123 PLATZ 12: BLUT Verschiedene Liganden des Häm-Eisens beeinflussen das Absorptionsspektrum der Hämgruppe im Sichtbaren. Allgemein bekannt ist der von Auge erkennbare Farbunterschied zwischen Oxyhämoglobin im hellroten arteriellen Blut und Desoxyhämoglobin im "blauen" venösen Blut (Exp. 12.3, 12.4). Theoretische Grundlagen: Photometrie (S. 31) Kenntnisse über Mechanismus des Sauerstofftransports und Quartärstruktur von Hämoglobin Kenntnisse über Wirkungsweise elektronenübertragender Häm-Enzyme Bezug zu anderen Plätzen: Absorptionsspektren von NAD+ und NADH, Exp. 1.6; Bestimmung von Eisenkonzentration und Eisenbindungskapazität im Serum, Exp 4.3. Giftige sauerstoffhaltige Nebenprodukte aus dem Stoffwechsel: Eine Folge des aeroben Stoffwechsels ist die Bildung giftiger sauerstoffhaltiger Nebenprodukte, die durch verschiedene Mechanismen entgiftet werden müssen. Hauptsächlich sind Oxidasen, die Sauerstoff als Oxidationsmittel benützen, und elektronentransportierende Enzyme verantwortlich für die kontinuierliche Bildung von Sauerstoffradikalen und Peroxiden. Besonders viele Radikale werden nach SauerstoffUnterversorgung von Geweben bei Reperfusion nach Infarktgeschehnissen (Hirn, Herz) gebildet. So produzieren Superoxiddismutase, Aminosäureoxidase, NADH-Oxidase aus Leukozyten und andere Enzyme Wasserstoffperoxid, ein Oxidationsmittel. Hauptsächlich betroffen durch diese Oxidationsgifte sind ungesättigte Fettsäuren in Membranlipiden, die durch Lipidperoxidation (eine Radikalkettenreaktion) zerstört und zum Teil quervernetzt werden. Als Folge der Lipidperoxidation werden weitere äusserst reaktive sauerstoffhaltige Verbindungen gebildet, welche ihrerseits zu Schäden an Proteinen und an DNA führen können. Vitamin E (in Lipid-Membranen eingelagert) ist eine der wichtigsten Substanzen, welche solche Radikale unschädlich macht. Andere wichtige Antioxidantien sind Glutathion, Vitamin C, beta-Carotin sowie körpereigene heterozyklische aromatische Substanzen. Für die schnelle Beseitigung von H2O2 ist die überall vorkommende Katalase und die Glutathionperoxidase verantwortlich. Glutathionperoxidase kann nicht nur Wasserstoffperoxid sondern auch andere Peroxide abbauen. In Exp. 12.1 wird gezeigt, dass Katalase die Oxidation des Hämeisens durch Wasserstoffperoxid verhindert. In wenigen Fällen können Enzyme den oxidativen Schaden beheben. Die "Reparaturfunktion" der Methämoglobinreduktase verhindert im Erythrozyten die Anhäufung von Methämoglobin. Angeborener Mangel oder Defekt von Enzymen, welche der Abwehr gegen oxidative Schäden dienen, sind beim Mensch bekannt und können zu erheblichen Störungen führen (Exp 12.5). 124 EXPERIMENT 12.1: Katalase im Blut Prinzip: Wasserstoffperoxid oxidiert Fe2+ im Hämoglobin (rot) zu Fe3+ im Methämoglobin (braun). Katalase katalysiert die Zerlegung von H2O2 zu Wasser und Sauerstoff. Katalase hat eine sehr hohe molekulare Aktivität von 5'000'000 min-1. Natriumazid hemmt die Katalase. Lösungen: Wasserstoffperoxid (3%); Phosphatpuffer (0.1 M), pH 7.0; Natriumazid (0.1 M), giftig! Ausführung: In 3 RG (A, B, C) je 3 ml Wasser und 3 Tropfen Citrat-Blut geben (die anfängliche Trübung verschwindet innert ca. 30 sek). Zu B und C 3 Tropfen Natriumazid-Lösung geben. Nun zu den drei Proben je 1 ml Phosphatpuffer, zu A und B je 1 ml Wasserstoffperoxid und zu C 1 ml Wasser geben. Die