Schnelle Identifizierung von oralen Actinomyces-Arten des
subgingivalen Biofilms mittels MALDI-TOF-MS
Publikationspromotion
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med. dent.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von:
Toralf Harald Borgmann
geboren am 14.04.1988 in Dresden
angefertigt am:
Institut für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der
Universität Leipzig
Betreuer:
Prof. Dr. med. A. C. Rodloff, OÄ Dr. medic. Catalina-Suzana Stingu,
Prof. Dr. K. Eschrich
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 17.11.2015.
Inhaltsverzeichnis
1. Bibliographische Beschreibung
3
2. Einführung
5
2.1. Einleitung
5
2.2. MALDI-TOF-MS-Analyse von Bakterien
6
2.3. Actinomyces
9
2.4. Grundlagen zur Bearbeitung und Auswertung der Spektren mit
Klassifikation und Clusteranalyse
14
2.4.1. Zentroide
14
2.4.2. Ähnlichkeitsanalyse
14
2.4.3. Hierarchisch-agglomeratives Verfahren und Darstellung der
Ergebnisse
2.4.4. Klassifikation
15
16
3. Publikation
19
4. Zusammenfassung
26
5. Literaturverzeichnis
30
6. Anlagen
39
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
39
Lebenslauf
40
Danksagung
42
1. Bibliographische Beschreibung
Name: Borgmann, Toralf Harald
Titel: Schnelle Identifizierung von oralen Actinomyces-Arten des subgingivalen Biofilms
mittels MALDI-TOF-MS
Universität Leipzig, Publikationspromotion
42 S1, 116 Lit.2, 5 Abbildungen, 1 Tabelle , 3 Anlagen
Referat:
Aktinomyzeten sind ein Teil der residenten Flora des menschlichen Verdauungstraktes,
des Urogenitalsystems und der Haut. Die zeitraubende Isolation und Identifikation der
Aktinomyzeten durch konventionelle Methoden stellt sich häufig als sehr schwierig dar. In
den letzten Jahren hat sich jedoch die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/IonisationFlugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) als Alternative zu etablierten Verfahren
entwickelt und stellt heutzutage eine schnelle und simple Methode zur Bakterienidentifikation dar. Unsere Studie untersucht den Nutzen dieser Methode für eine schnelle
und zuverlässige Identifizierung von oralen Aktinomyzeten, die aus dem subgingivalen
Biofilm parodontal erkrankter Patienten isoliert wurden. In dieser Studie wurden elf
verschiedene Referenzstämme aus den Stammsammlungen ATCC und DSMZ und 674
klinische Stämme untersucht. Alle Stämme wurden durch biochemische Methoden vorab
identifiziert und anschließend ausgehend von den erhobenen MALDI-TOF-MS-Daten
durch Ähnlichkeitsanalysen und Klassifikationsmethoden identifiziert und klassifiziert. Der
Genotyp der Referenzstämme und von 232 klinischen Stämmen wurde durch
Sequenzierung der 16S rDNA bestimmt. Die Sequenzierung bestätigte die Identifizierung
der Referenzstämme. Diese und die zweifelsfrei durch 16S rDNA Sequenzierung
identifizierten Aktinomyzeten wurden verwendet, um eine MALDI-TOF-MS-Datenbank zu
erstellen. Methoden der Klassifikation wurden angewandt, um eine Differenzierung und
Identifikation zu ermöglichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination aus
Datenerhebung mittels MALDI-TOF-MS und deren Verarbeitung mittels SVM-Algorithmen
1
Seitenzahl insgesamt
2
Zahl der im Literaturverzeichnis ausgewiesenen Literaturangaben
3
eine gute Möglichkeit für die Identifikation und Differenzierung von oralen Aktinomyzeten
darstellt.
4
2. Einführung
2.1. Einleitung
Bakterien stellen nach heutigem Erkenntnisstand neben den Archeae und Eukaryoten die
kleinsten und ältesten Lebewesen unseres Planten dar (1). Auch für unseren Organismus,
der etwa zehnmal mehr Bakterienzellen enthält als menschliche Körperzellen, spielen sie
eine wichtige Rolle. Ohne Bakterien wäre unser Leben nicht annähernd so vielseitig wie
wir es kennen (2). Dabei ist bis heute wahrscheinlich nur ein Bruchteil der tatsächlich
existierenden Bakterienspezies bekannt oder phylogenetisch korrekt eingeordnet (3).
Deshalb ist es besonders wichtig, auch wenig erforschte Bakterienarten in die aktuelle
Forschung mit einzubeziehen, um immer wieder neue Horizonte im Bereich der
Mikrobiologie zu erschließen, denn auch unscheinbare Spezies können eine für den
Menschen bedeutende Rolle spielen (4). In der Vergangenheit hat sich immer wieder
gezeigt, dass die Identifizierung und Klassifizierung von Bakterien eine schwierige
Aufgabe darstellt (5). Bereits mehrfach wurden bestehende Systeme geändert und im
Laufe der jüngeren Geschichte revolutioniert. Nach der Entdeckung der Bakterien im 17.
Jahrhundert war man mehrere Jahrhunderte lang auf eine Unterscheidung durch
morphologische Kriterien angewiesen, bis sich Mitte des 19. Jahrhunderts die Biochemie
als eigenständige Disziplin entwickelte und die Grundlagen für elementare Vorgänge und
Reaktionen in Lebewesen entdeckte und nachweisbar machte. Dieses Wissen wurde auch
in Methoden für die Bakterienidentifizierung umgesetzt und veränderte dadurch die
Mikrobiologie bis heute von Grund auf (6). Eine spezifische Behandlung mit Antibiotika auf
Grundlage einer genauen phänotypischen Keimklassifizierung ist aus Sicht der klinischen
Behandlung unentbehrlich geworden und rettet täglich unzähligen Menschen das Leben
(7). Mit der Entdeckung der DNA als Träger der Erbinformation und nach der Entwicklung
experimenteller DNA-Analyseverfahren ergaben sich völlig neue Möglichkeiten einer
genotypischen Charakterisierung von Bakterien (8). Inzwischen hat sich für die
Identifizierung von Bakterien das Verfahren der DNA-Sequenzierung zum Goldstandard
entwickelt und bildet heute die solide Grundlage einer phylogenetischen Zuordnung von
Bakterienarten auf Grundlage ihrer Erbinformationen (9). Auch für einzelne
Identifizierungen im Rahmen von Forschungsarbeiten oder der klinischen Diagnostik stellt
diese Methode eine gute Möglichkeit dar. Eine flächendeckende Diagnostik ist damit
jedoch meistens nicht möglich, da bisher der Zeit- und Kostenaufwand zu hoch und die
dafür nötigen Geräten oftmals nur speziellen Laboren zugänglich sind.
5
Parallel zur Genotypisierung wurden aber auch die auf dem Phänotyp basierenden
Identifizierungs- und Differenzierungsmethoden für Bakterien weiterentwickelt. In vielen
Laboren weltweit hat in den letzten Jahren die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/
Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) Einzug gehalten. Dieses
Verfahren erlaubt eine genaue, günstige und zeitsparende Routineuntersuchung,
nachdem es bereits seit längerem in der Proteomforschung zur Bestimmung von
Proteinmassen eingesetzt wird (10,11,12). Die Grundlage für gute Identifizierungsergebnisse sind valide Datenbanken, die durch die Gerätehersteller und auch durch die
Benutzer selbst bereitgestellt werden können. Eine simple, gleichbleibende und wenig
benutzerabhängige Bedienung in Form von unveränderlichen Verfahrensparametern
erlaubt somit eine nachvollziehbare und vertrauensvolle Auswertung.
2.2. MALDI-TOF-MS-Analyse von Bakterien
Auf einen Probenträger wird die zu untersuchende Probe aufgetragen und mit einer
organischen Matrix vermischt. Als Probe dienen entweder die Zellen, wie sie nach Kultur
erhalten wurden, oder Zelllysate, die nach einem einfachen Aufschlussprotokoll erhalten
wurden. Nach dem Einschleusen des Probenträgers in eine Vakuumkammer wird die
Probe mit einem Laser beschossen, um sie zu verdampfen und gleichzeitig Ionen der in
der Probe vorhandenen Moleküle zu erzeugen.
