Trennmechanismen (LC)

Trennmechanismen (LC)
1. Wechselwirkungschromatographie
•
Adsorption, Verteilung
•
Basis: zwischenmolekulare Wechselwirkungen (WW)
a) Normalphasenchromatographie (NP)
normal phase
•
•
•
Stationäre Phase (SP) ist polarer als mobile Phase (MP)
SP: Kieselgel, Al2O3 (hydrophile Oberfläche)
chemisch gebundene polare Phase
MP: unpolares LM (z.B. Hexan)
Retention:
tR ~ polarer Wechselwirkung zwischen Analyt und SP
tR ~ 1/Polarität der MP
b) Umkehrphasenchromatographie (RP)
(Reversed phase)
•
•
•
Stationäre Phase unpolarer als mobile Phase
SP: oberflächenmodifizierte Kieselgele (hydrophobe
Oberfläche, z.B. C8, C18), Polymere
MP: polare LM (z.B. H2O, CH3OH, CH3CN)
Retention:
tR ~ hydrophobe WW zwischen Analyt undSP
tR ~ Polarität der mob. Phase
c) Affinitätschromatographie
Biospezifische Wechselwirkung
•
selektive (elektrostatische und sterische) WW zwischen
immobilisierten Molekülen und Biopolymeren
z.B. Ligand, Cofaktor mit Protein
Antigen-Antikörper
Enzym mit Substrat, Inhibitor
•
Trennung einzelner Substanzen oder Substanzklassen
Trennmechanismen (LC)
2. Ionenaustauschchromatographie (IEC)
(Ion exchange chromatography)
•
•
•
Trennung gleichsinnig geladener Ionen
elektrostatische Wechselwirkung entgegengesetzt
geladener Ionen
SP: Anionen-oder Kationenaustauscher
(unlösliche Matrix mit geladenen Gruppen)
MP: wässrige Pufferlösung (Eluentionen erforderlich)
Zusatz organischer Lösungsmittel
Retention
tR ~ Ladung und Polarisierbarkeit der Analyten
tR ~ Austauschkapazität der SP
tR ~ 1/Pufferkonzentration in MP
3. (Sterische) Ausschlusschromatographie (SEC)
size exclusion chromatography
(Gelchromatographie, Gelpermeationschromatographie)
•
•
•
•
sterischer Ausschluss (Molekülgröße, keine WW)
Trennung nach Zugänglichkeit eines Porensystems
SP: hochporöse Kieselgele, Polymere, Dextrangele
MP: wässriger Eluent: Gelfiltrationschromatographie
organischer Eluent: Gelpermeationschromatographie
Eluent beeinflusst die Trennung nicht
Elution nach abnehmender Molekülgröße
Zwischenmolekulare Wechselwirkungen
Definition:
Anziehungskräfte zwischen valenzmäßig abgesättigten
Molekülen (Van der Waalsche Kräfte):
•
von wesentlich geringerer Energie als chemische Bindung
(Eww < 25 kJ/mol, ECB >400 kJ/mol)
•
stark entfernungsabhängig
(EWW ~ 1/r6 mit r = Abstand)
Retention wird vorrangig durch die Stärke der (reversiblen)
Anziehung zwischen Analyt und stat. Phase bestimmt
Struktur und Eigenschaften der Moleküle
1. Polare Moleküle
•
Moleküle mit permanentem elektrischem Dipolmoment :
Verbindungen mit Heteroatomen und funktionellen Gruppen
(unsymmetrische Ladungsverteilung)
z.B. R-CHO R-CN
R-OH
R-NO2
:
2,5
3,4
1,7
(R= Me, Et)
R1-O-R2
3,5
1,2
2. Polarisierbare Moleküle
•
unpolare (dipollose Moleküle), in denen durch ein
elektrisches Feld (oder benachbarte polare Moleküle) ein
Dipolmoment induziert werden kann
z.B. Doppelbindungen, aromatische Ringe
3. Unpolare Moleküle
•
kein Dipolmoment induzierbar
Zwischenmolekulare Wechselwirkungen
Dispersions-WW (Londonkräfte)
•
sehr schwache, ungerichtete (unspezifische) Kräfte
zwischen allen Atomen und Molekülen
auch wenn kein Dipolmoment vorhanden ist
Modell der fluktuierenden Dipole
Induktions-WW (Dipol-induzierter Dipol)
•
permanente gerichtete Anziehung zwischen polaren
(permanenter Dipol) und polarisierbaren Molekülen
Dipol-WW (Dipol-Dipol)
•
gerichtete Anziehung zwischen Molekülen mit permanentem
Dipolmoment
•
Wasserstoffbrücke:
X–HCCCY
X
Y
Protonendonator (–OH, –NH)
Protonenakzeptor (Elektronendonator)
Wechselwirkungschromatographie
(Adsorptionschromatographie)
Vor der Analyse
•
Säule mit mobiler Phase spülen (konditioniert)
•
Oberfläche der stationären Phase ist vollständig mit
Molekülen der mobilen Phase (Solvens S) bedeckt
Analyse
•
Dosieren der Probe (eine Substanz X)
•
Ein geringer Teil der Solvensmoleküle wird temporär durch
Analytmoleküle X verdrängt
K X wird adsorbiert
•
Wenn Analytmolekül diesen Oberflächenplatz verlässt, wird
die entstandene Lücke durch nachrückendes Solvens
ausgefüllt.
