Manuelle Zählung der Thrombozyten Themen Prinzip

Manuelle Zählung der
Thrombozyten
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9.2.1600
Themen
Erythrozyten, Thrombozyten, Neubauer-Kammer.
Prinzip
Thrombozyten werden in einer Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop gezählt. Mit einer hypotonen
Ammoniumoxalatlösung werden dafür die störenden Erythrozyten hämolysiert und die Thrombozyten
werden vereinzelt und abgerundet. Diese Untersuchung gehört zum kleinen Blutbild.
Material
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Schülerset
Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk.
Mikroliterpipette 10 – 100 µl
Mikroliterpipette 100 – 1000 µl
Pipettenspitzen 2 - 200 μl im Halter, 96 Stk.
Pipettenspitzen 50 - 1000 μl im Halter, 100 Stk.
Einmalreaktionsgefäß, 1,5 ml, 1000 Stk.
Zählkammer nach Neubauer mit Deckglas
Petrischale
Mikroskop
Chemikalien
Thrombo-Count-Reagenz
Zusätzlich erforderlich
Haushaltspapier
46395-00
47141-03
47141-05
47148-11
47148-12
37653-00
64697-00
64705-00
62194-93
31898-05
Achtung: Thrombo-Count-Reagenz (Diammoniumoxalat-Monohydrat 10 g/l Quecksilber (II)-Chlorid 10
mg/l). Aktuelle Hinweise zu Risiken, Gefahren und Vorsichtsmaßnahmen entnehmen Sie dem
Sicherheitsdatenblatt aus der Reagenzpackung
Abb. 1: Material
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Thrombozyten
Aufgaben
Bestimmen Sie die Thrombozytenzahl einer Blutprobe.
Durchführung:
Untersuchungsmaterial
Vollblut (EDTA-Blut oder Kapillarblut) – Siehe Kapitel Präanalytik.
Durchführung
In ein Mikroreaktionsgefäß werden 190 µl ThromboCount-Reagenz und 10 µl gut gemischtes EDTA-Blut
oder Kapillarblut pipettiert. Es entsteht eine Verdünnung von 1 : 20. Die Lösung sehr gut mischen und 20
– 30 Minuten bis zur vollständigen Hämolyse der Erythrozyten inkubieren.
Die Zählkammer innerhalb einer Stunde füllen: Das optisch plan geschliffene Deckglas mit leichtem Druck
beider Daumen auf die mit etwas Wasser angefeuchteten seitlichen Trägerschienen der Neubauer-Kammer
aufschieben, auf beiden Flächen sollten dann sogenannte Newton´sche Ringe sichtbar sein. Sie entstehen durch Interferenz des Lichts an der oberen und unteren Grenzfläche des Luftkeils zwischen Deckglas und Abb. 2: Füllen der Neubauer-Kammer
Steg. Sind sie zu sehen, so liegt die Höhe des Zwischenraums zwischen den Trägerstegen und dem
Deckglas in der Größenordnung der Lichtwellenlängen,
ist also zu vernachlässigen. In diesem Zustand verrutscht das Deckglas beim Kippen der Zählkammer
nicht.
Die Lösung auf beiden Seiten in die Zählkammer einfüllen.und die Thrombozyten darin 20 Minuten in einer
feuchten Kammer sedimentieren lassen.
Zum Zählen wird ein 40-er Objektiv benutzt. Ausgezählt
werden im inneren Zählkreuz der Neubauerkammer die
Thrombozyten, die sich innerhalb der unten markierten
5 Gruppenquadrate mit jeweils 16 Grundquadraten be- Abb. 3: Neubauer-Kammer, inneres Zählkreuz. Die 5
finden und ebenfalls die Thrombozyten, die sich auf je- Gruppenquadrate mit den 16 Grundquadraten, die ausweils zwei aneinanderstoßenden Begrenzungslinien gezählt werden sollen, sind grau hinterlegt.
der Quadrate des Zählnetzes (z. B. L-förmig) befinden;
die Anzahl jeweils notieren.
Wenn man die Mikrometerschraube des Mikroskops leicht verstellt, setzen sich die Thrombozyten vor
dem Hintergrund der oft noch sichtbaren Erythrozytenschatten als kleine, seidig aufglänzende Kugeln
ab.
Grundlagen
Unter der Thrombozytenzahl versteht man die Anzahl der Blutplättchen (Thrombozyten) in einem bestimmten Blutvolumen. Normal sind Konzentrationen von 136.000–423.000 Thrombozyten pro Kubikmillimeter (mm3) Blut. Bei höheren Werten spricht man von Thrombozytose bzw. Thrombozythämie, bei
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niedrigeren Werten von Thrombopenie (oder auch Thrombozytopenie).
Im Einzelnen bedeutet "Thrombozytose" eine Erhöhung der Thrombozytenzahl. Zu dieser Erhöhung
kann es beispielsweise als Reaktion auf eine ausgedehnte Operation oder eine größere Blutung kommen, um den entstandenen Verlust an Blut (und damit auch an Blutplättchen) wieder auszugleichen.
