Die Rolle des Interleukins 17A im allergischen Asthma
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat
vorgelegt von
Anna Graser
aus Neumarkt i.d.Opf.
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2015
Vorsitzender des Promotionsorgans
:
Prof. Dr. Jörn Wilms
Gutachter
:
Prof. Dr. Falk Nimmerjahn
Prof. Dr. Martin Herrmann
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung .................................................................................................. 10
2
Summary ................................................................................................................. 14
3
Einleitung ................................................................................................................ 17
3.1
Asthma bronchiale.................................................................................................... 17
3.1.1 Epidemiologie ...................................................................................................... 18
3.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie ........................................................................... 18
3.1.2.1
Exogen-allergisches Asthma ........................................................................ 19
3.1.2.2
Endogenes Asthma ....................................................................................... 20
3.1.2.3
Die Rolle von Rhinoviren bei Asthma bronchiale ....................................... 20
3.1.3 Asthma bronchiale bei Kindern............................................................................ 21
3.1.4 Einteilung des Asthma bronchiale nach Schweregraden ..................................... 22
3.1.5 Therapie des Asthma bronchiale .......................................................................... 23
3.2
Immunpathogenese des Asthma bronchiale ............................................................. 26
3.2.1 Polymorphkernige Granulozyten ......................................................................... 27
3.2.2 Dendritische Zellen .............................................................................................. 28
3.2.3 B-Lymphozyten .................................................................................................... 29
3.2.4 Mastzellen ............................................................................................................ 30
3.2.5 CD4+ T-Lymphozyten .......................................................................................... 31
3.2.5.1
Th1-Zellen ..................................................................................................... 33
3.2.5.2
Th2-Zellen ..................................................................................................... 34
3.2.5.3
Th9-Zellen ..................................................................................................... 36
3.2.5.4
Th17-Zellen ................................................................................................... 37
3.2.5.5
Regulatorische T-Lymphozyten ................................................................... 39
3
Inhaltsverzeichnis
3.2.5.6
Tfh-Zellen ...................................................................................................... 41
3.2.6 CD8+ T-Lymphozyten .......................................................................................... 42
3.2.7 Natürliche Killer Zellen und Natürliche Killer T-Zellen ..................................... 44
3.3
Das Zytokin IL-17A ................................................................................................. 45
3.3.1 IL-17 Rezeptoren und Signaltransduktion ........................................................... 47
3.3.2 IL-17A und Asthma bonchiale ............................................................................. 48
3.3.3 IL-17A und die virale Immunantwort .................................................................. 50
3.4
Der antivirale OAS1-RNaseL Signalweg ................................................................ 51
4
Zielsetzung .............................................................................................................. 54
5
Material und Methoden ......................................................................................... 56
5.1
Material .................................................................................................................... 56
5.1.1 Laborgeräte ........................................................................................................... 56
5.1.2 Verbrauchsmaterial .............................................................................................. 57
5.1.3 Chemikalien und Reagenzien ............................................................................... 58
5.1.4 ELISA-Kits........................................................................................................... 60
5.1.5 Antikörper und Zytokine ...................................................................................... 61
5.1.6 Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen .............................................. 61
5.1.7 Beads zur magnetischen Zellseparation ............................................................... 61
5.1.8 Oligonukleotide .................................................................................................... 62
5.1.9 Humanes Probenmaterial (PreDicta-Studie) ........................................................ 63
5.1.10 Rhinovirus 1b (RV1b) .......................................................................................... 66
5.1.11 Puffer und Lösungen ............................................................................................ 67
5.1.11.1
Zellkulturmedium für humane PBMCs .................................................... 67
5.1.11.2
Zellkulturmedium für humane A549 Zellen ............................................ 67
5.1.11.3
Puffer für die Genotypisierung von Mäusen ............................................ 67
4
Inhaltsverzeichnis
5.1.11.4
Puffer und Lösungen für die Zellisolation und Zellkultur ....................... 68
5.1.11.5
Puffer und Lösungen für ELISA .............................................................. 69
5.1.11.6
Kulturmedium für die Generierung von Mastzellen aus dem
Knochenmark ........................................................................................... 70
5.2
5.1.11.7
Tyrod´s Puffer für Histamin-Release aus Mastzellen (pH 7,4) ................ 70
5.1.11.8
Sontige Puffer und Lösungen ................................................................... 71
Methoden .................................................................................................................. 72
5.2.1 PreDicta-Studie .................................................................................................... 72
5.2.1.1
RNA Isolation aus dem Vollblut .................................................................. 74
5.2.1.2
Isolation peripherer mononukleärer Zellen aus dem Vollblut ..................... 75
5.2.1.3
Zellkultur der PBMCs .................................................................................. 76
5.2.1.4
Entnahme des Nasenabstrichs und Rhinovirusdetektion ............................. 76
5.2.2 Zellkultur mit der humanen Epithelzelllinie A549 .............................................. 77
5.2.3 Murine Studien ..................................................................................................... 77
5.2.3.1
Versuchstiere und Genotypisierung ............................................................. 77
5.2.3.2
Induktion des allergischen Asthma bronchiale ............................................ 78
5.2.3.3
Induktion der Atemwegstoleranz ................................................................. 79
5.2.3.4
Messung des Atemwegswiderstandes .......................................................... 79
5.2.3.5
Gewinnung und Analyse der Bronchoalveolären Lavage (BAL) ................ 81
5.2.3.6
Organpräperation .......................................................................................... 82
5.2.3.7
Gesamtzellisolation aus Lunge, Milz und Lymphknoten............................. 83
5.2.3.8
Isolation der CD4+ T-Zellen und CD11c+ T-Zellen ..................................... 83
5.2.3.9
Zellkultur der isolierten CD4+ und CD11c+ Lungenzellen .......................... 85
5.2.3.10
Transfektion der CD4+ T-Zellen der Milz mit Il-17a siRNA .................. 85
5.2.3.11
Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark............................... 87
5
Inhaltsverzeichnis
5.2.3.12
Histamin-Release ..................................................................................... 88
5.2.4 Infektion von Zellen mit dem Rhinovirus 1b ....................................................... 88
5.2.5 Rhinovirus PCR.................................................................................................... 88
5.2.6 RNA-Extraktion ................................................................................................... 89
5.2.7 Microarray ............................................................................................................ 90
5.2.8 cDNA-Synthese .................................................................................................... 91
5.2.9 Quantitative real-time PCR (qPCR) ..................................................................... 92
5.2.10 Durchflusszytometrie ........................................................................................... 93
5.2.10.1
Oberflächenfärbung .................................................................................. 95
5.2.10.2
Intrazelluläre Färbung .............................................................................. 95
5.2.11 Enzyme linked Immunosorbent Assay ................................................................. 96
5.2.12 Histologie ............................................................................................................. 98
5.2.13 Statistik ................................................................................................................. 99
6
Ergebnisse ............................................................................................................. 100
6.1
Analyse des Phänotyps IL-17A defizienter Mäuse in einem Modell allergischen
Asthmas .................................................................................................................. 100
6.1.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation ......... 101
6.1.2 Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der
bronchoalveolären Lavage ................................................................................. 102
6.1.3 Analyse der Mastzellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen .............. 103
6.1.4 Ermittlung des Entzündungsgrades und Mukusproduktion in der Lunge .......... 108
6.1.5 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum .................................................. 110
6.1.6 Analyse der Th2- und Th1-Zytokine in der Lunge .............................................. 111
6.1.7 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen .............. 115
6.2
Analyse des Phänotyps IL-17A defizienter Mäuse im Atemwegstoleranzmodell . 117
6
Inhaltsverzeichnis
6.2.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation im
Toleranzmodell................................................................................................... 118
6.2.2 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum .................................................. 119
6.2.3 Analyse der Th2-Zellen nach Induktion der Atemwegstoleranz ........................ 120
6.2.4 Analyse der Treg-Zellen im Toleranzmodell ....................................................... 121
6.2.5 Analyse der Tfh-Zellen im Atemwegstoleranzmodell ........................................ 124
6.3
Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A in einem murinen
Modell allergischen Asthmas ................................................................................. 127
6.3.1 Analyse der Genexpression in CD4+ T-Zellen der Lunge mittels Microarray... 128
6.3.2 Analyse der Oas1g mRNA Expression mittels qPCR ....................................... 130
6.3.3 Analyse der Ifn mRNA Expression in unterschiedlichen Zelltypen ................ 133
6.3.4 Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen ........ 134
6.3.5 Unterdrückung der Il-17a Genexpression mittels siRNA .................................. 135
6.3.6 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A nach Infektion
verschiedener Zelltypen mit dem Rhinovirus 1b ............................................... 139
6.3.6.1 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von Mastzellen mit dem
Rhinovirus 1b.................................................................................................. 140
6.3.6.2 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von CD4+ T-Zellen der
Lunge mit dem Rhinovirus 1b ........................................................................ 142
6.4
Die Rolle des Interleukins 17A im Krankheitsbild Asthma bronchiale bei
Vorschulkindern ..................................................................................................... 146
6.4.1 Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 Genexpression in PBMCs
............................................................................................................................ 147
6.4.2 Analyse der IFN und TYK2 Genexpression in PBMCs ................................... 148
6.4.3 Analyse von IL-17A-inhibierenden Faktoren .................................................... 149
7
Inhaltsverzeichnis
6.4.4 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A in der humanen
Epithelzellline A549 ........................................................................................... 151
6.4.5 Analyse der Einflussnahme von Arzneimitteln auf die antivirale Immunantwort
............................................................................................................................ 153
7
Diskussion ............................................................................................................. 155
7.1
IL-17A beeinflusst den Phänotyp bei allergischem Asthma bronchiale ................ 159
7.1.1 IL-17A beeinflusst die Entstehung der AHR ..................................................... 159
7.1.2 IL-17A fördert neutrophile Granulozyten .......................................................... 161
7.1.3 IL-17A ist ein wichtiger Faktor für die Differenzierung und das Überleben von
Mastzellen aus dem Knochenmark..................................................................... 162
7.1.4 IL-17A hat keinen Einfluss auf die bronchiale Entzündung, aber auf die
bronchiale Mukusproduktion ............................................................................. 163
7.1.5 IL-17A ist nicht direkt am Immunglobulin-Klassenwechsel beteiligt ............... 164
7.1.6 IL-17A beeinflusst Th1- und Th2-Zytokine ........................................................ 165
7.1.7 IL-17A nimmt keinen Einfluss auf Treg-Zellen im murinen Asthmamodell ...... 166
7.2
IL-17A ist an der Entstehung der Atemwegstoleranz beteiligt .............................. 167
7.2.1 Die Atemwegstoleranz beeinflusst die Entstehung der AHR und die IgE-Spiegel
negativ ................................................................................................................ 167
7.2.2 IL-17A inhibiert IL-10 und TGF- im Toleranzmodell ..................................... 169
7.2.3 IL-17A inhibiert follikuläre T-Helferzellen im Toleranzmodell ........................ 170
7.3
IL-17A ist an der antiviralen Immunantwort nach Infektionen mit Rhinoviren
beteiligt ................................................................................................................... 172
7.3.1 Beeinträchtigung antiviraler Gene in IL-17A defizienten Zellen im murinen
Modell allergischen Asthmas ............................................................................. 172
7.3.2 Rhinoviren inhibieren IL-17A in den PBMCs von Kindern mit Asthma .......... 177
8
Inhaltsverzeichnis
7.3.3 IL-17A induziert die antivirale Immunantwort in Epithelzellen ........................ 179
7.3.4 Arzneimittel beeinflussen die antivirale Immunantwort .................................... 180
8
Literaturverzeichnis ............................................................................................. 182
9
Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... 198
10
Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 201
11
Formelverzeichnis ................................................................................................ 202
12
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 203
13
Publikationen ........................................................................................................ 209
14
Danksagung........................................................................................................... 212
9
Zusammenfassung
1
Zusammenfassung
Die chronisch entzündliche Erkrankung Asthma bronchiale ist charakterisiert durch eine
Hyperreaktivität
und
reversible
Obstruktion
der
Atemwege,
Mukushypersekretion,
irreversible bronchiale Umbauprozesse und damit einhergehend wiederholt auftretende
Symptome akuter Atemnot, begleitet von Husten und pfeifenden Atemgeräuschen. Das
allergische Asthma bronchiale beruht auf einer Überempfindlichkeitsreaktion gegenüber
eigentlich harmlosen Antigenen. Dies ist die Folge einer unzureichenden immunologischen
Toleranz. Bei Asthmatikern ist v. a. das Gleichgewicht zwischen regulatorischen T-Zellen,
Th1- und Th2-Zellen zugunsten einer Th2-Immunantwort verschoben. Es hat sich aber vor
Kurzem auch gezeigt, dass Th17-Zellen und das von ihnen produzierte „Interleukin“ IL-17A
mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Daher sollte der Schwerpunkt dieser Arbeit auf
der Analyse der Rolle des Zytokins IL-17A im allergischen Asthma bronchiale liegen. Für die
Untersuchungen in einem murinen Modell allergischen Asthmas wurden Wildtyp- und
IL-17A defiziente Mäuse verwendet. Es konnte beobachtet werden, dass IL-17A defiziente
Mäuse eine verstärkte Atemwegshyperreaktivität (AHR) aufwiesen, was mit einer vermehrten
Produktion des Zytokins IL-13 einherging. Der Anteil der neutrophilen Granulozyten sowie
die Anzahl an mukusproduzierenden Zellen war im Vergleich zu asthmatischen
Wildtyp-Mäusen verringert. Weiterhin fiel auf, dass in Abwesenheit von IL-17A die
Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark und deren Fähigkeit Histamin zu
produzieren und zu speichern stark eingeschränkt war. In asthmatischen IL-17A defizienten
Mäusen wurde besonders das für Th2-Zellen typische Zytokin IL-4 vermehrt gebildet,
wohingegen der für Th1-Zellen typische Botenstoff IFN- nur vermindert freigesetzt wurde.
In einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob IL-17A an der Vermittlung der
Immuntoleranz beteiligt ist. Für diese Untersuchungen wurde in Wildtyp- und IL-17A
defizienten Mäusen eine Atemwegstoleranz induziert. Es konnte beobachtet werden, dass
10
Zusammenfassung
IL-17A defiziente Mäuse im Toleranzmodell eine deutlich geringere AHR aufwiesen, als
asthmatische IL-17A defiziente Mäuse. Sie reagierten jedoch immer noch stärker als
tolerogene Wildtyp-Mäuse. Im Toleranzmodell konnte bei IL-17A defizienten Mäusen im
Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verringerte Differenzierung von regulatorischen
CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen beobachtet werden, wohingegen Il-10 und Tgf vermehrt
exprimiert wurden. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass bei tolerogenen IL-17A
defizienten Mäusen im Vergleich zu tolerogenen Wildtyp- Mäusen die Genexpression von
Il-21, Il-21r, Il-6, Il-6r und Cxcr5 anstieg, was für eine vermehrte Differenzierung von
follikulären T-Helferzellen spricht. Diese Zellen tragen zur B-Zell-vermittelten Toleranz bei.
Weiterhin ist bereits bekannt, dass die IL-6/IL-6R-Achse regulatorische T-Zellen inhibiert,
welche eine Schlüsselfunktion bei der Vermittlung der immunologischen Toleranz
einnehmen. Daher bedarf es in diesem Modell noch weiterer Untersuchungen, um
herauszufinden, ob die suppressiven Eigenschaften der regulatorischen T-Zellen in
Abwesenheit von IL-17A unterdrückt werden.
Es ist bereits bekannt, dass Rhinoviren in Hinblick auf Aeroallergene die Induktion der
Atemwegstoleranz negativ beeinflussen. Außerdem spielen Rhinoviren bei der Pathogenese
des Asthma bronchiale eine wichtige Rolle, da sie als Auslöser der Erkältungskrankheit
häufig für Verschlimmerungen der Asthmasymptomatik verantwortlich sind. In einem
weiteren Abschnitt dieser Arbeit sollte untersucht werden, wie sich virale Infektionen auf den
Verlauf des Asthmas auswirken und welche Rolle IL-17A in diesem Zusammenhang spielt.
Mit Hilfe humaner PBMCs von gesunden und an Asthma erkrankten Kindern konnte gezeigt
werden, dass eine Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen zu einer verminderten
Freisetzung und Genexpression von IL-17A und der antiviralen 2´-5´Oligoadenylatsynthetase
1 (OAS1) innerhalb der Asthmagruppe führte. Dies ging einher mit einer vermehrten
Genexpression des Th1-typischen Transkriptionsfaktors T-BET, welcher in der Lage ist, die
11
Zusammenfassung
IL-17A Produktion zu inhibieren. Weiterhin konnte bei diesen Kindern beobachtet werden,
dass sich die Einnahme von Steroiden bei Kindern mit Asthma negativ auf die OAS1 und
IL-17A Genexpression auswirkte.
Weitere Untersuchungen im murinen Modell konnten zeigen, dass sowohl in naiven als auch
asthmatischen IL-17A defizienten Mäusen Oas1g, ein Mitglied der antiviralen OAS1-Familie,
im Lungengewebe, in den Lymphknoten, in CD4+ und CD11c+ Lungenzellen sowie in
Mastzellen aus dem Knochenmark stark vermindert exprimiert wurde. In den CD4+ und
CD11c+ Lungenzellen war gleichzeitig auch die Ifn Genexpression beeinträchtigt. Der
direkte Einfluss von IL-17A auf die Genexpression von Oas1g konnte durch den Einsatz einer
Il-17a siRNA bestätigt werden. Auch CD8+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der
Abwehr von Viren. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an CD8+ T-Zellen in naiven
IL-17A defizienten Mäusen vermindert war und somit Auswirkungen auf die virale Clearance
haben könnte.
Für weitere Untersuchungen wurden verschiedene Zelltypen in vitro mit dem Rhinovirus 1b
infiziert. Es konnte beobachtet werden, dass sowohl IL-17A defiziente Mastzellen aus dem
Knochenmark als auch naive CD4+ Lungenzellen nicht in der Lage waren, die
Virusreplikation zu unterdrücken, was mit einer stark reduzierten Oas1g mRNA Expression
einherging, während die Ifn Genexpression nicht beeinträchtigt war. Dies weist daraufhin,
dass IL-17A Oas1g in diesen Zellen induziert und dadurch die Virusreplikation unterdrückt,
während es keinen Einfluss auf Ifn hat.
Bei CD4+ T-Zellen aus der Lunge von asthmatischen Wildtyp-Mäusen nahm nach der
Infektion die IL-17A Produktion ab, wodurch sich der Rhinovirus ähnlich stark replizieren
konnte wie in IL-17A defizienten Zellen astmatischer Mäuse. Vor dem Hintergrund einer
12
Zusammenfassung
Asthmaerkrankung weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der Rhinovirus IL-17A inhibiert,
um so die antivirale Immunantwort des Wirts abzuschwächen.
Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen, dass das Zytokin IL-17A
sowohl beim Verlauf des allergischen Asthma bronchiale als auch bei der antiviralen
Immunantwort eine wichtige Rolle spielt. Weiterhin scheint dieses Zytokin auch bei der
Vermittlung der immunologischen Toleranz beteiligt zu sein.
13
Summary
2
Summary
Asthma bronchiale, a chronic inflammatory disease of the airways is characterized by airway
hyperresponsiveness (AHR), reversible airway obstruction and increased mucus production
associated with repeated episodes of acute shortness of breath, coughing and wheezing.
Allergic asthma is caused by a hypersensitivity reaction in response to an innocuous antigen.
This is the result of an insufficient immunological tolerance. In asthmatic patients there is an
imbalance among regulatory T cells, Th1- and Th2 cells towards a Th2 mediated immune
response. Recently, it has been shown that Th17 cells and their key cytokine “interleukin”
IL-17A positively correlates with the severity of the disease. The principal aim of this study
was to investigate the role of IL-17A in allergic asthma. For this purpose a murine model of
allergic asthma in wild-type and IL-17A deficient mice was analyzed. In these experiments,
asthmatic IL-17A deficient mice showed higher AHR than wild-type mice which goes along
with an increased production of IL-13 in these mice. Compared to asthmatic wild-type mice,
asthmatic IL-17A deficient mice had reduced amounts of neutrophils and mucus producing
cells in their airways. Furthermore, we noticed that the differentiation of mast cells from the
bone marrow and their ability to produce and store histamine was reduced in the absence of
IL-17A. In asthmatic IL-17A deficient mice the Th2 cytokine IL-4 was induced, whereas the
levels of IFN-, the key mediator of Th1 cells, were reduced.
Furthermore, we investigated the role of IL-17A on immunological airway tolerance. To this
aim we induced airway tolerance in wild-type and IL-17A deficient mice. Here, IL-17A
deficient mice showed decreased AHR compared to their asthmatic littermates. However, the
AHR was still increased compared to asthmatic wild-type mice. In tolerogenic IL-17A
deficient mice the number of CD4+CD25+Foxp3+ T regulatory cells was significantly
decreased compared to tolerogenic wildtype-mice, although the Il-10 and Tgf mRNA
expression was up-regulated. In addition, it could be observed that the gene expression of
14
Summary
Il-21, Il-21r, Il-6, Il-6r and Cxcr5 was induced in IL-17A deficient mice compared to
wild-type mice in the airway tolerance model. This indicates increased differentiation of
follicular T helper cells which contribute to the B cell mediated immunological tolerance.
Furthermore, the IL-6/IL-6R axis has been demonstrated to inhibit T regulatory cells which
are key players in tolerance. Further experiments are needed to prove whether the suppressive
function of the T regulatory cells in this model is inhibited in the absence of IL-17A.
It is already known that infections with Rhinovirus interfere with the induction of tolerance to
aeroallergens. The Rhinovirus plays an important role in the pathogenesis of asthma, because
it is the primary cause of common colds and could cause an exacerbation of the disease.
Therefore, one part of this thesis comprises the analysis of the impact of infections with
Rhinovirus on the pathogenesis of asthma and the role of IL-17A in this context. By the use of
human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy and asthmatic children, it
could be observed that infections of the upper airways with Rhinoviruses leads in asthmatic
children to a decreased secretion and gene expression of IL-17A and the anti-viral
2´-5´oligoadenylate synthetase 1 (OAS1). This observation goes along with an up-regulated
T-BET mRNA expression. This key Th1 transcription factor is known to inhibit IL-17A
production. In addition, by further analyzing the PBMCs of asthmatic children it could be
shown that the treatment with steroids negatively regulates the OAS1 and IL-17A gene
expression in these children. Furthermore, murine studies showed a decreased gene
expression of Oas1g, a member of the antiviral OAS1 family, in lung tissue, lymph nodes,
CD4+ and CD11c+ lung cells of naïve and asthmatic IL-17A deficient mice as well as in mast
cells generated from the bone marrow of IL-17A deficient mice. In addition, in CD4+ as well
as in CD11c+ lung cells the Ifn mRNA expression was down-regulated. By using Il-17a
siRNA, it could be confirmed that IL-17A directly affects the expression of Oas1g.
CD8+ T cells play an important role on the anti-viral immune response. Here, the number of
15
Summary
CD8+ T cells was decreased in naïve IL-17A deficient mice. This could contribute to the
reduced viral clearance observed in the absence of IL-17A.
In further experiments different cell types were infected with Rhinovirus 1b in vitro. It could
be observed that IL-17A deficient mast cells from the bone marrow as well as lung
CD4+ T cells of naïve IL-17A deficient mice were not able to clear the Rhinovirus infection.
Tallying with this, Oas1g gene expression could hardly be detected although Ifn mRNA
expression was not affected in infected cells. This indicates that IL-17A induces Oas1g in
these cells, but has no impact on Ifn. The production of IL-17A by lung CD4+ T cells of
wild-type mice was decreased after infection with Rhinovirus 1b and thus resulted in a similar
viral replication compared to cells from asthmatic IL-17A deficient mice. This indicates that
the Rhinovirus inhibits IL-17A in the context of bronchial asthma to damp the anti-viral
immune response of the host.
In summary, the results show that IL-17A plays an important role in the pathogenesis of
bronchial asthma as well as in the anti-viral immune response. Furthermore, it seems that
IL-17A is also involved in the induction of airway tolerance.
16
Einleitung
3
Einleitung
3.1 Asthma bronchiale
Der Begriff „Asthma“, vom griechischen „άσυμα“, bedeutet Atemnot und wurde erstmals
von Homer in der „Ilias“ (8. Jahrhundert v. Chr.) verwendet, wobei dieser Asthma als ein
normales Keuchen und Schnaufen der Helden im Kampf um Troja darstellte. Bis weit ins
20. Jahrhundert ging man davon aus, dass Asthma bronchiale eine Erkrankung der
Bronchialmuskulatur ist und durch neurogene Einflüsse auf die Muskulatur der Atemwege
entsteht. Die Erkenntnis, dass Asthma bronchiale auf eine anhaltende Entzündung der
Atemwege zurückzuführen ist, setzte sich erst vor etwa 20 Jahren durch (Reuter, 2004;
Mutschler et al., 2008). Nach dem aktuellen Stand der Wissenschaft definiert man Asthma
bronchiale als eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege die mit einer
Überempfindlichkeit (Hyperreaktivität) der Atemwege gegenüber unterschiedlichsten
Faktoren einhergeht (Reuter, 2004). Das Kardinalssymptom dieser Erkrankung sind
wiederholt auftretende Episoden akuter Atemnot, die v. a. nachts und in den frühen
Morgenstunden auftreten, wenn die Plasmaspiegel verschiedener Nebennierenrindenhormone
(z. B. Cortisol), deren Freisetzung einem zirkadianen Rhythmus unterliegen, am geringsten
sind (Mutschler et al., 2008; Ukena et al., 2008; Kim et al., 2010b). Zu den weiteren
Symptomen gehören einerseits Husten, pfeifende oder brummende Atemgeräusche, ein
Engegefühl im Burstkorb und Kurzatmigkeit sowie eine reversible Obstruktion der
Atemwege, eine bronchiale Hyperreaktivität und eine Entzündung der Atemwege. Die
Atemwegsobstruktion wird im Wesentlichen durch die Kontraktion der glatten Muskulatur
der Bronchien, Ödeme der Atemwegswände, übermäßige Schleimproduktion und irreversible
Umbauvorgänge verursacht (s. Abb. 3-1) (Finotto and Glimcher, 2004; Reuter, 2004; Ukena
et al., 2008).
17
Einleitung
Abb. 3-1 Querschnitt durch einen gesunden (linke Abbildung) und einen asthmatischen (rechte Abbildung) Bronchus.
Im Gegensatz zu einem gesunden Bronchus ist bei einem erkrankten Bronchus die Schleimhaut stark angeschwollen und das
Bronchialgewebe entzündet. Zusätzlich wird vermehrt Schleim produziert. (verändert nach (Freund et al., 2008))
3.1.1 Epidemiologie
Mit weltweit mehr als 300 Millionen Betroffenen und steigender Prävalenz v. a. in den
Industrienationen gehört Asthma bronchiale zu den großen Volkskrankheiten, wobei
Menschen jeder Altersstufe betroffen sein können (Reuter, 2004; Barnes, 2010). In
Deutschland sind etwa 5 % der erwachsenen und 10 % der kindlichen Bevölkerung betroffen.
Pro Jahr sterben in Deutschland mehr als 2000 Menschen an den Folgen der Erkrankung.
Neben den gesundheitlichen Einschränkungen verursacht Asthma bronchiale auch erhebliche
ökonomische Aufwendungen (Reuter, 2004; Ukena et al., 2008).
3.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie
Nach den auslösenden Ursachen, den sogenannten Triggern, unterscheidet man das
exogen-allergische (extrinsische) Asthma vom nicht-allergischen (intrinsischen) Asthma. Im
Kindesalter ist Asthma bronchiale hauptsächlich allergisch bedingt, wohingegen bei 30 - 50 %
der erwachsenen Betroffenen keine Allergie nachweisbar ist. Die beiden Formen, allergisches
und nicht-allergisches Asthma, sind selten in reiner Form ausgeprägt. In 70 - 80 % der Fälle
treten sie als Mischform auf (Mutschler et al., 2008; Ukena et al., 2008).
18
Einleitung
3.1.2.1 Exogen-allergisches Asthma
Das häufigere vorkommende exogen-allergische Asthma tritt bei genetisch prädisponierten
Personen,
den
sogenannten
(Immunglobulin E)-vermittelten
Atopikern
auf.
Es
beruht
Überempfindlichkeitsreaktion
auf
gegenüber
einer
IgE
eigentlich
harmlosen Allergenen. Diese Allergene können von unterschiedlichster chemischer Struktur
(z. B. Eiweiße, niedermolekulare Stoffe, Kohlenhydrate) und Herkunft (z. B. Tiere,
Hausstaub, Pflanzen, Schimmelpilze) sein. In der sogenannten Sensibilisierungsphase kommt
der Organismus zum ersten Mal mit dem Allergen in Kontakt und bildet daraufhin spezifische
IgE-Antikörper, welche sich auf der Oberfläche von Mastzellen, sowie eosinophilen und
basophilen Granulozyten festsetzen. Nach erneutem Allergenkontakt und Kreutzvernetzung
(cross-linking) benachbarter IgE-Antikörper kommt es zur Degranulation dieser Zellen und
somit zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren wie Histamin, Serotonin und Proteasen.
Anfangs sind an dieser Reaktion Mastzellen beteiligt, die sich an der Oberfläche der
Bronchialschleimhaut befinden. Da die freigesetzten Entzündungsmediatoren jedoch das
Bronchialepithel schädigen, werden auch Mastzellen und Entzündungszellen in tieferen
Gewebeschichten zur Degranulation und Freisetzung von Mediatoren veranlasst. Durch das
geschädigte Epithel können nun Allergene in den subepithelialen Raum gelangen, wo sie von
Makrophagen internalisiert und an spezifische T-Zellrezeptoren von CD4+ T-Lymphozyten
präsentiert werden. Auf diesem Weg differenzieren die T-Lymphozyten v. a. zu
T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2-Zellen), welche wiederum die IgE-Produktion steigern und
eosinophile und basophile Granulozyten rekrutieren und aktivieren. Dies führt dann zur
weiteren Freisetzung und Neusynthese von Mediatoren und Botenstoffen, welche die für den
Asthmaanfall typischen Symptome wie z. B. Bronchokonstriktion, Hyperkrinie und
Mukosaödeme hervorrufen. Im Laufe der Zeit und mit zunehmender Schwere der Krankheit
können neben den eigentlichen Allergenen auch unspezifische Reize die Asthmasymptome
hervorrufen (Mutschler et al., 2008; Galli and Tsai, 2012).
19
Einleitung
3.1.2.2 Endogenes Asthma
Das nicht-allergische endogene Asthma wird nicht durch spezifische Allergene sondern durch
andere Reize verursacht. Zu diesen Reizen gehören u. a. Infektionen der Atemwege,
Tabakrauch, Kaltluft, körperliche Anstrengung und Arzneimittel (z. B. Analgetikaasthma).
Man geht davon aus, dass diese nicht-allergenen Auslöser jedoch nicht ursächlich für die
Erkrankung sind. Vielmehr nimmt man an, dass eine Hyperreagibilität des Bronchialsystems
Voraussetzung für die Entwicklung des endogenen Asthmas ist (Reuter, 2004; Mutschler et
al., 2008; Ukena et al., 2008).
3.1.2.3 Die Rolle von Rhinoviren bei Asthma bronchiale
Virale Infektionen, insbesondere Rhinoviren, spielen bei Asthma-Anfällen eine wichtige
Rolle. Der weltweit vorkommende Rhinovirus ist der Auslöser von Erkältungskrankheiten.
Beim Rhinovirus handelt es sich um einen unbehüllten, relativ kleinen (Durchmesser
24 - 30 nm), lytischen RNA (Ribonukleinsäure, engl. Ribonucleic acid) Virus innerhalb der
Picornaviridae Familie. Es gibt mehr als 100 verschiedene Serotypen, die man danach
unterteilt, an welchen zellulären Rezeptor sie binden. Die rund 90 % Serotypen der
Hauptgruppe binden an das Protein ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), welches sich
z. B. auf der Oberfläche von Epithelzellen befindet. Zu dieser Gruppe gehören beispielsweise
der Rhinovirus 14 und 16. Die Rhinoviren der kleineren Gruppe von ca. 10 % binden dagegen
an Proteine der LDL (low density lipoprotein) Rezeptorengruppe. Zu diesen Serotypen zählt
u. a. der Rhinovirus 1b (Hadfield et al., 1997; Deszcz et al., 2005; Kapikian et al., 1972;
Newcomb et al., 2008).
Das durch Viren verursachte Giemen (Keuchen) ist mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit an
Asthma zu erkranken assoziiert (Le Souëf, 2009). Ob jedoch ein kausaler Zusammenhang
besteht, ist noch nicht eindeutig geklärt und wird kontrovers diskutiert (Schmidt, 2011).
20
Einleitung
Prinzipiell können Viren bei bestehendem Asthma bronchiale eine Exazerbation auslösen und
stellen die häufigste Ursache für eine Verschlimmerung der Symptome dar. So geht man
davon aus, dass bei Kindern in 80 – 85 %, bei Erwachsenen in 44 % der Fälle eine virale
Infektion eine Krankheitsverschlimmerung auslöst (Duff et al., 1993; Sterk, 1993; Tan, 2005;
Jackson, 2010; Schmidt, 2011; Newcomb et al., 2013). Ob Viren, insbesondere Rhinoviren,
die Ursache für eine Asthmaerkrankung darstellen, konnte noch nicht eindeutig nachgewiesen
werden. Gehäufte virale Infektionen der oberen Atemwege im Kindesalter scheinen mit einer
niedrigen Prävalenz von späteren Asthma bronchiale assoziiert zu sein (Illi et al., 2001).
Besonders bei Rhinovirus-bedingten Infektionen gilt jedoch, dass das gleichzeitige Auftreten
von Symptomen der unteren Atemwege (Giemen) zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit führt,
später an Asthma bronchiale zu erkranken. Bis jetzt konnte auch noch nicht eindeutig geklärt
werden, ob Viren zu einer Asthma-Prolongation beitragen (Tan et al., 2003; Jackson et al.,
2008; Gern, 2009; Kuehni et al., 2009; Thomsen et al., 2009; Schmidt, 2011).
3.1.3 Asthma bronchiale bei Kindern
Bei Kindern ist Asthma bronchiale die häufigste chronische Erkrankung überhaupt.
Deutschlandweit ist etwa jedes zehnte Kind unter 15 Jahren betroffen, wobei in 70 % der
Fälle die Krankheit vor dem 5. Lebensjahr ausbricht. Leider wird diese Erkrankung bei
Kindern oft übersehen oder erst zu spät behandelt (Kabesch, 2007; Freund et al., 2008;
Berdel, 2010; Bundesärztekammer et al., 2013). Bei etwa der Hälfte aller betroffenen
Kleinkinder verschwindet das Asthma bis zum 7. Lebensjahr oder spätestens im Laufe der
Pubertät. Bei der anderen Hälfte kommt es zur Chronifizierung mit anhaltenden Beschwerden
auch im erwachsenen Alter. Man geht davon aus, dass bei Kindern zwei Hauptfaktoren für die
Entstehung der Erkrankung verantwortlich sind, nämlich eine genetische Prädisposition sowie
das Auftreten bestimmter Umweltfaktoren. Bei Kindern und Jugendlichen stellen Allergien
21
Einleitung
den stärksten Risikofaktor dar. Kinder von Allergikern neigen besonders dazu, selbst eine
Allergie zu entwickeln. Ebenfalls in diesem Zusammenhang ist die sogenannte
„Hygiene-Hypothese“ zu erwähnen. Dieser Hypothese liegt die Beobachtung zugrunde, dass
es in den zivilisierten Ländern zu einer Art Sterilisierung der Lebensräume kommt. Dies führt
dazu, dass das Immunsystem während der Kindheit immer seltener mit bakteriellen,
parasitären und viralen Erregern in Kontakt tritt. Gemäß der Hygiene-Hypothese wirkt sich
dieser Zustand negativ auf die Entwicklung des Immunsystems aus, so dass es sich
beispielsweise gegen eigentlich harmlose Stoffe (z. B. Pollen) richtet. Die Hypothese wird
u. a. durch Beobachtungen gestützt, dass Kinder, die in einem „dreckigen“ Umfeld
aufwachsen, seltener Allergien entwickeln (Strachan, 1989; Kabesch and Lauener, 2004;
Schaub et al., 2006; Okada et al., 2010).
Bei Kindern kann häufig ein sogenannter Etagenwechsel beobachtet werden. Dies bedeutet,
dass zunächst z. B. eine Neurodermitis vorliegt, welche sich zwar im Laufe der Zeit bessert,
stattdessen aber allergische Reaktionen in den Atemwegen auftreten (Kabesch, 2007; Freund
et al., 2008). Wie in Kapitel 3.1.2.3 bereits beschrieben, scheinen auch virale Infekte zur
Pathogenese des Asthma bronchiale beizutragen. Man geht davon aus, dass gehäufte virale
Infekte in frühen Lebensjahren gesunde Kinder vor Asthma schützen, wohingegen sie sich bei
bereits erkrankten Kindern eher negativ auswirken (Illi et al., 2001; Freund et al., 2008;
Schmidt, 2011).
3.1.4 Einteilung des Asthma bronchiale nach Schweregraden
Zur Therapieüberwachung und Selbstkontrolle wird die maximale Atemstromstärke (peak
expiratory flow, PEF) mithilfe des sogenannten „Peak-Flow-Meters“ bestimmt. Eine
Verengung des Querschnitts der Atemwege bewirkt eine verminderte Luftströmung, die
mittels des Peak-Flow-Meters erfasst werden kann. Sinkende PEF-Werte können z. B. auf
22
Einleitung
einen Asthmaanfall hindeuten. Je nach Schwere der Symptome des Asthma bronchiale
können vier Stufen unterschieden werden (Tabelle 3-1). Die Einteilung nach Schweregrad ist
v. a. bei der Erstbeurteilung eines Patienten sinnvoll. Während der Therapie ist jedoch das
Ansprechen auf die Maßnahmen von größerer Bedeutung (Reuter, 2004; Mutschler et al.,
2008).
Tabelle 3-1 Schweregrad – Einteilung des stabilen Asthma bronchiale bei Erwachsenen (nach (Mutschler et al., 2008))
3.1.5 Therapie des Asthma bronchiale
Die Therapie des Asthma bronchiale richtet sich nach dem Schweregrad der Erkrankung. Das
oberste Ziel der Therapie ist in allen Fällen die Verbesserung der Lebensqualität und
Prognose durch Kontrolle der Asthmasymptome und Vermeidung akuter Exazerbationen.
Außerdem wird danach gestrebt, eine möglichst normale Lungenfunktion zu erreichen, um so
– unter Vermeidung von unerwünschten Nebenwirkungen - normale körperliche Aktivitäten
aufrechtzuerhalten. Ziel der Pharmakotherapie ist es, die asthmatische Entzündung zu
unterdrücken sowie die bronchiale Hyperreaktivität und Atemwegsobstruktion zu vermindern.
Grundsätzlich kann man die zu Therapiezwecken verwendeten Medikamente in zwei Gruppen
einteilen: Bedarfsmedikamente (sogenannte Reliever) und Dauermedikamente (sogenannte
Controller). Die Reliever dienen der raschen Bronchospasmolyse und werden bei akutem
Bedarf angewandt. Zu dieser Medikamentengruppe zählen hauptsächlich inhalative, rasch
23
Einleitung
wirksame β2-Sympathomimetika, wie z. B. Salbutamol, Fenoterol oder Terbutalin. Die für die
Langzeittherapie verwendeten Controller sollen die zugrunde liegende Entzündung
unterdrücken
und
so
die
Häufigkeit
der
Asthmaanfälle
vermindern.
Zu
dieser
Medikamentengruppe gehören inhalative Corticosteroide (ICS) wie Budesonid und
Beclometason, langwirksame β2-Sympathomimetika wie Formoterol und Salmeterol sowie
Leukotrienantagonisten (LTRA) wie z. B. Montelukast.
Die Therapie folgt einem dem Schweregrad entsprechenden Stufenplan (Abb. 3-2), wobei in
jeder Behandlungsstufe ein Reliever zur raschen Symptomverbesserung beinhaltet ist.
Abb. 3-2 Stufentherapie für die Langzeittherapie des Asthma bronchiale bei Erwachsenen: ICS: inhalative
Corticosteroide; LABA: langwirksame β2-Agonisten, LTRA: Leukotrienantagonisten; RABA: kurzwirksame β2-Agonisten
(nach den Empfehlungen der deutschen Atemwegsliga und der deutschen Gesellschaft für Pneumologie und
Beatmungsmedizin e. V.)
Eine kontinuierliche Beurteilung der Asthmakontrolle (s. Tabelle 3-2) ist von essentieller
Bedeutung, um während der Therapie das Ansprechen auf die vorgenommenen Maßnahmen
beurteilen zu können. Demzufolge richtet sich der Einsatz der Medikamente stark nach der
Kontrolle des Asthmas und führt nach deren Überprüfung entweder zu einer
24
Einleitung
Therapieintensivierung
oder
zu
einer
schrittweisen
Reduktion
der
Dosis
der
Dauermedikamente (s. Tabelle 3-2).
Tabelle 3-2 Grad der Asthmakontrolle bei Erwachsenen: # ein bis zwei Kriterien innerhalb einer Woche erfüllt,
FEV1 = Einsekundenkapazität (nach (Silverman, 2007; Zhao et al., 2012; Bundesärztekammer et al., 2013))
Beim
rein
allergischen
Asthma
bronchiale
greift
man
noch
auf
zusätzliche
Therapiemaßnahmen zurück. Zum einen sollte der auslösende Stoff gemieden werden
(Allergenkarenz), zum anderen besteht die Möglichkeit der De- bzw. Hyposensibilisierung,
(spezifische Immuntherapie, SIT), wobei der Patient mittels spezieller Impfstoffe gegen das
Allergen „unempfindlich“ gemacht wird. Diese Therapieform eignet sich z. B. bei einer
Pollen- oder Hausstaubmilbenallergie, wenn Karenzmaßnahmen und die medikamentöse
Therapie zu unzureichenden Ergebnissen führen.
Wie vorher bereits erwähnt spielt IgE bei der allergischen Reaktion eine wichtige Rolle.
Somit bieten sich monoklonale anti-IgE-Antikörper wie z. B. Omalizumab als Therapeutikum
an. Dieser anti-IgE-Antikörper richtet sich spezifisch gegen ein Epitop im konstanten Teil
(Fc-Teil) des IgE Antikörpers. Frei zirkulierende IgE-Moleküle können damit komplexiert
und so deren Bindung an den IgE-Rezeptor auf den Mastzellen verhindert werden (Holgate
and Polosa, 2008; Mutschler et al., 2008; Ukena et al., 2008; Piening et al., 2009; Andreev et
al., 2012).
25
Einleitung
3.2 Immunpathogenese des Asthma bronchiale
Die Immunpathogenese des Asthma bronchiale ist sehr komplex und vielschichtig.
Immunologische Faktoren spielen hierbei eine zentrale Rolle. Ursprünglich ging man davon
aus, dass im Wesentlichen Mastzellen an der Immunpathogenese der Erkrankung beteiligt
sind. Mittlerweile ist allerdings bekannt, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, wie
z. B. Dendritische Zellen, Lymphozyten, Makrophagen oder Granulozyten an der
asthmatischen Reaktion beteiligt sind, welche wiederum Mediatorsubstanzen freisetzen und
somit direkte Effekte auf lokale Zellen wie Muskelzellen und die Kapillarpermeabilität haben.
Entsprechend ihrer im Vordergrund stehenden Funktion während der Entzündungsreaktion
kann man die beteiligten Zelltypen grob in vier Gruppen unterteilen:

Initiierende und amplifizierende Zellen: Antigenpräsentierte Zellen (= APCs, z. B.
Makrophagen und Dendritische Zellen), T-Lymphozyten

Modulierende Zellen: B-Lymphozyten, γδ-T-Lymphozyten

Effektorzellen: Mastzellen, Granulozyten, Thrombozyten, Makrophagen

Effektorzielzellen
oder
Strukturzellen:
Epithelzellen,
glatte
Muskelzellen,
Myofibroblasten
Die Interaktion zwischen APCs und einem allergenspezifischen T-Zellklon gilt als Auslöser
für die Immunreaktion. Die Ausbreitung auf andere Zellen erfolgt daraufhin über
Amplifikationsmechanismen. In der Frühphase des allergischen Asthmas steht v. a. die
Kreuzvernetzung zwischen Antigenen mit spezifischen IgE-Antikörpern im Vordergrund. Im
weiteren Verlauf und der Manifestierung der Erkrankung dominieren dagegen neutrophile
und eosinophile Granulozyten, T-Lymphozyten, Makrophagen und Antikörper-produzierende
B-Lymphozyten (Finotto et al., 2000; Kroegel, 2002; Lloyd and Hessel, 2010).
26
Einleitung
3.2.1 Polymorphkernige Granulozyten
Polymorphkernige Granulozyten, kurz Granulozyten, besitzen einen gelappten Kern und viele
zytoplasmatische Granula. Sie werden aus Stammzellen im Knochenmark gebildet. Ihre
durchschnittliche Lebensdauer beträgt 8 - 14 Tage. Man unterscheidet neutrophile, basophile
und eosinophile Granulozyten. Sie kommen gehäuft an Entzündungsherden vor, allerdings
kaum im gesunden Gewebe. Nach Aufnahme in intrazelluläre Vesikel töten neutrophile
Granulozyten Infektionserreger mittels Sauerstoffradikalen und anderen toxischen Substanzen
ab. Besonders zu Beginn einer Entzündung nimmt ihre Zahl rasch zu. Eosinophile
Granulozyten sind ebenfalls zur Phagozytose befähigt. Ihre Anzahl im Blut unterliegt einem
deutlichen Tagesrhythmus, welcher der Steroid-Freisetzung genau entgegengesetzt ist. Sie
liegen besonders bei Asthma bronchiale in gehäufter Anzahl vor. Basophile Granulozyten,
auch Blutmastzellen genannt, enthalten Histamin, Serotonin und Heparin, sowie
proteolytische
Enzyme.
Sie
treten
v. a.
bei
Überempfindlichkeitsreaktionen
und
Hyperlipoproteinämien auf (Mutschler et al., 2008; Schütt and Bröker, 2009). Bei Asthma
bronchiale sind hauptsächlich die eosinophilen und neutrophilen Granulozyten von
Bedeutung. Die Eosinophilie stellt ein Hauptcharakteristikum bei allergischem Asthma
bronchiale dar. Th2-Zytokine, z. B. Interleukin 4 (IL-4) und IL-5, welche bei diesem
Krankheitsbild vermehrt vorliegen, sind maßgeblich für die erhöhte Anzahl an Eosinophilen
im Blut und im Gewebe verantwortlich. IL-5 gilt als spezifischer Wachstumsfaktor für
eosinophile Granulozyten und IL-4 sorgt dafür, dass sich die Zellen besser an das Endothel
anheften können. Außerdem verlängert IL-5 während einer Entzündungsreaktion ihr
Überleben (Sanderson, 1992; Wardlaw, 1999; Wardlaw et al., 2000). Eosinophile
Granulozyten spielen besonders in der Spätphase der asthmatischen Reaktion eine
entscheidende Rolle. Nach Eindringen in das entzündete Gewebe heften sie sich am
bronchialen Epithel fest und setzen u. a. zytotoxische Proteine, Zytokine (z. B. IL-1, IL-5,
IL-6, TNF-α) und Lipidmediatoren (z. B. LTC4) frei. Dies hat zur Folge, dass Epithelzellen zu
27
Einleitung
Grunde gehen und der Entzündungsprozess verstärkt wird. Außerdem kommt es zum Anstieg
der Schleimproduktion und der Gefäßdurchlässigkeit sowie zur Bronchokonstriktion
(Filipovic and Cekic, 2001). Neutrophile Granulozyten gehören mit zu den ersten
inflammatorischen Zellen, die nach Allergenexposition bzw. Verletzungen des Gewebes, v. a.
aktiviert durch IL-8, IL-1β, TNF-α und Leukotrien B4, in die Lunge einwandern (Gernez et
al., 2010). Neutrophile Granulozyten können vermehrt nach einem akuten Asthmaanfall bzw.
im persistierenden Stadium nachgewiesen werden. Dies gilt besonders für Patienten, bei
denen nur eine geringe Anzahl an eosinophilen Granulozyten nachgewiesen werden kann
bzw. wenn eine Steroidresistenz vorliegt. Man geht davon aus, dass die Anzahl der
Neutrophilen ein Marker für die Schwere der Erkrankung ist (Jatakanon et al., 1999; Green et
al., 2002; Loukides et al., 2002; Monteseirín, 2009). Neutrophile Granulozyten produzieren
u. a. das Zytokin IL-9, welches die Mukusproduktion und das Überleben von eosinophilen
Granulozyten positiv beeinflusst. Außerdem sind sie eine wichtige Quelle von TGF-β und
somit wohl auch an den Umbauprozessen des Lungengewebes während der Erkrankung
beteiligt (Foley and Hamid, 2007).
