Manuelle Zählung der Thrombozyten TEAS 9.2.1600 Themen Erythrozyten, Thrombozyten, Neubauer-Kammer. Prinzip Thrombozyten werden in einer Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop gezählt. Mit einer hypotonen Ammoniumoxalatlösung werden dafür die störenden Erythrozyten hämolysiert und die Thrombozyten werden vereinzelt und abgerundet. Diese Untersuchung gehört zum kleinen Blutbild. Material 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Schülerset Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk. Mikroliterpipette 10 – 100 µl Mikroliterpipette 100 – 1000 µl Pipettenspitzen 2 - 200 μl im Halter, 96 Stk. Pipettenspitzen 50 - 1000 μl im Halter, 100 Stk. Einmalreaktionsgefäß, 1,5 ml, 1000 Stk. Zählkammer nach Neubauer mit Deckglas Petrischale Mikroskop Chemikalien Thrombo-Count-Reagenz Zusätzlich erforderlich Haushaltspapier 46395-00 47141-03 47141-05 47148-11 47148-12 37653-00 64697-00 64705-00 62194-93 31898-05 Achtung: Thrombo-Count-Reagenz (Diammoniumoxalat-Monohydrat 10 g/l Quecksilber (II)-Chlorid 10 mg/l). Aktuelle Hinweise zu Risiken, Gefahren und Vorsichtsmaßnahmen entnehmen Sie dem Sicherheitsdatenblatt aus der Reagenzpackung Abb. 1: Material www.phywe.com P5921600 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved 1 TEAS 9.2.1600 Manuelle Zählung der Thrombozyten Aufgaben Bestimmen Sie die Thrombozytenzahl einer Blutprobe. Durchführung: Untersuchungsmaterial Vollblut (EDTA-Blut oder Kapillarblut) – Siehe Kapitel Präanalytik. Durchführung In ein Mikroreaktionsgefäß werden 190 µl ThromboCount-Reagenz und 10 µl gut gemischtes EDTA-Blut oder Kapillarblut pipettiert. Es entsteht eine Verdünnung von 1 : 20. Die Lösung sehr gut mischen und 20 – 30 Minuten bis zur vollständigen Hämolyse der Erythrozyten inkubieren. Die Zählkammer innerhalb einer Stunde füllen: Das optisch plan geschliffene Deckglas mit leichtem Druck beider Daumen auf die mit etwas Wasser angefeuchteten seitlichen Trägerschienen der Neubauer-Kammer aufschieben, auf beiden Flächen sollten dann sogenannte Newton´sche Ringe sichtbar sein. Sie entstehen durch Interferenz des Lichts an der oberen und unteren Grenzfläche des Luftkeils zwischen Deckglas und Abb. 2: Füllen der Neubauer-Kammer Steg. Sind sie zu sehen, so liegt die Höhe des Zwischenraums zwischen den Trägerstegen und dem Deckglas in der Größenordnung der Lichtwellenlängen, ist also zu vernachlässigen. In diesem Zustand verrutscht das Deckglas beim Kippen der Zählkammer nicht. Die Lösung auf beiden Seiten in die Zählkammer einfüllen.und die Thrombozyten darin 20 Minuten in einer feuchten Kammer sedimentieren lassen. Zum Zählen wird ein 40-er Objektiv benutzt. Ausgezählt werden im inneren Zählkreuz der Neubauerkammer die Thrombozyten, die sich innerhalb der unten markierten 5 Gruppenquadrate mit jeweils 16 Grundquadraten be- Abb. 3: Neubauer-Kammer, inneres Zählkreuz. Die 5 finden und ebenfalls die Thrombozyten, die sich auf je- Gruppenquadrate mit den 16 Grundquadraten, die ausweils zwei aneinanderstoßenden Begrenzungslinien gezählt werden sollen, sind grau hinterlegt. der Quadrate des Zählnetzes (z. B. L-förmig) befinden; die Anzahl jeweils notieren. Wenn man die Mikrometerschraube des Mikroskops leicht verstellt, setzen sich die Thrombozyten vor dem Hintergrund der oft noch sichtbaren Erythrozytenschatten als kleine, seidig aufglänzende Kugeln ab. Grundlagen Unter der Thrombozytenzahl versteht man die Anzahl der Blutplättchen (Thrombozyten) in einem bestimmten Blutvolumen. Normal sind Konzentrationen von 136.000–423.000 Thrombozyten pro Kubikmillimeter (mm3) Blut. Bei höheren Werten spricht man von Thrombozytose bzw. Thrombozythämie, bei 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved P5921600 TEAS 9.2.1600 Manuelle Zählung der Thrombozyten niedrigeren Werten von Thrombopenie (oder auch Thrombozytopenie). Im Einzelnen bedeutet "Thrombozytose" eine Erhöhung der Thrombozytenzahl. Zu dieser Erhöhung kann es beispielsweise als Reaktion auf eine ausgedehnte Operation oder eine größere Blutung kommen, um den entstandenen Verlust an Blut (und damit auch an Blutplättchen) wieder auszugleichen. Aber auch nach einer großen körperlichen Anstrengung oder bei Entzündungen kann eine Thrombozytose festgestellt werden. Eine Verminderung der Thrombozyten im peripheren Blut wird Thrombopenie (auch Thrombozytopenie) genannt. Ursachen können unter anderem sein angeborene