Humane Tötungsmethoden für Fische

Euthanasie, Anästhesie und Analgesie
Literaturübersicht für Laborfische
Almut Köhler, Ph.D.
KIT Sicherheitsmanagement, Abt. Zentrale Beauftragte und Technische Beratung, Genehmigungen
KIT – Universität des Landes Baden-Württemberg und
nationales Forschungszentrum in der Helmholtz-Gemeinschaft
www.kit.edu
Gründe für das Töten von Fischen
 Vermeidung von Schmerzen, Leiden, Schäden
 Nahrungsgewinnung
 Artenschutz/Ökologie
 Gewinnung von Blut, Gewebe für Versuche
 Ausmerzung aus Zuchtgründen
 Versuchsende
1
19.11.2015
Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
SUM
Kriterien für das humane Töten von Fischen
 Tod ohne Anzeichen von Panik, Schmerz, Leid
 minimale Zeit bis zum Eintritt der Bewusstlosigkeit
 verlässlich, reproduzierbar
 einfache, wartungsfreie Apparatur
 sicher für Durchführenden
 keine Kontamination der Umwelt
 geringe emotionale Effekte auf Durchführenden
2
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SUM
Methoden der Euthanasie
Physikalisch
 Pistolenschuss
 Bolzenschuss
 zervikale Dislokation
 Dekapitation
 Mikrowelle
 Elektroschlag
 Betäubungsschlag mit Ausbluten
Chemisch
 Injektion
Barbiturate, (Cloralhydrat, Ethanol, Ketamin, MgSO4, KCl, neuromuskuläre Blocker)
 Inhalation/Immersion
MS-222, Eugenol, Benzocain, (Halothan, Isofluran, Enfluran, Chloroform, NO, CO2, CO,
Argon, HCN, Methoxyfluran)
3
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SUM
Euthanasie/Anästhesie bei Fischen






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sehr große Tiergruppe (> 30000 Arten; Säuger 5500 Arten)
sehr heterogene Tiergruppe (ca. 500 Familien; Säuger: ca. 130 Familien)
andere Physiologie
andere Sinnesorgane
keine Mimik
keine Laute
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SUM
Anzeichen für Bewusstlosigkeit / Tod bei Fischen
Bewusstlosigkeit:
 Verlust des Stellreflexes
 Verlust des VOR
Tod:





5
Stillstand Operkulum
Verlust des Herzschlages
EEG (Kestin et al., 1991; Lambooij et al., 2002 ; Robb et al.; 2000b Van de Vis et al., 2003)
Rigor mortis
Livor mortis
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SUM
Rechtliche Grundlagen
TierSchVersV 2013 (identisch mit Annex 4 der Direktive EU 2010/63)
Zugelassene Tötungsmethoden im Rahmen von Tierversuchen:
 Gehirnerschütterung / stumpfer Schlag auf den Kopf
 Elektrische Betäubung (Zusatz: geeignete Anlagen / Geräte erforderlich)
 Überdosis eines Betäubungsmittels (unter vorheriger Sedierung, wenn nicht
unangemessen)
 Andere Methoden, wenn das Tier zuvor wahrnehmungs- und empfindungslos ist
und auch bleibt bis zum Eintritt des Todes
 Andere Methoden können durch die Behörden erlaubt werden, wenn
wissenschaftlich nachgewiesen werden, kann, dass die Methode nicht zu mehr
Schmerzen, Leiden oder Schäden führt.
 Andere Methoden können durch die Behörden erlaubt werden, wenn es
experimentelle Gründe gibt und die Methode ethisch vertretbar und unerlässlich ist.
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SUM
Gehirnerschütterung / stumpfer Schlag auf den
Kopf
 Training nötig
 ästhetisch schwierig
 Kombination mit anderen Methoden
European Food Safety Authority- AHAW/04-027
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SUM
Gehirnerschütterung / stumpfer Schlag auf den
Kopf
8
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SUM
Elektro-Euthanasie




Tod durch Kammerflimmern, Herzstillstand  zerebrale Hypoxie
epileptische Anfälle mit tonisch-klonischen Krämpfen
gefährlich für Anwender
unästhetisch
AVMA-Guide 2013; Lines et al., 2003, 2004, 2005
9
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SUM
Immersionsbäder
 direkter Übergang von Sedation und Narkose in den Tod
 Substanz wird meist vornehmlich über die Kiemen aufgenommen, zirkuliert
im Blut und wird unverändert oder nach Abbau über Kiemen, Niere, Haut
wieder ausgeschieden
 einfach anzuwenden, schnell, relativ billig
 Probleme:
 Metaboliten können sich im Wasser anreichern.