3.2.2 Dendritische Zellen
DCs (Dendritische Zellen) sind die effizientesten antigenpräsentierenden Zellen, die eine
antigenspezifische, T-Zell-vermittelte adaptive Immunantwort hervorrufen können. Sie
entstehen im Knochenmark aus hämatopoetischen oder myeloiden Vorläuferzellen und sind
sowohl in Oberflächengeweben des Körpers (z. B. Haut, Pharynx, Vagina, Anus) als auch in
großer Zahl in den inneren Schleimhäuten des respiratorischen und gastrointestinalen Systems
zu finden (Niess et al., 2005; Randolph et al., 2005; Schütt and Bröker, 2009). Unterhalb der
Epithelzellenschicht der Atemwege sind zahlreiche unreife DCs angesiedelt und bilden dort
ein dichtes Netzwerk. Diese DCs sind durch Cytoplasma-Fortsätze gekennzeichnet, welche
28
Einleitung
die über die Atemluft eindringenden Antigene mittels Mikropinozytose aufnehmen können.
Daraufhin wird das Antigen durch die DCs zu Peptiden prozessiert. Es folgt die Reifung und
Migration der DCs in die lokalen Lymphknoten. Daraufhin werden die phagozytierten
Antigene in Form von MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Klasse II/PeptidKomplexen in sehr hoher Dichte auf ihrer Zellmembran präsentiert. So kann das Antigen von
entsprechenden T-Lymphozyten mittels TCRs (T cell receptors) erkannt und gebunden
werden. Zusätzlich für die Erkennung und Aktivierung von T-Zellen werden costimulatorische Moleküle wie CD80 (B7.1) oder CD86 (B7.2) benötigt. Diese interagieren mit
CD28, welches auf der Oberfläche von T-Lymphozyten konstitutiv exprimiert wird. Bei den
geschilderten Abläufen handelt es sich um eine sogenannte Sensibilisierungsreaktion. Diese
ist Voraussetzung für das Auftreten einer allergischen Reaktion bei erneutem Allergenkontakt
(Guermonprez et al., 2002; Medoff et al., 2008; Schütt and Bröker, 2009; Kim et al., 2010b;
Andreev et al., 2012).
3.2.3 B-Lymphozyten
B-Zellen reifen beim Menschen im Knochenmark heran. Über das Blut gelangen sie u. a. in
die Milz und die Lymphknoten und siedeln sich dort bevorzugt in sogenannten Keimzentren
der Lymphfollikel an. Als immunologisch kompetente Zellen weisen sie auf ihrer Oberfläche
sogenannte BCRs (B cell receptors) auf. Dabei handelt es sich genau betrachtet um
Immunglobuline, welche über ihren Fc-Teil (c = constant) in der Membran verankert sind und
deren Antigen-bindende (Fab) -Fragmente in den Extrazellularraum weisen. Nach
Aktivierung können sie sich in Plasmazellen differenzieren, welche große Mengen von
Immunglobulinen synthetisieren und in löslicher Form sezernieren können. Zusätzlich kommt
es auch zur Ausbildung von Gedächtniszellen, welche ebenfalls im Blut zirkulieren. Sie
können bei erneuter Exposition ein Antigen noch Jahre später wiedererkennen (Mutschler et
29
Einleitung
al., 2008; Schütt and Bröker, 2009). Antikörper, kollektiv als Immunglobuline bezeichnet,
können ausschließlich von B-Lymphozyten gebildet werden und unterscheiden sich in ihren
antigenspezifischen Bindestellen. Jede B-Zelle produziert nach Aktivierung durch ein Antigen
eine einzige Antikörper-Spezies, welche eine einzigarte antigenspezifische Bindungsstelle
aufweist. Die typische Y-förmige Struktur ergibt sich aus zwei identischen schweren Ketten
(heavy chains) und zwei identischen leichten Ketten (light chains), welche über kovalente
Disulfidbrücken verbunden sind. Je nach Art der schweren Kette unterscheidet man die
Antikörper IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. Während der frühen Entwicklungsphase bilden
B-Zellen zuerst IgM. Nach Verlassen des Knochenmarks produzieren sie zusätzlich IgD,
welches neben IgM auf der Zelloberfläche membranständig co-exprimiert wird (Alberts et al.,
2002; Mutschler et al., 2008). IgE repräsentiert in Bezug auf allergische Reaktionen den
wichtigsten Antikörper. So kommt es bei der Immunabwehr im allergischen Asthma durch
spezifische Signale (z. B. IL-4) zum Klassenwechsel hin zu IgE.
3.2.4 Mastzellen
Mastzellen, auch Mastozyten genannt, gehören zu den Leukozyten und wurden von Paul
Ehrlich entdeckt (Ehrlich, 1878). Dabei handelt es sich um große Zellen der körpereigenen
Abwehr, welche mit elektronendichten Granula gefüllt sind. Diese Granula enthalten z. B.
Histamin, Bradykinin, Serotonin und Heparin. Sie entstehen aus hämatopoetischen
Stammzellen im Knochenmark, wandern jedoch noch als unreife Zellen ins Gewebe (v. a.
Haut und Schleimhäute) ein und reifen dort aus. Neben IL-3 und SCF (stem cell factor)
gehören IL-4 und IL-9 zu den Faktoren, die das Wachstum und die Entwicklung der
Mastzellen regulieren (Arinobu et al., 2009). Der hochaffine Rezeptor für IgE, FcεRI, wird
dauerhaft auf ihrer Oberfläche exprimiert. Die Aktivierung der sensibilisierten Mastzellen
erfolgt, wie vorher bereits beschrieben, über die durch ein Antigen ausgelöste
30
Einleitung
Kreuzvernetzung benachbarter FcεRI/IgE-Komplexe. Nach Aktivierung durch Allergene oder
andere Infektionserreger können sie innerhalb kürzester Zeit die gespeicherten Inhaltsstoffe
aus den Granula freisetzen. Sie gehören somit zu den Effektorzellen der allergischen Typ I
Sofortreaktion. Außerdem können sie über die Freisetzung neugebildeter Zytokine und
Chemokine, wie z. B. IL-3, IL-4, IL-5 und TNF-, weitere Zellen anlocken und so eine
Entzündung auslösen. Das bedeutet, dass Mastzellen nicht nur an der akuten Reaktion
sondern auch an der chronischen Entzündung beteiligt sein können (Brandenburg et al., 2000;
Busse and Lemanske, 2001; Mutschler et al., 2008; Schütt and Bröker, 2009). Die
Ausschüttung der jeweiligen Botenstoffe bewirkt eine Bronchokonstriktion, Vasodilatation,
erhöhte Gefäßdurchlässigkeit und vermehrte Schleimproduktion (Galli and Tsai, 2012). Somit
sind Mastzellen an der Entstehung von Allergien und Asthma bronchiale beteiligt. Zudem
scheinen Mastzellen auch bei der antiviralen Immunantwort eine Rolle zu spielen. Im
Mausmodell konnte gezeigt werden, dass die Aktvierung von Mastzellen durch synthetische
virale dsRNA (doppelstränige RNA) zur Rekrutierung von CD8+ T-Zellen zum Ort der
Entzündung führt (Orinska et al., 2005). Außerdem ergaben Untersuchungen, dass Mastzelldefiziente Mäuse, welche mit dem Dengue-Fieber infiziert wurden, aufgrund von fehlenden
NK (Natürlichen Killer)- und NKT (Natürlichen Killer T) -Zellen eine erhöhte Viruslast
aufwiesen (St John et al., 2011). Dem entgegen steht, dass Mastzellen während einer latenten
HIV (Humanes Immundefizienz Virus) Infektion möglicherweise als Reservoir für den Virus
dienen können (Sundstrom et al., 2007).
3.2.5 CD4+ T-Lymphozyten
T-Lymphozyten, auch T-Zellen genannt, bilden eine Untergruppe der Leukozyten. Zusammen
mit den B-Zellen (s. 3.2.3) stellen sie einen wichtigen Bestandteil der adaptiven
Immunantwort dar. Die Vorläuferzellen entstammen dem Knochenmark, wandern jedoch im
31
Einleitung
frühen Vorläuferstadium in den Thymus ein um dort auszureifen. Die T-Zellen lassen sich in
zwei Hauptpopulationen unterteilen: T-Helferzellen (Th) und zytotoxische T-Zellen
(cytotoxic T lymphocytes, CTL). T-Helferzellen tragen zur Optimierung der Immunantwort
bei, indem sie z. B. einerseits präsentierte Antigene erkennen und entscheiden, ob eine
Immunantwort notwendig ist, aber auch indem sie B-Zellen zur Antikörperproduktion
aktivieren oder Makrophagen unterstützen, aufgenommene Mikroorganismen abzutöten. Die
zytotoxischen T-Zellen dagegen sind darauf spezialisiert, infizierte Zellen abzutöten. Nötig
für die Erkennung von Antigenen ist ein membrangebundener T-Zell-Rezeptor. Dieser
Rezeptor ist bei jedem T-Lymphozyten-Klon für ein anderes Antigen spezifisch. Der T-ZellRezeptor besteht bei den meisten T-Zellen im Blut aus einer - und einer -Kette. Bei den
restlichen Zellen wird er aus einer - und einer -Kette gebildet. Die beiden T-ZellPopulationen lassen sich mit Hilfe von charakteristischen Differenzierungsmarker
unterscheiden. So exprimieren T-Helferzellen CD4 (cluster of differentiation 4), wohingegen
CTLs CD8 positiv sind. Die CD4+-Zellen können je nach Zytokinmillieu, Intensität der
TCR/Antigen-Bindung
und
Beschaffenheit
und
Konzentration
des
Antigens
zu
unterschiedlichen Subtypen von Effektorzellen differenzieren, deren Bedeutung bei Asthma
bronchiale im Folgenden beschrieben ist. Zu diesen Effektorzellen zählen Th1-, Th2-, Th17und Th9- Lymphozyten sowie Treg-Zellen (regulatorische T-Zellen) (s.Abb. 3-3) (Hansen,
2001; Murphy et al., 2007; Schütt and Bröker, 2009).
32
Einleitung
Abb. 3-3 Überblick über die für die Entstehung und den Verlauf des allergischen Asthmas beteiligten T-ZellPopulationen sowie der für die Differenzierung wichtigen Zytokine und Transkriptionsfaktoren. (verändert nach
(Silverman, 2007; Barnes, 2008))
3.2.5.1 Th1-Zellen
Th1-Zellen werden v. a. mit der zellvermittelten Immunantwort assoziiert. Bei der Abwehr
von intrazellulären Mikroorganismen spielen sie eine wichtige Rolle. Der stärkste Induktor
für die Differenzierung von Th1-Zellen ist IL-12. Dies wird von antigenpräsentierenden
Zellen (Makrophagen, DCs) bevorzugt nach Kontakt mit Viren und intrazellulären Bakterien
sezerniert. Funktionelle IL-12 Rezeptoren werden nur auf frisch aktivierten, jedoch noch nicht
differenzierten CD4+ T-Zellen und auf Th1-Zellen exprimiert. Das Binden von IL-12 an
seinen Rezeptor führt zur Phosphorylierung von STAT-4 (signal transducer and activator of
transcription 4). Daraufhin kommt es zur Produktion von IFN- (Interferon gamma)Dieses
Zytokin fördert ebenfalls die Entstehung von Th1-Zellen indem es zum einen die IL-12
33
Einleitung
Produktion von Makrophagen steigert und zum anderem, indem es die Expression des IL-12
Rezeptors auf CD4+-Zellen verlängert, was zum Erhalt der Sensibilität der Zellen gegenüber
IL-12 führt. Außerdem induziert IFN- die Phosphorylierung von STAT-1, was die
Transkription von T-bet (T-box expressed in T cells) einleitet. Hierbei handelt es sich um den
Haupttranskriptionsfaktor der Th1-Zellen, der wiederum die endogene Produktion von IFN-
induzieren kann. Des Weiteren ist IL-18 an der Differenzierung dieses Zelltyps beteiligt, da es
mit IL-12 kooperiert und so die IFN- Produktion durch T-, B- und NK-Zellen induziert
(Okamura et al., 1998; Dinarello, 1999; Hansen, 2001; Afkarian et al., 2002; Robinson and
Lloyd, 2002). Th1-Zytokine sind in der Lage, sowohl die Produktion von Th2- als auch
Th17-Zytokinen zu hemmen. Somit gelten Th1-Zellen als wichtige Gegenspieler zu
Th2-Zellen, welche bei Asthma bronchiale vermehrt vorliegen (s. 3.2.5.2). Studien konnten
zeigen, dass in den Atemwegen von Asthmatikern die Expression von T-bet reduziert ist. Man
schloss daraus, dass der Verlust dieses Faktors mit der Entstehung von Asthma bronchiale
einhergeht. Im Mausmodell wurde dann deutlich, dass eine T-bet Defizienz zu spontanen
Asthmasymptomen führt. Somit wird Th1-Zellen bei Asthma bronchiale ein protektiver Effekt
zugeschrieben (Hansen, 2001; Finotto et al., 2002).
3.2.5.2 Th2-Zellen
Th2-Lymphozyten sind Teil der humoralen Immunantwort und spielen v. a. bei der Abwehr
extrazellulärer Pathogene eine wichtige Rolle. Bei der Differenzierung von Th2-Zellen nimmt
IL-4 die wichtigste Rolle ein. Sobald eine gewisse Schwellenkonzentration an IL-4 erreicht
ist, wird die Differenzierung zu Th2-Zellen eingeleitet. Neben IL-4 können auch die Zytokine
IL-33 und IL-7 bzw. TSLP (thymic stromal lymphopoietin) an der Differenzierung beteiligt
sein. Charakteristisch für diesen Zelltyp ist die Sezernierung der Zytokine IL-4, IL-5 und
IL-13. Außerdem produzieren Th2-Zellen auch noch IL-9, IL-10, IL-21 und IL-25. Der
34
Einleitung
bedeutendste Transkriptionsfaktor dieser CD4+ T-Lymphozyten Subpopulation ist GATA-3
(GATA-binding protein 3). Dessen Aktivierung verläuft über den IL-4/STAT-6 Signalweg.
So wurde bereits beobachtet, dass die Expression von GATA-3 während der
Th2-Zell-Differenzierung erhöht ist. Außerdem konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass
die Suppression von GATA-3, z. B. durch antisense DNA (deoxyribonucleic acid), die
Produktion von Th2-Zytokinen unterdrückt. Neben STAT-6 und GATA-3 ist auch die
Aktivierung von STAT-5 durch IL-2 entscheidend für die Entstehung von Th2-Lymphozyten.
Charakterisiert wird dieser Zelltyp zusätzlich noch durch die Chemokinrezeptoren CCR4 und
CCR8 (Finotto et al., 2001; Hansen, 2001; Finotto and Glimcher, 2004; Schütt and Bröker,
2009; Lloyd and Hessel, 2010; Zhu, 2010). Es ist unumstritten, dass Th2-Zellen bei der
Entstehung und dem Verlauf des allergischen Asthmas eine zentrale Rolle spielen. Aus
Studien ging hervor, dass die Anzahl an Th2-Lymphozyten in der BAL (bronchoalveolären
Lavage) sowie in Lungenbiopsien von Asthmapatienten erhöht ist. Zusätzlich korreliert die
Anzahl an Th2-Zellen positiv mit dem Schweregrad der Erkrankung. Im Mausmodell konnte
nachgewiesen werden, dass Th2-Zellen für typische Asthmasymptome wie z. B. bronchiale
Hyperreagibilität, eosinophile Entzündungsprozesse, Umbauprozesse der Atemwege oder
vermehrte Mukusproduktion verantwortlich sind. Diese Symptome werden durch die
charakteristischen Th2-Zytokine vermittelt. So sind IL-4 und IL-13 an der Aktivierung von
B-Zellen beteiligt und spielen eine wichtige Rolle beim Immunglobulin Klassenwechsel von
IgE und IgG4. Zusammen mit IL-9 fördert IL-4 das Wachstum von Mastzellen und indirekt
ist IL-4 auch an der Migration von eosinophilen Granulozyten in das Gewebe beteiligt.
Außerdem ist IL-4 imstande, die Entstehung von Th1-Zellen zu unterdrücken. IL-13 ist
verantwortlich
für
die
Entstehung
der
bronchialen
Hyperreagiblität,
vermehrte
Mukusproduktion und für die Umbauprozesse in den Atemwegen, somit also für die
Schlüsselsymptome der allergischen Reaktion. Für die Eosinophilie ist IL-5 mit
verantwortlich, da es die Produktion, Reifung und Aktivierung von eosinophilen
35
Einleitung
Granulozyten fördert und außerdem deren Überlebenszeit verlängert. Im Mausmodell konnte
bereits gezeigt werden, dass die Hemmung der Th2-Zellen und deren charakteristischen
Zytokine die Symptome des Asthma bronchiale unterdrücken können. Erste klinische Studien
zeigten allerdings, dass IL-5 spezifische Antikörpern (Mepolizumab, Reslizumab) nur in der
Lage sind, die Anzahl an eosinophilen Granulozyten im Blut und im Sputum zu senken,
jedoch die Lungenfunktion nicht verbessern. Lebrikizumab, ein IL-13 spezifischer
Antikörper, konnte nachweislich eine Verbesserung der Lungenfunktion bewirken. Allerdings
wurde in Studien auch gezeigt, dass dies hauptsächlich für eine Untergruppe von Patienten
gilt, welche hohe Konzentrationen des Proteins Periostin aufweisen (Corren et al., 2011).
Daraus lässt sich schließen, dass Th2-Lymphozyten zwar eine wichtige Rolle beim
Krankheitsbild Asthma bronchiale spielen, dass aber auch andere Zelltypen wie z. B. Th1-,
Th17- und Treg Zellen von Bedeutung sind und es sich somit um ein komplexes
Zusammenspiel unterschiedlicher Zelltypen handelt. Diese Annahme wird auch dadurch
bestätigt, dass nicht alle Asthmatiker einen Th2-Zell-spezifischen Phänotyp aufweisen
(Hansen, 2001; Lloyd and Hessel, 2010; Zhu, 2010; Lloyd and Saglani, 2013).
3.2.5.3 Th9-Zellen
Eine erst vor Kurzem beschriebene Untergruppe der T-Helferzellen sind die Th9-Zellen.
Namensgebend für diesen Zelltyp ist die vorwiegende Produktion von IL-9. Es ist bereits
bekannt, dass Th9-Zellen durch IL-9 vermittelte Effekte an der Proliferation von Mastzellen
und Becherzellen sowie an der vermehrten Mukusproduktion in den Atemwegen beteiligt
sind. 2008 konnte gezeigt werden, dass IL-4 und TGF- (Transforming growth factor
beta)für die Differenzierung von Th9-Zellen nötig sind. Hierbei ist TGF-v. a. für die
Aktivierung des Transkriptionsfaktors PU.1 und die Hemmung von T-bet und GATA-3
verantwortlich. IL-4 induziert die Transkriptionsfaktoren STAT-6 und IRF4 (interferon
36
Einleitung
regulatory factor 4). Begünstigt wird die Entstehung von Th9-Lymphozyten durch IL-1, IL-25
und IL-33, wohingegen IFN-, IL-23, IL-12 und IL-18 die Differenzierung hemmen.
Außerdem wurde vor kurzem beschrieben, dass das kostimulatorische Molekül OX40
(CD134) – ein Mitglied der TNFR (tumor necrosis factor receptor) Superfamilie – ebenfalls
die Differenzierung des Zelltyps begünstigt. Man geht davon aus, dass mehrere zentrale
Transkriptionsfaktoren die Entstehung von Th9-Zellen regulieren, da sowohl die Defizienz
von PU.1, IRF-4 und STAT-6 die Entstehung von Th9-Zellen unterbindet (Ma et al., 2010;
Zhao et al., 2013). Außerdem scheint auch der Transkriptionsfaktor BATF (basic leucine
zipper transcription factor, ATF like) bei diesem Zelltyp eine wichtige Rolle zu spielen
(Jabeen et al., 2013). Obwohl Th9-Zellen auch unter optimalen Polarisierungskonditionen nur
in geringer Anzahl entstehen und dieser Zelltyp eng mit Th2 T-Lymphozyten verbunden ist,
kann man aufgrund der unterschiedlichen transkriptionellen Regulierung davon ausgehen,
dass Th9 T-Lymphozyten als eigenständige Untergruppe anzusehen sind (Zhao et al., 2013).
3.2.5.4 Th17-Zellen
Die Entdeckung der Th17-Zellen füllte einige Lücken im allgemeinen Verständnis, wie
Entzündungsprozesse ablaufen. Erst 2005 wurden sie als eigenständiger Subtyp innerhalb
der CD4+ T-Lymphozyten erkannt und wurden nach dem Zytokin IL-17A benannt, welches
sie bevorzugt produzieren (Langrish et al., 2005; Aujla and Alcorn, 2011). Die
Hauptaufgabe dieser Zellen ist die Abwehr bestimmter Pathogene, bei denen es einer
massiven Entzündungsreaktion bedarf und bei denen eine Th1- bzw. Th2-Zell-vermittelte
Immunantwort nicht ausreicht. Außerdem fand man heraus, dass Th17-Lymphozyten eine
wichtige Rolle bei der Autoimmunität spielen (Korn et al., 2009; Aujla and Alcorn, 2011).
Th17-Zellen wirken bevorzugt auf Zellen außerhalb des Immunsystems ein und fördern
Entzündungsprozesse im Gewebe, indem sie Fibroblasten, Endothelzellen oder
37
Einleitung
Epithelzellen zur Synthese proinflammatorischer Zytokine und Chemokine anregen.
Außerdem unterstützen sie die Rekrutierung und Aktivierung von Neutrophilen. Ihre
wichtigste Funktion ist allerdings, wie vorher bereits erwähnt, die Abwehr von
extrazellulären Pathogenen. Dies zeigt sich z. B. in Patienten, bei denen Defekte im
Th17-Signalweg nachgewiesen werden konnten. Diese Patientengruppe ist anfälliger für
Infektionen durch Pilze und extrazelluläre Bakterien (Puel et al., 2011). An der
Differenzierung dieser T-Lymphozyten sind TGF-, IL-6, IL-21, IL-1 und IL-23 beteiligt.
Zuerst beschrieben wurden die Effekte von TGF- und IL-6. Obwohl diese beiden
Zytokine gegenteilige Effekte bewirken, sind sie für die Entstehung von Th17-Zellen
verantwortlich. Hierbei hemmt IL-6 die Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3
(Forkhead-Box-Protein P3) und somit die Generierung regulatorischer T-Zellen. Außerdem
aktiviert IL-6 STAT-3, was zur Expression des Transkriptionsfaktors RORt (Retinoic
acid-related orphan recptor gamma t) führt. TGF- ist normalerweise für die
Differenzierung von Treg-Zellen verantwortlich. In Kombination mit IL-6 bewirkt es jedoch
die Entstehung der Th17-Lymphozyten. Es wird vermutet, dass geringe Konzentrationen
von TGF-β die Differenzierung von Th17-Zellen begünstigt, wobei hohe Konzentrationen
des Zytokins eher für die Entstehung regulatorischer T-Lymphozyten verantwortlich sind
(Bettelli et al., 2006; Aujla and Alcorn, 2011). Neben TGF-und IL-6 ist auch die
Kombination aus TGF- und IL-21 als Induktor für die Th17-Differenzierung beschrieben.
IL-23 ist erst in der späteren Phase der Differenzierung wichtig, da naive Zellen den IL-23
Rezeptor noch nicht exprimieren. IL-23 hält die Differenzierung aufrecht und verlängert
die IL-17 Produktion (Korn et al., 2009; Aujla and Alcorn, 2011). Der wichtigste
Transkriptionsfaktor dieses Zelltyps ist RORt, welcher durch STAT-3 in Abhängigkeit
von IL-6, IL-21 oder IL-23 aktiviert wird und direkt an den IL-17 Genpromoter bindet.
ROR scheint ebenfalls an der Differenzierung beteiligt zu sein, jedoch im geringeren
38
Einleitung
Maße als RORt (Yang et al., 2008b; Aujla and Alcorn, 2011). Neben RORt sind auch
BATF und IRF4 entscheidend für die Entstehung dieses Zelltyps. BATF und RORt
induzieren beide die Expression von IL-17A. IRF4, aktiviert durch IL-1, ist an der
Aktivierung von RORt beteiligt (Chung et al., 2009; Schraml et al., 2009). Die
Differenzierung kann durch Foxp3, T-bet und ETS1 (v-ets avian erythroblastosis virus E26
oncogene homolog 1) unterdrückt werden (Fujiwara et al., 2007; Moisan et al., 2007; Zhou
et al., 2008). Auch Zytokine wie IL-4, IFN- oder IL-2, die von Th1-, Th2- oder Treg-Zellen
freigesetzt werden, können die Entstehung von Th17-Zellen unterdrücken (Aujla and
Alcorn, 2011). Neben IL-17A produzieren Th17-Zellen auch IL-6, IL-17F, IL-21, IL-22,
IL-26, GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor), TNF (tumor
necrosis factor alpha) und CCL20 (Harrington et al., 2005; Dong, 2008; Korn et al., 2009).
Die Th17-Zytokine kooperieren häufig miteinander, um eine Entzündung im Gewebe
hervorzurufen. Die genaue Rolle der Th17-Zellen im allergischen Asthma ist noch nicht
vollständig geklärt. Sowohl im murinen Asthmamodell als auch im Plasma von
Asthmapatienten konnten vermehrt Th17-Zytokine nachgewiesen werden. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass IL-17A und IL-17F eine Steroidresistenz vermitteln, indem sie den
Glukokortikoidrezeptor- aktivieren, welcher die Effekte von Glukokortikoiden mindert
(Aujla and Alcorn, 2011; Vazquez-Tello et al., 2013).
.
3.2.5.5 Regulatorische T-Lymphozyten
Die Hauptaufgabe unseres Immunsystems ist es, uns vor Pathogenen und Mikroorganismen
zu schützen, indem infizierte Zellen beseitigt werden und gleichzeitig die Beschädigung des
Gewebes auf ein Minimum reduziert wird. In diesem Zusammenhang spielen regulatorische
T-Lymphozyten, kurz Treg-Zellen, eine entscheidende Rolle. Zu ihren Funktionen gehören
39
Einleitung
u. a. die Prävention von Autoimmunerkrankungen aber auch die Suppression von Allergien
und Asthma. Am entscheidendsten ist jedoch ihre Fähigkeit, Toleranz zu induzieren (Gershon
and Kondo, 1971; Gershon et al., 1972; Corthay, 2009; Andreev et al., 2012). Sakaguchi et al.
fanden heraus, dass die  Kette des IL-2 Rezeptors (CD25) ein Marker für Treg-Zellen ist
(Sakaguchi et al., 1995). Bis heute sind allerdings immer noch keine Moleküle bekannt,
welche ausschließlich auf der Oberfläche von regulatorischen T-Zellen exprimiert werden. Zu
den typischen Markern von Treg-Zellen, die allerdings auch bei anderen aktivierten T-Zellen
oder APCs vorzufinden sind, zählen CD4, CTLA-4 (CD 152, cytotocix T lymphocyteassociated antigen 4), GITR (glucocorticoid-induced tumor-necrosis factor receptor-related
protein), OX40 (CD134), L-Selektin (CD62 Ligand, CD62L), CD127, Helios und LAG3
(lymphocyte activation gene 3). Als relativ exklusiver intrazellulärer Marker gilt der
Transkriptionsfaktor Foxp3 (Cools et al., 2007; Corthay, 2009) . Dieser Transkriptionsfaktor
ist wichtig für die Entstehung und Funktionalität der CD4+CD25+ Treg-Zellen. So konnte
nachgewiesen werden, dass eine Foxp3 Defizienz sowohl im Menschen als auch in der Maus
zum Verlust von Treg-Zellen führt, was die Entstehung von Autoimmunerkrankungen fördert
(Wildin et al., 2002; Wildin and Freitas, 2005). Je nach Oberflächenmarker und produzierten
Mediatoren können zwei Treg-Populationen unterschieden werden. Zum einen findet man
CD4+CD25+Foxp3+ Zellen, welche auch als nTreg (natürliche Treg) bezeichnet werden. Diese
entstehen im Thymus und machen 5 - 10 % aller peripheren CD4+ T-Zellen aus. Die zweite
Population wird als iTreg (induzierbare Treg) bezeichnet. Zu dieser Gruppe gehören die
Foxp3+ iTreg (CD4+CD25hiFoxp3+), die IL-10-produzierenden Tr1-Zellen (regulatorische
T-Zellen vom Typ 1, CD4+CD25hiFoxp3-IL-10+) und die TGF- produzierenden Th3-Zellen
(CD4+Foxp3-TGF+) (Weiner, 2001; Roncarolo et al., 2006; Cools et al., 2007). nTreg und
iTreg benötigen eine TCR Stimulation, um ihre suppressorische Eigenschaften entfalten zu
können.
40
Einleitung
Wie genau die Treg-Zellen auf andere Zellen einwirken ist noch nicht vollständig geklärt. Man
geht davon aus, dass ein direkter Zell-Zell Kontakt über GITR und CTLA-4 (Oberfläche
Treg-Zellen) und CD80/CD86 (Oberfläche Effektor T-Zellen) benötigt wird. Außerdem
können
regulatorische
T-Zellen
andere
Zelltypen
durch
die
Freisetzung
immunsuppressorischer Zytokine wie z. B. IL-10 und TGF- hemmen (Cools et al., 2007).
Im Bezug auf Asthma bronchiale konnte gezeigt werden, dass der Transfer von
antigenspezifischen Treg-Zellen in mit Allergen sensibilisierten Mäusen zu einer Hemmung
der Th2-Zytokinproduktion und zur Unterdrückung der AHR führt. Zudem konnte
nachgewiesen werden, dass sich in der Lunge von asthmatischen Kindern weniger Treg-Zellen
befinden als in der von Kontrollkindern (Medoff et al., 2008). Da die Balance zwischen Tregund T-Effektorzellen für den Ausgang der Immunreaktion wichtig ist, zielen verschiedene
Therapieansätze auf die Erhöhung von Treg-Zellen und die Wiederherstellung ihrer Funktion
ab (Ryanna et al., 2009).
3.2.5.6 Tfh-Zellen
Für das Zustandekommen einer T-Zell-abhängigen Immunantwort sind Tfh-Zellen (follikuläre
T-Helferzellen) essentiell. Dabei handelt es sich um eine neu beschriebene Unterart der CD4+
T-Zellen. Sie sind besonders durch die Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 (CXCMotiv-Chemokinrezeptor 5)
gekennzeichnet.
Zu den weiteren
Oberflächenmarkern
follikulärer T-Helferzellen gehören u. a. IL-21R, IL-6R, ICOS (inducible T cell co-stimulator)
und OX40 (CD134) (Vinuesa et al., 2005; Nurieva et al., 2008; Kim et al., 2010a). Tfh-Zellen
tragen zur Affinitätsreifung in B-Zellen bei, unterstützen den Immunglobulin-Klassenwechsel
und sind bei der Entstehung von Plasma- und B-Gedächtniszellen in den Keimzentren
beteiligt. So tragen sich auch zur Entstehung und Regulation der B-Zell vermittelten Toleranz
bei. Dies bedeutet, dass B-Zellen auf ein bestimmtes Antigen (z. B. Autoantigene) keine
41
Einleitung
Immunantwort auslösen. Der Verlust von Tfh-Zellen führt zu einer stark beeinträchtigten
humoralen Immunantwort, welche durch eine verminderte Keimzentrumsbildung und damit
einer verringerten Anzahl an Plasmazellen und B-Gedächtniszellen gekennzeichnet ist
(Breitfeld et al., 2000; Schaerli et al., 2000; Crotty, 2011; Liu et al., 2013).
Bcl6 (B cell lymphoma 6) gilt als Haupttranskriptionsfaktor der Tfh-Zellen. Mäuse, welche
diesen Transkriptionsfaktor nicht exprimieren, können keine Tfh-Zellen bilden, wohingegen
die Differenzierung anderer T-Helferzellen unbeeinträchtigt bleibt (Yu et al., 2009). Bcl6 gilt
als transkriptionelles Repressorprotein und inhibiert so die Differenzierung in andere
T-Helferzellgruppen (Nurieva et al., 2009; Crotty, 2011). Vergleichbar zu anderen
CD4+ T-Zell Subtypen sind auch bei Tfh-Zellen mehrere Transkriptionsfaktoren an der
Kontrolle der verschiedenen Funktionen von beteiligt. So spielen neben Bcl6 auch c-maf,
STAT3, IRF4 und BATF eine wichtige Rolle (Crotty, 2011).
Es hat sich auch gezeigt, dass IL-21 in großen Mengen von Tfh-Zellen produziert wird und
nach bisherigem Kenntnisstand am effektivsten die Differenzierung von Plasmazellen fördert
(Nurieva et al., 2008; Suto et al., 2008; Crotty, 2011). Außerdem sezernieren sie IL-10 und
IL-6, wobei IL-6 auch für ihre Differenzierung benötigt wird (Liu et al., 2013).
Tfh-Zellen scheinen auch bei Asthma bronchiale eine wichtige Rolle zu spielen.
Untersuchungen ergaben, dass die Anzahl an zirkulierenden Tfh-Zellen bei Patienten mit
schwerem Asthma im Vergleich zu Kontrollpatienten erhöht war. Außerdem konnte in diesen
Patienten auch eine gesteigerte Bcl6 mRNA Expression und IL-21 Plasmakonzentration
nachgewiesen werden (Gong et al., 2014).
3.2.6 CD8+ T-Lymphozyten
CD8+ T-Lymphozyten werden durch die Interaktion zwischen dem antigenpräsentierenden
MHC-I Molekül und dem TCR aktiviert und werden in Anwesenheit von IL-2 zu CTLs
42
Einleitung
(cytotoxic T lymphocyte, Tc, zytotoxische T-Lymphozyten). Auf MHC-I Molekülen werden
hauptsächlich Peptid-Epitope von Proteinen präsentiert, welche im Zytoplasma der APCs
synthetisiert werden. Dabei handelt es sich meist um virale oder zelleigene Proteine. Somit
sind CD8+ T-Lymphozyten besonders dazu befähigt, virusinfizierte aber auch tumorale Zellen
zu erkennen und zu bekämpfen. Zu Beginn einer Infektion können CTLs ihre Anzahl schnell
expandieren, da zum einen die Aktivierung über das MHC-I Molekül relativ schnell von
statten geht und zum anderen, da sie relativ lange im Kreislauf überleben. In ihrer Funktion
sind CTLs sehr effektiv, da sie – unter Berücksichtigung harmloser, nicht infizierter Zellen mehr als eine Zielzelle zerstören können. Ihre Zytotoxizität wird entweder über die
membranständigen Moleküle Fas-Ligand (CD95-L)/Fas-Rezeptor (CD95R) oder über
Perforin/Granzym vermittelt (Schütt and Bröker, 2009; Broere et al., 2011). Die CD8+
T-Lymphozyten lassen sich, ähnlich wie die CD4+ T-Zellen, in verschieden Subtypen
unterteilen. So findet man Tc1, Tc2, Tc17 und Foxp3 exprimierende CD8+ T-regulatorische
Zellen (Croft et al., 1994; Sad et al., 1995; Carter and Murphy, 1999; Sullivan et al., 2003;
Meloni et al., 2006; Hamada et al., 2009; Yen et al., 2009). Die Rolle von CD8+ Zellen bei
Asthma bronchiale ist noch nicht vollständig geklärt. So konnten in Lungenbiopsien von
Patienten mit allergischem Asthma kleine Populationen CD8+ T-Zellen nachgewiesen
werden, die IL-4 und IL-5 produzieren. Zusätzlich fand man heraus, dass CD8+
T-Lymphozyten
aus
dem
Sputum
von
Asthmapatienten
mehr
IL-4,
IL-5
und
IFN-produzieren als dies bei gesunden Menschen der Fall ist (Ying et al., 1997; Cho et al.,
2005). Man geht davon aus, dass CD8+ T-Lymphozyten die Asthmasymptome
verschlimmern, indem sie die Effekte der CD4+ T-Zellen verstärken (Miyahara et al., 2004)
Andererseits konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass die unspezifische Aktivierung von
CD8+ Gedächtniszellen die allergische Sensibilisierung hemmt, was mit einer reduzierten
AHR und Th2-vermittelten Entzündung einhergeht (Leggat et al., 2008). Wie zu Beginn
bereits erwähnt, sind CD8+ T-Zellen bei der Abwehr virusinfizierter Zellen besonders
43
Einleitung
effektiv. Dies lässt sich v. a. auf die Sekretion von IFN- zurückführen. Befindet sich jedoch
eine große Anzahl an Th2 T-Lymphozyten in der Lunge, so wird die IFN- Produktion der
CD8+ T-Zellen zugunsten der IL-5 Produktion reduziert. Dies hat zur Folge, dass vermehrt
eosinophile Granulozyten die Lunge infiltrieren. Dies könnte eine mögliche Erklärung sein,
warum Virusinfektionen zu einer Verschlimmerung der Asthmasymptome führen. Zusätzlich
bewirkt eine verminderte Freisetzung von IFN- eine verlängerte Dauer der Virusinfektion
(Coyle et al., 1995; Corne et al., 2002).
3.2.7 Natürliche Killer Zellen und Natürliche Killer T-Zellen
NK (Natürliche Killer) -Zellen gehören zu den Lymphozyten und entstehen im Knochenmark
aus hämatopoietischen Stammzellen und sind etwas größer als B- und T-Lymphozyten. Sie
erkennen und lysieren virusinfizierte Zellen und Tumorzellen sowie Zellen, welche durch IgG
markiert wurden. Im Gegensatz zu T- und B-Zellen können sie gestresste Zellen auch ohne
das Vorhandensein von Antikörpern und MCH-Molekülen erkennen, was eine sehr rasche
Immunreaktion zur Folge hat (Schütt and Bröker, 2009; Vivier et al., 2011). In Bezug auf
allergisches Asthma bronchiale konnte gezeigt werden, dass NK-Zellen bei der Entstehung
der T-Zell vermittelten allergischen Entzündung der Atemwege beteiligt sind. So können
NK-Zellen beispielsweise durch IgE über den FcγRIII aktiviert werden, was die Produktion
von Zytokinen und Chemokinen zur Folge hat. Dies lässt darauf schließen, dass NK-Zellen an
der IgE vermittelten allergischen Immunreaktion beteiligt sind (Arase et al., 2003). Außerdem
konnte gezeigt werden, dass während einer akuten Exazerbation des Asthmas bei Kindern
eine erhöhte Anzahl an NK-Zellen im peripheren Blut vorliegt (Lin et al., 2003). Im
Gegensatz dazu ergaben andere Untersuchungen, dass NK-Zellen an der Bekämpfung der
allergischen Entzündung beteiligt sind. So steigt beispielsweise die Anzahl an aktivierten
NK-Zellen in der Lunge an, während eosinophile Granulozyten und T-Zellen nach einer
44
Einleitung
Entzündungsreaktion entfernt werden. Somit kommt es in Abwesenheit von NK-Zellen zu
einer verzögerten Beseitigung von Eosinophilen und CD4+ T-Zellen aus dem Lungengewebe
(Haworth et al., 2011).
NKT (Natürliche Killer T) -Zellen weisen sowohl Eigenschaften von NK-Zellen als auch von
T-Zellen auf. (Bendelac et al., 2007; Umetsu and Dekruyff, 2010). Nach ihrer Aktivierung
können NKT-Zellen u. a. IFN-γ und IL-4 produzieren und freisetzen, was eine Induktion von
B- und T-Zellen sowie von DCs, NK-Zellen und Makrophagen zur Folge hat und somit die
adaptive Immunantwort fördert (Umetsu and Dekruyff, 2010). Bezüglich Asthma bronchiale
konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass in Abwesenheit von NKT-Zellen eine
allergiebedingte AHR ausbleibt (Akbari et al., 2003). Dies galt auch für viral-bedingtes
Asthma (Kim et al., 2008). Humane Studien zeigten, dass eine erhöhte Anzahl an NKT-Zellen
in den Lungen von Asthmatikern vorliegt. Dies scheint allerdings abhängig von der Schwere
und dem Kontrollstatus der Erkrankung zu sein. So wiesen v. a. Patienten mit schwerem
Asthma, deren Gesundheitszustand nur mäßig überwacht wurde, vermehrt pulmonale
NKT-Zellen auf (Matangkasombut et al., 2009; Umetsu and Dekruyff, 2010). Diese Studien
weisen auf eine essentielle Rolle der NKT-Zellen im Krankheitsbild des Asthma bronchiale
hin, die jedoch noch weiterer Untersuchungen bedarf.
3.3 Das Zytokin IL-17A
IL-17A, häufig nur IL-17 genannt, ist ein aus 155 Aminosäuren bestehendes, 35 kd
(Kilodalton) schweres Polypeptid, welches als erstes Mitglied der IL-17 Familie gilt (Yao et
al., 1995a; Strzępa and Szczepanik, 2011). 1993 wurde dieses Zytokin zum ersten Mal
geklont und als CTLA8 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen 8) identifiziert (Rouvier
et al., 1993). Außerdem wurde nachgewiesen, dass IL-17A eine 58 % Sequenzhomolgie mit
45
Einleitung
dem offenen Leseraster des Herpesvirus Saimiri aufweist (Yao et al., 1995a). Im
menschlichen Genom befindet sich das Gen für IL-17A auf dem Chromosom 6p12 (Alcorn et
al., 2010). Die Aminosäuresequenzen des menschlichen und des murinen IL-17A stimmen zu
63 % überein (Alcorn et al., 2010). Die IL-17-Familie umfasst noch fünf weitere Mitglieder:
IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (= IL-25) und IL-17F (Aggarwal and Gurney, 2002;
Kawaguchi et al., 2004). IL-17E wird allerdings nicht von Th17-Zellen gebildet, sondern
gehört zu den Th2-Zytokinen (Fort et al., 2001). CD4+ T-Gedächtniszellen wurden zuerst als
IL-17A Produzenten beschrieben. Seit dieser Entdeckung hat man festgelegt, dass CD4+
T-Zellen, welche IL-17A bilden, als Th17-Zellen bezeichnet werden und einen eigenständigen
Zelltyp darstellen (Yao et al., 1995b; Harrington et al., 2005; Park et al., 2005). Die
Th17-Zell-bedingte
IL-17A
Produktion
wird
durch
verschiedenste
Zytokine
und
Transkriptionsfaktoren induziert (s. 3.2.5.4). Dem entgegen stehen Zytokine wie IL-2, IL-27,
IFN-γ oder IL-4, welche Th17-Zellen und somit auch die Expression ihrer Zytokinen
unterdrücken. Auch Foxp3 bzw. STAT-5 wirken sich negativ auf die Produktion von IL-17A
aus. Dieses Interleukin ist allerdings nicht nur das namensgebende Zytokin der Th17-Zellen,
sondern wird auch von einer Vielzahl anderer Zellen, wie z. B. γδ-T-Zellen, Tc17 Zellen,
NK-Zellen, NKT-Zellen, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten und Mastzellen
gebildet (Molet et al., 2001; Korn et al., 2009; Alcorn et al., 2010; Suurmond et al., 2011; Zhu
and Qian, 2012). IL-17A besitzt u. a. entzündungsfördernde Eigenschaften (Kolls and Lindén,
2004) und bewirkt bei einer Vielzahl unterschiedlichster Zelltypen die Expression von
Zytokinen (z. B. TNF, IL-1β, IL-6, GM-CSF, G-CSF), Chemokinen (z. B. CXCL1, CXCL8,
CXCL10) und Metalloproteinasen (Jovanovic et al., 1998; Laan et al., 1999; Park et al., 2005;
Korn et al., 2009). Außerdem gehört IL-17A zu den Schlüssel-Enzymen bei der Rekrutierung,
Aktivierung und Migration von neutrophilen Granulozyten (Aggarwal and Gurney, 2002;
Moseley et al., 2003). Dies bedeutet, dass IL-17A an der Wirtsabwehr (host defence) beteiligt
46
Einleitung
ist, da neutrophile Granulozyten gegen Pilze und einige Bakterien vorgehen (Strzępa and
Szczepanik, 2011).
3.3.1 IL-17 Rezeptoren und Signaltransduktion
Die IL-17 Rezeptoren IL-17RA – IL-17RE stellen eine eigenständige Familie dar. Dabei
binden IL-17A und IL-17F, welche sich sehr ähnlich sind, an die Rezeptoren IL-17RA und
IL-17RC (Yao et al., 1995a; Toy et al., 2006; Kuestner et al., 2007). IL-17B und mit
geringerer Affinität IL-17E leiten ihr Signal über IL-17RB weiter (Korn et al., 2009). Die
Liganden für die beiden verbleibenden Rezeptoren, IL-17RD und IL-17RE, sind derzeit noch
nicht bekannt (Korn et al., 2009). Die Mitglieder der IL-17R Familie gehören zu den Typ I
Transmembranproteinen. Sie besitzen einen konservierten strukturellen Aufbau, welcher eine
extrazelluläre Fibronektin-III ähnliche und eine zytoplasmatische SEFIR (SEF/IL-17R)
Domäne umfasst. IL-17A bindet mit hoher Affinität an den IL-17RA (Moseley et al., 2003).
Dieser Rezeptor ist in großer Zahl auf hematopoetischen Zellen und in geringerer Anzahl auf
Osteoblasten, Fibroblasten, Endothel- und Epithelzellen zu finden. Im Menschen können
IL-17RA und IL-17RC ein Heterodimer bilden, an welches sowohl IL-17A und IL-17F
binden können (Toy et al., 2006), wobei IL-17A mit höherer Affinität an den IL-17RA bindet
als IL-17F. IL-17RC weist im Menschen für beide Zytokine eine vergleichbare Affinität auf.
In der Maus dagegen scheint der IL-17RC bevorzugt Bindungen mit IL-17F einzugehen (Zhu
and Qian, 2012). Anders als die übrigen IL-17 Rezeptoren besitzt der IL-17RA noch zwei
zusätzliche Domänen: eine TILL (TIR/Toll/IL-1R) Domäne, welche direkt an die SEFIR
Domäne anschließt und eine distale Domäne im C-Terminus (CBAD = C/EPF activation
domain). Durch IL-17A initiiert, bilden IL-17RA und IL-17RC einen heterodimeren
Komplex, um so über Interaktionen mit der SEFIR Domäne Act1 (actin related gene 1) zu
rekrutieren. Daraufhin kommt es zur Verknüpfung von Act1 und TRAF6 (TNFR-associated
47
Einleitung
factor 6), um so TRAF6 dem IL-17 Rezeptorkomplex zuzuführen. Über den Act1-TRAF6Komplex werden sowohl der NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated
B-cells), als auch MAPK-AP1 und der C/EP1 (CCAAT/enhancer binding protein )
Signalwege initiiert und aktiviert. Diese Signalkaskade kann durch TRAF3 inhibiert werden
(Gaffen, 2009; Zhu and Qian, 2012) (s. Abb. 3-4).