Zur Ionisation der Probenmoleküle werden verschiedenartige Laser eingesetzt, die im UV(N2 oder Nd:YAG) oder im Infrarot-Bereich (Er:YAG und CO2) arbeiten. Im UV-Bereich
werden dabei die Elektronen des aromatischen π-Systems angeregt, bei IR-Lasern die
O-H-Bindungen der Matrices. Die Ionisierung der Moleküle erfolgt durch Protonierung,
Aufnahme und Abgabe eines Elektrons, Anlagerung eines Metall-Kations oder durch
Photoionisation. Dadurch werden in Abhängigkeit von Analyt, Matrix und Zusätzen
unterschiedliche Molekülionen gebildet. Durch Beschuss des Matrix-Analyt-Gemischs
werden Teile des Matrixgitters schlagartig verdampft und gleichzeitig sowohl Matrix- als
auch Analytmoleküle aus ihrem Verband gelöst. Die am häufigsten verwendeten Matrices
bestehen aus HCCA (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure) oder DHB (2,5-Dihydroxybenzoesäure). Auf diese Weise entstehen neutrale Moleküle und auch verschiedenartig
angeregte Teilchen, die sowohl von der Matrix als auch von den Analytmolekülen
stammen. Für die weitere Analyse werden überwiegend einfach geladene und
hauptsächlich unfragmentierte Moleküle, sogenannte „lucky survivors“, durch ein
elektrisches Feld innerhalb des Vakuums in Richtung des Detektors geleitet (13,14). Dabei
handelt es sich hauptsächlich um Peptide und Proteine. Daher ist es kaum verwunderlich,
6
dass genetisch sehr nah verwandte Bakterien auch nur schwer unterschieden werden
können (15). Standardmäßig werden die gleichen Proben zumindest im Doppelansatz
mehrfach gepulst, um damit das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und
Verunreinigungen und dem Verfälschen der Ergebnisse vorzubeugen.
Die massenspektrometrische Analyse erfolgt danach über die Flugzeit. Nach der initialen
Beschleunigung im elektrischen Feld fliegen die geladenen Teilchen im feldfreien Raum
zum Detektor. Schwere Teilchen erreichen den Detektor später als leichte. Die Flugzeit
beträgt dabei nur wenige Mikrosekunden (Abb. 1) (16).
Abb. 1 Schematische Darstellung des MALDI-TOF-MS-Verfahrens
Das Ergebnis wird graphisch in Form eines Spektrogramms mit der relativen oder
absoluten Intensität auf der Y-Achse und dem Quotienten von Masse zu Ladung auf der XAchse dargestellt. Besonders im Bereich zwischen m/z 2500 und 7000 treten die für
Bakterien charakteristischen und stabilen Peaks auf (Abb. 2). Diese Peaks repräsentieren
abundante Proteine, wie z. B. ribosomale Proteine. Bei manchen Bakterienspezies werden
auch im höheren Massenbereich bis m/z 20 000 noch deutliche Peaks beobachtet (15).
Die aufgenommenen Spektren werden durch unterschiedliche mathematische Algorithmen
im Nachgang angepasst. Dabei kann z.B. automatisch eine Glättung und Subtraktion der
Grundlinie der Spektren vorgenommen werden und es werden Peaks markiert. Eine
zusätzliche manuelle Bearbeitung der Spektren kann im Forschungsbetrieb von Vorteil
sein, eignet sich jedoch für die klinische Routinediagnostik nicht (17).
7
Abb. 2 Darstellung eines in unserer Studie aufgezeichneten Spektrogramms
Aus diesem Grunde sind die meisten MALDI-TOF-MS-Geräte mit einem unterschiedlichen
Benutzerinterface für die klinische Routinediagnostik und die Forschung ausgestattet. Hier
unterscheiden sich auch die Datenbanken zum Abgleich der generierten Spektren deutlich
(18). Welche mathematischen Berechnungen in der Software des jeweiligen Herstellers
ablaufen, ist nicht nachvollziehbar, da dies das Firmengeheimnis eines jeden Herstellers
darstellt (17).
Unter den gegebenen Umständen stellen bereits etablierte Systeme wie das BiotyperSystem von Bruker oder das Vitek-MS / Saramis-System von bioMérieux zur
Routinediagnostik und Forschung für viele Anwender ein geeignetes System dar
(15,19,20). Da jedoch in kommerziell erhältlichen Datenbanken vor allem wenig
untersuchte Bakterienarten unterrepräsentiert sind, können diese nur bedingt analysiert
werden. Beispielhaft beinhalten die aktuellen MALDI-TOF-MS-Datenbanken der
kommerziellen Systeme von Bruker 30 von 39 und bioMérieux lediglich 10 von 39
Actinomyces Spezies (21,22). Wenn es auch mit der erhältlichen Forschungsdatenbank
und -software nicht möglich ist, interessierende Bakterienspezies zu identifizieren, sind
alternative Lösungsansätze in Form der Erstellung einer eigenen Datenbank und
8
Auswertungsmethodik nötig. Dazu werden normalerweise die Rohdaten in Form von
Exceltabellen ausgelesen und Listen erstellt, die die Peakverteilung darstellen.
Auf Basis dieser Peaks können Ähnlichkeitsanalysen durchgeführt und Klassifikationsmethoden angewendet werden (17).
2.3. Actinomyces
Bei den Aktinomyzeten handelt es sich um eine Gruppe von gram-positiven, obligat oder
fakultativ anaeroben, kurzen und pleomorphen Stäbchen, die sowohl echte als auch
filamentöse Verzweigungen aufweisen können und deren heterogene Morphologie bis zu
kokkobazillären Formen reicht. Sie können eine glatte Oberfläche oder auch zahlreiche
Fimbrien aufweisen und bilden Bernsteinsäure als wichtiges Abbauprodukt des
Glucosestoffwechsels. Ein großer Teil der oralen Standortflora wird durch Aktinomyzeten
bestimmt. Daneben finden sich im gesamten Verdauungstrakt und Urogenitalbereich
Vertreter dieser Spezies (23,24).
Die Bezeichnung der Aktinomyzeten wurde das erste Mal 1877 von Carl Otto Harz
eingeführt, als er den auslösenden Keim für die bovine Aktinomykose als Actinomyces
bovis bezeichnete. Der Ursprung dieses Namens gründet sich in der morphologischen
Beschreibung von filamentösen Strukturen, die durch A. bovis produziert werden. Auch die
Entdeckung von Actinomyces israelii als Leitkeim der humanen Aktinomykose änderte an
diesem Hauptkriterium der Beschreibung der Aktinomyzeten nichts (25,26). Seit 1920 wird
der Begriff Actinomyces als eine eigenständige Bakteriengattung verwendet (27,28) und
erst ab 1965 änderte sich die Beschreibung dieser Art durch Pine und Georg (29,30),
indem sie weitere phänotypische Merkmale, wie die Zellwandmorphologie und
Stoffwechselprodukte benutzten, um einer moderneren Klassifizierung gerecht zu werden.
Die Taxonomie änderte sich danach weiterhin stetig. Neue Bakterienspezies wurden
hinzugefügt und fälschlicherweise enthaltene Spezies wie z.B. Propionibacterium
propionicum entfernt (31,32). Bis heute ist die genaue Taxonomie und Unterscheidung der
sehr heterogenen Gruppe der Aktinomyzeten nicht abgeschlossen. Exemplarisch stellt
sich die Differenzierung der heterogenen Gruppe von Actinomyces naeslundii und
Actinomyces viscosus dar. Nachdem Carl Naeslund A. naeslundii bereits 1925 das erste
Mal beschrieb, wurde 1951 die Zuordnung zur Art der Aktinomyzeten aufgrund
morphologischer Kriterien vorgeschlagen (33,34). Ein 1965 ursprünglich als Odontomyces
eingeführtes Bakterium wies eine große Ähnlichkeit zu A. naeslundii auf und wurde 1969
als A. viscosus in die Nomenklatur aufgenommen (35,36). Aufgrund der Ähnlichkeit
bezüglich ihrer Antigenstruktur und physiologischen Charakteristik wurde sogar
9
vorgeschlagen, sie als Variation einer Spezies zu betrachten (37,38,39,40,41). Zwischen
1979 und 2009 wurden Studien mittels DNA-DNA-Hybridisierung und 16S rDNA
Sequenzierung durchgeführt und teilten den Actinomyces naeslundii/viscosus Komplex
letztlich in vier verschiedene Spezies auf (42,43,44). Die aktuelle Taxonomie sieht damit
eine Unterteilung in A. naeslundii sensu stricto, Actinomyces oris und Actinomyces
johnsonii für die humanen Vertreter vor. A. viscosus sensu stricto bezeichnet nun die
Vertreter der tierischen Isolate. Vor allem aufgrund molekularbiologischer Untersuchungen
konnten bis heute mindestens 39 Bakterienspezies den Aktinomyzeten zugeordnet
werden, wohingegen 1986 im zweiten Band von Bergey´s Manual of Systematic
Bacteriology erst zehn bekannt waren. Sie gehören zur Familie der Actinomycetaceae
innerhalb der Ordnung der Actinomycetales und der Unterordnung der Actinomycineae,
die ebenso noch die Arten Arcanobacterium, Actinobaculum,Varibaculum und Mobiluncus
beinhaltet (24).