Farbveränderung während etwa 5 min beobachten. S Das Azidanion N3- bindet an Fe3+ der prosthetischen Hämgruppen von Katalase und Cytochromoxidase. Weshalb werden dadurch die beiden Enzyme gehemmt? EXPERIMENT 12.3: Absorptionsspektrum von Oxyhämoglobin Prinzip: Das Absorptionsspektrum von Oxyhämoglobin wird ausgemessen und mit den abgebildeten Spektren von CO-Hämoglobin (HbCO), Methämoglobin (MetHb, Fe3+ im Häm) quantitativ verglichen. Lösungen: Hämoglobin in Wasser; Natriumphosphatpuffer (0.01 M), pH 6.5. Ausführung: Hämoglobinlösung (0.50 ml) zu 40 ml 0.01 M Natriumphosphatpuffer geben und mischen. Die verdünnte Oxyhämoglobinlösung in Küvette (Schichtdicke 1 cm) einfüllen. Phosphatpuffer als Vergleichslösung in andere Küvette geben. Im Spektrophotometer Extinktionen der Oxyhämoglobinlösung gegen die Vergleichslösung an den in der Tabelle aufgeführten Wellenlängen zwischen 450 nm und 630 nm bestimmen und die erhaltenen Werte in die Tabelle eintragen. Bei jeder Wellenlänge Blindwert auf E = 0.0 abgleichen. Bei 540 nm beginnen und die molare Konzentration der untersuchten Oxyhämoglobinlösung berechnen unter Verwendung des millimolaren Extinktionskoeffizienten bei 540 nm von 59 mM-1 cm-1. Damit für sämtliche Wellenlängen die fehlenden ε-Werte sogleich ausrechnen 125 und das fehlende Spektrum von Oxy-Hämoglobin aufzeichnen (siehe weiter hinten) und mit den gegebenen Spektren vergleichen. Anschliessend an gleicher Probe Exp. 12.4 ausführen. ε Wellenlänge ε Wellenlänge nm Extinktion Extinktion 450 ....... ........ 555 ....... ........ 475 ....... ........ 560 ....... ........ 500 ....... ........ 565 ....... ........ 510 ....... ........ 570 ....... ........ 520 ....... ........ 575 ....... ........ 525 ....... ........ 580 ....... ........ 530 ....... ........ 585 ....... ........ 535 ....... ........ 590 ....... ........ 540 ....... ..59.. 600 ....... ........ 545 ....... ........ 610 ....... ........ 550 ....... ........ 630 ....... ........ mM-1 cm-1 mM-1 cm-1 S Wie gross ist die Extinktion eines mit O2 beladenen Erythrozyten bei 540 nm (angenommene mittlere Dicke: 2 µm; angenommene Hämoglobin-Konzentration: 300 mg/ml)? S Wie unterscheidet sich HbCO von HbCO2? EXPERIMENT 12.4: Absorptionsspektrum von Desoxyhämoglobin Prinzip: Oxyhämoglobin kann durch Entfernung des Sauerstoffs aus der Lösung in Desoxyhämoglobin übergeführt werden. Experimentell wird dies durch Reduktion des in der Lösung vorhandenen Sauerstoffs mit Natriumhyposulfit (Na2S2O4) erreicht. Lösungen: Wie im Exp. 12.3, zusätzlich Natriumhyposulfit (Na2S2O4). 126 Ausführung: Gleiche verdünnte Hämoglobinlösung wie im Exp. 12.3 verwenden. Küvette aus dem Photometer nehmen (Korrosionsgefahr!), eine Spatelspitze Hyposulfit zur Lösung in der Küvette geben, mit dem Rührstäbchen mischen und Extinktionen gegen Phosphatpuffer als Vergleichslösung messen und in Tabelle eintragen. Auswertung: Wie Exp. 12.3. Zur Berechnung der Extinktionskoeffizienten aus den gemessenen Extinktionen soll ε = 57 mM-1 cm-1 bei 550 nm benutzt werden. Mit den erhaltenen ε-Werten das Spektrum von Desoxyhämoglobin aufzeichen (siehe hinten). ε Wellenlänge Extinktion ε Wellenlänge nm Extinktion 450 ....... ........ 555 ....... ........ 475 ....... ........ 560 ....... ........ 500 ....... ........ 565 ....... ........ 510 ....... ........ 570 ....... ........ 520 ....... ........ 