Abb. 3-4 IL-17 Rezeptorsignalweg: CBAD = C/EBP activation domain, FN = Fibronektin Typ III ähnliche Domäne,
SEFIR = SEF/IL-17R, TILL = TIR-like loop (verändert nach (Gaffen, 2009; Zhu and Qian, 2012))
3.3.2 IL-17A und Asthma bonchiale
In Asthmapatienten konnte vermehrt IL-17A u. a. im Sputum, in der BAL oder in PBMCs
nachgewiesen werden (Bullens et al., 2006; Alcorn et al., 2010). Außerdem konnte zum einen
gezeigt werden, dass erhöhte Mengen an IL-17A positiv mit der Schwere der Erkrankung
korrelieren
und
zum
anderen
mit
einer
verstärkten
Neutrophil-vermittelten
Entzündungsreaktion und steroidresistentem Asthma einhergehen (Chakir et al., 2003;
48
Einleitung
Bullens et al., 2006; Al-Ramli et al., 2009). Zudem stellte man eine Verbindung zwischen
IL-17A und einer erhöhten AHR nach Methacholinprovokation her (Barczyk et al., 2003).
Man weiß noch nicht sicher, welche Zellen beim Asthma bronchiale für die Produktion von
IL-17A verantwortlich sind, aber man konnte im Lungengewebe von Asthmatikern eine
erhebliche Anzahl an IL-17 produzierenden CD4+ T-Zellen, möglicherweise Th17 T-Zellen,
nachweisen. Allerdings scheint dies auf Allergen-induziertes Asthma beschränkt zu sein
(Alcorn et al., 2010). Somit geht man davon aus, dass IL-17A in der Pathogenese des Asthma
bronchiale, insbesondere bei schwerem, neutrophilen Asthma, eine wichtige Rolle spielt.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass IL-17A auch bei der Expression der Muzin-Gene
MUC5AC
und
MUC5B
eine
Rolle
spielt,
was
für
eine
Beteiligung
an
der
Mukushypersekretion spricht. Es ist ebenfalls möglich, dass dieses Interleukin bei den
Umbauprozessen der Lunge involviert ist, da es die profibrotischen Moleküle IL-6 und IL-11
induziert. Darauf deutet auch die Aktivierung der MMP-9 (Metalloproteinase 9) hin, welche
in der Lage ist, Bestandteile der extrazellulären Matrix abzubauen (Molet et al., 2001; Chen et
al., 2003; Alcorn et al., 2010; Tan and Rosenthal, 2013). Studien ergaben, dass die
Neutralisation des Zytokins IL-17A mittels monoklonarer Antikörper eine reduzierte Anzahl
an neutrophilen Granulozyten in der BALF zu Folge hat (Strzępa and Szczepanik, 2011).
Die Ergebnisse, die murine Asthmamodelle lieferten, sind zum Teil sehr widersprüchlich.
Dies scheint sowohl auf die verwendeten Mausstämme, als auch auf die zu Grunde liegenden
Sensibilisierungsprotokolle zurückzuführen zu sein. Es ergab sich, dass IL-17A sowohl die
Kontraktion und Proliferation der glatten Muskulatur der Atemwege, als auch die
Permeabilität der Epithelzellen für Allergene verstärkt. Außerdem sind Mäuse in Abwesenheit
von Th17-Zellen vor AHR und Umbauprozessen geschützt (Tan and Rosenthal, 2013). IL-17A
wird aber nicht nur von Th17-Zellen, sonder u. a. auch von γδ-T-Zellen gebildet.
Untersuchungen am murinen Modell ergaben, dass IL-17A produzierende γδ-T-Zellen gegen
49
Einleitung
die allergenbedingte Entzündungsreaktion und AHR vorgehen. Weitere Experimente zeigten
aber auch, dass IL-17A, welches von γδ-T-Zellen freigesetzt wurde, antigenpräsentierende
Zellen zur Produktion von IL-23, IL-1β, IL-6 und TGF-β anregt, welche dann wiederum die
Differenzierung von pathogenen Th17-Zellen fördern (Sutton et al., 2009; Murdoch and Lloyd,
2010). Daraus lässt sich schließen, dass die jeweilige Rolle von IL-17A – pro- bzw.
anti-inflammatorisch – möglicherweise vom jeweiligen produzierenden Zelltyp abhängig ist.
3.3.3 IL-17A und die virale Immunantwort
Es ist bereits bekannt, dass IL-17A bei der Abwehr extrazellulärer Pathogene, besonders bei
Bakterien und Pilzen, eine entscheidende Rolle spielt. Aber auch bei der durch Viren
hervorgerufenen Immunantwort scheinen Th17-Zellen und IL-17A beteiligt zu sein, wobei ihre
genaue Rolle noch nicht geklärt ist (Gaffen, 2011; Martinez et al., 2012). Allgemein geht man
davon aus, dass IL-17A während einer viralen Infektion die inflammatorische Immunantwort
steigert. Dies zeigt sich z. B. darin, dass IL-17RA defiziente Mäuse nach einer Infektion mit
dem Influenza-Virus weniger pro-inflammatorische Zyokine bilden. Dies hat möglicherweise
zur Folge, dass sich Pathogene aufgrund einer ineffizienten Entzündungsreaktion ungehindert
ausbreiten können. Man geht auch davon aus, dass die jeweilige Rolle dieses Zytokins vom
immunologischen Hintergrund des Wirts und vom jeweiligen Virus abhängt. (Gaffen, 2011;
Ryzhakov et al., 2011) Bei einer primären Infektion mit dem Respiratorischen
Synzytial-Virus (RSV) kommt es sowohl im Menschen als auch in der Maus zu einem
Anstieg des IL-17A Proteins. Murine Studien einer primären RSV Infektion zeigten auch,
dass es zu einer durch IL-17A induzierten Mukushypersekretion sowie zu einer negativen
Beeinflussung zytotoxischer CD8+ Zellen und einer verminderten viralen Clearence kommt
(Mukherjee et al., 2011; Martinez et al., 2012). Andererseits konnte im murinen
Asthmamodell gezeigt werden, dass IL-17A die durch den Respiratorischen Synzytial-Virus
50
Einleitung
verursachte AHR und Entzündungsreaktion in asthmatischen Mäusen unterdrückt. Diese
Demonstration erfolgte in IL-17A defizienten Mäusen, welche zunächst mit OVA und
anschließend mit RSV behandelt wurden. In diesem Modell wurden eine erhöhte AHR, sowie
eine gesteigerte Konzentrationen an IL-13 und eosinophilen Granulozyten nachgewiesen.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine RSV Infektion während einer bereits
bestehenden allergischen Entzündungsreaktion der Atemwege zu erhöhten IL-17A
Konzentrationen, aber zur Reduktion von antiviralen Typ I Interferonen und IFN-führte
(Newcomb et al., 2013). Insgesamt gesehen bedarf es aber noch eingehender Untersuchungen,
um die Rolle des Interleukins 17A bei der (anti-) viralen Immunantwort besser zu verstehen.
3.4 Der antivirale OAS1-RNaseL Signalweg
Die Interferone wurden vor mehr 50 Jahren im Zusammenhang mit der Abwehr von
Influenzaviren entdeckt (Isaacs and Lindemann, 1957) Mittlerweile sind die Zytokine der IFN
Familie als wichtige Bestandteile der antiviralen Immunantwort anerkannt. So werden sie
z. B. in der Therapie bei Infektionen mit dem Hepatitis C Virus eingesetzt (Borden et al.,
2007; Sadler and Williams, 2008). Je nach ihrem spezifischen Rezeptor unterscheidet man
Typ I - III Interferone. Zu den Typ I IFN zählen IFN, IFN, IFNκ, IFNε, IFNο, IFNτ und
IFNδ. Sie binden an den IFNAR (IFN alpha Rezeptor), ein Heterodimer aus IFNAR1 und
IFNAR2. Typ I Interferone sind für ihre essentielle Rolle bei der Abwehr viraler Erreger
bekannt. Zu den Typ II Interferonen zählt IFN-welches an den IFN- Rezeptorkomplex
(IFNGR), bestehend aus IFNGR1 und IFNGR2, bindet. Dieses Zytokin bekämpft vor allem
nicht-virale Erreger. IFNλ zählt zu der dritten Gruppe. Diese Gruppe interagiert mit einem
Rezeptorkomplex, bestehend aus IL-10R2 und IFNLR1 (IFN lambda Rezeptor 1). Auch bei
diesen Zytokinen geht man von antiviralen Eigenschaften aus (Borden et al., 2007; Sadler and
Williams, 2008).
51
Einleitung
Für die Aktivierung des antiviralen OAS1-RNaseL Signalweges sind die Zytokine der Typ I
und Typ III Gruppe von Bedeutung. Nachdem die Typ I bzw. Typ III Interferone an ihren
jeweiligen Rezeptor gebunden haben, wird die weitere Signaltransduktion über die JAK1
(Januskinase 1) und TYK2 (Tyrosinkinase 2) eingeleitet, was zur Phosphorylierung des
IFNAR1 und anschließend zur Rekrutierung und Phosphorylierung von STAT1 und STAT2
führt. Die phosphorylierten STAT Heterodimere gehen mit IRF9 eine Bindung ein und bilden
so ISGF3 (IFN-stimulated gene factor 3). Dieser Komplex transloziert in den Zellkern, um
dort ISREs (IFN-stimulated response elements) zu induzieren. Daraufhin kommt es zur
Transkription der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase OAS1 (s. Abb. 3-6). Im Zellzytoplasma
akkumuliert OAS1 als inaktives Monomer. Nach Binden viraler dsRNA kommt es zur
Oligomerisierung des Enzyms und somit zur Bildung eines katalytisch-aktiven Tetramers.
Dieses wiederum erzeugt aus ATP (Adenosin-Triphosphat) Molekülen ein 2´-5´-Polyadenylat
(2-5 A). Dieses Polyadenylat bindet an die inaktive RNaseL (latente Ribonuclease), welche
als Monomer vorliegt und löst somit eine Dimerisierung aus. Die aktivierte RNaseL ist nun in
der Lage, virale RNA zu degradieren. Sie unterscheidet jedoch nicht zwischen viraler und
zellulärer RNA, wodurch auch zelluläre Prozesse zum Erliegen kommen. Die Aktivität dieses
Enzyms ist daher durch eine geringe Halbwertszeit reguliert (s. Abb. 3-5) (Hovanessian et al.,
1988; Silverman, 2007; Sadler and Williams, 2008; Zhao et al., 2012; Hornung et al., 2014).
52
Einleitung
Abb. 3-6 Interferon-Rezeptor Signalweg (verändert nach (Sadler and Williams, 2008; Hornung et al.,
2014)
Abb. 3-5 OAS1-RNaseL Signalweg (verändert nach (Sadler and Williams, 2008; Hornung et al., 2014)
53
Zielsetzung
4
Zielsetzung
In bisherigen Studien konnte nachgewiesen werden, dass das Interleukin 17A (IL-17A) bei
Asthmapatienten vermehrt gebildet wird und positiv mit der Schwere der Erkrankung
korreliert. So bringt man dieses Zytokin mit schwerem neutrophilen und steroid resistentem
Asthma in Verbindung. Weiterhin geht man davon aus, dass IL-17A an der für Asthma
bronchiale typischen Mukushypersekretion und Atemwegshyperreaktivität beteiligt ist. Ein
Ziel dieser Arbeit war es daher, die Rolle des Interleukins 17A in einem murinen Modell des
allergischen Asthmas eingehender zu untersuchen. Zu diesem Zweck sollten IL-17A
defiziente Mäuse im Asthmamodell untersucht werden, um einerseits die Effekte von IL-17A
auf typische Asthmasymptome wie AHR, bronchiale Entzündungsreaktionen und
Mukushypersekretion näher zu analysieren und andererseits den Einfluss von IL-17A auf
Mastzellen, Th1-, Th2- und Treg-Zellen, welche an der Immunreaktion im allergischen Asthma
beteiligt sind, zu untersuchen.
Auslöser des allergischen Asthma bronchiale ist eine überschießende Immunreaktion auf
eigentlich harmlose Antigene. Die Atemwegstoleranz stellt eine spezielle Form der
körpereignen Immunantwort dar, welche durch eine ausbleibende bzw. stark reduzierte
Immunantwort nach Kontakt mit speziellen, harmlosen Antigenen gekennzeichnet ist. Somit
könnte die gezielte Induktion der Atemwegstoleranz eine effektive Therapiemaßnahme bei
allergischem Asthma bronchiale sein. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es daher, im
murinen Modell zu untersuchen, ob und wie IL-17A bei der Vermittlung der
Atemwegstoleranz beteiligt ist.
Neben Allergenen können auch Viren zur Pathogenese des Asthma bronchiale beitragen.
Hierbei spielen v. a. Rhinoviren eine bedeutende Rolle, da sie als Auslöser der
Erkältungskrankheit zur Verschlimmerung der Asthmasymptomatik beitragen können. Es
konnte jedoch bisher noch nicht eindeutig geklärt werden, ob Rhinoviren einen Auslöser für
54
Zielsetzung
die Asthmaerkrankung darstellen. Das Hauptziel der europaweiten Studie PreDicta (Post
infectious immune-reprogramming and its association with persistance and chronicity of
respiratory allergic diseases) ist es daher, die Zusammenhänge zwischen wiederholt
auftretenden viralen Infektionen im Kindesalter sowie der Entstehung und dem Verlauf von
Asthma bronchiale zu erforschen. In einem weiteren Abschnitt der vorliegenden Arbeit sollte
deshalb untersucht werden, ob und in welcher Weise das Interleukin 17A an der durch
Rhinoviren hervorgerufenen antiviralen Immunantwort beteiligt ist, insbesondere vor dem
Hintergrund einer bestehenden Asthmaerkrankung. Es bestehen bereits Hinweise darauf, dass
IL-17A an der durch Viren hervorgerufenen Immunantwort beteiligt ist, indem es die
inflammatorische Immunantwort steigert, was sowohl positive als auch negative Effekte mit
sich bringt. Welche Rolle IL-17A im Zuge einer Rhinovirusinfektion einnimmt, ist jedoch
noch nicht vollständig geklärt. Zu diesem Zweck sollte zum einen humanes Probenmaterial
von gesunden und an Asthma erkrankten Kindern, welche eine Rhinovirusinfektion in den
oberen Atemwegen aufwiesen, untersucht werden. Außerdem sollten murine Zellen von
naiven und asthmatischen IL-17A defizienten Mäusen analysiert werden, welches in vitro mit
dem Rhinovirus 1b infiziert wurde.
Da Asthma bronchiale üblicherweise mit 2-Sympathomimetika und Glucocorticoiden
behandelt wird, sollte bei Kindern mit Asthma zusätzlich analysiert werden, wie sich die
jeweilige Therapie auf die antivirale Immunantwort auswirkt. Bisher konnte bereits gezeigt
werden, dass eine Therapie mit Glucocorticoiden und 2-Sympathomimetika negative
Auswirkungen auf die IFN und IL-17A Produktion hat.
Zusammengefasst sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob IL-17A an der
Vermittlung der Atemwegstoleranz beteiligt ist und welche Rolle IL-17A bei der Entstehung
und dem Verlauf des Asthma bronchiale spielt, besonders im Zusammenhang mit viralen
Infektionen.
55
Material und Methoden
5
Material und Methoden
5.1 Material
5.1.1 Laborgeräte
Gerät
Absorptionsreader MRX TC Revelation
Aerosol-Expositionssystem
CO2-Inkubator HERAcell 150i
Herstelle
Dynex Technologies GmbH, Denkendorf
FMI GmbH, Seeheim-Oberbeerbach
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA
TM
4D-Nucleofector X Unit
Lonza, Köln
Dispergiergerät Miccra D1
ART Prozess-und Labortechnik GmbH,
Müllheim
TM
Durchflusszytometer BD FACS Calibur
BD Biosciences, Heidelberg
Elektrophorese-Kammer für SDS-PAGE
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Ganzkörperplethysmograph
Buxco Electronics, Sharon, CT, USA
Gelelektrophorese-Stromquelle
Bio-Rad Laboratories, München
Gel-Dokumentationssystem
Intas Science Imaging Instruments GmbH,
Göttingen
Heizblock Thermomixer Comfort
Eppendorf AG, Hamburg
Kompaktschüttler KS 15A
Johanna Otto GmbH, Hechingen
Laborschüttler S20
Ingenieurbüro CAT, M. Zipperer GmbH,
Staufen
MACS® Separationssäulen
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Magnetrührer MR3001
Heidolph Instruments GmbH, Schwabach
Mikroskop Axio Vision
Carl Zeiss GmbH, Jena
Mikroskop Observer D.1
Carl Zeiss GmbH, Jena
Mikroskop Primo Vert
Carl Zeiss GmbH, Jena
Neubauerkammer
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
®
OctoMACS Separation Unit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
pH-Meter InoLab®
WTW
Wissenschaftlich-Technische
Werkstätten GmbH, Weilheim
Pipetten
Eppendorf AG, Hamburg
Pipettierhilfe
Hirschmann Laborgeräte GmbH, Heilbronn
Plethysmograph für invasive Messungen der flexiVentTM,
SCIREQ®
Scientific
AHR
Respiratory Equipment Inc., Montreal,
Kanada
®
QuadroMACS Separation Unit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
QIAxcel Advanced System
Qiagen GmbH, Hilden
Reagenzglasschüttler Reax Control
Heidolph Instruments GmbH, Schwabach
Spektrophotometer Nanodrop
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Sterilbank Herasafe KS
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA
Sterilbank Mars Safety Class 2
Scanlaf, LaboGene ApS, Lynge, Dänemark
Thermocycler Primus 25 advanced
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Thermocyler peqSTAR 96 Universal
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Thermocycler für qPCR CFX-96
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
56
Material und Methoden
Gerät
Hersteller
Ultraschallbad Sonorex RK 510S
Bandelin Elektronic GmbH, Berlin
Vakuumpumpe MINI VAC E1
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Vortex Reax Control
Heidolph Instruments GmbH, Schwabach
Waage AE50
Mettler, Basel, Schweiz
Waage PM300
Mettler, Basel, Schweiz
Washer für 96-Well-Platten
iLF-Bioserve, Langenau
Wasserbad
Memmert GmbH, Schwabach
Zellzählgerät CASY 1 Cell Counter Modell Schärfe Systeme GmbH, Reutlingen
TT
Zentrifugen
Heraeus
Megafuge
1.0R,
Heraeus
Instruments GmbH, München
Kühlzentrifuge, Eppendorf AG, Hamburg
Tischzentrifuge, Eppendorf AG, Hamburg
Zytospinzentrifuge Cytospin 4, Shandon,
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA
Tabelle 5-1 Laborgeräte
5.1.2 Verbrauchsmaterial
Vor Gebrauch wurden alle Glasgeräte bei 121°C autoklaviert. Verbrauchsmaterial aus Plastik
wurde als sterile Einmalware bezogen.
Verbrauchsmaterial
Cryotubes
EasyMag extractor
ESwabTM
FACS Röhrchen
MaxiSorp 96-well-Platte für ELISA
Multiplate® Low 96 well clear für qPCR
NucleocuvetteTM
Pasteurpipetten aus Glas
Parafilm
Petrischalen
5 ml Plastikpipetten, steril
10 ml Plastikpipetten, steril
25 ml Plastikpipetten, steril
50 ml Plastikpipetten, steril
24-well Platte
48-well Platte
Hersteller
Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA
Biomeriex, Mary l´Etoile, Frankreich
Copan, Brescia, Italien
BD Bioscience, Heidelberg
Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Lonza, Köln
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Cellstar,
Greiner
Bio-One
GmbH,
Frickenhausen
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Cellstar,
Greiner
Bio-One
GmbH,
Frickenhausen
Cellstar,
Greiner
Bio-One
GmbH,
Frickenhausen
57
Material und Methoden
Verbrauchsmaterial
96-well Platte
Polylysin-Objektträger
15 ml Röhrchen
50 ml Röhrchen
0,2 ml Reaktionsgefäß für PCR
0,5 ml Reaktionsgefäß
1,5 ml Reaktionsgefäß
2,0 ml Reaktionsgefäß
Sieb Cell strainer 40 µm Nylon
Skalpelle, steril
Spritzen Omnifix®-F
Spritzen Injekt F
Sterican®-Insulinkanülen G26
Hersteller
Cellstar,
Greiner
Bio-One
GmbH,
Frickenhausen
Menzel, Braunschweig
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
VWR International GmbH, Darmstadt
Eppendorf AG, Hamburg
Eppendorf AG, Hamburg
Eppendorf AG, Hamburg
BD Falcon, Bedford, MA, USA
Feather Safety Razor Co, Köln
B.Braun Melsungen AG, Melsungen
B.Braun Melsungen AG, Melsungen
B.Braun Melsungen AG, Melsungen
Tabelle 5-2 Verbrauchsmaterialien
5.1.3 Chemikalien und Reagenzien
Chemikalie / Reagenz
Hersteller
Aceton
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Agarose
STARLAB GmbH, Ahrensberg
Aluminiumkaliumdisulfat (AlK(SO4)2)
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Münche
Aluminiumkaliumbisulfat
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Münche
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Aprotinin
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Münche
Assay Diluent für ELISA
BD Bioscience, Heidelberg
BD Golgi-StopTM Protein Transport Inhibitor BD Bioscience, Heidelberg
Biocoll seperating solution 1,077 g/ml
Biochrom GmbH, Berling
Bovines Serumalbumin Fraktion V (BSA), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
gereinigt
Casy® Clean Lösung
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
®
Casy ton Isotone Salzlösung
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Chloroform
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Desoxy-Nucleosid-Triphosphate (dNTPs)
Promega GmbH, Mannheim
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Dinatriumcarbonat (Na2CO3)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Dinatrium-EDTA
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
DNase-I
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Entellan Mounting Medium
Merck KGaA, Darmstadt
Essigsäure 100%
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Ethanol 99,5%, reinst
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Fetal bovine serum (FBS), Hitze inaktiviert
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Fetal calf serum (FCS)
PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Formaldehyd (37%)
Merck KGaA, Darmstadt
GelRed®
Biotium Inc., Hayward, CA, USA
58
Material und Methoden
Chemikalie / Reagenz
Giemsa-Stammlösung
Ham´s F12K (Kaighn´s) Medium
Hersteller
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Life technologies, Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA
L-Glutamin
Invitrogen GmbH, Darmstadt
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Glycerin
Merck KGaA, Darmstadt
Glykogen
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Glyzin
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Igepal® (NP-40)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Ionomycin
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Isofluran
Abbott, GmbH + Co. KG, Wiesbaden
Isopropanol
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl)
Merck KgaA, Darmstadt
Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Ketamin
Ratiopharm, Ulm
Kollagenase Typ Ia
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
TM
Mag Max (Isolations-Kit für RNA)
Life technologies, Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA
May-Grünwald-Lösung
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
MEM Non-essential amino acid solution
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
MEM Vitamin solution 100x
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Methacholin
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Methanol
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
M-MuLV Reverse Transkriptase
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Nacoren® (Pentobarbital-Natrium)
Merial Gmbh, Hallbergmoos
Natriumchlorid (NaCl)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Natriumhydroxid (NaOH)
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Ovalbumin (Albumin chicken egg, 5x Calbiochem GmbH, Bad Soden
crystalline)
Paraformaldehyd
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Penicillin/Streptomycin Lösung
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
TM
PeqGold RNA Pure
PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Permfix Puffer
eBioscience (Natu Tec GmbH), Frankfurt
Permwash Konzentrat (10x)
eBioscience, Frankfurt
Phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA)
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)-EDTA Lonza GmbH, Köln
Proteinase K
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Puffer für Reverse Transkriptase (5x)
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
®
QUIazol Lysis Reagent
Quiagen Sciences, Maryland, USA
Random Hexamer Primer
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Release 300mg/ml (Pentobarbital-Natrium)
WDT, Garbsen
Red Load Taq Master
Jena Bioscience GmbH, Jena
59
Material und Methoden
Chemikalie / Reagenz
RiboLock RNase Inhibitor
Rompun® (Xylazin)
Roti-Load
Rotiphorese® Gel 40
RPMI 1640
Salzsäure 37%, reinst
Schwefelsäure 98%
Sodium pyruvate solution 100 mM
SsoFastTMEvaGreen® Supermix für qPCR
Sterofundin
3,3´5,5´Tetramethylbenzidin (TMB)
N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
(TEMED)
Tempus® Blood RNA Tube
TM
Tris-Base
Tris-HCl
Trypanblau 0,4%
Trypsininhibitor
Tween-20
Wasser (UltraPureTM DEPC treated Water)
Wasser (nuclease frei)
Wasser (steril, zur Injektion)
Wasserstoffperoxid (H2O2) 30%
Zitronensäure- Monohydrat
Hersteller
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Bayer AG, Leverkusen
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Life technologies, Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Gibco, Invitrogen Cor., New York, USA
Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Tabelle 5-3 Chemikalien und Reagenzien
5.1.4 ELISA-Kits
ELISA-Kit
Histamin ELISA
Fast Track
Lactate Dehydrogenase Activity Kit
Human IL-17 (DuoSet®)
Maus IFN (OptEIATM)
Maus IgE (OptEIATM)
Maus IL-3 (OptEIATM)
Maus IL-4 (OptEIATM)
Maus IL-5 (OptEIATM)
Maus IL-10 (OptEIATM)
Maus IL-13 (DuoSet®)
Maus IL-17A (DuoSet®)
Maus Tgf (DuoSet®)
Hersteller
Labor Diagnostika Nord GmbH + Co. KG,
Nordhorn
Sigma-Aldrich, Steinheim
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
BD Bioscience, Heidelberg
BD Bioscience, Heidelberg
BD Bioscience, Heidelberg
BD Bioscience, Heidelberg
BD Bioscience, Heidelberg
BD Bioscience, Heidelberg
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
Tabelle 5-4 ELISA-Kits
60
Material und Methoden
5.1.5 Antikörper und Zytokine
Reagenz
Maus anti-CD3 Antikörper
Maus anti-CD28 Antikörper
Maus anti-CD4 Antikörper
Maus anti-IFN-Antikörper
Rekombinantes IL-17A (human)
Rekombinantes IL-17A (murin)
Rekombinantes IL-6 (murin)
Rekombinantes TGF- (murin)
Hersteller
Generiert aus Hybridoma-Zellen bzw. BD
Bioscience, Heidelberg
Generiert aus Hybridoma-Zellen bzw.
BD Bioscience, Heidelberg
Generiert aus Hybridoma-Zellen
Generiert aus Hybridoma-Zellen
PeproTech GmbH, Hamburg
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
PeproTech GmbH, Hamburg
PeproTech GmbH, Hamburg
Tabelle 5-5 Antikörper und Zytokine
5.1.6 Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen
Antikörper
CCR-3
CD3
CD4
CD8
CD25 (Interleukin-2 Rezeptor, alpha)
CD45R
CD117 (ckit)
CD123 (Interleukin-3 Rezeptor, alpha)
Foxp3
FcεRIα
Ly-6G (GR-1)
IL-13
Hersteller
BD Bioscience, Heidelberg
eBioscience, Frankfurt
eBioscience, Frankfurt
BD Bioscience, Heidelberg
eBioscience, Frankfurt
eBioscience, Frankfurt
eBioscience, Frankfurt
eBioscience, Frankfurt
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach
eBioscience, Frankfurt
BD Bioscience, Heidelberg
eBioscience, Frankfurt
Tabelle 5-6 Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen
5.1.7 Beads zur magnetischen Zellseparation
Isolationskits und Beads
CD4 (L3T4) microbeads
CD11c (N418) microbeads
Hersteller
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach
Tabelle 5-7 Beads zur magnetischen Zellseparation
61
Material und Methoden
5.1.8 Oligonukleotide
Die verwendeten Oligonukleotide stammten von der Firma Eurofins MWG Operon aus
Ebersberg.
Genotypisierungs-Primer
Common primer 1
WT primer 1
KO primer 1
Sequenz 5´-3´
ACT CTT CAT CCA CCT CAC ACG A
GTA CAC CAG CTA TCC TCC AGA TAG
TCC TTG AAG TCG ATG CCC TTC A
Tabelle 5-8 Sequenzen der Genotypisierungs-Primer für IL-17A(-/-) PCR
Oligonukleotide für Rhinovirus PCR
OL 26
OL 27
Sequenz 5´-3´
GCA CTT CTG TTT CCC C
CGG ACA CCC AAA GTA G
Tabelle 5-9 Sequenzen der Primer für die Rhinovirus PCR
qPCR-Oligonukleotide
Human ETS1
Human HPRT
Human IFN-
Human IL-6
Human IL-17A
Human OAS1
Human T-BET
Human TYK2
Maus Batf
Maus Bcl6
Maus Cxcr5
Maus Foxp3
Sequenz 5´-3´
Fwd: TGG AGT CAA CCC AGC CTA TC
Rev: TCT GCA AGG TGT CTG TCT GG
Fwd: TGA CAC TGG CAA AAC AAT
GCA
Rev: GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT
Fwd: AGT AGG CGA CAC TGT TCG TG
Rev: AGC CTC CCA TTC AAT TGC CA
Fwd: TAC CCC CAG GAG AAG ATT CC
Rev: TTT TCT GCC AGT GCC TCT TT
Fwd: CAA GAC TGA ACA CCG ACT
AAG
Rev: TCT CCA AAG GAA GCC TGA
Fwd: AGC TGG AAG CCT GTC AAA GA
Rev: GGT TTA TAG CCG CCA GTC AA
Fwd: CAG AAT GCC GAG ATT ACT CAG
Rev: GGT TGG GTA GGA GAG GAG AG
Fwd: CCT CCT GGA GAT CTG CTT TG
Rev: TCT GGG TTG GCT CAT AGG TC
Fwd: GTT CTG TTT CTC CAG GTC C
Rev: GAA GAA TCG CAT CGC TGC
Fwd: ATG TAC AGC CAT CTC CCG CT
Rev: TTA GGG ACT TGC CTG GCA CT
Fwd: GAC TCC TTA CCA CAG TGC ACC
TT
Rev: GGA AAC GGG AGG TGA ACC A
Fwd: AGA GCC CTC ACA ACC AGC TA
Rev: CCA GAT GTT GTG GGT GAG TG
62
Material und Methoden
qPCR-Oligonukleotide
Maus Gata3
Maus Hprt
Maus Ifn
Maus Il-6
Mauls Il-6r
Maus Il-9
Maus Il-10
Maus Il-13
Maus Il-21
Maus Il-21r
Maus Oas1a
Maus Oas1g
Maus Tgf
Sequenz 5´-3´
Fwd: GTC ATC CCT GAG CCA CAT CT
Rev: TAG AAG GGG TCG GAG GAA CT
Fwd: GCC CCA AAA TGG TTA AGG TT
Rev: TTG CGC TCA TCT TAG GCT TT
Fwd: CCC TAT GGA GAT GAC GGA
GAA G
Rev: GAG CAT CTC TTG GAT GGC AAA
Fwd: AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA
Rev: TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC
Fwd: GCC CAA ACA CCA AGT CAA CT
Rev: TAT AGG AAA CAG CGG GTT GG
Fwd: CTG ATG ATT GTA CCA CAC CGT
GC
Rev: GCC TTT GCA TCT CTG TCT TCT
GG
Fwd: CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA
Rev: TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG
Fwd: CAG CTC CCT GGT TCT CTC AC
Rev: CCA CAC TCC ATA CCA TGC TG
Fwd: CAG GAG GGG AGG AAA GAA AC
Rev: GGG AAT CTT CTC GGA TCC TC
Fwd: CTC CCC CCT TGA ACG TGA CT
Rev: TTG CCC CTC AGC ACG TAG TT
Fwd: TTC CAG CAA GCC TGA TCC CA
Rev: CCC AGC TTC TCC TTA CAC AGT
T
Fwd: AAT GAT GGT TCC CGA GTG AG
Rev: GGC TGT GAT TGG ACA GGA GT
Fwd: GTC CTT GCC CTC TAC AAC CA
Rev: GTT GGA CAA CTG CTC CAC CT
Tabelle 5-10 Sequenzen der qPCR Oligonukleotide
5.1.9 Humanes Probenmaterial (PreDicta-Studie)
Bei allen Studienteilnehmern wurde zu Beginn der Studie ein Nasopharynxabstrich
durchgeführt und auf Rhinoviren hin untersucht. Der jeweilige Befund ist in der Spalte
„Rhinovirus Nachweis“ mit „positiv“ bzw. „negativ“ angegeben. Ein „-“ in dieser Spalte
bedeutet, dass das Testergebnis nicht eindeutig war. In der Spalte „Therapie“ ist bei Kindern
mit Asthma angegeben, mit welcher Medikamentengruppe sie behandelt wurden. Hierbei
bedeutet „s“, dass die Kinder mit Steroiden (= Glucocorticoide) behandelt wurden,
63
Material und Methoden
wohingegen „ns“ für nicht-steroidale Arzneimittel wie beispielsweise 2-Sympathomimetika
oder Leukotrienantagonisten steht. Die meisten Asthmakinder erhielten sowohl steroidale- als
auch nicht-steroidale („s, ns“) Arzneimittel. Ein „-“ in dieser Spalte bedeutet, dass bei dem
jeweiligen Kind keine Dauermedikation vorgesehen war. Sie nahmen nur im Bedarfsfall
Medikamente (Reliever) ein.
Patient
Alter
Geschlecht
[Jahre]
Rhinovirus
Therapie
Nachweis
Kontrollkinder
K1
6
männlich
negativ
-
K2
5
weiblich
positiv
-
K3
5
männlich
positiv
-
K4
4
männlich
negativ
-
K5
4
weiblich
positiv
-
K6
5
weiblich
-
-
K7
5
weiblich
negativ
-
K8
4
männlich
positiv
-
K9
6
männlich
negativ
-
K10
4
weiblich
-
-
K11
6
männlich
negativ
-
K12
4
männlich
positiv
-
K13
5
weiblich
positiv
-
K14
5
weiblich
positiv
-
K15
4
männlich
positiv
64
Material und Methoden
Patient
Alter
Geschlecht
[Jahre]
Rhinovirus
Therapie
Nachweis
K16
5
männlich
negativ
-
K17
4
männlich
negativ
-
K18
4
weiblich
positiv
-
K19
4
männlich
positiv
-
K20
5
weiblich
-
-
K21
4
männlich
negativ
-
K22
4
männlich
-
-
Kinder mit Asthma
A1
5
männlich
positiv
s, ns
A2
5
männlich
positiv
s
A3
5
weiblich
negativ
s
A4
6
männlich
negativ
s, ns
A5
5
männlich
negativ
s, ns
A6
5
weiblich
positiv
s
A7
5
männlich
negativ
s, ns
A8
4
weiblich
negativ
s
A9
6
weiblich
negativ
ns
A10
5
männlich
negativ
s, ns
A11
4
männlich
positiv
s, ns
A12
5
weiblich
negativ
s, ns
A13
6
weiblich
negativ
s
A14
5
männlich
positiv
s, ns
65
Material und Methoden
Patient
Alter
Geschlecht
[Jahre]
Rhinovirus
Therapie
Nachweis
A15
4
weiblich
-
S
A16
4
männlich
positiv
s, ns
A17
5
männlich
negativ
-
A18
4
männlich
positiv
ns
A19
5
männlich
positiv
-
A20
4
männlich
negativ
s, ns
A21
4
männlich
positiv
s, ns
A22
5
weiblich
positiv
-
A23
5
männlich
-
s, ns
A24
5
weiblich
positiv
s, ns
Tabelle 5-11 Übersicht der an der PreDicta-Studie beteiligten Kinder: Die Kontrollkiner (K) waren im Durchschnitt 4,6
Jahre alt (SEM ± 0,2), die an Asthma erkrankten Kinder (A) 4,8 Jahre (SEM ± 0,1). Ein „ – “ in der Spalte „Rhinovirus
Nachweis“ bedeutet, dass hier keine eindeutigen Ergebnisse vorlagen. In der Spalte „Therapie“ steht „s“ für steroidale
Arzneimittel, „ns“ für nicht-steroidale Medikamente. Ein „ – “ bei Kindern mit Asthma in dieser Spalte bedeutet, dass bei
diesen Kindern keine Dauermedikation vorgesehen war. Sie nahmen nur im Bedarfsfall Medikamente (Releaser) ein.
5.1.10 Rhinovirus 1b (RV1b)
Da bei den Analysen der vorliegenden Arbeit sowohl humane als auch murine Zellen mit dem
Rhinovirus infiziert werden sollten, wurde der Rhinovirus 1b benutzt. Dieser zählt zu der
kleineren Untergruppe der humanen Rhinoviren und bindet sowohl an die humanen als auch
die murinen Proteine der LDL-Rezeptorengruppe. Im Gegensatz dazu binden die Serotypen
der Hauptgruppe nur das humane ICAM-1 (Bartlett et al., 2008). Um den Virus zu vermehren
wurden, wie von Tuthill et al. beschrieben (Tuthill et al., 2003), Ohio HeLa Zellen verwendet.
Der RV1b wurde dazu aus infektiösen cDNA Klonen generiert. Durch Endpunkttitration
wurde ein Titer von TCID50/ml 107 ermittelt. TCID50 steht für „Tissue culture infective dose“
und stellt die Verdünnung einer geometrischen Verdünnungsreihe dar, bei der 50 % der
66
Material und Methoden
beimpften Zellen einen zytopathischen Effekt zeigen. Der Rhinovirus 1b wurde uns
freundlicherweise im Zuge der PreDicta Studie von der Abteilung für Allergie und
Immunologie der Nationalen und Kapodistrischen Universität Athen (Griechenland; Nikolaos
G. Papadopoulos, Stella Taka und Rena Stergiou) zur Verfügung gestellt.
5.1.11 Puffer und Lösungen
5.1.11.1 Zellkulturmedium für humane PBMCs
Komponente
RPMI 1640 + HEPES 25mM + L-Glutamin
Penicillin
Streptomycin
1M -Mercaptoethanol
L-Glutamin
MEM Vitamin
Non-essential Amino Acid Solution
Sodium Pyruvat
FBS
Konzentration
100 IU/ml
100 µg/ml
50 µM
1%
1%
1%
1%
10%
5.1.11.2 Zellkulturmedium für humane A549 Zellen
Komponente
Ham´s F12K (Kaighn´s) Medium
Penicillin
Streptomycin
L-Glutamin
FCS
Konzentration
100 IU/ml
100 µg/ml
1%
10%
5.1.11.3 Puffer für die Genotypisierung von Mäusen
Stammlösung für Ohrbiopsie-Verdau
Komponente
Tris-Base
EDTA
NaCl
SDS
Konzentration
100 mM
500 mM
200 mM
0,2 %
67
Material und Methoden
Verdaupuffer für eine Ohrbiopsie
Komponente
Stammlösung
Proteinase K (10 mg/ml)
Tween 20
Igepal® (10%)
Volumen
200 µl
5 µl
1 µl
1 µl
5.1.11.4 Puffer und Lösungen für die Zellisolation und Zellkultur
Kollagenase-DNase Lösung
Komponente
PBS
Kollagenase Typ Ia
DNaseI (10 mg/ml)
Konzentration
300 U/ml
0,01%
ACK-Lyse Puffer (pH 7,2-7,4)
Komponente
Aqua dest.
NH4Cl
KHCO3
Na2-EDTA
Konzentration
0,15 M
0,1 mM
0,1 mM
Puffer für MACS® Separation
Komponente
PBS-EDTA
BSA
Konzentration
0,5 %
Carbonatpuffer für anti-CD3 Beschichtung der Zellkulturplatte (pH 8,2)
Komponente
NaHCO3
Konzentration
0,1 M
68
Material und Methoden
Zellkulturmedium
Komponente
RPMI 1640 (+ L-Glutamin)
FCS
Penicillin/Streptomycin
Konzentration
10 %
1%
5.1.11.5 Puffer und Lösungen für ELISA
Carbonatpuffer (pH 9,5)
Komponente
Aqua dest.
Na2CO3
NaHCO3
Konzentration
3 mM
10 mM
Phosphatpuffer (pH 6,5)
Komponente
Aqua dest.
Na2HPO4
NaH2PO4
Konzentration
8 mM
13 mM
Waschpuffer
Komponente
PBS
Tween-20
Konzentration
0,05 %
TMB-Lösung
Komponente
TMB
Aceton
Ethanol
H2O2 (30%)
Konzentration
2mM
172 mM
1,95 M
50 mM
69
Material und Methoden
Substratpuffer (pH 4,1)
Komponente
Aqua dest.
Zitronensäure Monohydrat
Konzentration
30 mM
TMB-Substratlösung
Für 96 well Platte
Komponente
TMB-Lösung
Substratpuffer
Volumen
500 µl
9500 µl
Stopplösung
Komponente
H2SO4
Konzentration
30 %
5.1.11.6 Kulturmedium für die Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark
Komponente
RPMI 1640
FCS
L-Glutamin
Penicillin
Streptomycin
-Mercaptoethanol
EPES
IL-3
SCF
Konezntration
10%
2 mM
100 U/ml
100 µg/ml
50 µM
10 mM
10 ng/ml
10 ng/ml
5.1.11.7 Tyrod´s Puffer für Histamin-Release aus Mastzellen (pH 7,4)
Komponente
NaCl
Glucose
KCl
CaCl2 x 2 H2O
BSA
HEPES
NaH2PO4 x H2O
Konezntration
8 g/l
1 g/l
0,2 g/l
0,147 g/l
1 g/l
2,38 g/l
0,0552 g/l
70
Material und Methoden
5.1.11.8 Sontige Puffer und Lösungen
TAE Puffer
Komponente
Tris
Na2-EDTA
Essigsäure
Konzentration
400 mM
10 mM
200 mM
71
Material und Methoden
5.2 Methoden
5.2.1 PreDicta-Studie
Im Zuge dieser Arbeit wurde humanes Probenmaterial analysiert, welches aus der Studie
PreDicta (post-infectious immune reprogramming and its association with persistence and
chronicity of respiratory allergic diseases) hervorging (s. Tabelle 5-11). Bei PreDicta handelt
es sich um eine europaweite, prospektive, multizentrische Kohorten Studie. Das Projekt
basiert auf der Beobachtung, dass Asthma im Kindesalter meist nach einer viralen Infektion
der Atemwege auftritt. Hierbei scheint vor allem der humane Rhinovirus eine wichtige Rolle
zu spielen. Aufgrund dieser Erkenntnisse ergibt sich die zentrale Hypothese dieser Studie,
welche besagt, dass wiederholte, akute infektionsbedingte Vorkommnisse sowohl das
angeborene als auch das erworbene und möglicherweise auch das regulatorische
Immunsystem so beeinflussen, dass die Wahrscheinlichkeit für eine chronische Entzündung
steigt. Ziel der PreDicta Studie ist es, die Zusammenhänge zwischen Infektionen und der
Persistenz des Asthma bronchiale eingehender zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden
Vorschulkinder in fünf europäischen Ländern (Belgien, Deutschland, Finnland, Griechenland
und Polen) im Alter von vier bis sechs Jahren über einen Zeitraum von zwei Jahren
untersucht. Studienzentrum in Deutschland ist die Abteilung für Molekulare Pneumologie des
Universitätsklinikums Erlangen in Zusammenarbeit mit der Kinder- und Jugendklinik sowie
dem Mikrobiologischen Institut des Universitätsklinikums Erlangen. Die an der Studie
beteiligten Kinder waren entweder gesund (Kontrollgruppe) oder hatten eine positive
Diagnose
für
Asthma
bronchiale
(Asthmagruppe).
Die
Studie
wurde
von
der
Ethikkommission der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg genehmigt
(Registriernummer 4435). Eine Einverständniserklärung der Eltern der teilnehmenden Kinder
wurde
eingeholt
(Deutsches
Register
Klinischer
Studien
DRKS00004914).
Das
Studienprotokoll sah vor, dass die Kinder über einen Zeitraum von 24 Monaten hinweg
untersucht wurden. Beim ersten und beim letzten Besuch wurde peripheres Blut
72
Material und Methoden
abgenommen, um daraus einerseits periphere mononukleäre Zellen (PBMCs) zu isolieren,
andererseits wurde auch Serum gewonnen. Außerdem wurde aus dem Vollblut direkt RNA
extrahiert. Des weiteren wurde an diesen Tagen ein Nasenabstrich entnommen, um
Infektionen mit Viren nachweisen zu können. Ebenfalls wurde bei diesen Terminen die
Lungenfunktion überprüft und ein Lauftest durchgeführt. Zwischen dem ersten und dem
letzten Besuch in der Klinik wurde bei den Kindern der Asthmagruppe zusätzlich im
halbjährlichen Abstand die Lungenfunktion überprüft sowie ein Nasenabstrich und ein
Lauftest durchgeführt. Zwischen den halbjährlichen Besuchen wurden die an Asthma
erkrankten Kinder telefonisch zu ihrem Gesundheitszustand befragt (s. Abb. 5-1). Für die
Kinder der Asthmagruppe galt außerdem, dass sie in der Klinik vorstellig werden mussten,
wenn eine Infektion der oberen Atemwege bzw. eine Exazerbation des Asthmas vorlag
(Krankheitsbesuch). Außerdem war ein sogenannter Genesungsbesuch sechs bis acht Wochen
nach dem Krankheitsbesuch notwendig. An beiden Terminen wurde Blut zur Gewinnung von
Serum sowie ein Nasenabstrich abgenommen. Zusätzlich wurde die Lungenfunktion
überprüft. Für die vorliegende Arbeit wurde nur Proben- und Datenmaterial des ersten
Besuchs verwendet.
Abb. 5-1 Zeitverlauf der PreDicta Studie
73
Material und Methoden
5.2.1.1 RNA Isolation aus dem Vollblut
In der Kinderklinik wurde den Studienteilnehmern Vollblut abgenommen und sofort in
Tempus® Blood RNA Tubes überführt. Diese Tubes enthalten ein Stabilisierungsreagenz,
welches die zelluläre RNase inaktiviert und die RNA selektiv präzipitiert. Bis zur weiteren
Verwendung wurde das Probenmaterial bei -80 °C gelagert. Die Extraktion der RNA wurde
anschließend laut Herstellerangaben mit dem MagMaxTM System durchgeführt. Dazu wurden
die Tempus® Blood RNA Tubes zunächst auf Eis aufgetaut und anschließend der gesamte
Inhalt in ein frisches 50 ml Röhrchen überführt und mit Tempus® 1 x PBS zu einem
Gesamtvolumen von 12 ml ergänzt. Nach dem Zentrifugieren (15 min, 4 °C, 5000 g) wurde
der Überstand verworfen und das Probenmaterial in 4 ml Tempus® Pre-Digestion Wash
resuspendiert und erneut zentrifugiert (10 min, 4 °C, 5000 g). Nach sorgfältigem Entfernen
des kompletten Überstands wurde die RNA in 120 µl einer Lösung bestehend aus Tempus®
Resuspension Solution und Tempus® Proteinase gelöst und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß
überführt. Die Aufreinigung der RNA erfolgte mittels magnetischer Beads. Dazu wurde zu
der gelösten RNA zunächst 50 µl Binding Solution-Concentrate und 20 µl RNA Binding
beads gegeben, homogenisiert und anschließend 200 µl 100 % Isopropanol hinzugefügt und
erneut gemischt. Die magnetischen RNA binding beads wurden dann in einem magnetischen
Feld von der Lösung abgetrennt, der Überstand vorsichtig abgenommen und anschließend das
Reaktionsgefäß aus dem Magnetstativ entfernt. Die Beads wurden je zweimal mit der
Washing Solution 1 bzw. Washing Solution 2 gewaschen, indem die jeweilige Waschlösung
zu den Beads gegeben wurde und diese im magnetischen Feld wieder von der Lösung
abgetrennt wurden. Nach dem Waschen wurden die Beads bei Raumtemperatur getrocknet
und anschließend in 80 µl Elutionspuffer aufgenommen. Nach dem Entfernen der Beads im
magnetischen Feld, wurde der Überstand, welcher die aufgereinigte RNA enthielt, in ein
frisches Reaktionsgefäß überführt.