Aktinomyzeten spielen vor allem bei dentogenen Erkrankungen (Karies, Parodontitis,
Pulpitiden, Abszesse) und okulären Infektionen (Konjunktivitis, Canaliculitis des Ductus
lacrimalis, Keratitis oder bei intraokulären Infektionen) eine Rolle (45,46,47,48,49,50,51,
52,53,54,55). Die Virulenz ist dabei von Spezies zu Spezies verschieden. Die zervikofaciale Aktinomykose ist dabei die am weitesten bekannte Erkrankung und wird
hauptsächlich durch A. israelii und A. gerencseriae oder auch durch Propionibacterium
propionicum und seltener durch Bifidobacterium dentium ausgelöst (56). Es handelt sich
dabei um eine chronisch-granulomatöse Erkrankung, die durch eine Keimverschleppung
von Aktinomyzeten als ein Bestandteil der natürlichen Haut- und Schleimhautflora in tiefe
Hautschichten ausgelöst wird. Verschiedene andere Bakterienspezies verstärken
außerdem die pathogene Wirkung von Aktinomyzeten. Oft sind sie hierbei mit
Aggregatibacter actinomycetemcomitans assoziiert (57,58,59). Die Zusammensetzung der
jeweiligen Mischinfektion ist dabei von Fall zu Fall verschieden. Durch die anatomische
Nähe vom bevorzugt betroffenen Kopf- und Halsbereich zum Gehirn kann sich in seltenen
Fällen eine Infektion des zentralen Nervensystems anschließen. Auch eine hämatogene
Streuung von weiter entfernten Infektionsherden ist möglich und verursacht Meningitiden,
Abszesse und Empyeme (60,61,62,63.64). Die thorakale Aktinomykose kann sich sowohl
ausgehend von einer zerviko-facialen Aktinomykose, durch Aspiration oder durch eine
hämatogene Weiterleitung ausbilden (65,66,67). Die abdominale Aktinomykose tritt häufig
nach Appendizitiden, Traumata oder abdominalen Verletzungen auf und betrifft das jeweils
verletzte Segment des Verdauungstraktes (68,69,70,71). Insbesondere die kontinuierlich
erhöhte Anzahl von Actinomyces-assoziierten Infektionen des Beckens ist in den letzten
10
Jahren festgestellt worden (72,73,74,75). Im Bereich der Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie
stehen Aktinomyzeten außerdem seit kurzem im Verdacht, stärker als bisher vermutet mit
Osteoradionekrosen und Bisphosphonat-assoziierten Knochennekrosen in Verbindung zu
stehen. Der Wirt muss dabei nicht zwingend immunkompromittiert sein (76,77,78,79,
80,81,82). Weitere in Verbindung mit den in unserer Studie untersuchten Aktinomyzeten
stehende Erkrankungen sind exemplarisch in Tab. 1 dargestellt (83).
Actinomyces dentalis (2005)
Abszesse der Mundhöhle
Actinomyces europaeus (1997)
Dekubitusgeschwüre, subkutane Fisteln
Actinomyces georgiae (1990)
Endokarditis
Actinomyces gerencseriae (1990)
Canaliculitis des Ductus lacrimalis,
Actinomyces graevenitzii (1997)
Ostitis, Bronchialsekret, Koinfektion mit
Mycobacterium tuberculosis
Actinomyces israelii (1896/1990)
Aktinomykose, Cervicitis,
Endometritis,Canaliculitis des Ductus
lacrimalis
Actinomyces johnsonii (2009)
Actinomyces massiliensis (2009)
Abszesse der Mundhöhle
Actinomyces meyeri (1938/1984)
Hirn- und zerviko-faciale Abszesse,
Lungen- und Brustabszesse, Abszesse der
Hüfte, der Symphysis pubica, der Beine
und Füße sowohl mit als auch ohne
Osteomyelitis; Nierenentzündung,
Leberentzündung, starke
Streuungstendenz zu Niere, Herzklappen
oder Gehirn
Actinomyces naeslundii (1951/2009)
Infektionen der Gallenblase, von
Totalendoprothesen des Knies und der
Hüfte sowie des Kniegelenks; Plaque und
Kariesentstehung, Augenentzündungen
Actinomyces neuii (1994)
infizierte Atherome, infizierte
Brustimplantate, chronische Osteomyelitis,
Endokarditis
Actinomyces odontolyticus (1958)
Geschwüre der oralen Mucosa,
Peritonsillarabszess, Enterokutane Fisteln,
Leberabszesse, Lungenentzündung mit
Ausbreitung in die Pleura, das Mediastinum
und das Pericard, Sepsis, Plaque und
Kariesentstehung, Augenentzündungen
11
Actinomyces oris (2009)
Plaque- und Kariesentstehung
Actinomyces radicidentis (2000)
infizierte Wurzelkanäle
Actinomyces timonensis (2010)
Actinomyces urogenitalis (2000)
Penisgeschwüre, Beckenaktinomykose
Actinomyces viscosus (1965)
Abzsess ausgehend von einem Hundebiss
und in Blutproben eines
Endokarditispatienten isoliert,
Augenentzündungen
Tab. 1 In unserer Studie identifizierte Actinomyces-Arten mit dem Jahr ihrer Erstbeschreibung
und den korrespondierenden Erkrankungen
Die Therapieempfehlung für Aktinomyzeteninfektionen ist die primäre chirurgische
Behandlung mit unterstützender ß-Laktam-Antibiose (84). Aktinomyzeten sind darüber
hinaus oft sensibel gegenüber Tetrazyklinen, Clindamycin, Rifampicin, Linezolid und
Cefoxitin (85,86,87). Bei Isolaten einiger Spezies wurden Resistenzen gegenüber
Erythromycin, Ciprofloxacin und Mupirocin festgestellt (88, 89).
Eine folgerichtige und zuverlässige Taxonomie der Aktinomyzeten zu definieren ist immer
noch sehr schwierig (90,91). Um Verwandtschaftsbeziehungen darzustellen, werden oft
phylogenetische Bäume auf Grundlage ihrer 16S rDNA Sequenzen erstellt. Ein großes
Problem stellt das Festlegen einer genauen Abgrenzung zwischen den einzelnen Spezies
dar. Der Grund dafür sind die geringen „bootstrap values“ im phylogenetischen Baum der
neueren Aktinomyzeten (meint meistens Actinomyces Spezies, die nach 1990 entdeckt
wurden oder die Vertreter des „core cluster 2“) (92) und damit die Grundlage zur
Festlegung, wann sich Spezies voneinander unterscheiden. Sowohl die für die Analyse der
Gensequenzen zugrundeliegenden Algorithmen und Parameter der phylogenetischen
Analysen als auch die Anzahl der für den Vergleich zugrundeliegenden Spezies (und
wiederum die Anzahl der Proben pro Spezies) können die Anordnung der Äste stark
beeinflussen. Bei der nicht monophyletischen Gruppe (93) der Aktinomyzeten ist davon
auszugehen, dass sich deren Topologie durch die Einführung neuer Spezies weiterhin
ändert. Die bisherige Zuordnung der Aktinomyzeten aufgrund ihrer Gensequenzen stößt
damit an ihre Grenzen. Deshalb wird vorgeschlagen, dass weitere Kriterien wie z.B.
12
physiologische, morphologische und chemotaxonomische Kriterien in die Topologie mit
einfließen. Diese Kriterien fehlen momentan oft und müssen den neueren Spezies erst
noch zugeordnet werden, weshalb die Bakterienart der Aktinomyzeten auch manchmal als
„Abstellplatz“ für unklare Bakterienspezies bezeichnet wird (92). Für die Aktinomyzeten
wurde anhand solcher Dendrogramme die Einteilung in zwei sogenannte „core cluster“
vorgeschlagen (92,93). In der Veröffentlichung unserer Studie ist eine solche Analyse
ausgehend von unseren mittels MALDI-TOF-MS ermittelten Daten für die Referenzstämme der Datenbank enthalten (Abb. 3). Uns diente das von Schaal 2006 erstellte
Dendrogramm über die Verwandtschaftsbeziehungen der Actinomycetaceae als Vergleich
für unsere Datenbank (92).