 Notatmung einiger Fischarten kann den Effekt reduzieren.
 Chemikalien können für Umwelt oder Anwender giftig sein.
 Stress vs. Exzitationsphase
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SUM
Anästhesie und Stress
Anästhesie bedeutet Stress für den Fisch:
 Atemdepression
 reduzierter Gasaustausch
 Hypoxie
 respiratorische Azidose (CO2 Akkumulation)
 Anstieg von Adrenalin und Cortisol
Das gilt für jede Form der Anästhesie!
11
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SUM
Auswahlkriterien für eine gute Narkose
 Anästhesie in weniger als 3 min, Wiedererwachen in weniger als
5 min!
 Keine toxischen Nebenwirkungen für Fisch bzw. Anwender
 Keine langanhaltenden Auswirkungen auf Physiologie,
Immunsystem oder Verhalten
 Effizienz abhängig von Spezies, Größe, Dichte im Tank,
Wasserqualität
 Vortests mit kleiner Fischzahl! (Dosis, Wirkzeit)
 Anästhesie-Überwachung
Es gibt keinen Standard für alle Spezies und alle Zwecke!
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SUM
Narkose bei Fischen - Hinweise




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Schleimschicht nicht verletzen, Fisch feucht halten
Fütterung aussetzen (spezies-abhängig!)
immer Fischwasser verwenden (inkl. Temperatur)
Sauerstoffzufuhr sicherstellen
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SUM
Narkose-Stadien
Stadium
Beschreibung
Symptome
0
normal
Aktives Schwimmen, Reaktion auf externe Reize, normales Gleichgewicht,
normaler Muskeltonus
I.1
Leichte Sedation
Leichter Reaktionsverlust auf Reize (visuell, Berührung); normale Atemfrequenz,
normales Gleichgewicht; normaler Muskeltonus; freiwilliges Schwimmen
I.2
Tiefe Sedation
Verlangsamung; Einstellung freiwilliges Schwimmen; unkontrollierte Bewegungen,
Verlust Reaktionsfähigkeit (visuell, Berührung) ; leichte Abnahme der Atemfreq.;
Gleichgewicht normal, Muskeltonus leicht reduziert; Reaktion auf Positionsreize
II.1
Leichte Narkose
Exitationsphase ggf. vor Anstieg der Atemfrequenz, Verlust der Körperspannung;
Reaktion auf Positionsreize
II.2
Tiefe Narkose
(Toleranzstadium)
Ausfall der Positionsantwort; Abnahme der Atemfrequenz wieder auf Normalmaß,
Verlust des Gleichgewichts; Muskeltonus vermindert; leichte Reaktion auf starke
Reize (Berührung, Vibration); äußere Probennahme; Flossenbiopsien;
Kiemenbiopsien
III.1
Leichte Anästhesie
völliger Verlust des Muskeltonus; Reaktion auf starken Druck; weiterer Abfall der
Atemfrequenz; kleinere chirurgische Manipulationen
III.2
Chirurgisches
Stadium
Völliger Verlust von Reaktivität und Nozizeption; komplette Muskelrelaxation;
langsame Atmung und Herzfrequenz; völliger Verlust der Reizantwort; (→ Druck
auf Schwanzansatz); Chirurgische Eingriffe
IV
Medullärer
Kollaps
Totaler Verlust des Muskeltonus, Reaktion auf starken Druck, weiterer Abfall der
Atemfrequenz; irreversibel
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SUM
MS-222 (Tricain)
 am weitesten verbreitet
 Pulver, in gelöster Form sauer, daher puffern
 Wirkungsweise:

blockiert die Na+- (und K+)-Kanäle in Nervenzellmembranen 
Ausbleiben von Aktionspotentialen; Muskelrelaxation, Lokalanästhesie,
Signalunterbrechung Peripherie – Gehirn
 Blockade der Kiemenventilation  Hypoxie
 Blockade der Herz-Kontraktion  Herzstillstand
 wirkt besser in warmem Wasser mit geringerer Härte
(AVMA-Guide 2013 ; Matthews und Varga, 2012, Rombough, 2007)
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SUM
MS-222
Probleme mit MS-222:
 sehr unterschiedliche Konzentrationsangaben, was effektiv ist,
Speziesunterschiede (Carter et al., 2011; Neiffer und Stamper 2009)
 Indizien für Stress obwohl deutliche Anzeichen für Anästhesie (Carter et al., 2011; Matthews
und Varga, 2012)
 aversiv (Readman et al., 2013; Wong et al., 2014)
 dauert teilweise bis 3 h, dass Herzschlag aufhört (Veterinary Office, University of California,
Riverside)
 werden teilweise wieder wach (4/23 Fischen) (Wilson et al., 2009)
 retinotoxisch (Carter et al., 2011, Neiffer und Stamper 2009)
 Steigerung von Hämatopoese-Faktoren mRNA (stärker als bei Benzocain, CO2,
ZD) (Bowen et al., 2011)
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SUM
MS-222
Dosierung von MS-222 im Zebrabärbling:
 Sedierung: 0.01 mg/ml (Trevarrow, 2007, 2011)
 Anästhesie: 0.168 mg/ml (Westerfield, 2007)
 Euthanasie: 0.2 - 0.3 mg/ml (Wilson et al., 2009)
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SUM
Benzocain
 sehr ähnlich zu MS-222
 schlecht löslich, daher letale Dosis schwer zu erreichen (AFMA, 2013)
 nicht sauer, weniger empfindlich gegenüber Wasserhärte (Neiffer und Stamper, 2009)
 schlechtere Sicherheitsspanne bei höheren Temperaturen (Gilderhus, 1989)
 nach 15 min letal (Gilderhus, 1989)
 Bewusstlosigkeit setzt teilweise erst sehr spät ein (Zahl et al, 2009)
 aktiviert Hämatopoese-Faktoren nicht so sehr wie MS-222 (Bowen et al., 2011)
 unterdrückt signifikant zelluläre und humorale Immunantwort (Bressler und Ron 2004)
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SUM
Eugenol / Nelkenöl
 bekannt aus der Zahnmedizin als Lokalanästhetikum, riecht gut
 blockiert wahrscheinlich auch Na+-Kanäle (AFMA, 2013)
 in USA nicht zur Euthanasie zugelassen (AFMA, 2013)
 schnellere Bewusstlosigkeit als mit MS-222, als Narkose aber längere Erholung
(AFMA, 2013)
 vermutlich karzinogen (AFMA 2013), beeinflusst Hormonsynthese (Cytochrom P450)
(Jayashree und Subramanyam, 1999); lebertoxisch?(Matthews und Varga, 2012)
 Stressantwort weniger gesenkt (Goldelritze) (Palić et al., 2006)
 löst sich schlecht in kaltem Wasser (Neiffer und Stamper, 2009)
 kein analgetischer Effekt nachgewiesen (Sladky et al., 2001)
Dosierung von Eugenol im Zebrabärbling:
 Sedierung: 2 - 5 mg/l (Grush & Noakes, 2004)
 Anästhesie: 60 - 100 mg/ml (Grush & Noakes, 2004)
19
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SUM
Benzocain, Eugenol / Nelkenöl
MS-222
Benzocaine
Nelkenöl / Eugenol
Löslichkeit
gut
schlecht
schlecht in kaltem
Wasser
Azidität, Pufferung nötig
+
(+)
-
Wasserhärte
sensitiv
nicht sensitiv
?
