularen Onkologie. Seit seinem Wechsel in die Transfusionsmedizin im Jahr 2000 arbeitet Prof. Bugert auf dem Gebiet der Thrombozyten-Immunologie und -Funktion sowie der Molekulargenetik der Blutgruppen. Im Jahr 2004 hat er an der Medizinischen Fakultät Mannheim im Fach Klinische Molekularbiologie habilitiert und lehrt seitdem die Fächer Biochemie und Molekularbiologie im Mannheimer Reformstudiengang für Medizin (MaReCuM). Seit Oktober 2007 ist er akademischer Oberrat an der Medizinischen Fakultät Mannheim und führt seit Dezember 2008 die Bezeichnung außerplanmäßiger Professor. Prof. Bugert ist Autor und Koautor von über 100 wissenschaftlichen Originalarbeiten, Übersichtsartikeln und Buchbeiträgen. Er ist Gutachter zahlreicher internationaler Fachzeitschriften und Mitherausgeber der Zeitschrift „Transfusion Medicine and Hemotherapy“. DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gemeinnützige GmbH, Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie Mannheim, FriedrichEbert-Straße 107, 68167 Mannheim, [email protected] Dr. phil. nat. Sofia Lejon Crottet ist seit 2012 stellvertretende Abteilungsleiterin des Immunhämatologielabors und des schweizerischen nationalen Referenzlabors für Immunhämatologie. Dr. Lejon Crottet arbeitet seit 2009 bei der Interregionalen Blutspende SRK AG (ehemalige Blutspendedienst SRK Bern AG). Sie war zunächst in der Forschung und Entwicklung tätig im Bereich molekulare Blutgruppendiagnostik. Wissenschaftlich beschäftigt sie sich mit der Abklärung immunhämatologischer Spezialfälle, serologisch sowie molekularbiologisch. Daneben absolviert sie die monodisziplinäre FAMH-Ausbildung in Hämatologie (Fachausbildung labormedizinische Diagnostik im Bereich Hämatologie mit Schwerpunkt Immunhämatologie). Dr. Lejon Crottet ist auch Mitglied der nationalen und der internationalen (ISBT Working Party on Immunohematology) Arbeitsgruppe für Immunhämatologie. Interregionale Blutspende SRK AG, Murtenstrasse 133, 3008 Bern, Schweiz, [email protected] Dr. med. Robert Deitenbeck Facharzt für Transfusionsmedizin mit Zusatzbezeichnung Hämostaseologie. Nach dem Studium absolvierte er seine klinische Zeit an der Chirurgischen Klinik am Kantonalen Spital Walenstadt (SG) in der Schweiz. In den Jahren 1995-1998 absolvierte er seine transfusionsmedizinische Facharztweiterbildung am Institut für Hämostaseologie und Transfusionsmedizin der Universität Düsseldorf. Seit 1998 ist er im DRK-Blutspendedienst West tätig. Hier war er zunächst bis Ende 2005 als Leiter der Abteilung Entnahme am Standort Ratingen-Breitscheid tätig, bis er Anfang 2006 die ärztliche Leitung des Zentrums für Transfusionsmedizin Hagen übernahm. Der Standort Hagen beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit der z. T. überregionalen Versorgung von Patientinnen und Patienten mit seltenen 58 erythrozytären Antigen-/Antikörperkonstellationen und betreibt für diese Zwecke eines von drei in Deutschland verbliebenen Depots mit kryokonservierten Erythrozytenkonzentraten mit seltenen Blutgruppenmerkmalen. DRK-Blutspendedienst West gemeinnützige GmbH, Zentrum für Transfusionsmedizin Hagen, Feithstraße 182, 58097 Hagen Dr. rer. nat Andrea Döscher Diplom-Studiengang Biologie, seit 1995 Mitarbeiterin des DRK- Blutspendedienst NSTOB, Institut Oldenburg. Laborleitung des Bereichs Forschung und Entwicklung seit 2005 Schwerpunkte: Sequenzierung von Blutgruppen, Thrombozytenfunktions-Untersuchungen, Untersuchungen mitochondrialer DNA, Pränatale Genotypisierungen aus Fruchtwasser und Amnionzellen, seit 1998 pränatale RHD-Genotypisierung aus dem Blut der Mutter DRK-Blutspendedienst NSTOB gemeinnützige GmbH, Institut Bremen – Oldenburg, Abteilung Forschung und Entwicklung, Brandenburger Str. 21, 26133 Oldenburg Dr. Katja Bettina Ferenz lehrt und forscht am Universitätsklinikum Essen am