Abb. 3 Dendrogramm auf Grundlage der Referenzdatenbankzentroide (94)
13
2.4. Grundlagen zur Bearbeitung und Auswertung der Spektren mit Klassifikation
und Clusteranalyse
2.4.1. Zentroide
Für jedes Isolat einer Spezies wurden 10 Spektren aufgenommen. Um den Datenbestand
weiter bearbeiten zu können, müssen die aufgenommenen Spektren in eine miteinander
vergleichbare Form überführt werden. Um identische Peaks in den Datensätzen zu
erkennen, wird ein gleitendes Massefenster verwendet. Allen Peaks, die in ein
Massefenster fallen, wird der mittlere m/z-Wert der Peaks in diesem Fenster und eine
mittlere Peakintensität zugeordnet. Peaks, die nur in einem oder wenigen Spektren
auftreten, werden für die weiteren Untersuchungen nicht berücksichtigt. Auf diese Weise
werden Peaks, die in der Mehrzahl der Spektren auftreten, in ein gemeinsames,
übergeordnetes „Isolat-Spektrum“ überführt.
Waren mehrere Isolate für eine Spezies vorhanden, wurde diese Vorgehensweise
wiederholt und ein speziesspezifisches Spektrum („Spezies-Zentroid“ oder „Zentroidspektrum“) erzeugt, das mit dem Schwerpunkt eines vieldimensionalen ungleichmäßigen
geometrischen Körpers verglichen werden kann. Diese Zentroidspektren, die
Informationen vieler einzelner Spektren enthalten, können nun mit bekannten oder
unbekannten Spektren verglichen werden.
Für den Vergleich von Spektren und Zentroidspektren müssen zunächst die Merkmale der
Objekte festgelegt werden, die miteinander verglichen werden sollen und das Maß,
welches die Ähnlichkeit oder Proximität ausdrückt. Normalerweise werden die Merkmale
eines Objektes numerisch angegeben und stellen deshalb Punkte in einem ndimensionalen Raum dar. In dieser Arbeit wird das binäre Jaccard-Distanzmaß genutzt
(95,96). Dabei handelt es sich um eines der Token-basierten Distanzmaße, wobei
Teilstücke (sogenannte Token) der zu vergleichenden Zeichenkette in einem Vektorraum
miteinander verglichen werden. Die so als gleich bewerteten Token werden anschließend
mit der Anzahl aller Token der Zeichenkette verglichen, wobei der Wert eine Zahl zwischen
0 (Identität) und 1 (keine Ähnlichkeit) annehmen kann (97).
2.4.2. Ähnlichkeitsanalyse
Die Clusteranalyse dient dem Auffinden von Ähnlichkeitsbeziehungen in großen
Datenbeständen. Als Cluster werden dabei Gruppen von in Bezug auf das gewählte
Distanzmaß „ähnlichen“ Zentroidspektren bezeichnet. Im Gegensatz zu der unten
beschriebenen Klassifikation, bei der die Daten bestehenden Klassen zugeordnet werden,
14
werden hier Gruppen in den Daten auf der Grundlage von Distanzmaßen gebildet. Das
Ziel der Clusteranalyse besteht darin, neue Gruppen in einem Datenbestand zu
identifizieren. Dabei sollten Objekte innerhalb einer Gruppe idealerweise die
größtmögliche Identität und Objekte anderer Gruppen hingegen einen größtmöglichen
Unterschied aufweisen. In diesem Zusammenhang wird die Clusteranalyse häufig für die
Typologie von Bakterien eingesetzt. Die Clusteralgorithmen gehören zu den
unüberwachten Lernverfahren, da keine bekannten Merkmale der Daten für die Einteilung
genutzt werden. Dies trifft vor allem auf experimentelle Fragestellungen zu, wenn deren
Datenbestand noch nicht klassifiziert wurde. Die Konstruktion der Cluster geht dabei von
einer Ähnlichkeitsmatrix aus und kann grundsätzlich auf verschiedenen Wegen erfolgen
(98). Die partitionierenden und hierarchischen Verfahren stellen neben der
graphentheoretischen und optimierenden Verfahrensweise die klassischen Methoden dar.
Bei hierarchischen Systemen bestehen die Cluster aus Objekten, die zueinander eine
größere Ähnlichkeit aufweisen als zu den Objekten anderer Cluster. Es wird eine
Hierarchie aufgestellt, bei der auf der einen Seite ein Cluster entsteht, der alle Objekte
enthält und auf der anderen Seite eine maximale Auftrennung der Objekte erfolgt. Diese
Hierarchie kann divisiv oder agglomerativ erfolgen. Beim divisiven Clusterverfahren („Topdown-Verfahren“) werden aus einem Cluster schrittweise mehrere kleinere Cluster
gebildet. Beim agglomerativen Verfahren („Bottom-up-Verfahren“) erfolgt die
Clusterbildung in umgekehrter Reihenfolge ausgehend von einzelnen Objekten bis hin zur
Vereinigung der Objekte in einen gemeinsamen Cluster (99,100).
2.4.3. Hierarchisch-agglomeratives Verfahren und Darstellung der Ergebnisse
Bei diesem verbreiteten Verfahren werden ausgehend von einzelnen Objekten Gruppen
gebildet und diese weiter zu größeren Gruppen fusioniert. Es existieren veschiedene
Verfahren, die dieses Fusionskriterium definieren, wie z.B. das „single linkage“-, „complete
linkage“-, „average linkage“-, „centroid clustering“- oder das Ward´sche Verfahren. Das
von uns benutzte „complete linkage“-Verfahren wird vor allem verwendet, um Cluster mit
möglichst geringem Durchmesser zu erzeugen, da sich der Abstand der beiden Gruppen
aus dem maximalen Abstand zweier Objekte aus jeweils einer der Gruppen ergibt. Die
Heterogenität der Gruppen wächst damit im Laufe des Verfahrens an. Nach jeder Fusion
werden neue Abstände zwischen den Gruppen ermittelt und iterierend verarbeitet. Das
Ergebnis wird in einem Dendrogramm dargestellt (101). Dabei stellen die Knotenpunkte
die Gruppen dar. Die Inklusionsbeziehungen werden durch die waagerechten Linien
dargestellt. Abstandsrelationen werden anhand der Länge der waagerechten Linie und
15
damit deren Fusionreihenfolge angezeigt. Je näher die Knotenpunkte dabei an den
ursprünglichen Objekten oder Gruppen liegen, desto näher sind sie miteinander verwandt.
Die Länge der vereinigten Klammer in Richtung der X-Achse gibt die Kompaktheit des
Clusters an (102). Die Clusteranalyse kann mittels Computerprogrammen wie SPSS (103)
oder mit Hilfe von Algorithmen, wie sie z.B. in Matlab (104) bereit gestellt werden, erfolgen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Bioinformatics-Toolbox von Matlab verwendet.
Komplexe Distanzbeziehungen einer großen Anzahl von Objekten werden dabei
übersichtlich dargestellt. Die Zuordnung der Objekte hängt stark vom verwendeten
Verfahren ab (105). Auch haben oft kleine Veränderungen des Datensatzes (Einfügen oder
Weglassen einer Probe) drastische Effekte auf die Struktur des Dendrogramms.
2.4.4. Klassifikation
Support-Vektor-Maschinen (SVM, „support vector machines“) gehören zu den
überwachten Lernverfahren, da hier markierte Trainingsdaten verwendet werden. Die
Zentroide der Referenzspektren unserer Datenbank, die bereits einer Klasse, in unserem
Falle einer Spezies, zugeordnet sind, stellen dabei die Trainingsmenge mit ihren
charakteristischen Merkmalen in Form der bereits beschriebenen zusammengefassten
Peaklisten dar. Mit dieser Trainingsmenge wird ein Klassifikator erstellt, der in der Lage ist,
Objekte anhand ihrer Merkmale einer Kategorie zuzuordnen. Der Vorteil von SVM besteht
in ihrer Transparenz und leichten Handhabung (106). Sie stellen darüber hinaus eine
solide Grundlage für unsere Arbeit dar, da sie bereits sehr gute Ergebnisse, u.a. auch im
Bereich der Bakterienidentifizierung, gezeigt haben (107,108,109).