575 ....... ........ 525 ....... ........ 580 ....... ........ 530 ....... ........ 585 ....... ........ 535 ....... ........ 590 ....... ........ 540 ....... ........ 600 ....... ........ 545 ....... ........ 610 ....... ........ 550 ....... ...57.. 630 ....... ........ mM-1 cm-1 mM-1 cm-1 S Weshalb gibt Oxyhämoglobin den Sauerstoff in der Peripherie ans Gewebe ab? S Welche Prozesse übernehmen im Gewebe die "Rolle des Hyposulfits"? 70 CO-Hämoglobin Methämoglobin CN-Methämoglobin 60 -1 ε * 10 [M cm ] 50 -3 -1 40 30 20 10 0 460 480 500 520 540 560 580 620 640 660 680 127 Wellenlänge [nm] 600 128 EXPERIMENT 12.5: Bestimmung von Methämoglobin im Blut Im Körper kann Methämoglobin durch Einwirkung von Oxidationsmitteln wie Wasserstoffperoxid (siehe vorne) oder aromatischen Nitro- und Aminverbindungen entstehen (verschiedene gebräuchliche Medikamente kommen dazu in Frage). In geringer Menge entsteht im Erythrozyten Methämoglobin durch den am Häm-Eisen gebundenen Sauerstoff. Die in den Erythrozyten vorhandene NADH-abhängige Methämoglobinreduktase bewirkt, dass die Methämoglobinkonzentzration im allgemeinen 2% nicht überschreitet. Ein Mangel bei der familiären Methämoglobinämie führt zu einem erhöhten Methämoglobingehalt im Blut und bei gleichzeitiger Belastung mit oxidativ wirkenden Medikamenten im Blut (siehe oben) kann dies zu einer erheblichen Beeinträchtigung der Sauerstofftransportkapazität führen. Prinzip: Methämoglobin (MetHb) hat ein charakteristisches Extinktionsmaximum bei 630 nm (siehe Spektrum vorne), welches bei der Bildung von Cyanmethämoglobin (CNMet-Hb) verschwindet (das Cyanid-Anion bindet an Fe3+ im MetHb). Die Extinktionsänderung bei 630 nm ist proportional zur MetHbKonzentration. In hämolysiertem und bereits verdünntem Patientenblut wird die Extinktion bei 630 nm vor (A1) und nach (A2) Zugabe von Kaliumcynanid (KCN) gemessen. In einem zweiten Ansatz wird zuerst sämtliches Hämoglobin durch Zugabe von Kaliumhexacyanoferrat zu MetHb oxidiert und anschliessend die Extinktion wieder vor (B1) und nach (B2) Zugabe von KCN gemessen. % MetHb = A1 - A2 B1 - B2 x 100 Reagenzien: - verdünntes Hämolysat - Kaliumhexacyanoferrat (K3Fe(CN)6) - Kaliumcyanid (KCN, wird von Assistierenden abgegeben, sehr giftig!) Ausführung: Am Photometer Blindwert (Wasser) auf E = 0.0 bei 630 nm einstellen. Zwei Küvetten A, B mit Hb-Lösung vorbereiten. Zu B einige Kristalle Kaliumhexacyanoferrat zugeben (= alles Hb zu MetHb oxidiert). Küvette mit Parafilm verschliessen, mehrmals kippen. Die Extinktionen bei 630 nm ablesen. E630 nm A1: ....... B1: ....... In beide Küvetten einiger Körnchen KCN zugeben und mischen (KCN von Assistierenden verlangen. Stark giftig!). E630 nm A2: ....... B2: ....... Probe: ......... % MetHb Aus den Messwerten den Gehalt an MetHb berechnen. S Welche Ursache kann einer ausgeprägten angeborenen Methämoglobinämie zugrunde liegen? 