Molecular and transcriptomic characterization of - ETH E

DISS. ETH NO. 22704
Molecular and transcriptomic characterization of natural
resistance to cassava brown streak viruses in cassava
(Manihot esculenta, Crantz)
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
Presented by
Ravi Bodampalli Anjanappa
Master of Science in Plant Biotechnology, University of Agricultural Sciences,
Bangalore
Born 12th August 1979
Citizen of India
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wilhelm Gruissem, examiner
Prof. Dr. Hervé Vanderschuren, co-examiner
Dr. Maruthi M. N. Gowda, co-examiner
2015
Abstract
Cassava (Manihot esculenta Crantz) production in eastern and central African countries is
adversely impacted by cassava brown streak disease (CBSD), thereby threatening food security.
CBSD is caused by two viral species, Cassava brown streak virus (CBSV) and Ugandan
Cassava brown streak virus (UCBSV) which are collectively termed as cassava brown streak
viruses (CBSVs). Both are (+) single stranded (ss) RNA viruses of the genus Ipomovirus;
family Potyviridae. The prevalence of mixed infections of the two ipomoviruses CBSV and
UCBSV along with cassava mosaic geminiviruses (CMGs) that cause cassava mosaic disease
(CMD) is now well known. In the present study, 14 elite cassava cultivars (selected from the
cassava germplasm and breeding programmes) were assayed using top cleft grafting procedures
for identifying novel sources of resistance against the multiple CBSV and UCBSV isolates.
These infection assays identified cassava varieties with contrasting levels of virus resistance.
KBH 2006/18 and KBH 2006/26, two elite breeding lines from the IITA breeding programme
were identified as highly resistant as they remained symptom-free and did not support
replication for both CBSV and UCBSV isolates. Importantly, challenging with a mixed
infection of CBSVs and East African cassava mosaic virus (EACMV-Ug) could not break the
virus resistance. Independent grafting experiment using scions resistant KBH 2006/18 and
KBH 2006/26, moderately resistant TMS 30001 and susceptible 60444 varieties was performed
over a time course (16, 22 and 28 dag) to identify early molecular interactions. As expected,
these assays revealed variable CBSV titers across the different time points. Comparative
transcriptome analysis of resistant KBH 2006/18 and susceptible 60444 varieties were
performed using Illumina Hiseq2000 from both CBSV-infected and virus-free scions collected
at 28 dag. The RNA-seq analysis revealed that an average of 83.5% of the total reads mapped
to phytozome cassava reference genome v9 and identified 26,206 genome transcripts. A total
of 853 (60.3% of them up-regulated) and 334 (35.6% of them up-regulated) differentially
expressed genes (DEGs) were identified in susceptible 60444 and resistant KBH 2006/18
varieties, respectively. Further functional characterization of the DEGs using the MapMan
software to identify processes and pathways, revealed 27 and 24 bins MapMan bins or
functional classes in susceptible and resistant varieties, respectively. In variety 60444, signaling
(MapMan bin 30) was modulated with majority of the DEGs (85 %) being up-regulated while
in contrast KBH 2006/18 only 27% of the DEGs were modulated in signaling pathway. In KBH
2006/18, 90% of DEGs related to stress (MapMan bin 20) were up-regulated while 70% of
DEGs were up-regulated in susceptible variety. In both the varieties DEGs implicated in
photosystem were down-regulated (100%). Further, de novo assembly of unmapped reads
determined novel cassava (host) genes, in addition to complete genome sequences of CBSV
(TAZ:DES:01) (8,975 nt) and partial sequence of TAZ:DES:02 (6,645 nt). Moreover, analysis
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of host genes using RT-qPCR, revealed that four DEGs (RDRP1, NTL9, NIMIN2 and BG3)
where up-regulated in early time points samples (16 and 22 dag) in susceptible 60444 variety.
Further, expression analysis of these genes in moderately resistant TMS 30001 variety also
confirmed consistent up-regulation in presence of the virus.