Institut für Physiologische Chemie unter der Leitung von Prof. Dr. Dr. Herbert de Groot. Sie studierte Pharmazie an der Philipps-Universität Marburg sowie der Université Paris-Sud. Seit 2011 leitet sie ihre eigene Arbeitsgruppe mit dem Forschungsschwerpunkt „Entwicklung künstlicher Sauerstoffträger“. Ihr Interesse gilt insbesondere den Perfluorcarbon-basierten künstlichen Sauerstoffträgern. Universitätsklinikum Essen, Institut für Physiologische Chemie Dr. med. Beat M. Frey Direktor und Chefarzt des Regionalen Blutspendedienstes SRK in Zürich (Blutspende Zürich). Nach dem Studium der Humanmedizin in Zürich absolvierte er von 1982 – 1994 die klinische Ausbildung in Innerer Medizin, Hämatologie und Onkologie in Zürich, Baden und St. Gallen. Von 1994 – 1997 ließ er sich zum Transfusionsmediziner am New York Blood Center ausbilden und gleichzeitig hatte er die Position eines Research Fellows in der hämatologischen Stammzellforschung am Sloan Kettering Cancer Center, New York inne. Ab 1998 folgte die Ausbildung in Labormedizin FAMH Hämatologie sowie oberärztliche Tätigkeit bei Blutspende Zürich. 2002 übernahm er die Betriebsleitung von Blutspende Zürich als Direktor und Chefarzt. Die hauptsächlichen Forschungsinteressen sind die molekulare Hämatologie und molekulare Immunhämatologie, Phänotyp-Genotyp-Beziehungen bei der Blutgruppendiagnostik sowie adaptive Veränderungen des Eisenstoffwechsels unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Blutspende Zürich, Rütistrasse 19, 8952 Schlieren, [email protected] PD Dr. Christoph Gassner Österreicher. Biologe. Doktorarbeit zur Phagen T1 DNAMethyltransferase in E.coli, Universität Innsbruck. Routine HLA- und nicht HLA Immungenetik (KIR, IL, TIM), 1994 – 2010, Blutspendedienst Innsbruck. Seit 2006 Erfüllung der Qualifikation als (Co)Director HLA entsprechend EFI, seit 2007 Fachimmungenetiker mit der Ermächtigung für die Weiterbildung entsprechend DGI. PostDoc zur genomischen Organisation und zum Polymor- 25 2015 phismus von KIR, 1999, Fred Hutchinson Cancer Research Center/Seattle bei Daniel E. Geraghty. PostDoc zum KIR- und ILT-Poylmorphismus, 2000, Basel Institut für Immunologie bei Marco Colonna. Blutgruppen-Genetik, seit 1995 Entwicklung und Betreuung kommerzieller Blutgruppen-Genotypisierungs-Systeme basierend auf PCR-SSP und ab 2009 zusätzlich auf MALDI-TOF Massen-Spektrometrie. Habilitation zum Thema Blutgruppen-Genotypisierung mit Focus RHD-Genetik, 2005. Seit 2010 Leiter der Abteilung Molekulare Diagnostik und F&E an Blutspende Zürich. Seit 2008 Associate Editor des Journals „Transfusion Medicine and Hemotherapy”, und seit 2012 Mitglied der ISBT working party „Blood Group Terminology”, Kurator der Blutgruppen Lutheran (LU, BCAM) und John Milton Hagen (SEMA7A). Regionale Blutspende Zürich, SRK, Abteilung für Molekulare Diagnostik und Forschung und Entwicklung (MOC), Zürich-Schlieren, Schweiz Dr. med. Christof Geisen Facharzt für Transfusionsmedizin und Laboratoriumsmedizin mit den Zusatzbezeichnungen Hämostaseologie und Notfallmedizin. Seit 2005 leitet Dr. Geisen am Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie in Frankfurt am Main die Abteilungen für Immunhämatologie und Molekulare Hämostaseologie. Seine Weiterbildung zum Hämostaseologen absolvierte er an den Universitätskliniken in Bonn, Köln und Frankfurt am Main. Wissenschaftlich beschäftigt er sich mit den molekularen Grundlagen von Gerinnungsstörungen sowie deren Therapie. Einen besonderen Schwerpunkt bildet dabei die Pharmakogenetik der oralen Antikoagulation mit Vitamin-K-Antagonisten wie Marcumar® bzw. Coumadin®. DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gemeinnützige GmbH, Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Frankfurt am Main Dr. med. Christian Halfwassen ist Facharzt für Augenheilkunde und leitet seit 2014 