74
Material und Methoden
5.2.1.2 Isolation peripherer mononukleärer Zellen aus dem Vollblut
Zu Studienbeginn wurde den Kindern mit Hilfe einer mit Lithium-Heparin beschichteten
Monovette peripheres Vollblut entnommen. Daraufhin wurde zunächst das Volumen an
Vollblut bestimmt und daraufhin in ein steriles 15 ml Röhrchen überführt, um es mit dem
gleichen Volumen an warmen (Raumtemperatur) PBS zu vermischen. Entsprechend dem
Ausgangsvolumen an Blut wurde in einem zweiten sterilen 15 ml Röhrchen das
entsprechende Volumen an Biocoll Seperating Solution vorgelegt und anschließend mit dem
Blut-PBS
Gemisch
vorsichtig
überschichtet.
Daraufhin
erfolgte
eine
Dichtegradientzentrifugation bei 800 g und 20 °C für 20 min bei ausgeschalteter Bremse. Die
PBMCs (peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)
sammelten sich als Ring entsprechend ihrer spezifischen Dichte in der Interphase zwischen
Überstand (Serum/Thrombozyten) und Biocoll. Erythrozyten und Granulozyten, welche eine
höhere Dichte aufweisen, bildeten das Zellsediment (s.Abb. 5-2). Dieser Zellring wurde
vorsichtig abgenommen und zwei Mal bei 800 g bzw. 200 g für 10 min bei 8 °C mit
RPMI 1640 Medium gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in Kulturmedium (s.
5.1.11.1) aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Ein Teil der Zellen wurde direkt in
PeqGoldRNAPure® aufgenommen um RNA zu isolieren, die verbleibenden Zellen für die
Zellkultur verwendet (s. 5.2.1.3).
Abb. 5-2 Isolation von PBMCs aus Gesamtblut: Die PBMCs wurden unter Verwendung der Biocoll Seperating Solution
und anschließender Dichtegradientzentrifugation aus dem Vollblut isoliert
75
Material und Methoden
5.2.1.3 Zellkultur der PBMCs
Die isolierten PBMCs wurden zu einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml in
Zellkulturmedium (s. 5.1.11.1) aufgenommen. Die Zellkultur erfolgte in der 48-well Platte,
wobei pro Well 5 x 105 Zellen ausgesät wurden. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2
entweder für 24 h mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern oder für 48 h ohne weitere
Stimuli kultiviert. Nach Ablauf der Stimulationszeit wurde die Zellkulturplatte bei 1500 rpm
für 5 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und für weitere Analysen bei -80 °C
gelagert. Die Zellen wurden in PeqGoldRNAPure® (24 h Zellkultur) oder in QUIazol® Lysis
Reagent (48 h Zellkultur) aufgenommen und bis zur Extraktion der RNA bei -80 °C gelagert.
5.2.1.4 Entnahme des Nasenabstrichs und Rhinovirusdetektion
Der Nasopharynxabstrich wurde mit Hilfe eines Nylon-Flockfaser Abstrichtupfers (ESwabTM)
in der Kinder- und Jugendklinik des Universitätsklinikums Erlangen entnommen. Dabei
wurde der Tupfer in die Nasenöffnung eingeführt, bis ein Widerstand zu spüren war.
Daraufhin wurde der Tupfer sanft rotiert, damit Sekret am Tupfer haften blieb. Vor der
letztendlichen Entnahme des Tupfers wurde dieser noch an der Mucosa der Naris gerieben.
Der Tupfer wurde anschließend im ESwab Medium unter Rotation ausgespült und die
Flüssigkeit bis zu weiteren Untersuchungen bei -80 °C gelagert.
Der Nachweis von Rhinoviren in den gewonnen Proben erfolgte am Virologischen Institut der
Universität von Turku in Finnland. Dafür wurde unter Benutzung des easyMAg extractors
entsprechend der Herstellerangaben aus 200 µl Probenmaterial Nukleinsäuren isoliert. Mittels
PCR wurden, wie von Peltola et al. beschrieben, Enteroviren, Rhinoviren und
Respiratorische-Synzytial-Viren detektiert (Peltola et al., 2008). Mittels Anyplex™ II RV16
Detection Kit wurden 16 verschiedenen respiratorischen Viren nachgewiesen: Adenovirus,
Influenzavirus A und B, Parainfluenzavirus 1, 2, 3 und 4, Rhinovirus A, B und C,
76
Material und Methoden
Respiratorischer-Synzytial-Virus A und B, Bocavirus 1, 2, 3 und 4, Coronavirus 229E, NL63
und OC43, Metapneumovirus und Enterovirus. Für die vorliegende Arbeit wurde
berücksichtigt, welche Kinder positiv auf Rhinoviren getestet wurden.
5.2.2 Zellkultur mit der humanen Epithelzelllinie A549
Zellen der humanen Epithelzelllinie A549 wurden zunächst mit dem RV1b infiziert (s. 5.2.4).
Nach Aufnahme der Zellen zu einer Konzentration von 1x106 Zellen/ml in Kulturmdium (s.
5.1.11.2), wurden diese in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an rIL-17A (s.
5.1.5) für 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
5.2.3 Murine Studien
5.2.3.1 Versuchstiere und Genotypisierung
Für die Experimente der vorliegenden Arbeit wurden, je nach Versuchsptorokoll, 6 - 12
Wochen alte Wildtyp-(wt) Mäuse sowie IL-17A defiziente (IL-17A(-/-) bzw. IL-17A ko)
Mäuse
auf
Balb/c
Hintergrund
verwendet.
Die
IL-17A(-/-)
Mäuse
wurden
uns
freundlicherweise von Yoichiro Iwakura, National Instiute of Animal Health, Tsukuba in
Japan zur Verfügung gestellt. Um die IL-17A(-/-) Maus zu generieren, wurde das Exon 1 und 2
des IL-17 Gens durch eine Neomycin resistentes Gen ersetzt (Nakae et al., 2002). Die WildTyp Mäuse stammten aus der Zucht des Universitätsklinikums. Die Mäuse hatten stets freien
Zugang zu Futter und Wasser und waren an ein spezifisches Frischluftventilationssystem
angeschlossen.
Der Genotyp der IL-17A(-/-) Mäuse wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR)
bestimmt.
Dazu
wurden
von
den
Mäusen
Ohrbiopsien
entnommen,
in
den
detergenzienhaltigen Puffer (s. 5.1.11.3) überführt und zur Extraktion der DNA über Nacht
77
Material und Methoden
bei 55°C verdaut. Die im Puffer enthaltene Proteinase K wurde durch Erhitzen (95°C, 5 min)
deaktiviert, was einen Abbruch der enzymatischen Reaktion zur Folge hatte. Anschließend
wurde die DNA in einer PCR mittels des Red Load Taq Master Mix und entsprechender
Primer amplifiziert (s. Tabelle 5-8). Abschließend wurde das Endprodukt der PCR auf ein
Agarose-Gel (1.5 %, s. 5.1.11.8) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Nach
Anfärben des Gels mit dem DNA-interkalierenden Farbstoff GelRed® wurden die Banden
unter UV-Licht analysiert. Bei 700 bp (Basenpaare) befindet sich im Gel die Wildtyp-Bande,
bei 500 bp diejenige der IL-17A-defizienten Tiere.
5.2.3.2 Induktion des allergischen Asthma bronchiale
Zur Induktion des allergischen Asthmas wurden die Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse
entsprechend dem Behandlungsprotokoll an den Tagen 0 und 7 intraperitoneal (i. p.) mit
100 µg einer OVA/Alum (Ovalbumin/Aluminiumkaliumsulfat) -Suspension sensibilisiert (s.
5.1.3). Zur Herstellung dieser Suspension bedarf es zweier unterschiedlicher Komponenten.
Zum einen wurden 5 mg OVA in 10 ml 0,9 % NaCl gelöst. Zum anderen wurde aus 1 g
Aluminiumkaliumsulfat (Alum) und 10 ml Wasser (für Injektionszwecke) eine zweite Lösung
hergestellt. Beide Lösungen wurden anschließend vereinigt und auf einen pH-Wert von 6,5
eingestellt, so dass es zur Komplexbildung kam. Nach 1h Inkubationszeit bei Raumtemperatur
erfolgte ein Zentrifugationsschritt (5 min, 1500 rpm). Der Rückstand wurde anschließend ad
10 ml in 0,9 % NaCl resuspendiert. An den Tagen 18 - 20 des Versuchsprotokolls erfolgte die
Allergenkonfrontation, indem die Mäuse intranasal (i. n.) mit 25 µl OVA-Lösung (2 µg/ml
PBS) behandelt wurden. Für diesen Behandlungsschritt wurden die Mäuse zunächst mit
Ketamin/Xylazin bzw. Isofluran sediert und anschließend die Lösung mit einer Pipette
vorsichtig auf die Nase der Mäuse gegeben. Die Kontrollmäuse wurden nicht behandelt. Bei
78
Material und Methoden
einigen Experimenten wurde an Tag 20 die AHR gemessen. An Tag 21 endete das
Experiment (s. Abb. 5-3).
Abb. 5-3 Behandlungsprotokoll zur Induktion des allergischen Asthmas
5.2.3.3 Induktion der Atemwegstoleranz
Um eine Atemwegstoleranz zu induzieren, wurden die Mäuse zunächst an drei
aufeinanderfolgenden Tagen mit 25 µl OVA-Lösung (2 µg/ml PBS) i. n. behandelt. An Tag
12 des Experiments wurden die Mäuse i. p. mit 100 µg einer OVA/Alum -Suspension
sensibilisiert (s. 5.2.3.2). An den Tagen 20 – 22 erfolgte die Allergenkonfrontation mit 25 µl
OVA-Lösung (2 µg/ml PBS) i. n. Am 22. Tag des Experiments wurde die AHR gemessen.
Das Experiment endete an Tag 23 des Versuchsprotokolls (s. Abb. 5-4).
Abb. 5-4 Behandlungsprotokoll zur Induktion der Atemwegstoleranz
5.2.3.4 Messung des Atemwegswiderstandes
Die Bestimmung der AHR gilt als wichtiges Kriterium um die Schwere einer allergischen
Reaktion feststellen zu können. Im Asthmamodell erfolgte die Messung sowohl mittels eines
79
Material und Methoden
nicht-invasiven Verfahrens mit einem Ganzkörperplethysmographen bzw. mit Hilfe einer
invasiven Methode an Tag 20 des Versuchsprotokolls etwa zwei Stunden nach der letzten
Allergenkonfrontation. Im Toleranzmodell wurde die AHR mit Hilfe der nicht-invasiven
Methode an Tag 22 bestimmt. Bei dem nicht-invasiven Verfahren wurden die Mäuse in die
Kammern des Ganzkörperplethysmographen gesetzt und steigenden Dosen (12,5; 25; 50,
100 mg/ml) des Bronchokonstriktums MCh (Methacholin) ausgesetzt, welches als vernebeltes
Aerosol in die Kammer einströmte. Der Atemwegswiderstand wird als Penh (pause enhanced)
angegeben. Dabei handelt es sich um einen Parameter der veränderten Atemwegsfunktion.
Dieser errechnet sich aus der Exspirationszeit (Zeit in der 65 % des Volumens ausgeatmet
werden) und dem Quotienten aus der maximalen Exspirationshöhe (PEF) und der maximalen
Inspirationshöhe (PIF, s. Abb. 5-5 und Formel 5-1). Nach Gabe des Methacholins kommt es
zu einem deutlichen Anstieg der Penh, welcher bei Asthmatikern bzw. allergenkonfrontierten
Mäusen deutlich stärker ausfällt als bei Kontrollen (s. Abb. 5-5).
Abb. 5-5 Diagramm zum Verlauf der Atmung (nach www.buxco.com): Te = Expirationszeit; Rt = Zeit, um 65 % des
Volumens auszuatmen; PEF = Peak Expiratory Flow; PIF = Peak Inspiratory Flow
80
Material und Methoden
Formel 5-1 Berechnung der Penh: Te = Expirationszeit; Rt = Zeit, um 65 % des Volumens auszuatmen; PEF = Peak
Expiratory Flow; PIF = Peak Inspiratory Flow
Die
invasive
Lungenfunktionsmessung
wurde
mit
einem
computerkontrollierten
Kleintier-Kolben-Respirator (flexiVentTM) durchgeführt. Die Mäuse wurden zunächst mit
Pentobarbital narkotisiert. Anschließend wurde die Trachea freipräpariert, mit einem
waagrechten Schnitt zwischen zwei Knorpelspangen geöffnet, ein Trachealtubus eingeführt
und mit einem Faden fixiert. Daraufhin wurde der Tubus mit dem Endotrachealschlauch des
flexiVentTM verbunden. Mit diesem Respirator wurden die Mäuse mechanisch beatmet und
die Parameter der Atemwegsmechanik gemessen. Mittels Verneblers wurde zunächst PBS
aerosolisiert, welches als Basiswert diente. Zur Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve
wurden daraufhin 12.5, 25 und 50 mg/ml Methacholin in PBS vernebelt. Nach jeder Dosis
wurde der Atemwegswiderstand (Respiratory System Resistance, Rrs) erfasst. Dieser
errechnet sich aus dem Vergleich des pulmonalen Drucks und des Körperdrucks (Rrs[cm H2O
sek/ml]). Pro Dosis wurden 12 Einzelmessungen durchgeführt. Die je 12 Messwerte aller
Tiere einer Gruppe (z. B. PBS) wurden zusammengefasst und daraus der Mittelwert gebildet.
5.2.3.5 Gewinnung und Analyse der Bronchoalveolären Lavage (BAL)
An Tag 21 (Asthmamodell) bzw. an Tag 23 (Toleranzmodell), 24 Stunden nach der letzten
Allergenkonfrontation bzw. nach der invasiven Messung der AHR (Tag 20), wurden die
Mäuse entweder unter Verwendung von Ketamin / Xylazin sediert und anschließend durch
zervikale Dislokation getötet oder mittels Release eingeschläfert. Die Bronchoalveoläre
Lavage wurde nach einem standartisierten Protokoll durchgeführt (Maxeiner et al., 2007).
Dazu wurde zunächst die Trachea freigelegt, um die Mäuse anschließend intubieren zu
81
Material und Methoden
können. Unter Verwendung von je 800 µl Sterofundin wurde die Lunge zwei Mal lavagiert.
Die so erhaltene BAL-Flüssigkeit (BALF) wurde bei 1500 rpm für 5 min bei 4 °C
zentrifugiert, der Überstand abgenommen und für weitere Zytokinanalysen mittels ELISA bei
-20 °C gelagert. Das Zellpellet wurde in 1ml PBS resuspendiert und die Zellzahl bestimmt.
Daraufhin erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse der BAL-Zellen. Hierzu wurden
5 x 105 Zellen mit Antikörpern gegen CD3, CD45R, GR-1 und CCR3 für 30 min inkubiert
und anschließend analysiert.
5.2.3.6 Organpräperation
Am Ende des Experiments wurden die Mäuse entweder nach vorheriger Narkotisierung durch
zervikale Dislokation getötet oder mittels Release eingeschläfert. Unter sterilen Bedingungen
und nach Öffnen des Brustkorbes erfolgte die Entnahme der Lunge. Für histologische
Untersuchungen wurde ein Teil der Lunge in einer 4 % Formaldehyd Lösung fixiert. Ein
weiteres Stück der Lunge wurde entnommen und bei -80 °C gelagert, um später daraus RNA
zu isolieren. Die verbleibende Lunge wurde für die Gesamtzellisolation verwendet. Bei
einigen Versuchen erfolgte die Entnahme der Lymphknoten der Axillarregion, um ebenfalls
Gesamtzellen zu isolieren. Bei einigen Versuchen wurde auch die Milz entnommen, indem
die linke Flanke geöffnet wurde. Nach Entnahme der Organe wurde das Blut, welches sich in
der Körperhöhle angesammelt hat, mittels einer Spritze aufgenommen. Nach Koagulation
erfolgte ein Zentrifugationsschritt bei 1500 rpm für 30 min bei 20 °C. Das so erhaltene Serum
wurde abgenommen und bis zu weiteren Analysen bei -20 °C gelagert.
82
Material und Methoden
5.2.3.7 Gesamtzellisolation aus Lunge, Milz und Lymphknoten
Die Isolation der Gesamtzellen aus dem Lungengewebe bzw. aus der Milz erfolgte nach
einem in unserer Arbeitsgruppe etablierten und standardisierten Protokoll (Sauer et al., 2007).
Das Lungengewebe enthält viel Kollagen, in welches die Zellen eingebettet sind. Daher war
zunächst ein Verdau des Kollagens nötig. Dazu wurde die Lunge in eine Petrischale überführt,
mit Hilfe eines Skalpells in kleine Stücke geschnitten und anschließend in einer
Kollagenase/DNase-Lösung (s. 5.1.11.4) 45 min bei 37 °C unter ständigem horizontalem
Schütteln verdaut. Dieser erste Schritt war bei der Milz nicht nötig. Sie wurde, ähnlich wie die
verdaute Lunge, sofort mittels des Stempels einer Spritze durch ein Zellsieb der Porengröße
40 µm in ein 50 ml Röhrchen gedrückt, um so die Zellen zu vereinzeln. Nach einem
Zentrifugationsschritt (1500 rpm, 10 min, 4 °C) wurde der Überstand verworfen und das
Zellpellet in 10 ml ACK-Lyse Puffer (s. 5.1.11.4) 2 min bei Raumtemperatur inkubiert, um so
die Erythrozyten zu lysieren. Nach erneuter Zentrifugation (1500 rpm, 5 min, 4 °C) und
Verwerfen des Überstandes erfolgte ein Waschschritt mit 10 ml PBS, um störendes Fett
abzutrennen. Nach einer abschließenden Zentrifugation (1500 rpm, 5 min, 4 °C) wurde der
Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 10 ml PBS aufgenommen und die Zellzahl mittels
Trypanblau und einer Neubauerkammer bestimmt.
Um die Gesamtzellen aus den Lymphknoten zu isolieren, mussten diese zunächst durch ein
Zellsieb der Porengröße 40 µm gedrückt werden. Anschließend wurde die Zellsuspension
zentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C), der Überstand verworfen und die Zellen in 3 ml PBS
aufgenommen, um sie anschließend zu zählen.
5.2.3.8 Isolation der CD4+ T-Zellen und CD11c+ T-Zellen
Die Isolation der verschiedenen Zellpopulationen aus den Gesamtzellen der Lunge bzw. Milz
erfolgte mit Hilfe magnetischer Zellseperation der Firma Miltenyi Biotec (MACS ®: Magnetic
83
Material und Methoden
activated cells sorting). Das Prinzip der Zellseperation beruht darauf, dass die zu isolierenden
Zellen mit einem Oberflächenmarker-spezifischen Antikörper, an den ein Magnet gekoppelt
ist („Bead“), markiert werden. Die Aufreinigung erfolgt über Säulen, die sich in einem
magnetischen Feld befinden. Für die Isolation wurde die Zellsuspension auf die Säulen
gegeben. Die unmarkierten Zellen passierten die Säule (negative Zellfraktion), wohingegen
die mit magnetischen Beads behafteten Zellen im Magnetfeld und somit auf der Säule
verblieben. Nach mehrmaligem Waschen wurden die Säulen mit der gewünschten positiven
Zellfraktion aus dem Magnetfeld entfernt, um anschließend die Zellen von der Säule zu
eluieren.
Um CD4+ T-Zellen aus der Lunge und der Milz bzw. CD11c+ T-Zellen aus den Gesamtzellen
der Lunge zu isolieren, wurden die Zellen zunächst in MACS-Puffer (s. 5.1.11.4)
aufgenommen (CD4+ T-Zellen: 90 µl Puffer/107 Zellen; CD11c+ T-Zellen: 400 µl Puffer/108
Zellen). Anschließend gab man die magnetischen Beads hinzu (CD4+ T-Zellen: 10 µl
Beads/107 Zellen; CD11c+ T-Zellen: 100 µl Beads/108 Zellen) und inkubierte die Zellen für
15 min bei 4 °C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von MACS-Puffer (1-2 ml/107 Zellen)
abgestoppt und die Zellsuspension daraufhin zentrifugiert (300 g, 10 min, 4 °C). In der
Zwischenzeit wurden die MACS-Säulen in der MACS-Vorrichtung befestigt und mit
MACS-Puffer äquilibriert. Nach dem Zentrifugationsschritt wurde der Überstand verworfen
und die Zellen in 500 µl MACS-Puffer pro 108 Zellen aufgenommen und anschließend auf die
Säule gegeben. Daraufhin wurden die Säulen dreimal mit je 500 µl MACS-Puffer gespült.
Der so erhaltene Durchfluss enthielt die unmarkierte negative Zellfraktion. Nach den
erfolgten Waschschritten wurden die Säulen aus dem Magnetfeld enfternt und die Zellen mit
1 ml Puffer in ein frisches 15 ml Röhrchen eluiert.
84
Material und Methoden
5.2.3.9 Zellkultur der isolierten CD4+ und CD11c+ Lungenzellen
Die isolierten Gesamtzellen bzw. Zellpopulationen wurden zu einer Konzentration von
1 x 106 Zellen/ml in Zellkulturmedium (s. 3.1.10.3) aufgenommen und ausgesät. Mittels antiCD3 und anti-CD28 Antikörper wurden die T-Zellen während der Kultur stimuliert, damit
diese Zytokine produzierten und freisetzten. Dafür wurde die Zellkulturplatte zuvor mit
2 µg/ml anti-CD3 in 0,5 M NaHCO3 beschichtet (s. 3.1.10.3), eine Stunde bei 37 °C und 5 %
CO2 inkubiert und abschließend mit PBS gewaschen. Anti-CD28 (2 µl/ml Medium) wurde in
löslicher Form direkt dem Zellkulturmedium zugesetzt. Die Zellen wurden für 24 h bei 37 °C
und 5 % CO2 kultiviert. Nach der Inkubationszeit wurde das Medium abgenommen und bei
-20 °C bis zu weiteren Analysen gelagert. Die Zellen wurden in PeqGoldRNAPureTM zur
späteren RNA-Extraktion geerntet und bei -80 °C aufbewahrt.
5.2.3.10 Transfektion der CD4+ T-Zellen der Milz mit Il-17a siRNA
Wie in Kapitel 5.2.3.8 beschrieben, wurden aus den Gesamtzellen der Milz CD4+ TLymphozyten aufgereinigt. Anschließend wurden die Zellen kultiviert, um sie dann für die
Transfektion mit Il-17a siRNA (small interfering RNA) zu verwenden. Die Zellen wurden
jeweils zu einer Konzentration von 1 Millionen Zellen/ml in Kulturmedium 5.1.11.4
aufgenommen und entweder mit IL-6 oder unter sogenannten Th17-skewing Bedingungen
kultiviert. Für die Kultur mit IL-6 wurden die Zellen in Anwesenheit von rIL-6 (20 ng/ml) für
24 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Für das Th17-skewing der CD4+ T-Zellen der Milz
wurde zunächst eine Zellkulturplatte mit CD3 (2 µg/ml) beschichtet und daraufhin die
Zellen mit IL-4 (10 µg/ml), IFN- (10 µg/ml), CD28 (2 µg/ml), TGF- (2 ng/ml) und
IL-6 (20 µg/ml) in Kulturmedium (s. 5.1.11.4) für drei Tage kultiviert. Anschließend wurden
die Zellen gesplittet und neues Medium mit CD28 (2 µg/ml) zugesetzt und für weitere zwei
Tage bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der jeweiligen Kultur wurden die Überstände
85
Material und Methoden
abgenommen und bei -20 °C aufbewahrt, wohingegen die Zellen für die Transfektion benutzt
wurden.
Bei der siRNA handelt es sich um kurze, doppelsträngige Ribonukleinsäure-Moleküle von 20
– 25 bp Länge. Sie kodieren nicht für ein Protein, sondern unterdrücken die Expression von
Genen. Dazu wird die siRNA in die Zellen (Transfektion) eingebracht, wo sie an einen
zellulären Endonukleasekomplex, RISC (RNA-induced silencing complex) binden, was zu
einer Trennung der siRNA Stränge führt. Der Antisense Strang bindet daraufhin im RISC an
seine komplementäre mRNA, woraufhin diese mRNA durch Nucleasen im RISC hydrolisiert
wird. Somit sinken die mRNA-Spiegel und zeitlich versetzt auch die Konzentrationen des
entsprechenden Proteins (Fire et al., 1998; Schütt and Bröker, 2009).
Für die Transfektion der CD4+ T-Zellen wurde eine Il-17a siRNA verwendet. Bei der
verwendeten Il-17a siRNA handelte es sich um ein sogenanntes „Set of 4“. Das bedeutet, dass
zunächst vier verschiedene siRNA Sequenzen zur Verfügung standen, aus denen durch
Vorversuche die am besten geeignetste ermittelt wurde. Die Il-17a siRNA wurde unter
Verwendung der 4D-NucleofectorTM X Unit und unter Zuhilfenahme des AmaxaTM
4D-NucleofectorTM Protokolls für murine T-Zellen (Lonza) gemäß Herstellerangaben in die
Zellen eingeschleust. Dazu wurden die Zellen nach der Kultur geerntet, die Zellzahl ermittelt
und die benötigte Anzahl an Zellen abgenommen und zentrifugiert (10 min, 90 g, RT). Nach
Verwerfen des Überstandes und Aufnahme in 4D-NucleofectorTM Lösung, wurden die Zellen
in die Vertiefungen der NucleocuvetteTM überführt. Nach Zugabe der Il-17a siRNA (150nM),
pmaxGFPTM (green fluorescent protein) oder beide in Kombination, wurde die
NucleocuvetteTM in der 4D-NucleofectorTM X Unit platziert und die siRNA mittels eines
spezifischen Pulses in die Zellen eingeschleust. Als Kontrolle diente eine Kondition, bei der
der Puls fehlte. Als weitere Kontrolle dienten unbehandelte Zellen, welche auch nicht in der
4D-NucleofectorTM X Unit waren. Nach 24 h Zellkultur wurden die Überstände abgenommen,
86
Material und Methoden
um sie bis zu weiteren Analysen aufzubewahren. Die Zellen wurden geerntet und bei -80 °C
für weitere Analysen gelagert.
5.2.3.11 Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark
Für die Isolation des Knochenmarks wurden die Mäuse zunächst nach vorheriger
Narkotisierung durch zervikale Dislokation getötet oder mittels Release® eingeschläfert. Die
weiteren Arbeitsschritte erfolgten unter sterilen Bedingungen. Die Hinterbeine wurden
zunächst oberhalb des Hüftgelenks abgetrennt, so dass der Knochen geschlossen blieb und
anschließend wurden die Knochen freigelegt. Daraufhin erfolgte die Trennung des Ober- und
Unterschenkelknochens, indem das Bein vorsichtig entgegen der Beugerichtung gebogen
wurde. Zur Desinfektion wurden die einzelnen Knochen für 3 – 5 min in eine Petrischale mit
70 % Ethanol gelegt und anschließend in eine Petrischale mit PBS überführt. Der jeweilige
Knochen wurde am oberen und unteren Ende mit Hilfe einer Schere geöffnet. Mittels einer
sterilen 10 ml Spritze, einer Kanüle und sterilem PBS wurde das Knochenmark aus dem
Knochen in ein steriles 50 ml Röhrchen gespült, bis der Knochen statt einer rötlichen eine
weiße Färbung aufwies. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (1500 rpm,
5 min, 4 °C), die Zellen in 10 ml Kulturmedium (s. 5.1.11.6) aufgenommen und die Zellzahl
bestimmt. Danach wurde die Zellsuspension in eine 10 ml Zellkulturflasche überführt und die
Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für vier Wochen kultiviert. Während dieser Zeit wurden die
Zellen einmal pro Woche mit neuem Kulturmedium versorgt und in diesem Zuge auch
gezählt. Nachdem mittels Durchlusszytometrie festgestellt wurde, dass mindestens 85 % der
Zellen c-kit und FcεRI positiv waren, wurden die Zellen für weitere Experimente verwendet.
87
Material und Methoden
5.2.3.12 Histamin-Release
Um das Histamin aus den Mastzellen freizusetzen, wurde ein sogenannter „Histamin-Relase“
durchgführt. Dazu wurden die generierten Mastzellen zu einer Konzentration von
1 x 106 Zellen/ml in 1 ml warmen (37 °C) Tyord´s Puffer (s. 5.1.11.7) aufgenommen und für
5 min
bei
37 °C
inkubiert.
Anschließend
wurden
0,66 µl
PMA
(Phorbol-12-myristate-13-acetate) und 0,5 µl Ionomycin zugegeben und für weitere 10 min
bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml kaltem Tyrod´s Puffer
abgestoppt und die Zellsuspension anschließend bei 200 g und 4 °C für 5 min zentrifugiert.
Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Zellpellet in 3 ml
Tyrod´s Puffer resuspendiert. Dann wurde das Probenmaterial im Wasserbad gekocht und
anschließend bei -20 °C gelagert.
5.2.4 Infektion von Zellen mit dem Rhinovirus 1b
Für einige Experimente wurden humane A549 Zellen bzw. murine Zellen mit dem Rhinovirus
1b (RV1b, s. 5.1.10) infiziert. Um die isolierten Zellen zu infizieren, wurden diese 1 h bei
Raumtemperatur unter ständigem Schütteln mit dem RV1b (500 µl Virussuspension/1x106
Zellen) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von Medium gewaschen,
zentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C) und zu einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml im
Zellkulturmedium (s. 5.1.11.2; 5.1.11.4) aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen für
24 h bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
5.2.5 Rhinovirus PCR
Um den Nachweis zu erbringen, dass die Infektion der Zellen mit dem RV1b erfolgreich war,
wurde eine PCR durchgeführt. Dazu wurde zuerst RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben
88
Material und Methoden
(s. 5.2.6 und 5.2.8). Daraufhin wurde die PCR dann in Anlehnung an vorherige Publikationen
(Papadopoulos et al., 2000; Tuthill et al., 2003) durchgeführt. Dazu wurden 2 µl cDNA, je
0,5 µl Primer, 4,5 µl DEPC-Wasser und 12,5 µl KAPA2G Fast Ready Mix eingesetzt. Die
Primer OL 26 und OL 27 (s. 5.1.8) sind komplementär zu der Antisense-RNA in den
Positionen 542-557 und 169-185 in der 5´-nicht-kodierenden Region des RV1b. Die PCR
verlief über 32 Zyklen und begann mit der Denaturierung bei 94 °C für 30 sek gefolgt von der
Primerhybridisierung (primer annealing) bei 50 °C für 30 sek und der Elongation bei 72 °C
für 2 min und einem post-PCR-Extending Schritt bei 72 °C für 4 min. So entstand ein 380 bp
schweres Amplikon, welches mit Hilfe des QIAxcel Advanced Systems analysiert und
quantifiziert wurde.
5.2.6 RNA-Extraktion
Die RNA-Isolation aus dem Probenmaterial beruhte auf der Phenol-Chlorofom ExtraktionsTechnik. Die Zellen wurden entweder direkt nach der Isolation oder nach Beendigung der
Zellkultur in PeqGoldRNAPureTM oder in QUIazol® Lysis Reagent (PBMCs nach 48 h
Kultur) aufgenommen. Das Lungengewebe wurde vor der eigentlichen RNA-Extraktion
zunächst in 1 ml PeqGoldRNAPureTM homogenisiert. Die Isolation der RNA aus Zellen und
Gewebe erfolgte bei beiden verwendeten Reagenzien nach demselben Protokoll. Zunächst
musste das Probenmaterial im jeweiligen Lysereagenz für 5 min bei Raumtemperatur
inkubieren, wodurch es zur Dissoziation der Nukleotidkomplexe kam. Anschließend wurde
Chloroform hinzugegeben und das Probenmaterial nach der Homogenisierung für 3 min bei
4 °C inkubiert. Nach der Zentrifugation (12 000 g, 5 min, 4 °C) kam es zur Phasentrennung.
In der unteren organischen Phenol-Chloroform-Phase und in der Interphase befinden sich
DNA und Proteine, wohingegen in der oberen wässrigen Phase die RNA vorliegt. Die
wässrige Phase wurde vorsichtig abdekantiert, in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert und
89
Material und Methoden
nochmals mit Chloroform homogenisiert, um die Effizienz und Reinheit der Extraktion zu
steigern. Die Proben wurden nochmals zentrifugiert (12 000 g, 5 min, 4 °C), was zur erneuten
Phasentrennung führte. Die obere wässrige Phase wurde wiederum abgenommen. Durch
Zugabe von Isopropanol und Glykogen (10 mg/ml) kam es zur Präzipitation der RNA. Nach
Mischen der Proben wurden diese für 15 min bei 4°C inkubiert und anschließend zentrifugiert
(12 000 g, 10 min, 4 °C), wodurch die RNA pelletierte. Das Pellet wurde zweimal mit 70 %
Ethanol gewaschen und anschließend an der Luft zu getrocknet. Abschließend wurde die
RNA in 20 µl Nuklease-freiem Wasser aufgenommen und bei 65 °C gelöst. Unter
Verwendung von 1 µl Probenmaterial erfolgte die Bestimmung der RNA-Konzentration
mittels Nanodrop®-Spektrophotometer.
5.2.7 Microarray
Die aus murinem Lungengewebe isolierten CD4+ T-Zellen wurden mittels Microarray
analysiert. Microarrays dienen der RNA-Expressionsanalytik. Dazu werden Tausende von
Genen, welche durch Oligonukleotide repräsentiert werden, in einer definierten Anordnung
(array) als mikroskopisch kleine Punkte an Glasobjektträger gekoppelt. Die Oligonukleotide
dienen als zur Probe komplementäre „Fängermoleküle“. Für die Analyse wurde der
GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array der Firma Affymetrix verwendet und laut
Herstellerangaben durchgeführt. Zunächst wurde die Qualität der zu untersuchenden mRNA
überprüft und anschließend in cDNA umgeschrieben. Nach einem Aufreinigungsschritt
erfolgte eine in vitro Transkription, bei der biotinylierte cRNA produziert wurde. Die
Biotinylierung ermöglicht die spätere Detektion mittels Floureszenzmarker. Danach wurden
die cRNA-Ketten hydrolisiert un zu einem Hybridisierungscocktail hinzugefügt und auf den
Genchip aufgetragen. Bei dem Hybridisierungsschritt gehen zueinanderpassende Moleküle
eine Bindung ein. Danach wurde die Platte gewaschen und unspezifisch gebundene Moleküle
90
Material und Methoden
entfernt. Um anschließend die Bindungen sichtbar zu machen, wurde mit einem
Fluoreszenzmarker gefärbt. Mit einem Scanner wurde das Fluoreszenzsignal für jeden Punkt
des Microarrays detektiert. Anhand des Fluoreszenzsignals kann die Menge der gebunden
Probe ermittelt und somit die Expressionswerte der verschiedenen Gene bestimmt werden.
Die erhaltenen Daten des Arrays wurden als sogenannte Heatmap dargestellt. Die Analyse des
Probenmaterials sowie die Auswertung der Genexpressionsprofile erfolgte in freundlicher
Kollaboration mit Dr. Arif Ekici und Dr. Fulvia Ferrazzi, Institut für Humangenetik,
Universitätsklinikum Erlangen.
5.2.8 cDNA-Synthese
Für die Synthese der cDNA (complementary DNA) wurden 100 – 1000 ng Gesamt-RNA
eingesetzt. Dazu wurde das entsprechende Volumen RNA abgenommen und mit
DEPC-Wasser auf 11 µl verdünnt. Es folgte die Zugabe von 5 x Reaktionspuffer, 1 mM
dNTPs, 200 U RevertAidTM Reverse Trankskriptase , 20 U RiboLockTM RNase Inhibitor und
0,5 µg Random Hexamer Primer, so dass sich ein Endvolumen von 20 µl ergab. Daraufhin
schloss sich eine Inkubation von 5 min bei 25 °C an, um die Primer zu aktivieren. Die
eigentliche cDNA-Synthese fand bei 42 °C für eine Stunde statt, der optimalen Temperatur
für die Aktivität der Reversen Transkriptase. Durch fünfminütige Denaturierung der Reversen
Transkriptase bei 70 °C wurde die Reaktion terminiert. Die cDNA wurde zu einer
Endkonzentration von 5 ng/µl mit DEPC-Wasser verdünnt und bis zur weiteren Verwendung
bei -20 °C gelagert.
91
Material und Methoden
5.2.9 Quantitative real-time PCR (qPCR)
Die quantitative real-time PCR (qPCR) ermöglicht es, gemäß den Prinzipien einer PCR,
Nukleinsäuren zu vervielfältigen und diese in Echtzeit mittels einer Fluoreszensmessung nach
jedem Zyklus zu quantifizieren. Der Floureszenzfarbstoff, z. B. SYBR ®-Green, interkaliert
mit der doppelsträngigen DNA und flouresziert. Somit ist die Floureszenzintensität einer
Probe direkt proportional zu ihrem Gehalt an doppelsträngiger DNA. Die Quantifizierung der
DNA wird in der exponentiellen Phase der PCR durchgeführt. Das Gerät ermittelt dabei den
sogenannten Schwellenwert-Zyklus (Ct = threshold cycle). Dabei handelt es sich um den
PCR-Zyklus, bei dem sich die Floureszenzintensität stark von der Hintergrundfluoreszenz
unterscheidet und einen bestimmten Schwellenwert erreicht hat. Um zu gewährleisten, dass
nur das gewünschte PCR-Produkt amplifiziert wurde und keine anderen PCR-Produkte oder
Primer-Dimere, wird nach dem letzten Zyklus eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt.
Dazu wird die Temperatur kontinuierlich von 50 °C auf 95 °C erhöht, woraufhin die DNA
aufgeschmolzen wird. Bei einer für das Fragment spezifischen Temperatur denaturiert die
doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge und setzt den Floureszenzfarbstoff frei. Die
Floureszenzintensität nimmt somit ab und kann detektiert werden. Da das spezifische
PCR-Produkt eine höhere Schmelztemperatur als Primer-Dimere oder ungewünschte
PCR-Produkte aufweist, dient die Schmelzkurvenanalyse als Qualitätskontrolle.
Für die vorliegende Arbeit wurde mit dem Gerät CFX96 der Firma Bio-RAD sowie mit dem
Floureszenzfarbstoff-enthaltenden SsoFast™ EvaGreen® Supermix gearbeitet. In eine 96 well
Platte wurden zunächst 17 µl eines Mastermixes bestehend aus 10 µl SsoFast™ EvaGreen®
Supermix und Primern (125 pmol/ml) vorgelegt. Anschließend wurde 3 µl cDNA
hinzugegeben. Die Analyse des Probenmaterials erfolgte immer im Duplikat. In Tabelle 5-10
sind die Sequenzen der verwendeten humanen und murinen Oligomere aufgelistet. Die PCR
setzte sich aus 50 Zyklen zusammen. Dabei wurde die Polymerase zu Beginn bei 98 °C für
92
Material und Methoden
2 min aktiviert. Daran schloss sich die Denaturierung (95 °C, 5 sek), sowie die Hybridisierung
und Elongation bei 60 °C für 10 min an. Als Referenzgen (Housekeeping gene) diente die
HPRT (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase), ein nicht-reguliertes Gen, welches
unabhängig von Zelltyp, Zellstadium und äußeren Einflüssen ubiquitär exprimiert wird.
Für die Quantifizierung wurde die ΔΔCt-Methode (s. Formel 5-2) herangezogen, bei der die
n-fache Expression berechnet wird. Hierfür wurde der Ct-Wert benötigt, welcher von der
CDX96 Software ermittelt wurde. Der Ct-Wert des Zielgens wurde zunächst auf den Ct-Wert
des Referenzgenes bezogen (ΔCt-Wert). Anschließend wurde aus den ΔCt-Werten der
Bezugsgruppe (z. B. Wild-Typ PBS Mäuse bzw. gesunde Kontrollkinder) der Mittelwert
berechnet. Dieser Mittelwert wurde anschließend vom ΔCt-Wert jeder einzelner Probe
subtrahiert. Dies ergab den ΔΔCt-Wert. Abschließend wurde die Expression (E) berechnet.
Formel 5-2 ∆∆Ct Methode zur Berechnung der relativen Quantifizierung
5.2.10 Durchflusszytometrie
Bei der Durchlusszytometrie handelt es sich um ein Verfahren, bei dem Oberflächenmoleküle
und intrazelluläre Proteine quantitativ bestimmt werden. Das Prinzip beruht auf einer
Antigen/Antikörper-Reaktion. Dazu werden die Zellen mit Floureszenzfarbstoff-markierten
spezifischen Antikörpern gefärbt. Die Zellen liegen als Suspension vor und werden im
Durchflusszytometer vereinzelt. So gelangen sie in die Durchflusszelle, in der sie durch
Laserlicht angeregt werden. Das dabei erzeugte Streu- und Floureszenzlicht wird separat
detektiert. Beim Streulicht unterscheidet man Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter)
welches Aufschluss über das Volumen der Zelle gibt, sowie das Seitwärtsstreulicht (SSC =
Side Scatter), welches Rückschlüsse auf die Granularität, Größe und Struktur der Zelle
93
Material und Methoden
zulässt. Wenn die Floureszenz-markierten Zellen den Laser passieren, werden die
Flourochrome der auf den Zellen gebundenen Antikörper angeregt und emittieren Licht
charakteristischer Wellenlänge. Dieses Emissionssignal wird detektiert und ist direkt
proportional zur Menge des gebundenen Antikörpers. Da gleichzeitige Mehrfachfärbungen
möglich sind und die Zellen so innerhalb kürzester Zeit analysiert werden können, gilt die
Durchlusszytometrie als multiparametrisches Analyseverfahren, mit der Zellen charakterisiert
werden können.
Die Messungen erfolgten mit dem FACS-CaliburTM der Firma BD Bioscience. Das Gerät
verfügt über einen Argon Laser (488 nm) und eine rote Laserdiode (̴ 635 nm). Das emittierte
Licht wird über die Detektoren FL 1-4 erfasst. In Tabelle 5-12 sind die verwendeten
Flourochrome mit den dazu passenden Detektoren angegeben. Die Messung wurde über die
Software BD CellQuestTM Pro gesteuert und mittels der Software FlowJo (Treestar, Can
Carlos, USA) ausgewertet.
Flourochrom
Alexa 488
FITC
PE
PerCP
PerCP/Cy5.5
Alexa 647
APC
Detektor
FL-1
FL-1
FL-2
FL-3
FL-3
FL-4
FL-4
Tabelle 5-12 Übersicht über verwendete Flourochrome und deren Detektoren
Je nachdem, ob sich das nachzuweisende Antigen auf der Zelloberfläche befindet oder in der
Zelle exprimiert wird, unterscheidet man zwischen der Oberflächen- und der intrazellulären
Färbung.
94
Material und Methoden
5.2.10.1 Oberflächenfärbung
Um Oberflächenmarker anzufärben, wurden 5 x 105 Zellen verwendet und mit einem
Färbemix aus PBS und dem jeweiligen Antikörper für 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert.
Um die Reaktion abzustoppen und ungebundenen Antikörper zu entfernen, wurde 200 µl PBS
hinzugegeben und die Zellsuspension (1500 rpm, 5 min, 4 °C) zentrifugiert. Abschließend
wurden die Zellen in 200 µl PBS aufgenommen und im Durchflusszytometer analysiert. Falls
die Messung nicht direkt erfolgen konnte, wurden die Zellen in 2 % Paraformaldehyd fixiert
und bei 4 °C im Dunkeln gelagert.
5.2.10.2 Intrazelluläre Färbung
Für die intrazelluläre Färbung wurden 1 x 106 Zellen verwendet. Zunächst wurden, wie vorher
beschrieben, die Oberflächenmoleküle markiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen
und fixiert. Dazu wurden die Zellen in 100 µl Permfix-Lösung (1:4 verdünnt, eBioscience)
aufgenommen und bei 4 °C für 35 min inkubiert. Nach der Zentrifugation (1500 rpm, 5 min,
4°C)
erfolgte
die
Permeabilisierung
der
Zellmembranen.
Hierfür
wurde
50 µl
Permash-Lösung (1:10 verdünnt, eBioscience) zu den Zellen gegeben, welche den gelösten
intrazellulären Antikörper enthielt. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 4 °C im
Dunkeln wurde die Reaktion durch Zugabe von 200 µl Permwasch-Lösung abgestoppt, die
Zellsuspension zentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C) und die Zellen abschließend in 200 µl
PBS resuspendiert und im Durchflusszytometer analysiert. Zusätzlich zu der Oberflächenbzw. intrazellulären Färbung wurden Einzelfärbungen mitgeführt, um das Gerät vor der
Messung optimal einstellen zu können.
95
Material und Methoden
5.2.11 Enzyme linked Immunosorbent Assay
Der ELISA (enzyme linked Immunosorbent Assay) wurde für die Quantifizierung von
Zytokinen in murinen und humanen Zellkulturüberstanden bzw. BALF, sowie von
Immunglobulinen aus dem Serum benutzt. Außerdem wurde die Konzentration an Histamin
in Zellkulturüberständen detektiert. Die Basis dieser Methode bildet eine Antigen/AntikörperReaktion, wobei in der vorliegenden Arbeit in der Regel sogenannte „Sandwich-ELISAs“
verwendet wurden, bei dem das nachzuweisende Antigen am Ende gebunden zwischen zwei
Antikörpern vorliegt, an die das Enzym Meerretichperoxidase (=horse-radish-peroxidase,
HRP) gekoppelt wird. Durch die Zugabe des Substrats TMB (Tetramethylbenzidin) kommt es
zu einer Farbreaktion, über die der Gehalt an Antigen bestimmt werden kann.
Die verwendeten ELISAs lagen als Fertigsysteme vor und wurden gemäß Herstellerangaben
durchgeführt. Zunächst erfolgte die Kopplung des Fängerantikörpers (Captur-Antikörper),
welcher spezifisch für das zu analysierende Antigen ist, an eine feste Phase, d. h. die
Plastikoberfläche der Kavitäten einer 96 well Platte. Dies geschah über Nacht, wobei der
Capture-Antikörper gelöst in einem Capture-Puffer (Carbonatpuffer oder Phosphatpuffer, s.
5.1.11.5) vorlag. Am nächsten Tag wurde die Platte mit Waschpuffer (s. 5.1.11.5) gewaschen,
um ungebundene Antikörper zu entfernen. Anschließend wurden für eine Stunde mit BSAoder FCS-haltigen Puffer freie Proteinbindungsstellen geblockt, um unspezifische Signale zu
reduzieren. Daraufhin erfolgte ein erneuter Waschschritt, um dann die Antigen-haltigen
Proben aufzutragen. Es bildeten sich nun Antigen/Antikörper-Komplexe. Zusätzlich wurde
eine genau definierte Standardreihe des zu detektierenden Antigens aufgetragen. Nach Ablauf
der zweistündigen Inkubationszeit wurde die Platte gewaschen, um überschüssige Antigene
zu entfernen. Im nachfolgenden Schritt gab man einen biotinylierten Zweitantikörper
(Detection-Antikörper) zu und inkubierte die Platte für 1 h bei Raumtemperatur. Hierbei ist es
wichtig, dass dieser Antikörper ein anderes Epitop des Zielmoleküls erkennt als der
96
Material und Methoden
Fängerantikörper. Je nach verwendetem Protokoll wurde die an Streptavidin gebundene HRP
gleichzeitig oder in einem anschließenden Inkubationsschritt zugegeben. Dieses bindet an die
biotinylierten Antikörper, sodass es zur Bildung eins Sandwich-Komplexes kam. Nach
erneutem Waschen wurde eine TMB-Substratlösung (s. 5.1.11.5) auf die Platte gegeben. Die
HRP oxidiert das TMB, wodurch ein blaues Produkt entsteht. Die Blaufärbung korreliert
dabei positiv mit der Menge des zu untersuchenden Antigens. Die Reaktion wurde nach ca.
