Zellen von den adulten F

Evaluation des QuikQuant™ und Fetal Cell Count™ Kit zum Nachweis
fetaler Hämoglobin F-exprimierender Erythrozyten im peripheren Blut
1. Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit ist die Evaluation eines Testkits zur quantitativen, flowzytometrischen Bestimmung von Hämoglobin F (HbF)-Zellen im peripheren
Blut. Der Übertritt von fetalen Erythrozyten in den Blutkreislauf der Mutter, aufgrund eines Traumas oder durch spontane, rezidivierende Blutungen
bezeichnet man als fetomaternale Blutung (FMH). Dabei handelt es sich um eine Notfallsituation und stellt somit die Hauptindikation für den Nachweis
fetaler HbF-Zellen im mütterlichen Blut dar.
Die adulten HbF-Zellen, F-Zellen genannt, können in gewissen Situationen physiologisch erhöht sein. Solche adulte F-Zellen müssen jedoch von fetalen
HbF-Zellen klar unterschieden werden können. Wenn eine werdende Mutter mit erhöhten adulten F-Zellen ein Trauma erleidet, darf man nicht
fälschlicherweise auf eine FMH schliessen oder eine solche verpassen durch das Verwechseln der beiden Erythrozyten-Subpopulationen.
Die Auswertung zeigt, dass die beiden Testkits gut miteinander korrelieren, aber der QuikQuant™ bessere Resultate gegenüber dem Fetal Cell Count™
Kit aufweist.
2. Einleitung
Zur FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) Analyse werden mithilfe verschiedener, spezifischer Fluorochrom-markierten Antikörper
membranständige, wie auch zytoplasmatische und nukleäre Antigene der Zellen markiert und zusammen mit den Streulichteigenschaften der Zellen die
verschiedenen Zellpopulationen typisiert. Flowzytometrische Tests weisen eine hohe Sensitivität und Spezifität auf und die Resultate sind innert kürzester
Zeit verfügbar, weshalb sie sich auch zum Nachweis der fetalen HbF-Zellen eignen. Bei der FMH besteht die Gefahr eines massiven und möglicherweise
tödlichen Blutverlustes des Feten, weshalb der schnelle und exakte Nachweis der fetalen HbF-Zellen zwingend notwendig ist. [1]
Bei manchen Hämoglobinopathien kommt es durch die Verschiebung der Hb-Varianten zu einer kompensatorisch erhöhten HbF-Produktion. Auch ein
erythropoetischer Stress kann einen stimulierenden Einfluss auf die HbF-Synthese haben. In diesen Fällen wird jedoch adultes HbF gebildet. Diese FZellen unterscheiden sich von den fetalen HbF-Zellen durch ihre geringere HbF-Konzentration und ihrer Grösse. Fetale HbF-Zellen sind 22 % grösser als
die adulten F-Zellen und weisen eine wesentlich höhere HbF-Konzentration auf. [2]
3. Ziele und Fragestellungen
4. Material, Methodik, Vorgehen
Bei den nachfolgenden Kapiteln wird nur auf den in Zukunft
eingesetzten QuikQuant™ Testkit eingegangen.
Alle Testdurchführungen dieser Arbeit wurden mit Ethylendiamintetraacetat
(EDTA)-Blutproben aus dem Kantonsspital Aarau durchgeführt.
Bei der Sensitivitätsstudie werden von 6 unterschiedlichen Konzentrationen
Doppelmessungen mit 200’000 Events pro Messung akquiriert. Die Resultate der
1. Messung sind im Kapitel 5. Ergebnisse aufgeführt.
Für die Präzision von Tag zu Tag wurde das Level 2 „Low“ der FETALtrolKontrollen an 11 verschiedenen Tagen gemessen. Es war nicht möglich die
Kontrollen jeden Tag hintereinander zu messen.
Bei der Präzision in Serie wird von einem Ansatz des Level 2 so oft es geht
nacheinander 200‘000 Events aufgenommen.
Für einen Referenzbereich zu erstellen, werden Blutproben von 20 gesunden,
schwangeren Patientinnen zwischen der 18. bis 38. Schwangerschaftswoche
akquiriert. Ob die fetalen HbF-Zellen von den adulten F-Zellen unterschieden
werden können, wird mit der Messung einer gemischten Blutprobe von 3 % fetalen
HbF-Zellen mit 2,4 % adulten F-Zellen getestet.