Bei dem „support vector“ als „large margin classifier“ wird eine Menge von Objekten so in
Klassen eingeteilt, dass zwischen ihnen ein möglichst großer Bereich frei bleibt. Jedes
Objekt stellt dabei einen Vektor in einem Vektorraum dar. Der Klassifikator fügt in diesen
Raum eine Hyperebene ein, die als Trennfläche fungiert und die bekannten Objekte in
zwei Gruppen aufteilt. Diese Trennfläche liegt so, dass der Abstand der Vektoren, die der
Trennebene am dichtesten anliegen, maximal wird (Abb. 4).
16
Abb. 4 lineare Trennung
Abb. 5 nicht-lineare Trennung
Der Nutzen der maximierten Trennebene liegt darin, dass auch Objekte, die nicht genau
die Werte der Trainingsobjekte annehmen, trotzdem einer Klasse zugeordnet werden
können. Eine Trennung kann hierbei nur durch eine lineare Trennebene erfolgen (Abb. 4),
die für die meisten Anwendungsbeispiele nicht existiert (110). Deshalb wird der
sogenannte Kernel-Trick angewandt, bei dem der Vektorraum in einen höherdimensionalen Raum überführt wird, bis eine lineare Trennung möglich ist. Bei der
Rücktransformation in den ursprünglichen Raum entsteht eine nichtlineare Trennebene
(Abb. 5), die in der Lage ist, die zwei Klassen voneinander zu unterscheiden. Im Rahmen
unserer Arbeit wurde jedoch lediglich eine lineare Trennung verwendet. Das beschriebene
SVM-Verfahren wird typischerweise für 2-Klassen-Probleme („binary-class SVM“) genutzt.
Moderne Weiterentwicklungen der Programme können jedoch auch wie in unserem Fall
für n-Klassen-Probleme („multi-class SVM“) angewandt werden. Dabei werden
verschiedene Ansätze unterschieden, die entweder mehrere „binary-class SVM“
kombinieren oder direkt alle Daten innerhalb eines optimierten „multi-class SVM“
verarbeiten (111).
Für den Vergleich zwischen den klinischen Isolaten und den Spezies der
Referenzdatenbank wurde die „one-versus-one“-Methode als „multi-class-SVM“
verwendet. Dabei werden die zu vergleichenden Objekte paarweise analysiert und einer
Klasse zugeordnet. Die Klasse, welche die meisten Übereinstimmungen mit der
untersuchten Probe zeigt, wird als Identifikationsergebnis bestimmt. Genaue
Beschreibungen über Kernelfunktionen und „support vector machines“ sind in zahlreichen
Fachbüchern zu finden (112,113). In dieser Arbeit wurde das MATLAB-Interface der
LIBSVM-Toolbox genutzt (114). Weitere Klassifikationsmethoden wie „random forest“17
Algorithmen oder „kernel matching pursuits“ (115,116) wurden in dieser Arbeit nicht
genutzt.
18
3. Publikation
Rapid identification of oral Actinomyces species cultivated from subgingival biofilm
by MALDI-TOF-MS
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Datenbank bekannter Bakterienspezies mittels
MALDI-TOF-MS-Analyse angelegt und mit einem SVM-Algorithmus ausgewertet. Es
wurde keine kommerziell erhältliche Identifizierungssoftware benutzt. Das
Differenzierungspotential der MALDI-TOF-MS auf Grundlage der eigens angelegten
Datenbank und der Identifizierungsalgorithmen wurde mit jeweils 20 Bakterienstämmen
der sehr nah verwandten Spezies A. naeslundii und A. oris überprüft. Es konnte in 100 %
der Fälle eine korrekte Identifizierung erzielt werden.
C.-S. Stingu und T. Borgmann haben gleichberechtigt zur Arbeit beigetragen.
19
ournal of
r
ral
i
icrobiology
!
ORIGINAL ARTICLE
Rapid identification of oral Actinomyces species
cultivated from subgingival biofilm by MALDI-TOF-MS
Catalina S. Stingu1$*, Toralf Borgmann1$, Arne C. Rodloff1, Paul Vielkind1,
Holger Jentsch2, Wolfgang Schellenberger3 and Klaus Eschrich3
1
Institute for Medical Microbiology and Epidemiology of Infectious Diseases, University Hospital of Leipzig,
Leipzig, Germany; 2Centre of Periodontology, Department for Cariology, Endodontology and Periodontology,
University Hospital of Leipzig, Leipzig, Germany; 3Institute of Biochemistry, University of Leipzig, Leipzig,
Germany
Background: Actinomyces are a common part of the residential flora of the human intestinal tract,
genitourinary system and skin. Isolation and identification of Actinomyces by conventional methods is often
difficult and time consuming. In recent years, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometry (MALDI-TOF-MS) has become a rapid and simple method to identify bacteria.
Objective: The present study evaluated a new in-house algorithm using MALDI-TOF-MS for rapid
identification of different species of oral Actinomyces cultivated from subgingival biofilm.
Design: Eleven reference strains and 674 clinical strains were used in this study. All the strains were
preliminarily identified using biochemical methods and then subjected to MALDI-TOF-MS analysis using
both similarity-based analysis and classification methods (support vector machine [SVM]). The genotype
of the reference strains and of 232 clinical strains was identified by sequence analysis of the 16S ribosomal
RNA (rRNA).
Results: The sequence analysis of the 16S rRNA gene of all references strains confirmed their previous
identification. The MALDI-TOF-MS spectra obtained from the reference strains and the other clinical
strains undoubtedly identified as Actinomyces by 16S rRNA sequencing were used to create the mass spectra
reference database. Already a visual inspection of the mass spectra of different species reveals both similarities
and differences. However, the differences between them are not large enough to allow a reliable differentiation by similarity analysis. Therefore, classification methods were applied as an alternative approach for
differentiation and identification of Actinomyces at the species level. A cross-validation of the reference
database representing 14 Actinomyces species yielded correct results for all species which were represented by
more than two strains in the database.
Conclusions: Our results suggest that a combination of MALDI-TOF-MS with powerful classification
algorithms, such as SVMs, provide a useful tool for the differentiation and identification of oral Actinomyces.
Keywords: MALDI-TOF-MS; oral Actinomyces; support vector machine
*Correspondence to: Catalina S. Stingu, Institute for Medical Microbiology and Epidemiology of
Infectious Diseases, University Hospital of Leipzig, Liebigstrasse 21, DE-04103 Leipzig, Germany,
Email: [email protected]
Received: 26 September 2014; Revised: 9 December 2014; Accepted: 12 December 2014; Published: 16 January 2015
ctinomyces are a common part of the residential
flora of the human intestinal tract as well as
other habitats such as the genitourinary tract
system and the skin. They are gram-positive, anaerobic,
and aerotolerant, non-spore-forming, non-motile pleomorphic rods. Although the genus Actinomyces was
already described in 1919, many new species were found
A
quite recently. Although in 1986 only 10 species were
recognized as Actinomyces (1), the number has increased
to at least 36 by now (2), 20 of them being relevant for
human medicine. Actinomyces species are mainly associated with cervicofacial actinomycosis, oral or cerebral
abscesses, caries, and periodontitis (1, 3, 4). They seem
to play a bigger role than expected in the pathogenesis
$
Both authors had contributed equally to this work.
Journal of Oral Microbiology 2015. # 2015 Catalina S. Stingu et al. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons
Attribution-Noncommercial 3.0 Unported License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/), permitting all non-commercial use, distribution, and
reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110
1
(page number not for citation purpose)
20
Catalina S. Stingu et al.
of osteoradionecrosis- and bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw (5, 6), and can cause lethal infection
such as mediastinitis (7). As a consequence, fast and
reliable identification methods for Actinomyces species
have become increasingly important.
Isolation and identification of Actinomyces by conventional methods is often difficult and time consuming. Many studies have been performed to characterize
Actinomyces species using phenotypic (8!10) and molecular (11, 12) approaches. Most of the available commercial identification kits (Rapid ID 32 A, API Coryne,
VITEK 2, ANC ID Card, bioMerieux, and VITEK-MS,
bioMerieux) do not include the majority of newer species
in their database and the sophisticated molecular methods, such as chromosomal DNA fingerprinting, arbitrarily primed PCR, polymerase chain reaction-restriction
fragment length polymorphism (PCR-RFLP) (13), and
16S ribosomal RNA (rRNA) sequencing, are still available only in research and reference laboratories.
