RNA Isolation und Reverse Transkription

RNA Isolation und Reverse Transkription
Im heutigen Praktikum werden wir RNA aus Drosophila melanogaster isolieren und damit eine
reverse Transkription und PCR zur Analyse geschlechtsspezifischer Expression einzelner Gene
durchführen. Bitte lesen Sie die folgenden Hintergrundinformationen zur Vorbereitung auf das
Praktikum. Die Laborprotokolle werden Ihnen im Kurs zur Verfügung gestellt und dort auch
besprochen.
Reverse Transkriptase kann in der Praxis dazu benutzt werden, um sogenannte cDNA
(complementary DNA) zu synthetisieren, d.h. einzel- oder doppelsträngige DNA-Kopien von RNAMolekülen. Solche cDNAs werden vielfältig genutzt, etwa für Hybridisierung, für Klonierungen,
für Expressionsklonierungen, oder für die Erstellung von sog. cDNA- oder EST-Banken.
Die eukaryotische Zelle enthält viele tausend mRNA-Arten mit jeweils zell- und gewebespezifisch
unterschiedlicher Zusammensetzung. Unter einer cDNA- Genbank oder auch nur einer EST(“expressed sequence tag”) Bank versteht man eine Population von bakteriellen Stämmen oder
Phagen, in denen jeweils eine mRNA pro Zelle bzw. Phagen als cDNA-Insertion in einem Plasmid
bzw. Phagen vertreten ist. Die Gesamtmenge aller mRNAs an der Gesamtzell-RNA ist, trotz ihrer
Diversität, allerdings recht gering, in der Regel zwischen 0,5 und 2%. Will man cDNAs von
mRNA-Fraktionen herstellen, so ist es zweckmäßig, die Population der mRNA vor der reversen
Transkription präparativ anzureichern.
Die Synthese von cDNA kann operational in 4 Schritte gegliedert werden:
1) Assoziation der Primer:
Die reverse Transkriptase benötigt einen Primer mit einer freien 3’-Hydroxygruppe. Für den
heutigen Versuch wird eine von mehreren möglichen Varianten verwendet. Für eine klonierbare
cDNA nukleärer RNA verwenden wir Oligo-dT von einer Kettenlänge zwischen 10 und 20 als
generellen “Primer”. Dieses synthetische Oligonukleotid assoziiert vornehmlich mit den
polyadenalierten Enden der mRNAs.
2) Erststrangsynthese durch reverse Transkriptase:
In der Praxis wird dafür meist das Enzym eines Vögel befallenden Myoblastose-Virus (AMV, avian
myoblastosis virus) oder das Enzym eines Affen befallenden Virus (MMLV, moloney murine
leukoblasosis virus) eingesetzt. Durch die Polymerisation entstehen mRNA/DNA-Hybride.
3) Entfernung der mRNA aus dem mRNA/DNA-Hybrid:
Vor der Synthese des zweiten Strangs muss die RNA aus den RNA/DNA-Hybridmolekülen entfernt
werden. Dies kann durch eine spezifische RNase (RNase H) oder durch Alkalibehandlung erzielt
werden.
4) Zweitstrangsynthese:
Der zweite DNA-Strang kann im Prinzip mit verschiedenen Enzymen, auch der reversen
Transkriptase, hergestellt werden. Üblicherweise verwendet man jedoch das sog. KlenowFragment der DNA- Polymerase I aus E. coli. Diesem Enzym fehlt die 5’-3’-Exonukleaseaktivität
der Polymerase, so dass der Abbau der neugebildeten doppelsträngigen DNA verhindert wird. Auch
dieses Enzym benötigt ein freies 3’-OH-Ende und damit einen “Primer”, der im vorliegenden Fall
durch spontane Schleifenbildung (“hairpin”- oder “loop”-Bildung) der Einzelstrang-cDNA ensteht.
1
Weitere Schritte sind erforderlich, soll eine doppelsträngige cDNA kloniert werden:
1) Trimmen der doppelsträngigen cDNA:
Durch Behandlung mit S1- oder Mungbohnen Nuklease, beides Enzyme, die einzelsträngige
Nukleinsäuren hydrolysieren, werden überhängende Einzelstrangenden und die Schleifenstruktur an
einem Ende der cDNA entfernt. Es entsteht eine doppelsträngige cDNA mit glatten Enden (engl.
“blunt ends”).
2) “Linker”-Addition:
Sollen nach der Klonierung die cDNA-Insertionen wieder aus dem Vektor exzisierbar sein, so
müssen an die glatten Enden der cDNA sog. “linker” addiert werden, d.h. chemisch synthetisierte
kurzkettige, komplementäre Oligonukleotide meist von 6-15 Nukleotiden Länge, die die
Erkennungssequenz gewöhnlich einer Restriktionsendonuklease (z.B. EcoRI) enthalten. Solche
Moleküle können tandemartig miteinander oder mit einem analog restringierten Vektor assoziieren
und durch eine Inkubation mit DNA- Ligase kovalent miteinander verknüpft werden.
3) Maskierung interner Restriktionsschnittstellen:
Der “linker”-Addition vorgeschaltet wird meist eine Modifizierung sogenannter interner
Schnittstellen für das Enzym, mit dem die Klonierung durchgeführt wird, im beschriebenen Fall
durch die der EcoRI-Restriktase komplementären EcoRI-Methylase. Die Markierung etwaiger
EcoRI-Schnittstellen in der cDNA entzieht sich dem Angriff durch das EcoRI-Enzym und
verhindert das Zerschneiden der cDNA beim Trimmen der addierten „linker”.
Vor der molekularen Klonierung wird die cDNA nämlich mit dem für die Klonierung vorgesehenen
Enzym behandelt, um die tandemartig vorhandenen übererschüssigen “linker”-Sequenzen an den
cDNA-Enden zu entfernen und “linker”-Monomere zu erhalten. Danach ist die cDNA an ihren
Enden mit Sequenzen für EcoRI- Schnittstellen ausgestattet und kann durch Ligation in einen mit
EcoRI geschnittenen Vektor, z.B. in den Phagen λgt11, integriert und die rekombinante DNA in
Bakterien kloniert werden.
2

Download Report