10 min durch Zugabe 30 % H2SO4 abgestoppt, was einen Farbumschlag von blau nach gelb
zur Folge hatte. Die Absorption dieses Reaktionsproduktes wurde anschließend mittels eines
Photometers bei 450 nm ermittelt. Unter Berücksichtigung der Standardverdünnungsreihe
konnte die in den Proben enthaltene Antigen-Konzentration bestimmt werden.
Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase Aktivität in Zellkulturüberständen
Die LDH (Lactat-Dehydrogenase) ist eine Oxidoreduktase und spielt innerhalb des anaeroben
Stoffwechsels eine wichtige Rolle, da sie die Bildung von Lactat und NAD+
(Nicotinamidadenindinukleotid) aus Pyruvat und NADH katalysiert. Dieses Enzym ist sehr
stabil und kommt in den Zellen nahezu aller Lebewesen vor. Zellen setzen die LDH z. B. nach
Verletzungen des Gewebes in die Blutlaufbahn frei. Deshalb wird die LDH Aktivität dazu
genutzt, eine Beschädigung des Gewebes nachzuweisen. Bei dem verwendetem LDH Assay
Kit wird NAD+ durch die LDH zu NADH reduziert, wobei es zusammen mit einem im
Substrat enthaltenen Bestandteil zu einem Farbumschlag kommt, der bei 450 nm detektiert
werden kann. Das LDH Assay Kit wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt.
Zunächst wurde in einer 96 well Platte eine Standardreihe mit unterschiedlichen
Konzentrationen an NADH vorbereitet. Danach wurde das Probenmaterial in Form von
Zellkulturüberständen auf die Platte aufgetragen und ggf. mit LDH-Assay-Puffer verdünnt.
Anschließend wurde in jede Vertiefung der Platte ein Master Mix bestehend aus
97
Material und Methoden
LDH-Assay-Puffer und LDH-Substrat-Mix gegeben, die Platte für 2 - 3 min unter leichtem
Schütteln inkubiert und danach die sogenannte Initialmessung bei 450 nm ((A450)initial)
durchgeführt. Daraufhin wurde die Platte bei 37 °C inkubiert und in regelmäßigen Abständen
Messungen durchgeführt, bis der Wert der aktivsten Analyseprobe den höchsten Standardwert
(12,5 nmol/well) überstieg. Für die spätere Berechnung wurden die Daten der letzten
Messung ((A450)final) verwendet, bevor der Wert des höchstens Standards überschritten
wurde. Die LDH Aktivität wird als nmol/min/ml = milliunits/ml angegeben. Eine Einheit
LDH Aktivität ist definiert als die Menge des Enzyms, welche benötigt wird, um die
Umwandlung von Lactat in Pyruvat zu katalysieren, um so 1 µmol NADH pro Minute bei
37 °C zu generieren (s. Formel 5-3).
Formel 5-3 Berechnung der LDH Aktivität
5.2.12 Histologie
Für histologische Analysen wurde murines Lungengewebe entnommen und zunächst in 4 %
Formaldehyd-Lösung fixiert. Nach Einbettung in Paraffin wurden 3 – 5- µm dicke Schnitte
angefertigt und mittels standardisierter Protokolle in freundlicher Kollaboration von den
Mitarbeitern des Instituts für Pathologie (Universitätsklinikum Erlangen), gefärbt. Mittels HE
(Haematoxylin-Eosin)
gefärbten
Schnitten,
wurde
der
Grad
der
Entzündung im
Lungengewebe ermittelt (Doganci et al., 2008b). Dabei färbt das Haematoxylin alle sauren
bzw. basophilen Strukturen, wie z. B. auch Zellkerne mit enthaltener DNA, blau an. Eosin
lässt alle acidophile bzw. basische Strukturen (z. B. Zellplasmaproteine, endoplasmatisches
98
Material und Methoden
Retikulum und Kollagen) rot erscheinen. Um Informationen über die Mucusproduktion zu
erhalten, wurde die PAS-Reaktion (Periodic Acid Schiff Reaction) angewandt. Hierbei
werden u. a. neutrale Mucopolysaccaride und Mucoproteine magenta-rot angefärbt.
5.2.13 Statistik
Bei der Analyse der humanen Daten wurden die Kinder entsprechend der angegeben Gruppen
analysiert. Gezeigt sind Daten des ersten klinischen Besuchs. Die murinen Experimente
wurden 2 – 3 Mal durchgeführt mit jeweils 3 - 5 Tieren pro Versuchsgruppe. Gezeigt wurde
entweder ein repräsentatives Exeriment oder zusammengefasste Daten mehrer Experimente.
Für die Auswertung wurde jeweils das arithmetische Mittel der Messwerte gebildet, sowie der
Standardfehler (SEM = standard error of the mean) berechnet. Die Ergebnisse sind jeweils als
Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Messwerte wurden mit dem Student´s t-Test (PreDicta
Studie) bzw. der einfachen ANOVA (murine Studien) auf Signifikanz getestet. Dabei gilt:
* p ≤ 0,05 (schwach signifikant), ** p ≤ 0,01 (signifikant), *** p ≤ 0,001 (hoch signifikant).
99
Ergebnisse
6
Ergebnisse
IL-17A ist ein Zytokin mit entzündungsfördernden Eigenschaften, dessen Rolle im
Krankheitsbild Asthma bronchiale noch nicht vollständig geklärt ist. Es wird sowohl von
Zellen der angeborenen (z. B. Mastzellen), als auch der erworbenen (z. B. CD4+ T-Zellen)
Immunantwort gebildet. Bisher konnte gezeigt werden, dass IL-17A bei Patienten mit Asthma
vermehrt gebildet wird und v. a. zur Akkumulation von neutrophilen Granulozyten im
Lungengewebe beiträgt (Aujla and Alcorn, 2011). Weiterhin ist bekannt, dass IL-17A an der
mukosalen und epithelialen Abwehr und Bekämpfung von Pilzen und extrazellulären
Bakterien beteiligt ist (Hirota et al., 2011; Hirota et al., 2012). IL-17A spielt außerdem bei der
Immunpathophysiologie viraler Infektionen eine Rolle. Ziel der vorliegenden Arbeit war es,
neue Erkenntnisse über die Rolle des Zytokins IL-17A im allergischen Asthma bronchiale,
auch in Hinblick auf die Entstehung einer Atemwegstoleranz, zu erhalten. Weiterhin wurde
untersucht, welche Rolle IL-17A während der antiviralen Immunantwort bei bestehendem
Asthma bronchiale spielt. Zu diesem Zweck wurde sowohl humanes als auch murines
Probenmaterial untersucht.
6.1 Analyse des Phänotyps IL-17A defizienter Mäuse in einem Modell
allergischen Asthmas
Zunächst wurde untersucht, wie IL-17A defiziente (IL-17A(-/-), IL-17A ko) Mäuse in einem
murinen Modell allergischen Asthmas reagieren. Dazu wurde bei den Mäusen, wie in
Abschnitt 5.2.3.2 beschrieben, Asthma induziert. An den Tagen 20 bzw. 21 des Protokolls
wurden sie dann eingehender untersucht.
100
Ergebnisse
6.1.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation
Bei der Atemwegshyperreaktivität (AHR) handelt es sich um eines der charakteristischsten
Merkmale der Asthmaerkrankung. Die Messung der AHR erfolgte an Tag 20 des Protokolls,
sowohl mit einer nicht-invasiven als auch mit einer invasiven Plethysmographie. Dabei
ermittelt man die Reaktion auf ansteigende Konzentrationen des Arzneistoffs Methacholin
(MCh), welcher eine Obstruktion der Bronchien hervorruft. Die nicht-invasive Messung der
AHR zeigte, dass IL-17A(-/-) Mäuse sowohl im naiven (PBS) Zustand, als auch nach Induktion
des Asthmas durch OVA signifikant stärker auf MCh reagierten als die jeweiligen
Wildtyp-Mäuse (wt) (s. Abb. 6-1 A). Bei der invasiven Plethysmographie wiesen die IL-17A
defizienten und mit OVA behandelten Mäuse v. a. bei niedrigen Konzentrationen des
Methacholins
eine
erhöhte
AHR
auf.
Bei
der
höchsten
Konzentration
des
bronchokonstriktorischen Stoffes reagierten jedoch die erkrankten Wildtyp-Mäuse am
stärksten (s. Abb. 6-1 B).
Abb. 6-1 Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell: An Tag 20 des
Versuchsprotokolls wurde bei Wildtyp- und IL-17A ko Mäusen die Atemwegshyperreaktivität (AHR) gemessen. A) Die
Bestimmung der AHR mit Hilfe einer nicht-invasiven Ganzkörperplethysmographie ergab einen signifikanten Anstieg der
AHR sowohl bei naiven als auch bei erkrankten IL-17A(-/-) Mäusen im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen der jeweiligen
Gruppe. B) Die Messung der AHR mittels einer invasiven Methode zeigte, dass IL-17A(-/-) Mäuse nach der Asthmainduktion
v. a. auf niedrigere Dosen MCh verstärkt reagierten. Bei Dosen ab 25 mg/ml MCh konnte bei den erkrankten WildtypMäusen eine erhöhte AHR beobachtet werden.
101
Ergebnisse
6.1.2 Analyse
der
eosinophilen
und
neutrophilen
Granulozyten
in
der
bronchoalveolären Lavage
Beim allergischen Asthma bronchiale infiltrieren v. a eosinophile Granulozyten die Wände
der Atemwege, aber auch neutrophile Granulozyten wandern nach Kontakt mit einem
Allergen in die Lunge ein und tragen somit zur Entzündungsreaktion bei (Cohn et al., 2004).
Man geht davon aus, dass IL-17A die Akkumulation neutrophiler Granulozyten im
Lungengewebe fördert und so zur Entzündungsreaktion beiträgt (Sun et al., 2005).
Die BALF der Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse wurde durchflusszytometrisch analysiert.
Dafür wurden die Zellen mit Antikörpern gegen CD3, CD45R, CCR3 und Gr-1 inkubiert.
AbbildungAbb. 6-2 zeigt beispielhaft die sogenannte „Gating“-Strategie zur Analyse der
Granulozyten.
Abb. 6-2 „Gating“-Strategie zur Analyse eosinophiler und neutrophiler Granulozyten in der BAL: Eosinophile
Granulozyten zählen zu den CD3-CD45R-Gr-1+CCR3+-Zellen, wohingegen neutrophile Granulozyten zu den CD3-CD45RGr1+CCR3—Zellen gehören
Die eosinophilen Granulozyten sind in der Population der CD3-CD45R-Gr-1+CCR3+-Zellen
enthalten,
wohingegen
die
neutrophilen
Granulozyten
zu
den
CD3-CD45R-Gr-1+CCR3--Zellen gehören. Die Analyse der BAL-Zellen ergab, dass die
Anzahl der eosinphilen Granulozyten nach Induktion des Asthma bronchiale sowohl in den
Wildtyp-Mäusen als auch in den IL-17A defizienten Mäusen signifikant anstieg, wobei
innerhalb der PBS- bzw. OVA-Gruppe beider Stämme keine weiteren Unterschiede zu
erkennen waren (s. Abb. 6-3 A). Weiterhin konnte beobachtet werden, dass sich in den
102
Ergebnisse
Atemwegen der IL-17A(-/-) Mäuse sowohl im gesunden als auch im erkrankten Zustand
weniger neutrophile Granulozyten befanden als in den Wildtyp-Mäusen (s. Abb. 6-3 B).
Abb. 6-3 Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der BAL von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen
im allergischen Asthmamodell mit Hilfe der Durchlusszytometrie: Die Zellen der BAL wurden durchflusszytometrisch
analysiert. Hierfür wurden die Zellen mit Antikörper gegen CD3, CD45R, Gr-1 und CCR3 inkubiert. Eosinophile
Granulozyten gehören zu den CD3-CD45R-Gr-1+CCR3+-Zellen. Die neutrophilen Granulozyten zählen zu den
CD3-CD45R-Gr-1+CCR3--Zellen. A) Die Asthmainduktion führte bei beiden Genotypen zu einem signifikanten Anstieg der
eosinophilen Granulozyten. B) Bei gesunden und erkrankten IL-17A defizienten Mäusen waren im Vergleich zu
Wildtyp-Mäusen tendenziell weniger neutrophile Granulozyten nachweisbar.
6.1.3 Analyse der Mastzellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen
Mastzellen gehören einerseits zu den Effektorzellen der allergischen Typ I Sofortreaktion,
andererseits sind sie durch die Freisetzung von Zyokinen und Chemokinen an der Entstehung
einer Entzündungsreaktion beteiligt. Somit sind sie nicht nur Teil der akuten Reaktion
sondern auch der chronischen Entzündung (Busse and Lemanske, 2001; Mutschler et al.,
103
Ergebnisse
2008; Schütt and Bröker, 2009). Ihre Expansion wird u. a. durch IL-3, IL-4 und IL-9 gefördert
(Arinobu et al., 2009). Zunächst wurde die Konzentration von IL-3 in den Überständen der
BALF gemessen. Innerhalb der unbehandelten Gruppe deuteten die Ergebnisse auf eine
Reduktion von IL-3 in IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu wt Mäusen hin. Nach
Behandlung mit dem Allergen wiesen auch die Wildtyp-Mäuse geringere Konzentration des
Zytokins auf (s. Abb. 6-4 A). Die Genexpression des Interleukins 9 wurde in CD4+ T-Zellen
der Lunge untersucht. Es konnte in beiden Mausstämmen nach Auslösen der
Asthmaerkrankung ein signifikanter Anstieg der Il-9 mRNA Expression detektiert werden.
Der IL-17A-Gendefekt schien sich innerhalb dieser Gruppe außerdem in einer gesteigerten
Expression
dieses
Zytokins
auszuwirken
(s.
Abb.
6-4
B).
Mithilfe
der
durchflusszytometrischen Analyse wurde der Anteil an CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen in
der Lunge bestimmt. Bei gesunden Tieren ging die Abwesenheit des Zytokins IL-17A mit
einer Reduktion der CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen einher. Die Behandlung mit dem
Allergen OVA führte bei beiden Genotypen zu einem signifikanten Anstieg des analysierten
Zelltyps, wobei auch hier der Gendefekt eine tendenziell geringere Anzahl an
CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen hervorrief (s. Abb. 6-4 C und D).
104
Ergebnisse
Abb. 6-4 Analyse der Mastzellen in den Gesamtzellen der Lunge von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen: Die
Differenzierung von Mastzellen wird durch IL-3 und IL-9 gefördert. Deshalb wurden diese beiden Zytokine näher untersucht.
A) Die Konzentration von IL-3 wurde in der BALF gemessen. Gesunde IL-17A(-/-) Mäuse sezernierten tendenziell weniger
IL-3 als gesunde wt Mäuse. Das Auslösen der Asthmaerkrankung führte in wt Mäusen zu einer Reduktion der IL-3
Konzentration in der BALF. B) Die Il-9 Genexpression wurde in CD4+ T-Zellen der Lunge gemessen. Die Behandlung mit
OVA führte zu einer gesteigerten Genexpression bei beiden Mausstämmen, wobei der Gendefekt zu einem höheren Anstieg
der Il-9 mRNA Expression führte. C) Um Mastzellen in den Gesamtzellen der Lunge zu detektieren, wurden dafür zunächst
die ckit+FcεRIα+ Zellen ermittelt, um anschließend die CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellpopulation prozentual zu berechnen. D)
Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass sich in den Lungen gesunder IL-17A(-/-) Mäuse signifikant weniger
CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen befanden als bei wt Mäusen. Erkrankte Tiere beider Mausstämme wiesen eine erhöhte
Anzahl an Mastzellen auf, wobei IL-17A defiziente Mäuse tendenziell weniger Mastzellen in ihren Lungen hatten.
Um die Mastzellen der beiden Mausstämme weiter zu analysieren, wurden sie aus dem
Knochenmark generiert. Dazu wurde aus dem Ober- und Unterschenkel der Wildtyp- und
IL-17A(-/-) Mäuse das Knochenmark isoliert und anschließend für vier Wochen in
105
Ergebnisse
Anwesenheit von IL-3 und SCF kultiviert (s. 5.2.3.11). Einmal pro Woche wurde das
Kulturmedium gewechselt und zeitgleich die Zellzahl bestimmt. Hierbei fiel auf, dass aus
dem Knochenmark der IL-17A defizienten Mäuse deutlich weniger Mastzellen hervorgingen
als aus dem Knochenmark der Wildtyp-Mäuse (s. Abb. 6-5 A). Nach vier Wochen Zellkultur
wurde mittels Durchflusszytometrie festgestellt, dass mehr als 85 % der Zellen FcεRIckit+
waren (s. Abb. 6-5 B), zwei typische Oberflächenmarker für Mastzellen (Heneberg, 2011).
Wie zuvor erwähnt gehört IL-3 zu den Wachstumsfaktoren für Mastzellen. Dieses Zytokin
bindet an das Oberflächenmolekül CD123. Nachdem in Abwesenheit von IL-17A die
Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark beeinträchtigt war, wurde mittels
qPCR Analyse überprüft, ob diese Zellen den IL-3 Rezeptor überhaupt bilden. Es zeigte sich,
dass nach vier Wochen Zellkultur in den IL-17A defizienten Zellen sogar signifikant mehr
CD123 mRNA nachweisbar war als in den Wildtyp-Zellen (s. Abb. 6-5 C). Von den
generierten Mastzellen wurden auch Zytospins angefertigt, mit May-Grünwald-Giemsa
Lösung gefärbt und unter dem Mikroskop analysiert. Morphologisch betrachtet machte es den
Anschein, als hätten die IL-17A defizienten Zellen weniger vorgefertigte Botenstoffe in ihren
Granula gespeichert (s. Abb. 6-5 D). Ein Histamin-ELISA ergab, dass die Gesamtmenge an
Histamin im Überstand und Zellpellet der IL-17A defizienten Zellen sowohl unstimuliert als
auch nach Stimulation mit PMA/Ionomycin signifikant geringer war als in den Analyseproben
der Wildtyp-Zellen (s. Abb. 6-5 E). Betrachtete man nun den prozentualen Anteil an
freigesetztem Histamin, so zeigte sich, dass die Stimulation mit PMA/Ionomycin bei den
Zellen beider Genotypen zu einer verstärkten Freisetzung von Histamin führte, wobei die
IL-17A(-/-) Zellen tendenziell weniger Histamin freisetzten als die Zellen ohne Gendefekt (s.
Abb. 6-5 F).
106
Ergebnisse
Abb. 6-5 Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von naiven Wildtyp- und IL-17A defizienten
Mäusen: Für die Generierung von Mastzellen wurde das Knochenmark aus den Ober- und Unterschenkeln von wt und
IL-17A ko Mäusen isoliert und anschließend für vier Wochen in Anwesenheit von IL-3 und SCF kultiviert. A) Die
Zellzahl wurde einmal pro Woche bestimmt. Die jeweilige Zellzahl wurde ins Verhältnis zu den an Tag 0 isolierten
Knochenmarkszellen gesetzt. IL-17A(-/-) Zellen proliferierten signifikant weniger als wt Zellen. B) Nach vier Wochen
Kultur wurde mittels Durchflusszytometrie festgestellt, dass mindestens 85 % der Zellen FcεRIckit+ waren. C) Aus den
für 4 Wochen kultivierten Mastzellen wurde RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Mithilfe der qPCR Anlyse wurde
die CD123 mRNA Expression ermittelt. Es zeigte sich, dass in IL-17A defizienten Zellen die CD123 mRNA Expression
im Gegensatz zu wt Zellen erhöht war. D) Von den generierten Mastzellen wurden Zytospins angefertigt und mit MayGrünwald-Giemsa Lösung gefärbt. Mikroskopisch betrachtet erschien es, dass IL-17A ko Zellen weniger vorgefertigte
Botenstoffe in ihren Granula gespeichert hatten. E,F) Mit den generierten Mastzellen wurde ein Histamin Release
durchgeführt. Dazu wurden die Zellen zunächst mit PMA/Ionomycin stimuliert. In den Überständen und Zellpellets wurde
anschließend mittels ELISA die Histaminkonzentration gemessen. Die Gesamtmenge an Histamin (=
Histaminkonzentration im Überstand + Histaminkonzentration im Pellet) war bei IL-17A defizienten Zellen sowohl mit
als auch ohne vorherige Stimulation mit PMA/Ionomycin geringer als bei wt Zellen (E). Die Konzentration an
freigesetztem Histamin (= Verhältnis Histaminkonzentration im Überstand zu Histaminkonzentration im Pellet) stieg nach
Stimulation sowohl bei den wt- als auch bei den IL-17A ko Zellen an, wobei die IL-17A defizienten Zellen trotz
Stimulation tendenziell weniger Histamin freisetzten als die wt Zellen (F).
Es ist bereits bekannt, dass TGF- die IL-3 und IL-4 abhängige Proliferation von Mastzellen
aus dem Knochenmark negativ beeinflusst (Broide et al., 1989; Toyota et al., 1995). Aufgrund
dessen erfolgte eine weitere Analyse der Zellkulturüberstände, welche beim wöchentlichen
Wechsel
des
Kulturmediums
aufbewahrt
wurden
(s.
5.2.3.11).
Die
Konzentrationsbestimmung von TGF- mittels ELISA ergab, dass die IL-17A defizienten
107
Ergebnisse
Zellen zu jedem Zeitpunkt deutlich mehr TGF- freisetzten als die Mastzellen, welche aus
dem Knochenmark von Wildtyp-Mäusen generiert wurden. Für die Mastzellen beider
Genotypen galt, dass die freigesetzte Menge an TGF- nach einer Woche am höchsten war (s.
Abb. 6-6).
Abb. 6-6 TGF- Konzentration in den Kulturüberständen während der Generierung von Mastzellen aus dem
Knochenmark von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen: Während der Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark
von wt und IL-17A ko Mäusen wurde einmal pro Woche das Kulturmedium gewechselt. Ein Teil des Mediums wurde für
weitere Analysen aufbewahrt. Mittels ELISA wurde die Konzentration von TGF- im Kulturmedium bestimmt. Es zeigte
sich, dass IL-17A defiziente Zellen zu jedem Zeitpunkt mehr TGF- freisetzten als die wt Zellen. Außerdem konnte bei
beiden Genotypen beobachtet werden, dass die freigesetzten Mengen an TGF- nach 1 Woche am höchsten waren. (# p ≤
0,05 relativ zu wt 1. Woche; ### p ≤ 0,001 relativ zu wt 1. Woche; + p ≤ 0,05 relativ zu ko 1. Woche)
6.1.4 Ermittlung des Entzündungsgrades und Mukusproduktion in der Lunge
Die Ermittlung des Entzündungsgrades des Lungengewebes stellt ein weiteres wichtiges
Kriterium dar, um auf die Schwere der Asthmaerkrankung rückschließen zu können. Hierbei
wird mit Hilfe von HE gefärbten histologischen Paraffinschnitten die Infiltration des
Lungengewebes mit Lymphozyten und Granulozyten analysiert. Die Untersuchung ergab,
dass
die
Behandlung
Entzündungsreaktion
mit
dem
hervorrief,
Allergen
OVA
jedoch
konnten
in
beiden
innerhalb
Mausstämmen
der
eine
jeweiligen
Behandlungsgruppen keine weiteren Unterschiede festgestellt werden (s. Abb. 6-7).
108
Ergebnisse
Abb. 6-7 Bestimmung des Entzündungsgrades der Lunge von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Modell
allergischen Asthmas: Gewebeschnitte der Lunge wurden mit HE gefärbt und histologisch analysiert. A) wt PBS B)
IL-17A(-/-) PBS C) wt OVA D) IL-17A(-/-) OVA E) Quantifizierung des Entzündungsgrades (Doganci et al., 2008b): Das
Auslösen der Asthmaerkrankung führte in beiden Mausstämmen zu einer vermehrten Entzündungsreaktion im
Lungengewebe. Innerhalb der OVA-Gruppe konnten keine weiteren Unterschiede festgestellt werden.
Charakteristisch für das Asthma bronchiale ist, neben der beschriebenen Entzündungsreaktion
im Lungengewebe, auch eine vermehrte Mukusproduktion, was zusätzlich zur Verengung der
Bronchien und somit zu einer erschwerten Atmung beiträgt. Mittels PAS-Färbung werden
mukusproduzierende Becherzellen im Lungengewebe angefärbt. In erkrankten Mäusen beider
Genotypen
konnte
im
Vergleich
zu
den
unbehandelten
Tieren
eine
vermehrte
Schleimproduktion festgestellt werden. Die histologische Analyse des Lungengewebes ergab
weiterhin, dass die an Asthma erkrankten IL-17A ko Mäuse signifikant weniger PAS+-Zellen
aufwiesen als die mit Allergen behandelten wt Tiere (s.Abb. 6-8).
109
Ergebnisse
Abb. 6-8 Detektion der PAS+-Zellen im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im allergischen
Asthmamodell: Lungenschnitte wurden mittels PAS-Färbung auf mukusproduzierende Zellen hin untersucht. Zu diesem
Zweck wurde die Zahl der PAS+-Zellen pro Bronchus bestimmt und diese Anzahl anschließend ins Verhältnis zum
Durchmesser des jeweiligen Bronchus gesetzt. Die mikroskopischen Aufnahmen (A, B) stellen eine 63x Vergrößerung dar.
A) wt OVA B) IL-17A(-/-) OVA. In C) ist die Quantifizierung dargestellt. Erkrankte Tiere beider Genotypen zeigten eine
vermehrte Schleimproduktion. Im Lungengewebe mit Allergen behandelter wt Mäuse ließen sich signifikant mehr PAS+
Zellen detektieren als bei erkrankten IL-17A ko Mäusen.
6.1.5 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum
Ein Merkmal des allergischen Asthmas ist die Bildung von allergenspezifischem IgE. An
dessen Klassenwechsel ist der Transkriptionsfaktor BATF in B-Zellen direkt und über
Tfh-Zellen indirekt beteiligt. IgE ist das charakteristischste Immunglobulin, welches von
B-Zellen sezerniert wird. An Tag 21 des Versuchsprotokolls wurde zum einen die Lunge
entnommen, um daraus Gesamtzellen und anschließend CD4+ T-Lymphozyten zu isolieren,
zum anderen wurde den Mäusen Blut abgenommen, um daraus Serum zu gewinnen und
anschließend die IgE Konzentration bestimmen zu können. Aus den CD4+ T-Zellen wurde
RNA isoliert und anschließend in cDNA umgeschrieben, um mittels qPCR die Genexpression
des Transkriptionsfaktors Batf weiter untersuchen zu können. Die Analyse ergab, dass die
Behandlung mit OVA in beiden Genotypen zu einem Anstieg der Batf Genexpression führte
(s. Abb. 6-9 A). Die IgE–Konzentrationsbestimmung zeigte, dass bei unbehandelten Mäusen
kein Unterschied zwischen den beiden Genotypen im Serum IgE-Spiegel nachweisbar war.
110
Ergebnisse
Weiterhin konnte beobachtet werden, dass die Erkrankung in beiden Mausstämmen zu einem
signifikanten Anstieg der IgE Konzentration führte, wobei keine Unterschiede zwischen wt
und IL-17A ko Mäusen zu verzeichnen waren (s. Abb. 6-9 B).
Abb. 6-9 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen
Asthmamodell: A) Am Ende des Experiments wurde die Lunge entnommen, um daraus Gesamtzellen und anschließend
CD4+ T-Zellen zu isolieren. In den so erhaltenen Zellen wurde die Genexpression des Transkriptionsfaktors Batf untersucht.
Es zeigte sich, dass nach der Behandlung mit OVA die Expression von Batf in beiden Genotypen anstieg. B) Aus dem Blut
von wt und IL-17A ko Mäusen wurde das Serum gewonnen und die IgE Konzentration mittels ELISA bestimmt.
Unbehandelte Tiere beider Mausstämme wiesen nur geringe Konzentrationen von IgE auf, wohingegen die Behandlung mit
OVA zu einer starken Zunahme der IgE-Spiegel sowohl in wt als auch in IL-17A(-/-) Mäusen führte.
6.1.6 Analyse der Th2- und Th1-Zytokine in der Lunge
Während der Pathogenese des allergischen Asthmas spielen Th2-Lymphozyten eine
entscheidende Rolle. Durch die Produktion und Freisetzung von Zytokinen wie IL-4, IL-5 und
IL-13 sind sie maßgeblich am Entzündungsprozess und der Ausprägung der Symptomatik
beteiligt (Hansen, 2001; Lloyd and Hessel, 2010; Zhu, 2010; Lloyd and Saglani, 2013). Die
Proteinkonzentrationen dieser Zytokine wurden in der BALF mittels ELISA bestimmt.
Innerhalb der PBS-Gruppe konnten bei den jeweiligen Zytokinen keine Unterschiede
festgestellt werden. Für alle drei untersuchten Interleukine galt, dass die Induktion der
Asthmaerkrankung zu einem Anstieg der Proteinkonzentrationen führte (s. Abb. 6-10 A - C).
Dies war in Bezug auf IL-4 und IL-5 für beide Genotypen der Fall, bei IL-13 sah man nur
innerhalb der IL-17A defizienten Mäuse einen signifikanten Anstieg. In der BALF der
111
Ergebnisse
erkrankten IL-17A defizienten Mäuse konnte zudem signifikant mehr IL-4 nachgewiesen
werden als in der Wildtyp-Vergleichsgruppe (s. Abb. 6-10 A-C). Bei Gata3 handelt es sich
um den Haupttranskriptionsfaktor der Th2-Zellen. Aufgrund der erhöhten Konzentrationen an
Th2-Zytokinen wurde die Expression von Gata3 auf mRNA Ebene untersucht. Es zeigte sich,
dass das Auslösen der Asthmaerkrankung lediglich in IL-17A defizienten Mäusen zu einer
tendenziell erhöhten Expression von Gata3 führte, nicht jedoch in wt Mäusen (s. Abb. 6-10
D).
Abb. 6-10 Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im
murinen Asthmamodell: Nach Durchführung der Lavage wurde die erhaltene Flüssigkeit zentrifugiert und die Überstände
mittels ELISA analysiert. A) Die erkrankten Mäuse beider Genotypen produzierten signifikant höhere
Proteinkonzentrationen an IL-4 als die gesunden Tiere, wobei der Gehalt an IL-4 bei den IL-17A(-/-) Mäusen auch im
Vergleich zu OVA behandelten Wildtyp-Tieren signifikant erhöht war. B) An Asthma erkrankte Tiere beider Mausstämme
produzieren signifikant mehr IL-5 als die jeweiligen PBS-Vergleichstiere. C) In der BAL von IL-17A ko Mäusen konnten
signifikant höhere Konzentrationen an IL-13 nachgewiesen werden als bei gesunden IL-17A(-/-) Mäusen. Bei erkrankten
Wildtyp-Tieren konnte ein tendenzieller Anstieg festgestellt werden. D) Die Gata3 mRNA Expression im Lungengewebe
wurde mit Hilfe der qPCR analysiert. Die Behandlung mit OVA führte zu einem tendenziellen Anstieg der Gata3 Expression
in IL-17A defizienten Mäusen.
Das Interleukin 13, von welchem bekannt ist, dass es an der Entstehung der
Atemwegshyperreaktivität maßgeblich beteilig ist (Mattes et al., 2001), wurde mittels
Durchflusszytometrie und qPCR eingehender untersucht. Für die durchflusszytometrische
112
Ergebnisse
Analyse wurden zunächst die Lungen von Wiltyp- und IL-17A defizienten Mäusen
entnommen, um daraus die Gesamtzellen zu isolieren. Im Anschluss erfolgte die
Oberflächenfärbung mit einem Antikörper gegen CD4, gefolgt von der intrazellulären
Färbung mit einem Antikörper gegen IL-13. Die Auswertung ergab eine signifikant erhöhte
Anzahl der IL-13+CD4+ T-Lymphozyten in den Lungenzellen naiver IL-17A(-/-) Mäuse im
Vergleich zu wt Mäusen. Nach Behandlung mit dem Allergen kam es auch bei dem wt
Mäusen zu einem signifikanten Anstieg der IL-13-produzierenden CD4+ T-Zellen,
wohingegen bei den erkrankten IL-17A ko Mäusen kein weiterer Anstieg zu beobachten war
(Abb. 6-11 A). Für die Untersuchungen auf mRNA Ebene wurden CD4+ T-Zellen aus der
Lunge von Wildtyp und IL-17A defizienten Mäusen isoliert. Es konnte gezeigt werden, dass
IL-17A(-/-) Mäuse, die mit OVA behandelt wurden, signifikant mehr Il-13 mRNA in den
CD4+ T-Lymphozyten der Lunge exprimierten. Bei den Wildtyp-Mäusen konnte zwischen
den PBS und den OVA Tieren ein tendenzieller Anstieg der Il-13 mRNA Expression
beobachtet werden (Abb. 6-11 B).
113
Ergebnisse
Abb. 6-11 Analyse des Interleukins 13 in CD4+ T-Lymphozyten der Lunge von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im
murinen Asthmamodell: A) Durchflusszytometrische Analyse der IL-13-produzierenden CD4+ T-Zellen. Unbehandelte
IL-17A ko Mäuse wiesen mehr IL-13-produzierende CD4+ T-Lymphozyten auf als wt Mäuse. Die Behandlung mit OVA
hatte einen signifikanten Anstieg dieser Zellen in wt Mäusen zur Folge, wohingegen die Zellzahlen in erkrankten IL-17A(-/-)
Mäusen nicht weiter anstieg. B) Die Il-13 mRNA Expression wurde in CD4+ T-Lymphozyten der Lunge gemessen. Es
konnte bei mit OVA behandelten IL-17A(-/-) Mäusen ein signifikanter, bei wt Mäusen ein tendenzieller Anstieg der Il-13
mRNA Expression beobachtet werden.
Th1-Zellen wird bei Asthma bronchiale ein protektiver Effekt zugeschrieben. Sie gelten als
wichtige Gegenspieler der Th2-Zellen, da sie in der Lage sind, die Produktion der
Th2-Zytokine zu hemmen, welche bei Asthma bronchiale vermehrt vorliegen (Hansen, 2001).
Daher wurde die Produktion von IFN-, das Marker-Zytokin dieser Zellklasse, in der BALF
mittels ELISA gemessen. In unbehandelten Mäusen zeigte sich kein Unterschied zwischen
den beiden Genotypen, wohingegen nach der Gabe des Allergens in der BALF der
Wildtyp-Mäuse signifikant mehr IFN- nachgewiesen werden konnte als bei IL-17A
defizienten Mäusen (s. Abb. 6-12).
114
Ergebnisse
Abb. 6-12 IFN- in der BALF von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas:
An Tag 21 des Protokolls wurde eine BAL durchgeführt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde in Bezug auf die IFN- Konzentration
untersucht. In der Lavage von erkrankten IL-17A(-/-) Mäusen wurde signifkant weniger IFN- detektiert als bei erkrankten
Wildtyp-Mäusen.
6.1.7 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen
Treg-Zellen und deren immunsuppressorische Eigenschaften spielen bei Asthma bronchiale
eine wichtige Rolle. Sie sind gekennzeichnet durch die Oberflächenmoleküle CD4 und CD25,
sowie durch den Transkriptionsfaktor Foxp3. Ihre immunsuppressorische Wirkung erzielen
sie u. a. durch die Freisetzung der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF- (s.
3.2.5.5).
Zunächst wurden die Gesamtzellen der Lunge durchflusszytometrisch analysiert (s. Abb. 6-13
A). Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Behandlung mit dem Allergen OVA in beiden
Genotypen zu einem Anstieg der CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen führte, wobei innerhalb dieser
Behandlungsgruppe keine weiteren Unterschiede mehr nachweisbar waren (s. Abb. 6-13 B).
Auch auf mRNA Ebene zeichnete sich im Lungengewebe von asthmatischen Mäusen, im
Vergleich zu unbehandelten Mäusen, eine gesteigerte Foxp3 mRNA Expression ab. Eine
IL-17A Defizienz zeigte auch hier keine weiteren Auswirkungen (s. Abb. 6-13 C).
115
Ergebnisse
Abb. 6-13 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Modell allergischen
Asthmas: Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse wurden mit OVA behandelt, um Asthma zu induzieren. Anschließend wurden die
Lungen entnommen und weiter untersucht. A) Aus dem Lungengewebe wurden die Gesamtzellen isoliert und mittels
Durchflusszytometrie analysiert. Dafür wurden zunächst die CD4+ T-Zellen ermittelt, um anschließend die
CD25+Foxp3+ Treg-Population prozentual zu berechnen. B) In beiden Mausstämmen führte die Asthmaerkrankung zu einer
vermehrten Proliferation der CD4+CD25+Foxp3+ Treg-Zellen. C) Aus dem Lungengewebe wurde RNA isoliert, in cDNA
umgeschrieben und die Foxp3 mRNA Expression mittels qPCR untersucht. So konnte nachgewiesen werden, dass die OVATiere beider Genotypen im Vergleich zu PBS-Tieren mehr Foxp3 exprimierten.
Weiterhin konnte beobachtet werden, dass auch die Bildung der anti-inflammatorischen
Zytokine IL-10 und TGF-nicht von IL-17A beeinflusst wurde. So führte die
Asthmaerkrankung in beiden Genotypen zu einer verstärkten Il-10 mRNA Expression in den
CD4+ T-Zellen (s. Abb. 6-14 A). Auch in den Kulturüberständen dieser Zellen konnte eine
116
Ergebnisse
erhöhte Konzentration an IL-10 nachgewiesen werden. (s. Abb. 6-14 B). Die Analyse der
Tgf mRNA Expression zeigte, dass weder die Behandlung mit dem Allergen, noch der
Gendefekt zu weiteren Veränderungen führte (s. Abb. 6-14 C).
Abb. 6-14 Analyse der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und Tgf im murinen Asthmamodell: Aus den
Gesamtzellen der Lunge wurden CD4+ T-Zellen isoliert und danach entweder kultiviert oder für die RNA Extraktion
verwendet um mRNA Analysen durchführen zu können. A und B) Die Asthmaerkrankung führte in beiden Genotypen zu
einem signifikanten Anstieg der Il-10 mRNA Expression. Diese Beobachtung spiegelte sich auch in einer erhöhten IL-10
Proteinkonzentration nach 24 h Zellkultur wider. C) Bezüglich der Tgf mRNA Expression ergaben sich weder durch die
Allergenbehandlung noch durch den IL-17A Defekt weitere Unterschiede.
6.2 Analyse
des
Phänotyps
IL-17A
defizienter
Mäuse
im
Atemwegstoleranzmodell
Bei der Atemwegstoleranz handelt es sich um eine besondere Form der Immunüberwachung.
Darunter versteht man, dass harmlose Antigene von Pathogenen unterschieden werden und
nur gegen potenziell schädigende Stoffe vorgegangen wird. Es kann jedoch auch vorkommen,
dass ein eigentlich harmloses Antigen nicht als solches erkannt wird und so allergische
117
Ergebnisse
Erkrankungen wie z. B. Asthma auftreten. Ziel der Forschung ist es, die zugrunde liegenden
Mechanismen besser zu verstehen, um die gezielte Induktion einer Atemwegstoleranz
möglicherweise als Therapie des allergischen Asthmas einzusetzen. Diese Form der Therapie
würde sich beispielsweise bei Kindern eignen, die zwar noch nicht an Asthma erkrankt sind,
die aber aufgrund z. B. genetischer Faktoren prädestiniert sind, eine Allergie beispielsweise in
Form von Asthma zu entwickeln.
Um herauszufinden, ob IL-17A bei der Atemwegstoleranz eine Rolle spielt, wurden Wildtypund IL-17A defiziente Mäuse benutzt, um wie unter 5.2.3.3 beschrieben, eine
Atemwegstoleranz zu induzieren.
6.2.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation im
Toleranzmodell
Wie zuvor (s. 6.1.1) beschrieben, zeigten asthmatische IL-17A Mäuse im nicht-invasiven
Modell eine starke Reaktion nach Provokation mit dem Bronchokonstriktor Methacholin. Nun
sollte untersucht werden, ob sich die Induktion der Atemwegstoleranz positiv auf die AHR in
IL-17A(-/-) Mäusen auswirkt. Die Messung der AHR erfolgte an Tag 22 (s. Abb. 3-4) des
Protokolls mithilfe einer nicht-invasiven Methode. Es zeigte sich, dass tolerogene IL-17A
defiziente Mäuse deutlich weniger auf das Methacholin reagierten als asthmatische IL-17A ko
Mäuse. Sie wiesen allerdings immer noch eine höhere AHR auf als tolerogene WildtypMäuse bzw. naive IL-17A(-/-) Mäuse. Auch bei wt Mäusen bewirkte die intranasale
Applikation von OVA vor der Sensibilisierungsphase eine Abnahme der AHR (s. Abb. 6-15
A-C).
118
Ergebnisse
Abb. 6-15 Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen nach Induktion der Atemwegstoleranz: An
Tag 22 des Versuchsprotokolls wurde bei wt und IL-17A(-/-) Mäusen die AHR gemessen. A-C) Nach Induktion der
Atemwegstoleranz wiesen sowohl wt als auch IL-17A ko Mäuse eine geringere AHR auf als asthmatische Mäuse des
jeweiligen Genotyps. Tolerogene IL-17A defiziente Mäuse reagierten jedoch immer noch stärker auf das MCh als tolerogene
Wildtyp-Mäuse bzw. unbehandelte IL-17A ko Mäuse.
6.2.2 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum
Die Bestimmung der IgE Konzentration spielt eine wichtige Rolle, um die Schwere einer
allergischen Erkrankung beurteilen zu können. So wurde auch im Toleranzmodell die
Konzentration an IgE im Serum ermittelt. Wie im Asthmamodell bereits beobachtet, kommt
es bei an Asthma erkrankten Tieren beider Stämme zu einem Anstieg der IgE Konzentration
im Serum. Die Induktion der Atemwegstoleranz bewirkte bei beiden Mausstämmen einen
Rückgang der IgE Spiegel im Serum im Vergleich zu asthmatischen Mäusen, jedoch konnte
innerhalb der Toleranzgruppe kein Unterschied zwischen den beiden Genotypen festgestellt
werden (s. Abb. 6-16).
119
Ergebnisse
Abb. 6-16 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im
Toleranzmodell: Am Ende des Experiments wurde aus dem Blut der Mäuse Serum gewonnen und die IgE Konzentration
mittels ELISA bestimmt. Unbehandelte Tiere beider Genotypen wiesen nur geringe Konzentrationen an IgE auf. Bei
asthmatischen Tieren war ein Anstieg der IgE Konzentration sowohl bei den wt- als auch den IL-17A ko Mäusen zu
verzeichnen. Die Induktion der Atemwegstoleranz schützte die Mäuse beider Mausstämme vor gesteigerten IgE-Spiegeln im
Serum.
6.2.3 Analyse der Th2-Zellen nach Induktion der Atemwegstoleranz
Im murinen Asthmamodell konnte bereits nachgewiesen werden, dass IL-17A Einfluss auf die
Th2-Zytokine nimmt. Es sollte in der vorliegenden Arbeit auch überprüft werden, welche
Auswirkungen eine IL-17A Defizienz im Toleranzmodell mit sich bringt, bei dem die Mäuse
während der Sensibilisierungsphase nur einmalig mit OVA i.p. behandelt wurden (s. Abb.
5-4). Dazu wurde die BALF naiver, asthmatischer und tolerogener wt- und IL-17A ko Mäuse
mittels ELISA untersucht. In der BALF asthmatischer Mäuse konnte bei beiden Genotypen
eine erhöhte Konzentration an IL-4 und IL-5 im Vergleich zu gesunden Mäusen detektiert
werden (s. Abb. 6-17 A und B). Im Vergleich zu naiven Mäusen nahm die IL-13
Proteinkonzentration bei dem verwendeten Protokoll allerdings nur in asthmatischen
IL-17A (-/-) Mäusen zu (s. Abb. 6-17 C). Bei den Tieren beider Genotypen konnte nach
Induktion der Atemwegstoleranz ein Rückgang der IL-4 und IL-5 Proteinkonzentration in der
BALF ermittelt werden (s. Abb. 6-17 A und B). Des Weiteren sezernierten IL-17A (-/-) Mäuse
im Toleranzmodell weniger IL-13, wohingegen bei wt Mäusen im Vergleich zu den naiven
und asthmatischen Tieren eher ein Anstieg der IL-13 Proteinkonzentration zu ermitteln war (s.
Abb. 6-17 C).
120
Ergebnisse
Abb. 6-17 Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen
im murinen Toleranzmodell: Die BALF wurde zentrifugiert und die Überstände mittels ELISA analysiert. A) Gesunde
IL-17A ko Mäuse sezernierten weniger IL-4 als wt Mäuse. Bei asthmatischen Mäusen beider Genotypen konnte in der BALF
eine erhöhte Konzentration an IL-4 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu produzierten sowohl wt als auch IL-17A(-/-)
Mäuse im Toleranzmodell weniger IL-4. B) An Asthma erkrankte Tiere beider Genotypen setzen mehr IL-5 frei als gesunde
Mäuse. Nach Induktion der Atemwegstoleranz produzierten die Mäuse beider Stämme zwar mehr IL-5 als naive Tiere, jedoch
weniger als asthmatische Tiere. C) In der BALF asthmatische IL-17 ko Mäuse waren höhere IL-13 Proteinkonzentrationen
nachweisbar als bei gesunden IL-17A ko Mäusen. Im Toleranzmodell produzierten IL-17A(-/-) Mäuse tendenziell weniger
IL-13 als asthmatische Mäuse.
6.2.4 Analyse der Treg-Zellen im Toleranzmodell
Treg-Zellen spielen bei der immunologischen Toleranz eine wichtige Rolle. Sie unterdrücken
Teffektor-Zellen, welche gegen das körpereigene Immunsystem gerichtet sind und sie sind
Vermittler der Anergie (= fehlende Reaktion auf ein Antigen durch Abschalten der
Immunantwort). Die Hemmung anderer Zellen verläuft u. a. durch das Freisetzen
immunsuppressiver Zytokine wie IL-10 und TGF-. Der Anteil an Treg-Zellen in den Lungen
der zu untersuchenden Mäuse wurde durchflusszytometrisch bestimmt. So konnte gezeigt
werden, dass sich eine IL-17A Defizienz negativ auf die Anzahl der Treg-Zellen auswirkte, da
121
Ergebnisse
tolerogene IL-17A defiziente Mäuse signifikant weniger regulatorische T-Zellen aufwiesen
als tolerogene Wildtyp-Mäuse (s. Abb. 6-18 A). Dennoch konnte beobachtet werden, dass
IL-17A im Falle der Atemwegstoleranz wohl eine hemmende Wirkung auf die
immunsuppressiven Zytokine Il-10 und Tgf ausübte, da diese im Toleranzmodell in IL-17A
ko Mäusen verstärkt exprimiert wurden, sowohl im Vergleich zu gesunden IL-17A ko
Mäusen als auch zu asthmatischen wt Mäusen. Auch innerhalb der Wildtyp-Mäuse konnte im
Toleranzmodell eine gesteigerte Il-10 mRNA Expression ermittelt werden. Im Gegensatz
dazu führte die Induktion der Atemwegstoleranz in den Wildtyp-Mäusen zu einer Abnahme
der Tgf Genexpression (s. Abb. 6-18 B und C).