die Ambulanz der Abteilung für Erkrankungen des vorderen Augenabschnitts am Zentrum für Augenheilkunde des Universitätsklinikums Essen. Neben weiteren Schwerpunktthemen gibt es hier eine spezielle Sprechstunde für Patienten mit trockenen Augen, die hier sehr umfassend untersucht und beraten werden. Klinik für Erkrankungen des vorderen Augenabschnittes, Universitätsklinikum Essen (AöR) Prof. Dr. med. Reinhard Henschler Ärztlicher Leiter und Geschäftsführer des Regionalen Blutspendedienstes Graubünden SRK in Chur/Schweiz und Leiter des Medizinischen Dienstes des Regionalen Blutspendedienstes SRK in Zürich (Blutspende Zürich). Er studierte Medizin in Würzburg und Mainz und wurde an der University of Manchester auf dem Gebiet der Stammzellbiologie und -transplantation ausgebildet. Ab 1992 war er am Universitätsklinikum Freiburg als wiss. Assistent, ab 1995 als Leiter des Stammzelllabors für die GMP Herstellung hämatopoetischer Stammzellpräparate sowie die Entwicklung experimenteller Zelltherapeutika verantwortlich. Von 1999 bis 2011 leitete er die Abteilung für Produktion am DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gGmbH in Frankfurt/Main. Er habilitierte dort 2006 und etablierte seit 2008 die Stabstelle Forschung und Entwicklung. Von 2011 bis 2015 leitete er die Abteilung für Transfusionsmedizin am Klinikum der Universität München. Seine experimentelle Arbeitsgruppe befasst sich vor allem mit der ex vivoExpansion hämatopoetischer Stamm-und Vorläuferzellen sowie mit Mechanismen des Homings transplantierter Stammzellen. Brigitte Hoffmann ist Biomedizinische Fachanalytikerin für Immunhämatologie und Transfusionsmedizin und seit 1982 für den Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes als leitende MTA im Institut für Transfusionsmedizin in Augsburg tätig. Sie war von 2002 bis 2013 Mitarbeiterin der Stabsabteilung Qualitätsmanagement, die die Qualitätsmanagementprozesse für den gesamten BRK-Blutspendedienst ausführt. Seit vielen Jahren ist Frau Hoffmann sowohl organisatorisch wie auch inhaltlich als Referentin bei Seminaren und Fortbildungsveranstaltungen des BSD/BRK, dem Deutschen Institut zur Weiterbildung Technischer Assistenten (DIW-MTA) und dem deutschen MTAVerband (DVTA) maßgeblich beteiligt. Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes gemeinnützige GmbH, Institut für Transfusionsmedizin Augsburg, Westheimer Straße 80, 86156 Augsburg, [email protected] Dr. med. Christof Jungbauer ist Facharzt für Transfusionsmedizin, stellvertretender medizinischer Leiter und verantwortlich für die Labordiagnostik im Blutspendedienst für Wien, Niederösterreich und Burgenland des Österreichischen Roten Kreuzes. Neben der Aufbringung, Herstellung und Testung der Blutprodukte für den Ostösterreichischen Raum liegen die weiteren Schwerpunkte des Instituts auf der Abklärung immunhämatologischer Problemfälle, der Genotypisierung erythrozytärer Antigene und beim Betrieb eines Kryodepots für seltene Bluttypen. ÖRK Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland Manuela Krause ist Biomedizinische Fachanalytikerin für Immunhämatologie und Transfusionsmedizin und arbeitet als MTLA im immunhämatologischen Service- und Referenzlabor im Institut Augsburg des BRK-Blutspendedienstes. Außerdem ist sie Mitarbeiterin der Stabsabteilung Qualitätsmanagement, die die Qualitätsmanagementprozesse für den gesamten BRK-Blutspendedienst ausführt. Zu Ihren Schwerpunkten zählen hier die Durchführung interner Audits sowie regelmäßige Schulungen von Mitarbeitern im Gesamtunternehmen zu den Themen GMP (Gute Herstellungspraxis), Hygiene und Immunhämatologie. Zusätzlich engagiert sich Frau Krause seit vielen Jahren auch maßgeblich als Organisatorin und Referentin bei den Fortbildungsveranstaltungen des BSD/BRK sowie Seminaren des deutschen MTA-Verbandes und des Deutschen Instituts zur Weiterbildung Technischer Assistenten in der Medizin (DIW-MTA). Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes gemeinnützige GmbH, Institut für Transfusionsmedizin Augsburg, Westheimer Straße 80, 86156 Augsburg, [email protected] Christoph Metzelder Christoph Metzelder ist Mitinhaber und Gründer von Jung von Matt/sports, Vorstand seiner Stiftung und TV-Experte für Sky Deutschland. In seiner aktiven Karriere spielte der 47fache Nationalspieler und Vize-Weltmeister 2002 für Real Madrid, Schalke 04 und BvB. Mit der Christoph Metzelder Stiftung begleitet er seit 2006 Kinder und Jugendliche auf ihrem schulischen und persönlichen Lebensweg. 2014 hat Christoph Metzelder die DRK Mutspende mit initiiert. Blutspende Zürich, Rütistrasse 19, 8952 Schlieren, Tel.: 058272 5117-5127, Fax: 044731 9012, [email protected] 59 Dr. med. Angelika Reil ist Ärztin und Apothekerin. Sie leitet seit 2004 das Labor für Leukozyten- und Thrombozytenimmunologie im Zentrum für Transfusionsmedizin des DRK-Blutspendedienstes West in Hagen. Seit 2010 ist sie Stufenplanbeauftragte des DRK-Blutspendedienstes West. Davor war sie am Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin der Justus-LiebigUniversität Gießen sowie beim Blutspendedienst Bern des Schweizerischen Roten Kreuzes tätig. Ihr wissenschaftlicher Schwerpunkt ist die Granulozytenimmunologie. DRK-Blutspendedienst West gemeinnützige GmbH, Zentrum für Transfusionsmedizin Hagen, Labor für Leukozyten- und Thrombozytenimmunologie Dr. med. Uwe Sievert ist Facharzt für Transfusionsmedizin und am Institut für Transfusionsmedizin Chemnitz des DRK-Blutspendedienstes Nord-Ost, gemeinnützige GmbH tätig. Nach dem Studium der Humanmedizin an der Humboldt Universität Berlin und der Universität Leipzig begann er 1985 seine Ausbildung zum Facharzt für Transfusionsmedizin. Seit 1989 leitet er im Institut für Transfusionsmedizin in Chemnitz die Spenderabteilung, seit 2005 auch den Produktionsbereich. Er ist Leiter der Herstellung und Sachkundige Person. Im Standort Chemnitz werden neben Blut-, Plasma- und Thrombozytenspenden auch Stammzellpräparate und Eigenblutspenden entnommen. Seit 2006 werden hier spezielle Eigenblutpräparate für Patienten, die an Augenkliniken in Berlin und Sachsen behandelt werden, hergestellt. PD Dr. med. Franz Wagner ist Hauptabteillungsleiter am Institut Springe des DRKBlutspendedienstes NSTOB, verantwortlich für die Labordiagnostik am Institut Springe, einschließlich der Labordiagnostik aller Blutspenden im Bereich des DRKBlutspendedienstes NSTOB, zugleich ist er Stufenplanbeauftragter und stellvertretende sachkundige Person für das Institut Springe. Herr Dr. Wagner ist seit mehr als 15 Jahren im Fach der Transfusionsmedizin tätig, er ist derzeit Leiter der Sektion Immunhämatologie und -genetik der DGTI und wissenschaftlicher Leiter von immunhämatologischen Ringversuchen bei INSTAND. Während seiner Zeit in Ulm hat er sich intensiv mit der molekularen Grundlage der Rhesus-Blutgruppe beschäftigt und unter anderem die Ursache des „weak D“-Phänotyps und die Struktur des Rhesus-Lokus aufgeklärt. Seit 2003 beschäftigt er sich wissenschaftlich schwerpunktmäßig mit der Entwicklung von Genotypisierungsmethoden im Bereich der Blutgruppendiagnostik. DRK-Blutspendedienst NSTOB gemeinnützige GmbH, Institut Springe Dr. med. Christof Weinstock Facharzt für Transfusionsmedizin. Seit 2011 leitet er die Abteilung Blutgruppenserologie und Immunhämatologie am Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik in Ulm. DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen gemeinnützige GmbH, Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm (IKT) DRK-Blutspendedienst Nord-Ost gGmbH, Institut für Transfusionsmedizin Chemnitz, Zeisigwaldstraße 103, 09130 Chemnitz, [email protected] 60 25 2015 Leser