Ausarbeitung Biotechnological construction of bacteria using

Ausarbeitung
Biotechnological construction of bacteria using transposon
mutagenesis
Bearbeitung:
Alexander Becker
Betreuer:
Andriy Luzhetskyy
1. Einleitung
Das Thema “Biotechnological construction of bacteria using transposonmutagenesis” soll anhand
zweier Veröffentlichungen erläutert werden. In beiden Arbeiten werden Transposon-Systeme zur
Random Mutagenese von Streptomyceten verwendet.
“In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1”
(Luzhetskyy et al. 2012)
“A transposon-based strategy to identify the regulatory gene network responsible for landomycin
E biosynthesis” (Luzhetskyy et al. 2013)
Natürlich vorkommende Transposons, sind springende genetische Elemente innerhalb eu- und
prokaryotischer Organismen und gehören zur Klasse der „Transposablen Elemente“. Zu dieser Klasse
gehören weiterhin Bakteriophagen und Is-Elemente. Natürliche Transposons bestehen aus einer
Sequenz, die für ein Enzym(Transposase) codiert, welche die Transposition vermittelt. Die
Transposonsequenz ist von spezifischen invertierten Sequenzwiederholungen umrandet, die durch
die Transposase erkannt werden, sodass der eingerahmte Sequenzbereich transponiert wird. Man
unterscheidet zwei Arten der Transposition: „cut and paste“ und „copy and paste“. Der Unterschied
hierbei besteht darin, dass das Transposon beim „copy and paste“-Mechanismus zusätzlich
vervielfältigt wird und beim „cut and paste“-Vorgang lediglich der Locus des Transposons verändert
wird. Die in der Natur vorkommenden Transposons können modifiziert und biotechnologisch nutzbar
gemacht werden. Das Transposon System muss dabei zwei wichtige Elemente enthalten. Ein Gen, das
für eine Transposase codiert und die für die Transposase zugehörigen Inverted Repeats. Zwischen die
Inverted Repeats können beliebige Sequenzen eingebracht werden, die für jedes Experiment
individuell erstellt werden können. So zum Beispiel Resistenzgene, die unter der Kontrolle eines im
Zielorganismus funktionellen Promoters stehen. Die Einbringung des Transposon-Systems kann dabei
über Vektoren via Transformation bzw. Transfektion oder Konjugation erfolgen, abhängig vom
experimentellen Anspruch. Der Vektor kann das gesamte Transposonsystem beinhalten, oder
Transposase und die Inverted Repeats können auf zwei verschiedenen Vektoren lokalisiert sein.
Durch Transposon Systeme können Gene stillgelegt werden, sowie fremde Seqeunzen in einen
Organismus einbgebracht werden. Transposons stellen ein wichtiges Tool der Random Mutagenese
in der Biotechnologie dar. Die bekanntesten Transposon Systeme die Verwendung finden sind
Himar1 und Tn5.
2. Ausarbeitung
In den einleitenden Folien (2-5) werden Transposons charakterisiert und ihre Funktion sowie ihre
Verwendung grob umrissen. Auf eine ausführliche Erläuterung wurde verzichtet, da die Hintergründe
innerhalb des Studienganges ausführlich vermittelt werden. Hauptaugenmerk liegt deshalb im
Rahmen dieses Seminarvortrages auf dem Einsatzgebiet von Transposonsystemen, sowie die Vorteile
die sie im Bereich der Random Mutagenese bieten (Folie 5). Diese sind unter anderem die zufällige
Insertion von DNA in fremde Organismen und das damit verbundene Ausschalten von Genen, bei
einer hohen Sequenzabdeckung. Zusätzlich ermöglichen Transposons den Einbau von funktionellen
Fremdgenen in den Wirtsorganismus, wie Resistenzgene, Promotoren usw. die von LoxP Seiten
eingerahmt sein können für eine spätere Deletion der Fremdgene, insofern es der experimentelle
Vorgang benötigt. Transposons ermöglichen somit die Identifikation bislang unbekannter Gene, die
einen Einfluss auf die Bildung von bestimmten Metaboliten haben, oder das Wachstum des
Organismus beeinflussen. Auf diese Weise kann auch eine direkte Information über die Funktion des
beeinträchtigten Gens abgeleitet werden, was letztendlich auch eine Untersuchung von
Stoffwechselwegen ermöglicht.