122
Ergebnisse
Abb. 6-18 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Toleranzmodell: Wildtypund IL-17A(-/-) Mäuse wurden vor der Sensibilisierungsphase intranasal mit OVA behandelt, um eine Atemwegstoleranz zu
induzieren. Am Ende des Versuchs wurden die Lungen entnommen und weiter untersucht. A) Aus dem Lungengewebe
wurden die Gesamtzellen isoliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dafür wurden zunächst die Lymphozyten und
anschließend die CD4+ T-Zellen ermittelt. Aus der CD4+CD25+ Zellpopulation wurde daraufhin die
CD4+Foxp3+ Treg-Population prozentual berechnet. B) Die durchlusszytometrische Analyse ergab, dass tolerogene IL-17A
ko Mäuse signifikant weniger Foxp3+CD4+CD25+ Treg-Zellen ausbildeten als tolerogene wt Mäuse. C) Tolerogene wt und
IL-17A ko Mäuse exprimierten im Lungengewebe mehr Il-10 als unbehandelte Tiere. Außerdem war die Genexpression in
den asthmatischen und tolerogenen IL-17A ko Mäusen im Vergleich zu wt Mäusen tendenziell erhöht. D) Nach Induktion
der Atemwegstoleranz wurde in den Lungen der IL-17A defizienten Mäusen Tgf tendenziell verstärkt exprimiert.
123
Ergebnisse
6.2.5 Analyse der Tfh-Zellen im Atemwegstoleranzmodell
Tfh-Zellen stellen eine spezielle T-Helferzell-Population dar, welche die humorale
Immunantwort unterstützt. Darüber hinaus sind sie an der Entstehung und Regulation der
B-Zell-vermittelten Toleranz beteiligt (s. 3.2.5.6). Aufgrund ihrer Rolle während der
Vermittlung der immunologischen Toleranz wurden diese Zellen auch in der vorliegenden
Arbeit im murinen Modell untersucht. Zu diesem Zweck wurde aus dem Lungengewebe von
naiven, asthmatischen und tolerogenen wt- und IL-17A ko Mäusen RNA isoliert, in cDNA
umgeschrieben und mittels qPCR analysiert. Zunächst wurden die beiden Zytokine IL-6 und
IL-21 untersucht, da gezeigt wurde, dass diese beiden Faktoren Tfh-Zellen induzieren und
auch von diesen sezerniert werden (s. 3.2.5.6). Es zeigte sich, dass sowohl Il-6 als auch Il-21
im Toleranzmodell in Abwesenheit von IL-17A vermehrt gebildet wurden (s. Abb. 6-19 A
und B). Die höchste Il-6 mRNA Expression konnte bei asthmatischen wt und IL-17A ko
Mäusen nachgewiesen werden. Im Verhältnis dazu fiel die Expression im Toleranzmodell
geringer aus, war aber im Falle der IL-17A ko Mäuse immer noch signifikant höher als in
unbehandelten Mäusen (s. Abb. 6-19 A). Betrachtet man in Bezug auf die Il-21 mRNA
Expression die drei unterschiedlichen Versuchsgruppen – PBS, Asthma, Toleranz – so nahm
die Genexpression dieses Zytokins bei beiden Genotypen stetig zu, wobei die relativen
Unterschiede in Abwesenheit von IL-17A ausgeprägter ausfielen (s. Abb. 6-19 B).
124
Ergebnisse
Abb. 6-19 Analyse der Il-6 und Il-21 mRNA Expression im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A defizienten
Mäusen im Toleranzmodell: Aus dem Lungengewebe von wt und IL-17A ko Mäusen wurde RNA extrahiert, in cDNA
umgeschrieben und mittels qPCR analysiert. A) Die Behandlung mit dem Allergen führte sowohl bei wt als auch bei
IL-17A (-/-) Mäusen zu einem signifikanten Anstieg der Il-6 mRNA Expression. Die Induktion der Atemwegstoleranz
bewirkte in beiden Mausstämmen zwar eine Reduktion Il-6 Genexpression, jedoch blieb diese höher als bei unbehandelten
Mäusen. B) Die Genexpression des Zytokins Il-21 wurde durch OVA induziert. Dies galt besonders für das Toleranzmodell.
Sowohl asthmatische als auch tolerogene IL-17A ko Mäuse bildeten mehr der Il-21 mRNA als die wt Mäuse der jeweiligen
Gruppe.
Bcl6 gilt als Haupttranskriptionsfaktor der Tfh-Zellen. Es konnte aber auch gezeigt werden,
dass BATF bei diesem Zelltyp eine wichtige Rolle spielt (s. 3.2.5.6). In der vorliegenden
Arbeit konnte in Bezug auf die Transkriptionsfaktoren lediglich ein leichter Anstieg der Bcl6
Genexpression in tolerogenen IL-17A ko Mäusen im Vergleich zu tolerogenen wt Mäusen
beobachtet werden. Auch verglichen mit asthmatischen IL-17A(-/-) Mäusen war die Bcl-6
mRNA Expression erhöht (s. Abb. 6-20 A). Die Induktion von Asthma mit dem Allergen
OVA führte bei beiden Genotypen zu einer gesteigerten Batf mRNA Expression. Im
Gegensatz zu den wt Mäusen konnte zwischen naiven und tolerogenen IL-17A(-/-) Mäusen
auch ein signifikanter Anstieg der Genexpression dieses Transkriptionsfaktors beobachtet
werden (s. Abb. 6-20 B).
125
Ergebnisse
Abb. 6-20 Analyse der Transkriptionsfaktoren Bcl6 und Batf im Lungengewebe von tolerogenen Wildtyp- und
IL-17A defizienten Mäusen: Am Ende des Experiments wurden die Lungen entnommen und nach RNA Extraktion und
cDNA Synthese auf mRNA Ebene untersucht. A) Nach Induktion der Atemwegstoleranz wurde Bcl6 in Abwesenheit von
IL-17A im Vergleich zu asthmatischen Tieren oder auch zu tolerogenen wt Mäusen tendenziell vermehrt exprimiert. B) Die
Batf mRNA Expression stieg nach Asthmainduktion in beiden Genotypen deutlich an. Im Gegensatz zu wt Mäusen
exprimierten auch tolerogene IL-17A ko Mäuse mehr Batf mRNA als unbehandelte IL-17A(-/-) Mäuse.
Um diese Ergebnisse weiter zu verifizieren und in Richtung Tfh-Zellen einzuschränken, wurde
die RNA aus den Lungen auch auf die für Tfh-Zellen typischen Oberflächenmarker CXCR5,
IL-6R und IL-21R hin untersucht. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit OVA, sei es um
Asthma oder aber um Toleranz zu induzieren, bei beiden Genotypen zu einem Rückgang der
Cxcr5 mRNA Expression führte. Allerdings war dieser Vorgang bei IL-17A (-/-) Mäusen
weniger stark ausgeprägt als bei wt Mäusen. So konnte beobachtet werden, dass sowohl
asthmatische als auch tolerogene IL-17A ko Mäuse signifikant mehr Cxcr5 mRNA
exprimierten als wt Mäuse (s. Abb. 6-21 A).
Die Il-6r Genexpression schien in asthmatischen im Vergleich zu gesunden IL-17A (-/-)
Mäusen verringert zu sein. Durch Induktion der Atemwegstoleranz kam es zu einer
vermehrten Il-6r mRNA Expression, verglichen sowohl mit naiven und asthmatischen
IL-17A (-/-) Mäusen als auch mit tolerogenen wt Mäusen. Bei Wildtyp-Mäusen konnte
dagegen in keiner der drei zu untersuchenden Gruppen eine Veränderung beobachtet werden
(s. Abb. 6-21 B). Die Induktion des allergischen Asthmas führte bei Wildtyp-Mäusen zu
einem signifikanten Rückgang der Il-21r mRNA Expression. Im Toleranzmodell exprimierten
126
Ergebnisse
Wildtyp-Mäuse dann wieder tendenziell mehr Il-21r mRNA als asthmatische wt Mäuse. In
Abwesenheit von IL-17A lag sowohl im Vergleich zu naiven v. a. aber verglichen mit
asthmatischen Tieren eine erhöhte Il-21r Genexpression vor (s. Abb. 6-21 C).
Abb. 6-21 Untersuchung der Oberflächenmarker Cxcr5, Il-6r und Il-21r im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A
defizienten Mäusen im Toleranzmodell: Aus dem Lungengewebe von naiven, asthmatischen und tolerogenen Mäusen wurde
RNA isoliert und anschließend cDNA synthetisiert. Die weiteren Analysen erfolgten auf mRNA Ebene. A) Cxcr5 wurde in den
Lungen gesunder wt und IL-17A ko Mäuse am stärksten exprimiert. In asthmatischen und tolerogenen Mäusen war ein Rückgang
der Cxcr5 mRNA zu beobachten, wobei in beiden Gruppen IL-17A ko Mäuse mehr Cxcr5 mRNA bildeten als wt Mäuse. B und
C) Sowohl die Il-6r mRNA als auch die Il-21r mRNA wurde im Toleranzmodell in Abwesenheit von IL-17A stärker exprimiert
als in wt Mäusen. Verglichen mit unbehandelten und asthmatischen IL-17A ko Mäusen war ein tendenzieller Anstieg beider
Faktoren zu erkennen.
6.3 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A in einem
murinen Modell allergischen Asthmas
Es ist bereits bekannt, dass eine Sensibilisierung durch Aeroallergene einer der stärksten
Risikofaktoren für das Auslösen des allergischen Asthmas ist. Dabei spielen v. a. auch
CD4+ T-Lymphozyten eine wichtige Rolle. So geht man z. B. bei Th1-Zellen davon aus, dass
127
Ergebnisse
sie eine protektive Funktion einnehmen (s. 3.2.5.1), wohingegen die Th2-Zellen für die
typischen Asthmasymptome, wie beispielsweise bronchiale Hyperreaktivität verantwortlich
sind (s. 3.2.5.2). Man nimmt außerdem an, dass virale Infektionen beim Verlauf dieser
Erkrankung eine wichtige Rolle einnehmen (s. 3.1.2.3). Untersuchungen ergaben, dass
IL-17A an mukosalen und epithelialen Abwehrmechanismen beteiligt ist. Außerdem geht man
davon aus, dass Th17-Zellen und IL-17A die Immunpathophysiologie bei viralen Infekten
modulieren. Allerdings ist ihre genaue Rolle dabei noch nicht vollständig geklärt. Um
herauszufinden, ob das Zytokin IL-17A einen direkten Einfluss auf Gene der antiviralen
Immunantwort hat, wurde zunächst ein Genearray durchgeführt.
6.3.1 Analyse der Genexpression in CD4+ T-Zellen der Lunge mittels Microarray
CD4+ T-Lymphozyten wurden aus dem Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A defizienten
Mäusen isoliert und mittels Microarray-Analyse eingehender untersucht. Dazu wurden je drei
Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse verwendet, bei denen zuvor Asthma induziert wurde. Die
Analysen ergaben, dass die Abwesenheit von IL-17A in CD4+ T-Zellen zu einer signifikanten
Verminderung der Oas1a, Oas1g, Oas1c, Cxcr3 und Rnasel, sowie einer erhöhten
Genexpression von Ighg (Immunoglobulin heavy chain, gamma polypeptide), Il-6, PDC-Trem
(PDC = plasmacytic dendritic cell, TREM = triggering receptor expressed on myeloid cells),
Il-13 und Nfil3 (nuclear factor, IL-3 regulated) führte. Diese Gene können mit
Entzündungsprozessen und/oder der antiviralen Immunantwort in Verbindung gebracht
werden. In der Tabelle 6-1 sind die Ergebnisse der Microarray-Analyse aufgeführt.
128
Ergebnisse
Tabelle 6-1 Ergebnisse des Microarrays: Die Analyse der CD4+ T-Zellen aus dem Lungengewebe von erkrankten Wildtyp- und
IL-17A(-/-) Mäusen ergab, dass in der Abwesenheit von IL-17A viele Gene reguliert sind, welche in der pro-/antiinflammatorischen und/oder der pro-/anti-viralen Immunantwort eine Rolle spielen.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte auch in Form einer sogenannten „Heat-map“. Dabei
sind auf der linken Seite die Analyseproben der IL-17A defizienten Zellen zu sehen, auf der
rechten Seite die der Wildtyp-Zellen. Rot bedeutet, dass eine Induktion der Genexpression
vorliegt, wohingegen die blaue Farbe eine Reduktion anzeigt (s. Abb. 6-22 A). Die Ergebnisse
der Microarray-Analyse sind zusätzlich noch als graphische Darstellung zu sehen (s. Abb.
6-22 B).
129
Ergebnisse
Abb. 6-22 Heat-map und graphische Darstellung der Microarry-Analyse: A) Darstellung der Ergebnisse des Microarrays
als Heat-map. Gene, deren Expression reduziert war, wurden in blau, eine induzierte Genexpression in rot dargestellt. B)
Graphische Darstellung (Fold-change) der reduzierten und induzierten Genexpression in IL-17A defizienten Zellen.
6.3.2 Analyse der Oas1g mRNA Expression mittels qPCR
Die Untersuchung der CD4+ T-Zellen aus der Lunge mit Hilfe des Microarrys ergab, dass eine
IL-17A Defizienz sowohl Auswirkungen auf die beteiligten Gene einer Entzündungsreaktion,
als auch auf die durch Viren induzierten Gene, insbesondere auf die Familienmitglieder der
2´-5´-Oligoadenylatsynthetase, hat. Im Folgenden lag nun der Fokus auf Oas1g, dessen
Expression laut Microarray am stärksten von IL-17A abhing. Zunächst wurde die
Genexpression in den CD4+ T-Lymphozyten der Lunge ermittelt, um so die Ergebnisse des
Microarrays zu verifizieren. Die Analyse ergab einen signifikanten Rückgang der Oas1g
mRNA Expression sowohl in gesunden, als auch in erkrankten IL-17A defizienten Mäusen im
Vergleich zu den Kontrollmäusen (s. Abb. 6-23 A). Weiterhin konnte beobachtet werden,
dass die Asthmaerkrankung in Wildtyp-Mäusen zu einer verstärkten Genexpression führte (s.
Abb. 6-23 A). Es konnte auch gezeigt werden, dass in Abwesenheit von IL-17A die Oas1a
Genexpression sowohl mit als auch ohne OVA-Behandlung stark reduziert vorlag verglichen
130
Ergebnisse
mit wt Kontrollmäusen. Auch hier nahm nach Behandlung mit dem Allergen die Oas1a
mRNA Expression in den Wildtyp-Mäusen tendenziell zu. (s. Abb. 6-23 B).
Abb. 6-23 Analyse der Oas1g und Oas1a mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Lunge von Wildtyp- und IL-17A
defizienten Mäusen: CD4+ T-Zellen wurden aus den Lungen von gesunden und kranken Wildtyp und IL-17A defizienten
Mäusen isoliert und mittels qPCR analysiert. A) Die Oas1g mRNA Expression ist sowohl in behandelten als auch in
unbehandelten IL-17A(-/-) Mäusen signifikant reduziert im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Die Asthmaerkrankung führte bei
wt Mäusen zu einer verstärkten Genexpression. B) Auch die Genexpression von Oas1a ist in gesunden und kranken
IL-17A(-/-) Mäusen inhibiert. Asthmatische wt Mäuse neigten zu einer vermehrten Oas1a mRNA Expression verglichen mit
e
gesunden
wt Mäusen.
Nachdem nachgewiesen werden konnte, dass das antiviral wirksame Gen Oas1g in IL-17A
defizienten CD4+ T-Zellen der Lunge nahezu gar nicht exprimiert wurde, stellte sich die
Frage, ob das nur für diesen Zelltyp galt. Aus diesem Grund wurde die Expression dieser
2´-5´-Oligoadenylatsynthetase in weiteren Zelltypen, sowie im Lungen- und lymphatischen
Gewebe untersucht. Zunächst wurden aus dem Lungengewebe und den Gesamtzellen der
Lymphknoten RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben, um anschließend die Oas1g mRNA
Expression zu ermitteln. Es zeigte sich, dass sowohl in unbehandelten als auch in behandelten
IL-17A(-/-) Mäusen signifikant weniger der Oas1g mRNA exprimiert wurde als in
Wildtyp-Mäusen. Dies galt sowohl für das gesamte Lungengewebe (s. Abb. 6-24 A) als auch
für die Gesamtzellen der Lymphknoten (s. Abb. 6-24 B)
131
Ergebnisse
Abb. 6-24 Analyse der Oas1g mRNA Expression im Lungengewebe und in den Lymphknotenzellen von Wildtyp- und
IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell: Aus dem Lungengewebe und den Gesamtzellen der
Lymphknoten wurde RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mittels qPCR weiter analysiert. A) Die Oas1g mRNA war
sowohl in naiven als auch asthmatischen IL-17A(-/-) Mäusen kaum nachweisbar. B) Die Analyse der Lymphknoten
Gesamtzellen ergab eine signifikante Reduktion der Oas1g Genexpression sowohl in gesunden als auch in erkrankten IL-17A
defizienten Mäusen im Vergleich zu wt Mäusen.
Auch in CD11c+ Lungenzellen von gesunden und erkrankten IL-17A ko Mäusen war die
Oas1g mRNA Expression im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen gehemmt. Im Gegensatz zu den
Ergebnissen in CD4+ T-Zellen konnte in diesem Zelltyp nach Allergenkonfrontation kein
Anstieg der Genexpression in wt Zellen beobachtet werden (s. Abb. 6-25 A). In
ausdifferenzierten Mastzellen aus dem Knochenmark führte die IL-17A Defizienz ebenfalls
zu einer Unterdrückung der Oas1g mRNA Expression (s. Abb. 6-25 B).
Abb. 6-25 Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD11c+ Lungenzellen im murinen Asthmamodell und in
ausdifferenzierten Mastzellen des Knochenmarks von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen: Aus CD11c+
Lungenzellen und generierten Mastzellen wurde RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mittels qPCR weiter analysiert.
A) In CD11c+ Lungenzellen war die Oas1g mRNA sowohl in naiven als auch in OVA-behandelten IL-17A(-/-) Mäusen
signifikant reduziert. B) Die Untersuchung der Mastzellen, welche aus dem Knochemark generiert wurden, ergab eine
signifikante Reduktion der Oas1g Genexpression in IL-17A defizienten Zellen im Vergleich zu wt Zellen.
132
Ergebnisse
6.3.3 Analyse der Ifn mRNA Expression in unterschiedlichen Zelltypen
Wie in Abschnitt 3.4 beschrieben, wird der antivirale OAS1-RNaseL Signalweg durch Typ I
Interferone (z. B. IFN-) induziert. Deshalb wurde die Ifn Genexpression eingehender
untersucht. Zunächst erfolgte die Analyse der CD4+ T-Lymphozyten der Lunge, wobei
ersichtlich wurde, dass in beiden Genotypen eine Behandlung mit dem Allergen OVA zu
einer signifikanten Reduktion der Ifn Expression führte. Innerhalb der PBS-Gruppe wiesen
die IL-17A defizienten Mäuse tendenziell geringere Ifn mRNA Werte auf, wobei dieser
Unterschied nach Asthmainduktion nicht mehr erkennbar war (s. Abb. 6-26 A). In CD11c+
Zellen, welche ebenfalls aus den Gesamtzellen der Lunge aufgereinigt wurden, lag die Ifn
mRNA Expression sowohl in gesunden als auch in erkrankten IL-17A(-/-) Tieren signifikant
verringert vor. Nach Auslösen der Asthmaerkrankung wurde dieses Typ I Interferon in
Wildtyp-Mäusen tendenziell verstärkt exprimiert verglichen mit unbehandelten Mäusen (s.
Abb. 6-26 B). Weiterhin wurden die Mastzellen, welche über vier Wochen hinweg aus dem
Knochenmark differenziert wurden, untersucht. Im Gegensatz zu den vorher beschriebenen
CD4+ T-Zellen und CD11c+ Zellen aus der Lunge konnte hier kein Unterschied in der
Genexpression festgestellt werden (s. Abb. 6-26 C).
133
Ergebnisse
Abb. 6-26 Analyse der Ifn mRNA Expression in Wildtyp- und IL-17A defizienten Zellen: Aus den Gesamtzellen der
Lunge wurden CD4+- und CD11c+ Zellen isoliert, um die Ifn mRNA Expression zu untersuchen. A) Die Behandlung mit
OVA führte in beiden Mausstämmen zu einer signifikanten Reduktion der IfnGenexpression in CD4+ T-Zellen. Innerhalb
der naiven Tiere schien eine IL-17A Defizienz zu einer verringerten IfnmRNA Menge zu führen. B) In IL-17A defizienten
CD11c+ Zellen wurde die Ifn mRNA sowohl in behandelten als auch in unbehandelten Mäusen im Vergleich zu den
Kontrolltieren weniger exprimiert. C) In ausdifferenzierten Mastzellen aus dem Knochenmark konnte kein Unterschied in der
Ifn Genexpression nachgewiesen werden.
6.3.4 Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen
Wie in Abschnitt 3.2.6 bereits beschrieben, gehören CD8+ T-Lymphozyten zu den
zytotoxischen Zellen. Diese sind besonders bei der Bekämpfung von virusinfizierten Zellen
äußerst effektiv. Aufgrund dessen wurde mittels durchflusszytometrischer Analyse die Anzahl
der CD8+ T-Zellen in dem zu untersuchenden Asthmamodell überprüft. Es stellte sich heraus,
dass in naiven IL-17A(-/-) Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verringerte Anzahl
an CD8+ T-Zellen in der Lunge vorlag (s. Abb. 6-27 A). Nach Behandlung mit dem Allergen
nahm die Anzahl dieser Zellen innerhalb der IL-17A(-/-) Mäuse tendenziell zu, jedoch konnte
kein Unterschied im Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet werden (s.Abb. 6-27 A). Aus
den Lymphknoten beider Genotypen wurden ebenfalls die Gesamtzellen isoliert. Die
134
Ergebnisse
Ergebnisse stimmten mit den Beobachtungen der Gesamtzellen der Lunge überein (s. Abb.
6-27 B).
Abb. 6-27 Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell: Die
Gesamtzellen der Lunge bzw. der Lymphknoten wurden mittels Durchflusszytometer auf den Anteil an CD8+
T-Lymphozyten hin untersucht. Es zeigte sich, dass IL-17A(-/-) Mäuse im gesunden Zustand sowohl in den Lungenzellen (A)
als auch in den Lymphknotenzellen (B) weniger CD8+ T-Lymphozyten aufwiesen. Nach Behandlung der IL-17A defizienten
Mäuse mit OVA nahm die Anzahl der CD8+ T-Zellen sowohl in den Gesamtzellen der Lunge (A) als auch den Gesamtzellen
der Lymphknoten (B) tendenziell zu.
6.3.5 Unterdrückung der Il-17a Genexpression mittels siRNA
Wie die vorherigen Untersuchungen zeigen konnten, scheint die antivirale Wirkung des
Zytokins IL-17A in Zusammenhang mit der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase zu stehen. Um
herauszufinden, ob IL-17A dieses Enzym direkt oder indirekt beeinflusst, wurden
CD4+ T-Zellen aus den Gesamtzellen der Milz von Wildtyp-Mäusen mit Il-17a siRNA
transfiziert (s. 5.2.3.10). Zunächst wurde überprüft, ob mittels der verwendeten siRNA
tatsächlich die Il-17a Genexpression unterdrückt werden kann. Da erfahrungsgemäß naive
135
Ergebnisse
Zellen nur sehr wenig IL-17A sezernieren und der Effizienznachweis der Il-17a siRNA
dadurch erschwert werden könnte, wurden die Zellen zunächst zu Th17-Zellen differenziert (s.
5.2.3.10). Anschließend wurde in die zu Th17-Zellen differenzierten Zellen die Il-17a siRNA
eingeschleust und für 24 Stunden kultiviert. Nachfolgend wurde in den Zellkulturüberständen
die Konzentration des IL-17A Proteins ermittelt. Hierbei dienten zum einen die geskewten
Zellen ohne siRNA (=SN Th17 Skewing), sowie die für weitere 24 h unstimulierten Zellen
(=unst.) als Kontrolle. Weiterhin wurden die Überständer der mit siRNA alleine (= Il-17a
siRNA) und zusammen mit GFP (= Il-17a siRNA + GFP) behandelten Zellen analysiert. Als
zusätzliche Kontrolle diente die Kondition mit Il-17a siRNA, jedoch ohne den für die
Transfektion notwendigen Puls (= Il-17a siRNA –Puls; s. 3.2.2.9). Anschließend wurde unter
dem Mikroskop gezeigt, dass die Transfektion erfolgreich und das GFP-Signal detektierbar
war (s. Abb. 6-28 A). Die IL-17A Proteinkonzentration wurde mit Hilfe eines ELISAs
ermittelt. Es zeigte sich, dass in den Überständen des Th17 Skewings die größte Konzentration
an IL-17A enthalten war, wohingegen die Einschleusung der siRNA zu signifikant
verminderten Konzentrationen an IL-17A führte, wie die erhaltenen Konzentrationen in den
Überständen „Il-17a siRNA“ bzw. „Il-17a siRNA + GFP zeigten“. Man konnte zwar auch
einen signifikanten Rückgang der IL-17A Konzentration in den Überständen der „unst.“
Kondition erkennen, jedoch produzierten die Zellen dieser Kondition immer noch signifikant
mehr Proteine als die mit der Il-17a siRNA transfizierten Zellen (s. Abb. 6-28 B).
136
Ergebnisse
Abb. 6-28 Analyse der IL-17A Konzentration in den Zellkulturüberständen der CD4+ T-Zellen der Milz nach
Transfektion mit Il-17a siRNA: CD4+ T-Zellen der Milz wurden zunächst zu Th17-Zellen differenziert. Die Überstände
wurden zur Bestimmung der IL-17A Konzentration verwendet, die Zellen wurden mit Il-17a siRNA mit und ohne GFP
Vektor transfiziert. Als Kontrolle diente zum einen eine Kondition, ohne notwendigen Puls sowie unstimulierte Th17-Zellen.
A) Mikroskopischer Nachweis des GFP-Signals in transfizierten Zellen (obere Abbildung: Vergößerung 40x, untere
Abbildung: Vergrößerung 63x) B) Nach Transfektion mit der siRNA sezernierten die Zellen weniger IL-17A verglichen mit
den freigesetzten Mengen direkt nach dem Skewing bzw.von unbehandelten Zellen.
Da nun gewährleistet war, dass die verwendete Il-17a siRNA die Genexpression hemmte,
wurde in einem neuen Versuchsansatz überprüft, ob man unter Benutzung der Il-17a siRNA
die Genexpression von Oas1g unterdrücken kann. So wurden CD4+ T-Zellen aus den
Gesamtzellen der Milz von Wildtyp-Mäusen isoliert und für 24 h in Gegenwart von rIL-6
kultiviert. In diesem Fall wurde nur rIL-6 als Stimulus verwendet, um so die IL-17A
Produktion zu fördern. Zum einen wurden Zellen analysiert, die mit Il-17a siRNA transfiziert
wurden (= Il-17a siRNA), zum anderen Zellen, in die nur der GFP Vektor eingeschleust
wurde (= GFP). Als weitere Kontrolle dienten Zellen, zu denen zwar der GFP Vektor gegeben
wurde, jedoch der nötige Puls fehlte, um das GFP in die Zellen einzubringen (= GFP – Puls).
Nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese wurde die Genexpression von Oas1g mittels der
qPCR Methode ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Oas1g Gens in
den Zellen nach Transfektion mit der siRNA unterdrückt wurde, wie aus dem Vergleich mit
den beiden Kontrollkonditionen (GFP bzw. GFP –Puls) ersichtlich wurde (s. Abb. 6-29).
137
Ergebnisse
Abb. 6-29 Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz nach Kultur und Transfektion mit Il-17a
siRNA: CD4+ T-Zellen wurden aus den Milzzellen von naiven Wiltyp-Mäusen isoliert und 24 h in Anwesenheit von rIL-6
kultiviert. Anschließend wurden sie entweder mit Il-17a siRNA oder GFP Vektor transfiziert. Als Kontrolle diente eine
Kondition, bei der GFP zugegeben wurde, jedoch der für die Transfektion nötige Puls fehlte. Es konnte eine Reduktion der
Oas1g mRNA Expression nach Transfektion mit Il-17a siRNA beobachtet werden.
Um den Effekt der Il-17a siRNA weiter untersuchen zu können, wurden Wildtyp-Mäuse mit
dem Allergen OVA behandelt, um so eine Asthmaerkrankung auszulösen (s. 5.2.3.2), was
erfahrungsgemäß zu einem Anstieg der IL-17A Produktion führt. Anschließend wurden die
Milzen entnommen, die Gesamtzellen isoliert und die CD4+ T-Zellen aufgereinigt. Diese
CD4+ T-Zellen wurden daraufhin sofort mit Il-17a siRNA transfiziert (= Il-17a siRNA). Als
Kontrolle dienten zum einen Zellen, bei denen sowohl die siRNA als auch GFP zugegeben
wurde, jedoch der nötige Puls zum Einschleusen fehlte (= Il-17a siRNA – Puls) und zum
anderen komplett unstimulierte Zellen (= unst.). Unter diesen drei verschiedenen Konditionen
wurden die Zellen für 24 h kultiviert. Die Analyse der Oas1g mRNA Expression zeigte eine
tendenzielle Abnahme der Genexpression nach Transfektion mit der siRNA im Vergleich zu
unstimulierten Zellen (s. Abb. 6-30).
138
Ergebnisse
Abb. 6-30 Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz von asthmatischen Wildtyp Mäusen nach
in vitro Transfektion mit Il-17a siRNA: Bei Wildtyp Mäusen wurde Asthma induziert und anschließend die Milz
entnommen, um aus den Gesamtzellen CD4+ T-Zellen zu isolieren. Im Anschluss daran wurden die Zellen entweder mit
Il-17a siRNA transfiziert, oder im unbehandelten Zustand ausplattiert. Als weitere Kontrollkondition dienten Zellen, zu
denen die siRNA zugesetzt wurde, jedoch der für die Transfektion nötige Puls fehlte. Nach Transfektion mit der Il-17a
siRNA exprimierten die Zellen tendenziell weniger Oas1g mRNA als die unstimulierten Zellen.
6.3.6 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A nach Infektion
verschiedener Zelltypen mit dem Rhinovirus 1b
Virale Infektionen, insbesondere durch Rhinoviren verursachte, gehören zu den häufigsten
Auslösern von Exazerbationen bei einer bestehenden Asthmaerkrankung. Zu den über 100
verschiedenen Serotypen der Rhinovirus-Familie gehört auch der RV1b. Er zählt zu der
kleineren der beiden Rhinovirusgruppen und bindet sowohl an die humanen als auch die
murinen Proteine der LDL-Rezeptorengruppe (Bartlett et al., 2008). Wie anhand der
vorherigen Ergebnisse gezeigt werden konnte, steht das Zytokin IL-17A mit Komponenten
der antiviralen Immunantwort in Verbindung. Aus diesem Grund wurden für die folgenden
Analysen unterschiedliche Zelltypen mit dem Rhinovirus 1b infiziert und die darauf folgende
Immunantwort untersucht.
139
Ergebnisse
6.3.6.1 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von Mastzellen mit dem
Rhinovirus 1b
Wie in Abschnitt 5.2.3.11 beschrieben, wurde aus den Ober- und Unterschenkelknochen von
Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen das Knochenmark isoliert, um daraus über vier
Wochen hinweg Mastzellen zu differenzieren. Nach Beendigung der Kultur wurden die
Zellen mit dem RV1b infiziert und für 24 h kultiviert (s. 5.2.4). Anschließend wurden die
Überstände für weitere Untersuchungen abgenommen und aus den Zellen die RNA extrahiert,
welche anschließend in cDNA umgeschrieben wurde. Zunächst erfolgte mit Hilfe der PCR
Analyse (s. 5.2.5) der Nachweis, dass die Zellen mit dem RV1b infiziert wurden. Hierbei
konnte beobachtet werden, dass die IL-17A defizienten Mastzellen signifikant stärker infiziert
waren als die Zellen ohne Gendefekt. Daraus lässt sich schließen, dass diese Zellen nicht
gegen die Virusinfektion vorgehen konnten (s. Abb. 6-31 A und B).
Abb. 6-31 Analyse der Viruslast in Mastzellen nach Infektion mit dem RV1b: Aus dem Knochenmark von Wildtyp- und
IL-17A defizienten Mäusen wurden Mastzellen generiert, mit RV1b infiziert und für 24 h kultiviert. Anschließend wurde
mittels PCR (A) die Viruslast ermittelt. B) Es zeigte sich, dass die Zellen in Abwesenheit von IL-17A eine signifikant
erhöhte Viruslast aufwiesen.
Picornaviren, darunter auch der RV1b, gehören zu den zytopathogenen Viren, da sie bei
infizierten Zellen eine morphologische Änderung verursachen. Dies bedeutet, dass die Zellen
abgerundet und aus dem Zellverband losgelöst werden. Anschließend erfolgt ihre Lyse.
140
Ergebnisse
Dieser Vorgang wird als zytopathischer Effekt bezeichnet (Baron, 1996; Deszcz et al., 2005).
Daher wurde die LDH Aktivität bestimmt, um herauszufinden, welchen Schaden die Infektion
mit dem RV1b mit sich bringt. Zu diesem Zweck wurden die Zellkulturüberstände von
Mastzellen untersucht, welche zuvor mit dem RV1b infiziert wurden. Als Kontrolle dienten
nicht-infizierte Mastzellen (s. 5.2.11). Es konnte beobachtet werden, dass bereits in den
Überständen unbehandelter IL-17A defizienter Mastzellen eine signifikant erhöhte LDH
Aktivität vorlag als in den Überständen der wt Zellen. Die Virusinfektion führte dann dazu,
dass v. a. wt Zellen vermehrt zu Grunde gingen, was sich in einer verstärkten LDH Aktivität
widerspiegelte. Beim Vergleich der infizierten IL-17A(-/-) Zellen mit unbehandelten IL-17A
defizienten oder infizierten Wildtyp-Zellen konnten keine Unterschiede in der LDH Aktivität
detektiert werden (s. Abb. 6-32).
Abb. 6-32 Analyse der LDH Aktivität in den Zellkulturüberständen generierter Mastzellen vor bzw. nach Infektion
mit dem RV1b: Die ausdifferenzierten Mastzellen aus dem Knochenmark von wt- bzw. IL-17A(-/-) Mäusen wurden mit dem
RV1b infiziert und anschließend die LDH Aktivität in den Zellkulturüberständen analysiert. Bereits ohne vorherige Infektion
mit dem RV war in den Überständen der IL-17A defizienten Zellen eine erhöhte LDH Aktivität nachweisbar in Vergleich zu
den wt Kontrollzellen. Die Infektion führte bei diesen Zellen zu keiner weiteren Steigerung der LDH Aktivität. Bei den wt
Zellen rief die Infektion mit dem RV1b ein vermehrtes Zellsterben hervor, was sich in einer erhöhten LDH Aktivität
widerspiegelte.
Wie zuvor bereits gezeigt (s.Abb. 6-25), exprimierten IL-17A defiziente Mastzellen aus dem
Knochenmark signifikant weniger Oas1g mRNA, wobei keine signifkanten Unterschiede in
der Ifn Expression nachweisbar waren (s. Abb. 6-26). Die Expression dieser beiden Gene,
welche bei der antiviralen Immunantwort eine essentielle Rolle spielen, wurden auch nach der
Infektion mit dem RV1b analysiert. Die Inkubation mit dem RV1b führte in den Wildtyp141
Ergebnisse
Zellen zu einer Erhöhung der Ifn mRNA Expression im Vergleich zu nicht infizierten
Zellen, was auf eine normale antivirale Immunantwort schließen lässt (s. Abb. 6-33 A). Auch
in den Zellen mit einem IL-17A Gendefekt hatte der Kontakt mit dem RV1b einen
tendenziellen Anstieg der Ifn Genexpression zur Folge (s. Abb. 6-33 A). Die Untersuchung
des antiviralen Gens Oas1g auf mRNA Ebene ergab jedoch, dass auch eine Virusinfektion
den Defekt dieser Synthetase in IL-17A defizienten Zellen nicht zurücksetzen kann, sodass
die Oas1g mRNA auch in den infizierten Zellen nicht nachweisbar war (s. Abb. 6-33 B).
Abb. 6-33 Analyse der Ifn und Oas1g mRNA Expression in infizierten, generierten Mastzellen: Aus dem
Knochenmark von wt- und IL-17A(-/-) Mäusen wurden Mastzellen differenziert und anschließend mit dem RV1b infiziert.
Auf mRNA Ebene wurden Ifn und Oas1g weiter untersucht. (A) Die Infektion mit dem RV1b führte in wt Zellen zu einer
signifikant gesteigerten Expression von Ifn. Auch bei IL-17A defizienten Zellen kam es tendenziell zu einer Erhöhung der
Expremierung. B) Trotz viraler Infektion konnte in den IL-17A defizienten Zellen keine Oas1g mRNA nachgewiesen
werden.
6.3.6.2 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von CD4+ T-Zellen der
Lunge mit dem Rhinovirus 1b
Die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten erfolgt nach
Aufnahme, Prozessierung und Präsentation von Antigenen durch APCs (s. 3.2). Außerdem hat
man herausgefunden, dass Rhinoviren die Antigen-Präsentation umgehen können und so
humane T-Zellen direkt infizieren und aktivieren können (Ilarraza et al., 2013).
Um die Rolle des Zytokins IL-17A in Zusammenhang mit viralen Infektionen und Asthma
bronchiale auf der Ebene von CD4+ T-Zellen zu untersuchen, wurden diese Zellen aus den
142
Ergebnisse
Gesamtzellen der Lunge von gesunden und an Asthma erkrankten Wildtyp- und IL-17A
defizienten Mäusen isoliert und mit dem RV1b infiziert. Nach 24 h Zellkultur wurde die RNA
der Zellen näher untersucht. Zunächst wurde mittels PCR bestätigt, dass die Infektion mit dem
RV1b erfolgreich verlaufen ist (s. Abb. 6-34 A). Anschließend erfolgte mit Hilfe der
erhaltenen Banden die genauere Bestimmung der Viruslast. Diese Analyse ergab, dass
innerhalb der gesunden Gruppe die IL-17A defizienten CD4+ T-Zellen eine höhere Viruslast
aufwiesen als die Zellen ohne Gendefekt (s. Abb. 6-34 B). Die Behandlung mit OVA führte
dazu, dass die CD4+ T-Zellen, welche aus den Lungen erkrankter Wildtyp-Mäuse isoliert
wurden, nicht mehr so effektiv gegen den Virus vorgehen konnten, was sich in einer
gesteigerten Viruslast im Vergleich zu gesunden Wildtyp-Zellen widerspiegelte. Der
Gendefekt zusammen mit der OVA-Behandlung in vivo und der viralen Infektion in vitro
ergab jedoch keinen weiteren Anstieg der viralen Infektion in den CD4+ T-Zellen, sodass
innerhalb der Asthmagruppe keine Unterschiede zwischen Wildtyp- und IL-17A defizienten
Zellen nachweisbar war. Dies lässt darauf schließen, dass eine Vorbelastung mit einem
Allergen die virale Immunantwort in Wildtyp-Zellen beeinträchtigte (s. Abb. 6-34 B).
Abb. 6-34 Analyse virusinfizierter CD4+ T-Zellen im murinen Asthmamodell: Aus den Lungengesamtzellen von gesunden
und asthmatischen Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen wurden CD4+ T-Zellen aufgereinigt und anschließend mit dem
RV1b infiziert. A) Mittels PCR-Analyse wurde bestätigt, dass die Infektion bei allen Analyseproben erfolgreich verlaufen war.
B) Die Quantifizierung der erhaltenen PCR-Banden zeigte, dass IL-17A(-/-) CD4+ T-Zellen von gesunden Mäusen im Gegensatz
zu den Zellen aus wt Mäusen eine erhöhte Viruslast aufwiesen. Die Behandlung mit OVA führte bei anschließender in vitro
Infektion mit dem RV1b nur bei Wildtyp CD4+ T-Zellen zu einer weiteren Steigerung der Viruslast.
143
Ergebnisse
Wie in Abb. 6-26 A (s. Abschnitt 6.3.3) bereits gezeigt werden konnte, führte eine
Allergendisposition bei Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäuse zu einer verminderten
IfnGenexpression. Da Typ I Interferone durch Viren induziert werden (Randall and
Goodbourn, 2008), sollte nun untersucht werden, ob der vorher beschriebene Defekt nach
einer viralen Infektion weiterhin bestehen bleibt. Zu diesem Zweck wurden die
CD4+ T-Zellen der Lunge von naiven und asthmatischen Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen mit
dem RV1b infiziert und für 24 h kultiviert. Die nachfolgenden Analysen mittels qPCR
ergaben, dass die durch Allergendisposition ausgelöste Suppression des Typ I Interferons
auch durch die virale Infektion nicht ausgeglichen werden konnte (s. Abb. 6-35 A). So wiesen
IL-17A defiziente CD4+ T-Lymphozyten von asthmatischen Mäusen signifikant weniger Ifn
mRNA auf als die Zellen der naiven IL-17A(-/-) Mäuse nach Inkubation mit dem RV1b. Eine
ähnliche Tendenz konnte auch bei den Wildtyp-Zellen beobachtet werden. Dennoch kam es
innerhalb der PBS-Gruppe durch Infektion mit dem RV1b zu einem signifikanten (IL-17A(-/-)
Mäuse) bzw. zu einem tendenziellen (Wildtyp-Mäuse) Anstieg der Ifn mRNA Expression.
Innerhalb der OVA-Gruppe neigten nur die CD4+ T-Zellen ohne IL-17A Defekt zu einer
vermehrten Ifn mRNA Bildung nach Kontakt mit dem Virus (s. Abb. 6-35 A). Dessen
ungeachtet verblieb die Oas1g Genexpression bei den Wildtyp-Mäusen in jeder Kondition auf
einem ähnlichen Niveau, wohingegen in den IL-17A defizienten Zellen dieses antivirale Gen
zu keinem Zeitpunkt nachweisbar war (s. Abb. 6-35 B).
144
Ergebnisse
Abb. 6-35 Ifn und Oas1g Genexpressions-Analyse in CD4+ Lungenzellen von naiven und asthmatischen Wildtypund IL-17A defizienten Mäusen nach in vitro Infektion mit dem RV1b: Aus den Lungen von naiven und mit Allergen
behandelten Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen wurden CD4+ T-Zellen isoliert und in vitro mit dem RV1b infiziert.
Nach 24 h Zellkultur erfolgte die Genexpressions-Analyse. A) Nach viraler Infektion kam es in naiven wt- und IL-17A(-/-)
Zellen zur vermehrten Ifn Expression. Ähnlich wie bei nicht infizierten Zellen führte eine vorherige Allergenbehandlung zu
einer Suppression der Genexpression in beiden Genotypen. B) Bei Wildtyp-CD4+ T-Zellen war die Bildung der Ifn mRNA
unabhängig von Allergenbehandlung und Virusinfektion. In den IL-17A defizienten Zellen konnte Oas1g in keiner der
analysierten Konditionen nachgewiesen werden.
Um herauszufinden, weshalb bei Wildtyp-Zellen ein bestehendes allergisches Asthma in
Kombination mit einer Virusinfektion zu einer erhöhten Viruslast führte, wurden die
Zellkulturüberstände dieser Zellen näher analysiert. So zeigte sich, dass der RV1b bei
allergenspezifischen CD4+ T-Zellen aus der Lunge die IL-17A Freisetzung unterdrückte (s.
Abb. 6-36).
Abb. 6-36 Analyse der IL-17A Freisetzung allergenspezifischer CD4+ T-Zellen aus der Lunge von Wildtyp Mäusen
nach in vitro Infektion mit dem RV1b: CD4+ T-Lymphozyten wurden aus den Gesamtzellen der Lunge von asthmatischen
Wildtyp-Mäusen isoliert, mit RV1b infiziert und für 24 h kultiviert. Anschließend wurde die Konzentration an IL-17A in den
Zellkulturüberständen analysiert. Es zeigte sich, dass der RV1b bei allergenspezifischen CD4 + T-Zellen die Freisetzung des
Zytokins IL-17A unterdrückt.
145
Ergebnisse
6.4 Die Rolle des Interleukins 17A im Krankheitsbild Asthma bronchiale bei
Vorschulkindern
Bei Vorschulkindern basiert die Diagnose des Asthma bronchiale meist auf den auftretenden
Symptomen, vorhandenen Risikofaktoren und dem Ansprechen auf Therapiemaßnahmen. Das
typische Krankheitsbild bei dieser Altersgruppe besteht aus kurzen, aber wiederkehrenden
Episoden von Husten und Giemen (Keuchen), welche häufig durch Infektionen der
Atemwege ausgelöst werden. Im Gegensatz zu älteren Kindern sind die Vorschulkinder durch
diese Symptome jedoch relativ wenig beeinträchtigt. Auf molekularer Ebene stehen bei
Kindern, ähnlich wie bei Erwachsenen, die Th2-Zellen und deren Zytokine im Vordergrund.
Man geht aber davon aus, dass in dieser Altersgruppe auch Th17-Zellen und IL-17A bereits
eine wichtige Rolle spielen, da man z. B. bei Kindern mit schwerem Asthma einen Anstieg
der IL17A Genexpression nachweisen konnte (Fitzpatrick et al., 2010; Bacharier and Guilbert,
2012; Alyasin et al., 2013).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit und im Zuge der PreDicta Studie (s 5.2.1) wurden in
Zusammenarbeit mit der Kinder- und Jugendklinik Erlangen gesunde und an Asthma
bronchiale erkrankte Kinder im Alter von vier bis sechs Jahren untersucht. Besonderer Fokus
lag auf der Analyse der PBMCs aus dem Blut dieser Kinder. Bei den Analysen wurde
weiterhin berücksichtigt, ob im jeweilig abgenommenen Nasopharynxabstrich Rhinoviren
nachweisbar waren.
In Erlangen nahmen 22 gesunde Kinder (Kontrollkinder) und 24 an Asthma bronchiale
erkrankte Kinder (Asthmakinder) an der PreDicta-Studie teil (s. 5.1.9). Die Kontrollkinder
waren zu Studienbeginn im Durchschnitt 4,6 Jahre alt (SEM ± 0,2 Jahre), die Asthmakinder
4,8 Jahre (SEM ± 0,1 Jahr; s. 5.1.9). Die Kontrollgruppe bestand aus 13 Jungen und neun
Mädchen, die Asthmagruppe aus 15 Jungen und ebenfalls neun Mädchen (s. 5.1.9). Bei 10
Kindern der Kontrollgruppe konnte eine Rhinovirusinfektion im oberen Respirationstrakt
146
Ergebnisse
nachgewiesen werden (s. 5.1.9). Bei vier Kindern dieser Gruppe was das Testergebnis nicht
eindeutig. Elf der an Asthma bronchiale erkrankten Kinder wurden positiv auf eine
Rhinoviren getestet. Bei zwei Kindern dieser Gruppe konnte kein aussagekräftiges Ergebnis
erzielt werden (s. 5.1.9). Innerhalb der Asthmagruppe wurden vier Kinder nur mit Steroiden
behandelt, wohingegen 13 Kinder eine Kombinationstherapie aus einem steroidalen und
einem nicht-steroidalen Medikament erhielten. Bei zwei Kindern der Asthmagruppe war eine
nicht-steroidale Behandlung vorgesehen und drei Kinder erhielten nur im akuten Notfall
Rescue Medikamente (s. 5.1.9).
6.4.1 Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 Genexpression in PBMCs
Da im murinen Modell bereits gezeigt werden konnte, dass zwischen dem Zytokin IL-17A
und dem antiviralen Gen OAS1 ein Zusammenhang zu bestehen scheint, wurden diese beiden
Faktoren auch in den humanen Analyseproben untersucht. Dazu wurden aus dem Vollblut
gesunder und erkrankter Kinder PBMCs isoliert. Anschließend wurden diese zum einen für
24 h in Anwesenheit von CD3 und CD28 Antikörpern kultiviert, um die IL-17A
Freisetzung analysieren zu können. Zum anderen kultivierte man die Zellen ohne weitere
Stimuli für 48 h, um nachfolgend die RNA zu isolieren und Expressionsanalysen
durchzuführen.