•
Konkurrierende reversible Wechselwirkungen der Analytund Solvensmoleküle mit Oberfläche der stationären Phase
Sa + X
W
Xa + S (a = adsorbiertes Molekül)
Normalphasen-Chromatographie
Stationäre Phase: polar
•
Adsorptionsvermögen ergibt sich aus der Art und Anzahl
der aktiven Zentren (“Adsorptionsplätze”)
•
SiO2, Al2O3, SiO2-(CH2)n-NH2, SiO2-(CH2)n-CN
Mobile Phase: unpolar
•
organisches Lösungsmittel (LM) oder LM-Gemisch
•
Heptan, Hexan, Cyclohexan, Chloroform, Dichlormethan,
Dioxan, Methanol
•
Wassergehalt der mobilen Phase:
z.B.: Hexan
0% Wassergehalt (Molekularsieb 4 Å)
100% Wassersättigung
0 bis 100% durch Mischung
Elutionskraft
•
Fähigkeit zur Verdrängung der Analyten von der stationären
Phase
•
strukturabhängig
•
Eluotrope Reihe: Anordnung der Lösungsmittel nach
steigender Fließmittelstärke
n-Pentan<n-Hexan<Cyclohexan<Toluol<Chloroform
<Aceton<Dioxan<Acetonitril<Methanol
Trennung
•
nichtionische unpolare bis mittelpolare Substanzen
•
k’ Werte nehmen in folgender Reihe zu (gleiches M)
gesättigte CH < ungesättigte CH < Aromaten < Ether
< Ester < Aldehyde/Ketone < Alkohole < Amine
•
unterschiedliche starke Wechselwirkungen der Analyten mit
der stationären und mobilen Phase
Wechselwirkungsdreieck
Normalphasen-Chromatographie
Retention nimmt zu mit
•
steigender Polarität der Analyten
•
abnehmender Polarität der mobilen Phase (Elutionskraft,
Fliessmittelstärke)
•
abnehmendem Wassergehalt unpolarer Lösungsmittel
•
Vergrößerung der spezifischen Oberfläche der stat. Phase
Nachteile der klassischen NPC
•
energetisch inhomogene Oberfläche
º gekrümmte Adsorptionsisotherme
º Peaktailing
•
relativ langsame Gleichgewichtseinstellung
•
starke Adsorption polarer Substanzen an aktiven Zentren
º lange Konditionierung bei LM-Wechsel erforderlich
º Gradientenelution erschwert
º Retention wird stark durch polare Zusätze und
Verunreinigung der Eluenten beeinflusst
Anwendungsbeispiel
Stationäre Phase: CN-Phase
Mobile Phase: Cyclohexan-Isopropanol (75:25, V/V)
Phasensysteme für
Wechselwirkungschromatographie
Trennung
•
kommt durch unterschiedliche (selektive) Retention der
Gemischkomponenten zustande, d.h. durch unterschiedliche Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären
und mobilen Phase:
„Wechselwirkungsdreieck“
•
Elution und Auflösung erfordert Balance zwischen
Retentionsvermögen der stat. Phase und Fließmittelstärke
(solvent strength) der mobilen Phase
Stationäre Phase
•
Kieselgele, Aluminiumoxid (hydrophile polare Oberfläche)
•
Kieselgele mit chemisch gebundenen polaren Phasen
•
Kieselgele mit chemisch gebundenen unpolaren
(hydrophoben) Phasen: RP-Phasen (reversed phase)
•
vernetzte Polymere (z.B. Polystyrol-DivinylbenzolCopolymere)
Mobile Phase
•
ein oder mehrere Lösungsmittel (binäre, ternäre oder
quarternäre Lösungsmittelgemische)
•
isokratische Trennung: konstante Zusammensetzung der
mobilen Phase
•
Gradientenelution: Änderung der Zusammensetzung der
mobilen Phase während der Trennung (Erhöhung der
Fließmittelstärke)
Mobile Phase (Elutionsmittel, Fließmittel)
Aufgaben (geforderte Eigenschaften)
•
Lösungsmittel für Probekomponenten
•
Einstellung der Verteilungsgleichgewichte der Probekomponenten zwischen beiden Phasen
•
Benetzung der stationären Phase
•
vollständige Elution aller Probekomponenten von der Säule
Auswahlkriterien
•
Lösungsvermögen für Probekomponenten
•
Elutionskraft (Fließmittelstärke) K eluotrope Reihe
•
Reinheit: Verunreinigungen, Stabilisatoren, Zersetzungsprodukte, mechanische Partikel
unterschiedliche Anforderungen je nach Gradiententechnik,
Detektionsprinzip
•
Inert gegenüber Probe und stationär Phase
•
Mischbarkeit von LM-Gemischen (evtl. Volumenkontraktion)
•
Viskosität (bei LM-Gemischen hängt Gesamtviskosität von
LM-Zusammensetzung ab)
•
Benetzbarkeit der stat. Phase
•
Toxizität
•
Korrosionsbeständigkeit
•
chlorierte Lösungsmittel (HCI), Puffer, Komplexbildner
greifen die Apparatur an
Eluotrope Reihe
Adsorptionschromatographie:
•
Retention der Analyten hängt von der Stärke der Wechselwirkungen mit der stat. und mob. Phase ab („Wechselwirkungsdreieck“)
•
Elutionskraft der Lösungsmittel ist unterschiedlich und wird
von ihrer Struktur bestimmt.