Wirkung bei höheren
Temperaturen
gut
reduziert
?
sehr spät
schneller
letal nach 15 min
starker Einfluss auf die
zelluläre und
humorale
Immunantwort
kein Nachweis für einen
analgetischen Effekt
kaum Verminderung der
Stressantwort
karzinogen
lebertoxisch
hemmt
Hormonsynthese
(Cytochrome P450)
Bewusstseinsverlust
(verglichen mit MS-222)
Nachteile
aversiv
Tod nicht zuverlässig
retinotoxisch
verändert Transkription
Zeichen von Stress
während der
Anästhesie
AVMA –Guide 2013; EMEA;2001; Matthews und Varga; Meinertz et al., 1999; Neiffer und Stamper, 2009; Sladky et al., 2001
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SUM
Probleme mit Embryonen / Larven
 1-2 dpf (Embryo): keine Kiemen-Atmung  reagieren nur schlecht auf MS-222
o.ä.
 5-6 dpf (Larven): nicht empfindlich
 Larven werden dann zunehmend empfindlich gegenüber MS-222
 reagieren auch auf letale Dosen nicht gut, bes. < 1 h
 brauchen teilw. 10-20fach höhere Dosen (RBF) für LD50
 kein Herzschlag ≠ tot
 14 dpf: Herz schlug auf auch nach > 30 min (teilweise -75 min) noch
 wenn 20 min nach Ende des Herzschlags zurückgesetzt: 100% wieder erholt!
(Matthews und Varga, 2012; Rombough, 2007; Strykowski und Schech, 2015)
21
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Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
SUM
Hypothermie / „rapid chilling“
 oft nicht akzeptiert als Methode
 Ablehnung:
- zu langsam
- verzögert Eintritt des Todes (Fische brauchen kalt weniger O2)
- stressig
- Eiskristallbildung ist schmerzhaft
- vielleicht nur immobilisiert
- keine anästhetische Wirkung
Quelle: American Veterinary Medical Association (2001) und Zitate davon
aber: in Ausgabe von 2013 ist es zugelassen
22
19.11.2015
Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
SUM
Hypothermie / „rapid chilling“
 oft nicht akzeptiert als Methode
 Ablehnung:
- zu langsam, verzögert Eintritt des Todes (Fische brauchen kalt weniger O2)
Todeseintritt meist nach 10-20 s (oft schneller)
AVMA-Guide 2013; Wilson et al., 2009; Shine et al., 2015
23
19.11.2015
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SUM
Hypothermie / „rapid chilling“
 oft nicht akzeptiert als Methode
 Ablehnung:
-
zu langsam
-
stressig
Literatur: Plasma-Cortisol steigt; gestörte
Plasma-Osmolarität, pH-Wert im Muskel
gesenkt
(Donaldson, 1981; Rorvik et al., 2001; Skjervold et al., 2001)
Lachse, hohe Dichte, 1°C, 1 h
Shine et al., 2015
24
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Vergleich mit Benzocain (SüßwasserHering): weniger Muskelreaktionen,
schnellerer Gleichgewichtsverlust;
Operkulum-Bewegung endet schneller,
keine Anzeichen von Stress, abhängig von
Körpergröße (linear) [Blessing et al., 2010)
Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
SUM
Hypothermie / „rapid chilling“
 oft nicht akzeptiert als Methode
 Ablehnung:
-
zu langsam
-
stressig
-
Eiskristallbildung ist schmerzhaft
MS-222
Fische haben keine Kälte-sensitiven
Nozizeptoren (RBF, Ashley et al. 2006, 2007).
Eisbad
Gefrierschrank
Wilson et al., 2009
25
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SUM
Hypothermie / „rapid chilling“
 oft nicht akzeptiert als Methode
 Ablehnung:
-
zu langsam
-
stressig
-
Eiskristallbildung ist schmerzhaft
-
vielleicht nur immobilisiert
Keine Erholung nach Todeszeichen + 10 min (MS-222 4/23)
(Wilson et al., 2009)
26
19.11.2015
Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
SUM
Hypothermie / „rapid chilling“
 oft nicht akzeptiert als Methode
 Ablehnung:
-
zu langsam
-
stressig
-
Eiskristallbildung ist schmerzhaft
-
vielleicht nur immobilisiert
-
keine anästhetische Wirkung
Nervenleitfähigkeit nimmt bei Kälte ab (Analgesie, Anästhesie?)