CBSV-like symptoms were first reported in resistant variety KBH 2006/18 in a field trail in the
Chambezi province in Tanzania in 2012. Field-collected material was multiplied in the
greenhouse and used to inoculate KBH 2006/18 scions. CBSD was graft-transmissible to
healthy KBH 2006/18, which developed typical CBSD symptoms. We used conserved
sequences between CBSV and UCBSV genome sequences to develop primers and amplify
fragments of the isolates infecting KBH 2006/18. We detected only one CBSV isolate in the
field-collected material that we named CBSV TAZ: Cham:14. Comparing the resistant breaking
TAZ:Cham:14 isolate to other isolates (TAZ:DES:01, TAZ:DES:02, and UG:Kab4-3:07)
revealed specific mutations in the proteins from the TAZ:Cham:14 isolate with the exception
of the 6K1 protein which was identical between TAZ:DES:01 and TAZ:Cham:14. As expected,
the sequence diversity was greater between the two CBSVs species (~74.5% identical) than
within CBSV isolates (88% identical). This is the first report on CBSV isolates differing in
virulence and further efforts are being made to develop infectious clones and to identify
molecular virulence determinants of TAZ:Cham:14 in the KBH 2006/18 line.
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Zussamenfassung
Die Produktion von Maniok (Manihot esculenta Crantz) wird in Ost- und Zentralafrikanischen
Ländern von der Braunstreifen-Krankheit (Cassava Brown Streak Disease, CBSD) bedroht und
gefährdet damit die Ernährungssicherheit in dieser Region. CBSD wird von zwei Virusspezies
verursacht, Cassava brown streak virus (CBSV) und Ugandan Cassava brown streak virus
(UCBSV), die kollektiv als Cassava brown streak viruses (CBSVs) bezeichnet werden. Beides
sind Positive Einzelstrang-RNA Viren der Gattung Ipomovirus; Familie Potyviridae. Die
beiden Ipomoviren CBSV und UCBSV treten häufig als Mischinfektion mit Cassava-Mosaik
Geminiviren (CMGs) auf, welche die Cassava-Mosaik-Krankheit (Cassava Mosaic Disease,
CMD) verursachen. Zur Identifizierung von neuen Resistenzquellen gegen die zahlreichen
CBSV und UCBSV Isolate wurden in der vorliegenden Arbeit 14 Elite Maniok-Sorten (von der
Maniok Keimplasma-Bank und Zuchtprogrammen selektiert) mittels Aufpfropfen auf infizierte
Wurzelstöcke untersucht. Durch diese Infektionsassays wurden Maniok-Sorten mit
unterschiedlich stark ausgeprägter Virusresistenz identifiziert. KBH 2006/18 und KBH
2006/26, zwei Elite-Zuchtlinien aus dem IITA Zuchtprogramm, blieben symptomfrei und
erlaubten keine Replikation der beiden CBSV und UCBSV Isolate. Auch durch
Mischinfektionen mit CBSVs und East African cassava mosaic virus (EACMV-Ug) konnten
die Virusresistenz nicht gebrochen werden. Zur Identifizierung von frühen molekularen
Wechselwirkungen wurden unabhängige Pfropf-Experimente mit den resistenten Sorten KBH
2006/18 und KBH 2006/26, der mässig resistenten Sorte TMS30001 und der anfälligen Sorte
60444 durchgeführt. Dabei wurden in einem Time-Course-Experiment Proben an 16, 22 und
28 Tagen nach der Pfropfung (TNP) entnommen. Wie zu erwarten zeigten diese Versuche
variable CBSV Titer zwischen den verschiedenen Zeitpunkten. Des Weiteren wurden
vergleichende Transkriptom-Analysen mit der resistenten Sorte KBH 2006/18 und der
anfälligen Sorte 60444 durchgeführt. Dazu wurden CBSV infizierte und virusfreie Pflanzen 28
TNP mittels Illumina Hiseq2000 analysiert. Durchschnittlich 83.5% der gelesenen Fragmente
(reads) wurden dem Phytozome Maniok Referenzgenom v9 zugeordnet und 26,206 Transkripte
identifiziert. Insgesamt wurden 853 (davon 60.3% hochreguliert) und 334 (davon 35.6%
hochreguliert) differentiell exprimierte Gene (DEGs) in 60444 resp. KBH 2006/18 identifiziert.