Eluotrope Reihe
•
Anordnung der Lösungsmittel bzw. LM-Gemische nach
steigender Elutionskraft (Fließmittelstärke), ausgedrückt
durch Parameter ,/
•
,/ gilt nur für ein bestimmtes Adsorbens und wird empirisch
ermittelt
•
schwächstes Elutionsmittel: ,/=0
•
mit steigendem ,/ nimmt Elutionskraft zu (Retention ab)
Für Silikagel:
Substanz
Hexan
Toluol
CH2Cl2
<
<
,/
0
0,22
0,3
Substanz
Dioxan
Ethanol
H2O
,/
0,43
0,68
groß
mit wenigen LM bzw. LM-Gemischen lässt sich ein breiter
Retentionsbereich erzielen
in NP-Chromatographie ist ,/ der LM-Polarität proportional
Umrechnung
,/ (Al2O3) . 1,3 ,/ (SiO2)
,/ (SiO2) . 0,8 ,/ (Al2O3)
NP-Säulenmaterialien
Silicagel (Kieselgel); poröses Siliziumoxid
< erste Wahl bei NP-HPLC
< Herstellung:
<
Hydrolyse von Natriumsilikat und weitgehende
Entwässerung bis zum Gel
<
Zermahlen, Korngröße durch Sieben auswählen
•
je nach Behandlung: sauer, neutral oder basisch
Struktur
•
Gerüst aus dreidimensional vernetzten Siloxanketten, die
endständig mit Hydroxylgruppen abgesättigt sind
•
Belegungsgrad: 7-8 :mol/m² „Silanolgruppen“
•
Partikel bestehen aus Verbund unporöser Mikroteilchen
mit einer Hohlraumstruktur (permanente Porosität)
Eigenschaften
•
poröse, harte (druckstabile), hydrophile Materialien quellen
nicht in organischen Lösungsmitteln
•
stabil im pH-Bereich von 1 bis 8
•
Kieselgele nehmen leicht Wasser auf
•
Hydroxylgruppen an Oberfläche besitzen unterschiedliche
Eigenschaften
L freie Silanole: schwach sauer
L geminale und assoziierte Silanolgruppen: nicht sauer
L Silanole neben Metallkationen: stark sauer
Poröse Teilchen als stationäre LC-Phase
Porenstruktur
K
große innere Oberfläche
geschlossene Poren und durchgehende
Kanäle unterschiedlicher Größe
Stagnierende mobile Phase in Poren
in Poren befindliche mobile Phase bewegt sich faktisch nicht,
sie wird nur langsam mit mobiler Phase im Kornzwischenraum
ausgetauscht
Probenmoleküle in Poren
•
werden nicht durch mobile Phase transportiert
•
Ortsveränderung erfolgt nur durch Diffusion zur
<
Phasengrenzfläche
<
strömenden mobilen Phase
K Bandenverbreiterung
1. kurzer Diffusionsweg (~Teilchengröße)
K Verwendung kleiner Teilchen in HPLC
2. große Diffusionsgeschwindigkeit
K mobile Phase mit geringer Viskosität
Ausschlusseffekt
begrenzte Zugänglichkeit des Porensystems für große
Moleküle
K Ausschlusschromatographie
Säulenmaterialien
Chemisch modifiziertes Silicagel
<
OH-Gruppen auf der Oberfläche werden umgesetzt
<
Typische Umsetzungen sind
<
mit Thionylchlorid zu Chloriden
<
Umesterung mit Alkohol (extrem wasserempfindlich)
<
Polymerisation mit gebundenen Siliconölen
<
mit Silanen zu einer Si-O-Si-C-Bindung
Rest R
Bezeichnung
Eigenschaft
Butyl
C4
“schwach” hydrophob
Octyl
C8, RP-8
hydrophob
Octadecyl
C18, RP-18
hydrophob
Propylcyclohexyl
Cyclohexyl
schwach polar
Phenyl
mittelpolar
Propylphenyl
mittelpolar
-(CH2)3-CN
Nitril, Cyano
mittelpolar
Diol
NP oder RP
Amin
schwacher Anionenaustauscher
Carboxyl
schwacher Kationenaustauscher
-(CH2)3-SO2-OH
Sulfonsäure
