FIXIERUNG DER PROBEN Frische Proben können fixiert werden

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© Core Facility Cell Imaging and Ultrastructure Research | University of Vienna, Austria | www.univie.ac.at/cius
Verschiedene Techniken
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sind notwendig, um unsere Objekte
für die Mikroskopie zu präparieren.
EINBETTUNG DER PROBEN
Bevor Schnitte für das Transmissions-Elektronenmikroskop
(TEM) hergestellt werden können, müssen die Proben
entwässert und in Kunstharz eingebettet werden.
ULTRAMIKROTOMIE
© Norbert Cyran
Ultradünne Schnitte von 50 – 100 nm Schnittdicke sind notwendig, um ein Bild davon im TEM zu erzeugen. Sie
werden an einem Ultramikrotom mit
Glas- oder Diamantmessern in regelmäßiger Abfolge geschnitten. Bei der Cryo-Ultramikrotomie werden die Proben
tiefgefroren und mit trockenem Messer geschnitten.
Färbung
University of Vienna, Austria | www.univie.ac.at/cius
Gefrierfixierung
Gefrierschneiden
Gefrierbruch
Gefriertrocknung
Chemische
Fixierung
Gefriersubstitution
Gefriertrocknung/
Dehydrierung
Lufttrocknung
Dehydrierung
HarzEinbettung
Schneiden
Bedampfung
Färbung/
Kontrastierung
Bedampfung
Färbung/
Kontrastierung
Bedampfung
BILD UND ANALYSE IN LICHT- UND ELEKTRONENMIKROSKOPIE (CORRELATIVE MICROSCOPY)
GEFRIER-FIXIERUNG
Alternativ zu chemischer Fixierung können Proben bei
-180°C kryofixiert werden. Dazu wird Gewebe entweder in
flüssiges Propan getaucht (Plunge Freezing) oder es wird
flüssiger Stickstoff mit möglichst hohem Druck auf die Probe geschossen (High Pressure Freezing). Je schneller die
Probe einfriert, desto geringer ist die Gefahr, dass sich störende Eiskristalle im Gewebe bilden.
GEFRIER-SUBSTITUTION
In den tiefgefrorenen Proben wird das vitrifizierte Wasser
durch Aceton ausgetauscht (Cryo-Substitution). Dadurch
bilden sich auch während des Auftauens keine störenden Eiskristalle.
Die substituierten Proben können für die weitere Bearbeitung im Elektronenmikroskop in
Harz eingebettet oder für Analysen im
Lichtmikroskop aus dem Aceton in
Wasser überführt werden.
Präparationsmethoden für
Licht- und Elektronenmikroskopie
© Norbert Cyran
Besonders in der Elektronenmikroskopie ist die Trocknung
der Proben von großer Wichtigkeit, da der Elektronenstrahl
nur im Hochvakuum auf die Proben beschleunigt werden
kann und das Wasser dabei im Mikroskop verdampfen
würde. Eine sehr gute Strukturerhaltung erzielt die KritischPunkt-Trocknung, wobei durch Umgehung des Kritischen
Punktes zwischen gasförmiger, fester und flüssiger Phase
Oberflächenspannungen während des Trocknens vermieden werden.
PROBE (LEBENDE ZELLEN)
© Core Facility Cell Imaging and Ultrastructure Research
PRÄPARAT (TOTE ZELLEN)
TROCKNUNG DER PROBEN
Besonders in der Raster-Elektronenmikroskopie, wo Oberflächen abgebildet werden, ist es wichtig, eine leitende
Schicht aufzutragen; sie leitet Elektronen ab und verhindert Aufladung der Proben im Mikroskop. Für beste Auflösung der Bildgebung wird mit Gold beschichtet. Bestmögliche Analyse der Elemente wird durch Kohlebedampfung
erreicht.
© Gregor Eder
Frische Proben können fixiert werden um ihre Struktur und
Elementverteilung bestmöglich zu erhalten.
Für Licht- und Elektronenmikroskopie gibt es mehrere Möglichkeiten. Die Standardmethode ist die chemische Fixierung. Dabei haben sich Aldehyde (wie Paraformaldehyd
und Glutaraldehyd) in unterschiedlichen Kombinationen
und Konzentrationen als am wirkungsvollsten erwiesen.
Die chemische Fixierung geht aber langsam vor sich und
lässt den Zellen Zeit zu Veränderungen. Daher hat sich in
neuerer Zeit eine weitere Methode etabliert, die Gefrierfixierung.
BESCHICHTUNG VON PROBEN
PRÄPARAT (LEBENDE ZELLEN)
FIXIERUNG DER PROBEN

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