Bildungsstörungen im Knochenmark, verkürzte Lebensdauer der Thrombozyten verschiedener Genese und autoimmune Erkrankungen. Bei automatisierten Zählmethoden kann es außerdem zu einer EDTA-induzierten Pseudothrombozytopenie kommen; hierbei verklumpen die Thrombozyten in Gegenwart von EDTA und können nicht mehr einzeln gezählt werden. Deshalb muss bei unrklärliche niedrigen Thrombozytenzahlen im automatisierten Blutbild immer auch eine zusätzliche manuelle Zählung erfolgen. Die Zählkammer ist ein Objektträger mit einer um 0,1 mm vertieften Fläche in der Mitte, die eine Netzeinteilung trägt. Mit dem Auflegen des Deckglases schließt sich die Kammer und die Zellen können gezählt werden. Auswertung Berechnung Aus der Fläche (1/400 mm2) und der Höhe (1/10 mm) eines Kleinstquadrats lässt sich dessen Volumen als 1/4000 µl bestimmen. Da ein Gruppenquadrat aus 16 kleinen Grundquadraten besteht, hat es ein Volumen von 1/250 µl und fünf Gruppenquadrate beinhalten 1/50 µl, was 0.02 µl entspricht. Die Thrombozyten werden in den 5 Gruppenquadraten gezählt, also in 0.02 µl Blut. Durch folgende Umrechnung mit dem Verdünnungsfaktor 20 erhält man die Anzahl Thrombozyten pro µl Blut N: n ist die gezählte Anzahl in 0,02 µl 1:20 verdünntem Blut und N die Anzahl Thrombozyten pro µl Blut. Referenzwerte Normal sind Konzentrationen von 136000–423000 Thrombozyten pro µl Blut. Bei Neugeborenen liegt der Wert mit 100000–250000 etwas darunter. Weitere Informationen zu den Referenzwerten: siehe Vorbemerkungen, S. x. Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung! Note Fehlerquellen der Kammer-Methoden Die hier aufgeführten Fehlermöglichkeiten gelten für alle Kammermethoden und müssen bei Störungen beachtet werden: - Blut angeronnen falsches Verdünnungsvolumen www.phywe.com P5921600 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved 3 TEAS 9.2.1600 Manuelle Zählung der Thrombozyten Benutzung von ungeeichten, defekten, spülfeuchten, ungereinigten Gerätschaften - mangelhafte Durchmischung - Deckglas falsch auf die Kammer aufgelegt - Kammer nicht luftblasenfrei gefüllt - Kammer überfüllt - Sedimentationszeit zu kurz - Zählung in der Kammer falsch durchgeführt - Falscher Verdünnungsfaktor zur Berechnung benutzt Das kleine Blutbild kann mit den Versuchen P2541601, P5921500, P5921300, und P5921200 erstellt werden, für das große Blutbild ist überdies noch Versuch P5921400 nötig. - Fragen: - Welches Reagenz wird für die Thrombozytenzählung in der Kammer benötigt und was bewirkt es? Ammoniumoxalatlösung hämolysiert die roten Blutkörperchen. - Welche Blutuntersuchungen zählen neben der Thrombozytenzählung zum kleinen Blutbild und welche noch zusätzlich zum großen? Das kleine Blutbild umfasst die Zählung der zellulären Blutbestandteile (Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten), sowie eine Bestimmung der Hämoglobinkonzentration im Blut und die Bestimmung des MCV, eine Berechnung des Hämatokrit (HK) und der Erythrozyten-Indizes MCH und MCHC. Das große Blutbild enthält zusätzlich zum kleinen Blutbild eine Differenzierung der Leukozyten in ihre wichtigsten Untergruppen, ergänzend kann zum großen Blutbild noch eine Retikulozytenzählung durchgeführt werden. - Worauf muss bei der Füllung der Zählkammer geachtet werden? Das Deckglas muss so aufgelegt sein, dass Newton´sche Ringe entstehen. Die Kammer darf keine Luftblasen enthalten und darf auch nicht überfüllt sein. 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved P5921600 Manuelle Zählung der Thrombozyten TEAS 9.2.1600 Protokoll Sie können Ihre Ergebnisse in der folgenden Tabelle notieren: 1. Bestimmung Kammer 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Anzahl Thrombozyten Gesamtzahl: 2. Bestimmung Kammer Anzahl Thrombozyten Gesamtzahl: Fragen - Welches Reagenz wird für die Thrombozytenzählung in der Kammer benötigt und was bewirkt es? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ - Welche Blutuntersuchungen zählen neben der Thrombozytenzählung zum kleinen Blutbild und welche noch zusätzlich zum großen? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ www.phywe.com P5921600 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved 5 TEAS 9.2.1600 - Manuelle Zählung der Thrombozyten Worauf muss bei der Füllung der Zählkammer geachtet werden? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved P5921600
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