平成25年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書 かごしまの水産物付加価値創出研究事業-Ⅱ （緑茶抽出液による水産加工品のヒスタミン生成抑制試験） 保 【目 聖子・加治屋 大・稲盛 重弘 的】 ヒスタミン（以下Ｈｍという）は，魚肉中の遊離アミノ酸であるヒスチジン（以下Ｈｉｓという） が，ヒスタミン生成菌のヒスチジン脱炭酸酵素（以下ＨＤＣという）の作用を受けてＨｍに変換され たものである。昨年度までに，Ｈｉｓ含有量が高くＨｍの生成が懸念されるイワシ丸干品については， 内臓を含んだ原料形態での現状の加工工程では，Ｈｍ生成リスクを完全に回避することは困難との知 見を得た。一方，昨年度までの当該研究事業において，ボンタン果実の外皮抽出物にＨＤＣ活性阻害 作用があることが明らかとなった。ただし，ボンタン外皮抽出液は脂溶性であったことから，水産加 工における浸漬時に使用するには，やや難があった。 そこで水溶性の性質を持ち，かつヒトのアレルギー作用抑制効果に優れる緑茶に着目し，ＨＤＣ活 性阻害作用の有無についての確認試験を実施し，Ｈｍ生成リスクを回避する新たな加工技術を開発す ることを目的とする。 試験１．緑茶抽出液 のＨＤＣ活性阻害試験 【材料及び方法】 ・緑茶抽出液 市販の煎茶及びべにふうき茶を用い，茶20gを200mlの水で煮熟抽出した溶液を冷却し試験に供 した。 ・菌粗酵素液の調整 Ｈｍ生成菌は，（独）水産総合研究センター中央水産研究所より菌株分与されたMorganella mor- ganii を用い，0.5%のL-Hisを加えたトリプチケースソイブロス(以下TSBという)培地で37℃・24時 間の培養を行った。培養した菌液を遠心分離し(8,000rpm,20分，4℃），得られた沈殿物を滅菌リン 酸緩衝液(以下PBSという)で3回洗浄したものを洗浄菌体とした。次に，洗浄菌体をPBSに懸濁し， 超音波粉砕機（UD-21P トミー精工製）で冷却しながら，10分間の間欠粉砕を行った。その後，遠 心分離(14,000rpm,30分，4℃）して得られた上清を粗酵素液とした。 ・ＨＤＣ活性阻害の測定法 予め200mM 酢酸緩衝液にL-Hisを25mM になるよう添加し基質とした。また，ＨＤＣ活性阻害剤と して基質に緑茶抽出液及び緑茶抽出液に代えて滅菌水を加えたものを添加した。その後，基質に 0.5mg/mlに濃度調整した粗酵素液を加え，37℃で30分間の酵素反応を行った（表1）。酵素反応後， 16％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させ，基質中に生成したＨｍ濃度をEIA Histamarine kit （Beckman Coulter製）を用いて測定した。なお，測定は，マイクロプレートリーダー（MPR 東ソ ー製）で400nmにおける吸光度を求めた後，Ｈｍ標準品の吸光度と濃度の検量線からＨｍ濃度を求 めた。 - 221 - 平成25年度 表１ 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書 ＨＤＣ活性阻害試験の条件 粗酵素液の種類 基質 阻害剤等 阻害剤等の添加量(μｌ) 反応条件 M.morganii 粗酵素 25mM L-His,200mM酢酸ﾊﾞｯﾌｧｰ 緑茶（べにふうき茶） 500 37℃・30分間 M.morganii 粗酵素 25mM L-His,200mM酢酸ﾊﾞｯﾌｧｰ 緑茶（一般的な煎茶） 500 M.morganii 粗酵素 25mM L-His,200mM酢酸ﾊﾞｯﾌｧｰ 滅菌水 500 【結果及び考察】 結果を図１に示す。 M.morganii 600 のＨＤＣ活性については，阻害剤 として滅菌水を使用した区のＨｍ 500 が498.95ppmであったのに対し，緑 煎茶区では，それぞれ44.54ppm及 び24.92ppmと極めて低い値であっ た。滅菌水使用時Hm濃度を100％と した場合における抑制率（Ｈｍ生 成抑制率）はべにふうき茶で91%， Ｈｍ（ｐｐｍ） 茶抽出液であるべにふうき茶区と 400 300 200 100 煎茶で95%と共に，90%以上の割合 0 を示した。