Aber auch nach einer großen körperlichen Anstrengung oder bei Entzündungen kann eine
Thrombozytose festgestellt werden.
Eine Verminderung der Thrombozyten im peripheren Blut wird Thrombopenie (auch Thrombozytopenie)
genannt. Ursachen können unter anderem sein angeborene Bildungsstörungen im Knochenmark, verkürzte Lebensdauer der Thrombozyten verschiedener Genese und autoimmune Erkrankungen.
Bei
automatisierten
Zählmethoden
kann
es
außerdem
zu
einer
EDTA-induzierten
Pseudothrombozytopenie kommen; hierbei verklumpen die Thrombozyten in Gegenwart von EDTA und
können nicht mehr einzeln gezählt werden. Deshalb muss bei unrklärliche niedrigen
Thrombozytenzahlen im automatisierten Blutbild immer auch eine zusätzliche manuelle Zählung erfolgen.
Die Zählkammer ist ein Objektträger mit einer um 0,1 mm vertieften Fläche in der Mitte, die eine Netzeinteilung trägt. Mit dem Auflegen des Deckglases schließt sich die Kammer und die Zellen können gezählt
werden.
Auswertung
Berechnung
Aus der Fläche (1/400 mm2) und der Höhe (1/10 mm) eines Kleinstquadrats lässt sich dessen Volumen
als 1/4000 µl bestimmen. Da ein Gruppenquadrat aus 16 kleinen Grundquadraten besteht, hat es ein
Volumen von 1/250 µl und fünf Gruppenquadrate beinhalten 1/50 µl, was 0.02 µl entspricht.
Die Thrombozyten werden in den 5 Gruppenquadraten gezählt, also in 0.02 µl Blut. Durch folgende Umrechnung mit dem Verdünnungsfaktor 20 erhält man die Anzahl Thrombozyten pro µl Blut N:
n ist die gezählte Anzahl in 0,02 µl 1:20 verdünntem Blut und N die Anzahl Thrombozyten pro µl Blut.
Referenzwerte
Normal sind Konzentrationen von 136000–423000 Thrombozyten pro µl Blut. Bei Neugeborenen liegt
der Wert mit 100000–250000 etwas darunter. Weitere Informationen zu den Referenzwerten: siehe Vorbemerkungen, S. x.
Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung!
Note
Fehlerquellen der Kammer-Methoden
Die hier aufgeführten Fehlermöglichkeiten gelten für alle Kammermethoden und müssen bei Störungen
beachtet werden:
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Blut angeronnen
falsches Verdünnungsvolumen
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Benutzung von ungeeichten, defekten, spülfeuchten, ungereinigten Gerätschaften
- mangelhafte Durchmischung
- Deckglas falsch auf die Kammer aufgelegt
- Kammer nicht luftblasenfrei gefüllt
- Kammer überfüllt
- Sedimentationszeit zu kurz
- Zählung in der Kammer falsch durchgeführt
- Falscher Verdünnungsfaktor zur Berechnung benutzt
Das kleine Blutbild kann mit den Versuchen P2541601, P5921500, P5921300, und P5921200 erstellt
werden, für das große Blutbild ist überdies noch Versuch P5921400 nötig.
-
Fragen:
-
Welches Reagenz wird für die Thrombozytenzählung in der Kammer benötigt und was bewirkt es?
Ammoniumoxalatlösung hämolysiert die roten Blutkörperchen.
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Welche Blutuntersuchungen zählen neben der Thrombozytenzählung zum kleinen Blutbild und welche noch zusätzlich zum großen?
Das kleine Blutbild umfasst die Zählung der zellulären Blutbestandteile (Leukozyten, Erythrozyten und
Thrombozyten), sowie eine Bestimmung der Hämoglobinkonzentration im Blut und die Bestimmung
des MCV, eine Berechnung des Hämatokrit (HK) und der Erythrozyten-Indizes MCH und MCHC. Das
große Blutbild enthält zusätzlich zum kleinen Blutbild eine Differenzierung der Leukozyten in ihre
wichtigsten Untergruppen, ergänzend kann zum großen Blutbild noch eine Retikulozytenzählung
durchgeführt werden.
-
Worauf muss bei der Füllung der Zählkammer geachtet werden?
Das Deckglas muss so aufgelegt sein, dass Newton´sche Ringe entstehen. Die Kammer darf keine
Luftblasen enthalten und darf auch nicht überfüllt sein.
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Protokoll
Sie können Ihre Ergebnisse in der folgenden Tabelle notieren:
1. Bestimmung
Kammer
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Anzahl
Thrombozyten
Gesamtzahl:
2. Bestimmung
Kammer
Anzahl
Thrombozyten
Gesamtzahl:
Fragen
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Welches Reagenz wird für die Thrombozytenzählung in der Kammer benötigt und was bewirkt es?
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-
Welche Blutuntersuchungen zählen neben der Thrombozytenzählung zum kleinen Blutbild und welche noch zusätzlich zum großen?
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Worauf muss bei der Füllung der Zählkammer geachtet werden?
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