Nach 24 h Kultur sezernierten PBMCs von asthmatischen Kindern, welche ein positives
Testergebnis für Rhinoviren im Nasopharynxabstrich hatten, signifikant weniger IL-17A als
Kinder mit Asthma, die nicht durch Rhinoviren belastet waren (s. Abb. 6-37 A). Weiterhin
ergab sich, dass die OAS1 mRNA Expression in diesen Kindern ebenfalls reduziert vorlag (s.
Abb. 6-37 B).
147
Ergebnisse
Abb. 6-37 Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 mRNA Expression in PBMCs von Vorschulkindern:
PBMCs aus dem Vollblut von Kontroll- und Asthmakindern wurden entweder für 24 h oder 48 h kultiviert. A) Nach 24 h
Zellkultur wurde die IL-17A Proteinkonzentration ermittelt. Es zeigte sich, dass die PBMCs von Kindern mit Asthma,
welche in vivo mit Rhinoviren belastet waren, weniger IL-17A freisetzten. B) Nach 48 h Zellkultur wurde aus den PBMCs
die RNA isoliert, um die OAS1 Genexpression zu untersuchen. Die PBMCs von Kindern mit Asthma, welche positiv auf
Rhinoviren getestet wurden, exprimierten signifikant weniger OAS1 mRNA im Vergleich zu Kindern mit Asthma, welche
nicht mit Rhinoviren belastet waren.
6.4.2 Analyse der IFN und TYK2 Genexpression in PBMCs
Die Interferone sind die wichtigsten Bestandteile der antiviralen Immunantwort. Sie initiieren
den antiviralen OAS-RNaseL-Signalweg, wobei die Signaltransduktion u. a. über Tyk-2
weiter vermittelt wird. Um herauszufinden, ob die Ursache für die reduzierte OAS1 mRNA
Expression eine beeinträchtigte Signalkaskade war, wurde sowohl die IFN als auch TYK2
Genexpression untersucht. Die Analyse der PBMCs auf mRNA Ebene ergab, dass IFNbei
Kindern mit Asthma, welche zum Zeitpunkt der Untersuchung in den oberen Atemwegen eine
Rhinovirusinfektion aufwiesen, vermehrt gebildet wurde (s. Abb. 6-38 A). Dies hatte
allerdings keine Auswirkungen auf die Expression der nachgeschalteten Tyrosinkinase TYK2
(s. Abb. 6-38 B).
148
Ergebnisse
Abb. 6-38 Analyse der IFNund TYK2 Genexpression in PBMCs von Vorschulkindern: Nach 48 h Zellkultur wurde
aus den isolierten PBMCs die RNA extrahiert, in cDNA umgeschrieben und die IFN bzw. TYK2 Genexpression untersucht.
A) Kinder mit Asthma, deren Nasenabstrich positiv auf Rhinoviren getestet wurde, wiesen mehr IFN mRNA auf als
asthmatische Kinder mit negativem Testergebnis. B) Die TYK2 Genexpression wurde in den untersuchten Kontroll- und
Asthmakindern nicht von Rhinoviren oder Asthma bronchiale beeinflusst.
6.4.3 Analyse von IL-17A-inhibierenden Faktoren
Nachdem geklärt wurde, dass die verminderte Bildung der OAS1 mRNA nicht auf eine
Beeinträchtigung des Interferonsignals zurückzuführen ist, wurden als nächstes Faktoren
analysiert, welche IL-17A negativ beeinflussen, da aufgrund der vorherigen Ergebnisse davon
ausgegangen wurde, dass IL-17A und OAS1 im direkten Zusammenhang stehen. Dazu
wurden die beiden Transkriptionsfaktoren T-BET und ETS1 untersucht, von denen bekannt
ist, dass sie IL-17A supprimieren (Moisan et al., 2007; Reppert et al., 2011; Yeh et al., 2014).
Dazu wurden die PBMCs von gesunden und an Asthma erkrankten Kindern für 48 h
kultiviert, die RNA der Zellen extrahiert und auf mRNA Ebene weiter untersucht. Es zeigte
sich, dass bei Kindern mit Asthma eine Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen eine
gesteigerte T-BET mRNA Expression zur Folge hatte (s. Abb. 6-39 A). Auch die ETS1
mRNA wurde in diesen Kindern tendenziell vermehrt gebildet (s. Abb. 6-39 B).
149
Ergebnisse
Abb. 6-39 Analyse der T-BET und ETS1 Genexpression in gesunden und an Asthma erkrankten Vorschulkindern:
PBMCs aus dem Vollblut von Kontroll- und Asthmakindern wurden nach 48 h Zellkultur auf der mRNA Ebene untersucht.
A) Die PBMCs von Kindern mit Asthma und mit einer Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen exprimierten
signifkant mehr T-BET mRNA im Vergleich zu Asthmakindern ohne Rhinovirusinfektion. B) Der Transkriptionsfaktor ETS1
wurde in Kindern mit Asthma und einem positiven Rhinovirusnachweis in Nasopharynxabstrich tendenziell vermehrt
gebildet. In der entsprechenden Gruppe der Kontrollkinder wurde kein Unterschied in der ETS1 mRNA Expression gefunden.
Bisherige Studien zeigten, dass T-BET in CD4+ T-Zellen von Kindern mit Asthma vermindert
exprimiert wurde (Munthe-Kaas et al., 2008), wohingegen IL-6 bei Patienten mit Asthma
vermehrt gebildet wurde (Broide et al., 1992; Marini et al., 1992; Yokoyama et al.,
1995).Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zeigen, dass es bei Kindern mit Asthma eine
inverse Korrelation zwischen T-BET und IL-6 gibt. Dies bedeutet, dass in diesen Kindern eine
reduzierte T-BET Genexpression mit dazu relativ erhöhten IL-6 mRNA Werten einhergeht
(Koch et al., 2013).
Aufgrund dieser vorherigen Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe, wurden in der vorliegenden
Arbeit die Expressionswerte unter Berücksichtigung einer viralen Infektion in den oberen
Atemwegen weiter analysiert. So konnte beobachtet werden, dass bei Kontrollkindern mit
positivem Testergebnis für Rhinoviren im Nasenabstrich ebenfalls eine inverse Korrelation
der IL-6 und T-BET mRNA Expression vorlag (s. Abb. 6-40). Bei Kindern mit Asthma und
einer Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen konnte dieser Trend zwar immer noch
beobachtet werden, allerdings nicht mehr so stark ausgeprägt, wie bei den Kontrollkindern (s.
Abb. 6-40).
150
Ergebnisse
Abb. 6-40 Korrelation der IL-6 und T-BET mRNA Expression in den PBMCs von Kontroll- und Asthmakindern mit
positiven Rhinovirusnachweis im Nasenabstrich: Aus dem Vollblut von Kontroll- und Asthmakindern, bei welchen
Rhinoviren im Nasopharynxabstrich nachgewiesen werden konnten, wurden PBMCs isoliert. Nach Extraktion der RNA
wurde auf mRNA Ebene die Expression von IL-6 und T-BET analysiert und miteinander korreliert. Es zeigte sich, dass
sowohl bei gesunden Kindern als auch bei Kindern mit Asthma eine inverse Korrelation vorlag, wobei diese bei den
Kontrollkindern stärker ausgeprägt war.
6.4.4 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A in der humanen
Epithelzellline A549
In den Atemwegen gehören Epithelzellen zu den ersten Zelltypen, die mit Krankheitserregern
in Kontakt treten. Unter Berücksichtigung der vorherigen Ergebnisse in murinen und
humanen Analyseproben, wurden unter Verwendung der humanen Epithelzelllinie A549 die
antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A weiter untersucht. Zu diesem Zweck erfolgte
zunächst eine Infektion der A549 Zellen mit dem RV1b (s. 5.2.4) mit anschließender 24stündiger Zellkultur in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von rIL-17A (s.
5.2.2). Die Analyse der Viruslast mittels PCR zeigte, dass IL-17A konzentrationsabhängig die
intrazelluläre Replikation des RV1b unterdrückte (s. Abb. 6-41 A und B), ohne dabei die
LDH Aktivität nennenswert zu beeinflussen (s. Abb. 6-41 C). Zusätzlich konnte auf mRNA
Ebene beobachtet werden, dass es bei der spezifischen Konzentration von 25 ng/ml rIL-17A
zu einem signifikanten Anstieg der antiviralen Oas1g Expressionswerte kam (s. Abb. 6-41 D).
151
Ergebnisse
Abb. 6-41 Analyse humaner A549 Zellen nach Infektion mit dem RV1b und Zellkultur mit unterschiedlichen
Konzentrationen rIL-17A: Zellen der humanen Epithelzellline A549 wurden zunächst mit dem RV1b infiziert und danach
für 24 h in Anwesenheit ansteigender Dosen rIL-17A kultiviert. A und B) Die Analyse der Viruslast mittels PCR ergab eine
dosisabhängige Suppression der viralen Replikation in A549 Zellen. C) Die LDH Aktivität wurde nur bei einer Konzentration
von 12,5 ng/ml rIL-17A signifikant vermindert. D) Die Expression von OAS1 wurde bei einer definierten Menge von 25 ng/ml
rIL-17A nach Virusinfektion induziert. (Bei der Auswertung der OAS1 Genexpression mittels der ∆∆ct-Methode, wurden die
Konditionen „12,5 / 25 / 50 -RV1b“ auf die Kondition „unstimuliert –RV1b“ bezogen, die Konditionen „12,5 / 25 / 50
+RV1b“ wurden auf die Kondition „unstimuliert + RV1b“ bezogen. So ergibt sich, dass + p ≤ 0,05 verglichen mit Kondition
„50 ng/ml rIL-17A –RV1b“ und # p ≤ 0,05 verglichen mit Kondition „25ng/ml rIL-17A +RV1b“ bedeutet.)
152
Ergebnisse
6.4.5 Analyse der Einflussnahme von Arzneimitteln auf die antivirale Immunantwort
Wie in Kapitel 3.1.5 beschrieben, wird das Asthma bronchiale hauptsächlich mit inhalativen
Corticosteroiden oder kurz- und langwirksamen β2-Sympathomimetika behandelt. Im Falle
einer Verschlimmerung der Symptome, welche z. B. durch eine virale Infektion
hervorgerufen werden können, kann es kurzfristig zu einer Erhöhung der einzunehmenden
Dosis kommen oder zur Anwendung inhalativer Glucocorticoide (= Steroide), falls diese in
der sonstigen Therapie noch nicht verwendet werden. Grundsätzlich dienen diese
Medikamente der Unterdrückung der Entzündungsreaktion (Steroide) bzw. der Erweiterung
der Bronchien (β2-Sympathomimetika). Hier sollte aber auch analysiert werden, wie sich die
Medikamente auf die IL-17A und OAS1 Genexpression auswirkt. Dazu wurde zum einen
direkt aus dem Vollblut bzw. aus frisch isolierten PBMCs RNA isoliert, in cDNA
umgeschrieben, um die jeweilige Genexpression mittels qPCR Analyse zu ermitteln. Es stellte
sich heraus, dass im Vollblut von Kindern mit Asthma, welche nicht mit Steroiden behandelt
wurden, tendenziell mehr IL-17A exprimiert wurde als bei gesunden Kindern oder bei
Kindern mit Asthma, welche ein Steroid alleine oder in Kombination mit einem anderen
nicht-steroidalen Medikament erhielten (s. Abb. 6-42 A). Weiterhin zeigte sich, dass sich die
nicht-steroidale Behandlung auch positiv auf die OAS1 mRNA Expression auswirkte. Hier
war im Vergleich zu gesunden Kindern und Asthmakindern, bei welchen in der Therapie ein
Steroid enthalten war, ein statistisch signifikanter Anstieg der Genexpression zu verzeichnen
(s. Abb. 6-42 B). Dies lässt darauf schließen, dass man mithilfe von Arzneimitteln bei
Kindern mit bestehendem Asthma bronchiale die antivirale Immunantwort beeinflussen kann.
153
Ergebnisse
Abb. 6-42 Analyse der IL-17A und OAS1 Genexpression unter Berücksichtigung der Arzneimitteltherapie: Aus dem
Gesamtblut von Kontrollkindern und Kindern mit Asthma wurde entweder direkt RNA extrahiert oder zunächst PBMCs
isoliert, um anschließend aus diesen RNA zu extrahieren. Nach der cDNA Synthese wurden IL-17A und OAS1 auf mRNA
Ebene mittels qPCR weiter analysiert. A, B) Eine Therapie ohne Steroide steigert bei Kindern mit Asthma sowohl die IL-17A
Expression (A) als auch die OAS1 Genexpression (B).
154
Diskussion
7
Diskussion
Asthma bronchiale, eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege, gehört mit zu
den häufigsten chronischen Erkrankungen. Zu den ca. 300 Millionen Betroffenen weltweit
zählen sowohl Kinder als auch Erwachsene. Da die zugrunde liegenden molekularen Abläufe
noch nicht vollständig geklärt sind, ist die Erkrankung bist jetzt nur therapierbar, aber noch
nicht heilbar. Zur Immunpathogenese des Asthma bronchiale tragen eine Vielzahl
verschiedener Zelltypen bei, wobei das Ungleichgewicht zwischen Th1- und Th2-Zellen, aber
auch der Einfluss von Th17- und Treg Zellen von entscheidender Bedeutung sind. Zu den
Hauptsymptomen gehören Episoden akuter Atemnot, sowie eine reversible Obstruktion der
Atemwege, eine bronchiale Hyperreaktivität und eine Entzündung der Atemwege (Finotto and
Glimcher, 2004; Ukena et al., 2008; Barnes, 2010).
In der vorliegenden Arbeit wurden IL-17A defiziente Mäuse untersucht. Dieses Zytokin wird
von Th17-Zellen und einer Vielzahl anderer Zellen, wie z. B. Tc17-, NK-, NKT- und
Mastzellen, gebildet (Molet et al., 2001; Korn et al., 2009; Alcorn et al., 2010; Suurmond et
al., 2011; Zhu and Qian, 2012). Diesem Zytokin werden u. a. entzündungsfördernde
Eigenschaften zugeschrieben. So stellte man bereits fest, dass IL-17A im Sputum, in den
PBMCs und im Lungengewebe von Patienten mit Asthma bronchiale in erhöhten
Konzentrationen vorlag (Bullens et al., 2006; Alcorn et al., 2010). Es konnte auch gezeigt
werden, dass IL-17A mit der Schwere der Erkrankung korreliert, besonders bei Neutrophilvermittelten Entzündungsreaktionen und steroidresistentem Asthma (Chakir et al., 2003;
Bullens et al., 2006; Al-Ramli et al., 2009). Außerdem geht man davon aus, dass IL-17A bei
der Ausbildung der bronchialen Hyperreagibilität beteiligt ist (Barczyk et al., 2003), wobei
sich hier die Ansichten, ob IL-17A eine positive oder negative Wirkung hat,
auseinandergehen. Man geht auch davon aus, dass dieses Interleukin bei der für Asthma
typischen Mukushypersekretion beteiligt ist, indem es auf Muzin-Gene einwirkt (Chen et al.,
155
Diskussion
2003). Zum Teil wurden für IL-17A jedoch auch anti-inflammatorische Eigenschaften
beschrieben, besonders in Zusammenhang mit γδ-T-Zellen (Sutton et al., 2009; Murdoch and
Lloyd, 2010). Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die jeweilige Rolle von IL-17A, probzw. anti-inflammatorisch, vom jeweiligen Zelltyp abhängt.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, wie sich eine IL-17A Defizienz auf die
Immunpathogenese des allergischen Asthmas auswirkt. Dies geschah in einem murinen
Modell allergischen Asthmas. Um bei den Mäusen Asthma zu induzieren, wurde ein Protokoll
verwendet, welches in unserer Arbeitsgruppe gut etabliert ist und bereits seit längerer Zeit
angewandt wird (Finotto et al., 2001; Finotto et al., 2002; Maxeiner et al., 2007; Doganci et
al., 2008a). Hierbei wird ein Krankheitsbild hervorgerufen, welches mit dem im Menschen
vergleichbar ist. Zu den auftretenden Symptomen zählt sowohl die Entstehung der AHR, als
auch das Einwandern inflammatorischer Zellen ins Lungengewebe oder die verstärkte
Entwicklung von Th2-Zellen. Um die durch die Asthmaerkrankung hervorgerufenen
immunologischen Vorgänge in den IL-17A defizienten Mäusen besser beurteilen zu können,
wurden in den einzelnen Versuchen gesunde und an Asthma erkrankte Wildtyp-Mäuse
mitgeführt, welche jeweils als Kontrollgruppe dienten.
Asthma bronchiale ist bis heute nur therapierbar, aber noch nicht heilbar. Ziel der Forschung
ist es, dieses Defizit auszugleichen. Ein Schritt in diese Richtung ist die gezielte Induktion
einer Atemwegstoleranz. Charakteristisch für eine allergische Reaktion ist die überschießende
Immunreaktion auf ein eigentlich harmloses Antigen. Bei der Atemwegstoleranz handelt es
sich um eine spezielle Form der körpereigenen Immunüberwachung, bei der harmlose
Antigene von Pathogenen unterschieden werden und so nur gegen potenziell gefährliche
Faktoren vorgegangen wird. Aus diesem Grund geht man davon aus, dass die Induktion einer
Atemwegstoleranz eine effektive Möglichkeit darstellt, vor der Entstehung von Asthma
bronchiale zu schützen bzw. das Auftreten der Erkrankung besser kontrollieren zu können
156
Diskussion
(Andreev et al., 2012). IL-17A zählt zu den pro-inflammatorischen Zytokinen und wird v. a.
mit der durch neutrophile und eosinophile Granulozyten vermittelten Entzündungsreaktion in
Verbindung gebracht. Da es sich hierbei um ein charakteristisches Symptom der Erkrankung
handelt, könnte IL-17A ein geeignetes Therapieziel darstellen. Es konnte bereits gezeigt
werden, dass sowohl die direkte Blockade von IL-17A, als auch vor- und nachgeschalteter
Faktoren zu einer verminderten Anzahl an eosinophilen und neutrophilen Granulozyten sowie
Th2-Zytokinen führt (Andreev et al., 2012). Jedoch sind weitere Studien nötig, um einen
besseren Einblick in die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zu erhalten. In der
vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welche Rolle das Zytokin IL-17A bei der
Atemwegstoleranz spielt. Zu diesem Zweck wurde ein murines Modell herangezogen. Um in
Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen eine Atemwegstoleranz zu induzieren, wurden sie vor der
Sensibilisierungsphase intranasal mit dem Allergen OVA behandelt. Dies geschah in
Anlehnung an ein bereits etabliertes und zuvor beschriebenes Protokoll (Akbari et al., 2001).
Als Kontrollgruppen dienten sowohl unbehandelte als auch astmatische Wildtyp- und IL-17A
defiziente Mäuse.
Es ist mittlerweile auch bekannt, dass IL-17A bei der Abwehr extrazellulärer Pathogene,
insbesondere von Bakterien und Pilzen, eine wichtige Rolle spielt. Außerdem geht man davon
aus, dass IL-17A bei der durch Viren hervorgerufenen Immunantwort beteiligt ist. Dies äußert
sich im Falle einer Influenza Infektion z. B. in einer durch IL-17A hervorgerufenen
Entzündungsreaktion, welche den Virus an seiner Ausbreitung hindern soll. Es ist jedoch auch
in diesem Fall noch nicht vollständig geklärt, ob bzw. wann IL-17A pro- bzw. antiviral wirkt
(Gaffen, 2011; Martinez et al., 2012). So wurde einerseits beschrieben, dass IL-17A nach
primären Infektionen mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus zur Mukushypersekretion
und zur vermehrten viralen Last beiträgt, anderseits unterdrückte IL-17A während dieser
Erkrankung die AHR und die Entzündungsreaktion (Newcomb et al., 2013). Zusätzlich
157
Diskussion
scheint die jeweilige Rolle des Interleukins davon abzuhängen, ob neben der viralen Infektion
noch eine weitere Erkrankung, wie z. B. Asthma vorliegt. Daraus lässt sich schließen, dass die
Hauptfunktion des Zytokins IL-17A sowohl vom jeweiligen Virus als auch von den
immunologischen
Gegebenheiten
im
Wirt
abhängen.
Daher
sind
noch
weitere
Untersuchungen notwendig, um die jeweiligen Mechanismen zu verstehen. In der
vorliegenden Arbeit wurde eingehender untersucht, welche Rolle IL-17A nach Infektionen
mit dem RV1b bei bestehendem allergischen Asthma spielt. Dazu wurden sowohl humane
Epithelzellen (A549 Zellen) als auch murine Zellen von naiven und asthmatischen Mäusen in
vitro mit dem RV1b infiziert. Zu diesem Zweck wurden die Zellen für eine Stunde unter
ständigem Schütteln mit einer Suspension, welche den RV1b enthielt, inkubiert und
anschließend kultiviert. Hierbei orientierte man sich an Protokollen anderer Arbeitsgruppen
(Papadopoulos et al., 2000; Papadopoulos et al., 2002).
In einem weiteren Teil der Arbeit wurden im Zuge der PreDicta-Studie gesunde und an
Asthma erkrankte Kinder untersucht. Asthma bronchiale ist bei Kindern die am häufigsten
auftretende chronische Erkrankung, wobei sie bei den meisten Kindern schon vor dem
5. Lebensjahr ausbricht. Bei Kindern wird meist atopisches Asthma diagnostiziert, welches
häufig aus dem sogenannten Etagenwechsel hervorgeht. Aber auch andere Umweltfaktoren,
wie z. B. virale Infekte scheinen bei der Pathogenese in diesem Alter eine wichtige Rolle zu
spielen. Es ist jedoch noch nicht eindeutig geklärt, wie sich gehäufte Virusinfektionen im
Kindesalter auf die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung auswirken. Es besteht die
Annahme, dass zahlreiche virale Infekte gesunde Kinder davor schützen, in späteren Jahren
an Asthma zu erkranken. Bei Kindern, die bereits an dieser entzündlichen Erkrankung leiden,
tragen vermehrte Virusinfektionen eher zu einer Verschlimmerung und Chronifizierung des
Asthmas bei. Im Zuge der PreDicta-Studie wurden Vorschulkinder über einen Zeitraum von
zwei Jahren hinweg untersucht, um u. a. zu erforschen, wie sich Virusinfektionen auf den
158
Diskussion
Verlauf der Erkrankung auswirken. Dazu wurde den Kindern zum einen Vollblut
abgenommen, um daraus PBMCs zu isolieren und nachfolgend zu analysieren. Des Weiteren
wurde bei den einzelnen Besuchen ein Nasenabstrich abgenommen, um diesen auf Viren hin
zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurden die aus der Analyse der PBMCs
hervorgegangen Ergebnisse mit einer Rhinovirusinfektion der oberen Atemwege in
Verbindung gesetzt, um so herauszufinden, wie sich eine virale Infektion auf molekularer
Ebene auswirkt.
7.1 IL-17A beeinflusst den Phänotyp bei allergischem Asthma bronchiale
In zahlreichen humanen und murinen Studien wurde bereits festgestellt, dass IL-17A bei der
Entstehung und dem Verlauf der Asthmaerkrankung beteiligt ist. Allerdings lieferten die
murinen Studien z. T. widersprüchliche Ergebnisse, ob diesem Zytokin nun eher protektive
oder entzündungsförderende Eigenschaften zuzuschreiben sind. Gründe dafür könnten die
unterschiedlichen verwendeten Protokolle oder Mausstämme sein. In der vorliegenden Arbeit
wurde ein Asthmamodell verwendet, welches vergleichbare Symptome hervorruft wie bei
Menschen. Mithilfe dieses Modells sollte in IL-17A defizienten Mäusen der Phänotyp bei
allergischen Asthma bronchiale näher untersucht werden.
7.1.1 IL-17A beeinflusst die Entstehung der AHR
Ob und wie IL-17A die AHR beeinflusst war bereits Gegenstand zahlreicher Untersuchungen
verschiedener Arbeitsgruppen, ohne dabei ein eindeutiges Ergebnis zu erhalten. So
beobachtete z. B. Nakae et al. in IL-17A defizienten Mäusen 24 h nach der letzten OVABehandlung normale Penh-Werte (Nakae et al., 2002). Das Verabreichen eines anti-IL-17
monoklonalen
Antikörpers
fördert
bei
Wildtyp-Mäusen
dagegen
widersprüchliche
159
Diskussion
Erkenntnisse zu Tage. So wurde sowohl von einer reduzierten, einer gesteigerten als auch
einer unveränderten AHR berichtet (Hellings et al., 2003; Schnyder-Candrian et al., 2006; He
et al., 2007). Diese Beobachtungen scheinen zum einen vom jeweiligen Behandlungsprotokoll
aber auch vom Zeitpunkt der Verabreichung des Antikörpers abzuhängen. Man geht davon
aus, dass IL-17A zwar einerseits bei der Entstehung der AHR benötigt wird, bei etabliertem
Asthma allerdings eher vor der AHR schützt (Schnyder-Candrian et al., 2006). Im
vorliegenden Modell wurde mit Hilfe einer nicht-invasiven Methode eine erhöhte AHR in
IL-17A(-/-) Mäusen beobachtet. Wendet man für die Analyse jedoch eine invasive Methode an,
so kommt man zu dem Ergebnis, dass IL-17A defiziente Mäuse bei niedrigen
Konzentrationen des Bronchokonstriktors Methacholin zunächst stärker reagieren als
Wildtyp-Mäuse, erhöht man allerdings die Dosis, so weisen die asthmatischen
Wildtyp-Mäuse eine gesteigerte Reaktion auf. Die beobachteten Unterschiede basieren
möglicherweise auf den zwei unterschiedlichen Analysemethoden. Die nicht-invasive
Plethysmographie berücksichtigt auch den Einfluss des Atemwegswiderstandes im oberen
Respirationstrakt. Dort sind Änderungen der Glottis und der nasalen Passage zu verzeichnen,
so dass das exakte Ausmaß und die Lokalisation der Bronchokonstriktion nicht genau
nachvollziehbar sind. Da bei der invasiven Methode die oberen Atemwege umgangen werden,
ist diese Methode daher sensitiver und spezifischer für die Erfassung pulmonaler
Mechanismen (Glaab et al., 2007). IL-13, ein Th2-Zytokin, ist ebenfalls an der Entstehung der
AHR beteiligt. Hier gibt es Hinweise, dass IL-17A dieses Interleukin beeinflusst (Kinyanjui et
al., 2013). Da im vorliegenden Modell erhöhte IL-13 Konzentrationen in der BALF und eine
große Anzahl IL-13+CD4+ T-Lymphozyten in der Lunge nachgewiesen werden konnten, ist es
möglich, dass dieses Zytokin an der Ausbildung der AHR beteiligt war. Des Weiteren
existieren Hinweise darauf, dass IL-17A-produzierende γδ-T-Zellen bei den Prozessen,
welche zum Abklingen der AHR führen, beteiligt sind (Murdoch and Lloyd, 2010). Aufgrund
der beobachteten Ergebnisse bezüglich der AHR besteht die Möglichkeit, dass dieser Zelltyp
160
Diskussion
in IL-17A defizienten Mäusen beeinträchtigt ist. Diese Vermutung bedarf allerdings noch
eingehender Untersuchungen.
7.1.2 IL-17A fördert neutrophile Granulozyten
Man geht davon aus, dass IL-17A für die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten
verantwortlich ist. Dies konnte bereits im Mausmodell demonstriert werden, indem WildtypMäuse mit monoklonalen Antikörpern gegen IL-17 behandelt wurden, was zu einer
Reduktion der neutrophilen Granulozyten führte (Hellings et al., 2003; He et al., 2007). Auch
im vorliegenden Modell allergischen Asthmas konnte in IL-17A defizienten Mäusen eine
verringerte Anzahl an neutrophilen Granulozyten in der BALF im Vergleich zu
Wildtyp-Mäusen nachgewiesen werden. Bezüglich der Beteiligung an der Aktivierung und
Rekrutierung eosinophiler Granulozyten ist die Datenlage weniger eindeutig. So wurden zwar
in IL-17A- und IL-17RA defizienten Mäusen weniger eosinophile Granulozyten in der BALF
vorgefunden (Schnyder-Candrian et al., 2006; Yang et al., 2008a), behandelte man jedoch
Wildtyp-Mäuse mit monoklonalen Antikörpern, welche gegen IL-17A gerichtet waren, so
wurde zum einen ein Anstieg dieser Zellen verzeichnet (Schnyder-Candrian et al., 2006), aber
auch gleichbleibende Level (Hellings et al., 2003; He et al., 2007; Pichavant et al., 2008).
Dies veranlasst wieder zu der Schlussfolgerung, dass der jeweilige Effekt von dem Zeitpunkt
der IL-17A Neutralisation und dem zugrundeliegenden Protokoll abhängt.
In der vorliegenden Arbeit konnte nach Behandlung mit dem Allergen zwar ein signifikanter
Anstieg der eosinophilen Granulozyten in asthmatischen IL-17A defizienten Mäusen im
Vergleich zu naiven IL-17A(-/-) Mäusen beobachtet werden, innerhalb der OVA-Gruppe
waren jedoch keine weiteren Unterschiede zu verzeichnen. Diesbezüglich ist die derzeitige
Datenlage wiederum nicht eindeutig. So konnte zum einen beobachtet werden, dass die
Neutralisation des Zytokins IL-17A vor der Behandlung mit OVA zu einem enormen Anstieg
161
Diskussion
der eosinophilen Granulozyten in den Atemwegen führt, allerdings konnte in IL-17A
defizienten Mäusen auch gezeigt werden, dass es nach OVA-induziertem Asthma zu keiner
außergewöhnlich gesteigerten Anzahl dieses Zelltyps kam (Hellings et al., 2003; Suzukawa et
al., 2012). Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass IL-17A v. a. bei der Differenzierung und
Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten beteiligt ist.
7.1.3 IL-17A ist ein wichtiger Faktor für die Differenzierung und das Überleben von
Mastzellen aus dem Knochenmark
Mastzellen bilden die Schnittstelle zwischen der unspezifischen und der spezifischen
Immunantwort und sind somit entscheidend für die Entstehung und den Verlauf der
Asthmaerkrankung. Aus diesem Grund wurde im vorliegenden murinen Asthmamodell auch
untersucht, ob dieser Zelltyp von IL-17A beeinflusst wird. An Asthma erkrankte IL-17A(-/-)
Mäuse hatten tendenziell weniger pulmonale CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen als
Wildtyp-Mäuse, obwohl auf mRNA-Ebene eine erhöhte Expression des Wachstumsfaktors
IL-9 nachgewiesen werden konnte. Wie zuvor bereits erwähnt produzierten diese Mäuse auch
mehr IL-4, einen weiteren Wachstumsfaktor der Mastzellen. IL-3, ebenfalls ein Faktor,
welcher für die Expansion von Mastzellen essentiell ist, war in naiven IL-17A(-/-) Mäusen
marginal verringert. Differenzierte man nun Mastzellen aus dem Knochenmark von naiven
Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen, so konnte man beobachten, dass aus den IL-17A
defizienten Knochenmarkszellen über den gesamten Zeitraum hinweg weniger Mastzellen
hervorgingen als aus dem Knochenmark der Wildtyp-Mäuse. Morphologisch betrachtet
erschienen diese Zellen auch weniger vorgefertigte Botenstoffe in ihren Granula gespeichert
zu haben, was sich auch in einer geringeren Konzentration an Histamin widerspiegelte. Dies
stimmt mit vorherigen Untersuchungen überein, bei denen ebenfalls Mastzellen aus dem
Knochenmark generiert und analysiert wurden. Auch hier wurde für IL-17A defiziente Zellen
162
Diskussion
eine verminderte Freisetzung von Botenstoffen und eine geringere Anzahl an degranulierten
Mastzellen beschrieben (Quan et al., 2012). Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass IL-17A
maßgeblich an der Degranulation von Mastzellen beteiligt ist.
Eine Erklärung für die beeinträchtigte Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark
von IL-17A defizienten Mäusen lieferte die Analyse der Zellkulturüberstände. Hier konnten
zu jedem Zeitpunkt stark erhöhte Konzentrationen an TGF-β nachgewiesen werden. Für
dieses Zytokin ist bereits beschrieben, dass es die IL-3 und IL-4 abhängige Proliferation von
Mastzellen negativ beeinflusst (Broide et al., 1989; Toyota et al., 1995). Auf diese Blockade
schienen die IL-17A(-/-) Zellen mit einer gesteigerten CD123 mRNA Expression zu reagieren.
Zusätzlich scheint IL-17A das Überleben von Mastzellen zu sichern. Eine gesteigerte
LDH-Aktivität in den Zellkulturüberständen von IL-17A defizienten Mastzellen lässt darauf
schließen, dass IL-17A vor Apoptose bzw. Nekrose schützt. Diese Vermutung geht einher mit
der Beobachtung, dass IL-17A T-Zellen vor der Apoptose bewahrt (Boggio et al., 2014).
Zusammengefasst deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass IL-17A
zum einen wichtig für die Differenzierung und das Überleben von Mastzellen ist und zum
anderen auch an der Einlagerung und Freisetzung von Mediatoren wie z. B. Histamin beteiligt
ist.
7.1.4 IL-17A hat keinen Einfluss auf die bronchiale Entzündung, aber auf die
bronchiale Mukusproduktion
Die Entzündung des Lungengewebes und die vermehrte Schleimproduktion sind
charakteristisch für Asthma bronchiale. Beides trägt zur erschwerten Atmung und zu einem
Engegefühl in der Brust bei. In der vorliegenden Arbeit sollte auch untersucht werden, ob das
Zytokin IL-17A in diesem Zusammenhang eine Rolle spielt. Hierbei wurde beobachtet, dass
dieses Interleukin keinen offensichtlichen Einfluss auf die bronchiale Entzündungsreaktion
163
Diskussion
nimmt. Bisherige Untersuchungen konnten zeigen, dass IL-17A nur in Abwesenheit der für
Th2-Zellen typischen Zyotikine IL-4 und IL-13 die Entzündungsreaktion fördert, was anhand
IL-4/IL-13 DKO (double knock out) Mäusen demonstriert wurde. Inhibierte man in diesen
Mäusen IL-17A mit Hilfe eines Antikörpers, so nahm der Entzündungsgrad ab (He et al.,
2009). Im vorliegenden Modell wurde sowohl IL-4 als auch IL-13 von IL-17A defizienten
Mäusen weiterhin gebildet. Man kann also davon ausgehen, dass die beobachtete
Entzündungsreaktion sehr wahrscheinlich auf die Anwesenheit dieser beiden Zytokine
zurückzuführen ist.
Es ist bereits bekannt, dass IL-17A die Expression der Mucine MUC5B und MUC5AC
induziert und somit zur Hypersekretion von Mukus beiträgt (Chen et al., 2003). Dies deckt
sich mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, da im Lungengewebe asthmatischer
IL-17A(-/-) Mäuse ein statistisch signifikanter Rückgang der schleimproduzierenden Zellen zu
verzeichnen war. Weiterhin ist bekannt, dass Mastzellen über die Freisetzung von Histamin
die Mucussekretion anregen (Urb and Sheppard, 2012). In der vorliegenden Arbeit konnte
gezeigt werden, dass der IL-17A-Defekt zum einen zum Rückgang von Mastzellen führt und
diese Mastzellen zudem weniger Histamin freisetzen. Im vorliegenden Modell scheint die
verminderte Anzahl an schleimproduzierenden Zellen in Zusammenhang mit dem
Mastzellendefekt zu stehen.
7.1.5 IL-17A ist nicht direkt am Immunglobulin-Klassenwechsel beteiligt
In humanen B-Zellen konnte nachgewiesen werden, dass IL-17A die IgE Produktion fördert
(Milovanovic et al., 2010). Dies würde darauf schließen lassen, dass in Abwesenheit dieses
Zytokins der Klassenwechsel zu IgE beeinträchtigt ist. Nach Induktion allergischen Asthmas
in IL-17A(-/-) Mäusen konnte jedoch im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen kein Unterschied in der
IgE-Produktion festgestellt werden. Dafür wurde jedoch gezeigt, dass sowohl der
164
Diskussion
Transkriptionsfaktor Batf als auch IL-4 in diesen Mäusen vermehrt gebildet und freigesetzt
wurden. Von beiden genannten Faktoren ist bekannt, dass sie eine entscheidende Rolle beim
Immunglobulin-Klassenwechsel und somit der Bildung von IgE spielen. Für IL-4 ist hierbei
beschrieben, dass es den Transkriptionsfaktor Nfil3 induziert, welcher direkten Einfluss auf
die Bildung des Immunglobulins E hat (Kashiwada et al., 2010; Ise et al., 2011). Mittels
Genearray konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass dieser
Transkriptionsfaktor in Abwesenheit von IL-17A verstärkt exprimiert wird. Insgesamt lässt
sich daraus schließen, dass der Einfluss von IL-17A auf die IgE-Bildung durch andere
Komponenten kompensiert werden kann. Diese Annahme lässt sich dadurch bestärken, dass
in vorherigen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass IL-17A B-Zellen zum Klassenwechsel
und zur bevorzugten Bildung von IgG2a und IgG3 veranlassen kann (Mitsdoerffer et al.,
2010).
7.1.6 IL-17A beeinflusst Th1- und Th2-Zytokine
In einem gesunden Organismus liegt eine Th1/Th2 – Balance vor. Beim allergischen Asthma
allerdings ist dieses Gleichgewicht in Richtung Th2–Immunantwort verschoben. In der
vorliegenden Arbeit sollte auch untersucht werden, welche Rolle das Zytokin IL-17A bei
diesem Gleichgewicht spielt. Es wurde bereits beschrieben, dass IL-17A im Stande ist, eine
bestehende Th2–Antwort zu reduzieren (Bettelli et al., 2006). In der vorliegenden Arbeit
konnte gezeigt werden, dass IL-17A im allergischen Asthma die Th2-Zytokine, insbesondere
IL-4, negativ beeinflusst. Dem entgegen steht ein induzierender Effekt in Hinblick auf IFN-γ,
welches typischerweise von Th1-Zellen gebildet wird. Ähnliches wurde bereits bei in vitro
Versuchen beobachtet (Tang et al., 2014). Eine mögliche Erklärung für die verminderte IFN-
Freisetzung in asthmatischen IL-17A(-/-) Mäusen liefern die Treg-Zellen und deren Zytokin
IL-10, welche trotz Gendefekt weiterhin gebildet wurden. Demzufolge regulieren Treg-Zellen
165
Diskussion
über IL-10 die Bildung des für Th1-Zellen typischen Zytokins IFN- (Sojka and Fowell,
2011). Des Weiteren fand man heraus, dass auch IL-4, welches im vorliegenden
Asthmamodell in der Abwesenheit von IL-17A erhöht vorlag, die IFN--Produktion inhibiert
(Wurtz et al., 2004). Es wurde für IFN- aber auch ein direkter negativer Feedback-Einfluss
auf die IL-4 Expression beschrieben (Elser et al., 2002). Dies dürfte erklären, weshalb bei
astmatischen IL-17A(-/-) Mäusen die IL-4 Produktion statistisch signifikant erhöht vorlag.
Weiterhin bestätigt dieses Ergebnis vorherige Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe, die
zeigen konnten, dass IL-17A in Abhängigkeit von Tyk-2 die Produktion von Th2-Zytokinen
unterbinden kann (Übel et al., 2014).
7.1.7 IL-17A nimmt keinen Einfluss auf Treg-Zellen im murinen Asthmamodell
Es wurde bisher beschrieben, dass Th17-Zellen und Treg-Zellen sich gegenseitig regulieren. So
hat man herausgefunden, dass der für Th17-Zellen typische Transkriptionsfaktor RORt den
für Treg-Zellen typischen Transkriptionsfaktor Foxp3 hemmt und umgekehrt (Zhou et al.,
2008; Hwang, 2010). In dieser Arbeit wurde sowohl in den Lungen von gesunden als auch
erkrankten IL-17A(-/-) Mäusen der Anteil an Treg-Zellen näher untersucht. So konnte
beobachtet werden, dass nach Konfrontation mit dem Allergen zwar vermehrt regulatorische
T-Zellen und auch deren Transkriptionsfaktor Foxp3 gebildet wurden, im Vergleich zu den
jeweiligen Wildtyp-Mäusen konnten jedoch keine weiteren Unterschiede festgestellt werden.
Zudem wurde nach der Behandlung mit OVA innerhalb der CD4+-Zellfraktion beider
Genotypen vermehrt das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 gebildet. Dies deckt sich mit
der von uns bereits beschriebenen Beobachtung, dass die Gabe von IL-17A nur in Verbindung
mit einer Tyk-2-Defizienz zu einem Rückgang der Treg-Zellen führte. Bei asthmatischen
Wildtyp-Mäusen hingegen führte die Behandlung mit rIL-17A zu keiner veränderten Anzahl
an regulatorischen T-Zellen (Übel et al., 2014).
166
Diskussion
7.2 IL-17A ist an der Entstehung der Atemwegstoleranz beteiligt
Bei gesunden Menschen führt die erste Konfrontation mit einem harmlosen Antigen zunächst
zu einer kurzfristigen lokalen Immunantwort, gefolgt von einer langfristigen peripheren
Toleranz. Bei Asthmatikern dagegen können solch harmlose Antigene eine ungewollte
Th2-Sensibilisierung und somit eine Th2-vermittelte Immunantwort auslösen, welche
charakteristisch
für
das
allergische
Asthma
bronchiale
ist.
Das
Hauptziel
der
Asthmaforschung besteht darin, einen Weg zu finden, wie man die überschießende
Immunreaktion eindämmen bzw. unterdrücken kann. In diesem Zusammenhang spielt die
Atemwegstoleranz eine wichtige Rolle, da sie einen möglichen Schutz vor Asthma bronchiale
darstellt, da v. a. regulatorische T-Zellen aktiviert werden (Andreev et al., 2012). Da neben
Th1- und Th2-Zellen auch Th17-Zellen beim Asthma bronchiale eine entscheidende Rolle
spielen, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob und wenn ja, welche Rolle
das Zytokin IL-17A bei der Atemwegstoleranz spielt.
7.2.1 Die Atemwegstoleranz beeinflusst die Entstehung der AHR und die IgE-Spiegel
negativ
Die Hyperreaktivität der Atemwege zählt zu den Hauptsymptomen des Asthma bronchiale.
Mit dem Einsatz von 2-Sympathomimetika, welche die Bronchien erweitern, versucht man
dagegen vorzugehen (Mutschler et al., 2008). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten
darauf hin, dass die Induktion einer Atemwegstoleranz ebenfalls einen Schutz vor der
Ausbildung einer Atemwegshyperreaktivität darstellt. So wiesen sowohl Wildtyp- als auch
IL-17A defiziente Mäuse im Toleranzmodell eine geringere AHR auf als Mäuse mit
allergischem Asthma. Auch Tsitoura et al. konnten bereits zeigen, dass die Atemwegstoleranz
zu einer allergenspezifischen T-Zell-Toleranz führt und somit die Entstehung der AHR
negativ beeinflusst. Sie fanden auch heraus, dass dies unabhängig von IL-4 und IFN-
167
Diskussion
geschah (Tsitoura et al., 2000). Im vorliegenden Modell konnte durch Induktion der Toleranz
bei Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen zwar ein Rückgang der AHR im Vergleich zu
asthmatischen Mäusen beobachtet werden, allerdings reagierten diese Mäuse immer noch
stärker als unbehandelte Tiere. Dies könnte damit zusammenhängen, dass sowohl wt als auch
IL-17A ko Mäuse im Toleranzmodell immer noch erhöhte IL-13 Proteinkonzentrationen in
der BALF aufwiesen. Wie vorher bereits erwähnt (s. 7.1.1) ist auch dieses Zytokin
maßgeblich an der Entstehung der AHR beteiligt.
In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass die intranasale Behandlung mit
OVA vor der Sensibilisierungsphase die Bildung des antigenspezifischen Immunglobulins
IgE unterdrückt. So waren bei tolerogenen Mäusen beider Genotypen die Konzentrationen an
IgE im Serum vergleichbar zu denen im Serum von gesunden Mäusen. Auf diesen Effekt
scheint IL-17A keinen Einfluss zu haben, da tolerogene Wildtyp- und IL-17A defiziente
Mäuse ähnliche Konzentrationen an IgE aufwiesen. In Übereinstimmung mit diesen
Ergebnissen berichteten auch Tsitoura et al. von einer beeinträchtigten IgE Produktion im
Toleranzmodell (Tsitoura et al., 2000). Die verminderten IgE Spiegel im Serum tolerogener
Mäuse gehen einher mit einer geringeren IL-4 Proteinkonzentration in der BALF im
Vergleich zu Mäusen mit Asthma. Dieses Zytokin ist dafür bekannt, an der Bildung des
Immunglobulins E beteiligt zu sein (Kashiwada et al., 2010). Auch dieser Befund stimmt mit
vorherigen Untersuchungen überein (Tsitoura et al., 2000). Weiterhin ist bekannt, dass IL-10
und auch TGF- die IgE Produktion zugunsten der Immunglobulinisotypen IgG4 und IgA
unterbinden, welche keine entzündungsfördernden Eigenschaften besitzen (Asadullah et al.,
2003; Taylor et al., 2006). Beide Zytokine wurden im vorliegenden Toleranzmodell v. a. in
der Abwesenheit von IL-17A verstärkt gebildet.
168
Diskussion
7.2.2 IL-17A inhibiert IL-10 und TGF- im Toleranzmodell
Regulatorische T-Zellen spielen bei den zugrundeliegenden Mechanismen der Immuntoleranz
eine entscheidende Rolle, da sie z. B. Vermittler der Anergie sind und Teffektor-Zellen
inhibieren. Man geht davon aus, dass Foxp3+CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen in diesem
Zusammenhang eine wichtige Rolle spielen (Gershon and Kondo, 1971; Gershon et al., 1972;
Corthay, 2009; Andreev et al., 2012). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass
ein
IL-17A
Gendefekt
im
Toleranzmodell
zu
einer
verringerten
Anzahl
an
Foxp3+CD4+CD25+ Treg-Zellen führte. Dem entgegen steht eine verstärkte Tgf und Il-10
Genexpression im Lungengewebe von tolerogenen IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich
zu Wildtyp-Mäusen. Dies lässt vermuten, dass TGF- bzw. IL-10 in diesem Zusammenhang
nicht an der Differenzierung von Foxp3+CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen beteiligt waren
bzw. von diesen produziert wurden. So ist es möglich, dass in Abwesenheit von IL-17A im
Toleranzmodell bevorzugt Tr1 Zellen (Type 1 regulatory T cells) entstehen, welche eine
Untergruppe der induzierbaren regulatorischen T-Zellen darstellen. Sie sind dadurch
gekennzeichnet, dass sie große Mengen an IL-10 und TGF- produzieren und freisetzen,
jedoch den Transkriptionsfaktor Foxp3 gar nicht bzw. nicht kontinuierlich exprimieren. Auch
Tr1 Zellen sind für die die Entstehung und die Aufrechterhaltung der immunologischen
Toleranz von enormer Bedeutung (Pot et al., 2011b; Gregori et al., 2012). Die
Differenzierung dieses Subtyps wird u. a. durch IL-27 gefördert, welches außerdem die
Entstehung von IL-17-produzierenden Th17-Zellen unterdrückt (Pot et al., 2011a). Weiterhin
geht man davon aus, dass Tr1 Zellen auch in der Lage sind, die Entstehung der AHR zu
unterdrücken (Akbari et al., 2001; Umetsu et al., 2002). Dies könnte auch erklären, warum im
vorliegenden Toleranzmodell der Unterschied bezüglich der AHR zwischen den
asthmatischen und den tolerogenen Mäusen in Abwesenheit von IL-17A deutlicher hervortritt
als zwischen asthmatischen und tolerogenen Wildtyp-Mäusen. Eine weitere Untergruppe der
169
Diskussion
regulatorischen T-Zellen stellen die Th3 Zellen dar. Auch zu ihrer Differenzierung tragen
IL-10 und TGF- bei. Die ausgereiften Th3 Zellen produzieren anschließend hauptsächlich
TGF- aber auch IL-10 (Jonuleit and Schmitt, 2003). Es ist daher denkbar, dass in
Abwesenheit von IL-17A besonders diese beiden Subtypen bevorzugt gebildet werden und
die Immuntoleranz durch sie vermittelt wird. Es bedarf allerdings noch weiterer
Untersuchungen, um diese Annahme zu bestätigen.