fragen – Experten antworten! Beiträge zur Transfusionsmedizin Ihre Fragen leitet das Redaktionsteam an die Experten weiter. Veröffentlichte Anfragen werden anonymisiert. Ihre Frage: Bitte leserlich und in Druckschrift schreiben. hämotherapieAbonnement/ Adressänderung Beiträge zur Transfusionsmedizin Ich möchte die Zeitschrift „hämotherapie“ abonnieren! Bitte senden Sie zukünftig ein Exemplar kostenlos an die folgende Adresse: Name: Vorname: Straße, Hausnummer: PLZ/Ort: Telefon: Fax: Bitte leserlich und in Druckschrift schreiben. Themenvorschläge Beiträge zur Transfusionsmedizin Dieses Thema/diese Themen würde(n) mich interessieren. Bitte berichten Sie darüber!* Der Artikel hat mir sehr gut gefallen, bitte mehr zu diesem Thema! in Ausgabe Platz für Verbesserungsvorschläge! *Bitte haben Sie Verständnis, dass bei der Fülle an Rückmeldungen die geäußerten Wünsche kanalisiert werden müssen! Bitte leserlich und in Druckschrift schreiben. Meine Adresse: Nehmen Sie Kontakt mit uns auf Bitte ausreichend frankieren. Danke! Vorname: Name: Bitte leserlich und in Druckschrift schreiben. Straße, Hausnummer: PLZ/Ort: Telefon: Leser fragen – Experten antworten! Antwort DRK-Redaktionsteam Feithstr. 182 58097 Hagen Bitte streichen Sie folgende Adresse aus Ihrem Verteiler: Bitte ausreichend frankieren. Danke! Vorname: Name: Straße, Hausnummer: PLZ/Ort: Telefon: und ersetzen Sie diese durch: Vorname: hämotherapieAbonnement / Adressänderung Antwort DRK-Redaktionsteam Name: Straße, Hausnummer: PLZ/Ort: Feithstr. 182 58097 Hagen Telefon: Meine Adresse: Bitte ausreichend frankieren. Danke! Vorname: Name: Straße, Hausnummer: PLZ/Ort: Telefon: Themenvorschläge Antwort Feithstr. 182 58097 Hagen Bitte abtrennen, ausfüllen und abschicken DRK-Redaktionsteam Abo- und Redaktionsservice Die Zeitschrift Beiträge zur „hämotherapie – Transfusionsmedi- zin“ ist das Fachmagazin der DRKBlutspendedienste mit aktuellen Fachbeiträgen rund um die Themen Blut, Blutpräparate und deren Anwendung. Service-Postkarten Nutzen Sie unsere heraustrennbaren Service-Postkarten für Ihre Fragen oder Themenvorschläge an unser Experten-Team, für ein kostenloses Abo der Zeitschrift „hämotherapie“ oder für eine Änderung Ihrer Adresse, an die wir die „hämotherapie“ versenden. Die „hämotherapie“ im Internet Sie finden alle bisher erschienenen Ausgaben der „hämotherapie“ und weitere wichtige Informationen rund um die Fachzeitschrift online unter www.drk-haemotherapie.de Redaktionsservice Auf die Fragen, die sich in Ihrer all- und räumen Ihnen – je nach Bedarf Senden Sie uns Ihre Fragen mit der täglichen Arbeit ergeben, erhalten – in einer der nächsten Ausgaben der Service-Postkarte oder über unser Sie von uns eine Antwort! „hämotherapie“ ausreichend Platz für Leserservice-Formular im Internet: die Beantwortung ein. Vorab erhalten Wir legen jede Frage unseren trans- Sie persönlich eine schriftliche Ant- www.drk-haemotherapie.de/ fusionsmedizinischen Experten vor wort unserer Experten. leserservice ISSN 1612-5592 (Ausg. Baden-Württemberg, Hessen) ISSN 1612-5584 (Ausg. Bayern) ISSN 1612-5614 (Ausg. Bremen, Niedersachsen, Sachsen-Anhalt, Thüringen) ISSN 1612-5622 (Ausg. Hamburg, Schleswig-Holstein) ISSN 1612-5630 (Ausg. Mecklenburg-Vorpommern) ISSN 1612-5606 (Ausg. Nordrhein-Westfalen, Rheinland-Pfalz, Saarland) ISSN 1612-5657 (Ausg. Berlin, Brandenburg, Sachsen) Abonnieren Sie die hämotherapie als digitale Ausgabe! So verpassen Sie keine Ausgabe mehr! Und so geht´s: Einfach auf www.drk-haemotherapie.de Ihre E-Mail-Adresse für das digitale Abonnement eintragen und Sie erhalten direkt und kostenlos die neue Ausgabe der hämotherapie per E-Mail! Die hämotherapie erscheint als ebook und als PDF-Version. www.drk-haemotherapie.de Alle Ausgaben auch online als PDF & ebook
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