このことから，これら 滅菌水 緑茶抽出液は， M.morganii のＨＤ Ｃ活性を阻害する効果を持つことが べにふうき茶 煎茶 図１．緑茶抽出液のM.morganiiに対するＨＤＣ活性抑制結果 確認され，水産加工品中のＨｍ生成を抑制に有効であることが示唆された。 試験２．魚肉でのＨｍ生成抑制試験 【材料及び方法】 ・緑茶抽出液 市販のべにふうき茶を用い，茶20gを200mlの水で煮熟抽出した溶液を冷却し試験に供した。 ・供試魚 2013年6月に鹿児島県北薩海域で漁獲された新鮮なマイワシ（体重22.07±4.07g)を用いた。供試 魚は，三枚に卸し，フィレとした。冷水で洗浄し内臓等の付着物を取り除いた後，水気を拭き取り 保存袋に入れ，試験に供するまで-35℃で保管した。 ・Ｈｍ生成菌の調整及び菌の接種方法 試験１同様，（独）水産総合研究センター中央水産研究所より菌株分与されたP.damselae を用い た。菌体は，0.5%L-His及び2.5%のNaclを加えたTSB培地で培養し,30℃で107cfu/ml になるまで培 養を行った。その後，滅菌PBSで104cfu/ml に希釈し，試験用菌液とした。菌の接種方法は，供試 フィレを3分間菌液に浸漬して行う浸漬法とした。 ・試験の方法 イワシ丸干加工を想定し，塩漬工程中に緑茶抽出液を添加することで，Ｈｍの生成を抑制する手 法を検討した。10%食塩水及び10％食塩水に緑茶抽出液を10％量外添した浸漬液の2種類を準備した。 これら浸漬液に，予め菌液接種により汚染させたイワシフィレそれぞれに5枚ずつ，漬け込んだ。 また，対照区として，菌に汚染させていないフィレを10%食塩水に漬け込んだものも準備した。30 - 222 - 平成25年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書 分経過後にそれぞれ浸漬液から取り出し，保存袋に入れ，25℃で16時間保存した後，すべてのフィ レについてＨｍ濃度を測定した。 ・Ｈｍ測定 サンプル約2gを正確に量り取り，8倍量のイオン交換水を加え，ポリトロンホモジナイザーでホ モジネート（18,000rpm×1min）し，遠心分離（10,000rpm，5分，4℃）後，上清を得た。得られた 上清を試験１同様の方法で分析し，Ｈｍ濃度を求めた。 【結果及び考察】 60 結果を図２に示す。10％食塩水 が魚肉中に浸透している状態にも 50 関わらず，25℃で16時間の保存条 件であったため，洗浄フィレ区に 生成した。また，フィレ肉を予め Ｈｍ生成菌で汚染した区では平均 Ｈｍ（ｐｐｍ） おいても平均で18.77ppmのＨｍが 40 30 20 40.12ppmであった。一方，予めＨ ｍ生成菌で汚染したフィレにべに 10 ふうき抽出液を添加した場合に は，Ｈｍ生成が若干少なく，平均 0 フィレ で33.04ppmとなったもののＨｍ生 成低減効果に有意差は認められな 図２ 汚染フィレ 汚染フィレ＋べにふうき茶 イワシ魚肉での緑茶抽出液のＨｍ生成抑制試験 かった。このことは，試験１の結 （平均値±標準誤差） 果を十分に反映しているとは言い 難い。今回の試験においては，予めＨｍ生成菌で汚染した区における保存後のＨｍ生成濃度が昨年ま での数値と比べ極端に低かったことから，使用したＨｍ生成菌の活性が弱っていた可能性が示唆され た。また，べにふうき抽出物を添加した区においては，フィレ5枚のうち，3枚は2ppm以下であったが， 残り2枚では60ppm以上と高い値であり，同じ試験区内でのバラツキが非常に大きかった。このことは， Ｈｍ生成菌の接種による汚染が均等に行われなかった可能性を示唆するものである。これらのことを 併せて考慮すると，今回の試験の結果からは，汚染したフィレ肉に対するべにふうき抽出液のＨｍ生 成抑制効果を確認するには，不十分であり，生成菌汚染手法の再検討を含め再度試験を行う必要があ ると考えられた。 - 223 -
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