7.2.3 IL-17A inhibiert follikuläre T-Helferzellen im Toleranzmodell
Follikuläre T-Helferzellen werden sowohl für die Bildung von Keimzentren als auch für den
Immunglobulin-Klassenwechsel benötigt. Außerdem tragen sie zur Entstehung und
Produktion von antigenspezifischen B-Gedächtniszellen und Plasmazellen bei (Kim et al.,
2013). Somit sind Tfh-Zellen an der B-Zell vermittelten Toleranz beteiligt. Im vorliegenden
Toleranzmodell konnte gezeigt werden, dass im Lungengewebe von tolerogenen IL-17A
defizienten Mäusen besonders der für Tfh-Zellen typische Rezeptor Cxr5 im Vergleich zu
tolerogenen Wildtyp-Mäusen vermehrt exprimiert wurde. Weiterhin fiel auf, dass sich die
Asthmaerkrankung in beiden Mausstämmen negativ auf die Expression dieses Rezeptors
auswirkte. IL-21 gilt als Schlüsselzytokin der Tfh-Zellen und trägt über einen autokrinen
Effekt zur Proliferation und dem Überleben dieser Zellen bei (Ding et al., 2013). Es konnte
gezeigt werden, dass verglichen mit den jeweiligen Wildtyp-Mäusen, sowohl asthmatische als
auch besonders tolerogene IL-17A(-/-) Mäuse dieses Zytokin vermehrt exprimierten. Auch die
für Tfh-Zellen typischen Oberflächenmarker Il-6r und Il-21r wurden im Toleranzmodell in
Abwesenheit von IL-17A verstärkt exprimiert. Gleiches galt für den Transkriptionsfaktor
Bcl6, welcher als einer der wichtigsten Transkriptionsfaktoren der Tfh-Zellen gilt. Bcl6 wird
u. a. durch IL-21 induziert und fördert daraufhin die Expression des Chemokinrezeptors
CXCR5 (Ding et al., 2013).
170
Diskussion
Tfh-Zellen sind, wie zuvor bereits beschrieben, an der Entstehung und Regulation der
B-Zell-vermittelten Toleranz beteiligt. Dies bedeutet, dass B-Zellen z. B. nicht auf
körpereigene Antigene reagieren. Allerdings kann eine anormale Anreicherung und Funktion
von Tfh-Zellen eine Dysregulation von Keimzentren auslösen (Lee et al., 2012; Sweet et al.,
2012). So korreliert eine gesteigerte Anzahl an follikulären T-Helferzellen mit der Schwere
von Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Lupus erythematodes (Simpson et al., 2010; Feng et
al., 2012; Ma et al., 2012). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten deuten darauf hin, dass
IL-17A möglicherweise einen regulierenden Einfluss auf Tfh- und B-Zellen hat. Bisher geht
man davon aus, dass IL-17A weder zur Entwicklung von follikulären T-Helferzellen beiträgt
noch von diesen produziert wird. Allerdings exprimieren B-Zellen den IL-17RA und
reagieren auch auf IL-17A-Stimulation. So können Th17-Zellen und somit auch deren Zytokin
IL-17A B-Zellen zur Proliferation und zum Klassenwechsel veranlassen. Weiterhin sind sie
an der Bildung von Keimzentren beteiligt (Yao et al., 1995a; Nurieva et al., 2008;
Mitsdoerffer et al., 2010; Lüthje et al., 2012). Wie wichtig das IL-17/IL-17RA vermittelte
Signal für die Regulation von Tfh- und B-Zellen ist, konnte Ding et al. zeigen. Sie fanden
heraus, dass BXD2-IL-17RA(-/-) Mäuse zwar CXCR5+CD4+ Tfh-Zellen mit normalen
Funktionen bilden konnten, sich diese aber außerhalb der Keimzentren befanden und somit
nicht im direkten Kontakt mit den B-Zellen in den Keimzentren standen. Auch die
Neutralisation des Zytokins IL-17A führte dazu, dass Tfh- und B-Zellen nicht direkt
miteinander interagieren konnten und wirkte sich somit negativ auf die Bildung von
Autoantikörper-produzierenden B-Zellen aus (Ding et al., 2013).
Zusammengefasst deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass das Zytokin
IL-17A bei der Entstehung der Atemwegstoleranz beteiligt ist. Dies äußert sich v. a. in einer
reduzierten Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen und einer vermehrten
Expression typischer Marker follikulärer T-Helferzellen in der Abwesenheit von IL-17A.
171
Diskussion
7.3 IL-17A ist an der antiviralen Immunantwort nach Infektionen mit
Rhinoviren beteiligt
Virale Infektionen stellen die Hauptursache von Asthma-Exazerbationen dar. Im Kindesalter
stehen besonders Rhinoviren unter Verdacht, für das Ausbilden der Asthmaerkrankung mit
verantwortlich zu sein (s. 3.1.2.3). An der durch Viren hervorgerufenen Immunantwort sind
eine Vielzahl an Zellen und Zytokinen beteiligt. Man geht auch davon aus, dass IL-17A dabei
eine Rolle spielt.
7.3.1 Beeinträchtigung antiviraler Gene in IL-17A defizienten Zellen im murinen
Modell allergischen Asthmas
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, wie sich eine IL-17A Defizienz auf die
antivirale Immunantwort bei bestehendem Asthma auswirkt. Ein Microarray lieferte erste
Hinweise, dass die Abwesenheit von IL-17A in CD4+ T-Zellen der Lunge besonders bei
Mitgliedern der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase-Familie (Oas1a, Oas1c und Oas1g) zu einem
starken Rückgang der Genexpression führte. Diese Ergebnisse konnten im Lungengewebe, in
den Lymphknoten, in CD11c+ Lungenzellen und auch in Mastzellen bestätigt werden. Es
konnte auch gezeigt werden, dass dies in CD4+- und CD11c+- Lungenzellen mit einem
Rückgang der Ifn mRNA Expression einherging. Ifnzählt zu den Typ I Interferonen und
gilt als Initiator des antiviralen OAS1-RNaseL-Signalwegs. Der direkte Einfluss des
Interleukins 17A auf die Genexpression der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase 1g konnte durch
Hemmung der Il-17a Genexpression mittels siRNA bestätigt werden. Bei in vitro Studien mit
einer den Hepatitis B-Virus produzierenden Zelllinie konnte bereits gezeigt werde, dass
IL-17A die Replikation des DNA-Virus unterdrücken kann, indem antivirale Gene wie z. B.
OAS1 vermehrt exprimiert wurden (Wang et al., 2013). Jedoch kann nicht automatisch davon
ausgegangen werden, dass IL-17A als Reaktion auf jede beliebige Virenart antivirale
172
Diskussion
Eigenschaften vermittelt. So konnte im murinen Modell gezeigt werden, dass eine primäre
RSV Infektion zu einem Anstieg des IL-17A Proteins führt, jedoch die virale Clearance
vermindert war (Mukherjee et al., 2011; Martinez et al., 2012). Deshalb wurde in der
vorliegenden Arbeit untersucht, wie sich eine IL-17A Defizienz bei einer Infektion mit dem
Rhinovirus 1b auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass IL-17A(-/-) Mastzellen, welche aus
dem Knochenmark generiert und mit dem RV1b infiziert wurden, nicht mehr in der Lage
waren, die Virusreplikation zu unterbinden. Zudem war in diesen Zellen kaum Oas1g mRNA
nachweisbar, obwohl kein Defekt der Ifn Genexpression vorlag. Somit erscheint eine IL-17A
Defizienz gleich in mehrfacher Hinsicht die antivirale Effizienz von Mastzellen
einzuschränken. So sind sie nicht mehr in der Lage, die virale Replikation zu unterdrücken.
Unter Berücksichtigung vorangegangener Untersuchungen, die zeigten, dass bei latenten HIV
Infektionen Mastzellen als Reservoir für den Virus dienen (Sundstrom et al., 2007), ist es
möglich, dass in Abwesenheit von IL-17A den infizierten Mastzellen eine ähnliche Funktion
zuzuschreiben ist. Dafür spricht auch, dass die virale Infektion bei IL-17A(-/-) Mastzellen zu
keinem weiteren Anstieg der LDH-Aktivität führte. Des Weiteren tragen Mastzellen
normalerweise zur antiviralen Immunantwort bei, indem sie Botenstoffe wie Histamin
freisetzen, welche u. a. bewirken, dass vermehrt Sekret gebildet wird und so Pathogene besser
ausgeschieden werden können (Urb and Sheppard, 2012). Im vorliegenden Modell
produzierten und sezernierten IL-17A defiziente Mastzellen jedoch weniger Histamin und
auch die Anzahl an PAS+ Zellen war reduziert, womit auch dieser Abwehrmechanismus
eingeschränkt wäre. Zudem können Mastzellen als APCs fungieren und somit
T-Lymphozyten aktivieren. Im Mausmodell konnte bereits gezeigt werden, dass Mastzellen
nach viraler Aktivierung CD8+ T-Zellen an den Ort der Entzündung rekrutieren (Orinska et
al., 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde beobachtet, dass im Lungengewebe naiver
IL-17A(-/-) Mäuse weniger Mastzellen vorliegen. Außerdem waren die CD8+ T-Zellen im
Lungengewebe und in den Lymphknoten von gesunden IL-17A(-/-) Mäusen im Vergleich zu
173
Diskussion
Wildtyp-Mäusen nur in geringer Anzahl nachzuweisen. Dies lässt darauf schließen, dass sich
der Virus im Falle einer Infektion leichter ausbreiten kann. All diese Beobachtungen lassen
die Schlussfolgerung zu, dass im Falle der Mastzellen der RV1b IL-17A und somit auch
Oas1g inhibiert, um sich so besser in den Mastzellen replizieren und diese möglicherweise
sogar als Reservoir nutzen kann.
Da Rhinoviren die Antigen-Präsentation umgehen können und so T-Zellen direkt infizieren
und aktivieren können (Ilarraza et al., 2013), wurde in der vorliegenden Arbeit der
Fragestellung nachgegangen, ob und wenn ja, wie der RV1b Th17-Zellen beeinflusst und wie
sich eine bestehend Asthmaerkrankung dabei auswirkt. Dazu wurden CD4+ T-Zellen aus dem
Lungengewebe isoliert und mit dem RV1b infiziert. Es konnte beobachten werden, dass
CD4+ T-Zellen aus dem Lungengewebe von asthmatischen Wildtyp-Mäusen nach der
Infektion mit dem RV1b signifikant weniger IL-17A freisetzten als nicht infizierte Zellen.
Konsequenterweise wiesen diese Zellen auch eine vergleichbare Viruslast wie IL-17A
defiziente Zellen auf. In den Wildtyp-Zellen war zwar auch nach der viralen Infektion noch
Oas1g mRNA nachweisbar, entgegen der Erwartungen unterschied sich die Expression
jedoch nicht von der in nicht infizierten Wildtyp-Zellen. Es konnte aber auch gezeigt werden,
dass die Allergenbehandlung die Genexpression von Ifnsowohl in Wildtyp- als auch in
IL-17A (-/-) Mäusen stark verminderte. Somit kann man davon ausgehen, dass der antivirale
OAS1-RNasL Signalweg bereits zu Beginn beeinträchtigt wurde. Typ I Interferone sind nicht
nur entscheidend für die Abwehr unterschiedlichster Pathogene, ihre Transkription wird auch
hauptsächlich durch PAMPs (pathogen associated molecular patterns, Pathogen-assoziierte
molekulare Muster) aktiviert (Prinz and Knobeloch, 2012). Ein Bestandteil der durch PAMPs
aktivierten Signalkaskade ist NF-κB, welcher in den Zellkern transloziert und so die
Expression der Typ I Interferone mit induziert (Honda and Taniguchi, 2006). Wie in
Abschnitt 3.3.1 beschrieben, ist NF-κB auch an der dem Zytokin IL-17A nachgeschalteten
174
Diskussion
Signalweiterleitung beteiligt. Dies veranlasst zu der Vermutung, dass IL-17A möglicherweise
die Genexpression der Typ I Interferone mit induziert. Diese Annahme wird dadurch bestärkt,
dass man mithilfe von BXD2-Mäusen - ein Mausstamm der Lupus-ähnliche Symptome
entwickelt - herausfand, dass IL-17A die Expression von Ifnfördert und somit auch die IFNvermittelte Antikörper Produktion (Wang et al., 2008; Wang and Mountz, 2008). Nach der
Transkription akkumuliert OAS1 als inaktives Monomer im Zytoplasma und wird erst durch
Binden viraler dsRNA aktiviert. Dies hat zur Folge, dass 2´-5´-Polyadenylat aus ATP
synthetisiert wird, welches wiederum die inaktive RNaseL aktiviert. Dieses Enzym wiederum
degradiert u. a. die virale RNA und ist somit entscheidend für die Viruselimination. Die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass eine IL-17A Defizienz in
asthmatischen
Mäusen
nicht
nur
zu
einer
verminderten
Expression
der
Oas1-Familienmitglieder führte, sondern folglich auch zu einer reduzierten Genexpression der
RNaseL in CD4+ Lungenzellen. Bisher ist nur bekannt, dass IL-17A zusammen mit IFN- die
RNase 7 induziert, welche zur RNase A-Superfamilie zählt und v. a. in Keratinozyten zu
finden ist. Diesem Enzym werden hauptsächlich antimikrobielle Eigenschaften zugeschrieben
(Simanski et al., 2013).
Wie die Ergebnisse des Microarrays zeigen konnten, kam es in Abwesenheit von IL-17A auch
zu einer verminderten Genexpression von Cxcr3. Wie in diversen Modellen deutlich wurde,
scheint dieser Chemokinrezeptor entscheidend für die Rekrutierung zytotoxischer T-Zellen
und somit für die Viruselimination zu sein (Christensen et al., 2006; Stiles et al., 2006; Lindell
et al., 2008). Des Weiteren wird Cxcr3 auch bevorzugt von pDCs (plasmazytoide DCs)
exprimiert. Diese Zellen sind im Menschen u. a. durch CD4, CD86 und CD123
gekennzeichnet. In der Maus gelten Ly6C+B220+CD11cloCD4+ Zellen als Interferonproduzierende pDCs (Asselin-Paturel et al., 2001; Swiecki and Colonna, 2010). Diese Zellen
stellen eine Schlüsselrolle bei der antiviralen Immunantwort dar, da sie über Typ I Interferone
175
Diskussion
die Reifung von mDCs fördern und somit auch zur Aktivierung der T-Zell-vermittelten
Immunantwort beitragen. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Migration der pDCs vom
Ort der viralen Infektion hin zu den Lymphknoten von Cxcr3 abhängt (Yoneyama et al.,
2005; Lindell et al., 2008). Neben Cxcr3 wurde noch ein weiteres Oberflächenmolekül
identifiziert, welches von pDCs exprimiert wird. Dabei handelt es sich um PDC-Trem, einen
Rezeptor, welcher bevorzugt nach Stimulation von TLRs (Toll-like-recpetors) von pDCs
exprimiert wird und für die vermehrte Produktion von Typ I Interferonen durch pDCs
verantwortlich ist (Watarai et al., 2008). Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass PDC-Trem
trotz eingeschränktem TLR-Signal induziert werden kann, danach jedoch keine Typ I
Interferone produziert wurden (Watarai et al., 2008). Die Ergebnisse des Microarrays wiesen
darauf hin, dass PDC-Trem in IL-17A defizienten CD4+ T-Zellen von asthmatischen Mäusen
vermehrt exprimiert wurde. Im vorliegenden Modell konnte zudem beobachtet werden, dass
die Allergenkonfrontation sowohl in Wildtyp- als auch in IL-17A(-/-) Mäusen zu einer
verminderten Ifn mRNA Expression in CD4+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu stieg in
CD11c+ Lungenzellen von asthmatischen Wildtyp-Mäusen die Ifn Genexpression an,
wohingegen sie in IL-17A defizienten Zellen, unabhängig von der Behandlung, nur in
verminderten Maßen nachgewiesen werden konnte. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass
in Abwesenheit von IL-17A das TLR-abhängige Signal eingeschränkt ist und somit zwar
PDC-Trem induziert, die Produktion der Typ I Interferone jedoch nicht aktiviert werden
konnte.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit im murinen Modell gezeigt werden,
dass IL-17A einen wichtigen Bestandteil der antiviralen Immunantwort darstellt, da es sowohl
Zellen der angeborenen als auch der erworbenen Immunantwort beeinflusst.
176
Diskussion
7.3.2 Rhinoviren inhibieren IL-17A in den PBMCs von Kindern mit Asthma
In der vorliegenden Arbeit wurden die im murinen Modell gewonnen Erkenntnisse auch im
humanen Probenmaterial überprüft. Das zugrundeliegende Material entstammte der
europaweiten Studie PreDicta. Im Zuge dieser Studie wurden gesunde Kinder und an Asthma
erkrankte Kinder rekrutiert. Aus ihrem Vollblut wurde entweder direkt die RNA extrahiert
oder PBMCs isoliert und weiter analysiert. Des Weiteren wurde ein Nasenabstrich
durchgeführt und dieser auf Rhinoviren hin getestet. Die Ergebnisse wurden abschließend
miteinander in Verbindung gebracht.
So konnte in der vorliegen Arbeit gezeigt werden, dass eine Rhinovirusinfektion in den
oberen Atemwegen bei Kindern mit Asthma zu einem Rückgang der IL-17A
Proteinkonzentration und der OAS1 Expression führte. Dennoch konnte in diesen Kindern ein
Anstieg der IFNGenexpression verzeichnet werden. Bei in vitro Zellkulturen mit PBMCs
von gesunden und an Asthma erkrankten Spendern konnten Khaitov et al. bzw. Sykes et al.
ebenfalls einen Anstieg der IFN- Expression nach Infektion mit RV16 nachweisen (Khaitov
et al., 2009; Sykes et al., 2012). Dementgegen stehen Berichte, dass Rhinoviren Typ I
Interferone inhibieren, wobei dies zumeist keinen nennenswerten Einfluss auf die Expression
oder Aktivierung von antiviralen Molekülen hatte, welche man mit Typ I Interferonen in
Verbindung bringt. Hierbei ist jedoch zu berücksichtigen, dass es sich bei den untersuchten
Zellen nicht um PBMCs sondern um bronchiale Epithelzellen bzw. Zellen der
Bronchoalveolären Lavage von gesunden und asthmatischen Spendern handelte. Außerdem
entstammten einige der Ergebnisse aus Versuchen mit der humanen Epithelzellline A549
(Kotla et al., 2008; Baraldo et al., 2012; Edwards et al., 2012; Sykes et al., 2012). So besteht
die Möglichkeit, dass Epithelzellen, welche als erster Zelltyp mit dem Rhinovirus in Kontakt
kommen, anders auf eine virale Infektion reagieren, als PBMCs aus dem Blut, welche erst
später in die Immunantwort mit einbezogen werden. Außerdem ist zu berücksichtigen, dass
177
Diskussion
bei den vorher aufgeführten Experimenten anderer Arbeitsgruppen die Zellen in vitro mit
Rhinoviren infiziert und für unterschiedliche Zeitspannen kultiviert wurden. Im Gegensatz
dazu wurden die PBMCs in der vorliegenden Arbeit nicht in vitro infiziert. Stattdessen wurde
berücksichtigt, ob in den jeweils abgenommenen Nasopharynxabstrichen Rhinoviren
nachweisbar waren, also eine Infektion in vivo vorlag. Weiterhin wurden die Zellen bei den
zuvor erwähnten Experimenten immer nur mit einem bestimmten Rhinovirus (z. B. RV16,
RV14) infiziert. Bei der Analyse des Nasenabstriches wurden jedoch ganz allgemein
Rhinoviren der Gruppe A, B und C detektiert. Es wurde also nicht näher darauf eingegangen,
welcher Serotyp genau vorlag.
Iikura et al. haben ebenfalls PBMCs von Kindern mit Asthma (2 - 6 Jahre) analysiert. Sie
fanden jedoch bezüglich der Typ I Interferone keinen Unterschied zwischen gesunden und
erkrankten Kindern, wobei hier unterschieden wurde, ob die Kinder giemten oder nicht
(Iikura et al., 2014). Auch hier wurden die Zellen erst ex vivo mit dem RV 14 infiziert.
Die Tyrosinkinase Tyk-2, welche für die Weiterleitung des IFNSignals und somit für die
Transkription der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase wichtig ist, wies in allen Kindern, egal ob
gesund oder krank bzw. ob mit oder ohne positiven Testergebnis für Rhinoviren, eine
unveränderte Expression auf. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der für Th1–Zellen
typische Transkriptionsfaktor T-BET in den PBMCs von Kindern mit Asthma und einer
Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen erhöht vorlag. Diese Beobachtung könnte eine
mögliche Erklärung für die IL-17A Inhibition sein. Wie unsere Arbeitsgruppe und andere
bereits zeigen konnten, wirkt T-BET auf die IL-17A Produktion suppressiv (Reppert et al.,
2011; Yeh et al., 2014). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bei gesunden Kindern, welche
positiv auf Rhinoviren getestet wurden, IL-6 und T-BET invers miteinander korrelieren. So
gehen erhöhte IL-6 Expressionswerte mit einer erniedrigten T-BET mRNA Expression einher.
Diese Tendenz war zwar bei Kindern mit Asthma auch zu erkennen, jedoch nicht so deutlich
178
Diskussion
wie bei den Kontrollkindern. In vorherigen Arbeiten fand unsere Arbeitsgruppe bereits
heraus, dass in den PBMCs von Kindern mit Asthma IL-6 und der Th1-Transkriptionsfaktor
T-BET invers korrelieren, bei gesunden Kindern jedoch nicht (Koch et al., 2013). In diesem
Zusammenhang erscheint diese inverse Korrelation also eher negativ, da Th1-Zellen bei
Asthma als protektiv gelten, wohingegen IL-6 entzündungsfördernde Eigenschaften
vermittelt. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse ist jedoch im Hinblick auf eine
Rhinovirusinfektion diese Korrelation eher positiv zu bewerten, da IL-6 an der
Differenzierung von Th17-Zellen beteiligt ist, wohingegen T-BET Th17-Zellen negativ
reguliert. Neben T-BET ist auch der Transkriptionsfaktor ETS1 als Inhibitor von IL-17A
beschrieben (Moisan et al., 2007). Die Analyse der PBMCs ergab, dass auch dieser Faktor in
Kindern mit Asthma, welche positiv auf Rhinoviren getestet wurden, tendenziell erhöht
vorlag.
7.3.3 IL-17A induziert die antivirale Immunantwort in Epithelzellen
In den Atemwegen kommen Rhinoviren zuerst mit Epithelzellen in Kontakt. In der
vorliegenden Arbeit wurde daher anhand der humanen Epithelzelllinie A549 untersucht, ob
die antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A auch bei diesen Zellen von Bedeutung
sind. So konnte gezeigt werden, dass die virale Replikation in Anwesenheit von 50 ng/ml
rIL-17A erheblich eingeschränkt wurde, ohne sich dabei nennenswert auf die LDH-Aktivität
auszuwirken. Ein signifikanter Anstieg der OAS1 mRNA Expression erfolgte dagegen schon
bei einer Konzentration von 25 ng/ml rIL-17A. In HepG2.2.15 Zellen konnte ebenfalls
gezeigt werden, dass IL-17A in der Lage ist, die Replikation des Hepatitis-B-Virus zu
unterdrücken, ohne dass dabei zytopathische Effekte auftraten (Wang et al., 2013). Im
Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, gehen Wang et al. nicht davon aus,
dass die IL-17A vermittelten Effekte von der Dosis abhängen, wobei anzumerken ist, dass in
179
Diskussion
diesen Experimenten IL-17A nur im Konzentrationsbereich von 250 pg/ml und 4 ng/ml
eingesetzt wurde (Wang et al., 2013). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten jedoch
darauf hin, dass höhere Dosen notwendig sind, um Unterschiede zu erkennen.
7.3.4 Arzneimittel beeinflussen die antivirale Immunantwort
Asthma bronchiale wird üblicherweise mit kurz- und langwirksamen 2-Sympathomimetika
und Steroiden behandelt (s. 3.1.5). Um akuten Verschlimmerungen der Symptome, welche
z. B. durch virale Infektionen hervorgerufen wurden, entgegenzuwirken, kann kurzfristig die
Therapie umgestellt werden, indem die übliche Dosis des jeweiligen Medikamentes erhöht
wird oder eine nicht-steroidale Therapie mit einem Glucocorticoid ergänzt wird. So kann zwar
gegen die Entzündungsreaktion vorgegangen werden, ob sich dies aber auch positiv auf die
antivirale Immunantwort auswirkt, bleibt fraglich. Anhand von PBMCs, welche mit RV16
infiziert wurden, konnte Davies et al. zeigen, dass Budesonid (Steroid) in Kombination mit
Formoterol (2-Sympathomimetika) sowohl INF als auch OAS1 inhibiert (Davies et al.,
2011). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen ebenfalls darauf hin, dass in den
PBMCs von Kindern, welche mit Steroiden alleine bzw. in Kombination mit einem
Nicht-Steroid behandelt wurden, die OAS1 Genexpression unterdrückt wurde. Bei Analysen
des Gesamtblutes auf mRNA-Ebene zeigte sich auch, dass IL-17A ebenfalls negativ durch
eine Kombination dieser Arzneimittel beeinflusst wurde. Diese Beobachtung wird dadurch
bestärkt, dass in Biopsien des Bronchialgewebes von Patienten mit moderatem bis schwerem
Asthma gezeigt werden konnte, dass die orale Applikation von Glucocorticoiden einen
Rückgang der IL-17-produzierenden Zellen bewirkte (Chakir et al., 2003). Der Rückgang der
IL-17-produzierenden Zellen mag auch mit dem Einfluss von Glucocorticoiden auf
Dendritische Zellen zusammenhängen. Es konnte nämlich gezeigt werden, dass DCs, welche
mit Steroiden behandelt wurden, nicht mehr so gut in der Lage sind, die T-Zellproliferation
180
Diskussion
einzuleiten, da die Steroide die costimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 sowie die
Freisetzung von Zyokinen wie beispielsweise IL-12 stark beeinträchtigen (Rozkova et al.,
2006; Larangé et al., 2012). Weiterhin ergab sich, dass Steroide die durch den TLR7
vermittelte Maturation der DCs unterdrückten. Dieser Rezeptor ist in der Lage, ssRNA (single
stranded RNA) zu erkennen und ist somit maßgeblich an der antiviralen Immunantwort
beteiligt (Diebold et al., 2004; Larangé et al., 2012). Die Aktivierung dieses Rezeptors führt
bei pDCs zur Produktion von IFN,womit sie, wie vorher bereits beschrieben, an der
antiviralen Immunantwort beteiligt sind(Gibson et al., 2002).
Zusammengefasst mag es zwar zunächst als sinnvoll erscheinen, bei Verschlechterung der
Asthmasymptomatik Glucocorticoide verstärkt einzusetzen, allerdings sollte hierbei
berücksichtig werden, wodurch die Exazerbation ausgelöst wurde. Im Falle einer viralen
Infektion scheint der Einsatz von Steroiden in Bezug auf die antivirale Immunantwort nicht
unbedingt empfehlenswert zu sein. Weiterhin erscheint die Unterdrückung des Zytokins
IL-17A im Verlauf des Asthma bronchiale einen sinnvollen Therapieansatz darzustellen. Die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen jedoch auch darauf hin, dass im Falle einer viralinduzierten
Asthma-Exazerbation
die
Neutralisation
dieses
Zyotkins
gravierende
Auswirkungen haben kann. So konnte Newcomb et al. im Mausmodell bereits zeigen, dass
bei einer bestehenden allergischen Atemwegsentzündung IL-17A in der Lage ist, die durch
eine virale Infektion hervorgerufene Atemwegshyperreaktivität zu unterdrücken (Newcomb et
al., 2013). So ist auf diesem Gebiet immer noch weiterer Forschungsbedarf erfoderlich, um
herauszufinden, ob und wann eine Neutralisation bzw. Inhibition des Zytokins IL-17A
sinnvoll und angebracht ist.
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197
Abbildungsverzeichnis
9
Abbildungsverzeichnis
Abb. 3-1: Querschnitt durch einen gesunden (linke Abbildung) und einen asthmatischen
(rechte Abbildung) Bronchus. _________________________________________________ 18
Abb. 3-2: Stufentherapie für die Langzeittherapie des Asthma bronchiale bei Erwachsenen 24
Abb. 3-3: Überblick über die für die Entstehung und den Verlauf des allergischen Asthmas
beteiligten T-Zell-Populationen sowie der für die Differenzierung wichtigen Zytokine und
Transkriptionsfaktoren. ______________________________________________________ 33
Abb. 3-4: IL-17 Rezeptorsignalweg ____________________________________________ 48
Abb. 3-5: Interferon-Rezeptor Signalweg _______________________________________ 53
Abb. 3-6: OAS1-RNaseL Signalweg ___________________________________________ 53
Abb. 5-1: Zeitverlauf der PreDicta Studie _______________________________________ 73
Abb. 5-2: Isolation von PBMCs aus Gesamtblut __________________________________ 75
Abb. 5-3: Behandlungsprotokoll zur Induktion des allergischen Asthmas ______________ 79
Abb. 5-4: Behandlungsprotokoll zur Induktion der Atemwegstoleranz _________________ 79
Abb. 5-5: Diagramm zum Verlauf der Atmung ___________________________________ 80
Abb. 6-1: Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen
Asthmamodell ____________________________________________________________ 101
Abb. 6-2: „Gating“-Strategie zur Analyse eosinophiler und neutrophiler Granulozyten in der
BAL ____________________________________________________________________ 102
Abb. 6-3: Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der BAL von Wildtypund IL-17A(-/-) Mäusen im allergischen Asthmamodell mit Hilfe der Durchlusszytometrie 103
Abb. 6-4: Analyse der Mastzellen in den Gesamtzellen der Lunge von Wildtyp- und IL-17A
defizienten Mäusen ________________________________________________________ 105
Abb. 6-5: Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von naiven Wildtyp- und
IL-17A defizienten Mäusen__________________________________________________ 107
Abb. 6-6: TGF- Konzentration in den Kulturüberständen während der Generierung von
Mastzellen aus dem Knochenmark von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen ______________ 108
Abb. 6-7: Bestimmung des Entzündungsgrades der Lunge von Wildtyp- und IL-17A(-/-)
Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas ________________________________ 109
Abb. 6-8: Detektion der PAS+-Zellen im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen
im allergischen Asthmamodell _______________________________________________ 110
Abb. 6-9: Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A
defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell __________________________________ 111
Abb. 6-10: Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und
IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Asthmamodell ___________________________________ 112
Abb. 6-11: Analyse des Interleukins 13 in CD4+ T-Lymphozyten der Lunge von Wildtypund IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Asthmamodell _______________________________ 114
Abb. 6-12: IFN- in der BALF von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen
Modell allergischen Asthmas ________________________________________________ 115
Abb. 6-13: Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen
Modell allergischen Asthmas ________________________________________________ 116
Abb. 6-14: Analyse der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und Tgf im murinen
Asthmamodell ____________________________________________________________ 117
198
Abbildungsverzeichnis
Abb. 6-15: Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen nach Induktion
der Atemwegstoleranz ______________________________________________________ 119
Abb. 6-16: Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A
defizienten Mäusen im Toleranzmodell ________________________________________ 120
Abb. 6-17: Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und
IL-17A defizienten Mäusen im murinen Toleranzmodell ___________________________ 121
Abb. 6-18: Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen
Toleranzmodell ___________________________________________________________ 123
Abb. 6-19: Analyse der Il-6 und Il-21 mRNA Expression im Lungengewebe von Wildtypund IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell ______________________________ 125
Abb. 6-20: Analyse der Transkriptionsfaktoren Bcl6 und Batf im Lungengewebe von
tolerogenen Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen ____________________________ 126
Abb. 6-21: Untersuchung der Oberflächenmarker Cxcr5, Il-6r und Il-21r im Lungengewebe
von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell ___________________ 127
Abb. 6-22: Heat-map und graphische Darstellung der Microarry-Analyse _____________ 130
Abb. 6-23: Analyse der Oas1g und Oas1a mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Lunge
von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen ___________________________________ 131
Abb. 6-24: Analyse der Oas1g mRNA Expression im Lungengewebe und in den
Lymphknotenzellen von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell
________________________________________________________________________ 132
Abb. 6-25: Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD11c+ Lungenzellen im murinen
Asthmamodell und in ausdifferenzierten Mastzellen des Knochenmarks von Wildtyp- und
IL-17A defizienten Mäusen__________________________________________________ 132
Abb. 6-26: Analyse der Ifn mRNA Expression in Wildtyp- und IL-17A defizienten Zellen
________________________________________________________________________ 134
Abb. 6-27: Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im
murinen Asthmamodell _____________________________________________________ 135
Abb. 6-28: Analyse der IL-17A Konzentration in den Zellkulturüberständen der CD4+
T-Zellen der Milz nach Transfektion mit Il-17a siRNA ___________________________ 137
Abb. 6-29: Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz nach Kultur
und Transfektion mit Il-17a siRNA ___________________________________________ 138
Abb. 6-30: Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz von
asthmatischen Wildtyp Mäusen nach in vitro Transfektion mit Il-17a siRNA___________ 139
Abb. 6-31: Analyse der Viruslast in Mastzellen nach Infektion mit dem RV1b _________ 140
Abb. 6-32: Analyse der LDH Aktivität in den Zellkulturüberständen generierter Mastzellen
vor bzw. nach Infektion mit dem RV1b ________________________________________ 141
Abb. 6-33 Analyse der Ifn und Oas1g mRNA Expression in infizierten, generierten
Mastzellen _______________________________________________________________ 142
Abb. 6-34: Analyse virusinfizierter CD4+ T-Zellen im murinen Asthmamodell _________ 143
Abb. 6-35: Ifn und Oas1g Genexpressions-Analyse in CD4+ Lungenzellen von naiven und
asthmatischen Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen nach in vitro Infektion mit dem
RV1b ___________________________________________________________________ 145
Abb. 6-36: Analyse der IL-17A Freisetzung allergenspezifischer CD4+ T-Zellen aus der
Lunge von Wildtyp Mäusen nach in vitro Infektion mit dem RV1b __________________ 145
199
Abbildungsverzeichnis
Abb. 6-37: Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 mRNA Expression in
PBMCs von Vorschulkindern ________________________________________________ 148
Abb. 6-38: Analyse der IFNund TYK2 Genexpression in PBMCs von Vorschulkindern _ 149
Abb. 6-39: Analyse der T-BET und ETS1 Genexpression in gesunden und an Asthma
erkrankten Vorschulkindern _________________________________________________ 150
Abb. 6-40: Korrelation der IL-6 und T-BET mRNA Expression in den PBMCs von Kontrollund Asthmakindern mit positiven Rhinovirusnachweis im Nasenabstrich ______________ 151
Abb. 6-41: Analyse humaner A549 Zellen nach Infektion mit dem RV1b und Zellkultur mit
unterschiedlichen Konzentrationen rIL-17A _____________________________________ 152
Abb. 6-42: Analyse der IL-17A und OAS1 Genexpression unter Berücksichtigung der
Arzneimitteltherapie _______________________________________________________ 154
200
Tabellenverzeichnis
10 Tabellenverzeichnis
Tabelle 3-1: Schweregrad – Einteilung des stabilen Asthma bronchiale bei Erwachsenen __ 23
Tabelle 3-2: Grad der Asthmakontrolle bei Erwachsenen ___________________________ 25
Tabelle 5-1: Laborgeräte ____________________________________________________ 57
Tabelle 5-2: Verbrauchsmaterialien ____________________________________________ 58
Tabelle 5-3: Chemikalien und Reagenzien _______________________________________ 60
Tabelle 5-4: ELISA-Kits ____________________________________________________ 60
Tabelle 5-5: Antikörper und Zytokine __________________________________________ 61
Tabelle 5-6: Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen ______________________ 61
Tabelle 5-7: Beads zur magnetischen Zellseparation _______________________________ 61
Tabelle 5-8: Sequenzen der Genotypisierungs-Primer für IL-17A(-/-) PCR ______________ 62
Tabelle 5-9: Sequenzen der Primer für die Rhinovirus PCR _________________________ 62
Tabelle 5-10: Sequenzen der qPCR Oligonukleotide _______________________________ 63
Tabelle 5-11: Übersicht der an der PreDicta-Studie beteiligten Kinder _________________ 66
Tabelle 5-12: Übersicht über verwendete Flourochrome und deren Detektoren __________ 94
Tabelle 6-1: Ergebnisse des Microarrays _______________________________________ 129
201
Formelverzeichnis
11 Formelverzeichnis
Formel 5-1: Berechnung der Penh _____________________________________________ 81
Formel 5-2: ∆∆Ct Methode zur Berechnung der relativen Quantifizierung _____________ 93
Formel 5-3: Berechnung der LDH Aktivität _____________________________________ 98
202
Abkürzungsverzeichnis
12 Abkürzungsverzeichnis
2-5 A
2´-5´-Polyadenylat
Ak
Antikörper
Alum
Aluminiumkaliumsulfat
Act1
Actin related gene 1
AHR
Atemgwegshyperreaktivität
AlK(SO4)2
Aluminiumkaliumdisulfat
Aqua dest.
Aqua destillata
APCs
Antigenpräsentierende Zellen
APS
Ammoniumperoxodisulfat
ATP
Adeonosin-Triphosphat
BAL
bronchoalveoläre Lavage
BALF
bronchoalveoläre Lavage Flüssigkeit
BATF
basic leucine zipper transcription factor, ATF like
Bcl6
B cell lymphoma 6
BCR
B cell receptor
bp
Basenpaare
BSA
Bovines Serum Albumin (Kälberserum)
ca.
circa
CBAD
C/EPF activation domain
CD
cluster of differntiation
CD62L
CD62 Ligand (= L-Selektin)
cDNA
complementary DNA
C/EP1
CCAAT/enhancer binding protein
CO2
Kohlenstoffdioxid
Ct
threshold cycle
CTL
cytotoxic T lymphocyte
CTLA
cytotocix T lymphocyte-associated antigen
CTLD
C-type lectin-like domain
CXCR
CXC-Motiv-Chemokinrezeptor
DC
Dendritische Zelle
DKO
double knock out
DNA
desoxyribonucleic aci
DMSO
Dimethylsulfoxid
203
Abkürzungsverzeichnis
dNTPs
Desoxy-Nukleosid Triphosphat
dsRNA
doppelstränige RNA
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
et al
et alii (und andere)
EtOH
Ethanol
ETS1
v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog -1
Fab
Antigen-bindendes Fragmente
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorting
FCS
Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum)
Foxp3
Foxhead box P3
FSC
Forward Scatter
Fwd
forward
g
Gramm
g
Zentrifugalbeschleunigung (x g)
GATA-3
GATA-binding protein-3
GFP
green fluorescent protein (grün fluoreszierendes Protein)
GITR
glucocorticoid-induced tumor-necrosis factor receptor-related protein
GM-CSF
Granulocyte macrophage conoly-stimulating factor
h
Stunde
H2O2
Wasserstoffperoxid
H2SO4
Schwefelsäure
HCl
Salzsäure
HE
Haematoxylin-Eosin
HPRT
Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
HRP
horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase)
HIV
Humanes Immundefizienz Virus
HLA
human leukocyte antigen
ICAM
intercellular adhesion molecule
ICS
inhalative Corticosteroide
IFN
Interferon
IFNAR
Interferonalpha Rezeptor
IFNGR
Interferon gamma Rezeptor
IFNLR1
Interferon lambda Rezeptor 1
Ig
Immunglobulin
204
Abkürzungsverzeichnis
Ighg
Immunoglobulin heavy chain, gamma polypeptide
IL
Interleukin
IL-17A(-/-)
IL-17A Defizienz
i.n.
intranasal
i.p.
intraperitoneal
IRF
interferon regulation factor
ISGF3
IFN-stimulated gene factor 3
ISRE
IFN-stimulated response element
iTreg
induzierbare Treg
JAK1
Januskinase 1
kb
Kilo-Basenpaare
KCl
Kaliumchlorid
kd
Kilodalton
KHCO3
Kaliumhydrogencarbonat
KOH
Kaliumhydroxid
ko
knockout
LAG3
lymphocyte activation gene 3
LDH
Lactat-Dehydrogenase
LDL
low density lipoprotein
LPS
Lipopolysaccarid
LTRA
Leukotrienantagonisten
MACS
Magnetic Activated Cell Sorting
MAPK
mitogen-activated protein kinase
MCh
Methacholin
mg
Milligramm
MgCl2
Magnesiumchlorid
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex
min
Minute
ml
Milliliter
MMP
Metalloproteinase
mRNA
messenger RNA
MUC
mucin
Na
Natrium
NaCl
Natriumchlorid
Na2CO3
Dinatriumcarbonat
205
Abkürzungsverzeichnis
NH4Cl
Ammoniumchlorid
NAD
Nicotinamidadenindinukleotid
Na2HPO4
Dinatriumhydrogenphosphat
NaH2PO4
Natriumhydrogenphosphat
NaHCO3
Natriumhydrogencarbonat
NaN3
Natriumazid
NaOH
Natriumhydroxid
NFAT
nuclear factor of activated T cells
Nfil3
nuclear factor, IL 3 regulated
ng
Nanogramm
NF-κB
Nuclear factor ´kappa-light-chain-enhancer´of activated B-cells
NK-Zellen
Natürliche Killer Zellen
NKT-Zellen
Natürliche Killer T-Zellen
nm
Nanometer
nM
nanomolar
nTreg
natürliche Treg
OAS1
2´ 5´ Oligoadenylatsynthetase 1
OVA
Ovalbumin
p
Irrtumswahrscheinlichkeit
PAMP
pathogen associated molecular patterns
PAS
Periodic Acid Schiff reaction
PDC
plasmacytic dendritic cell
pg
Pikogramm
PBS
phosphate buffered saline
PBMCs
peripheral blood mononuclear cells
PCR
Polymerasekettenreaktion
PEF
peak expiratory flow
Penh
Pause enhanced
PIF
Peak inspiratory flow
PMA
Phorbol-12-myristate 13-acetate
PreDicta
Post infectious immune-reprogramming and its association with
persistance and chronicity of respiratory allergic disease
PPRs
Pattern-Recognition-Receptors
PU.1
Spi-1 proto-oncogene
qPCR
quantitative Real-Time Polymerasekettenreaktion
206
Abkürzungsverzeichnis
r
rekombinant
RABA
kurzwirksame 2-Agonisten
rev
reverse
RISC
RNA-induced silencing complex
RNA
Ribonukleinsäure
RNaseL
latente Ribonuclease
RORt
Retinoic acid-related orphan recptor t
rpm
revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
Rrs
Respiratory systeme resistance
RSV
Respiratorischer Synzytial-Virus
RT
Raumtemperatur
RV
Rhinovirus
sec
Sekunde
SCF
stem cell factor
SDS
Natriumdodecylsulfat
SEM
standard error of the mean (Standardfehler)
siRNA
small interfering RNA
SOCS
suppressor of cytokine signaling
SSC
Side scatter
STAT
signal transducer and activator of transcription
TAE
Tris-Acetat-EDTA
T-bet
T-box expressed in T cells
Tc
Cytotoxic T-lymphocyte
TCRs
T cell Receptors
Te
Expirationszeit
TEMED
N,N´,N,N´-Tetramethylethylendiamin
Tfh-Zellen
follikuläre T-Helferzellen
TGF-
Transforming growth factor beta
Th-Zellen
T-Helferzellen
TILL
TIR/Toll/IL-1R
TLR
Toll like receptor
TMB
3, 3´, 5,5´-Tetramethylbenzidin
TNF
Tumor necrosis factor
TNFR
tumor necrosis factor receptor
207
Abkürzungsverzeichnis
Tr1
regulatorische T-Zellen vom Typ 1
TRAF6
TNFR-associated factor 6
Treg-Zellen
regulatorische T-Zelle
TREM
triggering receptor expressed on myeloid cells
TSLP
thymic stromal lymphopoietin
TYK2
Tyrosinkinase 2
U
Units
u.a.
unter anderem
unst.
unstimuliert
wt
Wildtyp
z. B.
zum Beispiel
α
anti
μg
Mikrogramm
μl
Mikroliter
208
Publikationen
13 Publikationen
Übel, C., Koch, S., Meier, A., Sopel, N., Graser, A., Mousset, S. und Finotto, S., 2012. Local
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Abstract)
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(*These authors contributed equally to this work)
Roumpedaki, E., Xepapadaki, P., Taprantzi, P., Tineke, D., Bachert, C ., Lukkarinen, H.,
Jartti, T., Graser, A., Zimmermann, T., Finotto, S., Sobanska, A., Kowalski, M.L. und
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preschoolers and healthy controls. ALLERGY, Volume: 69 (Meeting Abstract)
Graser, A., Zimmermann, T., Papadopoulos, N. G., Vuorinen, T. und Finotto, S., 2014.
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Sopel, N., Übel, C., Graser, A., Hildner, K., Reinhardt, C., Zimmermann, T., Rieker, R.J.,
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(Meeting Abstract)
210
Publikationen
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04. 05– 08.05.2012
Immunology 2012™, 99th annual meeting, Boston;
Posterpräsentation und Vortrag: “Role of IL-17A in airway
tolerance in a murine model of allergic asthma”
29.06 – 01.07.2013
12th International Congress of Pediatric Pulmonology, Valencia
Posterpräsentation: “Gender specific regulation of GATA-3 in
allergic asthma”
07.06 – 11.06.2014
European Academy and Clinical Immunology Congress 2014,
Kopenhagen
Posterpräsentation: “IL-17A and its anti-viral properties in
allergic asthma”
211
Danksagung
14 Danksagung
Ich möchte mich an dieser Stelle herzlichst bei allen Personen bedanken, die mich während
der Entstehung dieser Arbeit unterstützt haben.
Besonders bedanken möchte ich mich bei:
Frau Prof. Dr. Dr. Susetta Finotto für die Bereitstellung des interessanten und vielfältigen
Promotionsthemas und ihre Betreuung, Förderung und Unterstützung bei der Erstellung
meiner Doktorarbeit.
Herrn Prof. Dr. Falk Nimmerjahn für die Übernahme der Betreuung und des Erstgutachtens.
Herrn Prof. Dr. Martin Herrmann für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Dem gesamten Team der PreDicta-Studie, besonders den Mitarbeitern der Kinder- und
Jugendklinik in Erlangen.
Der gesamten AG Finotto für das gute Arbeitsklima und die unermüdliche Hilfe und
Unterstützung, vor allem an den Versuchstagen.
Herrn Prof. Dr. Markus F. Neurath, Dr. Sonja Koch, Dr. Sarah Reppert und Nina Sopel für
das Korrekturlesen meiner Arbeit.
Meiner Familie, die mich während meiner Promotionszeit immer unterstützt hat.
Maximilian, für seine Hilfe, Unterstützung und Geduld während der vergangen Jahre.
212

Bergisch Gladbach atmet durch!

Die Magie der Zellen Vortragsabend

Asthma- und Allergiezentrum

Abend-Workshop zur Vorsorgeaktion

- Immunologie für Jedermann

Persönlicher Asthma-Aktionsplan

Wir beginnen am Freitag, den 22. Januar 2016 mit neuen

Asthma und Sport - Hotel Engel Liestal

Den Tumor kontrollieren

Direkte Laserinterferenzstrukturierung und anodische Oxidation zur