Im Anschluss an die einleitenden Folien wird die Anwendung eines Transposon-Systems am Beispiel
des wissenschaftlichen Ausarbeitung: “In vivo random mutagenesis of streptomycetes using
mariner-based transposon Himar1” (Luzhetskyy et al. 2012), erläutert.
Bei den in dieser Arbeit verwendeten Organismen handelt es sich um Vetreter der Gattung der
Streptomyceten, die zur Familie der Aktinomyceten gehören. Die Folien 7 bis 9 sollen einen Überblick
über die Streptomyceten und deren Lebenszyklus liefern und vor allem darlegen, dass
Streptomyceten aufgrund der Produktion von zahlreichen biologisch aktiven Metaboliten (v.a.
Antibiotika) von großem Interesse für die Forschung sind. Der untersuchte Organismus S. coelicolor
ist für die Produktion von Actinorhodin bekannt und soll mittels Transposon-basierter Random
Mutagenese untersucht werden. Die Arbeit soll Aufschluss über Gene liefern, die einen Einfluss auf
die Actinorhodinproduktion und das Wachstum des Organismus nehmen. Das Transposonsystem soll
zusätzlich auf seine Funktionalität geprüft und der Gesamtprozess optimiert werden (Folie 10). Für
die Mutagenese wurde ein Himar1-basierendes Transposonsystem verwendet. Die erfolgreiche
Transposonmutagenese mit Himar1 wurde bereits mehrfach verifiziert. Das System eignet sich vor
allem für GC-reiche Streptomyceten, da es lediglich ein TA-Nukleotid benötigt um eine Transposition
im Zielgenom zu vermitteln (Folie 11). Folie 12 zeigt Beispielhaft den Vektor pHTM. Anhand dieses
Vektors sollen alle funktionellen Einheiten der verwendeten Vektoren erläutert werden. Durch Folie
13 bis 16 soll der molekulare Ablauf der Transposonmutagenese am Beispiel des Vektors pHTM
erläutert werden und die einzelnen Schritte ausführlich dargelegt werden, um die ablaufenden
Prozesse verständlich zu machen und die im Vektor enthaltenen Features im Kontext des
Experimentes gezeigt werden. Zur Bestimmung der Insertionsloci besaßen die verwendeten Plasmide
einen speziellen Origin of Replication und ein Antibiotikaresistenzgen, die beide innerhalb der
transponierten Sequenz liegen. Durch Restriktion der chromosomalen DNA der Mutanten und
anschließender Selbstligation können so neue Vektoren abgeleitet werden, die aus Transposon mit
Ori, Antibiotikaresistenz & bakterieller chromosomaler DNA bestehen. Wird mit den erzeugten
Plasmiden eine Transformation (E. coli TransforMax™ EC100D™ pir-116 electrocompetent cells)
durchgeführt, kann eine Antibiotikaselektion erfolgen. Die Plasmide können anschließend isoliert und
sequenziert werden, um so anhand der chromosomalen DNA-Sequenz, Aussagen über den Ort der
Insertion treffen zu können. Folie 17 erläutert den Prozess, Folie 18 zeigt die bestehenden
Möglichkeiten. Die Ergebnisse des Southern Blots zeigen, dass zum Teil Mehrfachinsertionen
vorliegen (Folie 19). Gewünscht sind allerdings einzelne Insertionen, um eine direkte Beziehung
zwischen Gen, Metabolitproduktion & Wachstum herstellen zu können. Eine Veränderung der
Kultivationsbedingungen konnte die Erzeugung von Einzelnen Transposoninsertionen verbessern (vgl.