In recent years, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS)
has become a rapid and simple method to identify bacteria.
However, this method can be used for routine detection
only if high quality reference spectra databases are available (14, 15). Moreover, if phenotypically similar bacterial
species are to be discriminated, powerful algorithms for
spectra analysis are critical for success.
The present study aimed to evaluate a new in-house
identification algorithm using MALDI-TOF-MS for rapid
identification of different species of oral Actinomyces
cultivated from subgingival biofilm.
identified using the diagnostic traits of the type strains
(16!18).
The genotypes of all the reference strains and of 232
clinical isolates were identified by sequence analysis of
the 16S rRNA gene. The strain sequences were compared
with sequences deposited in GenBank using the program
BLAST through the NCBI server and with the sequences
deposited in the Human Oral Microbiome Database
(HOMD) using the program HOMD 16S rRNA Sequence
Identification (19). We included in the reference database
only the strains with percent identities of at least 99%
in both programs.
The similarity in 16S rRNA gene sequence analysis was
very similar for A. odontolyticus and Actinomyces meyeri
in both programs that we used. Biochemical characteristics cannot separate them either, so we pooled the two
species and attempted using MALDI-TOF-MS only to
differentiate this group from other Actinomyces species.
Material and methods
MALDI-TOF-MS analysis
The MALDI-TOF-MS procedures have been described in
detail elsewhere (15). Briefly, we used a MALDI-TOF
mass spectrometer, Autoflex II (Bruker Daltonics) with
a nitrogen laser (337 nm) operated in positive linear mode
(delay 150 ns, voltage 20 kV, mass range 3!20 kDa), and
we used a Flexcontrol software version 2.4 (Bruker
Daltonics). Each spectrum was automatically obtained
(average of 500 laser shots). The spectra were calibrated
externally using the Escherichia coli DH 5 alpha strain
prepared the same way as the clinical samples. The data
files were transferred to Flexanalysis version 2.4 (Bruker
Daltonics) for automated peak extraction. Sixty peaks
were automatically labeled in each spectrum according to
their appearance above the background (threshold ratio
1.5). We controlled manually the correct labeling. Peak
lists containing masses and intensities were exported as
Excel files.
Bacterial strains
In total, 685 bacterial strains were used in this study.
Eleven were reference strains: Actinomyces dentalis (DSM
19115), Actinomyces georgiae (DSM 6843), Actinomyces
gerencseriae (ATCC 23860), Actinomyces graevenitzii
(DSM 15540), Actinomyces neuii (DSM 8576), Actinomyces odontolyticus (DSM 43331), Actinomyces radicidentis (DSM 15433), Actinomyces viscosus (DSM 43798),
Actinomyces naeslundii (DSM 17233), Actinomyces oris
(DSM 23056), and Actinomyces israelii ATCC 12107.
The other 674 strains were fresh clinical isolates from
the subgingival biofilm of patients with chronic periodontitis. The presumptive identification of the clinical
strains was performed by established biochemical methods: colony morphology, pigmentation, gram stain morphology, catalase test, CAMP test, and Rapid ID 32 A.
Flowcharts for preliminary identification of Actinomyces
species proposed from Sarkonen et al. were also used (9).
The newly described species (Actinomyces timonensis, Actinomyces massiliensis, and A. dentalis) were preliminarily
2
(page number not for citation purpose)
MALDI-TOF-MS sample preparation
Individual colonies of each isolate or reference strain were
subcultured on Columbia blood agar for 4 days at 378C in
an anaerobic chamber (Whitley MG1000 anaerobic workstation, Meintrup DWS Laborgeräte, GmbH, Germany).
Colonies from the half surface of plates were suspended in
1 ml DNase-free water (SIGMA, Taufkirchen, Germany)
and then centrifuged at 8,500 g for 15 min. The further
processing of the samples was done according to Friedrichs et al. (15). For each strain, 10 consecutive spots
were prepared. In order to demonstrate reproducibility,
the sample preparation was repeated for each strain,
starting with a new culture.
Cluster formation of the mass peaks
To refine spectra accuracy, peak lists were aligned for
mass drift adjustment (15). Briefly, a mass-dependent
size of the mass window was used according to window
Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110
21
Identification of oral Actinomyces with MALDI-TOF-MS
size !sizeabs"(sizerel * peak mass) with sizeabs !0.8 m/z
and sizerel !0.001. Thus, for each bacterial species we
arrived at a mean spectrum containing common m/z
values. All spectra obtained for this species were aligned
individually to the peaks of the mean spectrum by linear
mass adjustment of the peaks (20). Subsequently, peak
clusters were formed which contained all peaks originating
from different individual spectra, however, occurring in
the same window. All peaks assigned to one cluster are
represented by the respective mean cluster mass. In this
study, each sample was analyzed 10 times (see MALDITOF-MS sample preparation). The aligned m/z values of
cluster peaks occurring in one sample and the respective
mean peak intensities are used for further analysis and
denoted sample centroid. To set up the mass spectra
reference database all sample centroids of a species were
combined to species centroids.
Similarity analysis
A hierarchical clustering procedure performed with the
MatLab software (R2013b; the Math-Works Inc., Natick,
MA) (21) was used for both characterization of the similarity relations between the species centroids of the mass
spectra reference database and identification of samples
by finding the species centroid of the data base which
is most similar to the sample centroid. The similarity
between centroids was determined by pairwise comparison. The Jaccard similarity measure was applied to the
similarity of the sample centroids. From the Jaccard similarity coefficients distances were calculated (1-Jaccard
similarity coefficient), which are the percentages of nonzero cluster mass peaks that differ between the sample
centroids (21). The number of clusters to which the two
centroids contributed was counted. By this procedure,
a symmetric matrix of pairwise similarities (peak massbased similarity matrix) was formed. Distance matrices
were calculated from normalized similarity matrices and
dendrograms were calculated on the basis of the distance
matrices by using a complete linkage function.
Classification analysis
A machine learning method was used as an alternative to
similarity analysis in order to better identify Actinomyces
species. Sample centroids were classified using the support
vector machine (SVM) tool implemented in the Bioinformatic toolbox of MatLab (21). The SVM algorithm was
trained with the reference database sample centroids
of bacteria of known identity using a ‘one against one’
approach. To estimate the class prediction a 10-fold crossvalidation error was calculated for the training group.
The training set was first divided into 10 subsets of equal
size. Sequentially, one subset was tested by using the
classifier trained on the remaining nine subsets. Consequently, each probe of the training set was predicted
once. The cross-validation accuracy is the percentage of
data which were correctly classified (15).
Results and discussion
Many scientific and clinical investigations have been
hampered by problems in the identification of Actinomyces
species. The laboratory growth of these organisms is
challenging, so identification of Actinomyces species is
often based on histopathology and biopsy material. This
has led to an empirical treatment rather than a true
diagnosis of actinomycotic infections. Therefore, efficient,
reliable, and rapid methods for the identification of
Actinomyces at the species level would be of considerable
clinical value.
The sequence analysis of the 16S rRNA gene of all
references strains confirmed their previous identification.
One hundred and forty clinical strains were identified as
Actinomyces species by sequence analysis of 16S rRNA
genes showing percent identities of at least 99% in both
the NCBI BLAST and the HOMD Blast. The sample
centroids calculated from the MALDI-TOF-MS spectra
obtained from the reference strains and 100 confirmed
Actinomyces were used to create the Actinomyces mass
spectra reference database (Table 1). The other 40
well-identified clinical strains (20 A. naeslundii and 20
A. oris) were used as a test group. For each Actinomyces
species of the reference database a species centroid was
calculated from all sample centroids available from
strains of this species. The species centroids were used
for quality assessment of the reference database and for
identification of unknown clinical samples. Actinomyces
johnsonii, formerly known as A. naeslundii serotype WVA
963, with only four entries proved to be very similar with
A. naeslundii strains. That was the reason for pooling
these two species in one group when we used the database
to identify the unknown clinical strains.