1. Sind die beiden Tests bezüglich analytischer Sensitivität und
Präzision vergleichbar?
2. Kann man mit beiden Tests sicher zwischen adulten und fetalen
HbF-Zellen bei Patientinnen mit erhöhten HbF-Werten (z.B.
Thalassämie-Patientinnen) unterscheiden?
5. Ergebnisse
5.1 Sensitivitätsstudie:
In der nebenstehenden Abbildung
sind die Resultate der Sensitivität
anhand der Regression und
Korrelation nach der PearsonMethode ersichtlich, welche
folgende Resultate ergeben:
Achsenabschnitt a: –0,003
Steigung b: 1,019
Korrelationskoeffizienten r: 0,995
Die Regressionsgerade ist rot
dargestellt und die Identitätsgerade
schwarz.
Abb. 5.1 Sensitivitätsstudie Messung Nr. 1
5.4 Gesunde, schwangere
Patientinnen:
Bei allen 20 Blutproben der
gesunden, schwangeren
Patientinnen von KSA 01-20
wurden 0,00 % fetale HbFZellen nachgewiesen.
5.2 Präzision von Tag zu Tag:
Der Mittelwert (MW) beträgt
0,15. Die Standardabweichung
beträgt für das Level 2 „Low“
0,013 % und der
Variationskoeffizienten (VK)
liegt bei 8,33 %.
5.3 Präzision in Serie:
Level 2 „Low“: Der MW beträgt 0,15,
die Standardabweichung 0,005 %
und der VK 3,28 %.
Level 3 „High“: Der MW weist 1,54,
die Standardabweichung 0,029 %
und der VK 1,88 % auf.
5.5 Unterscheidung der fetalen HbFZellen von den adulten F-Zellen:
Das analysierte, links abgebildete Dotplot
ergibt folgende Resultate:
Pink dargestellt:
fetale HbF-Zellen: 2,25 %
Orange dargestellt:
adulte F-Zellen: 2,41 %
Rot erscheinen die adulten Erythrozyten
ohne HbF.
Abb. 5.5 Analysiertes Dotplot PI vs. HbF
6. Diskussion
1. Die beiden Testkits korrelieren bei der Sensitivität mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,995 sehr gut miteinander, da er ≥ 0,94 betragen sollte. Die
Steigung beträgt mit 1,019 sehr dem Idealwert von 1. Der y-Achsenabschnitt ist mit –0,003 sehr gut, da er ideal 0 beträgt. Die Präzision von Tag zu
Tag beim QuikQuant™ ist mit einem MW von 0,15, einer Standardabweichung von 0,013 % und einem VK von 8.33 % zufriedenstellend. Auch die
Präzision in Serie vom Level 2 „Low“ mit einem MW von 0,15, einer Standardabweichung von 0,005 % und einem VK von 3,28 % ist in Ordnung.
2. Eine gemischte Blutprobe aus 3 % fetalen HbF-Zellen mit 2,4 % adulten F-Zellen wurde gemessen. Die daraus analysierten Werte von 2,25 % für die
fetalen HbF-Zellen und die 2,41 % für die adulten F-Zellen sind sehr gut.
Ein Referenzbereich für den zukünftigen Einsatz des QuikQuant™ Testkits muss noch erstellt werden.
Quellenverzeichnis: [1] De Wall, S., Glaubitz, M., 2000: S. 66 [2] Lloyd-Evans et al., 1999: S. 155
Abbildungsverzeichnis: Abb. 5.1 Leuenberger, L (2014) Sensitivitätsstudie Messung Nr. 1 Roggwil, eigene Abbildung Abb. 5.5 Leuenberger, L (2014) Analysiertes Dotplot PI vs. HbF Roggwil, eigene Abbildung
Hintergrundbild: Blutspende SRK Schweiz [28.08.2014] Wärmeverteilung http://www.blutspende.ch/de/blutspende/wissen_und_blut/die_aufgaben_des_blutes/waermeverteilung
Larissa Leuenberger, BMA 11-14, Praktikumsbetrieb: FACS/Stammzell-Labor, Kantonsspital Aarau AG

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