Folie19). Die Ergebnisse der Sequenzierung nach Anwendung der Plasmid rescue Methode zeigen
eine zufällige Verteilung der Transposons im Genom der Zielorganismen sowie den Vergleich mit
einer zuvor durchgeführten Transposonmutagenese mit Tn5 in s. coelicolor.
Als zweites Beispiel für die biotechnologische Konstruktion von Bakterien mit Hilfe der
Transposonmutagenese diente die Veröffentlichung: “A transposon-based strategy to identify the
regulatory gene network responsible for landomycin E biosynthesis” (Luzhetskyy et al. 2013).
S. globisporus produziert den Naturstoff Landomycin E (laE). Ziel war die Identifizierung von Genen,
die einen Einfluss auf die Landomycin E Produktion haben und nicht innerhalb des bereits bekannten
Landomycin E-Genclusters liegen. Der erstellte Tn5-Transposonvektor besitzt zudem nach außen
gerichtete Promotoren, sodass nicht nur die Möglichkeit für einen funktionellen Knockout besteht,
sondern auch die Hochregulierung von Genen, insofern das Transposon an den Anfang eines Gens
inseriert wurde (Folie 24). Folie 5 veranschaulicht die Vorselektion von Mutanten mit erhöhter laE
Produktion. Kolonien die eine verstärkte laE-Produktion besitzen, verändern aufgrund der Absorption
des Stoffes ihre Farbe ins bräunliche. Die ausgewählten Mutanten wurden anschließend weiter
untersucht. Mittels Plasmid rescue, analog zum zuvor besprochenen Versuch, wurden die
Insertionsloci in S. globisporus und die damit verbundenen Gene identifiziert. Die Mutante mit der
größten laE Produktion wurde für weitere Analysen verwendet. Bei dem ausgeschalteten Gen
handelt es sich um einen GntR-type Regulator. Die Annahme war, dass das Gen für einen negativen
Regulator der laE Produktion kodiert. Via Sequenzvergleich konnte das homologe Gen in S.coelicor
identifiziert werden. Hier wurde das entsprechende Gen sco3269 über homologe Rekombination mit
einem mutierten Allel ausgeschaltet. In einem parallelen Versuch sollte wurde ein Wildtypstamm so
verändert, dass er das sco3269 Gen überexprimiert. In beiden Fällen konnten Phänotypen
beobachtet werden die vom Wildtyp abweichen. Im Falle der Deletion des Gens konnte eine 2,5-fach
höhere Actinorhodinproduktion und eine 1,6-fache Undecylprodigiosinproduktion nachgewiesen
werden. Im Falle der Überexpression zeigte sich eine 2-fach verminderte Actinorhodinproduktion
und eine in etwa gleiche Undecylprodigiosinproduktion, wodurch die Annahme der Einflussnahme
der Gendosis bestätigt werden konnte. Im Rahmen der durchgeführten Arbeiten konnten S.
globisporus Mutanten via Transposon Mutagenese erzeugt werden und die an der Überproduktion
beteiligten regulatorischen Gene identifiziert werden. Zusätzlich wurde eine weiterführende
Untersuchung des Gens der Mutante mit der größten laE-Produktion durchgeführt. Ein Homolog des
Gens konnte in S.coelicolor identifiziert werden. Das gezielte Ausschalten des homologen Gens in
S.coelicolor führte zu einer erhöhten Actinorhodinproduktion und eine Überexprimierung zu einer
Verminderung. Die Funktionalität des Systems wurde bestätigt und erfolgreich in einem NichtModellorganismus angewendet (S. globisporus). Zusätzlich bietet das System durch die starken, nach
auswärts gerichteten Promotoren die Möglichkeit, strangabwärtsgelegene Gene zu beeinflussen, die
sich unmittelbar neben der Insertionsstelle befinden.

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