Table 1. Species of Actinomyces which were included in the
reference database
Species
Actinomyces dentalis
Actinomyces gerencseriae
No. of strains
6
15
Actinomyes georgiae
2
Actinomyces graevenitzii
1
Actinomyces urogenitalis
Actinomyces europaeus
1
1
Actinomyces israelii
Actinomyces meyeri/odontolyticus
Actinomyces oris
Actinomyces radicidentis
Actinomyces timonensis
15
6
20
1
4
Actinomyces naeslundii/johnsonii
24
Actinomyces neuii
Actinomyces massiliensis
3
11
Actinomyces viscosus
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1
3
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22
Catalina S. Stingu et al.
Fig. 1. Phenotypic relation between the species centroids of the Actinomyces reference database. The dendrogram was generated
by similarity analysis. 1. A. dentalis, 2. A. gerencseriae, 3. A. georgiae, 4. A. graevenitzii, 5. A. urogenitalis, 6. A. europaeus, 7. A.
israelii, 8. A. meyeri/odontolyticus, 9. A. oris, 10. A. radicidentis, 11. A. timonensis, 12. A. naeslundii/johnsonii, 13. A. neuii, 14. A.
massiliensis, 15. S. sanguinis.
Already a visual inspection of the species centroids of
different Actinomyces species reveals both similarities and
differences. The results of a computational similarity
analysis are shown in Fig. 1. The dendrogram consists of
three significantly different main branches of Actinomyces.
Remarkably, the one represented by A. graevenitzii and
Actinomyces urogenitalis is more dissimilar to the other
Actinomyces than is Streptococcus sanguinis, which was
included as an external reference. With only one reference
spectrum created, one could wonder if the strains are good
representatives for these species. The species within each
main branch show different degrees of similarity. However,
the differences between them are not large enough to allow
a reliable differentiation. This is mainly caused by the
Fig. 2. Similarity of the test group of 20 A. naeslundii strains on the x-axis with the centroids of the Actinomyces reference
database on the y-axis. Black indicates identity while white indicates maximum dissimilarity. 1. A. dentalis, 2. A. gerencseriae,
3. A. georgiae, 4. A. graevenitzii, 5. A. urogenitalis, 6. A. europaeus, 7. A. israelii, 8. A. meyeri/odontolyticus, 9. A. oris, 10.
A. radicidentis, 11. A. timonensis, 12. A. naeslundii/johnsonii, 13. A. neuii, 14. A. massiliensis.
4
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23
Identification of oral Actinomyces with MALDI-TOF-MS
inhomogeneity of the sample centroids of each species
due to biological variation of strains and in some cases
also due to a small number of samples contributing to the
respective species. Both effects hamper the species identification of unknown samples by similarity analysis. For
illustration, the results of a similarity analysis of a test
group of 20 confirmed A. naeslundii samples are shown
in Fig. 2. The sample centroids of each sample were
compared pairwise with the species centroids of the reference database. Black indicates identity, whereas white
indicates maximum dissimilarity. For a reliable species
identification, each sample should reveal a high degree
of similarity to the reference database species centroid of
A. naeslundii and much less similarity to all other species
centroids. As can be seen, this is true only for some
samples, for example, S1309, whereas other samples show
comparable similarities to different species centroids, for
example, S1397.
Therefore, classification based on a SVM algorithm was
applied as an alternative approach for differentiation and
identification of Actinomyces at the species level. A crossvalidation of the reference database represented by the
sample centroids of the 14 Actinomyces species yielded
correct results (accuracy ! 100%) for all species which
were represented by more than two strains in the database.
This provides a sound basis for an assignment of unknown
Actinomyces strains to those species which are represented
in the reference database by a sufficient number of
different strains to reflect the biological heterogeneity
within a species. Identification results pointing to species
which are represented by less than 10 samples (A. georgiae,
A. radicidentis, A. urogenitalis, Actinomyces europaeus,
A. neuii, and A. graevenitzii) may be correct but have to
be interpreted with caution and should be verified by 16S
Table 2. Identification of unknown Actinomyces species
using classification by pattern recognition
Bacterial strains
No. of clinical strains
Actinomyces dentalis
44
Actinomyces gerencseriae
58
Actinomyces georgiae
16
Actinomyces graevenitzii
1
Actinomyces urogenitalis
17
Actinomyces europaeus
0
Actinomyces israelii
57
Actinomyces meyeri/odontolyticus
Actinomyces oris
8
58
Actinomyces radicidentis
Actinomyces timonensis
Actinomyces naeslundii/johnsonii
Actinomyces neuii
Actinomyces massiliensis
0
7
291
3
14
rRNA sequencing. The performance of the classification
analysis was tested by two test groups of 20 samples each
of confirmed A. naeslundii and A. oris. All of them were
correctly identified (correct rate !100%, sensitivity !1,
specificity !1). Taken into account that A. oris, formerly
known as A. naeslundii genotype 2, is closely related to
A. naeslundii, this result is encouraging.
The results of the identification of the unknown
clinical samples by classification analysis are given in
Table 2.
The quality and reliability of the identification depends
on the quality and the amount of reference spectra present in the database (22). A higher number of entries for
the same species will better reflect the diversity within
the species. Although obvious differences between spectra
were observed, only tentative identification can be made
for the species which were not very well represented in
our collection: A. georgiae, A. radicidentis, A. urogenitalis,
A. europaeus, A. neuii, and A. graevenitzii.
Conclusions
Our results suggest that a combination of MALDI-TOFMS with powerful classification algorithms, such as
SVMs, provide a useful tool for the differentiation and
identification of oral Actinomyces, provided that the
database contains enough entries for one species to reflect
biological intra-species heterogeneity.
Acknowledgements
The authors appreciate the laboratory work of Angela Pöschel and
Annett Hennig-Rolle.
Conflict of interest and finding
The authors declare no conflict of interest in this study.
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25
4. Zusammenfassung
Publikationspromotion zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. dent.
Titel:
Schnelle Identifizierung von oralen Actinomyces-Arten des
subgingivalen Biofilms mittels MALDI-TOF-MS
eingereicht von:
Toralf Harald Borgmann
geboren am 14.04.1988 in Dresden
angefertigt am:
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der
Universität Leipzig und Institut für Biochemie der Medizinischen
Fakultät der Universität Leipzig
betreut von:
Prof. Dr. med. Arne C. Rodloff
OÄ Dr. medic. Catalina-Suzana Stingu
Prof. Dr. Klaus Eschrich
16. Juni 2015
26
Die Studie zielte darauf ab, einen eigenen Klassifikationsalgorithmus für die Identifikation
oraler Aktinomyzeten zu entwickeln und diesen zu evaluieren.
In diesem Rahmen wurden 11 verschiedene Referenzstämme (Actinomyces dentalis
(DSM 19115), Actinomyces georgiae (DSM 6843), Actinomyces gerencseriae (ATCC
23860), Actinomyces graevenitzii (DSM 15540), Actinomyces neuii (DSM 8576),
Actinomyces odontolyticus (DSM 43331), Actinomyces radicidentis (DSM 15433),
Actinomyces viscosus (DSM 43798), Actinomyces naeslundii (DSM 17233), Actinomyces
oris (DSM 23056), Actinomyces israelii (ATCC 12107) und 674 klinische Stämme
untersucht, die aus dem subgingivalen Biofilm parodontal erkrankter Patienten isoliert
wurden. Alle Stämme wurden mittels Koloniemorphologie, Pigmentierung, Gramfärbung,
Katalase- und CAMP-Test und Rapid API 32 A vorläufig identifiziert, um Fremdstämme von
der Untersuchung auszuschließen. Der Genotyp der Referenzstämme und von 232
klinischen Isolaten wurde durch Sequenzierung der 16S rDNA bestimmt. Die
Sequenzierung bestätigte die Identifizierung der Referenzstämme. Die 16S rDNA
Sequenzen von 140 klinischen Stämmen wiesen sowohl in der Human Oral Microbiome
Database (HOMD) als spezielle Datenbank für Bakterien aus dem oralen Milieu als auch
in der wesentlich bekannteren Datenbank des National Center for Biotechnology
Information (NCBI) als Referenzgendatenbanken eine Ähnlichkeit von mindestens 99,9 %
auf. Die Referenzstämme und 100 zweifelsfrei durch DNA-Sequenzierung identifizierte,
klinisch gewonnene Aktinomyzeten wurden verwendet, um eine Maldi-TOFMassenspektren-Datenbank zu erstellen. Weitere 40 sicher identifizierte Aktinomyzetenisolate wurden verwendet, um eine Kontrollgruppe zu bilden. Diese bestand aus 20
Actinomyces naeslundii und 20 Actinomyces oris Stämmen. Die Stämme wurden unter
anaeroben Bedingungen bei 37 ℃ für 4 Tage auf Columbia-Blutagar kultiviert und dem
Protokoll von Friedrichs et al. (2007) folgend für die MALDI-TOF-MS-Analyse vorbereitet.