Zur Identifikation von physiologischen Prozessen und Stoffwechselwegen wurden diese DEGs
mittels MapMan Software analysiert. Die funktionelle Charakterisierung dieser DEGs ergaben
27 MapMan bins oder funktionelle Klassen in anfälligen und 24 in resistenten Sorten. In 60444
waren hauptsächlich Signaltransduktionsvorgänge (MapMan bin 30) moduliert mit
mehrheitlich hochregulierten DEGs (85%), im Gegensatz zu KBH 2006/18 27% DEGs in
Signalwegen moduliert waren. 90% der DEGs die im Zusammenhang mit Stress (MapMan bin
20) stehen waren in KBH 2006/18 hochreguliert während in 60444 nur 70% der DEGs
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hochreguliert waren. In beiden Sorten waren die ins Photosystem involvierten DEGs
runterreguliert (100%). Des Weiteren konnten durch die de novo Assemblierung von nicht
zugeordneten Fragmenten, nebst der kompletten Genomsequenz von CBSV (TAZ:DES:01)
(8975 nt) und der partiellen Sequenz von TAZ:DES:02 (6645 nt), auch neue Maniok Gene
bestimmt werden. Darüber hinaus ergab die Analyse der Wirts-Gene mittels RT-qPCR, dass
vier DEGs (RDRP1, NTL9, NIMIN2 und BG3) an frühen Zeitpunkten (16 und 22 TNP) in 60444
hochreguliert sind. Expressionsanalysen dieser Gene in der mässig resistenten Sorte TMS
30001 bestätigten eine konsistente Hochregulation über alle drei Zeitpunkte.
CBSV-ähnliche Symptome in einer resistenten Sorte wurden erstmals 2012 in KBH 2006/18
bei einem Feldversuch in der Chambezi Provinz in Tanzania beobachtet. Symptomatische
Pflanzen vom Feld wurden im Gewächshaus vermehrt und zur Infektion von KBH 2006/18
mittels Pfropfverfahren verwendet. CBSV wurde von den infizierten Wurzelstöcken auf KBH
2006/18 übertragen, welche die typischen CBSD Symptome entwickelten. PCR-Primer wurden
anhand von konservierten Genomsequenzen von CBSV und UCBSV entwickelt und damit
Fragmente der infektiösen Virus-Isolate amplifiziert. Dabei wurde nur ein CBSV Isolat
detektiert und als CBSV TAZ:Cham:14 bezeichnet. Vergleiche mit dem Resistenz-brechenden
Isolat TAZ:Cham:14 und anderen Isolaten (TAZ:DES:01, TAZ:DES:02, und UG:Kab4-3:07)
zeigten spezifische Mutationen in den Proteinen von TAZ:Cham:14 mit Ausnahme des 6K1
Proteins, welches identisch ist zwischen TAZ:DES:01 und TAZ:Cham:14. Wie zu erwarten
war die Sequenz-Diversität zwischen den beiden CBSVs Spezies (~74.5% identisch) grösser
als zwischen den CBSV Isolaten (88% identisch). Dies ist der erste Bericht von CBSV Isolaten
mit unterschiedlicher Virulenz. Weitere Anstrengungen zur Entwicklung von infektiösen
Klonen und zur Identifizierung der molekularen Virulenz-Determinanten von TAZ:Cham:14
in KBH 2006/18 werden momentan unternommen.
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