129 EXPERIMENT 12.6: Bestimmung von [Na+] und [K+] in Erythrozyten und Blutplasma mit dem Flammenphotometer Intra- und extrazelluläre Elektrolytkonzentrationen sind verschieden. Die Na+, K+-ATPase der Erythrozytenmembran pumpt gegen ein Konzentrationsgefälle Na+ aus der Zelle heraus und K+ in die Zelle hinein. Die ungleiche Verteilung von Na+ und K+ ist nur gewährleistet, solange die Zelle genügend ATP produziert. Von der Norm abweichende Na+- und K+-Konzentrationen im Plasma können bei verschiedenen Störungen auftreten (Krankheiten der Niere, des Verdauungstrakts, endokrine Störungen u.a.m.). Elekrolytkonzentrationen ausserhalb des relativ engen Normalbereichs können zu gefährlichen Komplikationen führen (z.B. von Seiten des Reizleitungssystems des Myokards). Die Plasmakonzentrationen von Na+ und K+ werden deshalb im klinischen Labor routinemässig bestimmt. Prinzip der Flammenphotometrie: Wird ein Gas genügend stark erhitzt, so kann ein Elektron aus einer inneren Elektronenschale in eine äussere, bei Normaltemperatur nicht besetzte Schale springen. Derart angeregte Elektronenzustände sind kurzlebig. Wenn das Elektron auf seine angestammte Schale zurückfällt, wird die freiwerdende Energie als Licht ausgestrahlt. Die Wellenlänge des ausgestrahlten Lichts charakterisiert das Element, die Intensität die Menge der angeregten Atome. Für Na+ ist 8 = 589 nm und für K+ ist 8 = 770 nm. Im Flammenphotometer wird die Lösung eines Gemisches von Metallionen in eine Flamme gesprüht. Die winzigen Tröpfchen verdampfen sofort und ein Teil der zu Atomen reduzierten Metallionen wird zur Emission von Licht angeregt. Das ausgestrahlte Licht wird mit Hilfe einer Linse konzentriert. Mit geeigneten Filtern wird das von einem einzelnen Element ausgestrahlte Licht herausgefiltert und in einer Photozelle in einen Strom umgewandelt. Der Galvanometerausschlag ist der Lichtintensität und damit der Ionenkonzentration proportional. Das Galvanometer hat eine Skala mit willkürlichen Einheiten von O bis 100. Es muss mit Lösungen bekannter Konzentration geeicht werden. Der Galvanometerausschlag ist in einem für das Gerät charakteristischen Bereich linear proportional zur Ionenkonzentration. In diesem Bereich genügen zur Eichung zwei Standardlösungen mit Konzentrationen über und unter der gesuchten Konzentration. Beispiel: Ablesung im Galvanometer: 35 = unbekannte K+-Konzentration 20 = 60 µM K+-Standard 40 = 120 µM K+-Standard Lineare Interpolation gibt 105 µM K+ für die unbekannte Lösung. Im folgenden Experiment wird Frischblut in Plasma und Blutzellen getrennt. Das Blut enthält Natriumcitrat als Gerinnungshemmer, wodurch die Natriumkonzentration um 77 mM erhöht wird und die Resultate entsprechend zu korrigieren sind. Um die optimalen Messbereiche des Flammenphotometers zu erreichen, müssen Zellen und Plasma für die Bestimmung je 30 x und 600 x verdünnt werden. 130 Lösungen: 1) Frischblut, bereits zentrifugiert und in Plasma und gepackte Zellen getrennt. 2) Standardlösungen: Na 360 = Na 180 = Na 90 = 360 µM NaCl 180 µM NaCl 90 µM NaCl K 240 = 240 µM KCl K 120 = 120 µM KCl K 60 = 60 µM KCl 3) Waschlösungen für Erythrozyten: 97.2 mM MgCl2, 2.5 mM Tris-Chlorid, pH 7.2 1. Verdünnen des Plasmas: - 0.25 ml Plasma und 7.25 ml bidestilliertes Wasser in RG pipettieren, mischen (Parafilm, Daumen) = Plasma-30 und - 0.25 ml Plasma-30 + 7.25 ml H20 = Plasma-900. 2. Verdünnen der gewaschenen Zellen: - Aus zeitlichen Gründen sind die gepackten Erythrozyten mit isotoner MgCl2-Waschlösung 3 mal gewaschen. Genau 0.25 ml der gepackten Zellen mit einer 0.5 ml Glaspipette in ein RG mit 7.25 ml H20 pipettieren. Pipette mehrmals aufsaugen und ausblasen, mischen = Zellen-30. - 0.5 ml Zellen-30 + 9.5 ml H20 = Zellen-600. Die restlichen gewaschenen Erythrozyten werden in Exp. 12.7 gebraucht! 