Mit einem Bruker Autoflex II (Bruker Daltonics) wurden zehn Spots pro Bakterienstamm im
Doppelansatz gemessen und mit der Flexanalysis 2.4 Software ausgelesen. Vor jeder
Messung wurde das Gerät mit einem E. coli Standard (DH 5 alpha) kalibriert. In jedem
Spektrum wurden maximal 60 Peaks identifiziert. Die Peakauswahl verlief automatisch,
wurde jedoch manuell kontrolliert. Die ermittelten Peaks mit ihren Intensitäten und m/zWerten wurden in Exceltabellen exportiert. Für jede Spezies wurden ausgehend von den
gemessenen MALDI-TOF-MS-Daten speziesspezifische Zentroide gebildet, die sich aus
den Zentroiden der Referenzstämme und klinischen Stämme der jeweiligen Spezies
zusammensetzen.
27
Diese Zentroide wurden im weiteren Verlauf verwendet, um die Datenbank qualitativ zu
überprüfen und die unbekannten Bakterienspezies zu identifizieren. Actinomyces
odontolyticus und Actinomyces meyeri wurden ebenso wie Actinomyces naeslundii und
Actinomyces johnsonii aufgrund zu starker Ähnlichkeit in jeweils eine Gruppe innerhalb der
Datenbank zusammengefasst. Eine Kreuzvalidierung der aus 14 unterschiedlichen
Aktinomyzetenspezies bestehenden Datenbank ergab korrekte Ergebnisse für alle
Spezies, die mehr als zwei Vertreter innerhalb der Datenbank besaßen. Die Auswertung
mittels Ähnlichkeitsanalysen auf Grundlage eines hierarchischen Clusterverfahrens wurde
sowohl für die Erstellung der Verwandtschaftsbeziehungen der Spektren der
Referenzdatenbank als auch für die Identifizierung von Spektren unbekannter Proben
verwendet. Dabei wurden die Zentroide der Referenzstämme paarweise mit den Spektren
der unbekannten Stämme verglichen und ermittelt, zu welchen sie die meiste Ähnlichkeit
aufweisen. Diese Methode war geeignet für die Erstellung eines Dendrogramms,
ausgehend von speziesspezifischen Zentroiden der Referenzdatenbank, zeigte jedoch
erhebliche Schwächen bei der Identifizierung der Isolate der Kontrollgruppe. Deshalb
wurde für die endgültige Identifizierung ein Klassifikator aus dem Gebiet des maschinellen
Lernens eingesetzt, eine sogenannte „support vector machine“ (SVM). Die Kontrollgruppe
wurde zu 100 % richtig identifiziert. Die Sensitivität und Spezifität der „support vector
machine“ lag damit bei 1. Besonders erfreulich ist die Tatsache, dass es sich bei der
Kontrollgruppe um Stämme der Spezies Actinomyces naeslundii und Actinomyces oris
handelt, welche eine große Verwandtschaft aufweisen und vormals nur durch die
Sequenzierung von Housekeeping-Genen unterschieden werden konnten (44). Um eine
verlässliche Identifikation der oralen Aktinomyzeten zu ermöglichen, muss sich deren
Heterogenität in der Referenzdatenbank widerspiegeln. Dazu sollten pro Spezies fünf bis
zehn Vertreter in den Zentroidcluster der Referenzdatenbank aufgenommen werden.
Die Ergebnisse für Aktinomyzetenspezies, die nur mit wenigen Stämmen in der Datenbank
vertreten sind (Actinomyces georgiae, Actinomyces radicidentis, Actinomyces urogenitalis,
Actinomyces europaeus, Actinomyces neuii und Actinomyces graevenitzii) sollten
zurückhaltend interpretiert werden und gegebenenfalls mittels 16S rDNA Sequenzierung
überprüft werden. Die 16S rDNA Sequenzierung hat für einen Fall eine Übereinstimmung
mit einer bisher nicht identifizierten Aktinomyzetenspezies gezeigt. Dieses Isolat kann nun
weitergehenden Analysen unterzogen werden und eventuell zur Beschreibung einer neuen
Actinomyces Spezies dienen.
28
Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination aus der Datenerhebung mittels MALDITOF-MS und deren Verarbeitung durch SVM-Algorithmen eine gute Möglichkeit für die
Identifikation und Differenzierung oraler Aktinomyzeten darstellt.
29
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112.Bishop CM. Pattern Recognition and Machine Learning. Springer-Verlag; 2006.
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2008.2008337.
38
6. Anlagen
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige
Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich
versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwertige Leistungen
für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion
oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und
von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder
auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere
wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit
beteiligt waren.
16.06.2015
Datum
Unterschrift
39
Lebenslauf
Toralf Harald Borgmann
geboren am: 14.04.1988 in Dresden
Familienstand: ledig, keine Kinder
Schulische Ausbildung & Studium
seit Oktober 2014
Vorbereitungsassistent in oralchirurgischer Praxis Fr. Essig in
Delitzsch
September 2013
Vorbereitungsassistent in Gemeinschaftspraxis Dr. Schneider
bis August 2014
in Elsterwerda
November 2012
ganztägige Forschung und Bearbeitung der am 26.10.2011
bis August 2013
begonnenen Dissertation am Institut für Mikrobiologie
und Infektionsepidemiologie Leipzig und am Institut für
Biochemie in Leipzig
seit 26.10. 2011
Dissertation am Institut für Mikrobiologie und
Infektionsepidemiologie mit dem Arbeitsthema „Untersuchung
mittels MALDI-TOF-MS, PFGE und Nachweis von Resistenzen
bei oralen Actinomyceten“
Oktober 2007
Zahnmedizinstudium an der Universität Leipzig mit
bis Oktober 2012
bestandenem Staatsexamen vom 01.10.2012 und Verleihung
der Approbationsurkunde als Zahnarzt vom 17.10.2012
Juni 2007
einwöchige Famulatur in der Mund-, Kiefer-,
bis September 2007
Gesichtschirurgischen Praxis Dr. Dr. Reichert und
Praktikum im Dentallabor André und May in Radebeul
Oktober 2006
Zivildienst in der Notfallaufnahme an den Elblandkliniken
bis Mai 2007
Standort Radebeul
40
1998 - 2006
Gymnasium Luisenstift in Radebeul mit Abschluss der
Allgemeinen Hochschulreife
1994 - 1998
Grundschule Am Waldpark in Radebeul
Leipzig, den 16.06.2015
41
Danksagung
Zunächst möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Arne C. Rodloff, Direktor des Institutes für
Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig, für die
jederzeit gewährte Unterstützung danken.
Ich möchte mich darüber hinaus herzlich bei Frau Dr. Catalina-Suzana Stingu für die
Bereitstellung der Thematik der Arbeit und die stets vorhandene Hilfsbereitschaft bei
praktischen und theoretischen Fragen bei der gesamten Dissertationsschrift bedanken.
Ebenso gilt mein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. Klaus Eschrich, der diese Arbeit mit viel
Zeit- und Energieeinsatz begleitete und immer ein offenes Ohr für meine Fragen und
Probleme hatte.
Auch Herrn Dr. Jochen Frenzel gilt mein Dank für die praktische Unterstützung der
massenspektrometrischen Versuche.
Vielen Dank an Frau Andrea Böhme aus dem Institut für Biochemie der Universität
Leipzig, die mich bis zuletzt mit viel Einsatz bei der Bakterienidentifizierung unterstützte.
Des Weiteren möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für Mikrobiologie und
des Institutes für Biochemie für die dauerhafte und immer freundliche Unterstützung
bedanken. Mein Dank gilt daher Frau Annett Hennig-Rolle und Frau Angela Pöschel, die
ebenso einen großen Anteil zu meiner Arbeit beigetragen haben.
Am meisten möchte ich jedoch meinen Eltern danken, die mir durch ihre Unterstützung
den Rückhalt zur Durchführung dieser Arbeit gegeben haben.
42

Was No. 10 und 11, nämlich die zwei Zamiae betrifft, so kann ich

Die Ausbreitungsgeschichte von Linaria cymbalaria: oder wie

Sepp Puwein-Borkowski, BSc Convenient Identification - E-Day

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