starker Kationenaustauscher
-(CH2)3-N+(CH3)2
QAE
starker Anionenaustauscher
-(CH2)n-CH(OH)CH2(OH)
-(CH2)3-NH2
-(CH2)3-COOH
Umkehrphasen-Chromatographie I
(RP-Chromatographie)
Stationäre Phase
•
unpolar (hydrophob)
•
meist RP-18 (C18) und RP-8 (C8)
•
Aus sterischen Gründen werden nur 50 % der
Silanolgruppen aus der Kieselgeloberfläche umgesetzt
•
Verbleibende OH-Gruppen werden weitgehend (aber nicht
vollständig!) durch Alkylketten abgeschirmt.
Mobile Phase
•
polar
meist Gemische H2O/org. LM (CH3OH, CH3CN)
H2O= hat geringste Elutionskraft (hohe Retention)
Trennung
•
vorrangig: Unterschiede in hydrophober Wechselwirkung
•
zusätzlich: „sekundäre Wechselwirkungen“ mit polaren
Analyten durch Silanolgruppen und Metallverunreinigungen möglich
K Störungen bei Spurenbestimmung basischer
Verbindungen
Retentionsregeln
Retention steigt mit
•
Zunahme der hydrophoben WW zwischen stationärer
Phase und Analyt
•
Verringerung der WW zwischen Analyt und mob. Phase
<
<
<
hydrophobem Charakter und C-Zahl der Analyten
je unpolarer desto größer ist ihr k-Wert
zunehmender C-Zahl der Alkylketten in stat. Phase
zunehmender Polarität (abnehmender Elutionskraft) der
mobilen Phase
THF < Dioxan < i-Propanol < Methanol < Acetronitril
steigendem Wassergehalt der mobilen Phase
Erhöhung um 10 % führt zur Verdopplung von k
Eluenten in der RP-HPLC
Eluotrope Reihe
Wasser
Methanol
Acetonitril
Ethanol
Dimethylformamid
Tetrahydrofuram
0,0
5,5
7,3
7,6
8,0
8,4
Isokatisch
<
wässrige Gemische mit 1 oder 2 organischen
Lösungsmitteln
Gradient
<
meist lineare Gradienten
<
von 5% bis maximal 95% organischer Anteil
Stärke eines Eluentengemisches
F( Mischung ) = S LM 1 × VLM 1 + S LM 2 × VLM 2
F
Elutionsstärke
SLM eluotropes Equivalent Lösemittel
VLM Volumenanteil Lösemittel
Beispiel:
20% wässriges Methanol
Vernünftige RT aber keine gute Trennung
FMischung = FMethanol + FWasser
FMischung =5,5x0,2 + 0x0,8 = 1,1
für MeCN:
1,1 =Xx7,3 + (1-X)x0
X = 0,151
K 15% CH3CN in Wasser
Gradienten-Elution
Isokratische Elution
•
konstante Zusammensetzung der mobilen Phase während
der Trennung (LM-Gemisch)
•
ungünstig für komplexe Proben mit großen Polaritätsunterschieden der Komponenten
Gradiententechnik
•
programmierte Änderung der Zusammensetzung der
mobilen Phase während der Trennung
•
Zunahme der Elutionskraft durch Erhöhung des Anteils der
Komponente mit größerer Elutionskraft
Anwendung
Trennung von Gemischen mit großen Unterschieden in der
Retention der Komponenten
Variablen
•
Anzahl der Lösungsmittel: binärer, ternärer Gradient
•
Eluentzusammensetzung zu Beginn der Analyse
<
gute Auflösung der ersten Peaks (Fließmittel mit
geringer Stärke)
•
Form des Gradienten
stufenweise, linear oder exponentiell
•
Eluentzusammensetzung am Ende der Analyse zur
Elution der stark retardierten Komponenten
•
Steilheit des Gradienten
•
Kompromiss aus Auflösung und Analysenzeit
Realisierung
•
Niederdruck-Gradientensystem
•
Hochdruck-Gradientensystem

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