3. Messung am Flammenphotometer: Die Messungen dürfen nicht selbständig, sondern nur im Beisein Assistierender oder Co-Assistierender ausgeführt werden! Einstellen, Justieren und Überwachen des Flammenphotometers ist Sache des Kurspersonals. Natriumfilter einrasten, mit Standard Na 180 das Galvanometer auf 40 Skalenteile einstellen. Messen in der Reihenfolge: Na 90, H2O, Na 180, H2O, Na 360, H2O, Plasma 600, H2O, Zellen 30, H2O, Detergens, H2O. Diese Reihe 3 x hintereinander durchmessen und Werte in Tabelle eintragen. Kaliumfilter einrasten, mit Standard K 120 das Galvanometer auf 40 Skalenteile einstellen. Messen in der Reihenfolge: K 60, H2O, K 120, H2O, K 240, H2O, Plasma 30, H2O, Zellen 600, H2O, Detergens, H2O. Diese Reihe 3 x hintereinander durchmessen und Werte in Tabelle eintragen. Nach dem Messen sofort wieder Wasser einsaugen. Das Gerät darf nicht länger als einige Sekunden "trocken laufen". Spülen mit Detergens ist nötig, um den Nebulisator sauber zu halten. Einmal verstopft, kann er kein Aerosol mehr erzeugen. 131 Natrium Messung Na 90 Na 180 Na 360 Plasma 900 Zellen 30 1 ...... ...... ...... .......... .......... 2 ...... ...... ...... .......... .......... 3 ...... ...... ...... .......... .......... Mittel: ...... ...... ...... .......... .......... .......... .......... mM in Plasma und Zellen* * Berechnet durch Interpolation zwischen den beiden nächstliegenden Standardwerten. Die gemessene Natriumkonzentration wird durch das bei der Blutentnahme zugegebene Natriumcitrat um 77 mM erhöht und ist entsprechend zu korrigieren. Kalium Messung K 60 K 120 K 240 Plasma 30 1 ...... ...... ...... .......... .......... 2 ...... ...... ...... .......... .......... 3 ...... ...... ...... .......... .......... Mittel: ...... ...... ...... .......... .......... ......... .......... mM in Plasma und Zellen* Zellen 600 * Berechnet durch Interpolation zwischen den beiden nächstliegenden Standardwerten. S Wie wird die Elektrolytkonzentration im Serum reguliert? S Die Na+-Konzentration im Serum dient als ungefähres Mass der Serum-Osmolarität. Weshalb? S Wie ändert die extrazelluläre K+-Konzentration, wenn das Citratblut während einigen Stunden aufbewahrt wird? S Wie gross sind die Na+/K+-Konzentrationen in der interstitiellen Flüssigkeit? 132 Die für die klinische Medizin sehr bedeutsame Na+/K+-Verteilung in die verschiedenen Körperflüssigkeitsräume soll für eine 70 kg schwere Person abgeschätzt werden. Das Gesamtkörperwasser beträgt beim Erwachsenen Mensch etwa 60% des Körpergewichtes (KG). Davon entfallen rund 2/3, also ca. 40% des KG, auf den intrazellulären Raum. Der extrazelluläre Raum setzt sich aus dem interstitiellen Raum, rund 16% des KG, und aus dem intravasalen Raum (Plasma), rund 4% des KG, zusammen. Mit den gemessenen Na+-Konzentrationen soll in der unten stehenden Tabelle der Na+-Bestand in den verschiedenen Körperkompartimenten berechnet werden. Berücksichtigen Sie, dass die Elektrolyte im interstitiellen Raum im Gleichgewicht mit den Elektrolyten im intravasalen Raum stehen. Die K+-Konzentration ist in verschiedenen Zellen des Organismus leicht verschieden. Für die Berechnung des K+-Bestandes soll deshalb die durchschnittliche intrazelluläre K+-Konzentration von 120 mM verwendet werden. Plasma interstitieller Raum intrazellulärer Raum [Ca2+], mmol/l: 2.5 1.25 1 [Mg2+], mmol/l: 1.5 0.75 13 [Eisen], mmol/l: 0.020 0.005 unterschiedlich total Volumen (liter): [Na+], mmol/l: Na+-Bestand: (mmol) [K+], mmol/l: K+-Bestand: (mmol) Da Na+ im wesentlichen auf den extrazellulär Raum beschränkt ist, Wasser dagegen die Schranken zwischen den Körperräumen passieren kann, und da der Körper immer bestrebt ist, die Iso-Osmolarität aufrecht zu erhalten, führen Störungen des Körper-Natriumbestandes immer zu einer Störung des extrazellulären Volumens (Ödem, Exsikose). Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass nur etwa ..... % des Körpergehaltes an K+ (Wert von Tabelle berechnen) im extrazellulär Raum vorhanden ist. Die Bestimmung der K+-Konzentratiom im Plasma ist deshalb ein schlechtes Mass für den gesamt Körpergehalt an K+, denn er ist abhängig von der gesamten Zell- und Muskelmasse des Körpers. Änderungen des Plasmakaliums um 1 mM bedeuten eine Veränderung des K+-Bestandes von etwa 200 mmol. Bei Plasmawerten unter 3 mM muss der Kaliummangel durch Verabreichung von 1500-2000 mmol K+ pro Änderung der Plasmakonzentration von 1 mM ersetzt werden. Solche Überlegungen sind im klinischen Alltag wichtig für die parenterale Verabreichung und den Ersatz von Flüssigkeit, Elektrolyten und Nährstoffen. S Obwohl die Elektrolyte im interstitiellen Raum im Gleichgewicht stehen mit den Elektrolyten im intravasalen Raum, ist die Konzentration von Ca2+, Mg2+ und Eisen im Plasma höher als in der interstitiellen Flüssigkeit. Erklärung? 133 EXPERIMENT 12.7: Undurchlässigkeit der Erythrozytenmembran für polare Substanzen Ionen und polare Substanzen können nicht oder sehr schlecht durch Lipidmembranen diffundieren. Transmembranale Proteine ermöglichen als "Transporter", Ionenkanäle (passiver Transport) oder als Ionenpumpen (Na+/K+-ATPase, aktiver Transport) den Transport von bestimmten Ionen und polaren Molekülen durch die Erythrozytenmembran (siehe Exp. 12.6). Im folgenden Versuch wird die Undurchlässigkeit der Erythrozytenmembran für Kaliumhexacyanoferrat (K3Fe(CN)6) demonstriert. Prinzip: Hämoglobin wird durch Kaliumhexacyanoferrat zu Methämoglobin (braun) oxidiert. Die Erythrozytenmembran ist für Kaliumhexacyanoferrat undurchlässig und Methämoglobin wird erst nach Zerstörung der Erythrozytenmembran durch Hämolyse gebildet. Ausführung: Es werden die restlichen gewaschenen und gepackten Erythrozyten von Exp. 12.6 verwendet. Drei Plastikröhrchen vorbereiten und mit folgenden Volumina beschicken (ml): A B C gepackte EC 0.2 0.2 - NaCl, 150 mM 1.8 1.8 2.0 Kaliumhexacyanoferrat + + + zu Röhrchen A, B und C eine kleine Spatelspitze Kaliumhexacyanoferrat geben. Röhrchen mit Parafilm verschliessen und mehrmals kippen (nicht schütteln!). Röhrchen A und B für 1 Minute zentrifugieren und die Farbe des Sedimentes und des Überstandes beobachten. A B C ..... ..... ..... Überstand von A und B bis auf kleinen Rest abgiessen, danach Zugabe zum Sediment: NaCl, 150 mM 2.0 - H2O - 2.0 Röhrchen A und B mit Parafilm verschliessen und nach mehrmaligem Kippen zentrifugieren. Farbe von Überstand und Sediment, wenn vorhanden, mit C vergleichen und notieren. Sediment (Ja/Nein): ..... ..... Überstand (Farbe): ..... ..... ..... S Wie kommt die Farbänderung zustande? S Welche anderen Transportsysteme, die für Erythrozyten eine wichtige Rolle spielen, kennen Sie? S Wie gelangen O2 und CO2 durch die EC-Membran?
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