(Wilson et al., 2009)
27
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SUM
Hypothermie / „rapid chilling“
 mit physikalischer Methode kombinieren (Mazeration o.ä.)
 entscheidend: Körpergröße, Leitfähigkeit des Gewebes, große Körperoberfläche
im Verhältnis zur Größe
 Temperatur: 2-4° C; letale Temperatur des Fisches muss > 4°C sein
 anwendbar bei kleinen tropischen-subtropischen Fischen
 Adulte + 10 min nach scheinbarem Tod, 4-7 Tage: + 20 min
 Nicht anwenden < 3 dpf: keine Effekt; teilw. > 14 h behandelt und trotzdem
überlebt, sehr Hypoxie-resistent  Bleichlösung o.ä.
 nicht Einfrieren bei Bewusstsein, nicht langsam abkühlen
 nicht gut: moderate Kühlung zusammen mit Anästhetikum, weil das
Anästhetikum dann langsamer wirkt und die Tiere weniger O2 benötigen
 Euthanasie dauert oft länger (Matthews und Varga, 2012)
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SUM
Zusammenfassung Euthanasie / Anästhesie
chemisch
MS-222
Benzocain
Eugenol
Bleich-Lösung
Eisbad
++ / +++ + / ++
- /+
-/-
+++ /
+ / ++
+ / ++
?/?
-/-
++ /
- /-
- /-
- /-
+++ /
adult
Larve
Embryo
29
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physikalisch
-
Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
-
-
-/-
SUM
Anästhesie und Analgesie beim Fisch im Labor
Analgesie
Anästhesie
≠
30
Empfindungslosigkeit
Schmerzausschaltung
(ggf. zusammen mit Narkose = reversibler
Zustand der Bewusstlosigkeit)
Unterdrückung des Schmerzempfindens
ohne Auswirkung auf Bewusstsein,
Sinneswahrnehmung oder andere primäre
ZNS-Funktionen
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SUM
Analgesie bei Fischen
 Rezeptorenproteine der Nozizeptoren sind nachgewiesen; Funktionsweise unklar
 Schmerz wird auf absteigenden Bahnen moduliert, Efferenzen bisher nicht
beschrieben; viele Analgetika (u.a. Opioide) setzen an diesen Synapsen an
 keine Opioidrezeptoren im RM nachgewiesen, an diesen bindet Morphin beim
Säuger als Analgetikum
 Modulatoren-Funktion (s. Aspirin auf Prostglandine): nichts bekannt
 Opioide bisher nur als Hungerregulatoren oder Funktion bei Entzündung,
Hormonsynthese, Verhalten etc. untersucht, nicht wirklich als Analgetika
 Pharmakodynamik Morphin: -, keine dosisabhängigen Informationen vorhanden
 Ehernsink (1982) hat Morphin am optischen Tektum appliziert: Reaktion auf
Elektroschock beim Goldfisch vermindert; Naloxon als Antagonist wirksam
31
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SUM
Analgesie bei Fischen
 Morphin: Dosisangaben schwanken zwischen 10 und 3000 mg/kg
(Säuger: 2-5 mg/kg)
Regenbogenforelle (Sneddon)
300
Elephant
0,06
Pferd
0,2
Hund
2
Kaninchen
5
Ratte
5
Maus
5
0
50
100
150
200
Morphin mg/kg i.m.
250
300
350
 Studie von Sneddon: 0,3 g / 1 ml i.m. (0,1 ml/ 10 g) = 3000 mg/kg;
angeblich Rechenfehler (nie offiziell): 300 mg/kg (LD50 Maus: 200 mg/kg)
 keinerlei Nebenwirkungen (?)  andere Wirkung oder Pathways?
32
19.11.2015
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SUM
Analgesie bei Fischen
 Gabe ins Wasser: sehr langsame Wirkung, große Mengen nötig; andere
Applikationen: zusätzlicher Stress
 Eliminations-Halbwertszeit sehr spezies-abhängig
 Verteilung im Fisch: 10x langsamer als bei Säugern (Temperatur) Sneddons
Einsatz
von4-6
Analgetika
bei Laborfischen sehr
Dosis
noch und
höherNutzen
(32 Tage statt
h)
unklar;
Potential
 Morphin
wirktanalgetisches
anziehend (Sucht?)
von MS-222, Benzocain
 manche Analgetika sind tödlich im Fisch (Sidnophen, Analgin)
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SUM
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SUM
Literatur
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19.11.2015
Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen
SUM

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